CN111269869B - 一种重组丙酮丁醇梭菌的构建方法以及在发酵半纤维制备丁醇中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组丙酮丁醇梭菌的构建方法以及在发酵半纤维制备丁醇中的应用，所述的重组丙酮丁醇梭菌是通过在丙酮丁醇梭菌中过表达木聚糖酶基因构建得到的。与现有技术相比，本发明具有如下优势：(1)在丙酮丁醇梭菌中过表达木聚糖酶基因，成功表达木聚糖酶，该木聚糖酶具有高度可溶性且可完全分泌至细胞外，有效的提升了丙酮丁醇梭菌降解半纤维素的能力。(2)实现以半纤维为唯一碳源发酵制备丁醇的生物过程，大幅降低了制备丁醇的成本，进一步验证了将可再生的生物质能转化为生物燃料的可行性。(3)相比于野生菌，本发明构建的重组丙酮丁醇梭菌将丁醇产量从1.25g/L提高到4.03g/L。

Description

一种重组丙酮丁醇梭菌的构建方法以及在发酵半纤维制备丁 醇中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种重组丙酮丁醇梭菌的构建方法以及在发酵半纤维制备丁醇中的应用。

背景技术

丁醇是一种重要的精细化工产品和极具潜力的生物燃料。在生物燃料领域，与乙醇相比，丁醇具有更高的能量密度，可与汽油以任意比例混合，还具有低挥发性，低腐蚀性等。丁醇所具有的优良化学特性使生物丁醇成为重要的新兴生物燃料之一。

制备丁醇的方式主要以石油化工原料为主，但是随着不断增加的环境污染以及化石能源不断衰竭等问题，传统的以石油化工为原料制备丁醇的方法已不再成为主要的制备方法。此外，传统的生物发酵法制备丁醇的原料主要是以玉米、谷物等作为原料，近年来，随着粮食价格的上涨以及各国对于粮食安全的重视，传统的生物法制备生物丁醇在生产成本以及伦理上均面临着巨大的挑战。因此，寻找可再生的替代性原料成为制备生物丁醇的关键。目前，利用可再生的生物质能来制备生物丁醇受到越来越多的专家学者的关注。

木质纤维素作为地球上数量最大的一种可再生的生物质能，全世界纤维素的年产量约为10¹¹吨，但只有少量的木质纤维素被有效利用，绝大多数被作为废物弃置在自然界中，反而造成了一定的环境污染问题。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素、木质素等三部分组成，其中半纤维的含量为25-35％，是自然界中仅次于纤维素的碳水化合物。

利用木质纤维素发酵生产丁醇具有明显的优势，其原材料来源广泛，供应充足，价格低廉，还可减少环境污染，提高资源利用率，保证国家能源和粮食安全等。然而，木质纤维素是一种难以降解的生物质能，应用木质纤维素作为底物原料进行发酵，必须对原料物质进行预处理，预处理之后需要添加相应的水解酶，将对应的多糖水解为单糖后才可用于产溶剂梭菌的发酵。此工艺过程复杂，且使生产成本大幅增加。因此，为解决木质纤维素利用中存在的一系列问题，研究者提出了整合生物过程这一概念。所谓整合生物过程就是将水解酶的生产、底物原料的水解、溶剂的生成集合于一个生物反应器中同步进行，极大的降低了水解酶的生产成本和过程操作以及设备投资。

以生物发酵法制备丁醇，目前研究较为广泛的产丁醇的梭菌主要以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)为主。在厌氧条件下发酵生成丁醇，同时也伴随着其他产物丙酮和乙醇的生成，故此发酵也称为ABE发酵。相比于化学合成法，生物发酵法具有反应条件温和，制造过程简单，能源消耗低，投资小，技术设备要求低，安全性好，副产物少，原料来源广泛等优点。此外，丙酮丁醇梭菌还具有在很多介质表面形成生物被膜的特性，生物被膜是以胞外蛋白质和多糖等为主体的大分子聚合基质，其形成表明细胞具有大量合成、分泌胞外蛋白的能力。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，生物发酵法制备丁醇过程中生产成本过高，工艺条件复杂以及可再生生物质能半纤维素难以直接降解利用等问题，本发明提供一种重组丙酮丁醇梭菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组丙酮丁醇梭菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组丙酮丁醇梭菌在发酵制备丁醇中的应用。

发明思路：基于丙酮丁醇梭菌具有合成分泌胞外蛋白质的能力，在该菌株中分泌表达木聚糖酶基因，使木聚糖酶成功表达并分泌至细胞外。以半纤维素为唯一碳源，利用木聚糖酶对半纤维素的水解能力，丙酮丁醇梭菌可发酵木糖生成丁醇的能力，构建可直接降解半纤维素生成生物丁醇的整合生物过程，降低丁醇发酵的生产成本，减少发酵过程中的生物能的损失。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种重组丙酮丁醇梭菌，其是通过在丙酮丁醇梭菌中过表达木聚糖酶基因构建得到的。其中，所述木聚糖酶基因的过表达是指将木聚糖酶基因克隆至表达载体上，从而提高木聚糖酶的表达量，增强木聚糖酶活性。

其中，所述的丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌B3(C.acetobutylicum B3)，其保藏编号为CGMCC No.5234，该菌株的信息在申请号为201210075094.X的中国专利中详细公开。

其中，所述的木聚糖酶基因来源于丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum B3，为CA_P0053、CA_P0116和CA_P0054中的任意一种；其中，CA_P0053的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CA_P0116的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，CA_P0054的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

其中，所述的木聚糖酶基因优选CA_P0053。

上述重组丙酮丁醇梭菌的构建方法也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的重组丙酮丁醇梭菌的构建方法包括如下步骤：构建重组表达质粒，将重组表达质粒甲基化后，电击转化至丙酮丁醇梭菌CGMCC No.5234中，筛选得到过表达木聚糖酶基因的重组丙酮丁醇梭菌。

其中，所述的重组表达质粒的构建方法为：

(1)以丙酮丁醇梭菌CGMCC No.5234基因组为模板，分别以SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列为引物进行PCR，扩增木聚糖酶基因，得到木聚糖酶基因片段，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

(2)将步骤(1)得到的木聚糖酶基因片段克隆至到表达载体上；

(3)将步骤(2)得到的产物转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，筛选，得到重组质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

步骤(2)中，所述的表达载体为pSY8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述的克隆为将木聚糖酶基因片段与经过Nde I酶切线性化的表达载体片段连接，pSY8质粒载体中木聚糖酶基因的插入位点为Nde I酶切位点。

其中，所述的甲基化为构建成功的重组表达质粒，热激转化至E.coli Top10(含pAN2质粒，该质粒有一个枯草芽抱杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，可实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化)感受态中，具体操作如下所述：20μL质粒与200μL E.coli Top10感受态混合，冰上放置30min；42℃水浴锅中热激90s；冰上放置3-5min；加入新鲜的LB培养基800-1000μL；37℃，200rpm摇床复苏45-60min；取复苏后的菌液200μL涂布至含有氨苄青霉素和四环素抗性的LB固体平板培养基(含1.5％琼脂粉)上，37℃静止培养12-16h；挑取单菌落在LB液体培养基中扩大培养，之后提取质粒，所得质粒即为甲基化质粒。

上述重组丙酮丁醇梭菌，该菌株可分泌表达木聚糖酶，木聚糖酶可以有效的分泌至重组菌株的细胞外，分泌至细胞外的木聚糖酶可有效的降解半纤维素。

上述重组丙酮丁醇梭菌在发酵制备丁醇中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的应用为将重组丙酮丁醇梭菌制备的种子液接种到含有半纤维素(作为碳源)的发酵培养基中，发酵制备丁醇。

具体的，包括如下步骤：

(i)将重组丙酮丁醇梭菌涂布至P2固体平板培养基中(含有20ug/mL甲砜氯霉素)，置于厌氧箱中于37℃，培养时间24h；将平板培养的菌体转接至P2液体培养基中(含有20ug/mL甲砜氯霉素)，于37℃静置培养至OD₆₀₀＝2.2，即为种子液；

(ii)按照P2发酵培养基体系，配置以半纤维素为唯一碳源的发酵培养基，发酵体系为50mL，该发酵培养基在接种之前2h置于厌氧箱中排除氧气。

(iii)将步骤(i)得到的种子液，按照10vt％的接种量接种于步骤(ii)所述的发酵培养基中，置于37℃静置发酵。

步骤(ii)中，所述的发酵培养中半纤维素的浓度为10～60g/L，优选45～55g/L，更优选50g/L。

步骤(iii)中，发酵的时间为10～150h，优选100～120h，更优选108h。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)在丁醇梭菌中过表达木聚糖酶基因，成功表达木聚糖酶，该木聚糖酶具有高度可溶性且可完全分泌至细胞外，有效的提升了丙酮丁醇梭菌降解半纤维素的能力，进而提升丁醇的终产量。

(2)实现以半纤维为唯一碳源发酵制备丁醇的生物过程，大幅降低了制备丁醇的成本，进一步验证了将可再生的生物质能转化为生物燃料的可行性。

(3)实现了将木聚糖酶的生产、半纤维素的水解、丁醇的发酵集于一体化的整合生物过程，极大的节约了制备丁醇的成本，减少了发酵过程中生物能的损失。

(4)相比于野生菌，本发明构建的重组丙酮丁醇梭菌将丁醇产量从1.25g/L提高到4.03g/L。

附图说明

图1为重组质粒图谱。

图2为木聚糖酶基因CA_P0053基因片段PCR产物核酸凝胶电泳图，泳道1-10是木聚糖酶基因CA_P0053基因片段PCR产物，泳道M是DNA分子量标准Marker。

图3为重组丙酮丁醇梭菌，阳性转化子菌落PCR产物核酸凝胶电泳图，其中泳道1-8是菌落PCR产物，泳道9是阳性对照，泳道10是阴性对照，泳道M是DNA分子量标准Marker。

图4为重组丙酮丁醇梭菌B3-0053，细胞外、细胞内、细胞碎片SDS-PAGE图，其中泳道1是野生型菌株C.acetibutylicum B3细胞外物质，泳道2是C.acetibutylicum B3-0053细胞外物质，泳道3是野生型菌株C.acetibutylicum B3细胞内物质，泳道4是C.acetibutylicum B3-0053细胞内物质，泳道5是C.acetibutylicum B3细胞碎片物质，泳道6是C.acetibutylicum B3-0053细胞碎片物质，泳道M是蛋白质分子质量标准Marker。

图5为重组菌株及其对应的野生菌株丁醇发酵动力学。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。下属实施例中所用试剂均可从商业途径获得。

下列实施例以木聚糖酶基因CA_P0053为例，详细阐明本发明方法。

本实验所需培养基如下表1,2,3,4所示：

表1. LB培养基组分(溶剂为水)

LB培养基组分	浓度(g/L)
		胰蛋白胨	10
酵母粉	5
		NaCl	10

表2. P2种子液培养基组分(溶剂为水)

表3. P2发酵培养基组分(溶剂为水)

P2发酵培养基组分	浓度(g/L)
		半纤维素	50
CH<sub>3</sub>COONH<sub>4</sub>	2.2
		K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	0.5
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.5
		FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.2
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	0.2
		MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	0.01
NaCl	0.01
		对氨基苯甲酸	0.001
硫胺素	0.001
		生物素	0.0001

表4.表2.2×YTG培养基组分(pH 5.2)(溶剂为水)

2×YTG培养基组分(pH 5.2)	浓度(g/L)
		胰蛋白胨	16
酵母粉	10
		葡萄糖	5
NaCl	5

实施例1：木聚糖酶基因重组表达质粒的构建

(1)采用细菌基因组提取试剂盒(TaKaRa Code：DV810A)提取对数生长中后期的丁醇梭菌C.acetobutyicum B3基因组DNA；

(2)按照ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒说明书，设计合理的PCR扩增引物，其序列如表5所示，其中F代表正向引物，R代表反向引物。以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增的方式，获得木聚糖酶CA_P0053基因(NCBI-GeneID:1116058)片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所构建质粒图谱如图1所示；木聚糖酶基因CA_P0053基因片段PCR扩增后，PCR产物核酸凝胶电泳结果如图2所示；

(3)使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒，纯化回收步骤(2)中PCR扩增的片段。

(4)按照ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒说明书，将步骤(3)纯化回收得到的基因片段与经过Nde I酶切线性化的载体片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO.10)连接。

(5)步骤(4)所得到的一步克隆产物按照热激转化的方法转化至E.coli DH5α中以扩增质粒，具体操作如下所述：一步克隆产物与200μL E.coli DH5α感受态混合，冰上放置30min；42℃水浴锅中热激90s；冰上放置5min；加入新鲜的LB培养基800μL；37℃，200rpm摇床复苏45min；取复苏后的菌液200μL涂布至含有氨苄青霉素抗性的LB固体平板培养基(含1.5％琼脂粉)上，37℃静止培养12h；挑选出的阳性转化子接种至液体LB培养基中扩大培养，之后提取质粒，酶切验证后送至金唯智基因测序公司测序。

(6)步骤(5)得到的构建成功的质粒，热激转化至E.coli Top10(含pAN2质粒，该质粒有一个枯草芽抱杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，可实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化)感受态中，具体操作如下所述：20μL质粒与200μL E.coli Top10感受态混合，冰上放置30min；42℃水浴锅中热激90s；冰上放置5min；加入新鲜的LB培养基800μL；37℃，200rpm摇床复苏45min；取复苏后的菌液200μL涂布至含有氨苄青霉素和四环素抗性的LB固体平板培养基(含1.5％琼脂粉)上，37℃静止培养12h；挑取单菌落在LB液体培养基中扩大培养，之后提取质粒，所得质粒即为甲基化质粒。

表5.木聚糖酶基因PCR扩增引物

表6. PCR反应体系(100μL)

PCR反应组分	体积(μL)
		5×PS Buffer	20
dNTPmix	10
		Primer 1	1
Primer 2	1
		模板DNA	1
Prime STAR(高保真酶)	1
		dd H<sub>2</sub>O	66

表7.一步克隆反应体系

反应体系组分	体积(μL)
		5×CE II Buffer	4
线性化质粒载体	2(50-200ng)
		目的基因片段	1(10-100ng)
Exnase<sup>TM</sup> II	2
		dd H<sub>2</sub>O	Up to 20

实施例2：重组丙酮丁醇梭菌的构建

(1)厌氧条件下，取2×YTG培养基中培养至对数中期(OD₆₀₀＝1.1)的C.acetobutylicum B3(保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC5234；该菌株的信息在申请号为201210075094.X的中国专利中详细公开)培养液60mL。

(2)4℃，5000rpm离心10min后弃掉上清液，加入适量的已经预冷的电转缓冲液EPB(270mM蔗糖，5mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4)，洗涤两次，并用2.3mL EPB重悬。

(3)然后取570μL步骤(1)所述的重悬菌液，加入4mm电转杯放置在冰浴中冷却，并加入20μL实施例1中构建完成的甲基化质粒，冰上放置2min。2.0kV电压，25uF电容进行电转化。

(4)将步骤(3)电转后的菌液加入到5mL 2xYTG培养基中，37℃复苏培养4h，离心收集细胞100uL并将细胞涂布于含有20ug/mL甲砜氯霉素的新鲜P2固体平板培养基(含1.5％琼脂粉)中。

(5)用菌落PCR(所用引物如表1所示)的方法，筛选出阳性转化子，根据图3所示，菌株2,3,4,6,7,8即为阳性克隆子，各菌株纯化培养后用已配置好的20％的甘油进行保菌，储存于-80℃超低温冰箱。

实施例3：重组菌株可有效分泌表达木聚糖酶

(1)取实施例2中所保藏的基因工程菌株C.acetobutylicum B3-0053以及其相对应的野生型菌株C.acetobutylicum B3各200uL，涂布至P2固体平板培养基中(含有20μg/L甲砜氯霉素)，放置于厌氧箱中于37℃，培养时间为24h。

(2)将平板培养的菌体转接至P2液体培养基中(含有20μg/L甲砜氯霉素)，于37℃静置培养至OD₆₀₀＝2.2；

(3)将步骤(2)所述的以及种子培养基按10％的接种量转接至二级P2种子培养基中，30℃培养箱中静止培养36h后收集处理样品；

(4)将步骤(3)所述的所收集的样品，4℃，8000rpm离心，收集上清液和沉淀，所收集的上清液即为重组丙酮丁醇梭菌分泌至细胞外的物质；

(5)步骤(4)所收集的菌体沉淀，用20mL磷酸盐缓冲液(pH 6.0)重悬洗涤一次后，4℃，8000rpm离心，收集沉淀；

(6)步骤(5)所述的菌体沉淀用10mL磷酸盐缓冲液(pH 6.0)重悬后，置于超声细胞破碎仪中破碎(3s超声，5s间隔，280W)；

(7)步骤(6)所述的超声破碎后的产物，4℃，8000rpm离心，分别收集离心后的上清和沉淀，所收集沉淀用10mL磷酸盐缓冲液重悬；

(8)步骤(7)所收集的上清液即为重组丙酮丁醇梭菌细胞内的可溶性物质，沉淀即为菌体碎皮及细胞内不可溶的物质；

(9)利用SDS-PAGE分别检测重组丙酮丁醇梭菌细胞外、细胞内以及细胞碎片中目的蛋白即木聚糖酶的分泌表达情况。

图4所示即为SDS-PAGE结果，重组菌株中所表达的木聚糖酶具有高度可溶性，且可有效分泌至重组菌株的细胞外。

实施例4：半纤维素为原料，发酵制备丁醇

(1)取实施例2中保藏的基因工程菌株C.acetobutylicum B3-0053、C.acetobutylicum B3-0116、C.acetobutylicum B3-0054以及其相对应的野生型菌株C.acetobutylicum B3各200uL，涂布至P2固体平板培养基中(含有20μg/L甲砜氯霉素)，放置于厌氧箱中于37℃，培养时间24h。

(2)将平板培养的菌体转接至P2液体培养基中(含有20μg/L甲砜氯霉素)，于37℃静置培养至OD600＝2.2，即为种子液。

(3)按照P2发酵培养基体系，配置以半纤维素(50g/L)为唯一碳源的发酵培养基，发酵体系为50mL，该发酵培养基在接种之前2h至于厌氧箱中排除氧气。

(4)将步骤(2)所述的种子液，按照10vt％的接种量接种于步骤(3)所述的发酵培养基中，置于37℃静置发酵，每隔12h取样一次，检测产物浓度。

实施例5：气相色谱法检测发酵产物

气相色谱条件如下：HP-INNOWax毛细管色谱柱，PEG-20M，60m×0.25mm×0.5μm，担体为硅藻土。柱温采用程序升温法：初始70℃，保持0.5min后以20℃·min^-1的速度升至190℃，保持0.5min，柱流量1.0mL·min^-1，尾吹流速29mL·min^-1，氢气流速30mL·min^-1，空气流速300mL·min^-1。前进样口温度180℃，FID温度220℃，进样量1.0μL，分流比90：1。

实施例3中每隔12h所取样品在气相检测前先离心，然后取上清1～1.5mL过0.22μm滤膜后备用。

所述三株重组菌株及野生型菌株所制备的丁醇产量如表8所示，产丁醇的动力学曲线如图5所示。

表8.各菌株发酵制备丁醇产量

本发明提供了一种重组丙酮丁醇梭菌的构建方法以及在发酵半纤维制备丁醇中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种重组丙酮丁醇梭菌的构建方法以及在发酵半纤维制备丁醇中的应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 957

<212> DNA

<213> 木聚糖酶基因1(CA_P0053)

<400> 1

atgttaaaat caaaattatc aaaaatatgt acaggagtct tagctttagg tcttgccctt 60

tcaatttcag gtgtaggaac ttttaaagct gctatgtcac atagcaaatt tgtaggaaat 120

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<210> 2

<211> 957

<212> DNA

<213> 木聚糖酶基因2(CA_P0116)

<400> 2

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aatggtactg aacgtccagc tcttaaatgg ttaagatctt atttagctag tcattaa 957

<210> 3

<211> 750

<212> DNA

<213> 木聚糖酶基因3(CA_P0054)

<400> 3

atgaaaaaat tactcactgt aattcttatc ttgacacttt tatctattcc ttactctgta 60

aaatctgcga aagcagaaac taatgtacgt gtcccagttc ttctatatca tgttgtttct 120

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aataaagctc cactttactt ggcataccct tatggaacat atgatgcaga tagtgtttca 600

atccttaaaa gtttaggtta taaagctggt ttttccgtat caaacgtctt aagcaccgac 660

acaagtaaca aatatggttt acctcgtatt gttattacaa atggcgatac cttaaatgta 720

tttgaaaaaa agcttttaaa tggtcattaa 750

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物(0053-F)

<400> 4

atagtaaaag ggagtgtcga catatgatgt taaaatcaaa attatc 46

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物(0053-R)

<400> 5

agattgtact gagagtgcac catatgctaa tgtgatgcta agtaag 46

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物(0116-F)

<400> 6

atagtaaaag ggagtgtcga catatgatgt taaaatcaaa gttagc 46

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物(0116-R)

<400> 7

agattgtact gagagtgcac catatgttaa tgactagcta aataag 46

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物(0054-F)

<400> 8

atagtaaaag ggagtgtcga catatgatga aaaaattact cactgt 46

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物(0054-R)

<400> 9

agattgtact gagagtgcac catatgttaa tgaccattta aaagct 46

<210> 10

<211> 4040

<212> DNA

<213> 载体(pSY8)

<400> 10

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 60

ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 120

caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtttatgtt 180

acagtaatat tgacttttaa aaaaggattg attctaatga agaaagcaga caagtaagcc 240

tcctaaattc actttagata aaaatttagg aggcatatca aatgaacttt aataaaattg 300

atttagacaa ttggaagaga aaagagatat ttaatcatta tttgaaccaa caaacgactt 360

ttagtataac cacagaaatt gatattagtg ttttataccg aaacataaaa caagaaggat 420

ataaatttta ccctgcattt attttcttag tgacaagggt gataaactca aatacagctt 480

ttagaactgg ttacaatagc gacggagagt taggttattg ggataagtta gagccacttt 540

atacaatttt tgatggtgta tctaaaacat tctctggtat ttggactcct gtaaagaatg 600

acttcaaaga gttttatgat ttataccttt ctgatgtaga gaaatataat ggttcgggga 660

aattgtttcc caaaacacct atacctgaaa atgctttttc tctttctatt attccatgga 720

cttcatttac tgggtttaac ttaaatatca ataataatag taattacctt ctacccatta 780

ttacagcagg aaaattcatt aataaaggta attcaatata tttaccgcta tctttacagg 840

tacatcattc tgtttgtgat ggttatcatg caggattgtt tatgaactct attcaggaat 900

tgtcagatag gcctaatgac tggcttttat aaatcgatta tgtcttttgc gcattcactt 960

cttttctata taaatatgag cgaagcgaat aagcgtcgga aaagcagcaa aaagtttcct 1020

ttttgctgtt ggagcatggg ggttcagggg gtgcagtatc tgacgtcaat gccgagcgaa 1080

agcgagccga agggtagcat ttacgttaga taaccccctg atatgctccg acgctttata 1140

tagaaaagaa gattcaacta ggtaaaatct taatataggt tgagatgata aggtttataa 1200

ggaatttgtt tgttctaatt tttcactcat tttgttctaa tttcttttaa caaatgttct 1260

ttttttttta gaacagttat gatatagtta gaatagttta aaataaggag tgagaaaaag 1320

atgaaagaaa gatatggaac agtctataaa ggctctcaga ggctcataga cgaagaaagt 1380

ggagaagtca tagaggtaga caagttatac cgtaaacaaa cgtctggtaa cttcgtaaag 1440

gcatatatag tgcaattaat aagtatgtta gatatgattg gcggaaaaaa acttaaaatc 1500

gttaactata tcctagataa tgtccactta agtaacaata caatgatagc tacaacaaga 1560

gaaatagcaa aagctacagg aacaagtcta caaacagtaa taacaacact taaaatctta 1620

gaagaaggaa atattataaa aagaaaaact ggagtattaa tgttaaaccc tgaactacta 1680

atgagaggcg acgaccaaaa acaaaaatac ctcttactcg aatttgggaa ctttgagcaa 1740

gaggcaaatg aaatagattg acctcccaat aacaccacgt agttattggg aggtcaatct 1800

atgaaatgcg attaagcttg gctgcaggtc gacggatccc cgggaattct ataaaatata 1860

aataattttc taaaaaactt aacttcatgt gaaaagtttg ttaaaatata aatgagcacg 1920

ttaatcattt aacatagata attaaatagt aaaagggagt gtcgacatat ggtgcactct 1980

cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 2040

tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 2100

ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa 2160

gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac 2220

gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 2280

acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 2340

aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 2400

attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 2460

tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 2520

gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 2580

cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 2640

tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 2700

agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 2760

tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 2820

tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 2880

tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 2940

acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 3000

accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 3060

tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 3120

cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 3180

tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat 3240

actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 3300

tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 3360

cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 3420

gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 3480

tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt 3540

gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 3600

gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 3660

ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 3720

acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 3780

agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 3840

cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 3900

tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 3960

gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 4020

ttttgctcac atgttctttc 4040

<210> 11

<211> 5003

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial )

<400> 11

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 60

ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 120

caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtttatgtt 180

acagtaatat tgacttttaa aaaaggattg attctaatga agaaagcaga caagtaagcc 240

tcctaaattc actttagata aaaatttagg aggcatatca aatgaacttt aataaaattg 300

atttagacaa ttggaagaga aaagagatat ttaatcatta tttgaaccaa caaacgactt 360

ttagtataac cacagaaatt gatattagtg ttttataccg aaacataaaa caagaaggat 420

ataaatttta ccctgcattt attttcttag tgacaagggt gataaactca aatacagctt 480

ttagaactgg ttacaatagc gacggagagt taggttattg ggataagtta gagccacttt 540

atacaatttt tgatggtgta tctaaaacat tctctggtat ttggactcct gtaaagaatg 600

acttcaaaga gttttatgat ttataccttt ctgatgtaga gaaatataat ggttcgggga 660

aattgtttcc caaaacacct atacctgaaa atgctttttc tctttctatt attccatgga 720

cttcatttac tgggtttaac ttaaatatca ataataatag taattacctt ctacccatta 780

ttacagcagg aaaattcatt aataaaggta attcaatata tttaccgcta tctttacagg 840

tacatcattc tgtttgtgat ggttatcatg caggattgtt tatgaactct attcaggaat 900

tgtcagatag gcctaatgac tggcttttat aaatcgatta tgtcttttgc gcattcactt 960

cttttctata taaatatgag cgaagcgaat aagcgtcgga aaagcagcaa aaagtttcct 1020

ttttgctgtt ggagcatggg ggttcagggg gtgcagtatc tgacgtcaat gccgagcgaa 1080

agcgagccga agggtagcat ttacgttaga taaccccctg atatgctccg acgctttata 1140

tagaaaagaa gattcaacta ggtaaaatct taatataggt tgagatgata aggtttataa 1200

ggaatttgtt tgttctaatt tttcactcat tttgttctaa tttcttttaa caaatgttct 1260

ttttttttta gaacagttat gatatagtta gaatagttta aaataaggag tgagaaaaag 1320

atgaaagaaa gatatggaac agtctataaa ggctctcaga ggctcataga cgaagaaagt 1380

ggagaagtca tagaggtaga caagttatac cgtaaacaaa cgtctggtaa cttcgtaaag 1440

gcatatatag tgcaattaat aagtatgtta gatatgattg gcggaaaaaa acttaaaatc 1500

gttaactata tcctagataa tgtccactta agtaacaata caatgatagc tacaacaaga 1560

gaaatagcaa aagctacagg aacaagtcta caaacagtaa taacaacact taaaatctta 1620

gaagaaggaa atattataaa aagaaaaact ggagtattaa tgttaaaccc tgaactacta 1680

atgagaggcg acgaccaaaa acaaaaatac ctcttactcg aatttgggaa ctttgagcaa 1740

gaggcaaatg aaatagattg acctcccaat aacaccacgt agttattggg aggtcaatct 1800

atgaaatgcg attaagcttg gctgcaggtc gacggatccc cgggaattct ataaaatata 1860

aataattttc taaaaaactt aacttcatgt gaaaagtttg ttaaaatata aatgagcacg 1920

ttaatcattt aacatagata attaaatagt aaaagggagt gtcgacatat gatgttaaaa 1980

tcaaaattat caaaaatatg tacaggagtc ttagctttag gtcttgccct ttcaatttca 2040

ggtgtaggaa cttttaaagc tgctatgtca catagcaaat ttgtaggaaa tattatagca 2100

ggaagtattc cttctaactt tgatacctat tggaatcaag ttacaccaga aaatgcaact 2160

aagtggggcg caattgaata tggtcgtggc aattataact ggggaagcgc agatcttatt 2220

tataattacg ccagaagtaa aaacatgcca ttcaaatttc ataatttagt atggggaagt 2280

cagcagctta cttggttgtc aaatctttca cctcaagatc aaaaatctga agtatcaaaa 2340

tggattgcag ccgcaggtca aagatattct ggttcagctt ttgttgatgt tgtaaatgaa 2400

ccactgcata ctcaaccttc ttacaaaaat gctttaggcg gagatggttc caccggttat 2460

gattggattg tatggtctta tcagcaggca agaaaagcct tccctaattc aaaactttta 2520

attaatgaat atggcataat aggcgatcct aatgcagcag ctaattatgt taaaatcata 2580

aatgttctta aaagcaaagg tttaattgat ggaataggaa ttcaatgtca ctatttcaat 2640

atggataacg tttctgtagg aacaatgaac tatgttttaa atatgttatc taatacaggt 2700

ttaccaatat acgtatcaga acttgatatg actggcgatg actcaactca gcttgctaga 2760

tatcaacaaa agttccctgt tctatatcaa aatcctaatg taaaaggtat aactttatgg 2820

ggatatatgc aaggtcaaac ttggaatagt ggtacttatt tagttaattc aaatggtact 2880

gaacgtccag ctcttaaatg gttaagatct tacttagcat cacattagca tatggtgcac 2940

tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc 3000

cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac 3060

cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg 3120

aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta 3180

gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta 3240

aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata 3300

ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc 3360

ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga 3420

agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct 3480

tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg 3540

tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta 3600

ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat 3660

gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt 3720

acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga 3780

tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga 3840

gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga 3900

actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc 3960

aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc 4020

cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg 4080

tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat 4140

cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata 4200

tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct 4260

ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga 4320

ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg 4380

cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc 4440

aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct 4500

agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 4560

tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 4620

ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 4680

cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct 4740

atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 4800

ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 4860

tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 4920

gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg 4980

gccttttgct cacatgttct ttc 5003

Claims (8)

1.一种重组丙酮丁醇梭菌，其特征在于，其是通过在丙酮丁醇梭菌中过表达木聚糖酶基因构建得到的；

其中，所述的丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌（clostridium acetobutylicum）B3，其保藏编号为CGMCC No.5234；

其中，所述的木聚糖酶基因为CA_P0053、CA_P0116和CA_P0054中的任意一种；

其中，CA_P0053的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CA_P0116的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，CA_P0054的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的重组丙酮丁醇梭菌的构建方法，其特征在于，构建重组表达质粒，将重组表达质粒甲基化后，电击转化至丙酮丁醇梭菌CGMCC No.5234中，筛选得到过表达木聚糖酶基因的重组丙酮丁醇梭菌；

其中，所述的木聚糖酶基因为CA_P0053、CA_P0116和CA_P0054中的任意一种；

其中，CA_P0053的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CA_P0116的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，CA_P0054的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的重组丙酮丁醇梭菌的构建方法，其特征在于，所述的重组表达质粒的构建方法为：

（1）以丙酮丁醇梭菌CGMCC No.5234基因组为模板，分别以SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列为引物进行PCR，扩增木聚糖酶基因，分别得到木聚糖酶基因片段CA_P0053、CA_P0116和CA_P0054；其中，CA_P0053的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CA_P0116的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，CA_P0054的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

（2）将步骤（1）得到的木聚糖酶基因片段与线性化的载体片段连接；

（3）将步骤（2）得到的产物转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，筛选，得到重组质粒。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的表达载体为pSY8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.权利要求1所述的重组丙酮丁醇梭菌在发酵制备丁醇中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将重组丙酮丁醇梭菌制备的种子液接种到含有半纤维素的发酵培养基中，发酵制备丁醇。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养中半纤维素的浓度为10~60 g/L。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵的时间为10~150 h。

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