CN110904142A - 一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法 - Google Patents

一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110904142A
CN110904142A CN201811078900.2A CN201811078900A CN110904142A CN 110904142 A CN110904142 A CN 110904142A CN 201811078900 A CN201811078900 A CN 201811078900A CN 110904142 A CN110904142 A CN 110904142A
Authority
CN
China
Prior art keywords
diatom
shell surface
sequence
algae
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811078900.2A
Other languages
English (en)
Inventor
冯超
李静
陈西广
张凯超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ocean University of China
Original Assignee
Ocean University of China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ocean University of China filed Critical Ocean University of China
Priority to CN201811078900.2A priority Critical patent/CN110904142A/zh
Publication of CN110904142A publication Critical patent/CN110904142A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • G01N2333/936—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) acting on beta-1, 4 bonds between N-acetylmuramic acid and 2-acetyl-amino 2-deoxy-D-glucose, e.g. lysozyme

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法，属于基因的遗传转化技术领域，包括以下步骤：1）基础质粒的构建；2）功能蛋白基因表达序列设计；3）硅藻壳面锚定蛋白表达载体的构建；4）硅藻壳面锚定蛋白表达载体对硅藻的遗传转化；5）重组硅藻的筛选与鉴定，最终获得表达壳面锚定蛋白的转基因硅藻。本发明方法生产的转基因硅藻具有高效表达壳面锚定蛋白的能力，可稳定遗传，并可根据实际应用需要更换转入的功能基因，其表达的壳面锚定蛋白具有功能蛋白活性，可以应用于动物饲料、生物肥料、生物制药、功能食品以及保健品研制等领域。

Description

一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法
技术领域
本发明属于基因的遗传转化技术领域，具体涉及一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法。
背景技术
蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质，具有结构组成、催化、调节、贮存和转运等多种生理生化功能。蛋白质固定化是指利用物理、化学或生物方法将蛋白质固定在材料表面，并保持其活性的过程。蛋白质在材料表面的固定化技术有着广泛的应用，比如蛋白分析、药物筛选、和生物催化等等。蛋白质的固定化是一个复杂的动态过程，涉及蛋白质与载体材料之间的多种作用力，如范德华力、氢键、静电吸引等。在固定化过程中，由于蛋白质分子的不稳定性和易变性，使得蛋白质的固定化显得尤为重要和困难。
实现蛋白质固定化的方法有很多，可分为物理吸附法、化学方法固定法以及生物亲和吸附法等等。然而，物理吸附法会使蛋白质在材料表面随意排列，不能精确控制蛋白质的吸附量和构象，也不能有选择性的吸附特定的蛋白质，同时其活性部位得不到充分的暴露，从而导致蛋白质的生物活性降低。化学吸附法的操作过程繁杂，吸附过程中化学试剂的加入容易造成蛋白质的变性和失活，因而不能大规模使用。生物亲和吸附法能够选择性的吸附特定的蛋白质并能够保持蛋白质的活性，但是操作步骤繁琐，生产成本较高。
蛋白质的固定化一般选用水不溶性的固体材料作为载体，载体的种类很多，来源和性质也各不相同。但都应满足以下条件：（1）来源广泛，价格便宜；（2）有一定的机械强度，不易变形；（3）有较好的酸碱耐受度；（4）固定过程中不会引起酶的变性；（5）能充分暴露蛋白质的活性基团。
遗传转化技术为蛋白质的生产提供了新的思路，可以在物种间转移基因，也可以选择易于大量繁殖和不易被微生物污染的生产者。海洋硅藻在自然界中分布广泛，生长周期较短，易于大规模人工养殖。而且其具有多孔硅质外壳，是固定化蛋白质的理想载体。通过转基因的方法在海洋硅藻的壳面上表达锚定蛋白，可以直接得到固定化蛋白质，大大降低了生产成本，简化了生产工艺，且该方法具有可持续性，对环境污染较小。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法，以大规模生产固定化蛋白质，降低生产成本。经遗传转化方法得到的表达壳面锚定蛋白的转基因藻可以应用于动物饲料、生物肥料、生物制药、功能食品以及保健品研制等领域。
具体实施方式
1. 质粒的制备：参照序列1构建基础质粒pLJ01，根据功能基因序列和硅藻的密码子偏好性，设计适合硅藻表达的功能基因表达序列，将硅藻特有启动子、相应抗性筛选标记基因和特有终止子按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-1（序列2）位置上，将硅藻特有启动子、锚定蛋白基因序列、功能基因表达序列、荧光筛选标记基因和特有终止子按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-2（序列3）位置上，获得硅藻壳面锚定蛋白表达载体；
2. 藻细胞的准备：选用生长快、易培养的硅藻作为受体藻，采用藻类特定培养基，海水取自青岛附近海域，经0.22 μm滤膜过滤后高压灭菌。通气培养，生长至对数生长期后进行后续实验；
3. 转化方法：采用玻璃珠转化法、基因枪法或电转法将功能基因表达载体转入硅藻中；
4. 转基因藻的筛选：将转基因藻细胞重新涂布于含有载体相应筛选标记抗生素的固体培养基上（注：固体平板倒置）培养，待长出单克隆藻落后，挑取单克隆藻落于含有抗生素的藻类特定培养基中培养；
5. 转基因藻的鉴定：采用荧光观察法、PCR法、RT-PCR法、Western-blot法等进行荧光观察、基因测序和表达产物分析，确定高效表达功能基因的转化藻。
实施例1
1. 假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）壳面锚定溶菌酶表达载体的构建：
（1） 基础质粒的构建：参照序列1构建基础质粒pLJ01；
（2） 硅藻壳面锚定蛋白表达载体的构建：根据假微型海链藻的密码子偏好性，设计适合假微型海链藻表达的溶菌酶基因序列（序列4），总基因长度为435 bp。将硅藻特有启动子Tpfcp8 promoter（序列5）、相应抗性筛选标记基因Nourseothricin N-acetyl-transferase gene（序列6）和特有终止子Tpfcp8 terminator（序列7）按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-1位置上；将硅藻特有启动子Tpfcp8 promoter、溶菌酶基因表达序列、锚定蛋白基因序列（序列8）、荧光筛选标记基因EGFP（序列9）和特有终止子Tpfcp8 terminator按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-2位置上，获得最终的假微型海链藻壳面锚定溶菌酶表达载体pLJ02（序列10）。载体构建完成后进行PCR、酶切以及DNA测序验证质粒序列的正确性；
2. “基因枪法”转化假微型海链藻并进行转基因藻的筛选
（1） 藻细胞的准备：采用假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）作为受体藻，培养基为无菌的f/2培养基，培养器皿为500 mL的锥形瓶，海水经0.22 μm滤膜过滤后高压灭菌。光照周期为12 L:12 D，光照强度为75 μmoLphotons.m-2.s-1，温度为21±1℃，培养至藻细胞数量为2 - 3×106 cells/mL时收集进行遗传转化。取藻细胞离心（4000 g， 10 min）浓缩至200 μL（108 cells/mL），均匀涂布于f/2固体平板正中央（直径≤2 cm），尽快轰击；
（2） 基因枪轰击：用表达载体pLJ02制备钨粉微弹，基因枪法轰击假微型海链藻进行遗传转化；
（3） 轰击藻细胞的筛选及后续培养：轰击的藻细胞置于光照状态下恢复24 h后，将藻细胞用海水f/2培养基(1 mL)洗下，重新涂布于含有诺尔丝菌素（100 - 300 μg/mL）的f/2固体平板上（注：固体平板倒置，光照强度75 μmoLphotons.m-2.s-1，光照周期12 L:12 D，温度21±1℃）。待长出单克隆藻落后，挑取单克隆藻落于含有诺尔丝菌素（100 - 300 μg/mL）的海水f/2培养基中扩大培养；
3. 表达壳面锚定溶菌酶的假微型海链藻的鉴定：
（1） 荧光观察：利用激光共聚焦显微镜的绿色荧光蛋白相应波长对遗传转化假微型海链藻进行观察；
（2） 转基因藻的PCR检测：根据溶菌酶序列设计引物F、R；提取野生型假微型海链藻和转基因假微型海链藻的DNA，利用引物F、R进行PCR反应，PCR条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性20 sec，60 ℃退火20 sec，72 ℃延伸30 sec，35个循环；72 ℃延伸5 min， 4 ℃保温。转基因藻PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，显示出435 bp大小的基因片段，说明溶菌酶基因已经整合到假微型海链藻的基因组中；
（3） 转基因藻的RT-PCR检测：转基因藻的RT-PCR检测：用RNA提取试剂盒提取转基因假微型海链藻的总RNA，取1 μg作为模板，采用反转录试剂盒进行反转录，然后以引物F、R进行RT-PCR扩增，RT-PCR条件：25 ℃，10 min，50 ℃，30 min，85 ℃，5 min，转基因藻PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，显示出435 bp大小的基因片段，表明溶菌酶基因在转录水平上能够成功表达，说明溶菌酶基因能够成功进行自我复制，并且该基因能够在假微型海链藻中转录获得相应的mRNA；
（4） 转基因藻的Western-blot检测：提取假微型海链藻的总蛋白，使用Anti-Lysozyme作为一抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG作为二抗进行免疫反应，检测溶菌酶在假微型海链藻中的表达情况，该结果说明溶菌酶基因在假微型海链藻中成功表达，从而在蛋白水平上验证了溶菌酶在假微型海链藻中表达的可行性。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2960
<212> DNA
<213> 硅藻(Diatoma tenue)
<400> 1
atgaccatga ttacgccaag ctctaatacg actcactata gggaaagctt gcatgccctt 60
aagggcgcgc ccctcagcgc gatcgcggtc gactctagag gatctactag tcatatggat 120
gatatcctcg agacgcctag gactctgcag accgggcccg cggccgcaat cggatccccg 180
ggtaccgagc tcgaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg 240
cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga 300
agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggaaat 360
tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt 420
taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg 480
gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt 540
caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc 600
aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg 660
atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa 720
aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc 780
cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 840
cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 900
ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 960
ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 1020
aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 1080
actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 1140
gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 1200
agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 1260
cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 1320
catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 1380
aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 1440
gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 1500
aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 1560
agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 1620
ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc 1680
actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 1740
aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 1800
gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 1860
atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 1920
tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 1980
tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 2040
ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 2100
agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 2160
ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 2220
tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 2280
gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 2340
cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 2400
ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 2460
agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 2520
tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 2580
ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 2640
ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 2700
ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa 2760
accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 2820
ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 2880
ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 2940
atttcacaca ggaaacagct 2960
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 硅藻(Diatoma tenue)
<400> 2
cttaagggcg cgcccctcag cgcgatcgc 29
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 硅藻(Diatoma tenue)
<400> 3
gatatcctcg agacgcctag gactctgcag accgggcccg cggccgc 47
<210> 4
<211> 435
<212> DNA
<213> 硅藻(Diatoma tenue)
<400> 4
atgatccccc aaatcacccg ttccgtgctc ctcctcctca tcgttatggc cgcctccgga 60
caagttccct ccgactgcct caagtgtatc tgtttcgtgg agtccacctg taccatccca 120
tctcctctct gtcacatgga tgttggatct ctctcttgcg gaccatatca aatcaagctc 180
ggatactggc aagatgctcg tttgaaggga ggatctttgg atggagattg gcaaaagtgt 240
tctgctacct tcgactgttc cgagcgtgct gtccaaggat acatggctcg ttacgctact 300
tacgctcgtt tggaacacaa cccaacctgt gaggattttg ctcgtatcca caacggagga 360
cctaacggat ttaagaaccc agctactgag aagtactggc tccgtgtgaa gaagtgtctc 420
gatatgtcta acaac 435
<210> 5
<211> 958
<212> DNA
<213> 硅藻(Diatoma tenue)
<400> 5
tccgagaact ccccataagt caacggctcc aatcaagaat gtatccgaca acggcgagca 60
tagcaacacg tccgtctttg gagtagaatc atcatgttgt ggatgaatac acagatgaat 120
gacattaaaa gcatgaacat gttagagagt aggaggtaga gattgatatg gtagcattgc 180
gatgtttgtt tttggtcagc atatgatgag tggataccaa tatgatgaaa gttgaatctc 240
gcgtttgagc tcagcggtac gttattgatc gaaagtagcc tgatcaaaat ccttggagag 300
tacaagagga tcaaagaatc cagtgggggc gataactcca agctcgttct caaagaggca 360
atggaggtag aaactcatcc cagttgagaa gaagtgaagg cagtggcggt ggcgaaagca 420
gaggcaacga ggacagactt cctgtgggtt gatgcaacga atatttccag aaggagaagt 480
ttagagagtt gaaccgctac ctacaatgac aaagtatcgt atcgattttg atgttggttg 540
gttatgaatt caaactgtaa gttggattgt gagaagatca gaagttgaac gaacacatct 600
ttccgatcat tcacctccac actgcaacaa cacggtactt cttccgcggc aggtctctgt 660
cgccattctc ttgtcctgtt gttggctgtg agacgaggaa agcaacgaca agtttcacaa 720
aagggagttc ctttaacgag atatgttttt tataaagagt cccaatagaa agacaaattg 780
attcctccgt gcaaacgcgc aaataaacac cacgtccatt atatccatat ctttcagagt 840
atccaacaag tgttgaagga caggtagttg aagtaacgta tcttccccct cgactggatc 900
catcaacaag gcgaacaaat ccattcaacc tctcataaat tatctgattt accaaacc 958
<210> 6
<211> 570
<212> DNA
<213> 硅藻(Diatoma tenue)
<400> 6
atgaccactc ttgacgacac ggcttaccgg taccgcacca gtgtcccggg ggacgccgag 60
gccatcgagg cactggatgg gtccttcacc accgacaccg tcttccgcgt caccgccacc 120
ggggacggct tcaccctgcg ggaggtgccg gtggacccgc ccctgaccaa ggtgttcccc 180
gacgacgaat cggacgacga atcggacgcc ggggaggacg gcgacccgga ctcccggacg 240
ttcgtcgcgt acggggacga cggcgacctg gcgggcttcg tggtcgtctc gtactccggc 300
tggaaccgcc ggctgaccgt cgaggacatc gaggtcgccc cggagcaccg ggggcacggg 360
gtcgggcgcg cgttgatggg gctcgcgacg gagttcgccc gcgagcgggg cgccgggcac 420
ctctggctgg aggtcaccaa cgtcaacgca ccggcgatcc acgcgtaccg gcggatgggg 480
ttcaccctct gcggcctgga caccgccctg tacgacggca ccgcctcgga cggcgagcag 540
gcgctctaca tgagcatgcc ctgcccctga 570
<210> 7
<211> 503
<212> DNA
<213> 硅藻(Diatoma tenue)
<400> 7
atactggatt ggtgaatcaa tgagccgtag cacaatggtt acattcggct agctaagatc 60
caatggcaag gaccaagtgc tggaacttgt tttgctttag cagatcttag cgtgagaggt 120
atttgtcctc tgtcaggagt agatagtaga tgttcttttt aaactaaaat gctaactgtt 180
ccgaattcct catcgcagct aatccgtaca tcaaaagaca aaatgctagg tatgtgtact 240
acatctcctg ttgctagata agacatatga taggaaacac accatcaata gtcattgtag 300
ctttacttat actacgcatt tgcactttcc cctgagtggc agaggcgcat tgagaaaatc 360
gatctcaaca tagtttatgt agcatcccct agatccatta cgttaagtct ccttcgtctt 420
tggtgtaggc atgttggaca caacgaggta aaacacaaca caaacaatgt gtccagcaaa 480
gtagtagctg ctccagttct ccc 503
<210> 8
<211> 693
<212> DNA
<213> 硅藻(Diatoma tenue)
<400> 8
atgaagactt ctgccattgc attgcttgcc gttctcgcca ccactgctgc caccgagccc 60
cgccgattga gaactcttga aggacatggg ggagatcact ccatctccat gtccatgcac 120
agctcgaaag ctgagaagca agccatcgag gcagctgttg aggaggatgt tgctggccct 180
gcaaaggcag ccaagctttt caagcccaaa gcaagcaagg ctggttccat gcctgatgag 240
gccggtgcaa agagtgccaa gatgagcatg gacaccaaga gtggaaagtc ggaggacgca 300
gctgccgtag atgccaaagc ttccaaggaa tctcacatgt ctataagtgg tgatatgagc 360
atggccaagt cacacaaggc cgaggccgag gacgtcactg agatgtccat ggcaaaggcc 420
ggcaaggatg aggcttcaac cgaggatatg tgtatgccct tcgctaaaag tgacaaggaa 480
atgagcgtca aatcgaagca aggaaagacc gagatgagtg tggccgatgc caaggcctca 540
aaggagtcta gcatgccctc ttcgaaggct gccaagatct tcaagggaaa gagtgggaag 600
tccgggagtc tctccatgct caagagtgaa aaggcaagct ccgctcacag cctcagtatg 660
ccaaaagctg agaaggtcca ctccatgagc gct 693
<210> 9
<211> 720
<212> DNA
<213> 硅藻(Diatoma tenue)
<400> 9
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 10
<211> 8300
<212> DNA
<213> 硅藻(Diatoma tenue)
<400> 10
atgaccatga ttacgccaag ctctaatacg actcactata gggaaagctt gcatgccctt 60
aagtccgaga actccccata agtcaacggc tccaatcaag aatgtatccg acaacggcga 120
gcatagcaac acgtccgtct ttggagtaga atcatcatgt tgtggatgaa tacacagatg 180
aatgacatta aaagcatgaa catgttagag agtaggaggt agagattgat atggtagcat 240
tgcgatgttt gtttttggtc agcatatgat gagtggatac caatatgatg aaagttgaat 300
ctcgcgtttg agctcagcgg tacgttattg atcgaaagta gcctgatcaa aatccttgga 360
gagtacaaga ggatcaaaga atccagtggg ggcgataact ccaagctcgt tctcaaagag 420
gcaatggagg tagaaactca tcccagttga gaagaagtga aggcagtggc ggtggcgaaa 480
gcagaggcaa cgaggacaga cttcctgtgg gttgatgcaa cgaatatttc cagaaggaga 540
agtttagaga gttgaaccgc tacctacaat gacaaagtat cgtatcgatt ttgatgttgg 600
ttggttatga attcaaactg taagttggat tgtgagaaga tcagaagttg aacgaacaca 660
tctttccgat cattcacctc cacactgcaa caacacggta cttcttccgc ggcaggtctc 720
tgtcgccatt ctcttgtcct gttgttggct gtgagacgag gaaagcaacg acaagtttca 780
caaaagggag ttcctttaac gagatatgtt ttttataaag agtcccaata gaaagacaaa 840
ttgattcctc cgtgcaaacg cgcaaataaa caccacgtcc attatatcca tatctttcag 900
agtatccaac aagtgttgaa ggacaggtag ttgaagtaac gtatcttccc cctcgactgg 960
atccatcaac aaggcgaaca aatccattca acctctcata aattatctga tttaccaaac 1020
cggcgcgcca tgaccactct tgacgacacg gcttaccggt accgcaccag tgtcccgggg 1080
gacgccgagg ccatcgaggc actggatggg tccttcacca ccgacaccgt cttccgcgtc 1140
accgccaccg gggacggctt caccctgcgg gaggtgccgg tggacccgcc cctgaccaag 1200
gtgttccccg acgacgaatc ggacgacgaa tcggacgccg gggaggacgg cgacccggac 1260
tcccggacgt tcgtcgcgta cggggacgac ggcgacctgg cgggcttcgt ggtcgtctcg 1320
tactccggct ggaaccgccg gctgaccgtc gaggacatcg aggtcgcccc ggagcaccgg 1380
gggcacgggg tcgggcgcgc gttgatgggg ctcgcgacgg agttcgcccg cgagcggggc 1440
gccgggcacc tctggctgga ggtcaccaac gtcaacgcac cggcgatcca cgcgtaccgg 1500
cggatggggt tcaccctctg cggcctggac accgccctgt acgacggcac cgcctcggac 1560
ggcgagcagg cgctctacat gagcatgccc tgcccctgac ctcagcatac tggattggtg 1620
aatcaatgag ccgtagcaca atggttacat tcggctagct aagatccaat ggcaaggacc 1680
aagtgctgga acttgttttg ctttagcaga tcttagcgtg agaggtattt gtcctctgtc 1740
aggagtagat agtagatgtt ctttttaaac taaaatgcta actgttccga attcctcatc 1800
gcagctaatc cgtacatcaa aagacaaaat gctaggtatg tgtactacat ctcctgttgc 1860
tagataagac atatgatagg aaacacacca tcaatagtca ttgtagcttt acttatacta 1920
cgcatttgca ctttcccctg agtggcagag gcgcattgag aaaatcgatc tcaacatagt 1980
ttatgtagca tcccctagat ccattacgtt aagtctcctt cgtctttggt gtaggcatgt 2040
tggacacaac gaggtaaaac acaacacaaa caatgtgtcc agcaaagtag tagctgctcc 2100
agttctcccg cgatcgcggt cgactctaga ggatctacta gtcatatgga ttccgagaac 2160
tccccataag tcaacggctc caatcaagaa tgtatccgac aacggcgagc atagcaacac 2220
gtccgtcttt ggagtagaat catcatgttg tggatgaata cacagatgaa tgacattaaa 2280
agcatgaaca tgttagagag taggaggtag agattgatat ggtagcattg cgatgtttgt 2340
ttttggtcag catatgatga gtggatacca atatgatgaa agttgaatct cgcgtttgag 2400
ctcagcggta cgttattgat cgaaagtagc ctgatcaaaa tccttggaga gtacaagagg 2460
atcaaagaat ccagtggggg cgataactcc aagctcgttc tcaaagaggc aatggaggta 2520
gaaactcatc ccagttgaga agaagtgaag gcagtggcgg tggcgaaagc agaggcaacg 2580
aggacagact tcctgtgggt tgatgcaacg aatatttcca gaaggagaag tttagagagt 2640
tgaaccgcta cctacaatga caaagtatcg tatcgatttt gatgttggtt ggttatgaat 2700
tcaaactgta agttggattg tgagaagatc agaagttgaa cgaacacatc tttccgatca 2760
ttcacctcca cactgcaaca acacggtact tcttccgcgg caggtctctg tcgccattct 2820
cttgtcctgt tgttggctgt gagacgagga aagcaacgac aagtttcaca aaagggagtt 2880
cctttaacga gatatgtttt ttataaagag tcccaataga aagacaaatt gattcctccg 2940
tgcaaacgcg caaataaaca ccacgtccat tatatccata tctttcagag tatccaacaa 3000
gtgttgaagg acaggtagtt gaagtaacgt atcttccccc tcgactggat ccatcaacaa 3060
ggcgaacaaa tccattcaac ctctcataaa ttatctgatt taccaaaccg atatcatgaa 3120
gacttctgcc attgcattgc ttgccgttct cgccaccact gctgccaccg agccccgccg 3180
attgagaact cttgaaggac atgggggaga tcactccatc tccatgtcca tgcacagctc 3240
gaaagctgag aagcaagcca tcgaggcagc tgttgaggag gatgttgctg gccctgcaaa 3300
ggcagccaag cttttcaagc ccaaagcaag caaggctggt tccatgcctg atgaggccgg 3360
tgcaaagagt gccaagatga gcatggacac caagagtgga aagtcggagg acgcagctgc 3420
cgtagatgcc aaagcttcca aggaatctca catgtctata agtggtgata tgagcatggc 3480
caagtcacac aaggccgagg ccgaggacgt cactgagatg tccatggcaa aggccggcaa 3540
ggatgaggct tcaaccgagg atatgtgtat gcccttcgct aaaagtgaca aggaaatgag 3600
cgtcaaatcg aagcaaggaa agaccgagat gagtgtggcc gatgccaagg cctcaaagga 3660
gtctagcatg ccctcttcga aggctgccaa gatcttcaag ggaaagagtg ggaagtccgg 3720
gagtctctcc atgctcaaga gtgaaaaggc aagctccgct cacagcctca gtatgccaaa 3780
agctgagaag gtccactcca tgagcgctct cgagatgatc ccccaaatca cccgttccgt 3840
gctcctcctc ctcatcgtta tggccgcctc cggacaagtt ccctccgact gcctcaagtg 3900
tatctgtttc gtggagtcca cctgtaccat cccatctcct ctctgtcaca tggatgttgg 3960
atctctctct tgcggaccat atcaaatcaa gctcggatac tggcaagatg ctcgtttgaa 4020
gggaggatct ttggatggag attggcaaaa gtgttctgct accttcgact gttccgagcg 4080
tgctgtccaa ggatacatgg ctcgttacgc tacttacgct cgtttggaac acaacccaac 4140
ctgtgaggat tttgctcgta tccacaacgg aggacctaac ggatttaaga acccagctac 4200
tgagaagtac tggctccgtg tgaagaagtg tctcgatatg tctaacaaca cgcctaggac 4260
tctgcagacc gggcccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat 4320
cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga 4380
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc 4440
cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta 4500
ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca 4560
ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt 4620
cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg 4680
caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc 4740
cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg 4800
cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct 4860
gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa 4920
gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga 4980
cgagctgtac aagtaagcgg ccgcatactg gattggtgaa tcaatgagcc gtagcacaat 5040
ggttacattc ggctagctaa gatccaatgg caaggaccaa gtgctggaac ttgttttgct 5100
ttagcagatc ttagcgtgag aggtatttgt cctctgtcag gagtagatag tagatgttct 5160
ttttaaacta aaatgctaac tgttccgaat tcctcatcgc agctaatccg tacatcaaaa 5220
gacaaaatgc taggtatgtg tactacatct cctgttgcta gataagacat atgataggaa 5280
acacaccatc aatagtcatt gtagctttac ttatactacg catttgcact ttcccctgag 5340
tggcagaggc gcattgagaa aatcgatctc aacatagttt atgtagcatc ccctagatcc 5400
attacgttaa gtctccttcg tctttggtgt aggcatgttg gacacaacga ggtaaaacac 5460
aacacaaaca atgtgtccag caaagtagta gctgctccag ttctcccaat cggatccccg 5520
ggtaccgagc tcgaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg 5580
cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga 5640
agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggaaat 5700
tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt 5760
taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg 5820
gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt 5880
caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc 5940
aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg 6000
atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa 6060
aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc 6120
cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 6180
cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 6240
ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 6300
ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 6360
aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 6420
actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 6480
gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 6540
agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 6600
cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 6660
catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 6720
aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 6780
gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 6840
aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 6900
agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 6960
ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc 7020
actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 7080
aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 7140
gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 7200
atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 7260
tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 7320
tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 7380
ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 7440
agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 7500
ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 7560
tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 7620
gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 7680
cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 7740
ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 7800
agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 7860
tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 7920
ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 7980
ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 8040
ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa 8100
accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 8160
ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 8220
ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 8280
atttcacaca ggaaacagct 8300

Claims (6)

1.一种硅藻壳面锚定蛋白表达载体的构建方法，其特征在于此方法包括以下步骤：
（1） 基础质粒的构建：参照序列1构建基础质粒pLJ01；
（2） 功能蛋白基因表达序列设计：根据功能基因序列和硅藻的密码子偏好性，设计适合硅藻表达的功能蛋白基因表达序列；
（3） 硅藻壳面锚定蛋白表达载体的构建：将硅藻特有启动子、相应抗性筛选标记基因和特有终止子按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-1（序列2）位置上，将硅藻特有启动子、锚定蛋白基因序列、功能基因表达序列、荧光筛选标记基因和特有终止子按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-2（序列3）位置上，构建硅藻壳面锚定蛋白表达载体。
2.如权利要求1所述的一种硅藻壳面锚定蛋白表达载体的构建方法，其特征在于：假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）壳面锚定溶菌酶表达载体构建方法，该方法包括以下步骤：
（1） 基础质粒的构建：参照序列1构建基础质粒pLJ01；
（2） 密码子偏好性设计：根据假微型海链藻的密码子偏好性，对原始溶菌酶的基因序列进行改造，在不改变溶菌酶氨基酸序列的基础上设计适合假微型海链藻表达的溶菌酶基因序列（序列4）；
（3） 壳面锚定溶菌酶表达载体的构建：将硅藻特有启动子Tpfcp8 promoter（序列5）、相应抗性筛选标记基因Nourseothricin N-acetyl-transferase gene（序列6）和特有终止子Tpfcp8 terminator（序列7）按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-1位置上；将硅藻特有启动子Tpfcp8 promoter、锚定蛋白基因序列Sil3（序列8）、功能基因表达序列、荧光筛选标记基因EGFP（序列9）和特有终止子Tpfcp8 terminator按顺序插入到pLJ01的多克隆位点-2位置上，获得最终的假微型海链藻壳面锚定溶菌酶表达载体pLJ02（序列10）。
3.一种表达壳面锚定蛋白硅藻的遗传转化方法及鉴定方法，其特征在于：将壳面锚定蛋白表达载体导入受体硅藻中，经筛选和鉴定得到能够表达壳面锚定蛋白的转基因硅藻，包括以下步骤：
（1） 藻细胞的准备：选用生长迅速，稳定性良好的硅藻作为受体藻，用无菌的藻类特定培养基培养至对数生长期；
（2） 硅藻壳面锚定蛋白表达载体的导入：分别采用玻璃珠转化法、基因枪法或电转法将构建好的硅藻壳面锚定蛋白表达载体转入受体硅藻中；
（5） 转化硅藻的筛选与鉴定：采用抗性平板对遗传转化硅藻进行筛选，并进行基因测序和表达产物分析，确定表达壳面锚定蛋白的转基因硅藻藻株。
4.如权利要求3所述的表达壳面锚定蛋白的硅藻的转化方法及鉴定方法，其特征在于选用假微型海链藻作为受体藻，转入壳面锚定溶菌酶表达载体，经筛选和鉴定得到能够表达壳面锚定溶菌酶的转基因硅藻，其具体步骤如下：
（1） 藻细胞的准备：采用假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）作为受体藻，培养基为无菌的f/2培养基，培养器皿为500 mL的锥形瓶，海水经0.22 μm滤膜过滤后高压灭菌，光照周期为12 L:12 D，光照强度为75 μmoLphotons.m-2.s-1，温度为21±1℃，培养至藻细胞数量为2 - 3×106 cells/mL时收集进行遗传转化；
（2） 表达载体的导入：分别采用玻璃珠转化法、基因枪法或电转法将重组表达载体pLJ02转入假微型海链藻中；
（3）表达壳面锚定溶菌酶的假微型海链藻的筛选：重组的假微型海链藻细胞重新涂布于含有诺尔丝菌素（100 - 300 μg/mL）的f/2固体平板上（注：固体平板倒置，光照强度75 μmoLphotons.m-2.s-1，光照周期12 L:12 D，温度21±1℃），待长出单克隆藻落后，挑取单克隆藻落于含有诺尔丝菌素（100 - 300 μg/mL）的f/2培养基中扩大培养；
（4）表达壳面锚定溶菌酶的假微型海链藻的鉴定：
① 荧光观察：利用激光共聚焦显微镜的绿色荧光蛋白相应波长对遗传转化假微型海链藻进行观察；
② 转基因藻的PCR检测：根据溶菌酶序列设计引物F、R；提取野生型假微型海链藻和转基因假微型海链藻的DNA，利用引物F、R进行PCR反应，PCR条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性20 sec，60 ℃退火20 sec，72 ℃延伸30 sec，35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保温，转基因藻PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，显示出435 bp大小的基因片段，说明溶菌酶基因已经整合到假微型海链藻的基因组中；
③ 转基因藻的RT-PCR检测：用RNA提取试剂盒提取转基因假微型海链藻的总RNA，取1μg作为模板，采用反转录试剂盒进行反转录，然后以引物F、R进行RT-PCR扩增，RT-PCR条件：25 ℃，10 min，50 ℃，30 min，85 ℃，5 min，转基因藻PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，显示出435 bp大小的基因片段，表明溶菌酶基因在转录水平上能够成功表达，说明溶菌酶基因能够成功进行自我复制，并且该基因能够在假微型海链藻中转录获得相应的mRNA；
④ 转基因藻的Western-blot检测：提取假微型海链藻的总蛋白，使用Anti-Lysozyme作为一抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG作为二抗进行免疫反应，检测溶菌酶在假微型海链藻中的表达情况，该结果说明溶菌酶基因在假微型海链藻中成功表达，从而在蛋白水平上验证了溶菌酶在假微型海链藻中表达的可行性。
5.如权利要求4所述的表达壳面锚定溶菌酶的假微型海链藻的鉴定，其特征在于：所述的引物序列F为：5'-CAAGTTCCCTCCGACTGCCTCAA-3'，R为：5'-AATCTCCATCCAAAGATCCTCCC-3'。
6.根据权利要求1所述的表达壳面锚定蛋白的硅藻的遗传转化方法所得到的转基因藻可以应用于动物饲料、生物肥料、生物制药、功能食品以及保健品研制等领域。
CN201811078900.2A 2018-09-17 2018-09-17 一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法 Pending CN110904142A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811078900.2A CN110904142A (zh) 2018-09-17 2018-09-17 一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811078900.2A CN110904142A (zh) 2018-09-17 2018-09-17 一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110904142A true CN110904142A (zh) 2020-03-24

Family

ID=69812433

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811078900.2A Pending CN110904142A (zh) 2018-09-17 2018-09-17 一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110904142A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110034671A1 (en) * 2007-09-18 2011-02-10 Johan R Lillehaug Systems for Expression of Heterologous Proteins in M. Capsulatus
WO2013063388A1 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 The Regents Of The University Of California Diatom-based vaccines

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110034671A1 (en) * 2007-09-18 2011-02-10 Johan R Lillehaug Systems for Expression of Heterologous Proteins in M. Capsulatus
WO2013063388A1 (en) * 2011-10-28 2013-05-02 The Regents Of The University Of California Diatom-based vaccines

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: AB849918.1: "Shuttle vector pTha-K1 DNA, complete sequence", 《NCBI》 *
KATHRYN E. MARSHALL等: "FRET Imaging of Diatoms Expressing a Biosilica-Localized Ribose Sensor", 《PLOS ONE》 *
NICOLE POULSEN等: "Silica Immobilization of an Enzyme through Genetic Engineering of the Diatom Thalassiosira pseudonana", 《SILICA BIOTECHNOLOGY》 *
YOSHIAKI MAEDA: "Peptide-mediated microalgae harvesting method for efficient biofuel production", 《BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100540667C (zh) 利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组人血清白蛋白
CN110117551B (zh) 生产瓦伦西亚烯的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
KR101229418B1 (ko) 활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법
CN113046355B (zh) 一种中温原核Argonaute蛋白PbAgo表征及应用
CN110438053B (zh) 一种适用于聚球藻的生物封存系统、构建方法及应用
CN112877351A (zh) 一种用于防治新冠病毒感染的重组质粒、重组乳酸杆菌表达系统及其应用
CN113308482B (zh) 云南腾冲来源四氢嘧啶合成基因簇及其应用
CN110184292B (zh) 一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法
CN112266935A (zh) 一种人iPS细胞基因编辑和筛选方法
CN112646833A (zh) 一种全人源抗体酵母展示技术的设计与构建
CN108277208B (zh) 携带绿色荧光蛋白以及转铁蛋白的水疱性口炎病毒感染性克隆及制备方法和应用
CN110938648B (zh) 一种真菌分泌表达载体、构建方法及其应用
CN109872774B (zh) 一种基于yess分析原核生物中蛋白相互作用的方法
CN111088204A (zh) 表达Caspase-3重组scFv78的重组大肠杆菌及其功能验证方法
CN111088209B (zh) 一种产1,4-丁二醇的重组丁醇梭菌及其构建方法与应用
CN110904142A (zh) 一种表达壳面锚定蛋白硅藻的构建技术与应用方法
CN109735558B (zh) 一种重组car19-il24基因、慢病毒载体、car19-il24-t细胞及应用
CN114277190A (zh) 一种hiPSC中外源基因残留检测用特异性DNA片段、引物、试剂盒和检测方法
CN111909945B (zh) 一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法
CN111909850B (zh) 基于杜氏盐藻代谢途径和夏侧金盏花cbfd与hbfd的产虾青素工程菌及其构建与应用
CN107142259A (zh) 一种表达外源基因的启动子及其应用
CN112180087B (zh) 检测鸭疫里默氏杆菌抗体的elisa方法及其试剂盒和应用
CN115161294B (zh) 新城疫疫苗株及其构建方法、禽类免疫识别方法、应用
CN110679606B (zh) dsRNA及其在防治埃及伊蚊中的应用
CN103995121A (zh) 基于单链抗体的金标试纸的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200324