JP2014532402A - 構築物 - Google Patents

Abstract

本発明は、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列を含む構築物であって、それらが、融合タンパク質ＴＨ−ＣＨ１をコードするように、ＴＨをコードするヌクレオチド配列が、ＣＨ１をコードするヌクレオチド配列に対して連結される、構築物を提供する。本発明はまた、そのようなヌクレオチド配列を含むウイルスベクターならびにパーキンソン病の治療および／または予防におけるその使用もまた、提供する。

Description

本発明は、ドーパミン合成経路に関与する酵素活性をコードするヌクレオチド配列を含む構築物に関する。少なくとも２つのヌクレオチド配列は、それらが、融合タンパク質をコードするように、作動可能に連結される。本発明はまた、そのようなヌクレオチド配列を含むウイルスベクターゲノム、ベクター産生系、およびウイルスベクター粒子を提供する。たとえば、ウイルスベクター粒子を使用する遺伝子療法による、インビボにおけるヌクレオチド配列の発現は、パーキンソン病などのような、ドーパミン産生ニューロンの低下または損失によって特徴づけられる神経障害の治療および／または予防において有用であるドーパミン合成を引き起こす。

パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの損失によって特徴づけられる神経変性障害である。これは、最終的に、線条体におけるドーパミン枯渇をもたらし、重度の運動障害を引き起こす。パーキンソン病の１つの治療は、ドーパミンの前駆物質であるＬ−ドパの経口投与であり、これにより、ある程度の運動機能を回復させることができる。しかしながら、疾患が進行するにつれて、Ｌ−ドパ療法は、運動障害の治療においてそれほど有効でなくなってしまい、より高用量の使用が必要とされ、これは、重度の副作用を有する。

ＰＤの治療の改善は、線条体に直接ドーパミンを放出することによって実現することができるかもしれない。これは、遺伝子療法によって実現されてもよい。特定のタンパク質産生が、線条体などのような、ＣＮＳの特定のエリアを標的にすることができるので、遺伝子療法は、ＰＤの治療にとって魅力的である。アミノ酸チロシンからのドーパミンの合成は、チロシンからのＬ−ドパの合成を触媒する酵素チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）およびＬ−ドパをドーパミンに変換する芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を伴う。ＴＨステップは、律速であると考えられる。ＴＨは、機能するために補因子、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ_４）を必要とし、この合成は、酵素ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＣＨ−１）によって触媒される。

ドーパミン生合成経路由来の単一の遺伝子を送達するためにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用する遺伝子療法アプローチは、ＰＤ動物モデルにおけるいくつかの行動上の有益性により調査された（非特許文献１；非特許文献２）。さらなるアプローチは、ドーパミン合成を媒介する２つ以上の酵素の同時の送達が、ＰＤの動物モデルにおいてより大きな効能を実証したことを示した（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。

これは、３つすべてのドーパミン合成酵素を、一緒に、同じ細胞において発現することができた場合に、ドーパミン合成が、より大きなものとなり、ＰＤにおけるより大きな効能に至るであろうという理論をもたらした。しかしながら、ＡＡＶベクターの限られたパッケージ容量により、送達することができる遺伝子の数は、限られる。したがって、レンチウイルスベクター（ＬＶ）のパッケージ容量が、はるかに大きいので、これらのベクターをこの目的に使用することが決定された。レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、ニューロンなどのような非分裂細胞型を安定して形質導入するそれらの能力のために、中枢神経系（ＣＮＳ）に対する遺伝子療法アプローチにとって特に有利である。ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）などのようなヒトに対して感染性であるまたは病原性であることが知られていない非霊長動物レンチウイルスに由来するＬＶは、開発され、非分裂細胞を形質導入するためのそれらの能力について確立されてきた。ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）は、ＰＤの治療のための、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベースのＬＶである。ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）のゲノムは、２つの配列内リボソーム進入部位（internal ribosome entry site）（ＩＲＥＳ）によって作動可能に連結された、３つの重要なドーパミン生合成酵素、ＴＨ、ＡＡＤＣ、およびＣＨ１についてのコード配列を含むトリシストロン（ｔｒｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）構築物である。ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の、３つのプラスミドによる、一過性の同時トランスフェクションを含むプロセスにおいて生成されたベクター材料を用いるフェーズＩ／ＩＩ臨床試験において、現在、評価中である（非特許文献６）。

あらゆる遺伝子療法アプローチの目標は、ベクターの力価を増加させることであり、その結果として、より低容量のベクター調製物が、使用され得る。これは、低容量の使用を要する、ベクターが脳に直接注射される、ＰｒｏＳａｖｉｎ（登録商標）型の治療において、特に望ましい結果である。

ＩＲＥＳエレメントの複雑な二次構造は、効率的な逆転写にとって障害として作用するかもしれない。そのため、本発明者らは、ＩＲＥＳエレメントの除去が、ベクターの力価を増加させるはずであると仮定した。１つの選択肢は、ＩＲＥＳエレメントを、短いペプチド配列（リンカー）をコードする配列と交換し、ドーパミン合成に必要な３つの酵素活性のうちの２つ以上を含む融合タンパク質を生成することであろう。しかしながら、ＴＨの天然の形態が、ホモ四量体として存在し（非特許文献７）、ＣＨ１の天然の形態が、ホモ十量体として存在するので（非特許文献８；非特許文献９）、互いのまたはＡＡＤＣなどのような他の酵素とのこれらの酵素の融合は、酵素の正確な三次構造形成を妨げるかもしれず、次いで、これにより、酵素機能が阻害されるまたはそれらが最大の能力で機能するのを妨げられるかもしれない。これを支持するものであるが、ＴＨおよびβ−ガラクトシダーゼの間の融合物は、酵素的に不活性であることが、以前に報告された（非特許文献１０）。

驚いたことに、本発明者らは、２つまたは３つすべてのドーパミン合成酵素の融合が、ｉ）機能的な酵素；ならびにｉｉ）Ｌ−ドパおよび／またはドーパミン産生のレベルの上昇をもたらす、いくつかの構築物についての、ドーパミン生合成経路の増強をもたらすということを発見した。特に、ドーパミン産生の増強は、ＩＲＥＳ配列によって分離されるドーパミン合成酵素をコードする３つすべての遺伝子を有する構築物を使用して得られるレベルと比較した場合に、いくつかの構築物について観察された。期待に反して、多くの構築物について、これらの融合体デザインから結果として生じる改善は、ベクター力価における増加と関連せず、ＩＲＥＳ配列が、力価に対して阻害効果を有していなかったことを示した。さらに、Ｌ−ドパおよびドーパミンのレベルの増加は、融合体デザインベクターからのタンパク質発現における増加によるものではなく、融合体デザインにより、より高い比活性が得られたことを示唆する。

Ｌｅｆｆら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）９２、１８５〜１９６ Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ（２００６）１４、５６４〜５７０ Ｆａｎら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（１９９８）９、２５２７〜２５３５ Ｓｈｅｎら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２０００）１１、１５０９〜１５１９ Ｍｕｒａｍａｔｓｕら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（２００２）１３、３４５〜３５４ Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ（１９９９）６、１８０８〜１８１８ Ｇｏｏｄｗｉｌｌら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ（１９９７）４、５７８〜５８５ Ｎａｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９５）３、４５９〜４６６ Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９８）２７９、１８９〜１９９ ＷｕおよびＣｅｐｋｏ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９４）６２：８６３〜７２

本発明者らは、３つの遺伝子のうちの少なくとも２つの遺伝子の融合物を含む、ドーパミン合成酵素チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を含む多くの構築物について試験した。この研究の結果として、２つの明確な事柄が、出現した：
（ｉ）その順で（つまりＴＨ−ＣＨ１融合タンパク質を形成する）、ＣＨ１に対して連結されたＴＨを有する構築物が、高い絶対的なレベルのカテコールアミン産生を示し、
（ｉｉ）いずれかの順で（つまりＡＡＤＣ−ＴＨまたはＴＨ−ＡＡＤＣ融合タンパク質を形成する）連結されたＡＡＤＣおよびＴＨを有する構築物が、Ｌ−ドパの、ドーパミンへの非常に効率的な変換を示す。そのような構築物と関連する、ドーパミン：Ｌ−ドパの比は、高い。

本発明の第１の態様の第１の実施形態において、本発明は、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列を含む構築物であって、それらが、融合タンパク質ＴＨ−ＣＨ１をコードするように、ＴＨをコードするヌクレオチド配列が、ＣＨ１をコードするヌクレオチド配列に対して連結される、構築物を提供する。

構築物は、以下から選択されてもよい：
ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_{−ＩＲＥＳ−}ＡＡＤＣ、
ＡＡＤＣ_−Ｌ−ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１、
ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_−Ｌ−ＡＡＤＣ、および
ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_−Ｐ−ＡＡＤＣ
Ｌ＝リンカーコード配列
ＩＲＥＳ＝配列内リボソーム進入部位
Ｐ＝プロモーター
構築物は、ＴＨ−ＣＨ１融合タンパク質の翻訳を開始するために、ＴＨ−ＣＨ１コード配列の上流にＩＲＥＳを含まなくてもよい。

本発明の第１の態様の第２の実施形態において、本発明は、（ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列を含む構築物であって、それらが、ＡＡＤＣ−ＴＨまたはＴＨ−ＡＡＤＣ融合タンパク質をコードするように、ＡＡＤＣをコードするヌクレオチド配列が、ＴＨをコードするヌクレオチド配列に対して作動可能に連結される、構築物を提供する。

構築物は、以下から選択されてもよい：
ＴＨ_−Ｌ−ＡＡＤＣ_{−ＩＲＥＳ−}ＣＨ１
ＡＡＤＣ_−Ｌ−ＴＨ_{−ＩＲＥＳ−}ＣＨ１
ＡＡＤＣ_−Ｌ−ＴＨ１_−Ｌ−ＣＨ１
ＴＨ１_−Ｌ−ＡＡＤＣ_−Ｌ−ＣＨ１
Ｌ＝リンカーコード配列
ＩＲＥＳ＝配列内リボソーム進入部位 。

構築物は、ヒトの使用頻度についてコドン最適化されていないリンカーを含んでいてもよい。

構築物は、配列番号１として示される配列または配列番号３として示される配列を含むリンカーを含んでいてもよい。

構築物は、配列ＡＡＤＣ_−Ｌ１−ＴＨ_−Ｌ２−ＣＨ１またはＴＨ_−Ｌ１−ＡＡＤＣ_−Ｌ２−ＣＨ１を有していてもよく、Ｌ１およびＬ２が、２つの異なるリンカー配列である。Ｌ１およびＬ２の核酸配列は、異なっていてもよいが、Ｌ１およびＬ２のアミノ酸配列は、同じであってもよい。その代わりに、Ｌ１およびＬ２は、同じヌクレオチド配列を有していてもよい。

Ｌ１およびＬ２は、配列番号１または配列番号３から選択されてもよい。

構築物が、プロモーターを含む場合、プロモーターは、たとえば、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターであってもよい。構成的プロモーターの例は、ＣＭＶプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、およびチミジンキナーゼプロモーターを含む。

第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様による構築物を含むウイルスベクターゲノムを提供する。

ウイルスベクターゲノムは、たとえば、レンチウイルスベクターゲノムまたはアデノ随伴ウイルスベクターゲノムであってもよい。

第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様によるゲノムを含むウイルスベクター系を提供する。

ウイルスベクター系は、たとえば、レンチウイルスベクター系またはアデノ随伴ウイルスベクター系であってもよい。

レンチウイルスベクター系は、
（ｉ）本発明の第２の態様によるゲノム、
（ｉｉ）ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）ｉｉ）のヌクレオチド配列によってコードされない、他の不可欠なウイルスパッケージング構成成分をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。

第４の態様において、本発明は、レンチウイルス粒子を産生するための方法であって、産生細胞の中に、
ｉ）本発明の第２の態様によるゲノム、
ｉｉ）ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列、ならびに
ｉｉｉ）ｉｉ）のヌクレオチド配列のうちの１つまたはそれより多くによってコードされない、他の不可欠なウイルスパッケージング構成成分をコードするヌクレオチド配列を導入するステップを包含する、方法を提供する。

第５の態様において、本発明は、本発明の第３の態様の系または本発明の第４の態様の方法によって産生されるウイルス粒子であって、ドーパミン合成酵素ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、および芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするＮＯＩを含み、これらのうちの少なくとも２つが、融合タンパク質として存在する、ウイルス粒子を提供する。

ＥＩＡＶベクター粒子であり、ＶＳＶ−Ｇによりシュードタイプされた、本発明の第５の態様によるウイルスベクター粒子もまた、提供される。

第６の態様において、本発明は、薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤と一緒に、本発明の第５の態様によるウイルス粒子を含む薬学的組成物を提供する。

第７の態様において、本発明は、インビボにおいてドーパミンを産生するための方法であって、本発明の第１の態様による構築物から、被験体において、ドーパミン合成酵素ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、および芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を発現させるステップを包含する、方法を提供する。

第８の態様において、本発明は、神経変性疾患またはドーパミンレベルが被験体において低下している疾患を治療するおよび／または予防する方法であって、被験体に対して、本発明の第５の態様によるウイルス粒子または本発明の第６の態様による薬学的組成物を投与するステップを包含する、方法を提供する。

第９の態様において、本発明は、ドーパミン合成をインビボにおいて誘発することによって、被験体において神経変性疾患を治療するおよび／または予防するのに使用するための、本発明の第５の態様によるウイルス粒子または本発明の第６の態様による薬学的組成物を提供する。

神経変性疾患は、パーキンソン病であってもよい。ドーパミンレベルが低下している疾患は、レッシュ−ナイハン症状群によるものであってもよい。

第１０の態様において、本発明は、配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するリンカーをコードするヌクレオチド配列を提供するが、このヌクレオチド配列は、配列番号３において示されるものと異なる配列を有する。

ヌクレオチド配列は、コドンペアＧＧＡ ＧＧＣを欠いていてもよい。

ヌクレオチド配列は、配列番号１として示される配列を含んでいてもよい。

図１は、ドーパミン酵素融合物をコードするゲノムの略図を示す図である。 図２は、ｐＯＮＹＫ−ＴＡｉＣからのベクター産生およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、組み込みされたベクターからのカテコールアミン産生を示す図である。ａ）ベクター力価を評価するためのＤＮＡ組み込みアッセイからの結果。ｂ）カテコールアミン産生を評価するためのＨＰＬＣ分析からの結果。 図３は、ベクターおよびカテコールアミン産生を示す図である。ａ）ベクター力価を評価するためのＤＮＡ組み込みアッセイからの結果。ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における産生を評価するためのＨＰＬＣ分析からの結果。 図４は、ウエスタンブロット分析によるドーパミン作動性経路におけるタンパク質の検出を示す図である。 図５は、ベクターおよび５つの融合構築物からのカテコールアミン産生を示す図である。ａ）ベクター力価を評価するためのＤＮＡ組み込みアッセイからの結果。ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるカテコールアミン産生を評価するためのＨＰＬＣ分析からの結果。 図６は、ウエスタンブロット分析によるドーパミン作動性経路におけるタンパク質の検出を示す図である。ａ）ＴＨの発現を検査するためのウェスタンブロッティング分析。ｂ）ＣＨ１の発現を検査するためのウェスタンブロッティング分析。ｃ）ＡＡＤＣの発現を検査するためのウェスタンブロッティング分析。 図６は、ウエスタンブロット分析によるドーパミン作動性経路におけるタンパク質の検出を示す図である。ａ）ＴＨの発現を検査するためのウェスタンブロッティング分析。ｂ）ＣＨ１の発現を検査するためのウェスタンブロッティング分析。ｃ）ＡＡＤＣの発現を検査するためのウェスタンブロッティング分析。 図７は、ＧＳ１５リンカーを介してのＡＡＤＣに対するＴＨの切断型バージョンの連結を示す図である。 図８は、ウエスタンブロット分析による、ＨＥＫ２９３Ｔ形質導入細胞からのドーパミン作動性経路におけるタンパク質の検出を示す図である。ａ）ＴＨの発現を検査するためのウェスタンブロッティング分析。ｂ）ＣＨ１の発現を検査するためのウェスタンブロッティング分析。ｃ）ＡＡＤＣの発現を検査するためのウェスタンブロッティング分析。^＊ＣＨ１に融合されたＴＨについての正確なバンドサイズは、６８ｋＤａであり、これらのレーンにおいてバンドを見ることができるが、このサイズに、他のすべてのレーンにおいて、非特異的なバンドがある。しかしながら、これらのバンドは、非特異的バンドよりも強度が濃い。 図９は、非濃縮および濃縮融合ベクター調製物のベクター力価を評価するためのＤＮＡ組み込みアッセイからの結果を示す図である。 図１０は、ＭＯＩ １でＥＩＡＶベクターにより形質導入された線条体ニューロンを示す図である。ａ）ＥＩＡＶ−ＧＦＰ形質導入線条体ニューロン（ＭＯＩ １）。ｂ）ベクターにより形質導入された線条体ニューロンからのカテコールアミン産生。 図１１は、ＴＣｉＡｍｏｄからのベクター産生および組み込みされたベクターからのカテコールアミン産生を示す図である。ａ）ベクター力価を評価するためのＤＮＡ組み込みアッセイからの結果。ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのカテコールアミン産生を評価するためのＨＰＬＣ分析からの結果。 図１２は、ｐＯＮＹＫ１、融合物、およびＧＦＰベクターによるヒト初代皮質ニューロンの形質導入を示す図である。ａ）ＭＯＩ ２および１０で、ＥＩＡＶ−ＧＦＰベクターにより形質導入されたヒト初代皮質ニューロンの画像。ｂ）ＭＯＩ ０．４で、ＥＩＡＶベクターにより形質導入されたヒト初代皮質ニューロンからのカテコールアミン産生（ＧＦＰバックグラウンドレベルを引く）−収集１（形質導入の５日後）。 図１３は、ウエスタンブロット分析による、形質導入されたヒト皮質ニューロンからのドーパミン合成酵素の検出を示す図である。ａ）ＴＨの発現を検査するためのウェスタンブロッティング分析。ｂ）ＡＡＤＣの発現を検査するためのウェスタンブロッティング分析。 図１４は、１日目の定位ベクター投与後の臨床評価スコア（最高１４）を示す図である。 図１５は、ベースライン時の（Ｂａｓｅｌｉｎｅ）、ＭＰＴＰ病変後の（ＭＰＴＰ）、および最後に、ＯＸＢ−１０２ベクター投与の３か月後の（ＭＰＴＰ ３Ｍ ＰＩ）、カニクイザルマカクの脳のＰＥＴ画像を示す図である。動物は、放射性トレーサー^１８Ｆ−ＦＭＴ（１８Ｆ−ＦＭＴｙｒ）および^１８Ｆ−ファリプリド（１８Ｆ−ファリプリド）により、別個の機会に治療された。

構築物
本発明の第１の態様は、構築物に関する。

ヌクレオチド配列は、それぞれが酵素活性をコードする、３つの関心のあるヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を含む。

構築物は、たとえば合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、組換えＲＮＡ／ＤＮＡ配列（つまり、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製される）、ｃＤＮＡ配列、または部分的なゲノムＤＮＡ配列などのようなＤＮＡまたはＲＮＡ配列であってもよく、その組み合わせを含む。

本発明はまた、本発明の構築物を含む、プラスミドなどのようなベクターを包含する。
ＮＯＩ
構築物におけるそれぞれのＮＯＩは、ドーパミン合成に関与する酵素をコードする。ＮＯＩは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）、および芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードする。

３つの酵素すべての配列は、入手可能である：それぞれ、受入番号Ｘ０５２９０、Ｕ１９５２３、およびＭ７６１８０。

ＮＯＩは、ドーパミン合成酵素のすべてまたは一部をコードしてもよい。たとえば、ＮＯＩは、酵素活性を保持する、タンパク質の切断型バージョンをコードしてもよい。

完全長ＴＨは、触媒ドメイン、四量体化ドメイン、およびＮ−末端調節ドメインを含む。本発明のベクターのＴＨコードＮＯＩは、触媒および四量体化ドメインを含有するが、機能的なＮ−末端調節ドメインを欠く切断型ＴＨをコードしてもよい。

ＴＨのこの形態は、完全長酵素の活性を制限し得る、ドーパミンによるフィードバック阻害を回避する。

ＮＯＩは、ドーパミン合成酵素の突然変異体、ホモログ、または変異体をコードしてもよい。

用語「突然変異体」は、野生型配列からの１つ以上のアミノ酸変異を含む酵素を含む。たとえば、突然変異体は、１つ以上のアミノ酸追加、欠失、または置換を含んでいてもよい。突然変異体は、天然に生じてもよく、または人工的に（たとえば部位特異的突然変異誘発によって）作り出されてもよい。

ここで、用語「ホモログ」は、ドーパミン合成酵素と、ある程度の相同性を有するタンパク質を意味する。ここで、用語「相同性」は、「同一性」と同等と考えることができる。

本発明の文脈において、相同な配列は、アミノ酸またはヌクレオチドレベルで、対象の配列に対して少なくとも７５、８５、もしくは９０％同一または少なくとも９５もしくは９８％同一であってもよい。典型的に、ホモログは、対象の配列と同じ活性部位などを含むまたはコードするであろう。同一性の比較は、たとえば、ＢＬＡＳＴソフトウェアを使用して、行われてもよい。

ＮＯＩは、コドン最適化されてもよい。

リンカー
本発明のレンチウイルスベクターゲノムは、ドーパミン合成酵素をコードする３つのＮＯＩを含む。ＮＯＩのうちの少なくとも２つは、リンカーコード配列（Ｌ）によってつながれ、その結果として、ゲノムは、酵素アミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする。

適したリンカーは、グリシン−セリンリピートなどのようなアミノ酸リピートを含んでいてもよい。リンカーの目的は、酵素の正確な形成および／または機能化を可能にすることである。それは、その目的を実現するために、十分に可動性があり、かつ十分に長いものであるべきである。ＮＯＩが異なる酵素をコードするので、両方の酵素の機能化を可能にするためにリンカーを選ぶ必要がある。可動性リンカーのコード配列は、それが、翻訳の休止を促し、そのため、ＮＯＩのタンパク質産物の独立したフォールディングを促すように選ばれてもよい。

当業者は、本発明のヌクレオチド配列において使用するのに適したリンカーをコードする配列をデザインすることができるであろう。適したリンカーのいくつかの特定の例は、下記に示されるが、本発明は、これらの特定のリンカーに限定されない。

１．Ｓｏｍｉａら、１９９３ ＰＮＡＳ ９０、７８８９において記載される（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_３
２．（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_５
３．酵母のＨＳＦ−１由来の（Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ）、Ｗｉｅｄｅｒｒｅｃｈｔら、１９８８ Ｃｅｌｌ ５４、８４１を参照されたい。

４．ＰＯＵ特異的ＯＣＴ−１由来の（Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ）、Ｄｅｋｋｅｒら、１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６２およびＳｔｕｒｍら、１９８８ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．２，１５８２を参照されたい。

５．ＲＧＤ含有ラミニンペプチド由来の（Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＧｌｎＧｌｙ）、Ａｕｍａｉｌｌｙら、１９９０ ＦＥＥＳ Ｌｅｔｔ．２６２、８２を参照されたい。

６．ＬＤＶ含有リンカー由来の（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）、Ｗｉｃｋｈａｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９９５ ２、７５０を参照されたい。

以下のＧＳ１５可動性リンカーが、使用されてもよい：（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_３。ＧＳ５、ＧＳ１５、およびＧＳ３０リンカーもまた、適していてもよい。

２つのリンカーを含む、つまり、３つの酵素がすべて、連結されて、１つの融合タンパク質として発現される構築物において、２つの同一ではないリンカーをコードする配列が、選ばれてもよい、その代わりに、リンカー配列は、同一であってもよい。リンカー配列は、アミノ酸レベルで同一であってもよいが、それらのコード核酸配列は、遺伝子コードにおける縮重により異なっていてもよい。

下記の実施例において示されるように、ＴＨおよびＣＨ１遺伝子の間の修飾ＧＳ１５リンカーコード配列（ＧＳ１５ｍｏｄ）の使用は、タンパク質発現における増加についての証拠がないにもかかわらず、両方の構築物で、カテコールアミン産生における増加をもたらした。

本発明のヌクレオチド配列において使用されるリンカーコード配列は、ヒト使用頻度についてコドン最適化されていない、ＧＳ５、ＧＳ１５、およびＧＳ３０をコードするものなどのようなリンカーコード配列の修飾形態であってもよい。

リンカーコード配列は、以下の配列を含んでいてもよい。

ＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＣＴＣＣ（配列番号１） 。

本発明の第１０の態様は、配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するが、そのヌクレオチド配列が、配列番号３において示されるものと異なる配列を有するリンカーをコードするヌクレオチド配列に関する。

（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_３（配列番号２）
ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣ（配列番号３） 。

構築物は、配列番号１（上記）として示される配列を含んでいてもよい。

ＩＲＥＳ
ｍＲＮＡにおけるオープンリーディングフレームの間に位置する場合、ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳエレメントでのリボソームの侵入、その後に続く、下流の翻訳の開始を促進することによって、下流のオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。レトロウイルスベクターにおけるＩＲＥＳエレメントの使用について、調査されている（たとえば国際公開第９３／０３１４号パンフレットを参照されたい）。レンチウイルスベクターにおいて使用するための、適したＩＲＥＳ配列は、国際公開第０２／２９０６５号パンフレットにおいて記載される。

プロモーター
ＩＲＥＳは、とりわけ、ＡＡＤＣ遺伝子の発現をコントロールするために、プロモーターと交換されてもよい。ＡＡＤＣ発現がＩＲＥＳのコントロール下にある配置において、ＡＡＤＣレベルは、ドーパミン産生を制限し得る。

ＮＯＩの発現は、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを含むコントロール配列を使用して、コントロールされてもよい。原核生物プロモーターおよび真核生物細胞において機能的なプロモーターが、使用されてもよい。組織特異的または刺激特異的プロモーターが、使用されてもよい。２つ以上の異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターもまた、使用されてもよい。

適した促進配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのようなウイルスのゲノムまたはアクチンプロモーターもしくはリボソームタンパク質プロモーターなどのような哺乳動物細胞のプロモーターに由来するものを含む、強力なプロモーターである。遺伝子の転写は、エンハンサー配列をベクターの中に挿入することによってさらに増加させてもよい。エンハンサーは、方向および位置について比較的非依存性であるが、複製開始点の後期の側（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサーおよびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーなどのような真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いてもよい。エンハンサーは、プロモーターに対して５’または３’の位置でベクターにつながれてもよいが、好ましくは、プロモーターから５’の部位に位置する。

プロモーターは、そのうえ、適した宿主における発現を確実にするまたは増加させるための特徴を含むことができる。たとえば、特徴は、保存領域、たとえばプリブノーボックスまたはＴＡＴＡボックスとすることができる。プロモーターは、ヌクレオチド配列の発現のレベルに影響を与えるように（維持する、増強する、減少させるようになど）他の配列をさらに含有してもよい。適した他の配列は、Ｓｈ１−イントロンまたはＡＤＨイントロンを含む。他の配列は、温度、化学物質、光、またはストレス誘発性エレメントなどのような誘発性エレメントを含む。また、転写または翻訳を増強するための適したエレメントが、存在してもよい。

プロモーターは、たとえば、構成的または組織特異的であってもよい。

構成的プロモーター
適した構成的プロモーターの例は、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターを含む。

組織特異的プロモーター
適した組織特異的プロモーターの例は、シナプシン１、エノラーゼ、α−カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ、およびＧＦＡＰを含む。

融合物
本発明の構築物は、ＴＨ、ＡＡＤＣ、およびＣＨ１をコードするＮＯＩを含む。３つのうちの２つまたは３つすべての酵素が、たとえば、可動性リンカーを使用することによって、融合されてもよい。２つの酵素が融合される場合、第３の酵素をコードするＮＯＩは、たとえばＩＲＥＳによって、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して作動可能に連結されてもよい。ＩＲＥＳは、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して５’または３’に位置してもよい。その代わりに、第３の酵素をコードするＮＯＩは、プロモーターに対して適切に作用するように連結されてもよい。

本発明者らは、（ｉ）その順で（つまりＴＨ−ＣＨ１融合タンパク質を形成する）、ＣＨ１に対して連結されたＴＨを有する構築物が、高い絶対的なレベルのカテコールアミン産生を示し、
（ｉｉ）いずれかの順で（つまりＡＡＤＣ−ＴＨまたはＴＨ−ＡＡＤＣ融合タンパク質を形成する）連結されたＡＡＤＣおよびＴＨを有する構築物が、Ｌ−ドパの、ドーパミンへの非常に効率的な変換を示すことを発見した。

それぞれの構築物により産生されるタンパク質（つまり酵素）の量を考慮することは重要である。いくつかの構築物について、産生されるタンパク質の絶対的なレベルは、低かったが、Ｌ−ドパおよび／またはドーパミンのレベルは、比較的高かった。これは、より低い量の酵素が、同等の量のＬ−ドパ／ドーパミンをもたらしているので、その特定の配置をした酵素の効率が高いことを示す。

表１は、ニューロン細胞の形質導入後の、それぞれの構築物についての総カテコールアミン産生量を示す。構築物は、総カテコールアミン産生量に従って並べる。同じ実験におけるｐＯＮＹＫ１についてのカテコールアミン産生量を、括弧中に示す。

表２は、ニューロン細胞の形質導入後の、それぞれの構築物についてのドーパミン：Ｌ−ドパ比を示す。構築物は、ドーパミン：Ｌ−ドパ比に従って並べる。同じ実験におけるｐＯＮＹＫ１についてのドーパミン：Ｌ−ドパ比を、括弧中に示す。

＊バックグラウンドレベルに対する補正の後のｐＯＮＹＫ１について、検出可能なＬ−ドパはない。

構築物ＣＴｉＡは、性能の改善を示さない。

理論によって束縛されることを望むものではないが、発明者らは、ＴＣｉＡが性能の改善を示したが、ＣＴｉＡは示さなかった理由が、ＴＣ融合物における酵素の順が重要であるからであると考える。そのため、本発明の構築物は、ＣＴではなく、ＴＣの順をした、ＴＨおよびＣＨ１の融合物をコードしてもよい。

構築物は、以下から選択されてもよい：
ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_{−ＩＲＥＳ−}ＡＡＤＣ、
ＡＡＤＣ_−Ｌ−ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１、
ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_−Ｌ−ＡＡＤＣ、および
ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_−Ｐ−ＡＡＤＣ
ＴＨ_−Ｌ−ＡＡＤＣ_{−ＩＲＥＳ−}ＣＨ１
ＡＡＤＣ_−Ｌ−ＴＨ_{−ＩＲＥＳ−}ＣＨ１
ＴＨ１_−Ｌ−ＡＡＤＣ_−Ｌ−ＣＨ１
Ｌ＝リンカーコード配列
ＩＲＥＳ＝配列内リボソーム進入部位
Ｐ＝プロモーター 。

上記に言及されるように、ＴＨは、触媒ドメイン、四量体化ドメイン、およびＮ−末端調節ドメインを含む。

ＴＨコードＮＯＩは、触媒および四量体化ドメインを含有するが、機能的なＮ−末端調節ドメインを欠く切断型ＴＨをコードしてもよい。

図７は、ＴＨの切断型バージョンのＣ−末端が、ＡＡＤＣのＮ−末端に対して、ＧＳ１５リンカーを介して融合される構築物の配列を示す。

その代わりに、ＣＨ１は、そのＮ末端を介して融合され、そのＣ−末端はフリーのままであってもよい。

ウイルスベクター
本発明はまた、本発明の第１の態様によるヌクレオチド配列を含む、レンチウイルスベクターゲノムまたはアデノ随伴ウイルスベクターゲノムなどのようなウイルスベクターゲノムを提供する。本発明はまた、そのようなゲノムを含むウイルスベクター産生系およびベクター粒子を提供する。

本発明のウイルスベクターは、任意の適したウイルスから誘導されてもよいまたは誘導可能であってもよい。組換えウイルス粒子は、関心のあるヌクレオチド配列（ＮＯＩ）を標的細胞に形質導入することができる。

レトロウイルス粒子については、一度だけ、細胞内で、ベクター粒子由来のＲＮＡゲノムは、ＤＮＡに逆転写され、標的細胞のゲノムの中に組み込みされる。

レンチウイルスベクター
レンチウイルスは、より大きなグループであるレトロウイルスの一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら（１９９７）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ７５８−７６３）において見つけられてもよい。手短に言えば、レンチウイルスは、霊長動物および非霊長動物のグループに分けることができる。霊長動物レンチウイルスの例は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因病原体であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含むが、これらに限定されない。非霊長動物レンチウイルスグループは、原型「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を含む。

レンチウイルスは、レンチウイルスが、分裂および非分裂細胞に感染する能力を有する点で、レトロウイルスファミリーの他のメンバーと異なる（Ｌｅｗｉｓら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ １１（８）：３０５３−３０５８）およびＬｅｗｉｓ ａｎｄ Ｅｍｅｒｍａｎ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（１）：５１０−５１６）。対照的に、ＭＬＶなどのような他のレトロウイルスは、たとえば筋肉、目、脳、肺、および肝組織を構成するものなどのような非分裂細胞またはゆっくり分裂する細胞に感染することができない。

本明細書において使用されるレンチウイルスベクターは、レンチウイルスから誘導可能な、少なくとも１つの構成部分を含むベクターである。好ましくは、その構成部分は、それによってベクターが細胞に感染する、遺伝子を発現する、または複製される生物学的メカニズムに関与する。

レトロウイルスおよびレンチウイルスゲノムの基本構造は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲなどのような多くの一般的な特徴を共有し、それらの間にまたはそれらの内に、ゲノムがパッケージされるのを可能にするためのパッケージングシグナル、プライマー結合部位、宿主細胞ゲノムの中への組み込みを可能にする付着部位、ならびにパッケージング構成成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子−これらは、ウイルス粒子の構築に必要とされるポリペプチドである、が位置する。レンチウイルスは、ＨＩＶにおけるｒｅｖおよびＲＲＥ配列などのようなさらなる特徴を有し、これは、感染した標的細胞の核から細胞質への、組み込みプロウイルスのＲＮＡ転写物の効率的な搬出を可能にする。

プロウイルスにおいて、ウイルス遺伝子は、末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域が両端の側面に位置する。ＬＴＲは、エンハンサー−プロモーター配列およびポリアデニル化シグナルとして果たし、それによって、ウイルス遺伝子の発現をコントロールすることによって、転写を担う。

ＬＴＲは、それら自体、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と呼ばれる３つのエレメントに分けることができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’エンドに特有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’エンドに特有の配列に由来する。３つのエレメントのサイズは、異なるウイルスの中でかなり変動し得る。

複製欠損レンチウイルスベクターゲノムにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖは、不在であってもよいまたは機能的でなくてもよい。

本発明の典型的なレンチウイルスベクターにおいて、複製にとって不可欠な１つ以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部は、ウイルスから除去されてもよい。これは、ウイルスベクターを複製欠損にする。ウイルスゲノムの一部分はまた、標的非分裂宿主細胞を形質導入するおよび／または宿主ゲノムの中にそのゲノムを組み込みすることができる、ＮＯＩを含むベクターを生成するためにＮＯＩと交換されてもよい。

一実施形態において、レンチウイルスベクターは、国際公開第２００７／０７１９９４号パンフレットにおいて記載されるように、非組み込みベクターである。

さらなる実施形態において、ベクターは、ウイルスＲＮＡがないまたはそれを欠く配列を送達する能力を有する。さらなる実施形態において、送達されることとなっている、ＲＮＡ上に位置する異種結合ドメイン（ｇａｇに対して異種）およびｇａｇまたはｐｏｌ上の同種の結合ドメインは、送達されることとなっているＲＮＡのパッケージングを確実にするために使用することができる。これらのベクターは両方とも、国際公開第２００７／０７２０５６号パンフレットにおいて記載される。

レンチウイルスベクターは、「非霊長動物」ベクターであってもよい、つまり、主として霊長動物、とりわけヒトに感染しないウイルスに由来してもよい。

ウイルスベクターは、ＥＩＡＶに由来してもよい。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子に加えて、ＥＩＡＶは、３つの他の遺伝子：ｔａｔ、ｒｅｖ、およびＳ２をコードする。ｔａｔは、ウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用し（Ｄｅｒｓｅ ａｎｄ Ｎｅｗｂｏｌｄ（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４（２）：５３０−５３６、およびＭａｕｒｙら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００（２）：６３２−６４２）、ｒｅｖは、ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を通してウイルス遺伝子の発現を調節し、調和させる。（Ｍａｒｔａｒａｎｏら（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２−３１１１）。これらの２つのタンパク質の作用のメカニズムは、霊長動物ウイルスにおける同様のメカニズムに対して大まかに類似していると考えられる（Ｍａｒｔａｒａｎｏら（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２−３１１１）。Ｓ２の機能は、知られていない。そのうえ、膜貫通型タンパク質の開始点で、ｅｎｖコード配列につながれるｔａｔの第１のエクソンによってコードされるＥＩＡＶタンパク質、Ｔｔｍが同定された（Ｂｅｉｓｅｌら（１９９３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７（２）：８３２−８４２）。

用語「組換えレンチウイルスベクター」は、標的細胞に感染することができるウイルス粒子の中に、パッケージング構成成分の存在下において、ＲＮＡゲノムをパッケージするのを可能にするための、十分なレンチウイルス遺伝子情報を有するベクターを指す。標的細胞の感染は、逆転写および標的細胞ゲノムへの組み込みを含んでいてもよい。組換えレンチウイルスベクターは、ベクターによって標的細胞に送達されることになっている、非ウイルスコード配列を持つ。組換えレンチウイルスベクターは、最終的な標的細胞内で、感染性レンチウイルス粒子を産生するための非依存性の複製をすることができない。通常、組換えレンチウイルスベクターは、機能的なｇａｇ−ｐｏｌおよび／もしくはｅｎｖ遺伝子ならびに／または複製にとって不可欠な他の遺伝子を欠く。本発明のベクターは、分断イントロン（ｓｐｌｉｔ−ｉｎｔｒｏｎ）ベクターとして構成されてもよい。分断イントロンベクターは、国際公開第９９／１５６８３号パンフレットにおいて記載される。

本発明の組換えレンチウイルスベクターは、最小限のウイルスゲノムを有していてもよい。

本明細書において使用されるように、用語「最小限のウイルスゲノム」は、感染するのに必要とされる機能性を提供し、標的宿主細胞に対して、関心のあるヌクレオチド配列を形質導入し、送達するために、不可欠でないエレメントを除去し、かつ不可欠なエレメントを保持するように、ウイルスベクターが、操作されていることを意味する。この戦略のさらなる詳細については、発明者らの国際公開第９８／１７８１５号パンフレットにおいて見つけることができる。

本発明の一実施形態において、ベクターは、自己不活性化ベクターである。

例として、自己不活性化レトロウイルスベクターは、転写エンハンサーまたは３’ＬＴＲのＵ３領域におけるエンハンサーおよびプロモーターを欠失させることによって構築された。一連のベクターの逆転写および組み込みの後に、これらの変化は、５’および３’ＬＴＲの両方にコピーされ、転写不活性プロウイルスを産生する（Ｙｕら（１９８６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８３：３１９４−３１９８；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：１１９７−１２０１；Ｈａｗｌｅｙ（１９８７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４：２４０６−２４１０、およびＹｅｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１：９５６４−９５６８）。しかしながら、そのようなベクターにおけるＬＴＲに対して内部にあるあらゆるプロモーター（複数可）は、なお、転写活性である。この戦略は、内部に配置される遺伝子からの転写に対する、ウイルスＬＴＲにおけるエンハンサーおよびプロモーターの効果を排除するために用いられた。そのような効果は、転写の増加（Ｊｏｌｌｙら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１：１８５５−１８７２）または転写の抑制（Ｅｍｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｔｅｍｉｎ（１９８４）Ｃｅｌｌ ３９：４４９−４６７）を含む。この戦略はまた、ゲノムＤＮＡへの３’ＬＴＲから下流の転写を排除するために使用することもできる（Ｈｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｆｆｉｎ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８４５−８４８）。これは、内因性癌遺伝子の偶発的な活性化を妨げることが決定的に重要であるヒト遺伝子療法において特有の関心事である。

しかしながら、宿主細胞／パッケージング細胞内でウイルスゲノムを産生するために使用されるプラスミドベクターはまた、宿主細胞／パッケージング細胞においてゲノムの転写を指示するために、レンチウイルスゲノムに対して作動可能に連結された転写調節コントロール配列をも含むであろう。これらの調節配列は、転写されたレンチウイルス配列、つまり５’Ｕ３領域と関連する自然の配列であってもよいまたはそれらは、他のウイルスプロモーター、たとえばＣＭＶプロモーターなどのような異種プロモーターであってもよい。いくつかのレンチウイルスゲノムは、効率的なウイルス産生のために、さらなる配列を必要とする。たとえば、ＨＩＶの場合には、ｒｅｖおよびＲＲＥ配列が、好ましくは含まれる。しかしながら、ｒｅｖおよびＲＲＥについての必要性は、ｇａｇ−ｐｏｌのコドン最適化によって低下させてもよいもしくは排除されてもよい（国際公開第０１／７９５１８号パンフレットにおいて記載されるように）および／またはＬＴＲの下流かつ内部プロモーターの上流でのオープンリーディングフレーム、たとえばｎｅｏの包含は（国際公開第０３／０６４６６５号パンフレットにおいて記載されるように）、図１において示される構築物において使用したが、しかしながら、当業者は、任意の適したオープンリーディングフレームを使用することができる。ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機能を実行する、代替の配列もまた、知られている。たとえば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的な類似体は、メーソンファイザーサルウイルスにおいて見つけられる。これは、構成的運搬エレメント（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＣＴＥ）として知られており、感染細胞においてある因子と相互作用すると考えられる、ゲノムにおけるＲＲＥ型配列を含む。その細胞因子は、ｒｅｖ類似体と考えることができる。したがって、ＣＴＥは、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の代わりとして使用されてもよい。知られているまたは入手可能になる任意の他の機能的な等価物が、本発明に対して適切であってもよい。たとえば、ＨＴＬＶ−ＩのＲｅｘタンパク質をＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質と機能的に交換することができることもまた、知られている。ＲｅｖおよびＲｅｘが、ＩＲＥ−ＢＰに類似する効果を有することもまた、知られている。

本発明によるレンチウイルスベクターは、ドーパミン合成経路に関与する３つの酵素を好ましくはコードする、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する、自己不活性化最小限レンチウイルスベクターからなってもよい。そのようなベクターによってコードされるタンパク質は、ヒトチロシンヒドロキシラーゼ遺伝子の切断型形態（ＴＨのフィードバック調節に関与するＮ−末端１６０アミノ酸を欠く）、ヒト芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、およびヒトＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＧＴＰ−ＣＨ１）遺伝子を含んでいてもよい。ベクターは、（１）本明細書において記載されるベクターゲノム（２）合成ＥＩＡＶ ｇａｇ／ｐｏｌ発現ベクター（ｐＥＳＧＰＫ、国際公開第０１／７９５１８号パンフレットおよび国際公開第０５／２９０６５号パンフレット）、ならびに（３）ＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現ベクター（ｐＨＧＫ）をコードする、３つのプラスミドによる、細胞（たとえばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）の一過性のトランスフェクションによって産生されてもよい。

パッケージング配列
「パッケージング配列」または「ｐｓｉ」とも区別なく呼ばれる用語「パッケージングシグナル」は、ウイルス粒子形成の間にレンチウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド形成に必要とされる非コードシス作用性配列に関して使用される。ＨＩＶ−１において、この配列は、主なスプライス供与部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンに及ぶ遺伝子座にマッピングされている。

本明細書において使用されるように、用語「パッケージングシグナルの伸長」または「パッケージング配列の伸長」は、ｇａｇ遺伝子の方にさらに伸長した、ｐｓｉ配列のあたりの配列の使用を指す。これらのさらなるパッケージング配列の包含は、ウイルス粒子へのベクターＲＮＡの挿入の効率を増加させ得る。

シュードタイピング
本発明のレンチウイルスベクターは、シュードタイプされてもよい。この点に関して、シュードタイピングは、１つ以上の利点を付与することができる。たとえば、レンチウイルスベクターにより、ＨＩＶベースのベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、ＣＤ４と称されるタンパク質を発現する細胞のみの感染にこれらのベクターを制限するであろう。しかし、これらのベクターにおけるｅｎｖ遺伝子が、他のウイルス由来のｅｎｖ配列と置換された場合、それらは、より広い感染範囲を有し得る（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９−２４２）。例として、Ｍｉｌｌｅｒらは、広宿主性レトロウイルス４０７０Ａ由来のエンベロープにより、ＭｏＭＬＶベクターをシュードタイプし（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：４３１−４３７）、他の研究者らは、ＶＳＶ由来の糖タンパク質により、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクターをシュードタイプした（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９−２４２）。

他の代替物において、Ｅｎｖタンパク質は、突然変異または遺伝子操作されたＥｎｖタンパク質などのような修飾Ｅｎｖタンパク質であってもよい。修飾は、標的能力を導入するもしくは毒性を低下させるためにまたは他の目的のためになされてもよいまたは選択されてもよい（Ｍａｒｉｎら（１９９６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０（５）：２９５７−２９６２；Ｎｉｌｓｏｎら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３（４）：２８０−２８６；およびＦｉｅｌｄｉｎｇら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１（５）：１８０２−１８０９ならびにその中に引用される参考文献）。

ベクターは、たとえば、狂犬病Ｇタンパク質またはＶＳＶ−Ｇタンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子によりシュードタイプされてもよい。

ＶＳＶ−Ｇ
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ラブドウイルスのエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、レンチウイルスを含む、あるレトロウイルスをシュードタイプすることができることが示されたエンベロープタンパク質である。

あらゆるレトロウイルスエンベロープタンパク質の非存在下において、ＭｏＭＬＶベースのレトロウイルスベクターをシュードタイプするその能力は、Ｅｍｉら（１９９１）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６５：１２０２−１２０７）によって最初に示された。国際公開第９４／２９４４４０号パンフレットは、レトロウイルスベクターが、ＶＳＶ−Ｇによりうまくシュードタイプされ得ることを教示する。これらのシュードタイプＶＳＶ−Ｇベクターは、広範囲の哺乳動物細胞を形質導入するために使用されてもよい。より最近では、Ａｂｅら（１９９８）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ７２（８）：６３５６−６３６１は、非感染性レトロウイルス粒子を、ＶＳＶ−Ｇの追加によって感染性にすることができることを教示する。

Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８０３３−８０３７）は、ＶＳＶ−ＧによりレトロウイルスＭＬＶをうまくシュードタイプし、これは、その天然の形態をしたＭＬＶと比較して、改変された宿主範囲を有するベクターをもたらした。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプベクターは、哺乳動物細胞だけではなく魚、爬虫類動物、および昆虫に由来する細胞株にも感染することが示された（Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：８０３３−８０３７）。それらはまた、様々な細胞株に対して、従来の広宿主性エンベロープよりも効率的であることが示された（Ｙｅｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９５６４−９５６８およびＥｍｉら（１９９１）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：１２０２−１２０７）。ＶＳＶ−Ｇタンパク質はまた、その細胞質側末端がレトロウイルスのコアと相互作用することができるので、あるレンチウイルスおよびレトロウイルスをシュードタイプするために使用することもできる。

ＶＳＶ−Ｇタンパク質などのような非レンチウイルスシュードタイピングエンベロープという手段は、感染性の損失を伴うことなく高い力価までベクター粒子を濃縮することができるという利点を与える（Ａｋｋｉｎａら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２５８１−２５８５）。レンチウイルスおよびレトロウイルスエンベロープタンパク質は、おそらくそれらが２つの非共有結合サブユニットからなるので、超遠心分離の間の剪断力に明らかに耐えることができない。サブユニットの間の相互作用は、遠心分離によって破壊され得る。それに比べて、ＶＳＶ糖タンパク質は、単一のユニットから構成される。そのため、ＶＳＶ−Ｇタンパク質シュードタイピングは、有力な利点を提供することができる。

国際公開第００／５２１８８号パンフレットは、膜結合ウイルスエンベロープタンパク質として水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を有する、安定性の産生細胞株からの、シュードタイプレトロウイルスおよびレンチウイルスベクターの生成について記載し、ＶＳＶ−Ｇタンパク質についての遺伝子配列を提供する。

ロスリバーウイルス
ロスリバーウイルスエンベロープは、非霊長動物レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）をシュードタイプするために使用され、続く全身投与は、主に、肝臓を形質導入した（Ｋａｎｇら（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６（１８）：９３７８−９３８８）。効率は、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプベクターにより得られるものよりも２０倍大きいことが報告され、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによって測定されるように、引き起こされる細胞毒性は、より少なかった。

ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）は、オーストラリアの熱帯および温帯地方においてその土地固有の流行性の蚊によって広げられるアルファウイルスである。温帯沿岸水域における正規母集団における抗体率は、低い（６％〜１５％）傾向があるが、血清有病率は、マレーバレー水系の平原において２７〜３７％に達する。１９７９〜１９８０年に、ロスリバーウイルスは、太平洋の島々において流行した。その疾患は、ヒトの間で伝染せず、致命的ではなく、最初の症状は、関節痛であり、患者の約半分において疲労および嗜眠がある（Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００７）Ｅｄｓ． Ｋｎｉｐｅ ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ）。

バキュロウイルスＧＰ６４
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床上および商業上の適用に必要とされる高力価のウイルスの大規模生産において使用されるウイルスベクターにとってＶＳＶ−Ｇに対する魅力的な代替物となることが示された（Ｋｕｍａｒ Ｍ、Ｂｒａｄｏｗ ＢＰ、Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇ Ｊ（２００３）Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １４（１）：６７−７７）。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプベクターと比較して、ＧＰ６４シュードタイプベクターは、類似する広い親和性および類似する天然の力価を有する。ＧＰ６４発現は、細胞を死滅させないので、ＧＰ６４を構成的に発現する２９３Ｔベースの細胞株を生成することができる。

狂犬病Ｇ
本発明において、ベクターは、狂犬病Ｇタンパク質またはその突然変異体、変異体、ホモログ、もしくはフラグメントの少なくとも一部によりシュードタイプされてもよい。

狂犬病Ｇタンパク質およびその突然変異体についての教示は、国際公開第９９／６１６３９号パンフレットならびにＲｏｓｅら（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４３：３６１−３６４、Ｈａｎｈａｍら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５３０−５４２；Ｔｕｆｆｅｒｅａｕら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０８５−１０９１、Ｋｕｃｅｒａら（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５５：１５８−１６２；Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄら（１９８３）ＰＮＡＳ ８０：７０−７４；Ｓｅｉｆら（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：９２６−９３４；Ｃｏｕｌｏｎら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２７３−２７８；Ｔｕｆｆｅｒｅａｕら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１０８５−１０９１０；Ｂｕｒｇｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３５９−３６７；Ｇａｕｄｉｎら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５５２８−５５３４；Ｂｅｎｍａｎｓｏｕｒら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：４１９８−４２０３；Ｌｕｏら（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：１８７−１９３、Ｃｏｌｌ（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４２：２０８９−２０９７；Ｌｕｏら（１９９７）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．５１：３５−４１；Ｌｕｏら（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：１８７−１９３；Ｃｏｌｌ（１９９５）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：８２７−８５１；Ｔｕｃｈｉｙａら（１９９２）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．２５：１−１３；Ｍｏｒｉｍｏｔｏら（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９：２０３−２１６；Ｇａｕｄｉｎら（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８７：６２７−６３２；Ｗｈｉｔｔら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５：６８１−６８８；Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄら（１９７８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４０：１３１−１３９；Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄら（１９７８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４０：４５−５５；Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄら（１９７７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２３：２８６−２９３、およびＯｔｖｏｓら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２２４：６８−７６において見つけられてもよい。狂犬病Ｇタンパク質はまた、欧州特許第０４４５６２５号明細書においても記載されている。

代替のエンベロープ
レンチウイルスベクターをシュードタイプするために使用することができる他のエンベロープは、モコラ、エボラ、４０７０Ａ、およびＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）を含む。

アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、限られたパッケージング容量を有し、そのため、効率的に送達することができる遺伝子の数にマイナスに影響を与えることは、当技術分野において知られていた。しかしながら、この限界は、ＡＡＶ血清型に対して依存性であることが現在知られている。たとえば、ＡＡＶ５および７血清型のキャプシドは、８ｋｂまでのゲノムをパッケージすることができる。この研究は、米国特許第７，９４３，３７４号明細書において記載されている。そのうえ、米国特許出願公開第２００９／０２１４４７８号明細書は、９ｋｂまでのパッケージング容量を有するＡＡＶ２／５組換えベクターについて記載している。

ＡＡＶベクターの特徴は、一般に、当業者に知られている。たとえば、ＡＡＶベクターは、広い宿主範囲を有し、比較的低い免疫原性で分裂および非分裂細胞の両方を形質導入する。すべてのＡＡＶウイルス遺伝子を、遺伝子カセットと交換して、シス作用性ＡＡＶエレメントである逆位末端配列（ＩＴＲ）、ＤＮＡパッケージングシグナル、および複製開始点のみを適所に残す方法もまた、よく知られている。たとえばＭｕｓａｔｏｖら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、Ｄｅｃ ２００２、７６（２４）を参照されたい。ＡＡＶ遺伝子産物であるＲｅｐおよびＣａｐならびに他のアクセサリータンパク質が、トランスで提供される場合、ＡＡＶを、産生細胞中でパッケージすることができる。ＡＡＶパッケージング系は、記載されている。たとえば米国特許第５，１３９，９４１号明細書を参照されたい。非ＡＡＶアクセサリー機能は、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびワクシニアウイルスなどのような、知られているヘルパーウイルスのいずれかによって供給されてもよい。そのようなＡＡＶパッケージング系は、たとえば米国特許第４，７９７，３６８号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；米国特許第５，８６６，５５２号明細書；米国特許第６，００１，６５０号明細書；米国特許第６，７２３，５５１号明細書において記載されている。

コドン最適化
本発明において使用されるポリヌクレオチド（ＮＯＩおよび／またはベクター構成成分を含む）は、コドン最適化されてもよい。コドン最適化は、国際公開第９９／４１３９７号パンフレットおよび国際公開第０１／７９５１８号パンフレットにおいて以前に記載されている。細胞が異なると、特定のコドンのそれらの使用頻度が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量におけるバイアスに相当する。コドンが、対応するｔＲＮＡの相対的存在量とマッチするように調整されるように、配列におけるコドンを改変することによって、発現を増加させることが可能である。同じ理由で、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型においてまれであることが知られているコドンを故意に選ぶことによって、発現を減少させることが可能である。したがって、補足的な程度の翻訳のコントロールが、利用可能である。

ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、多くのまれなコドンを使用し、よく使用される哺乳動物コドンに対応させるためにこれらを変化させることによって、哺乳動物産生細胞における関心のある遺伝子、たとえばＮＯＩまたはパッケージ構成成分の発現の増加を実現することができる。コドン利用表は、哺乳動物細胞および様々な他の生物について当技術分野において知られている。

ウイルスベクター構成成分のコドン最適化は、多くの他の利点を持つ。それらの配列における改変のおかげで、産生細胞／パッケージング細胞におけるウイルス粒子の構築に必要とされる、ウイルス粒子のパッケージ構成成分をコードするヌクレオチド配列は、ＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）がそれらから排除されている。同時に、パッケージ構成成分についてのアミノ酸配列コード配列は、配列によってコードされるウイルス構成成分は同じままとなるようにまたはパッケージ構成成分の機能が損なわれないように少なくとも十分に類似するように保持される。レンチウイルスベクターにおいて、コドン最適化はまた、搬出のためのＲｅｖ／ＲＲＥの必要性を克服しており、最適化配列をＲｅｖ非依存性にする。コドン最適化はまた、ベクター系内の異なる構築物の間の（たとえばｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖオープンリーディングフレームにおけるオーバーラップの領域の間の）相同組換えを低下させる。そのため、コドン最適化の全体的な効果は、ウイルス力価における顕著な増加および安全性の改善となる。

一実施形態において、ＩＮＳに関係するコドンのみが、コドン最適化される。しかしながら、より好ましい実際的な実施形態において、配列は、いくつかの例外、たとえば、ｇａｇ−ｐｏｌのフレームシフト部位を包含する配列を除いて、それらの全体がコドン最適化される（以下を参照されたい）。

ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質をコードする、２つのオーバーラップリーディングフレームを含む。両方のタンパク質の発現は、翻訳の間のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳の間のリボソーム「翻訳スリップ」の結果として起こる。この翻訳スリップは、リボソームを失速させる（ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｓｔａｌｌｉｎｇ）ＲＮＡ二次構造によって少なくとも部分的に引き起こされると考えられる。そのような二次構造は、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子におけるフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶについては、オーバーラップの領域は、ｇａｇの始まりの部分の下流のヌクレオチド１２２２（ここで、ヌクレオチド１は、ｇａｇ ＡＴＧのＡである）からｇａｇの最後（ｎｔ１５０３）まで及ぶ。結果的に、フレームシフト部位および２つのリーディングフレームのオーバーラップ領域にわたる２８１ｂｐフラグメントは、好ましくは、コドン最適化されない。このフラグメントの保持は、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現を可能にするであろう。

ＥＩＡＶについては、オーバーラップの始まりの部分は、ｎｔ１２６２（ここで、ヌクレオチド１は、ｇａｇ ＡＴＧのＡである）であると考えられてきた。オーバーラップの最後は、１４６１ｂｐにある。フレームシフト部位およびｇａｇ−ｐｏｌオーバーラップが保存されるのを確実にするために、野生型配列は、ｎｔ１１５６〜１４６５まで保持された。

最適なコドン使用頻度からの誘導は、たとえば、好都合な制限部位を組み込むためになされてもよく、保存的アミノ酸変化は、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質の中に導入されてもよい。

一実施形態において、コドン最適化は、容易に発現される哺乳動物遺伝子に基づく。３番目、時に２番目および３番目の塩基を変化させてもよい。

遺伝子コードの縮重の性質により、当業者が、多数のｇａｇ−ｐｏｌ配列を実現することができることが十分に理解される。コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列を生成するための出発点として使用することができる、記載される多くのレトロウイルス変異体もまたある。レンチウイルスゲノムは、かなり変異性となり得る。たとえば、なお機能的である、ＨＩＶ−１の多くの疑似種がある。これはまた、ＥＩＡＶについても当てはまる。これらの変異体は、形質導入プロセスの特定の部分を増強するために使用されてもよい。ＨＩＶ−１変異体の例は、＜ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ＞でＬｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ， ＬＬＣによって管理されるＨＩＶデータベースで見つけられてもよい。ＥＩＡＶクローンの詳細については、＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＞にあるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースで見つけられてもよい。

コドン最適化されたｇａｇ−ｐｏｌ配列についての戦略は、任意のレトロウイルスに関連して使用することができる。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１、およびＨＩＶ−２を含むすべてのレンチウイルスに適用されるであろう。そのうえ、この方法は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶ、およびヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶ、ならびに他のレトロウイルス由来の遺伝子の発現を増加させるために使用することができる。

コドン最適化は、ｇａｇ−ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存性にすることができる。しかしながら、レンチウイルスベクターにおいて抗ｒｅｖ因子または抗ＲＲＥ因子の使用を可能にするために、ウイルスベクター生成系を完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存性にすることが必要であろう。したがって、ゲノムはさらに修飾される必要がある。これは、ベクターゲノム構成成分を最適化することによって実現される。好都合には、これらの修飾はまた、プロデューサーおよび形質導入細胞の両方においてすべての補足的なタンパク質がない、より安全な系の産生をもたらす。

活性
本発明の融合構築物は、機能的なドーパミン作動性合成酵素を産生し、国際公開第０２／２９０６５号パンフレットにおいて記載される、ＩＲＥＳ配列によって分離された、ドーパミン合成酵素をコードする３つすべての遺伝子を有する構築物を使用して得られるレベルと比較した場合に、ドーパミン産生における増加を引き起こしてもよい。

本発明のベクターは、国際公開第２００１／０４４３３号パンフレットにおいて記載されるベクターであるｐＯＮＹＫ１よりも、細胞内で発現された場合に、Ｌ−ドパおよび／またはドーパミン産生の増加を引き起こしてもよい。

本発明のベクターは、ドーパミンおよび／またはＬ−ドパ産生において、少なくとも２、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、２００、５００、１０００倍の増加を示してもよい。

本発明のベクターは、たとえばＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＰＣ−１２細胞において発現された場合に、ｐＯＮＹＫ１と比較した場合、Ｌ−ドパおよび／またはドーパミン産生の増加を引き起こしてもよい。

ドーパミンまたはＬ−ドパ産生は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのような当技術分野において知られている多くの方法のいずれかによって測定されてもよい。

理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、コードされたタンパク質が相互に物理的に近く、それによって、互いのそれらの相互作用を容易にするので、Ｌ−ドパおよび／またはドーパミン合成が、融合タンパク質によって増加されることを示唆する。酵素のそれぞれの物理的な近さが、ある酵素から他のものへの、効率的な代謝産物の流れを容易にし得、最大のＬ−ドパまたはドーパミン産生を可能にするので、これは、ドーパミン生合成経路の酵素について特に有利である。

実施例において示され、また表１（上記）において要約されるように、ある融合構築物は、Ｌ−ドパ産生の改善を示し、あるものはドーパミン産生の改善を示した。

薬学的組成物
本発明のレンチウイルスベクターは、薬学的組成物の形態で提供されてもよい。薬学的組成物は、遺伝子療法によって個人を治療するために使用されてもよく、組成物が、治療有効量のレンチウイルスベクターを含む。

ウイルス調製物は、超遠心分離によって濃縮されてもよい。その代わりに、国際公開第２００９／１５３５６３号パンフレットは、レンチウイルスベクターの下流のプロセシングのための方法を記載している。結果として生じる薬学的組成物は、少なくとも１０^７ＴＵ．／ｍＬ、たとえば１０^７〜１０^９ＴＵ．／ｍＬまたは少なくとも１０^９ＴＵ．／ｍＬを有してもよい。（力価は、標準的なＤ１７またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞株に対して力価測定される（ｔｉｔｒｅ）、１ｍｌ当たりの形質導入単位（ＴＵ．／ｍＬ）で表される）。

薬学的組成物は、ヒトを治療するために使用されてもよい。

組成物は、任意選択で、薬学的に許容され得るキャリア、希釈剤、賦形剤、または補助剤を含んでいてもよい。医薬キャリア、賦形剤、または希釈剤の選択は、投与について意図されるルートおよび標準的な薬務に関して選択することができる。薬学的組成物は、キャリア、賦形剤、または希釈剤として（またはそれに加えて）、任意の適したバインダー（複数可）、潤滑剤（複数可）、懸濁化剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）、および標的部位へのウイルスの侵入を支援してもよいまたは増加させてもよい他のキャリア剤（たとえば脂質送達系など）を含んでいてもよい。

疾患
ウイルスベクターは、神経学的な状態を治療するために使用されてもよい。たとえば、ベクターは、神経変性疾患の治療および／または予防に有用であってもよい。

疾患は、被験体におけるＬ−ドパおよび／またはドーパミンの産生によって治療可能であってもよい。

疾患は、パーキンソン病であってもよい。

たとえばＴＨ、ＧＴＰ−ＣＨ１、およびＡＡＤＣを送達することができるベクターによる遺伝子療法による治療は、経口Ｌ−ドパ治療に対して難治性になった末期のＰＤ患者に特に有用となりそうである。

本明細書において記載されるある構築物は、Ｌ−ドパの産生を増加させ、他のものは、ドーパミンの産生を増加させた。Ｌ−ドパの産生の増加は、残存しているＡＡＤＣ酵素活性を保持し、したがって、Ｌ−ドパをドーパミンに少なくとも部分的に変換することができる患者において有用となり得る。これらの患者は、従来のＬ−ドパ治療に対して感受性があるかもしれない。たとえば、ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_{−ＩＲＥＳ−}ＡＡＤＣ構築物は、高レベルのドーパミンおよびＬ−ドパの両方を産生したのに対して、ＴＨ_−Ｌ−ＡＡＤＣ_{−ＩＲＥＳ−}ＣＨ１およびＡＡＤＣ_−Ｌ−ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１は、Ｌ−ドパと比べて、より高いレベルのドーパミンを生成した。

ドーパミンの産生の増加は、Ｌ−ドパをプロセシングするのに十分な内因性のＡＡＤＣ活性を欠き、したがって、従来のＬ−ドパ治療に対してそれほど感受性がない末期患者において有用であってもよい。

本発明はまた、パーキンソン患者のための療法を選択するための方法であって、Ｌ−ドパおよびドーパミンを産生するための、その相対的な能力に基づいて、本発明によるベクターを選択するステップを包含する、方法も提供する。

投与
本発明において使用されるウイルスベクターは、たとえば、尾状被殻への注射によって脳に投与される。

ベクターは、半球当たり１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の経路を介して投与されてもよい。

レンチウイルスベクターについて以前に記載される投与系において（Ｊａｒｒａｙａら（２００９）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １４：１（２）２−４）、ベクター組成物は、経路の末端部分に一定分量（４μＬ）を投与し、少しだけ針を引っ込め、次いで、第２の一定分量（３μＬ）を投与し、針をもう少し引っ込め（２回目）、次いで、第３の一定分量（３μＬ）を投与することによって、非連続的なまたは「点状の」様式で投与され、したがって、一定分量は、それぞれの穿刺経路（ｎｅｅｄｌｅ ｔｒａｃｔ）に沿って３つの場所に蓄積され、合計１０μＬが送達された。

その代わりに、ベクターは、同時係属英国特許出願第１００９０５２．０号明細書において記載されるように、連続的に注入されてもよい。

本発明は、これから、実施例を介してさらに記載されるが、これらは、当業者が本発明を実行するのを支援するように果たすためのものであり、本発明の範囲を限定するものとして決して意図されるものではない。

実施例１−ｐＯＮＹＫ−ＴＡｉＣからのベクター産生および組み込みされたベクターからのカテコールアミン産生
ｐＯＮＹＫ１と比較して、力価を改善するために生成し、かつ試験するための第１の融合構築物を、ｐＯＮＹＫ−ＴＡｉＣとした（図１）。ｐＯＮＹＫ−ＴＡｉＣまたはｐＯＮＹＫ１のゲノムを使用するレンチウイルスベクター（ＬＶ）調製物を、三通り生成し、結果として生じるベクター力価を、ＤＮＡ組み込みアッセイによって定量化した（図２ａ）。これらのデータは、驚いたことに、ｐＯＮＹＫ−ＴＡｉＣから生成されたベクターの力価が、ｐＯＮＹＫ１と同じである、つまり、一方のＩＲＥＳエレメントの除去が、力価を改善したわけではなかったことを実証した。ＨＰＬＣ分析は、産生されるＬ−ドパおよびドーパミンのレベルを検査するために、形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞上清に対して実行した。ＨＰＬＣ結果（図２ｂ）は、ｐＯＮＹＫ−ＴＡｉＣベクターにより形質導入された細胞が、ｐＯＮＹＫ１ベクターにより形質導入された細胞と比較して、総カテコールアミンのレベルにおいて、２．４倍の増加をもたらしたことを実証した。Ｌ−ドパレベルは、両方のゲノムの間で同等であった、しかしながら、ドーパミンのレベルは、ｐＯＮＹＫ１よりもｐＯＮＹＫ−ＴＡｉＣについて１５．３倍高かった。したがって、カテコールアミン産生は、改善された。全体として、これは、細胞が、ｐＯＮＹＫ１ベクターと比較して、ｐＯＮＹＫ−ＴＡｉＣベクターにより形質導入される場合に、ドーパミン生合成経路がより効率的となることを示唆する。

実施例２−ベクター産生および組み込みされたベクターからのカテコールアミン産生
ｐＯＮＹＫ−ＴＡｉＣおよびｐＯＮＹＫ１と共に、さらに３つのドーパミン酵素融合プラスミドについて試験した（ｐＯＮＹＫ−ＡＴｉＣ、ｐＯＮＹＫ−ＴＣｉＡ、ｐＯＮＹＫ−ＡＴＣ（図１））。それぞれの異なるゲノムプラスミドを使用するＬＶ調製物を、三通り生成し、結果として生じるベクターを、ＤＮＡ組み込みアッセイによって定量化した（図３ａ）。結果は、力価が、すべてのベクターについて類似していることを実証し、力価は、１．３Ｅ＋０５ＴＵ／ｍｌ〜４．０Ｅ＋０５ＴＵ／ｍｌの範囲にわたった。興味深いことには、両方のＩＲＥＳエレメントを欠いたｐＯＮＹＫ−ＡＴＣは、力価における増加を示さなかった。これは、融合構築物がベクター産生を改変せず、導入遺伝子の配置転換およびＧＳ１５リンカー（複数可）の存在が力価に影響を与えないことを示唆する。ＨＰＬＣ分析からの結果は、それぞれの異なるベクターにより形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、様々なカテコールアミン産生をもたらすことを実証した（図３ｂ）。さらに、ドーパミンに変換されるＬ−ドパの量は、異なるベクターの間で有意に変動した。ｐＯＮＹＫ１ベクターは、最も低いレベルのドーパミン産生およびＬ−ドパのドーパミンへの最も低い変換を示した。ｐＯＮＹＫ−ＴＣｉＡを使用して生成したベクターは、最も高いカテコールアミン産生を示し（ｐＯＮＹＫ１よりも４．８倍高い）、ドーパミンレベルは、ｐＯＮＹＫ１よりも１３．２倍高かった。

したがって、ＴＨおよびＣＨ１が単一のユニットとして発現される場合に、最も高いレベルのカテコールアミンが産生されるように思われる。興味深いことには、３つすべての遺伝子を相互に融合し、３重融合構築物（ｐＯＮＹＫ−ＡＴＣ）を得て、１つのタンパク質をもたらすことにより、ドーパミン産生が、ｐＯＮＹＫ１と比較した場合に、増加した（９．３倍）ことを実証した。

実施例３−異なる融合プラスミドによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるドーパミン酵素レベルの評価
タンパク質発現レベルについて調査するために、それぞれの導入遺伝子産物（ＡＡＤＣ、ＣＨ１、およびＴＨ）についてのウエスタンブロット分析を、それぞれの融合ゲノムプラスミドによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解産物から実行した（図４）。結果は、それぞれの異なる融合構築物について、それぞれのドーパミン合成酵素が存在し、予測されるサイズをしていたことを実証した。１２４ｋＤａのバンドが３つすべてのウエスタンブロットにおいて見られたように、３重融合カセット（ｐＯＮＹＫ−ＡＴＣ）を含めて、ＧＳ１５リンカーを有するドーパミン合成酵素を発現させることができることを実証した、また、これは、それぞれのゲノム構築物が、３つすべての連結されたドーパミン酵素タンパク質を含有する融合タンパク質について期待されるサイズである。異なるゲノム構築物によって発現される様々なタンパク質のそれぞれのレベルは、かなり変動する。３つすべてのタンパク質についての最も高いレベルは、ｐＯＮＹＫ１、ｐＯＮＹＫ−ＴＡｉＣ、およびｐＯＮＹＫ−ＴＣｉＡから発現されるように思われる。最も低いレベルのタンパク質は、ｐＯＮＹＫ−ＡＴＣで見られた。

ウエスタンブロットおよびＨＰＬＣの結果について、タンパク質の強度の間に直接的な関係があるようには思われない。ｐＯＮＹＫ１は、最も高いレベルのタンパク質発現のうちの１つを示したが、しかし、このプラスミドから作製されたベクターにより形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、最も低いドーパミン産生を示した。

実施例４−ベクターおよび５つの融合構築物からのカテコールアミン産生
上記論じられるように、ＴＨおよびＣＨ１が単一のユニットとして発現される場合に、最も高いレベルのカテコールアミンが産生されるように思われる。Ｌ−ドパのレベルが、ｐＯＮＹＫ−ＴＣｉＡで非常に高かったので、ＡＡＤＣの発現レベルは、Ｌ−ドパのドーパミンへの変換を制限していそうである。遺伝子がＩＲＥＳ配列の後に配置される場合、遺伝子発現が低下することが知られているので、この配置の方向を逆転させることにより、Ｌ−ドパのドーパミンへの変換を増加させることによって、最大のドーパミンレベルがもたらされるかもしれず、したがって、ＡＡＤＣ遺伝子を発現カセットの最初に配置させる（その発現を最大限にするためにＣＭＶプロモーターの下流に配置させ、その後ＩＲＥＳ、次いでＴＨ：ＣＨ１融合物が続く）。したがって、このゲノム構築物（ｐＯＮＹＫ−ＡＴＣ、図１）を生成した。ｐＯＮＹＫ−ＡＴＣによりトランスフェクトした細胞からのウエスタンブロット結果は、低いレベルの大きな融合タンパク質を示した（実施例３）。しかしながら、これらの明らかな低いレベルにもかかわらず、ｐＯＮＹＫ−ＡＴＣから作製されたベクターにより形質導入された細胞は、Ｌ−ドパのドーパミンへの高レベルの変換を示し、これは、高レベルのドーパミン産生をもたらした。３つすべてのコード配列が相互に連結され、これにより、発現が比較的弱かった大きなタンパク質（１２４ｋＤａ）が得られることを考慮すれば、これは驚くべきことである。ｐＯＮＹＫ−ＴＣｉＡを使用して生成されたベクターが、最も高いレベルのドーパミン産生を示したことおよびＩＲＥＳ配列が遺伝子発現を低下させると知られているという事実を考慮すれば、この同じ順（ＴＨ：ＣＨ１：ＡＡＤＣ）で配置された導入遺伝子の３重融合物が、形質導入された細胞からのドーパミン産生のレベルの増強をもたらすということがあり得る。そのため、さらなる３重融合構築物、ｐＯＮＹＫ−ＴＣＡ（図１）を生成した。

アミノ酸配列が変わらないが、ＤＮＡ配列が改変された修飾ＧＳ１５リンカーを生成した。このリンカーは、ｐＯＮＹＫ−ＡＴＣおよびｐＯＮＹＫ−ＴＣＡの中にクローニングし、ＴＨおよびＣＨ１遺伝子の間のもとのＧＳ１５リンカーと交換した。これにより、ｐＯＮＹＫ−ＡＴＣｍｏｄおよびｐＯＮＹＫ−ＴＣＡｍｏｄが得られた（図１）。それぞれの異なるゲノムプラスミドを使用するベクターを、二通り生成し、結果として生じるベクターを、ＤＮＡ組み込みアッセイによって定量化した（図５）。

結果から見ることができるように、すべての構築物についてのベクター力価は、類似しており、力価は、１．２Ｅ＋０５ＴＵ／ｍｌ〜５．３Ｅ＋０５ＴＵ／ｍｌの範囲にわたった。したがって、新しい構築物は、ベクター産生を改変せず、しがたって、導入遺伝子の配置転換ならびにＧＳ１５リンカーおよび／または修飾ＧＳ１５リンカーの存在は、力価に影響を与えない。

形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのカテコールアミン産生をＨＰＬＣ分析によって実行した、また、結果を図５ｂに示す。新しい修飾３重融合構築物（ＡＴＣｍｏｄおよびＴＣＡｍｏｄ）から生成されたベクターは、カテコールアミンレベルにおけるさらなる増加を示した。３重融合構築物の両方により形質導入された細胞からのドーパミン産生のレベルは、Ｌ−ドパのレベルよりもはるかに大きく、Ｌ−ドパのドーパミンへの変換が、これらの構築物で非常に効率的であったことを示唆した。ＡＴＣｍｏｄベクターにより形質導入された細胞は、最も高いレベルのカテコールアミン産生を示し、ｐＯＮＹＫ１により形質導入された細胞と比較して、ドーパミン産生において全体的に６．５倍増加した。さらに重要であったのは、修飾３重融合構築物（ＴＨおよびＣＨ１の間に修飾リンカーを使用）から生成されたベクターにより形質導入された細胞から産生されたドーパミンレベルが、両方のＧＳ１５リンカーが同一のヌクレオチド配列を有した３重融合ゲノムを使用して生成されたベクターから産生されたものよりもはるかに大きかったという発見であった。

実施例５−９つの異なる融合プラスミドによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるドーパミン酵素レベルの評価
それぞれのベクターゲノムについてのタンパク質発現レベルを検査するために、それぞれの導入遺伝子産物（ＡＡＤＣ、ＣＨ１、およびＴＨ）についてのウエスタンブロット分析を、それぞれのベクターゲノムによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの細胞溶解産物を使用して実行した（図６）。結果は、ベクターゲノムのすべてについて、それぞれのドーパミン合成酵素が存在し、酵素が融合物として発現されたかどうかに依存して、予測されたサイズであったことを実証した。これは、先に試験していなかった新しい構築物（ｐＯＮＹＫ１−ＣＴｉＡ、ｐＯＮＹＫ１−ＡｉＴＣ、ｐＯＮＹＫ１−ＴＣＡ、ｐＯＮＹＫ１−ＡＴＣｍｏｄ、およびｐＯＮＹＫ１−ＴＣＡｍｏｄ）について最も重要なことであった。これは、それぞれのゲノム構築物が、ＧＳ１５リンカーを有するドーパミン合成酵素を発現させることができることを実証した。これは、期待されるサイズ（１２４ｋＤａ）のタンパク質バンドが３つすべてのウエスタンブロットにおいて見られた３重融合カセット（ＴＣＡおよびＡＴＣ）を含んだ。

最も高いレベルの３つすべてのタンパク質は、ｐＯＮＹＫ１、ｐＯＮＹＫ１−ＴＡｉＣ、およびｐＯＮＹＫ１−ＴＣＡｍｏｄから発現されるように思われる（図５）。最も低いレベルのタンパク質は、ｐＯＮＹＫ１−ＡＴＣから見られ、これは、前の結果（図４）と同等であった。

実施例６−９つの異なる融合物ベクターにより形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるドーパミン酵素レベルの評価
上記に記載されるように、ウエスタン分析を、融合プラスミドによりトランスフェクトされた細胞由来の細胞溶解産物について実行した（図４および６）。このあとに、それぞれの融合ベクターにより形質導入された細胞からのドーパミン合成酵素レベルの分析を続けた。形質導入された細胞からのタンパク質レベルの分析は、結果として生じる機能的なベクターから発現されたタンパク質のレベルに対するよりよい洞察を与える。それぞれの融合構築物により形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、それぞれのドーパミン合成酵素のタンパク質発現についてのウェスタンブロッティングによって分析され、また、結果を図８に示す。ブロットは、正確なサイズのタンパク質が、それぞれのベクターゲノムカセットについて発現されたことを実証した。データは、コード配列がＩＲＥＳエレメントの下流に配置された場合に、タンパク質レベルが低下することを示唆した。

３重融合構築物において修飾リンカーを使用して生成されたベクター（ＡＴＣｍｏｄおよびＴＣＡｍｏｄ）により形質導入された細胞は、未修飾リンカーを有する構築物から生成されたベクター（ＡＴＣおよびＴＣＡ）により形質導入された細胞と比較した場合に、より高いレベルのドーパミン産生を実証した（図３ｂおよび５ｂ）。

実施例７−融合構築物によるラット線条体ニューロン形質導入
ドーパミン補充療法のための標的細胞集団であるラット線条体ニューロンを、それぞれの融合ベクターにより形質導入し、これらの初代細胞からのカテコールアミン産生を評価することを決定した。ニューロンについての最適な形質導入条件を確立するために、ＥＩＡＶ−ＧＦＰベクターを使用して予備実験を実行した（データ示さず）。ベクターの製造は、前に記載されるそれぞれのベクターゲノムを使用して実行し、非濃縮ベクター上清および濃縮した最終的なベクターを、ＤＮＡ組み込みアッセイによって定量化した（図９）。濃縮ベクター調製物は、ＭＯＩ １で、三通り、線条体ニューロンを形質導入するために使用した。並行して、線条体ニューロンを、ＭＯＩ １で、ＥＩＡＶ−ＧＦＰベクターにより形質導入した。これは、形質導入の可視化が、ＧＦＰポジティブ細胞の存在によって、容易に観察することができるので、形質導入についてのコントロールとして、また、ＨＰＬＣ分析についてのネガティブコントロールとしても果たすために実行した。図１０ａから見られるように、ニューロン細胞は、ＭＯＩ １での、ＥＩＡＶ−ＧＦＰによる形質導入に成功した。

ＨＰＬＣ分析は、ＭＯＩ １を使用する形質導入が、線条体培養物におけるドーパミンおよびＬ−ドパのレベルの検出を可能にするのに十分であることを実証した（図１０ｂ）。図１０ｂは、ＴＣｉＡベクターにより形質導入されたニューロンが、ｐＯＮＹＫ１ベクターにより形質導入されたニューロンよりも１６０倍高い、カテコールアミンの最も大きな産生量（８０ｎｇ／ｍｌ）を示したことを実証する。しかしながら、検出されたカテコールアミンのほとんど（７３ｎｇ／ｍｌ）は、ドーパミンではなくＬ−ドパであった。そのため、ＴＣｉＡからのＬ−ドパのドーパミンへの変換は、非効率的であった。ＴＣｉＡにより形質導入された細胞から観察された、Ｌ−ドパのドーパミンへの非効率的な変換は、これまでのすべての実験において観察された結果である（図３ｂ、５ｂ、６ｂ、および１０ｂ）。前に論じられたように、これは、ほぼ確実に、ＡＡＤＣの限られた発現によるものである。ドーパミン産生の点から、ＴＣｉＡベクターがより効率的に働くように、ＡＡＤＣの発現レベルは、増加させる必要があるであろう。しかしながら、ＩＲＥＳの前にＡＡＤＣを配置しても、おそらく、ＩＲＥＳの後にＴＨ−ＣＨ１を配置することによる低いＬ−ドパレベルにより、このベクターにより形質導入されたニューロンからのカテコールアミンレベルが低かった（図１０ｂ）ので、ＴＨ−ＣＨ１融合構築物（ＡｉＴＣ）は、解決をもたらさなかった。ＡＡＤＣを配置の１番目にして、３つすべての導入遺伝子を相互に融合すると、Ｌ−ドパのドーパミンへの変換を改善した（ＡＴＣおよびＡＴＣｍｏｄにより形質導入されたニューロンについての結果を参照されたい）が、全体的なカテコールアミン産生量は、ＴＣｉＡと比較して、低かった。それにもかかわらず、このベクターゲノムにより実現されたドーパミンレベル（２１．５ｍｇ／ｍｌ）は、評価したすべての構築物のうちで最も高かった。これは、ｐＯＮＹＫ１により形質導入されたニューロンと比較して、ドーパミンレベルにおいて１０７．５倍の増加に相当する。

ＡＴＣｍｏｄにより形質導入されたニューロンからのＬ−ドパに対するドーパミンの比は、非常に高く（５．２）、Ｌ−ドパのドーパミンへのほぼ完全な変換を示した。Ｌ−ドパのドーパミンへのこの効率的な変換はまた、ＡＴＣベクターにより形質導入されたニューロンにおいても観察されたが、総カテコールアミン産生量は、より低かった。この結果は、ＡＴＣおよびＡＴＣｍｏｄベクターにより形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から前に観察されたものであり（図３ｂおよび５ｂ）、ＡＴＣｍｏｄへの修飾リンカー（ＧＳ１５ｍｏｄ）の追加が、より高いカテコールアミン産生を付与することを確認するものである。

実施例８−ＴＣｉＡｍｏｄの評価
論じられるように、ＡＴＣｍｏｄおよびＴＣＡｍｏｄ３重融合ゲノムにおいてＴＨおよびＣＨ１を連結するために使用した修飾ＧＳ１５リンカー（ＧＳ１５ｍｏｄ）は、親のゲノム（同一のＧＳ１５リンカーを含有する）から生成されたベクターにより形質導入された細胞からよりも、これらの構築物から作製されたベクターにより形質導入された細胞（ニューロンおよびＨＥＫ２９３Ｔ）からの高いドーパミン産生を実証した。この修飾ＧＳ１５リンカーが、単一の融合ゲノムから作製されたベクターからのカテコールアミン産生の増加をもたらすかどうかを確証することを決定した。最も高いカテコールアミン産生が、ＴＣｉＡベクターにより形質導入された細胞から観察されたので、ＴＣｉＡにおける未修飾ＧＳ１５リンカーを、修飾リンカーと交換し、ＴＣｉＡｍｏｄを得ることを決定した（図１）。図１１ａにおいて見られるように、ｐＯＮＹＫ１およびＴＣｉＡに対するＴＣｉＡｍｏｄからのベクター力価は、より低かった（それぞれ３．４倍および２．２倍低い）が、これは、ベクター産生およびアッセイのばらつきによって引き起こされたものであろう。

形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのカテコールアミン産生の決定は、ＨＰＬＣ分析によって実行した、また、結果を図１１ｂに示す。ＴＣｉＡｍｏｄベクターにより形質導入された細胞は、ｐＯＮＹＫ１ゲノムにより形質導入された細胞と比較した場合、カテコールアミン産生における７倍の増加を示した。さらに、ＴＣｉＡｍｏｄベクターにより形質導入された細胞からのカテコールアミン産生は、ＴＣｉＡベクターにより形質導入された細胞と比較した場合、１．７５倍増加した。これは、ＧＳ１５ｍｏｄリンカーが、未修飾ＧＳ１５リンカーよりも利点をもたらし、この現象は、単に、３重融合構築物と関係するものではないことを確認するものである。

報告されるように、ＴＣｉＡは、高いカテコールアミン産生を前に示したが、ドーパミンおよびＬ−ドパの相対量は、同等であり、ＡＡＤＣによる、Ｌ−ドパのドーパミンへの変換が限られていることを示した。おそらく、ＡＡＤＣがなおＩＲＥＳの下流で発現されるので、この傾向はまた、ＴＣｉＡｍｏｄでも明らかであり、そのために、リンカーの変更によって影響を受けなかった。

まとめ
ＡＡＤＣ、ＣＨ１、およびＴＨを発現する１０の融合ゲノムを構築した。５つは、ＩＲＥＳエレメントのうちの１つの代わりにＧＳ１５リンカーを含有する（ＴＣｉＡ、ＴＡｉＣ、ＡＴｉＣ、ＣＴｉＡ、およびＡｉＴＣ）。残り４つの構築物は、ＧＳ１５リンカーを両方のＩＲＥＳエレメントと交換した３重融合構築物である。これらの構築物のうちの２つは、同一のＧＳ１５リンカーを含有し（ＡＴＣおよびＴＣＡ）、他の２つの３重構築物は、同じ遺伝子配置を含有するが、ＴＨおよびＣＨ１遺伝子の間に配置される修飾リンカー（ＧＳ１５ｍｏｄ）を有する（ＡＴＣｍｏｄおよびＴＣＡｍｏｄ）。このＧＳ１５ｍｏｄリンカーは、もとのＧＳ１５リンカーと同じアミノ酸配列をコードするが、異なるＤＮＡ配列を有する。ＧＳ１５ｍｏｄリンカーはまた、ＴＣｉＡの中にも挿入し、未修飾リンカーを交換して、ＴＣｉＡｍｏｄを得た。

これらの研究は、ｐＯＮＹＫ１トリシストロンゲノムからのＩＲＥＳエレメントの除去およびリンカー配列による置換が、効率的な逆転写を妨害すると考えられたＩＲＥＳエレメント内に含有される複雑な構造を排除することによって、ベクター力価を改善し得るという仮説について試験するものであった。様々な融合ゲノムからのベクター力価が、ｐＯＮＹＫ１に類似する力価を示したので、この理論は、反証された。アッセイ内の力価は、変動したが、すべてのアッセイの比較は、一貫して低い力価を示した融合ベクターを同定せず、特定の融合ゲノムが低いベクター産生を付与しなかったことを示唆した。

ウェスタンブロッティング分析（図４および８）は、それぞれの、カテコールアミンを放出する酵素が、発現され、それぞれの様々な融合構築物について正確な予測されるサイズであったことを実証した。導入遺伝子がＩＲＥＳエレメントの下流に配置された場合、タンパク質レベルが低下したこともまた、ウエスタン分析から示唆された。

予想外に、構築物の評価は、ＴＨおよびＣＨ１の融合物が、おそらく、このＴＨ：ＣＨ１融合物による、チロシンのＬ−ドパへの効率的な触媒作用により、総カテコールアミン産生量を増加させるための最良のメカニズムをもたらしたことを実証した。

ＧＳ１５リンカーの２つのコピーを使用する３重融合ゲノム（ＡＴＣおよびＴＣＡ）の構築は、ベクター産生を損なわず、ｐＯＮＫＹ１と比較して、カテコールアミン産生を増加させた。

ＴＨおよびＣＨ１遺伝子の間の修飾ＧＳ１５リンカー（ＧＳ１５ｍｏｄ）の使用もまた、タンパク質発現における増加についての証拠がないにもかかわらず、両方の構築物で、カテコールアミン産生における増加をもたらした。カテコールアミンの増加を媒介する修飾リンカーの効率の増加はまた、ＴＣｉＡ配置に適用された場合（ＴＣｉＡｍｏｄ）にも実証された。

全体的に、データは、ＴＣｉＡｍｏｄおよびＡＴＣｍｏｄゲノムが、両方とも、ＰＯＮＹＫ１と比較して、改善されたドーパミン産生を媒介することができることを示唆する。ＴＣｉＡｍｏｄは、全般的に、最も高い総レベルのＬ−ドパおよびドーパミンを媒介するが、ＡＴＣｍｏｄは、全般的に、最も高いレベルのドーパミンを媒介する。

実施例９−ＩＲＥＳの構成的プロモーターとの交換
ＴＣｉＡｍｏｄ配置を使用するドーパミン産生は、ＩＲＥＳ媒介性のＡＡＤＣ発現によって制限されるので、ＩＲＥＳの構成的プロモーターとの交換は、ＡＤＤＣ発現の増加をもたらし、形質導入された細胞のより高いレベルのドーパミン産生を可能にし得る。そのため、ＴＣｉＡｍｏｄにおけるＩＲＥＳエレメントをＰＧＫまたはＴＫプロモーターと交換する代替の２つのゲノムを作り出した（図１を参照されたい）。

実施例１０−初代皮質ニューロンの形質導入
３つの融合ベクター（ＴＡＣｍｏｄ、ＴＣｉＡｍｏｄ、およびＴＣｔｋＡ）は、０．４のＭＯＩで、三通り、ヒト初代皮質のニューロン（Ｉｎｎｏｐｒｏｔ、カタログ番号Ｐ１０１５１）を形質導入するために使用した。これらのベクターは、ｐＯＮＹＫ１と類似する力価を有した（ｐＯＮＹＫ１ １．５Ｅ＋０８ＴＵ／ｍｌ、ＴＡＣｍｏｄ ７．４Ｅ＋０７ＴＵ／ｍｌ、ＴＣｉＡｍｏｄ ８．４Ｅ＋０７ＴＵ／ｍｌ、ＴＣｔｋＡ １．２Ｅ＋０８ＴＵ／ｍｌ）。コントロールとして、ＧＦＰベクターは、ＭＯＩ ２および１０で、ヒトニューロンを形質導入するために使用した。形質導入が起こったことを確実にするために、ＧＦＰが形質導入された細胞は、ＧＦＰ蛍光について評価し、研究の終わりに（形質導入後９日目）、画像を取り込んだ、またそれを図１２ａに示す。ＧＦＰ蛍光細胞の高いパーセンテージは、ＭＯＩ ２および１０の両方で可視化され、両方のＭＯＩでのＧＦＰベクターによる形質導入が成功したことを示した。細胞上清は、形質導入後５日目（収集１）および９日目（収集２）に、カテコールアミンＨＰＬＣ分析のために収集した。収集１でのＨＰＬＣ分析からの結果を図１２ｂに示す。収集２からのＨＰＬＣデータは、収集１から見られたものと同等であった（データ示さず）。

ＴＣｔｋＡにより形質導入された細胞は、Ｌ−ドパの有意な産生（ｐＯＮＹＫ１よりも＞２５倍高い）を示したが、低いドーパミン産生（ｐＯＮＹＫ１よりも低い）を示し、Ｌ−ドパのドーパミンへの非効率的な変換を示唆する。

最も高いレベルのドーパミン産生は、ＴＣｉＡｍｏｄにより形質導入された細胞から観察され、これは、ｐＯＮＹＫ１により形質導入されたものと比較して、ドーパミン産生における７．４倍の改善を示した。さらに、Ｌ−ドパレベルは、ドーパミン産生量を超えず、Ｌ−ドパのドーパミンへの効率的な変換を示唆した。

ＨＰＬＣ分析に加えて、ウエスタンブロットは、様々なベクターにより形質導入されたヒト皮質ニューロンから発現されるＴＨおよびＡＡＤＣタンパク質レベルを評価するために実行した。これらの結果を図１３ａおよびｂに示す。ウエスタンブロットは、正確なサイズのドーパミン合成酵素（ＴＨおよびＡＡＤＣ）が、様々なベクターにより形質導入されたヒトニューロンから発現されることを実証した。

ＡＡＤＣのレベル（図１３ｂ）は、ＴＣｔｋＡにより形質導入された細胞からわずかに検出することができ、これは、上記に記載されるように、この構築物により形質導入された細胞についての高いＬ−ドパ：ドーパミン比について説明し得る。

実施例１１−パーキンソン病の非ヒト霊長動物モデルにおけるＴＣｉＡ（ｍｏｄ）およびｐＯＮＹＫ１の行動上のおよびＰＥＴ画像化の評価
進行中である研究のねらいは、ＭＰＴＰにより処理された非ヒト霊長動物の行動上の回復について、２つの用量レベルのＴＣｉＡ（ｍｏｄ）を、単一の用量レベルのｐＯＮＹＫ１と比較することであり、そのうえ、^１８Ｆ−ＦＭＴおよび^１８Ｆ−ファリプリドＰＥＴ画像化は、それぞれＡＡＤＣまたはＤ２／Ｄ３受容体レベルを評価するために、手術の前におよび注射後３か月目に再び、すべて安定してパーキンソン病である動物に対して実行し、それぞれの放射性トレーサーの正常なベースラインレベルを決定するために、健康な動物をコントロールとして使用する。

４つのグループ、それぞれの４匹のＭＰＴＰ病変ｍ． ファスシクラリス（ｍ． ｆａｓｃｉｕｌａｒｉｓ）を、下記に記載されるように、ウイルスベクターにより治療する（ＭＰＴＰ病変およびベクター投与は、材料および方法において詳述される）。それぞれのグループは、ベクターの投与後６か月までの間、経過観察する。

グループ１由来の４匹の動物は、ベースライン^１８Ｆ−ＦＭＴおよび^１８Ｆ−ファリプリドＰＥＴスキャンを受ける。そのうえ、すべてのグループ由来のそれぞれの動物は、
＊ １回のＭＲＩベースラインスキャン
＊ １か月のベースライン歩行活動のビデオベースの特徴づけ（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎによって評価）
＊ ２か月のＭＰＴＰ中毒および歩行活動のビデオベースの評価（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ）
＊ １回のＭＰＴＰ後の^１８Ｆ−ＦＭＴ ＰＥＴスキャン
＊ １回のＭＰＴＰ後の^１８Ｆ−ファリプリドＰＥＴスキャン
＊ １回の経口Ｌ−ドパチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）および必要に応じた、１回の経口コントロールチャレンジ、それぞれ、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ分析（６時間のフィルムにわたる）が後続
＊ ウイルス投与前に１回、血液サンプルを収集
＊ 脳にベクターを送達するための１回の外科的処置
＊ ３か月の、治療後の行動の経過観察（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ）（０〜３か月）
＊ 治療の３か月後の１回のＭＲＩスキャン
＊ 治療の３か月後の１回の^１８Ｆ−ＦＭＴ ＰＥＴスキャン
＊ 治療の３か月後の１回の^１８Ｆ−ファリプリドＰＥＴスキャン
＊ 治療の３か月後の、１回の経口Ｌ−ドパチャレンジおよび必要に応じた、１回の経口コントロールチャレンジ、それぞれ、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ分析（６時間のフィルムにわたる）が後続
＊ さらに３か月の、治療後の行動の経過観察（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ）（３〜６か月）
＊＊ 安楽死の前に１回、血液サンプルを収集
＊ 安楽死（経心腔的灌流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）および脳摘出）
を受ける（詳細については材料および方法を参照されたい）。

ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、ｌｂａ１、ＡＡＤＣ、ＣＨ１、およびＴＨまたはβｇａｌについての染色を含む、死後の組織学的分析。

図１４は、１／５用量のＴＣｉＡ（ＯＸＢ−１０２）が、臨床評価スコアによって評価されるように、パーキンソンの症状の改善において、ｐＯＮＹＫ１よりも有効であることを示す。コントロールであるＥＩＡＶ−ＬａｃＺにより治療された動物は、これらの時点までに、さらに重度に障害性となった。

図１５のファリプリドＰＥＴ画像は、ＯＸＢ−１０２ベクターによる治療後に減少する、ベースラインと比較した、ＭＰＴＰ病変後のドーパミンＤ２／Ｄ３受容体の相対的な増加を示す。ＦＭＴ ＰＥＴ画像は、ＯＸＢ−１０２ベクターによる治療後に被殻において増加する、ベースラインと比較した、ＭＰＴＰ病変後の被殻におけるＡＡＤＣ発現の相対的な減少を示す。

材料および方法
細胞株
一過性のトランスフェクションに使用したＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｍ Ｃａｌｏｓ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得た。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＰＡＡから得られ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｇ７５１３）および１％非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ、Ｍ７１４５）が補足された、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ、Ｃａｔ．Ｄ５６７１）において維持した。

ラット線条体ニューロン
線条体は、以前に記載されるように（Ｍａｚａｒａｋｉｓら、２００１）、ウィスターラット（胎児１８日目）から摘出し、線条体をプールし、培養物を、以前に記載されるように（Ａｚｚｏｕｚら、２００２）、調製した。結果として生じる培養物は、５００μｌ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で、ウェル当たり７．５Ｅ＋０４細胞の密度で２４ウェルプレートに平板培養し、５％ＣＯ_２を含有する３７℃インキュベーターにおいて維持した。

形質導入前に、培地をそれぞれのウェルから除去し、組み合わせ、２５０μｌをそれぞれのウェルに追加し戻し、これにより、それぞれのウェルが、等量の条件培地を含有することを確実にした。ＭＯＩ １を実現するために必要とされるベクターの量を、二通りまたは三通り、それぞれのウェルに追加した。ネガティブコントロールについては、線条体ニューロンの２つのウェルを、ＭＯＩ １で、ＧＦＰ発現ベクターにより形質導入した（ｐＯＮＹＫ−ＧＦＰ、ロット：ＫＧ１２０３１０）。形質導入の３〜６時間後に、２５０μｌ培地をそれぞれのウェルに追加した。

カテコールアミン産生量を測定するために、ニューロン培養物を、Ｌ−チロシンを１００ｕＭの最終濃度でそれぞれのウェルに追加した形質導入後の４日間、培養し、培養物を一晩、インキュベートした。翌朝、４００μｌのニューロン培養上清を収集し、４０μｌの２Ｍ過塩素酸および４０μｌのピロ亜硫酸ナトリウムを含有するチューブの中に入れ、サンプルは、前に論じられるように、ＨＰＬＣ検出によるカテコールアミン分析のためにプロセシングした。

ヒト初代皮質ニューロン
ヒト凍結保存ニューロンは、Ｉｎｎｏｐｒｏｔ（Ｃａｔ．Ｐ１０１５１、ロット．６１９５、５Ｅ＋０６細胞／バイアル）から得た。２４ウェルプレートは、２ｕｇ／ｃｍ^２で、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）コーティングした（Ｉｎｎｏｐｒｏｔ、Ｃａｔ．ＰＬＬ）。ヒトニューロンを解凍し、ニューロン増殖剤（ＮＧＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｉｎｎｏｐｒｏｔ Ｃａｔ．Ｐ６０１５７）を補足した無血清ニューロン培地において１．２Ｅ＋０６細胞／ｍｌの密度まで再懸濁した。希釈したニューロン懸濁液は、５０μｌの全容量で、６Ｅ＋０４細胞／ウェルで、ＰＬＬコーティングプレートのウェルの中心に追加した。プレートは、ニューロンを付着させるために、３０分間、３７℃でインキュベートし、その後、ウェルは、０．５ｍｌの完全ニューロン培地により洗われた。細胞は、形質導入前の４日間、３７℃でインキュベートした。形質導入前に、培地をそれぞれのウェルから除去し、組み合わせ、２５０μｌをそれぞれのウェルに追加し、これにより、それぞれのウェルが、等量の条件培地を含有することを確実にした。ＭＯＩ ０．４を実現するために必要とされるベクターの量を、三通り、それぞれのウェルに追加した。コントロールとして、ニューロンは、ＭＯＩ ２および１０で、ＧＦＰ発現ベクターにより形質導入した（ｐＯＮＹＫ−ＧＦＰ、ロット：ＫＧ２９０７１１）。形質導入の３〜６時間後に、２５０μｌ培地をそれぞれのウェルに追加した。

カテコールアミン産生量を測定するために、ニューロン培養物を、Ｌ−チロシンを１００ｕＭの最終濃度でそれぞれのウェルに追加した形質導入後の４日間、培養し、培養物を一晩、インキュベートした。翌朝、３００μｌのニューロン培養上清を収集し、３０μｌの２Ｍ過塩素酸および３０μｌのピロ亜硫酸ナトリウムを含有するチューブの中に入れ、サンプルは、前に論じられるように、ＨＰＬＣ検出によってカテコールアミン分析のためにプロセシングした。ＧＦＰベクターにより形質導入されたコントロールニューロンサンプルは、形質導入が起こったことを確実にするために、ＧＦＰ蛍光について分析し、画像を取り込み、記録に残した。

プラスミド
最小限のｐＯＮＹＫ１ゲノムプラスミドは、ｐＯＮＹ８．９．４ＴＹ（ＫａｎＲ遺伝子を含有する）として、最近になって、記載された（Ｊａｒｒａｙａら、２００９ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １、２ｒａ４）。このプラスミドは、Ａｚｚｏｕｚ Ｍらによって、さらに詳細に記載されるｐＯＮＹ８．０Ｔに基づくものである（Ａｚｚｏｕｚら、２００２ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２２、１０３０２−１０３１２）。手短に言えば、ｐＯＮＹＫ１は、（順に）Ｎｅｏ、内部ＣＭＶプロモーター、切断型コドン最適化ヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＥＭＣＶ配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、コドン最適化ヒト芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、ポリオウイルスＩＲＥＳ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＧＴＰ−ＣＨ１）、およびヤマネズミ肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含有するカセットが挿入されたＥＩＡＶ ＳＩＮベクターゲノムである。２つの融合された遺伝子および１つのＰＶ ＩＲＥＳエレメントを含有する融合プラスミド（図１：ｐＯＮＹＫ−ＡＴｉＣ、ｐＯＮＹＫ−ＴＡｉＣ、ｐＯＮＹＫ−ＴＣｉＡ、ｐＯＮＹＫ−ＣＴｉＡ、およびｐＯＮＹＫ−ＡｉＴＣ）は、合成されたＤＮＡ（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の領域を、トリシストロンカセットの中に挿入し、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ領域および第１の遺伝子の終止コドンをＧＳ１５リンカーと交換することによって、生成した。ＧＳ１５リンカーは、４×グリシンアミノ酸、その後に続く１×セリンアミノ酸が３回繰り返され、これにより、１５アミノ酸のリンカーが得られる。このＧＳ１５リンカーについてＤＮＡ配列は、以下のとおりである：
ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣ 。

３重融合構築物（図１：ｐＯＮＹＫ−ＡＴＣおよびｐＯＮＹＫ−ＴＣＡ）を生成する場合、ＰＶ ＩＲＥＳエレメントを第２のＧＳ１５リンカーと交換した。ＧＳ１５リンカーはまた、アミノ酸配列は変わらないが、ＤＮＡ配列が異なるという点で、修飾した（ＧＳ１５ｍｏｄ）。新しいＧＳ１５ｍｏｄリンカーＤＮＡ配列は、以下のとおりである：
ＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＣＴＣＣ。

このＧＳ１５ｍｏｄリンカーを、３重融合構築物の中にクローニングし、未修飾ＧＳ１５リンカーのうちの１つと交換した（図１：ｐＯＮＹＫ−ＡＴＣｍｏｄおよびｐＯＮＹＫ−ＴＣＡｍｏｄ）。

本研究において使用されるＶＳＶ−ＧエンベロープおよびＥＩＡＶ合成Ｇａｇ／Ｐｏｌプラスミドは、それぞれ、ｐＨＧおよびｐＥＳＧＰＫとした。

ウイルスベクター産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トランスフェクションの２４時間前に、３．５×１０^６細胞／皿の密度で１０ｃｍ皿の中に接種した。ベクター産生は、メーカーの説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１２５６６−１０１）によって媒介された。手短に言えば、以下の量のプラスミドを、３４０μｌ ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．１２３０９−０１９）に追加した：４μｇゲノムプラスミド（図１を参照されたい）、２μｇ ｐＥＳＧＰＫ、および０．０８μｇ ｐＨＧ。次いで、このＤＮＡミックスを、２５μｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＤ ２０００および３１５μｌ ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）を含有するミックスに追加した。トランスフェクションの１４〜１８時間後に、酪酸ナトリウムを、１０ｍＭの最終濃度まで追加した。培地は、酪酸ナトリウム誘発の６〜８時間後に変え、２１〜２３時間後に、ベクターを収集し０．４５μｍシリンジフィルターでろ過した。形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）のベクター力価を、組み込み（ＤＮＡ）力価アッセイによって評価した。

生化学アッセイ
様々な融合構築物によってコードされるカテコールアミン酵素の機能性について試験するために、チロシンのドーパミンへの変換を測定する生化学アッセイを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して実行した。このアッセイを実行するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０μｇ ｍｌ^−１ポリブレン（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ． Ｎｏ．Ｈ９２６８）の存在下において、試験ベクターおよびＰＯＮＹＫ１コントロールにより形質導入した。これらの細胞を３日間培養し、次いで、１０分の１の細胞を、カテコールアミン生化学アッセイのための細胞を接種するために使用し、残りの細胞は、組み込み（ＤＮＡ）力価アッセイによる分析のためにさらに継代した（上記を参照されたい）。２日後に、生化学アッセイのために接種した細胞の培地は、１００ｍＭの最終濃度でＬ−チロシン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｔ１１４５）を補足した培地と交換し、細胞を一晩、培養した。翌朝、８００μｌの細胞培養上清を収集し、８０μｌの２Ｍ過塩素酸（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ． Ｎｏ．２４４２５２）および８０μｌのピロ亜硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ． Ｎｏ．Ｓ９０００）を含有するチューブの中に入れた。サンプルを完全に混合し、一旦沈殿が形成されたら、サンプルを、あらゆるデブリを除去するために１０分間、１０，０００ｘｇで遠心分離した。次いで、別個のチューブに上清を取り出し、ＨＰＬＣ分析を実行することができるまで−８０℃のフリーザーにおいて凍結させた。収集の時の細胞の数をさらに確かめた。

予備ＨＰＬＣ分析 サンプルは、解凍し、０．２μＭ超高純度ＰＴＦＥフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ． Ｎｏ．ＵＦＣ３０ＬＧ２５）でろ過した。上清は、ＨＰＬＣカテコールアミン標準物質と共に、ＥＳＡ Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ ＩＩ電気化学的検出器（ＥＳＡ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）が装備されたＨＰＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ）にかけた。カテコールアミンは、１．５ｍｌ／分の流量で、Ｃａｔ−Ａ−Ｐｈａｓｅ（ＥＳＡ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）により平衡化したＣ−１８逆相カラム（ＥＳＡ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して、分離し、次いで、電気化学的に検出した。このＨＰＬＣアッセイは、_Ｌ−ドパ、ジヒドロキシフェニール酢酸（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｏｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＯＰＡＣ）、およびドーパミン（ＤＡ）の検出のために最適化し、結果は、組み込みベクターゲノムの１０^５のコピー当たりの_Ｌ−ドパ、ＤＯＰＡＣ、またはＤＡのｎｇの数として表す。

ウエスタンブロット分析による、カテコールアミンを放出する酵素の検出
ベクター構成成分により一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、分画バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ７．３、０．２％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＢＤＳ、ｃａｔ． Ｎｏ．５６００９）中に溶解した。総タンパク質濃度を確かめ、１０μｇを、４〜２０％ポリアクリルアミド変性ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ． Ｎｏ．ＥＣ６０２８５ＢＯＸ）上にロードした。ウェスタンブロッティングは、以下のうちの１つを使用して実行した：抗ＣＨ１抗体（Ｄｒ Ｅ． Ｗｅｒｎｅｒ、Ａｕｓｔｒｉａから得た）、抗ＴＨ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、ＵＫ、Ｃａｔ．ＡＢ１５２）、または抗ＡＡＤＣ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｃａｔ．ＡＢ１３６）。一次抗体インキュベーションの後に、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ二次抗体（ＤＡＫＯ、Ｅｌｙ、ＵＫ、Ｃａｔ．Ｐ０４４８）とのインキュベーションを続けた。可視化は、ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔにより実行した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｃａｔ．ＲＰＮ２１３５）。

ビデオ録画およびＥｔｈｏｖｉｓｉｏｎ分析
ビデオケージ（フィルムは必要としなかった）に対する慣らしを、それぞれ３０分間の３回のセッションにわたって実行する。ベースラインの運動の定量化は、Ｍｅｄｉａ Ｒｅｃｏｒｄｅｒ収集ソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ）を使用して、特注品のビデオケージにおいて記録した、５回の３０分間のビデオによって評価する。ビデオはすべて、ビデオ追跡ソフトウェア、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ（Ｎｏｌｄｕｓ）を使用して分析する。それぞれの動物のベースライン歩行活動は、ＭＰＴＰ中毒が始まる前に収集した最後の３つのビデオについて、総移動距離（ＴＤＴ）として計算した平均歩行活動からなる。経口Ｌ−ドパによるチャレンジは、ＭＰＴＰ中毒前のベースライン時に実行しない。

ＭＰＴＰ中毒
動物（１回に４匹まで）を、筋肉内投与を介して７日間、０．２ｍｇ／ｋｇ ＭＰＴＰの用量により処理し、新たなＭＰＴＰサイクルの開始前に少なくとも５日間休ませる。ＭＰＴＰサイクルは、歩行活動が平均ベースライン活動の８０〜９０％まで低下するまで繰り返し、臨床スコアは、少なくとも８／１４とする。少なくとも３週間の安定性のパーキンソン病の行動上のスコアは、ＰＥＴスキャンおよび／またはウイルスベクターによる治療を実行する前に必要とされる。臨床スコアリングは、ＰａｐａおよびＣｈａｓｅから改良したものであり（Ｐａｐａ ａｎｄ Ｃｈａｓｅ １９９６ Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ ３９、５７４−５７８）、ＭＰＴＰ中毒の開始に際して、また、ウイルスベクターによる治療まで、一日単位で、ＭＰＴＰにより誘発された運動障害をモニターするために使用する。３０分間のビデオは、歩行活動を定量化するために、最後のＭＰＴＰ注射後の３日目からスタートして毎週の単位で収集する。一旦、動物が、３週間、安定してパーキンソン病であることが評価されたら（ＴＤＴ偏差≦１５％）、Ｌ−ドパチャレンジおよび必要に応じて、別個のネガティブコントロールチャレンジを実行し、動物は、ＯＦＦ時間の３０分間のビデオと比較するための、最良の３０分間のＯＮ期間を決定するために、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ分析のために６時間、フィルムに記録する。

体重減少が１２％を超過する場合、動物は、看病し、胃管栄養法（経口的に）によって栄養を補充する。

画像化研究
ＭＲＩ：３Ｄ Ｔ２強調画像を使用する定位ＭＲＩは、注射座標を確立するために手術の前に収集する。画像はすべて、１００ｍＴ／ｍ（３００μｓ立ち上がり時間）に達する傾斜磁場コイルおよび円形高周波１Ｈコイル（１２ｃｍ内径）を装備した７テスラ水平システム（Ｖａｒｉａｎ−Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）上で収集する。

ＰＥＴ：一旦それらが、上記に記載されるように、安定してパーキンソン病であることが評価されたら、^１８Ｆ−ＦＭＴおよび^１８Ｆ−ファリプリドスキャンを、すべての動物に対して実行する。最初に、研究を通じて適用される定量化方法を確立するために、４匹の健康なコントロール動物を、^１８Ｆ−ＦＭＴおよび^１８Ｆ−ファリプリドの両方により画像化する。スキャンは、１．５ｍｍ軸方向分解能および４％感度を有するＦＯＣＵＳ ２２０ ＰＥＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して、プロポフォール麻酔薬下で実行する。動物は、異なるトレーサーの間で放射性崩壊を可能にするために、異なる日に、二つ一組で画像化される。

外科手術
ベクターを、それぞれの半球の被殻の中に注射する（ｍ． ファスシクラリスの脳地図から計算する）。それぞれの半球について、５０μＬの１回目の注射は、前交連から１ｍｍ尾側とする。５０μＬの２回目の注射は、前交連から４ｍｍ尾側とする。２×５０μＬ沈積物／半球の注射は、１００μＬ Ｈａｍｉｌｔｏｎガラスシリンジに付けられた２８ゲージ５１ｍｍ長ブラントステンレス鋼針を使用して、プロポフォール麻酔下で３μＬ／分の流量で行った。ベクター沈積物の正確な位置決めを確実にするために、ガイドチューブもまた使用する。

治療後の行動の経過観察
看護は、必要に応じて継続する。

３０分間のビデオ録画は、外科手術の３週間後からスタートして毎週撮り、外科手術の３か月後に終える。外科手術後の３〜６か月、３０分間のビデオ録画を、２週間ごとに撮る。臨床スコアリングは、外科手術後０〜３か月間、毎週、また、外科手術後３〜６か月間、２週間ごとに実行する。臨床評価スコア評価は、Ｊａｒｒａｙａら ２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：２ｒａ４において記載される。

ＭＲＩスキャン、^１８Ｆ−ＦＭＴおよび^１８Ｆ−ファリプリドＰＥＴスキャンはすべて、外科手術の３か月後に実行する。Ｌ−ドパチャレンジもまた、外科手術の３か月後に実行し、動物は、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ分析のために６時間、フィルムに記録する。ネガティブコントロールチャレンジもまた、必要に応じて実行し、その後にＥｔｈｏｖｉｓｉｏｎ分析を続ける。

死後の分析
安楽死の後に、脳を摘出し、抗体およびβｇａｌによる染色の前にプロセシングする。

上記の本明細書において言及される刊行物はすべて、参照によって本明細書において組み込まれる。本発明の記載される方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者らに明らかになるであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関して記載したが、主張される本発明がそのような特定の実施形態に不当に限定されないことが理解されたい。実際、分子生物学、ウイルス学、神経生物学、または関係する分野における当業者らに明らかな、本発明を実行するための記載されるモードの様々な修飾は、以下の請求項の範囲内にあるように意図される。

Claims (23)

1. （ｉ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードするヌクレオチド配列を含む構築物であって、融合タンパク質ＴＨ−ＣＨ１をコードするように、ＴＨをコードする前記ヌクレオチド配列が、ＣＨ１をコードする前記ヌクレオチド配列に対して連結されている、構築物。
2. 以下：
   ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_{−ＩＲＥＳ−}ＡＡＤＣ、
   ＡＡＤＣ_−Ｌ−ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１、
   ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_−Ｌ−ＡＡＤＣ、および
   ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_−Ｐ−ＡＡＤＣ
   から選択される、請求項１に記載の構築物であって、ここで、
   Ｌは、リンカーコード配列であり、
   ＩＲＥＳは、配列内リボソーム進入部位であり、
   Ｐは、プロモーターである、構築物。
3. ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_{−ＩＲＥＳ−}ＡＡＤＣである、請求項２に記載の構築物。
4. ヒトの使用頻度についてコドン最適化されていないリンカーを含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の構築物。
5. 配列番号１として示される配列を含むリンカーを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の構築物。
6. 配列ＡＡＤＣ_−Ｌ１−ＴＨ_−Ｌ２−ＣＨ１またはＴＨ_−Ｌ１−ＣＨ１_−Ｌ２−ＡＡＤＣを有し、Ｌ１およびＬ２が、２つの異なるリンカー配列である、請求項１または２に記載の構築物。
7. Ｌ１およびＬ２の核酸配列は異なるが、Ｌ１およびＬ２のアミノ酸配列は同じである、請求項６に記載の構築物。
8. Ｌ１およびＬ２の核酸配列が異なり、そして配列番号１および配列番号３から選択される、請求項７に記載の構築物。
9. 配列ＴＨ_−Ｌ−ＣＨ１_−Ｐ−ＡＡＤＣを有し、前記プロモーターが、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターである、請求項２に記載の構築物。
10. 前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、またはチミジンキナーゼプロモーターである構成的プロモーターである、請求項９に記載の構築物。
11. 前述の請求項のいずれか一項に記載の構築物を含むウイルスベクターゲノム。
12. レンチウイルスベクターゲノムまたはアデノ随伴ウイルスベクターゲノムである、請求項１１に記載のウイルスベクターゲノム。
13. 請求項１１または１２に記載のゲノムを含むウイルスベクター系。
14. レンチウイルスベクター系またはアデノ随伴ウイルスベクター系である、請求項１３に記載のウイルスベクター系。
15. 以下：
    （ｉ）請求項１１に記載のゲノム、
    （ｉｉ）ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）のヌクレオチド配列によってコードされない、他の不可欠なウイルスパッケージング構成成分をコードするヌクレオチド配列
    を含む、請求項１４に記載のレンチウイルスベクター系。
16. レンチウイルスベクター粒子を産生するための方法であって、前記方法は、産生細胞の中に、以下：
    ｉ）請求項１１に記載のゲノム、
    ｉｉ）ｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列、ならびに
    ｉｉｉ）ｉｉ）のヌクレオチド配列のうちの１つまたはそれより多くによってコードされない、他の不可欠なウイルスパッケージング構成成分をコードするヌクレオチド配列
    を導入するステップを包含する、方法。
17. 請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の系または請求項１６に記載の方法によって産生されるウイルス粒子であって、前記ウイルス粒子は、ドーパミン合成酵素ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、および芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を含み、ここでＴＨおよびＣＨ１が、ＴＨ−ＣＨ１融合タンパク質として存在する、ウイルス粒子。
18. ＥＩＡＶベクター粒子であり、ＶＳＶ−Ｇによりシュードタイプされた、請求項１７に記載のウイルスベクター粒子。
19. 薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤と一緒に、請求項１７または１８に記載のウイルス粒子を含む、薬学的組成物。
20. インビボにおいてドーパミンを産生するための方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の構築物から、被験体においてドーパミン合成酵素ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩ（ＣＨ１）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、および芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を発現させるステップを包含する、方法。
21. 被験体における神経変性疾患を治療するおよび／または予防するための方法であって、請求項１７もしくは１８に記載のウイルス粒子または請求項１８に記載の薬学的組成物を、前記被験体に対して投与するステップを包含する、方法。
22. インビボにおけるドーパミン合成を誘発することによって、被験体における神経変性疾患を治療するおよび／または予防するのに使用するための、請求項１７もしくは１８に記載のウイルス粒子または請求項１９に記載の薬学的組成物。
23. 前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項２１または２２に記載の方法、ウイルス粒子、または薬学的組成物。