PT1337655E - Vectores lentivirais para o tratamento de doenças neurodegenerativas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "VECTORES LENTIVIRAIS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS" A presente invenção refere-se a um sistema de vector. Em particular, a presente invenção refere-se a um sistema de vector lentiviral para o tratamento da doença de Parkinson. ANTECEDENTES Doença de Parkinson A doença de Parkinson (PD) é um distúrbio neurodegenerativo caracterizado pela perda da via nigrostriatal. Embora a causa da doença de Parkinson não seja conhecida, esta está associada com a morte progressiva de neurónios mesencefálicos dopaminérgicos (positivos para a hidroxilase da tirosina (TH)), induzindo dificuldades motoras. Os sintomas caracteristicos da doença de Parkinson aparecem quando degeneraram até 70% dos neurónios nigrostriatais positivos para a TH. Não existe actualmente qualquer cura satisfatória para a doença de Parkinson. O tratamento sintomático das dificuldades motoras associadas à doença envolve a administração oral de di-hidroxifenilalanina (L-DOPA). A L-DOPA é transportada através da barreira hematocefálica e é convertida em dopamina, parcialmente por neurónios dopaminérgicos residuais, originando 1 uma melhoria substancial da função motora. No entanto, após alguns anos, a degenerescência dos neurónios dopaminérgicos progride, os efeitos da L-DOPA são reduzidos e os efeitos secundários reaparecem. É, conseguentemente, necessária uma melhor terapia para a doença de Parkinson.

Uma estratégia alternativa para a terapia consiste no enxerto neuronal, o qual é baseado na ideia de que a dopamina proporcionada a partir de células implantadas no estriato pode substituir as células nigrostriatais perdidas. Foi demonstrado em ensaios clínicos que neurónios mesencefálicos positivos para a TH, obtidos a partir de cadáveres de embriões humanos (fetos abortados), podem sobreviver e funcionar nos cérebros de doentes com doença de Parkinson. No entanto, a recuperação funcional foi apenas parcial e a eficácia e a reproductibilidade do processo estão limitadas. Existem, também, questões éticas, práticas e de segurança associadas à utilização de tecido derivado de fetos humanos abortados. Além disso, as grandes quantidades de tecido necessárias para produzir um efeito terapêutico deverão revelar-se proibitivas. Foram realizadas algumas tentativas para utilizar neurónios positivos para TH provenientes de outras espécie (de forma a contornar alguns problemas éticos e práticos). No entanto, o xenotransplante requer tratamento imunossupressor e é também controverso devido, por exemplo, ao possível risco da transferência inter-espécies de agentes infecciosos. Outra desvantagem consiste no facto de, nos protocolos de enxerto actuais, não sobreviverem mais de 5-20% dos números esperados de neurónios positivos para TH enxertados. De forma a desenvolver um protocolo de transplante praticável e eficaz, é necessária uma fonte alternativa de neurónios positivos para TH. 2

Uma estratégia alternativa adicional para terapia consiste na terapia génica. Foi sugerido que a terapia génica possa ser utilizada na doença de Parkinson de dois modos: para substituir a dopamina no estriato afectado, pela introdução das enzimas responsáveis pela L-DOPA ou pela síntese da dopamina (por exemplo, hidroxilase da tirosina); e para introduzir moléculas neuroprotectoras potenciais que podem prevenir a morte dos neurónios positivos para TH ou estimular a regeneração e recuperação funcional no sistema nigrostriatal danificado (Dunnet S. B. e Bjõrklund A. (1999) Nature 399 A32-A39).

In vivo, a dopamina é sintetizada a partir da tirosina por duas enzimas, hidroxilase da tirosina (TH) e descarboxilase DOPA de aminoácidos aromáticos (AADC). A doença de Parkinson revelou responder a tratamentos que facilitam a transmissão dopaminérgica no caudado-putâmen. Em animais experimentais, as células geneticamente modificadas que expressam hidroxilase da tirosina e que deste modo sintetizam L-DOPA, induzem a recuperação comportamental em modelos de roedor da PD (Wolff et al. (1989) PNAS (USA) 86:9011-14; Freed et al. (1990) Arch. Neurol. 47:505-12; Jiao et al. (1993) Nature 262:4505). A actividade funcional da hidroxilase da tirosina depende da disponibilidade do seu cofactor tetra-hidrobiopterina (BH4) . O nível de cofactor pode ser insuficiente no estriato desinervado e, portanto, pensa-se que possa ser também necessária que a ciclo-hidrolase I do GTP, a enzima que catalisa o passo limitante da velocidade na via da síntese de BH4, seja transduzida para obter níveis suficientes de produção de L-DOPA in vivo (Bencsics et al. (1996) J. Neurosci 16:4449-4456; Leff et al. (1998) Exp. Neurol. 151:249-264). 3

Embora já tenham sido propostas estratégias de terapia génica in vivo e ex vivo para o tratamento da doença de Parkinson (Dunnet e Bjorklund (1999) como acima; Raymon et ai. (1997) Exp. Neurol. 144:82-91; Kang (1998) Mov. Dis. 13: 59-72) o progresso significativo nesta tecnologia tem sido impedido pela eficiência limitada da transferência génica e da expressão nas células alvo. Um problema no que a isto respeita consiste no facto das células alvo serem normalmente células em não-divisão (i. e. neurónios) que são notoriamente recalcitrantes à transdução.

Expressão de mais de uma proteína 0 documento WO 98/18934 refere-se a uma sequência polinucleotídica para utilização em terapia génica, em que a sequência polinucleotídica compreende dois ou mais genes terapêuticos ligados operativamente a um promotor e codifica um produto de proteína de fusão dos genes terapêuticos. Isto proporciona uma forma de expressar dois genes terapêuticos a partir de um único "gene quimérico". Numa forma de realização preferida, a sequência polinucleotídica é capaz de codificar uma proteína de fusão compreendendo hidroxilase da tirosina e descarboxilase DOPA na ordem ΤΗ-DD ou DD-ΤΗ, ligada por um elemento de ligação flexível.

Como discutido no documento WO/18924, de entre os sistemas de transferência génica, os vectores retrovirais são substancialmente promissores para a terapia génica. Estes sistemas podem transferir genes eficientemente e estão a emergir novos vectores que são particularmente úteis para a distribuição de genes a células cerebrais (Naldini et al., 1996 Science 272, 4 263). No entanto, resulta evidente da literatura que os vectores retrovirais atingem os títulos mais elevados e as propriedades de expressão génica mais potentes se estes forem mantidos geneticamente simples (documento PCT/GB96/01230; Bowtell et al., 1988 J. Virol. 62, 2464; Correll et al., 1994 Blood 84, 1812;

Emerman e Temin 1984 Cell 39, 459; Ghattas et al., 1991 Mol. Cell. Biol. 11, 5848; Hantzopoulos et al., 1989 PNAS 86, 3519; Hatzoglou et al., 1991 J. Biol. Chem 266, 8416; Hatzoglou et al., 1988 J. Biol. Chem 263, 17798; Li et al., 1992 Hum. Gen.

Ther. 3, 381; McLachlin et al., 1993 Virol. 195, 1; Overell et al • r 1988 Mol. Cell Biol. • 8, 18 03; Scharfman et al., 1991 PNAS 00 00 4626; Vile et al., 1994 Gene Ther 1, 307; Xu et al., 1989 Virol. 171, 331; Yee et al., 1987 PNAS 84, 5197). Isto significa utilizar uma única unidade de transcrição no interior do genoma do vector e organizar uma expressão génica adequada a partir de sequências no interior da LTR 5' ou a partir de um promotor interno, utilizando uma LTR auto-inactivante ou utilizando a tecnologia do intrão dividido descrita no documento W099/15683 .

De acordo com o documento WO 98/18934, se for verificada uma necessidade de expressar duas proteínas a partir de um único vector retroviral é preferido, expressá-las como uma proteína de fusão (codificada por uma única sequência nucleotídica) do que utilizar um local de entrada de ribossoma interno (IRES) para iniciar a tradução da segunda sequência codificante numa mensagem poli-cistrónica. De acordo com o documento WO 98/18934, isto é devido à eficiência de um IRES ser frequentemente baixa e dependente do tecido tornando a estratégia indesejável quando se pretende maximizar a eficiência da conversão metabólica, por exemplo, da tirosina para a dopamina. 5

Quando localizado entre grelhas de leitura aberta num ARN, um IRES permite a tradução da grelha aberta a jusante pela promoção da entrada do ribossoma no elemento IRES seguido pela iniciação da tradução a jusante. Foi investigada a utilização de elementos IRES em vectores retrovirais (ver, por exemplo, o documento WO 93/0314) mas a expressão do ADNc situado a jusante do IRES revelou ser frequentemente ineficiente. Isto pode ser devido à competição dos ribossomas e de outros factores celulares. Consequentemente, irá ser expectável que a eficiência da iniciação de tradução diminua com números crescentes de elementos IRES.

Expressão de genes heterólogos grandes

Embora o conceito da utilização de vectores virais para distribuir um gene heterólogo a uma célula receptora seja bem conhecido (Verma e Somia (1997) Nature 389:239-242), é amplamente aceite que existem limites para o tamanho do gene heterólogo que pode ser transduzido com sucesso (ver, por exemplo, página 446, Capitulo 9 de Coffin et al. “Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press). Se a incorporação do gene heterólogo e dos elementos reguladores associados aumentar drasticamente o tamanho do genoma virai, então existe um risco significativo de deixar de poder ser empacotado com sucesso ou, pelo menos, que a eficiência do empacotamento seja significativamente reduzida.

Apesar do preconceito aparente na técnica, a presente requerente mostrou que os vectores lentivirais expressando uma cassete bicistrónica (codificando TH e GTP-CH1) e mesmo uma cassete tricistrónica (codificando TH, AADC e GTP-CH1) podem 6 das enzimas originar a expressão das enzimas adequadas em células heterólogas em cultura e in vivo. A incorporação da cassete tricistrónica no vector lentiviral causa um aumento do tamanho do genoma de ARN de aproximadamente 10%-30% (em relação ao genoma de ARN do tipo selvagem) mas, surpreendentemente, a eficiência de transferência genética não é significativamente afectada. As eficiências de integração são comparáveis e é demonstrada uma transferência genética eficiente para os neurónios. Além disso, a requerente mostrou que esses vectores podem ser utilizados para aumentar os niveis de determinadas catecolaminas no tecido desinervado e, consequentemente, corrigir modelos de roedor e de primata da doença de Parkinson.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 0 primeiro aspecto da invenção refere-se a genomas de vectores virais. Numa primeira forma de realização do primeiro aspecto da invenção é proporcionado um genoma de vector lentiviral compreendendo três ou mais NOI (sequências nucleotídicas de interesse) operativamente ligadas por dois ou mais Local (ais) de Entrada do Ribossoma internos, em que as NOI codificam uma proteína seleccionada do grupo seguinte:

Hidroxilase de Tirosina, ciclo-hidrolase I do GTP, Descarboxilase Dopa de Aminoácidos Aromáticos e Transportador Vesicular 2 de Monoamina. 0 segundo aspecto da invenção refere-se a sistemas de vector. 7

Numa primeira forma de realização do segundo aspecto da invenção é proporcionado um sistema de vector compreendendo um genoma de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

De acordo com aspectos adicionais da invenção, é proporcionado: um método para produzir uma partícula lentiviral que compreende a introdução desse genoma virai numa célula produtora; uma partícula virai produzida através desse sistema ou método; uma composição farmacêutica compreendendo esse genoma, sistema ou partícula; a utilização desse genoma, sistema ou partícula na preparação de uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir uma doença; e uma célula que foi transduzida com esse sistema.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 0 primeiro aspecto da invenção refere-se a genomas de vectores retrovirais e lentivirais.

RETROVIRUS O conceito de utilizar vectores virais em terapia génica é bem conhecido (Verma e Somia (1997) Nature 389:239-242).

Existem muitos retrovirus. Para o presente pedido, o termo "retrovírus" inclui: virus da leucemia murina (MLV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV), vírus do tumor mamário de murganho (MMTV), vírus do sarcoma de Rous (RSV), vírus do sarcoma de Fujinami (FuSV), vírus da leucemia murina Moloney (Mo-MLV), vírus do osteosarcoma murino FBR (FBR MSV), vírus do sarcoma murino de Moloney (Mo-MSV), vírus da leucemia murina de Abelson (A-MLV), vírus da mielocitomatose Aviária-29 (MC29) e vírus da eritroblastose Aviária (AEV) e todos os outros retrovírus incluindo lentivírus.

Em Coffin et al. ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Ed: Coffin JM, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763) pode ser encontrada uma lista detalhada de retrovírus.

Os lentivírus pertencem também à família dos retrovírus, mas estes podem infectar células em divisão e em não-divisão (Lewis et al. (1992) EMBO J. 3053-3058). 0 grupo dos lentivírus pode ser dividido em "primata" e "não-primata". Os exemplos de lentivírus de primata incluem o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida humana (SIDA) e o vírus da imunodeficiência símia (SIV). O grupo lentiviral não-primata inclui o protótipo vírus visna/maedi (VMV) de "vírus lento", assim como o vírus da artrite-encefalite caprina (CAEV) relacionado, o vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) e o 9 vírus da imunodeficiência felina (FIV) mais recentemente descrito e o vírus da imunodeficiência bovina (BIV).

Podem ser encontrados na técnica detalhes da estrutura genómica de alguns lentivírus. A título de exemplo, na base de dados NCBI Genbank podem ser encontrados detalhes sobre o HIV e o EIAV (i. e., respectivamente N° de Acesso de Genoma AF033819 e AF033820). Podem ser também encontrados detalhes de variantes do HIV em http://hiv-web.lanl.gov. Os detalhes de variantes do EIAV podem ser encontrados em http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Durante o processo de infecção, um retrovírus liga-se inicialmente a um receptor específico da superfície celular. Após a entrada na célula hospedeira susceptível, o genoma de ARN retroviral é, então, copiado para ADN pela transcriptase reversa codificada viralmente que está contida no interior do vírus parental. Este ADN é transportado até ao núcleo da célula hospedeira onde este, subsequentemente, se integra no genoma hospedeiro. Nesta etapa, é tipicamente designado como provírus. 0 provírus é estável no cromossoma hospedeiro durante a divisão celular e é transcrito como outros genes celulares. 0 provírus codifica as proteínas e outros factores necessários para produzir mais vírus que podem abandonar a célula através de um processo por vezes designado "gemulação".

Cada genoma retroviral compreende genes designados gag, pol e env que codificam para proteínas do virião e enzimas. Estes genes estão flanqueados em ambas as extremidades por regiões designadas por repetições terminais longas (LTR). As LTR são responsáveis pela integração e pela transcrição proviral. Estas servem também como sequências intensificadoras-promotoras. Por outras palavras, as LTR podem controlar a expressão dos genes 10 virais. A encapsidação dos ARN retrovirais ocorre em consequência de uma sequência psi localizada na extremidade 5' do genoma virai.

As próprias LTR são sequências idênticas que podem ser divididas em três elementos, que são designados U3, Re U5. A U3 é derivada da sequência única da extremidade 3' do ARN. A R é derivada de uma sequência repetida em ambas as extremidades do ARN e a U5 é derivada da sequência única da extremidade 5' do ARN. Os tamanhos dos três elementos podem variar consideravelmente entre retrovirus diferentes.

Para o genoma virai, o local da iniciação da transcrição situa-se no limite entre U3 e R na LTR do lado esquerdo e o local de adição de poli(A) (terminação) situa-se no limite entre R e U5 na LTR do lado direito. A U3 contém a maioria dos elementos de controlo da transcrição do provírus, a qual inclui o promotor e sequências intensificadoras múltiplas que correspondem a proteínas activadoras da transcrição celulares e em alguns casos, virais. Alguns retrovirus têm um ou mais dos genes seguintes que codificam para proteínas que estão envolvidas na regulação da expressão génica: tat, rev, tax e rex.

No que se refere aos próprios genes estruturais gag, pol e env, gag codifica a proteína estrutural interna do vírus. A proteína gag é processada proteoliticamente nas proteínas maduras MA (matriz), CA (cápside) e NC (nucleocápside) . 0 gene pol codifica a transcritase reversa (RT), a qual contém a polimerase de ADN, RNase H e integrase (IN) associadas, que medeiam a replicação do genoma. 0 gene env codifica a glicoproteína de superfície (SU) e a proteína transmembranar 11 (TM) do virião, que forma um complexo que interage especificamente com proteínas receptoras celulares. Esta interacção conduz finalmente à infecção por fusão da membrana virai com a membrana celular. Os retrovírus podem também conter genes "adicionais" que codificam para proteínas além de gag, pol e env. Os exemplos de genes adicionais incluem em HIV, um ou mais de vif, vpr, vpx, vpu, tat, rev e nef. 0 EIAV tem, por exemplo, os genes adicionais S2 e dUTPase.

As proteínas codificadas por genes adicionais servem várias funções, algumas das quais podem ser duplicadoras de uma função proporcionada por uma proteína celular. No EIAV, por exemplo, a tat actua como um activador da transcrição da LTR virai. Esta liga-se a uma estrutura secundária de ARN em ansa, estável designada como TAR. Rev regula e coordena a expressão de genes virais através de elementos de resposta a rev (RRE). Pensa-se que os mecanismos da acção destas duas proteínas sejam de um modo geral semelhantes aos mecanismos análogos nos vírus de primata. A função da S2 é desconhecida. Além disso, foi identificada uma proteína do EIAV, a Ttm, que é codificada pelo o primeiro exão da tat processado para a sequência codificante de env no início da proteína transmembranar.

SISTEMAS DE DISTRIBUIÇÃO

Foram propostos sistemas de vectores retrovirais como um sistema de distribuição para inter alia a transferência de uma NOI para um ou mais locais de interesse. A transferência pode ocorrer in vitro, ex vivo, in vivo ou suas combinações. Os sistemas de vectores retrovirais foram até mesmo explorados para estudar vários aspectos do ciclo de vida do retrovírus, 12 incluindo a utilização do receptor, transcrição reversa e empacotamento do ARN (revisto por Miller, 1992 Curr Top Microbiol Immunol 158:1-24).

Uma partícula de vector retroviral recombinante é capaz de transduzir uma célula receptora com uma NOI. Uma vez no interior da célula o genoma de ARN da partícula de vector é transcrito reversamente em ADN e é integrado no ADN da célula receptora.

Como aqui utilizado, o termo "genoma do vector" refere-se à construção de ARN presente na partícula de vector retroviral e à construção de ADN integrado. 0 termo também se refere a uma construção de ADN separada ou isolada capaz de codificar esse genoma de ARN. Um genoma retroviral ou lentiviral deve compreender, pelo menos, uma parte componente derivável de um retrovírus ou um lentivírus. 0 termo "derivável" é utilizado com o seu sentido normal significando uma sequência nucleotídica ou uma sua parte que não necessita de ser necessariamente obtida de um vírus, tal como um lentivírus mas em lugar disso pode ser derivada desta. A título exemplo, a sequência pode ser preparada sinteticamente ou utilizando técnicas de ADN recombinante. De um modo preferido, o genoma compreende uma região psi (ou um componente análogo que é capaz de causar encapsidação). 0 genoma do vector virai é, de um modo preferido, "deficiente para a replicação" pelo que se pretende significar que o genoma não compreende a informação genética suficiente isoladamente para permitir a replicação independente para produzir partículas virais infecciosas no interior da célula receptora. Numa forma de realização preferida, o genoma necessita de um gene env, gag ou pol funcional. 13 0 genoma do vector virai pode compreender alguns ou todas as repetições terminais longas (LTR). De um modo preferido, o genoma compreende, pelo menos, parte das LTR ou uma sequência análoga que seja capaz de mediar a integração e a transcrição proviral. A sequência pode também compreender ou actuar como uma sequência intensificadora-promotora. 0 genoma do vector virai do primeiro aspecto da invenção pode ser proporcionado sob a forma de um kit de partes. Por exemplo, o kit pode compreender (i) um plasmideo ou plasmideos contendo a(s) sequência(s) do IRES e da NOI; e (ii) uma construção de genoma retroviral com locais de reconhecimento de enzima de restrição adequados para clonar as NOI e IRES no genoma virai. É conhecido que a expressão separada dos componentes necessários para produzir uma partícula de vector retroviral em sequências de ADN separadas co-introduzidas na mesma célula irá produzir partículas retrovirais contendo genomas retrovirais deficientes que contêm genes terapêuticos (e. g. Revisto por Miller 1992). Esta célula é designada como célula produtora (ver abaixo) . Há dois processos comuns para produzir células produtoras. Num destes, as sequências codificando as proteínas retrovirais Gag, Pol e Env são introduzidas na célula e são integradas de forma estável no genoma da célula; é produzida uma linha celular estável que é designada como a linha celular de empacotamento. A linha celular de empacotamento produz as proteínas necessárias para empacotar o ARN retroviral mas esta não pode realizar a encapsidação devido à falta de uma região psi. No entanto, quando um genoma de vector de acordo com o primeiro aspecto da 14 invenção (tendo uma região psi) é introduzido na linha celular de empacotamento, as proteínas auxiliadoras podem empacotar o ARN do vector recombinante positivo para psi para produzir o armazenamento de vírus recombinante. Isto pode ser utilizado para transduzir a NOI em células receptoras. 0 vírus recombinante cujo genoma não apresenta todos os genes necessários para produzir as proteínas virais pode infectar apenas uma vez e não se pode propagar. Deste modo, a NOI é introduzida no genoma de célula hospedeira sem a produção de retrovírus potencialmente perigosos. Em "Retroviruses" (1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Ed: Coffin JM, SM Hughes, He Varmus pp 449) é apresentado um sumário das linhas de empacotamento disponíveis. A presente invenção proporciona também uma linha celular de empacotamento compreendendo um genoma de vector virai do primeiro aspecto da invenção. Por exemplo, a linha celular de empacotamento pode ser transduzida com um sistema de vector virai compreendendo o genoma ou ser transfectada com um plasmídeo contendo uma construção de ADN capaz de codificar o genoma de ARN. A presente invenção proporciona também uma partícula de vector retroviral (ou lentiviral) produzida por essa célula. A segunda abordagem consiste em introduzir simultaneamente três sequências de ADN diferentes que são necessárias para produzir uma partícula de vector retroviral i. e. as sequências codificantes de env, a sequência codificante de gag-pol e o genoma retroviral deficiente contendo uma ou mais NOI na célula ao mesmo tempo por transfecção transiente e o processo é designado como transfecção tripla transiente (Landau e 1992 Littman; Pear et al. 1993). 0 processo de transfecção triplo foi 15 optimizado (Soneoka et al. 1995; Finer et al. 1994). 0 documento WO 94/29438 descreve a produção de células produtoras In vitro utilizando este método de transfecção transiente de ADN múltiplo.

Os componentes do sistema virai que são necessários para complementar o genoma do vector podem estar presente em um ou mais "plasmídeos produtores" para transfecção em células. A presente invenção proporciona também um sistema de vector, compreendendo (i) um genoma virai de acordo com o primeiro aspecto da invenção; (ii) uma sequência nucleotidica codificando para as proteínas lentivirais gag e pol; (iii) sequências nucleotídicas codificando outros componentes de empacotamento virais essenciais não codificados pela sequência nucleotidica de ii). Numa forma de realização preferida, a sequência nucleotidica de (iii) é capaz de codificar uma proteína env. A presente invenção proporciona também uma célula transfectada com esse sistema de vector e uma partícula de vector retroviral produzida por essa célula. De um modo preferido, a sequência gag-pol é optimizada em termos de codões para utilização na célula produtora particular (ver abaixo). A proteína env codificada pela sequência nucleotidica de iii) pode ser uma proteína env retroviral ou lentiviral homóloga. Alternativamente, esta pode ser uma env heteróloga ou 16 uma env de um não-retro ou lentivírus (ver abaixo sob "pseudotipagem"). 0 termo "sistema de vector virai" é utilizado geralmente para significar um kit de partes que podem ser utilizadas quando combinadas com outros componentes necessários para a produção de partículas virais para produzir partículas virais em células hospedeiras. Por exemplo, o genoma do vector retroviral pode não apresentar um ou mais dos genes necessários para a replicação virai. Isto pode ser combinado num kit com uma sequência ou sequências nucleotídicas complementars adicionais, por exemplo, em um ou mais plasmídeos produtores. Os componentes necessários devem ser proporcionados por cotransfecção do genoma em conjunto com o(s) plasmídeo(s) produtor(es), para a produção de partículas virais infecciosas.

Alternativamente, a(s) sequência(s) nucleotídica(s) complementar(es) pode(m) estar presentes de uma forma estável no interior de uma linha celular de empacotamento que está incluída no kit.

De um modo preferido, o sistema de vector retroviral da presente invenção é um sistema de vector auto-inactivante (SIN). A título de exemplo, foram construídos sistemas de vectores retrovirais auto-inactivantes eliminando os intensificadores da transcrição ou os intensificadores e promotor na região U3 da LTR 3'. Após um ciclo de transcrição reversa e integração do vector, estas modificações são copiadas para as LTR 5' e para as 3' produzindo um provírus inactivo transcricionalmente. No entanto, qualquer(quaisquer) promotor(s) interno(s) em relação às LTR nesses vectores irá(ão) ser ainda transcricionalmente 17 activo(s). Esta estratégia foi utilizada para eliminar os efeitos dos intensificadoras e promotores nas LTR virais na transcrição de genes localizados internamente. Esses efeitos incluem a transcrição aumentada ou supressão da transcrição. Esta estratégia pode ser também utilizada para eliminar a transcrição a jusante das LTR 3' no ADN genómico. Isto é de particular importância em terapia génica humana em que pode ser importante impedir a activação adventícia de um oncogene endógeno. Yu et al., (1986) PNAS 83: 3194-98; Marty et al., (1990) Biochimie 72: 885-7; Naviaux et al., (1996) J. Virol. 70: 5701-5; Iwakuma et al., (1999) Virol. 261: 120-32; Deglon et al.; (2000) Human Gene Therapy 11: 179-90.

De um modo preferido, é utilizado um mecanismo assistido por recombinase que facilita a produção de vectores lentivirais regulados de título elevado a partir das células produtoras da presente invenção.

Como aqui utilizado, o termo "sistema assistido por recombinase " inclui, mas não está limitado a um sistema utilizando os locais de reconhecimento da recombinase Cre/loxP do bacteriófago PI ou a recombinase FLP específica para um local de S. cerevisiae que catalisa eventos de recombinação entre alvos de reconhecimento da FLP (FRT) com 34 pb. A recombinase FLP específica para um local de S. cerevisiae que catalisa eventos de recombinação entre alvos de reconhecimento da FLP (FRT) com 34 pb foi configurada em construções de ADN para produzir linhas celulares produtoras de nível elevado utilizando eventos de recombinação assistidos por recombinase (Karreman et al. (1996) NAR 24:1616-1624). Foi desenvolvido um sistema semelhante utilizando os locais de 18 reconhecimento recombinase Cre/loxP do bacteriófago Pl (Vanin et al. (1997) J. Virol 71:7820-7826). Isto foi configurado num genoma lentiviral de forma a serem produzidos títulos elevados de linhas celulares produtoras de lentivírus. É possível propagar e isolar quantidades de partículas de vector retroviral (e. g. para preparar títulos adequados de partículas de vector retroviral) para a transdução subsequente de, por exemplo, um local de interesse (tal como tecido cerebral adulto) utilizando linhas celulares produtoras/empacotadoras. As linhas celulares produtoras são normalmente melhores para produção em grande escala de partículas de vector. A transfecção transiente apresenta várias vantagens em relação ao método do empacotamento em células. No que a isto respeita, a transfecção transiente evita o tempo mais longo necessário para produzir linhas celulares produtoras de vector estáveis e é utilizada se o genoma do vector ou os componentes de empacotamento retroviral forem tóxicos para as células. Se o genoma do vector codificar genes tóxicos ou genes que interfiram com a replicação da célula hospedeira, tais como inibidores do ciclo celular ou genes que induzam a apoptose, pode ser difícil produzir linhas celulares produtoras de vector estáveis, mas pode ser utilizada a transfecção transiente para produzir o vector antes da morte das células. Foram também desenvolvidas linhas celulares utilizando infecção transiente que produzem níveis de título de vector que são comparáveis aos níveis obtidos a partir de linhas celulares produtoras de vector estáveis (Pear et al. 1993, PNAS 90:8392-8396).

As células de células produtoras/empacotadoras podem ser de qualquer tipo de célula adequado. As células produtoras são 19 geralmente células de mamífero mas podem ser, por exemplo, células de insecto.

Como aqui utilizado, o termo "célula produtora" ou "célula produtora de vector" refere-se a uma célula contendo todos os elementos necessários para a produção de partículas de vector retroviral.

De um modo preferido, a célula produtora é obtenível a partir de uma linha celular produtora estável.

De um modo preferido, a célula produtora é obtenível a partir de uma linha celular produtora estável derivada.

De um modo preferido, a célula produtora é obtenível a partir de uma linha celular produtora derivada.

Como aqui utilizado, o termo "linha celular produtora derivada" é uma linha celular produtora transduzida que foi rastreada e seleccionada para a expressão elevada de um gene marcador. Essas linhas celulares suportam uma expressão de nível elevado do genoma retroviral. 0 termo "linha celular produtora derivada" é utilizado de modo indiferente com o termo "linha celular produtora estável derivada" e o termo "linha celular produtora estável.

De um modo preferido, a linha celular produtora derivada inclui, mas não está limitada a uma célula produtora de retrovírus e/ou de lentivírus. 20

De um modo preferido, a linha celular produtora derivada é uma linha celular produtora de HIV ou de EIAV, de um modo mais preferido, uma linha celular produtora de EIAV.

De um modo preferido, as sequências de proteína do invólucro e as sequências da nucleocápside estão todas integradas, de forma estável, na célula produtora e/ou empacotadora. No entanto, pode também existir uma ou mais destas sequências na forma epissómica e pode ocorrer expressão génica a partir do epissoma.

Como aqui utilizado, o termo "célula empacotadora" refere-se a uma célula contendo os elementos necessários para a produção do vírus recombinante infeccioso que não estão presentes no genoma de ARN. Tipicamente, essas células empacotadoras contêm um ou mais plasmídeos produtores que são capazes de expressar proteínas estruturais virais (tais como gag-pol e env optimizadas em termos de codões) mas estas não contêm um sinal de empacotamento. É utilizado o termo "sinal de empacotamento" que é desingado de um modo indiferente como "sequência de empacotamento" ou "psi" em referência à sequência não-codificante, que actua em cis necessária para a encapsidação de cadeias de ARN retroviral durante a formação da partícula virai. No HIV-1, esta sequência foi mapeada em loci estendendo-se desde a montante do local dador de processamento principal (SD) até, pelo menos, ao codão de iniciação de gag.

Podem ser facilmente preparadas linhas celulares empacotadoras adequadas para a utilização com as construções de vector acima descritas (ver também o documento WO 92/05266) e 21 podem ser utilizadas para criar linhas celulares produtoras para a produção de partículas de vector retroviral. Como já referido, em "Retroviruses" (como acima) é apresentado um resumo das linhas de empacotamento disponíveis.

Como também discutido acima, foi verificado que as linhas celulares de empacotamento simples, compreendendo um provírus em que foi eliminado o sinal de empacotamento, oriqinam a produção rápida por recombinação de vírus competentes para a replicação indesejáveis. Para melhorar a segurança, foi produzida uma segunda geração de linhas celulares, em que foi eliminada a LTR 3' do provírus. Nessas células, seriam necessárias duas recombinações para produzir um vírus do tipo selvagem. Uma melhoria adicional envolve a introdução dos genes gag-pol e do gene env em construções separadas designada terceira geração de linhas celulares de empacotamento. Estas construções são introduzidas em sequência para prevenir a recombinação durante a transfecção.

De um modo preferido, as linhas celulares de empacotamento são linhas celulares de empacotamento de segunda geração.

De um modo preferido, as linhas celulares de empacotamento são linhas celulares de empacotamento de terceira geração.

Nestas construções separadas, linhas celulares de terceira geração, pode ser realizada uma redução adicional da recombinação por modificação dos codões. Esta técnica, baseada na redundância do código genético, pretende reduzir a homologia entre as construções separadas, por exemplo, entre as regiões de sobreposição nas grelhas de leitura aberta de gag-pol e env. 22

As linhas celulares de empacotamento são úteis para proporcionar os produtos génicos necessários para encapsidar e proporcionar a proteína de membrana para uma produção de partículas de vector com um título elevado. A célula empacotadora pode ser uma célula cultivada in vitro tal como uma linha celular de cultura de tecidos. As linhas celulares adequadas incluem, mas não estão limitadas a células de mamífero, tais como linhas celulares derivadas de fibroblastos murinos ou linhas celulares humanas. De um modo preferido, a linha celular de empacotamento é uma linha celular de primata ou humana, tais como por exemplo: HEK293, 293-T, TE671, HT1080.

Alternativamente, a célula empacotadora pode ser uma célula derivada do indivíduo a ser tratado, tal como um monócito, macrófago, célula sanguínea ou fibroblasto. A célula pode ser isolada a partir de um indivíduo e os componentes de empacotamento e do vector serem administrados ex vivo seguidos pela re-administração das células de empacotamento autólogas. É altamente desejável utilizar preparações de vírus de título elevado em aplicações experimentais e práticas. As técnicas para aumentar o título virai incluem a utilização de um sinal de empacotamento psi mais como discutido acima e a concentração de armazenamentos virais.

Como aqui utilizado, o termo "título elevado" significa uma quantidade eficaz de um vector ou partícula retroviral que é capaz de transduzir um local alvo, tal como uma célula.

Como aqui utilizado, o termo "quantidade eficaz" significa uma quantidade de um vector ou de uma partícula de vector 23 retroviral ou lentiviral regulado que é suficiente para induzir a expressão dos NOI num local alvo.

Uma preparação virai de título elevado para uma célula produtora/empacotadora é normalmente da ordem de 105 a 107 partículas retrovírus por mL. Para a transdução em tecidos, tal como o cérebro, é necessário utilizar volumes muito pequenos, pelo que a preparação virai é concentrada por ultracentrifugação. A preparação resultante deve ter, pelo menos, 108 t.u./mL, de um modo preferido, de 10 8 a 109 t.u./mL, de um modo mais preferido, pelo menos, 109 t. u. / mL . (0 título é expresso em unidades de transdução por mL (t. u./mL) como titulado numa linha celular D17 padrão - ver o Exemplo 9). Podem ser utilizados outros métodos de concentração, tal como ultrafiltração ou ligação a uma matriz e eluição a partir desta.

Os produtos de expressão codificados pelas NOI podem ser proteínas que são segregadas pela célula. Alternativamente os produtos de expressão de NOI não são segregados e são activos no interior da célula. Para algumas aplicações, é preferido, que o produto de expressão da NOI apresente um efeito espectador ou um efeito de espectador distante; ou seja a produção do produto de expressão numa célula a originar a modulação de células adicionais, relacionadas, vizinhas ou distantes (e. g. metastáticas), que possuem um fenótipo comum. Zennou et al., (2000) Cell 101: 173; Folleuzi et al., (2000) Nat. Genetics 25: 217; Zennou et al., (2001) Nat. Biotechnol. 19: 446. A presença de uma sequência denominada o tracto central da polipurina (cPPT) pode melhorar a eficiência da distribuição de genes a células em não-divisão. Este elemento que actua em cis está localizado, por exemplo, no elemento da região codificante 24 da polimerase do EIAV. De um modo preferido, o genoma da presente invenção compreende uma sequência cPPT.

De um modo preferido, o genoma virai compreende um elemento regulador pós-tradução. Por exemplo, o genoma pode compreender um elemento, tal como o elemento regulador pós-transcrição do vírus da hepatite do sagui comum (WPRE). Zufferey et al., (1999) J. Virol. 73: 2886; Barry et al., (2001) Human Gene Therapy 12: 1103 .

Além disso ou em alternativa, o genoma virai pode compreender um intensificador da tradução.

As NOI podem estar ligadas operativamente a um ou mais elementos promotores/intensificadores. A transcrição de uma ou mais NOI pode estar sob o controlo de LTR virais ou alternativamente de elementos promotores-intensificadores. De um modo preferido, o promotor é um promotor virai forte, tal como CMV ou é um promotor constitutivo celular, tal como PGK, beta-actina ou EFlalpha. O promotor pode ser regulado ou ser específico para um tecido. Esses promotores podem ser seleccionados de genes, tais como neurofilamentos, nestina, parkina, receptores da dopamina, hidroxilase da tirosina. Esses promotores podem também conter sequências supressoras neurorrestrictivas tais como as encontradas no gene do receptor mu-opoid. Numa forma de realização preferida, o promotor pode ser específico para células gliais ou ser específico para neurónios. O controlo da expressão pode ser também realizado utilizando tais sistemas como o sistema da tetraciclina que liga ou desliga a expressão génica em resposta a agentes externos (neste caso tetraciclina ou seus análogos). 25

PSEUDOTIPAGEM

Na concepção de sistemas de vector retrovirais é desejável modificar partículas com especificidade diferente para as células alvo em relação ao vírus nativo, para permitir a distribuição do material genético a uma gama alargada ou alterada de tipos celulares. Uma forma para realizar isto consiste em modificar a proteína do invólucro do vírus para alterar a sua especificidade. Outra abordagem consiste em introduzir uma proteína do invólucro heteróloga na partícula de vector para substituir ou adicionar à proteína do invólucro nativa do vírus. 0 termo pseudotipagem significa incorporar em, pelo menos, uma parte ou substituir uma parte ou substituir a totalidade de um gene env de um genoma virai por um gene env heterólogo, por exemplo, um gene env de outro vírus: a Pseudot ipagem não é um novo fenómeno e podem ser encontrados exemplos nos documentos WO 99/61639, WO-A-98/05759, WO-A-98/05754, WO-A-97/17457, WO-A-96/09400, WO-A-91/00047 e Mebatsion et al. 1997 Cell 90, 841-847 .

Numa forma de realização preferida da presente invenção o sistema de vector é pseudotipado com um gene codificando, pelo menos, a parte da proteína G da raiva. Numa forma de realização adicional preferida da presente invenção o sistema de vector é pseudotipado com um gene codificando, pelo menos, parte da proteína VSV-G.

Foi demonstrado que pode ser construído um sistema mínimo de lentivírus a partir dos vírus HIV, SIV, FIV e EIAV. Esse sistema não requer qualquer dos genes adicionais vif, vpr, vpx, 26 vpu, tat, rev e nef quer para a produção do vector quer para a transdução de células em divisão e não-divisão. Foi também demonstrado que pode ser construído um sistema mínimo de vector EIAV que não requer S2 para a produção do vector ou para a transdução de células em divisão e não-divisão. A eliminação de genes adicionais é altamente vantajosa. Em primeiro lugar, esta permite que sejam produzidos vectores sem os genes associados à doença em infecções lentivirais (e. g. HIV) . Em particular tat está associado à doença. Em segundo lugar, a eliminação de genes adicionais permite ao vector empacotar mais ADN heterólogo. Em terceiro lugar, os genes cuja função é desconhecida, tal como S2, podem ser omitidos, reduzindo deste modo o risco de causar efeitos indesejados. Nos documentos WO-A-99/32646 e WO-A-98/17815 são divulgados exemplos de vectores mínimos lentivirais.

Assim, de um modo preferido, o sistema de distribuição utilizado na invenção é destituído de, pelo menos, tat e S2 (se este for um sistema de vector de EIAV) e possivelmente também de vif, vpr, vpx, vpu e nef. De um modo mais preferido, os sistemas da presente invenção são também destituídos de rev. Rev foi anteriormente considerado essencial para a produção de vírus eficiente em alguns genomas retrovirais. Por exemplo, no caso do HIV, considerava-se que deveriam ser incluídos rev e a sequência RRE. No entanto, foi verificado que a necessidade de rev e RRE pode ser reduzida ou eliminada por optimização dos codões (ver abaixo) ou por substituição por outros sistemas equivalentes funcionais, tal como o sistema do MPMV. Como a expressão de gag-pol optimizada em termos de codões é independente de REV, RRE pode ser removido da cassete de expressão gag-pol, removendo deste modo qualquer potencial de recombinação com qualquer RRE contido no genoma do vector. 27

Numa forma de realização preferida o genoma virai do primeiro aspecto da invenção não apresenta o elemento de resposta a Rev (RRE).

Numa forma de realização preferida, o sistema utilizado na presente invenção é baseado num sistema designado ''mínimo" em que têm que ser removidos alguns ou todos os genes adicionais.

OPTIMIZAÇÃO DE CODÕES A optimização dos codões foi anteriormente descrita no documento W099/41397. Células diferentes diferem na sua utilização de codões particulares. Este enviesamento dos codões corresponde a um enviesamento na abundância relativa de ARNt particulares no tipo celular. É possível aumentar a expressão por alteração dos codões na sequência de forma a que estes sejam ajustados para combinar com a abundância relativa dos ARNt correspondentes. Do mesmo modo, é possível diminuir expressão por selecção deliberada de codões cujos ARNt correspondentes sejam conhecidos como raros no tipo de célula particular. Deste modo, está disponível um grau adicional de controlo da tradução

Muitos vírus, incluindo HIV e outros lentivírus, utilizam um grande número de codões raros e a expressão aumentada dos componentes de empacotamento em células produtoras de mamífero pode ser realizada modificando-os para corresponder a codões de mamífero normalmente utilizados. São conhecidas na técnica tabelas de utilização de codões para células de mamífero, assim como para vários outros organismos. 28 A optimização dos codões apresenta várias outras vantagens. Devido às alterações nas suas sequências, as sequências nucleotidicas codificando os componentes de empacotamento das partículas virais necessárias para a montagem de partículas virais nas células produtoras/células de empacotamento têm as sequências de instabilidade de ARN (INS) eliminadas. Simultaneamente, a sequência de aminoácido sequência codificante para os componentes de empacotamento está conservada de forma a que os componentes virais codificados pelas sequências permaneçam iguais ou, pelo menos, suficientemente semelhantes de forma a que a função dos componentes de empacotamento não fique comprometida. A optimização dos codões contorna também a necessidade de Rev/RRE para a exportação, originando sequências optimizadas independentes de Rev. A optimização dos codões reduz também a recombinação homóloga entre diferentes construções no interior do sistema de vector (por exemplo entre as regiões de sobreposição nas grelhas de leitura aberta gag-pol e env). 0 efeito global da optimização dos codões é, consequentemente, um aumento notável no título virai e melhorou a segurança.

Numa forma de realização, apenas os codões relacionados com INS são optimizados em termos de codões. No entanto, numa forma de realização muito mais preferida e prática, as sequências são optimizadas em termos de codões no seu conjunto, com excepção da sequência que abrange o local de alteração da grelha. 0 gene de gag-pol compreende duas grelhas de leitura sobrepostas codificando respectivamente as proteínas gag e pol. A expressão de ambas as proteínas depende de uma alteração da grelha durante a tradução. Esta alteração da grelha ocorre em consequência de um "deslizamento" do ribossoma durante a tradução. Pensa-se que este deslizamento seja causado, pelo 29 menos, parcialmente por estruturas secundárias de ARN que atrasam o ribossoma. Essas estruturas secundárias existem a jusante do local de alteração da grelha no gene gag-pol. Para o HIV, a região da sobreposição estende-se do nucleótido 1222 a jusante do inicio da gag (em que o nucleótido 1 é A do ATG da gag) até ao final da gag (nt 1503). Consequentemente, um fragmento com 281 pb abrangendo o local de alteração da grelha e a região de sobreposição das duas grelhas de leitura é, de um modo preferido, não optimizado em termos de codões. A conservação deste fragmento irá permitir a expressão mais eficiente das proteínas gag-pol.

Para o EIAV o início da sobreposição foi considerado como sendo o nt 1262 (em que o nucleótido 1 é o A do ATG da gag) . O final da sobreposição situa-se nas 1461 pb. De forma a assegurar que o local de alteração da grelha e a sobreposição de gag-pol são conservados, a sequência de tipo selvagem foi conservada do nt 1156 ao 1465.

Podem ser realizadas derivações da utilização óptima de codões, por exemplo, para acomodar locais de restrição adequados e podem ser introduzidas modificações conservadoras de aminoácidos nas proteínas gag-pol.

Numa forma de realização altamente preferida, a optimização dos codões foi baseada em genes de mamífero altamente expressos. Podem ser modificadas a terceira e por vezes a segunda e terceira base.

Devido à natureza degenerada do Código Genético, irá ser tido em consideração que podem ser obtidas numerosas sequências gag-pol por um especialista na técnica. Existem também muitas 30 variantes retrovirais descritas que podem ser utilizadas como um ponto de partida para produzir uma sequência gag-pol optimizada em termos de codões. Os genomas de lentivirus podem ser bastante variáveis. Por exemplo existem várias quase-espécies de HIV-1 que são ainda funcionais. Este é também o caso para o EIAV. Estas variantes podem ser utilizadas para intensificar partes particulares do processo de transdução. Em http://hiv-web.lanl.gov podem ser encontrados exemplos de variantes do HIV-1. Na base de dados NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov podem ser encontrados detalhes de clones do EIAV. A estratégia para sequências gag-pol optimizadas em termos dos codões pode ser utilizada em relação a qualquer retrovirus. Isto aplicar-se-à a todos os lentivirus, incluindo EIAV, FIV, BIV, CAEV, VMR, SIV, HIV-1 e HIV 2. Além disso este método pode ser utilizado para aumentar a expressão de genes de HTLV-1, HTLV-2, HFV, HSRV e retrovirus endógenos humanos (HERV), MLV e outros retrovirus. A optimização dos codões podem tornar a expressão de gag-pol independente de Rev. No entanto para permitir a utilização de factores anti-rev ou RRE no vector retroviral, irá ser necessário tornar o sistema de produção do vector virai totalmente independente de Rev/RRE. Deste modo, o genoma necessita também de ser modificado. Isto é realizado pela optimização de componentes do genoma do vector. Vantajosamente, estas modificações originam, também, a produção de um sistema mais seguro isento de todas as proteínas adicionais na célula produtora e na transduzida. 31

Como descrito acima, os componentes de empacotamento para um vector retroviral incluem produtos de expressão de genes gag, pol e env. Além disso, o empacotamento eficiente depende de uma sequência curta de 4 ansas seguida por uma sequência parcial de gag e env (o "sinal de empacotamento"). Deste modo, a inclusão de uma sequência gag eliminada no genoma do vector retroviral (além da sequência gag completa na construção de empacotamento) irá optimizar o titulo do vector. Até à data foi descrito que o empacotamento eficiente requer de 255 a 360 nucleótidos de gag em vectores que ainda conservam sequências env ou cerca de 40 nucleótidos de gag numa combinação particular mutação de dador de processamento, eliminações de gag e env. Foi surpreendentemente verificado que uma eliminação de todos os nucleótidos excepto aproximadamente 360 do terminal N na gag origina um aumento do título do vector. Deste modo, de um modo preferido, o genoma do vector retroviral inclui uma sequência gag que compreende uma ou mais eliminações, de um modo mais preferido, a sequência de gag compreende cerca de 360 nucleótidos deriváveis do terminal N.

NOI

Na presente invenção, a NOI (sequência nucleotídica de interesse) pode ser, por exemplo, uma sequência sintética de ARN/ADN, uma sequência de ARN/ADN optimizada em termos de codões, uma sequência de ARN/ADN recombinante (i. e. preparada por utilização de técnicas de ADN recombinantes), uma sequência de ADNc ou uma sequência de ADN genómico parcial, incluindo as suas combinações. De um modo preferido, esta está na orientação sentido. De um modo preferido, a sequência é, compreende ou é transcrita a partir de ADNc. 32 A(s) NOI, pode(m) ser também aqui designada (s) como "sequência(s) heteróloga(s)", "gene(s) heterólogo(s)" ou "transgene(s)".

As NOI no genoma do vector lentiviral da invenção são úteis no tratamento da doença de Parkinson. A NOI pode codificar uma enzima envolvida na síntese ou no armazenamento da dopamina. Por exemplo, a enzima pode ser uma das seguintes: Hidroxilase da Tirosina, ciclo-hidrolase I do GTP e/ou Descarboxilase Dopa de Aminoácidos Aromáticos. Estão disponíveis as sequências dos três genes: respectivamente N° de Acesso XO5290, U19523 e M76180.

Alternativamente a NOI pode codificar o Transportador 2 da Monoamina Vesicular (VMAT2, Número de acesso L23205.1). Numa forma de realização preferida o genoma virai compreende uma NOI codificando a Descarboxilase Dopa de Aminoácidos Aromáticos e uma NOI codificando VMAT 2. Esse genoma pode ser utilizado no tratamento da doença de Parkinson, em particular em conjunto com a administração periférica de L-DOPA. A NOI pode codificar a totalidade ou parte da proteína de interesse ("POI") ou um seu mutante, homólogo ou variante. Por exemplo, a NOI pode codificar um fragmento da POI que é capaz de funcionamento ín vivo de uma forma análoga à proteína de tipo selvagem.

Numa forma de realização altamente preferida, uma das NOI compreende uma forma truncada do gene TH, não apresentando o domínio regulador. Essa NOI evita a inibição da dopamina por 33 retroalimentação que possa limitar a expressão da enzima completa. 0 termo "mutante" inclui POI que incluem uma ou mais variações de aminoácidos em relação à sequência de tipo selvagem. Por exemplo, um mutante pode compreender uma ou mais adições, eliminações ou substituições de aminoácidos. Um mutante pode surgir naturalmente ou pode ser criado artificialmente (por exemplo, por mutagénese dirigida para um local).

Aqui, o termo "homólogo" significa uma entidade tendo uma determinada homologia com a NOI ou que codifica uma proteína tendo algum grau de homologia com a POI. Aqui, o termo "homologia" pode ser comparado com "identidade".

No presente contexto, uma sequência homóloga é considerada como incluindo uma sequência de aminoácidos que pode ser, pelo menos, 75, 85 ou 90% idêntica, de um modo preferido, , pelo menos, 95 ou 98% idêntica à sequência alvo. Tipicamente, os homólogos irão compreender os mesmos locais activos etc. que a sequência de aminoácidos alvo. Embora a homologia possa ser também considerada em termos de semelhança (i. e. resíduos de aminoácido tendo propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto da presente invenção é preferido, expressar a homologia em termos de identidade de sequência.

No presente contexto, uma sequência homóloga é considerada como incluindo uma sequência nucleotídica que pode ser, pelo menos, 75, 85 ou 90% idêntica, de um modo preferido,, pelo menos, 95 ou 98% idêntica à sequência alvo. Tipicamente, os homólogos irão compreender as mesmas sequências que codificam para os locais activos etc., como a sequência alvo. Embora a 34 homologia possa ser também considerada em termos de semelhança (i. e. resíduos de aminoácido tendo propriedades/funções químicas semelhantes), no contexto da presente invenção é preferido, expressar a homologia em termos de identidade de sequência.

Podem ser realizadas comparações de homologia visualmente ou mais frequentemente, com o auxílio de programas de comparação de sequências facilmente disponíveis. Estes programas de computador comercialmente disponíveis podem calcular a % de homologia entre duas ou mais sequências. A % de homologia pode ser calculada ao longo de sequências contíguas, i. e. uma sequência é alinhada com outra sequência e cada aminoácido numa sequência é comparado directamente com o aminoácido correspondente na outra sequência, um resíduo de cada vez. Isto é designado um alinhamento "sem espaços". Tipicamente, esses alinhamentos sem espaços são realizados apenas ao longo de um número relativamente pequeno de resíduos.

Embora este seja um método muito simples e consistente, este não leva em consideração que uma inserção ou eliminação, por exemplo, num par de sequências de outra forma idênticas, irá fazer com que os resíduos de aminoácidos seguintes sejam colocados fora de alinhamento, resultando deste modo potencialmente numa grande redução da % de homologia quando é realizado um alinhamento global. Consequentemente, a maioria dos métodos de comparação de sequências são concebidos para produzir alinhamentos óptimos que levam em consideração possíveis inserções e eliminações sem penalizar indevidamente a pontuação de homologia global. Isto é realizado inserindo "espaços" no 35 alinhamento da sequência para tentar maximizar a homologia local.

No entanto, estes métodos mais complexos atribuem "penalizações de espaço" a cada espaço que ocorre no alinhamento para que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de sequência com menos espaços quanto possível -reflectindo uma relação mais próxima entre as duas sequências comparadas - atinja uma pontuação mais elevada do que uma com muitos espaços. São tipicamente utilizados "custos de espaço afins" que atribuem um custo relativamente elevado à existência de um espaço e uma penalização menor para cada resíduo subsequente no espaço. Este é o sistema de pontuação de espaços mais frequentemente utilizado. Penalizações de espaços elevadas irão evidentemente produzir alinhamentos optimizados com menos espaços. A maioria dos programas de alinhamento permite que as penalizações de espaços sejam modificadas. No entanto, é preferido, utilizar os valores pré-definidos quando esses programas informáticos são utilizados para comparações de sequências. Por exemplo, quando é utilizado o pacote GCG Wisconsin Bestfit a penalização de espaço por omissão para sequências de aminoácidos é de -12 para um espaço e de -4 para cada extensão.

Consequentemente, o cálculo da % de homologia máxima requer inicialmente a produção de um alinhamento óptimo, levando em consideração penalizações de espaço. Um programa de computador adequado para realizar esse alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, E.U.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Os exemplos de outros programas informáticos que podem realizar comparações de sequência incluem, mas não estão limitados a, pacote BLAST (ver Ausubel 36 et al., 1999 ibid - Capítulo 18), FASTA (Atschul et al.f 1990, J. Mol. Biol., 403-410) e o conjunto GENEWORKS de ferramentas de comparação. Tanto BLAST como FASTA estão disponíveis para pesquisa offline e online (ver Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). No entanto, para algumas aplicações, é preferido, para utilizar o programa GCG Bestfit. Está também disponível uma nova ferramenta, designada BLAST 2 Sequences para comparar sequências de proteína e de nucleótidos (ver FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8 e tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).

Embora a % de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o próprio processo de alinhamento é tipicamente não baseado numa comparação tudo ou nada de pares. Em lugar disso, é geralmente utilizada uma matriz ponderada de pontuação de semelhança que atribui pontuação a cada comparação de pares baseada na semelhança química ou na distância evolutiva. Um exemplo dessa matriz normalmente utilizada é a matriz BLOSUM62 -a matriz pré-definida do conjunto BLAST de programas. Os programas GCG Wisconsin utilizam geralmente os valores públicos pré-definidos ou uma tabela de comparação personalizada se proporcionada (ver o manual de utilizador para mais detalhes). Em algumas aplicações, é preferido, utilizar os valores públicos pré-definidos para o pacote de GCG ou no caso de outros programas informáticos, a matriz pré-definida, tal como BLOSUM62.

Logo que o programa informático produz um alinhamento óptimo, é possível calcular a % de homologia, de um modo preferido, a % de identidade de sequência. O programa informático realiza isto tipicamente como parte da comparação de sequências e produz um resultado numérico. 37

As sequências podem ter também eliminações, inserções ou substituições de resíduos de aminoácido que produzem uma modificação silenciosa e resultam numa substância funcionalmente equivalente. Podem ser realizadas substituições de aminoácidos deliberadas com base na semelhança em termos de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos desde que seja conservada a actividade de ligação secundária da substância. Por exemplo, os aminoácidos carregados negativamente incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; os aminoácidos carregados positivamente incluem lisina e arginina; e os aminoácidos com grupos de cabeça polares não carregados tendo valores de hidrofilicidade semelhantes incluem leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina e tirosina.

Podem ser realizadas substituições conservadoras, por exemplo de acordo com a Tabela abaixo. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e de um modo preferido, na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos entre si:

ALIFÁTICo Não-polar GAP ILV Polar - não carregado CSTM NQ Polar - carregado DE KR AROMÁTICO HFWY A presente invenção abrange também a substituição homóloga (substituição e permuta são ambas aqui utilizadas para significar a permuta de um resíduo de aminoácido existente, por um resíduo alternativo) que pode ocorrer i. e. substituição 38 semelhante-por-semelhante, tais como básico por básico, acídico por acídico, polar por polar etc. Pode também ocorrer substituição não-homóloga i. e. de uma classe de resíduos por outra.

De um modo preferido, a NOI codifica uma POI única ou um seu mutante, homólogo ou variante. Numa forma de realização altamente preferida, a NOI não codifica uma proteína de fusão. Como aqui utilizado, o termo "proteína de fusão" é utilizado no seu sentido convencional para significar uma entidade que compreende duas ou mais actividades de proteína, reunidas em conjunto por uma ligação peptídica para formar uma única proteína quimérica. Uma proteína de fusão é codificada por um único polinucleótido regulado por um único promotor. LOCAL DE ENTRADA DE RIBOSSOMAS INTERNO (IRES) 0 genoma virai do primeiro aspecto da invenção compreende doiss ou mais NOI. Para ambos os NOI a serem expressos, podem existir duas ou mais unidades de transcrição no interior do genoma do vector, uma para cada NOI. No entanto, resulta evidente da literatura que os vectores retrovirais alcançam títulos mais elevados e propriedades de expressão génica mais potentes se estes forem mantidos geneticamente simples (PCT/GB96/01230; Bowtell et al., 1988 J. Virol. 62, 2464; Correll et al. , 1994 Blood 84, 1812; Emerman e Temin 1984 Cell 39, 459; Ghattas et al., 1991 Mol. Cell. Biol. 11, 5848;

Hantzopoulos et al., 1989 PNAS 86, 3519; Hatzoglou et al., 1991 J. Biol. Chem 266, 8416; Hatzoglou et al., 1988 J. Biol. Chem 263, 17798; Li et al., 1992 Hum.Gen .Ther. 3, 381; McLachlin et al., 1993 Virol. 195, 1; Overell et al., 1988 Mol. Cell Biol. 39 8, 1803; Scharfman et al., 1991 PNAS 88, 4626; Vile et al., 1994 Gene Ther 1, 307; Xu et al., 1989 Virol. 171, 331; Yee et al., 1987 PNAS 84, 5197) e portanto é preferido, utilizar um local de entrada de ribossomas interno (IRES) para iniciar a tradução da segunda (e subsequentes) sequência(s) codificante(s) numa mensagem poli-cistrónica (Adam et al. 1991 J. Virol. 65, 4985). A inserção de elementos IRES em vectores retrovirais é compatível com o ciclo de replicação retroviral e permite a expressão de múltiplas regiões codificantes a partir de um único promotor (Adam et al. (como acima); Koo et al. (1992) Virology 186:669-675; Chen et al. 1993 J. Virol 67:2142-2148). Os elementos IRES foram inicialmente encontrados nas extremidades 5' não-traduzidas de picomavírus onde estes promovem a tradução de proteínas virais independente de cap (Jang et al. (1990) Enzyme 44: 292-309). Quando localizados entre grelhas de leitura abertas num ARN, os elementos IRES permitem a tradução eficiente da grelha aberta a jusante promovendo a entrada do ribossoma no elemento IRES seguido pela iniciação da tradução a jusante. É apresentada uma revisão de IRES por Mountford e Smith (TIG Maio de 1995 vol 11, N°. 5:179-184). São conhecidas várias sequências IRES diferentes incluindo as do vírus da encefalomiocardite (EMCV) (Ghattas, I.R., et al., Mol. Cell. Biol.r 11:5848-5859 (1991); da proteína BiP [Macejak e Sarnow, Nature 353:91 (1991)]; do gene Antennapedia de Drosophila (exões d e e) [Oh, et al., Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)] assim como do vírus da poliomielite (PV) [Pelletier e Sonenberg, Nature 334: 320-325 (1988); ver também Mountford e Smith, TIG 11, 179-184 (1985)]. 40

De acordo com o documento WO-A-97/14809, as sequências IRES são tipicamente encontradas na região 5' não-codificante dos genes. Além dos que se encontram na literatura estes podem ser encontrados empiricamente, pesquisando sequências genéticas que afectem a expressão e determinando, depois, se essa sequência afecta o ADN (i. e. se actua como um promotor ou como um intensificador) ou apenas o ARN (actua como uma sequência IRES).

Foram anteriormente utilizados elementos IRES de PV, EMCV e vírus da doença vesicular de porco em vectores retrovirais (Coffin et al., como acima). 0 termo "TIRES" inclui qualquer sequência ou combinação de sequências que funciona como ou melhora a função de um IRES. 0 (s) IRES pode (m) ser de origem virai (tais como IRES de EMCV, IRES de PV ou sequências semelhantes a FMDV 2A) ou de origem celular (tais como IRES de FGF2, IRES de NRF, IRES de

Notch 2 ou IRES de EIF4).

Para o IRES ser capaz de iniciar a tradução de cada NOI, deve estar localizado entre ou antes da NOI, no genoma do vector. Por exemplo, para uma sequência multicistrónica contendo n NOI, o genoma pode ser como se segue: [(NOI,-IRES,]...NOIn n=1-»n

Para sequências bi e tricistrónicas, a ordem pode ser como se segue: noi,-ires,-noi2 41 NOI1-IRESi-NOI2-IRES2-NOl3

Podem ser também utilizadas configurações alternativas de IRES e NOI. Por exemplo não é necessário que as cópias contendo IRES e NOI sejam reguladas pelo mesmo promotor.

Um exemplo deste arranjo pode ser: IRESi-NOIi-promotor-NOl2-IRES2-NOl3.

Numa forma de realização preferida, em qualquer construção utilizando uma cassete interna tendo mais de um IRES e NOI, os IRES podem ser de origens diferentes, isto é, heterólogos entre si. Por exemplo, um IRES pode ser proveniente de EMCV e o outro IRES pode ser proveniente do vírus da poliomielite.

OUTROS MÉTODOS DE EXPRESSÃO DE GENES MÚLTIPLOS A PARTIR DE UM VECTOR

Embora os IRES sejam uma forma eficiente de co-expressar genes múltiplos a partir de um vector, outros métodos são também úteis e podem ser utilizados isoladamente ou em conjunto com os IRES. Estes incluem a utilização de promotores múltiplos internos no vector (Overell et al., Mol Cell Biol. 8: 1803-8 (1988)) ou a utilização de padrões de processamento alternativo originando múltiplas espécies de ARN derivadas do genoma virai único que expressam os diferentes genes. Esta estratégia foi anteriormente utilizada por si para dois genes (Cepko et al. Cell 37: 1053 (1984)). 42

CÉLULAS TRANSDUZIDAS A presente patente divulga também uma célula que foi transduzida com um sistema de vector compreendendo um genoma virai de acordo com o primeiro aspecto da invenção. A transdução com o sistema de vector da presente invenção pode conferir ou aumentar a capacidade da célula para produzir catecolaminas. Esta pode, por exemplo, conferir ou aumentar a capacidade da célula para converter tirosina em L-dopa e/ou L-dopa em dopamina. A libertação de catecolaminas pode ser medida por técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, utilizando um detector electroquímico ligado a uma célula analítica. Além das próprias catecolaminas, podem ser também detectados produtos secundários associado à libertação de catecolamina (tal como DOPAC, um produto de degradação especifico da dopamina). A célula pode ser transduzida in vivo, in vitro ou ex vivo. Por exemplo, se a célula for uma célula de um indivíduo mamífero, a célula pode ser removida do indivíduo e transduzida pronta para reimplantação no indivíduo (transdução ex vivo). Alternativamente a célula pode ser transduzida por transferência genética directa in vivo, utilizando o sistema de vector da presente invenção de acordo com técnicas padrão (tal como através de injecção de armazenamentos de vector expressando as NOI) . Se a célula for parte de uma linha celular que é estável em cultura (i. e. que pode sobreviver a passagens numerosas e que se pode multiplicar in vitro) então esta pode ser transduzida in vitro por técnicas padrão, por exemplo, por exposição da célula a sobrenadantes virais compreendendo vectores expressando as NOI. 43 A célula pode ser qualquer célula que seja susceptível à transdução. Se o sistema de vector for capaz de transduzir células em não-divisão (por exemplo, se este for um sistema lentiviral) então a célula pode ser uma célula em não-divisão tal como um neurónio. A célula transduzida constitui, de um modo preferido, parte de uma linha celular neuronal geneticamente modificada. Essa linha celular pode ser, por exemplo, transplantada no cérebro para o tratamento da doença de Parkinson. A célula pode ser adicionalmente uma célula estaminal neuronal. Essa linha celular pode ser, por exemplo, transplantada no cérebro para o tratamento da doença de Parkinson. A célula pode ser adicionalmente uma célula no estriato de um indivíduo, tal como um neurónio ou uma célula glial. A transferência génica directa in vivo para essa célula pode, por exemplo, convertê-la numa célula produtora de dopamina.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS A presente invenção proporciona também a utilização de um genoma de vector retroviral como definido no primeiro aspecto da invenção na preparação de uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica pode ser utilizada para tratar um indivíduo por terapia génica, em que a composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma partícula de vector retroviral de acordo com a presente invenção. 44 A composição farmacêutica pode ser utilizada para tratar o indivíduo humano ou animal. De um modo preferido, o indivíduo é um indivíduo mamífero. De um modo mais preferido, o indivíduo é humano. Tipicamente, um médico irá determinar a dosagem efectiva que irá ser mais adequada para um indivíduo particular e esta irá variar com a idade, peso e resposta do doente particular. A composição pode compreender opcionalmente um veículo, diluente, excipiente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. A selecção do veículo, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser realizada tendo em consideração a via de administração pretendida e prática farmacêutica normal. As composições farmacêuticas podem compreender como (ou para além de) veículo, excipiente ou diluente, qual(quais)quer ligante(s), lubrificante(s) , agente(s) de suspensão, agente(s) de revestimento, agente(s) solubilizante(s) e outros agentes veículo adequado(s) que possam auxiliar ou aumentar a entrada virai no local alvo (tal como, por exemplo, um sistema de distribuição de lípidos).

Quando adequado, as composições farmacêuticas podem ser administradas por qualquer um ou mais de: inalação, na forma de um supositório ou pessário, topicamente na forma de uma loção, solução, creme, unguento ou pó de pulverização, por utilização de um emplastro dérmico, oralmente na forma de comprimidos contendo excipientes, tais como amido ou lactose ou em cápsulas ou óvulos quer isoladamente quer em mistura com excipientes ou na forma de elixires, soluções ou suspensões contendo agentes aromatizantes ou corantes ou estes podem ser injectados parentericamente, por exemplo, intracavernosamente, intravenosamente, intramuscularmente ou subcutaneamente. Para administração parentérica, as composições podem ser melhor 45 utilizadas na forma de uma solução aquosa estéril que podem conter outras substâncias, por exemplo, sais ou monossacáridos suficientes para tornar a solução isotónica em relação ao sangue. Para administração bucal ou sublingual as composições podem ser administradas na forma de comprimidos ou de pastilhass que podem ser formulados de uma forma convencional.

De um modo preferido, as partículas de vector virai da presente invenção são administradas por injecção no caudado putâmen.

DOENÇAS 0 genoma do vector retroviral e as partículas de vector da presente invenção são particularmente úteis para o tratamento e/ou a prevenção de doenças neurodegenerativas.

As doenças que podem ser tratadas incluem, mas não estão limitadas a: doença de Parkinson; doença dos neurónios motores, doença de Huntington e distúrbios do movimento que respondem a L-dopa, tal como as distonias.

Em particular a presente invenção é útil no tratamento e/ou na prevenção da doença de Parkinson. 0 tratamento por terapia génica com vectores capazes de distribuição, por exemplo, de TH, GTP-CH1 e opcionalmente AADC ou AADC e VMAT2, irá ser provavelmente particularmente útil para as etapas tardias de doentes com PD que não respondem significativamente ao tratamento com L-dopa. 0 tratamento utilizando AADC ou AADC e VMAT2, em combinação com L-dopa 46 administrada periféricamente pode ser também útil em etapas tardias de doentes com PD. A presente invenção irá ser agora descrita apenas a titulo de exemplo, em que irá ser feita referência às Figuras e Tabelas seguintes

Figura 1: Sequências oligonucleotidicas dos iniciadores utilizados para clonar o ADNc da Hidroxilase da Tirosina do Tipo 2 humana (Número de acesso X05290). Os locais de reconhecimento das endonucleases de restrição (BamHI e HindIII) aparecem sublinhados, a sequência de Kozak de consenso em itálico e o epitopo c-myc em negrito.

Figura 2: Mapa plasmidico de pNE4. Um plasmideo de expressão de mamífero derivado de pcDNA3.1/Zeo que expressa a Hidroxilase de Tirosina humana de Tipo 2 marcada com c-myc (cmyc-hTH).

Figura 3: Sequências oligonucleotídicas dos iniciadores utilizados para clonar ADNc de Descarboxilase Dopa de Aminoácidos Aromáticos humana (Número de acesso M76180 M30772). Os locais de reconhecimento das endonucleases de restrição (Bgl II e HindIII) aparecem sublinhados, a sequência de Kozak de consenso em itálico e o epitopo HA em negrito.

Figura 4: Mapa plasmidico de pNE2. Um plasmideo de expressão de mamífero derivado de pcDNA3.1/Neo que expressa Descarboxilase Dopa de Aminoácidos Aromáticos humana marcada com HA (HA-hAADC). 47

Figura 5: Sequências oligonucleotídicas dos iniciadores utilizados para clonar o ADNc da ciclo-hidrolase 1 do GTP humano (Número de acesso U19523). Os locais de reconhecimento das endonucleases de restrição (Bgl II e HindIII) aparecem sublinhados, a sequência de Kozak de consenso em itálico e o epitopo FLAG em negrito.

Figura 6: Mapa plasmidico de ρΝΕβ. Um plasmideo de expressão de mamífero derivado de pcDNA3.1/Hygro que expressa ciclo-hidrolase 1 do GTP humana marcada com FLAG (FLAG-hGTP).

Figura 7: Sequências oligonucleotídicas dos iniciadores utilizados para clonar uma forma truncada da Hidroxilase de Tirosina do Tipo 2 humana. Os locais de reconhecimento das endonucleases de restrição (BamHI, Hindlll e EcoRI) aparecem sublinhados, a sequência de Kozak de consenso em itálico e o epitopo c-myc em negrito.

Figura 8: Mapa plasmidico de phTHt-1. Um plasmideo de expressão de mamífero derivado de pcDNA3.1/Zeo que expressa a forma truncada de hTH marcada com o epitopo c-myc (cmyc-hTHt).

Figura 9: Mapa plasmidico de pneo2. Um plasmideo de expressão de mamífero derivado de BL-EP (Science (1995) 269:847) que expressa cmyc-hTHt e a FLAG-hGTP como uma cassete bicistrónica. 0 IRES do vírus da poliomielite está localizado a jusante do gene cmyc-hTHt.

Figura 10: Mapa plasmidico de ptricis. Um plasmideo de expressão de mamífero derivado de BL-EP (Science (1995) 48 269:847) que expressa HA-hAADC, cmyc-hTHt e FLAG-hGTP como uma cassete tricistrónica. O IRES do EMCV está localizado a jusante do gene HA-hAADC e o IRES do vírus da poliomielite a jusante do gene cmyc-hTHt.

Figura 11: Expressão transiente das cassetes Bicistrónicas e Tricistrónicas em células HEK 293T. Transferência de Western sondada com anticorpos monoclonais de murganho específicos. As proteínas marcadas ligadas aos anticorpos são detectadas com IgG de coelho anti murganho conjugada com peroxidase de rábano (HRP). Faixas; 1, Controlo; 2, phTHt; 3, Plasmídeo bicistrónico (pneo2); 4, Plasmídeo tricistrónico (ptricis) e 5, três plasmídeos monocistrónicos (phTHt, pNE2 e pNE6).

Figura 12: Diagrama esquemático de vectores mínimos EIAV.

Figura 13: Diagrama esquemático de vectores EIAV BIC e EIAV TRIC.

Figura 14: Diagrama esquemático de vectores EIAV TRIC contendo o tracto central da polipurina (cppt).

Figura 15: Conteúdo em PERT e ARN virai de vectores EIAV

Figura 16: Expressão dos vectores EIAV BIC e EIAV TRIC em células D17 transduzidas em diferentes MOI (MOI). Transferência de Western sondada com anticorpos monoclonais de murganho específicos. As proteínas marcadas ligadas aos anticorpos são detectadas com IgG de coelho anti-murganho conjugada com peroxidase de rábano (HRP). Faixas: a, pONY8G (100 x); b, pONY8.lZ (100 x) ; c, pONY8.1BIC (100 x) ; d, 49

ρΟΝΥ8.1BIC (10 x); e, pONY8BIC (IX); f, células não transduzidas; h, pONY8.1TRIC (100 x) ; i, pONY8.1TRIC (10 x) ; j, pONY8.1TRIC (1 X); k, pONY8TRIC (100 x) ; 1, pONY8TRIC (10 x) ; m, pONY8TRIC (1 X); n, pONY8.1TRIC-B (100 x); o, pONY8.1TRIC-B (10 x); p, pONY8.1TRIC-B (1 X); e. g., células HEK 293T transfectadas com os plasmídeos monocistrónicos (ver a Figura 11).

Figura 17: Expressão de vectores EIAV TRIC em células D17 transduzidas a MOI-100. (A) Imunocoloração de células D17 transduzidas com os vectores EIAVlacZ ou EIAV TRIC utilizando respectivamente policlonal de coelho anti LacZ ou monoclonal de murganho anti HA. O anticorpo ligado às proteínas nativas foi detectado com IgG de cabra anti-coelho ou de cabra anti-murganho conjugado com Alexa 488 (verde) (Ampliação ~10 x) . (B) Células D17 transduzidas com vectores EIAV TRIC. Imunocoloração como em (A) + iodeto de propídio (vermelho) que cora os núcleos (Ampliação ~40 x).

Figura 18: Catecolaminas (pg/106 células) produzidas por células HEK 293T transduzidas com vectores EIAV TRIC.

Figura 19: Transdução de estriato de rato adulto com vectores EIAV lacZ. Os painéis A-C correspondem a 3 secções coronais independentes com 50 pm coradas com X-gal. São coradas cerca de cinquenta dessas secções por animal, mostrando que a transdução abrange o estriato do rato. Os painéis D-H representam uma ampliação maior da secção em C mostrando que muitas das células transduzidas têm morfologia neuronal no interior do estriato (D-F) e no núcleo accumbens (G-H) . 50

Figura 20: Transdução do estriato de rato adulto com vectores EIAV TRIC. O painel A representa secções coronais com 50 pm coradas com anticorpo HA monoclonal de murganho. A detecção imunofluorescente com um anticorpo secundário FITC indica a expressão de AADC. O painel C representa secções coronais com 50 pm coradas com anticorpo FLAG monoclonal de murganho. A detecção imunofluorescente com Alexa 488 indica a expressão de GTP-CH1. Não é detectada qualquer expressão no estriato contralateral (painéis B e D) . O painel E representa a coloração com anticorpo c-myc monoclonal de murganho detectado com imuno-histoquimica DAB. Os resultados indicam que a TH é expressa no estriato ipsilateral mas não no contralateral (painel F) . A especificidade celular da expressão destas proteínas no lado transduzido é uma confirmação adicional da transdução eficaz.

Figura 21: Mapa plasmidico de pONY8G Figura 22: Mapa plasmidico de pONY8.1G Figura 23: Mapa plasmidico de pONY8Z

Figura 24. (A) Histograma mostrando a modificação em rotações/min, induzidas por estimulação com apomorfina (0,05 mg/kg) em ratos lesionados com 6-OHDA após injecção de ρΟΝΥδ.ΙΖ ou pONY8.1T. PONY8.1Z n = 5, pONY8.1T n = 2. (B) Comportamento rotacional induzido por apomorfina em ratos lesionados com 6-OHDA após injecção de ρΟΝΥδ.ΙΖ (n = 4) ou pONY8.1T (n = 7). 51

Figura 25. Imunorreactividade à hidroxilase da tirosina (TH) na substância negra (A) e no estriato (B) de ratos lesionados com β-OHDA injectados com vectores EIAV TRIC. Refira-se gue não se verifica gualquer imunorreactividade TH no lado ipsilateral, comparado com o lado contralateral (controlo), indicando que a β-OHDA afectou os neurónios dopaminérgicos na parte reticulada da substância negra (SNr).

Figura 26: Conteúdo em catecolaminas (ng/mg tecido fresco) no estriato normal e desinervado de ratos lesionados com 6-OHDA injectados com vectores EIAV TRIC. A quantidade de catecolaminas detectada no estriato desinervado confirma que a lesão com β-OHDA afectou a maioria dos neurónios dopaminérgicos da substância negra. A quantidade de dopamina produzida por EIAV TRIC varia entre 5-8% em comparação com o estriato não lesionado.

Figura 27: Proporções DOPAC/Dopaina em estriato normal e desinervado de ratos lesionados com 6-OHDA injectados com vectores EIAV TRIC. Refira-se que os animais injectados que apresentaram uma redução mais pronunciada das rotações induzidas pelo fármaco são os animais em que a proporção DOPAC/Dopamina (renovação de dopamina) no estriato desinervado foi mais baixa.

Tabela 1: Catecolaminas (ng/hora/108 células) libertadas por células HEK 293T transfectadas com os plasmídeos monocistrónicos, bicistrónicos ou tricistrónicos (n. d., não detectável). 52

Tabela 2: Catecolaminas (ng/106 células) produzidas por células HEK 293T transfectadas com os plasmídeos monocistrónicos, bicistrónicos ou tricistrónicos (n. d., não detectável).

Tabela 3: Eficiência de integração de vectores EIAV. EXPERIMENTAL

Exemplo 1. Clonagem de ADNc de Hidroxilase de Tirosina 1 de Tipo 2 Humana É amplificadoO ADNc Hidroxilase de Tirosina 1 de Tipo 2 humana (Número de acesso X05290) por RT-PCR a partir de ARNm da Substância negra humana poli A+ (Clontech) e epitopo marcado com o epitopo c-myc utilizando os iniciadores descritos na Figura 1. É amplificado um fragmento com 169 pb correspondente à extremidade 5' do gene utilizando os iniciadores 5'hTH2 e 3'hTH2 (Figura 1) enquanto é obtido o fragmento 1418 pb a partir da extremidade 3' do ADNc da hidroxilase da tirosina utilizando os iniciadores 5'hTH3 e 3'hTHl (Figura 1).

Foi utilizado o kit de RT-PCR Titan One Tube (Boehringer) para realizar a reacção de RT-PCR. Tipicamente a reacção é composta por duas soluções. 53

Solução A

Contém 0,2 pg de ARN de substância negra humana poli A+, 32 μΜ de cada dNTP, DTT 10 mM, 1 pL de Inibidor de ARNase (RNAsin, Promega), - 100 ng de cada iniciador e água, até 25 pL.

Solução B

Contém 10 pL de Tampão 5XRT-PCR, 1 pL de mistura de Enzima e água até 25 pL. As Soluções A e B são misturadas e são programadas as condições de RT-PCR. 1.1. A amplificação do produto com 169 pb é realizada a 50 °C, 30 min, para permitir a realização da reacção RT, seguida por 2 min a 94 °C e 35 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 60 °C e 45 s a 68 °C. 1.2. A amplificação do produto com 1418 pb é realizada a 50 °C, 30 min, para permitir a realização da reacção RT, seguida por 2 min a 94 °C e 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a60 °C e 2 min a 68 °C.

Ambos os fragmentos são purificados e utilizados como molde numa terceira reacção de PCR para obter o ADNc completo da Hidroxilase de Tirosina (TH) . A reacção de PCR recombinante é realizada utilizando iniciadores 5'hTH2 e 3'hTHl (Figura 1) e um kit KlenTaq (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante. As condições de PCR são estabelecidas como se segue: 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 60 °C e 2 min a 68 °C. O produto de PCR recombinante é clonado no vector pGEM-Teasy (Promega) para criar pNE3. 54 0 ADNc da TH é então excisado a partir do pNE3 sob a forma de um fragmento BamHI-EcaRI com 1,57 kb e é ligado ao pcDNA3.1/Zeo (Invitrogen) previamente digerido com as mesmas enzimas. 0 plasmídeo de expressão de mamifero produzido de novo é designado pNE4 (Figura 2).

Exemplo 2: Clonagem de ADNc de Descarboxilase Dopa de Aminoácidos Aromáticos 1 humana É amplificado ADNc de Descarboxilase Dopa de Aminoácidos Aromáticos humana (AADC) (Número de acesso M76180 M30772) a partir de uma biblioteca de expressão de ADNc de fígado humano (Clontech) e de epitopo marcado com o epitopo HA utilizando os iniciadores 5'hAADC e 3'hAADC, descritos na Figura 3. A reacção de PCR foi realizada utilizando um kit KlenTaq (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante. A reacção contém 4 pL de ADNc de fígado humano e 1 μΜ de cada iniciador, num volume final de 50 pL. As condições de PCR são como se segue: um primeiro passo, 30 s a 94 °C; um segundo passo, 5 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 seg a 58 °C e 2 min a 68 °C e um terceiro passo, 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 55 °C e 2 min a 68 °C. A PCR amplifica duas bandas esperadas, 1,485 kb e 1,36 kb, correspondentes aos dois transcriptos da Descarboxilase Dopa de Aminoácidos Aromáticos (AADC). A banda com 1,485 kb é purificada e é clonada no vector pGEM-Teasy (Promega) para produzir o plasmídeo designado pNEl. O ADNc da AADC humana completo é excisado a partir de pNEl sob a forma de um fragmento BglII-SalI com ~1,5 kb e é ligado ao pcDNA3.1/Neo digerido previamente com as enzimas BamHI e Xhol. O novo plasmídeo produzido é designado pNE2 (Figura 4). 55

Exemplo 3: Clonagem do ADNc da ciclo-hidrolase 1 do GTP humana É amplificado ADNc da ciclo-hidrolase I do GTP humana (GTP-CH1) (Número de acesso U19523) a partir de ARNm de Substância negra humana Poli A+ e de epitopo marcado com o epitopo FLAG utilizando os iniciadores 5'hGTP e 3'hGTP (Figura 5) . Foi utilizado um kit de RT-PCR Titan One Tube (Boehringer) para realizar a reacção de RT-PCR. Tipicamente a reacção é composta por duas soluções, como descrito acima no Exemplo 1. As Soluções A e B são misturadas e as condições de RT-PCR são estabelecidas como se segue: 50 °C, 30 min, para permitir a realização da reacção de RT, seguida por 30 s a 94 °C e 35 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 60 °C e 1 min a 68 °C. 0 produto de RT-PCR (-0,75 kb) é purificado e é clonado no vector pGEM-Teasy (Promega) para produzir o plasmídeo pNE5. O ADNc GTP-CH é excisado a partir de pNE5 sob a forma de um BglII-Notl com -0,75 kb e é ligado ao pcDNA3.1/Hygro digerido com as enzimas BamHI e Notl para produzir o pNE6 (Figura 6).

Exemplo 4: Clonagem de uma forma truncada da Hidroxilase de Tirosina I de Tipo 2 humana

Para evitar a retroinibição da enzima TH pela dopamina foi decidido utilizar a forma truncada da TH de tipo 2 que não apresenta o domínio regulador. A TH é activada pela fosforilação em locais localizados neste domínio do terminal N e sofre retroinibição pelo produto final mediada por, pelo menos, um destes locais de fosforilação (J. Biol. Chem. (1992) 267:25754-

25758; Adv. Exp. Med. e Biol. (1993) 338:87-92). Esta TH 56 truncada (hTHt) é marcada com epitopo com o epitopo c-myc e é amplificada por PCR utilizando os iniciadores 5'hTHt e 3'hTHt (Figura 7) e plasmídeo pNE4 como molde. A reacção de PCR é realizada utilizando Polimerase Pfu I (Stratagene) a 95 °C, 1 min e 30 ciclos de 1 min a 95 °C, 1 min a 60 °C e 1 min a 72 °C. É amplificada uma banda com -1,04 kb, é digerida com as enzimas BamHI e EcoRI e é ligada ao pcDNA3.1/Zeo previamente digerido com as mesmas enzimas. O novo plasmideo produzido é designado phTHt (Figura 8).

Exemplo 5: Cloagem de TH, AADC e GTP-CH num vector de expressão de mamífero É clonado ADNc de hTHt no plasmídeo BL-EP (Science, 269:847 (1995)) a jusante do IRES do EMCV. Para realizar isto, os fragmentos de CMVp-hTHt do phTHt são excisados como um BglII-EcoRV e clonados em BLEP digerido com BamHI-EcoRV para produzir o pneol. O fragmento CMVp-DC é excisado a partir do pNE2 como um BglII-EcoRV e é ligado ao BLEP cortado com Smal-BamHI para produzir BLEP-CMV-DC.

Para criar uma cassete de expressão de mamífero compreendendo os genes hTHt e GTP-CH1 (cassete bicistrónica), o ADNc GTP-CH1 é clonado a jusante do IRES da poliomielite como se segue. O ADNc GTP-CH1 é excisado a partir de ρΝΕβ sob a forma de um fragmento -0,75 kb Nhel-Xbal e é clonado em BLEP-THt digerido com as mesmas enzimas. O novo plasmídeo é designado BLEP-THt-CHl. O fragmento CMVp-THt é excisado a partir do pneol sob a forma de um fragmento Xbal-EcoRV e é ligado a BLEP-hTHt-CHl digerido com as mesmas enzimas para produzir o pneo2 (pbicis) (Figura 9). 57 BLEP-CMVp-DC e BLEP-hTHt-CHl são digeridos com Blnl-Clal para produzir o ptricis para criar uma cassete tricistrónica compreendendo os genes hTHt, GTP-CH1 e AADC, (Figura 10). Isto cria uma cassete que tem o promotor CMV, DC, hTHt e GTP-CH1 nessa ordem.

Exemplo 6: Expressão transiente a partir das cassetes Bicistrónicas e Tricistrónicas em células humanas heteróloqas

As células 293T de rim embrionário humano (HEK293T) não sintetizam quaisquer catecolaminas e estas não expressam quaisquer enzimas catecolaminérgicas. Estas são seleccionadas para determinar se as cassetes de expressão bicistrónicas e tricistrónicas são funcionais. As células HEK 293T são inoculadas numa placa de 6 X poços numa densidade de ~2-3 X 105 células/poço. Vinte e quatro horas após o plaqueamento as células são transfectada com 2 pg de ADN plasmídico utilizando Fugene™ (Roche) em meio isento de soro, seguindo as instruções do fabricante. São adicionadas 0,2 pg (1/10) de plasmídeo pEGFP-Cl (Clontech) expressando GFP à mistura ADN-Fugene™, como controlo da transfecção.

As células são lavadas em Tampão Fosfato Salino (PBS) e são recolhidas aproximadamente 48 h após a transfecção. Os extractos de célula totais são preparados utilizando tampão de Lise (Promega). São carregadas aproximadamente 10 pg de proteína total em três géis de SDS-PAGE a 10% e as proteínas são separadas e são transferidas para uma membrana ECL-western de nitrocelulose (Amersham-Pharmacia). As membranas são sondadas com uma diluição 1/1000 de anticorpos de murganho anti-HA (Roche), de murganho anti-cmyc (Roche) ou de murganho anti-FLAG 58 (Sigma). 0 anticorpo secundário estava numa diluição de 1/2000 de anti-murganho de coelho marcado com HRP (Dako). Os anticorpos ligados às membranas são detectados utilizando um kit de detecção ECL-western. São detectadas proteínas com peso molecular aparente adequado nas células transfectada e não no controlo falso: HÁ-hAADC, ~53 kDa; cmyc-hTHt, ~42 kDa e FLAG-GTP/CHI, ~30 kDa. As cassetes bicistrónicas e tricistrónicas expressam, respectivamente, duas ou três das enzimas (Figura 11).

Exemplo 7: Produção de catecolaminas em células humanas transfectadas transientemente.

Como descrito no exemplo 6, são inoculadas células HEK 293T numa placa de 6 X poços numa densidade de ~2-3 X 105 células/poço. Vinte e quatro horas após o plaqueamento as células são transfectada com 2 pg de ADN plasmídico utilizando Fugene™ (Roche) em meio isento de soro, seguindo as instruções do fabricante. São adicionadas 0,2 pg (1/10) de plasmídeo pEGFP-C1 expressando GFP (Clontech) à mistura ADN-Fugene™ como controlo de transfecção.

As células são lavadas em Tampão Fosfato Salino (PBS) aproximadamente 48 h após a transfecção. São adicionados 0,5 mL de "Tampão de Libertação" (Solução Salina Equilibrada de Hank, Hepes 25 mM pH 7,4, BSA a 0,25% e tirosina 1 nM) às células transfectadas para medir as catecolaminas libertadas para o meio. Estas células são incubadas a 37 °C durante 30 min. Não é adicionada qualquer tetra-hidrobiopterina (BH4) , cofactor TH, às células nesta experiência. As catecolaminas presentes no tampão 59 são extraídas com o mesmo volume de ácido perclórico (PCA) 0,8 M e EDTA 0,2 mM. Os detritos celulares são removidos por centrifugação numa microcentrífuga a 4 °C, 10000 rpm, durante 15 min. 0 passo de libertação pode ser repetido durante mais 30 min. As catecolaminas produzidas nas células são extraídas em 0,5 mL de PCA 0,4 M e EDTA 0,1 mM.

As catecolaminas são separadas por HPLC numa coluna C18 de fase reversa (ESA Analytical) (Dionex) utilizando a fase móvel Cat-A-Phase (ESA Analytical) com uma velocidade de fluxo de 1,5 mL/min durante 15 min. São injectados aproximadamente 20 pL no sistema. As catecolaminas são detectadas num detector electroquímico (ESA Analytical) ligado a uma célula Analytical (modelo 5144, ESA Analytical) com potenciais de entrada como se segue: Célula guarda, +250 mV; Canal 1,10 mV e Canal 2, -250 mV. A quantidade de catecolaminas nas amostras é calculada integrando a área dos picos em relação a padrões conhecidos separados de acordo com o mesmo protocolo. Este método permite a detecção de L-dopa, Dopamina e DOPAC, um produto específico de degradação da dopamina. A detecção das catecolaminas libertadas (Tabela 1) e/ou produzidas (Tabela 2) por células heterólogas independentes de BH4 confirma que as enzimas são funcionais. Como esperado, é produzida L-dopa por cassetes de expressão mono, bi e tricistrónicas enquanto é apenas produzida dopamina pela cassete tricistrónica. A bicistrónica produz uma quantidade muito maior de L-dopa do que a TH apenas, confirmando a utilidade de GTP-CH1 para proporcionar BH4 nestas células. É também produzida dopamina pela bicistrónica em combinação com AADC. DOPAC, o produto específico de degradação da dopamina é apenas detectado quando são produzidas quantidades elevadas de dopamina. 60

Exemplo 8: Construção de vector lentiviral expressando as cassetes Bicistrónicas e Tricistrónicas

Os vectores lentivirais são particularmente úteis para transferência génica para células em não-divisão. Entre várias células alvo em não-divisão importantes, encontram-se os neurónios do cérebro humano. Estas células podem ser células alvo para a distribuição de TH, AADC e GTP-CH1 no tratamento da doença de Parkinson. Aqui, descreve-se a construção de vectores mínimos baseados em EIAV que irão distribuir e expressar TH, AADC e GTP-CH1 e irão ser capazes de produzir o neurotransmissor (dopamina) em falta no cérebro com Parkinson gravemente afectado. Esta terapia irá ser adequada nas etapas tardias de doentes com PD, que não respondem ao tratamento com L-DOPA. Na Figura 12 é mostrada a estrutura dos vectores mínimos EIAV gerais.

Construção de pONY8G 0 pONY8G foi derivado de ρΟΝΥδ.ΟΖ, por permuta do gene repórter LacZ pelo gene intensificado da proteína fluorescente verde (GFP). Isto foi realizado transferindo o fragmento Sacll-Kpnl correspondente ao gene GFP e às sequências flanqueadoras de pONY2.13GFP (documento W099/32646) para ρΟΝΥδ.ΟΖ cortado com as mesmas enzimas. 0 ρΟΝΥδ.ΟΖ foi derivado de pONY4.0Z (documento W099/32646) introduzindo mutações em que 1) impediram a expressão de TAT através de uma eliminação de 83 nt no exão 2 de tat) impediram a expressão da ORF S2 através de uma eliminação de 51 nt 3) impediram a expressão de REV por eliminação de uma única base no interior do exão 1 de rev e 4) impediram a expressão da porção do terminal N de gag por 61 inserção de T nos codões de iniciação ATG, modificando deste modo a sequência de ATG para ATTG. No que respeita à sequência de EIAV do tipo selvaqem N° de Ac. U01866 estes correspondem à eliminação dos nt 5234-5316 inclusivamente, nt 5346-5396 inclusivamente e nt 5538. A inserção de resíduos de T foi após os nt 526 e 543.

A cassete Bicistrónica expressando os genes da THt e GTP-CH1 humanos é excisada a partir de pneo2 sob a forma de um fragmento Xhol-Xbal e é ligada a pONY8G (SEQ ID N° 1, Figura 21), cuja construção é descrita acima, digerido com as mesmas enzimas. Neste caso a cassete CMVp-GFP é substituída pela cassete CMVp-hTHt-CHl. 0 novo plasmídeo é designado pONY8-BIC (SEQ ID N° 4). A cassete tricistrónica expressando os genes humanos AADC, THt e GTP-CH1 é excisada a partir de pTricis sob a forma de um fragmento Xhol-Xbal e ligada à estrutura base de pONY8G (SEQ ID N° 1, Figura 21), cuja construção é descrita acima. 0 novo plasmídeo é designado pONY8TRIC (SEQ ID N° 5). 0 tamanho de genoma de ARN do vector resultante deste vector é de 8,8 kb e consequentemente 10% mais longo do que o do genoma de ARN de EIAV com 8 kb.

Construção de pONY8.1Z e pONY8.1 G O pONY8.1Z foi obtido directamente a partir de pONY8.0Z por digestão com Sall e digestão parcial com Sapl. Após restrição os terminais salientes do ADN foram tornados terminais rombos por tratamento com polimerase de ADN de T4. O ADN resultante foi então religado. Esta manipulação resulta numa eliminação da 62 sequência entre o gene repórter LacZ e imediatamente a montante de PPT 3'. O limite 3' da eliminação é o nt 7895 no que respeita ao EIAV de tipo selvagem, N° de Ac. U01866. Deste modo o ρΟΝΥδ.ΙΖ não contém sequências correspondentes ao RRE do EIAV. 0 pONY8.1G foi derivado de pONY8G utilizando a mesma estratégia.

As cassetes Bicistrónicas e as Tricistrónicas são excisadas respectivamente de pONY8BIC ou de pONY8TRIC de sob a forma de fragmentos Nsil-Xhol e ligadas à estrutura base de pONY8.1G (construção descrita acima, SEQ ID N° 2, Figura 22) digerido com as mesmas enzimas. Os dois novos plasmídeos são designados pONY8.1BIC e pONY8.1TRIC (Figura 13). A presença de uma sequência designada tracto central da polipurina (cPPT) pode melhorar a eficiência da distribuição de genes a células em não-divisão. Este elemento que actua em cis está localizado no elemento da região codificante da polimerase EIAV e pode ser obtido sob a forma de um elemento funcional utilizando amplificação por PCR utilizando qualquer plasmideo que contenha a região codificante da polimerase de EIAV (por exemplo pONY3.1, que é descrito no documento WO 99/32646 (e. g. ver o exemplo 9, fig. 6)) como se segue. 0 produto de PCR inclui o cPPT e as sequências de terminação centrais (CTS). Os iniciadores oligonucleotidicos utilizados na reacção de PCR foram: EIAV cPPT PD POS: 5' -CGG ATC AGA TCT TGA TCA CTG CAG GCT CTC ATT ACT TGT AAC AAA GGG AG-3’ EIAV CPPT PD NEG: 57-AG CTC GGA TCC CTG CAG CAT GTT CAC CAG GGA TTT TG-3' 63 0 local de reconhecimento de BglII está sublinhado, de Bell está em itálico, de BamHI está em negrito itálico e de PstI está em negrito. A introdução de cPPT/CTS numa posição a montante do IRES do EMCV ou do IRES do PV foi realizada subclonando o fragmento BcII-BssHII único de pONY8TRIC no pSL-1180 (Pharmacia) utilizando os mesmos locais no vector. Este foi denominado pSL-1180-PD. A digestão do produto de PCR cPPT/CTS com BglII e BamHI permitiu a inserção no local Bell a montante do IRES do EMCV ou com PstI, no local de PstI único a montante do IRES da poliomielite, para produzir, respectivamente, pSL-1180-PD-5'cPPT ou pSL-1180-PD-3'cPPT. A orientação do fragmento clonado no pSL-1180-PD foi confirmada por sequenciação de ADN. 0 fragmento BcII-BssHII destes dois clones foi ligado em pONY8TRICdeICTS, uma forma modificada de pONY8TRIC. 0 P0NY8TRICdeICTS foi construído por ligação do fragmento SalI-PinAI de pONY8ZdelCTS (descrito abaixo) ao pONY8TRIC digerido com Xhol e PinAI. Os dois novos genomas de vector são designados pONY8TRIC5'cPPT e pONY8TRIC3'cPPT. Na Figura 14 é mostrada uma representação esquemática dos genomas destes vectores.

Construção de pONY8ZdeICTS 0 pONY8Z (SEQ ID N° 3, Figura 23) é modificado para remover o CTS que já está presente no vector ρΟΝΥδΖ. Isto é realizado subclonando o fragmento de SalI a Seal abrangendo a região CTS e

RRE de pONY8Z em pSP72, preparado para a ligação por digestão com Sall e EcoRV. A região CTS é então removida por digestão com Kpnl e PpuMI, as extremidades salientes são tornadas rombas por tratamento com polimerase de ADN de T4 e seguidamente as extremidades são religadas. 0 fragmento do vector EIAV modificado é então excisado utilizando Sall e NheI e é ligado em 64 pONY8Z preparado para a ligaçao por digestão com as mesmas enzimas. Este novo vector EIAV é denominado pONY8Z dei CTS.

Exemplo 9: Produção de armazenamentos de vector lentiviral expressando genes terapêuticos

Foi utilizado o método de transfecção dos três plasmideos como descrito anteriormente (Soneoka et al., 1995) para produzir vectores lentivirais pseudotipados. As transfecções são realizadas na linha celular HEK 293T (Soneoka et al., 1995) para produzir os viriões do vector. Foram recolhidos sobrenadantes de cultura 48 h após transfecção e foram filtrados através de filtros com um tamanho de poro de 0,45 pm (Millipore) . O sobrenadante virai é concentrado 100-1000 vezes por ultracentrifugação (Burns et al., 1993 PNAS 90:8033-803 7) e é ressuspenso em PBS. O número de partículas nos armazenamentos virais foi titulado por ensaios de Transcritase Reversa de Desempenho Melhorado (PERT) e em comparação com uma preparação virai pONY8G padrão com título biológico conhecido. O título biológico é avaliado por transformação de células D17, uma linha celular de osteossarcoma de cão. O título é expresso em unidades de transdução por mL (t.u./mL). Com esta finalidade, as células foram inoculadas em placas de cultura de tecidos de 12 poços no dia antes da infecção a 1 X 105 células por poço. São adicionados às células alvo sobrenadantes virais preparados por transfecção de células 293T com plasmideos adequados, como descrito acima. É adicionado polibreno (8 pg/mL) a cada poço no momento da transdução em 0,5 mL do sobrenadante de cultura utilizado para a infecção. Após transdução durante aproximadamente 2-5 horas, o 65 sobrenadante de cultura é substituído por meio fresco. As células expressando GFP (verdes) são examinadas sob iluminação UV e são contadas. 0 ensaio PERT utiliza tecnologia RT-PCR quantitativa em tempo real para detectar um produto de PCR específico do ARN de MS2 e a transcritase reversa retroviral presente nas partículas virais (neste caso EIAV RT). Resumidamente, as partículas virais são rebentadas por mistura de volumes 1:1 de armazenamentos de vector virai e tampão rebentamento (Tris-HCl 40 mM pH 7,5, KC1 50 mM, DTT 20 mM e NP-40 a 0,2 %) . São realizadas diluições em série das partículas rebentadas antes da sua adição à mistura de reacção RT-PCR TaqMan (Perkin-Elmer). Além disso, a mistura de reacção contém 1/10 de volume de partículas virais rebentadas, iniciador directo PERT 300 nM, iniciador inverso PERT 300 nM, sonda PERT 150 nM, 1/10 de ARN MS2 0,8 mg/mL. As condições RT-PCR são como se segue: Manter, 48 °C durante 30 min; manter, 95 °C durante 10 min; quarenta ciclos, 95 °C durante 15 s e 60 °C durante 1 min. Os dados são analisados utilizando ABI PRISMr Sequence Detection System (Perkin-Elmer).

De um modo semelhante, o conteúdo em ARN das preparações virais é também estimado por RT-PCR por comparação com uma preparação virai pONY8G padrão. O ARN virai é isolado a partir dos armazenamentos virais utilizando um kit de ARN virai Qiagen (Qiagen) e é tratado com DNAse I (Ambion). São utilizadas diluições em série do ARN virai como molde na reacção de RT-PCR. São preparadas duas misturas de reacção, +RT e -RT, contendo 1/10 de volume do molde de ARN virai e os iniciadores directo e inverso específicos e a sonda. As condições de RT-PCR são como se segue: Manter, 48 °C durante 30 min; manter, 95 °C durante 10 min; quarenta ciclos, 95 °C durante 15 s e 60 °C durante 66 1 min. Os dados são analisados utilizando o ABI PRISMr Sequence Detection System (Perkin-Elmer). A figura 15 mostra os resultados do ensaio PERT e o conteúdo em ARN virai dos vectores EIAV TRIC e EIAV GFP. Os vectores EIAV TRIC parecem ter um número de partículas semelhante por preparação, mas - 4 vezes menos ARN do que EIAV GFP. A eficiência da integração dos genomas do vector EIAV-TRIC é medida por PCR quantitativa em tempo real do ADN genómico total a partir de células transduzidas. Com esta finalidade, as células alvo, tais como as células D17 ou HT1080 são transduzidas com EIAV-TRIC ou EIAV-GFP em MOI diferentes como descrito anteriormente. As células transduzidas são divididas, pelo menos, três vezes antes do isolamento de ADN total a partir destas. São utilizadas aproximadamente 100 ng de ADN total como molde na reacção de PCR. A amplificação do fragmento do sinal de empacotamento de EIAV é quantificada por comparação com a amplificação de um gene de manutenção, tal como beta-actina ou GAPDH. As condições da PCR quantitativa em tempo real são como se segue: manter, 95 °C durante 10 min; quarenta ciclos, 95 °C durante 15 s e 60 °C durante 1 min. Os dados são analisados utilizando ABI PRISMr Sequence Detection System (Perkin-Elmer). Tabela 3 mostra a eficiência de integração dos vectores EIAV.

Exemplo 10: Os vectores EIAV-BIC e -TRIC originam expressão de TH, AADC e GTP-CH1 em células heterólogas em cultura São transduzidas células heterólogas, tais como células D17 ou HEK 293T com vectores EIAV-TRIC em diferentes multiplicidades da infecção (MOI). Os sobrenadantes virais são preparados por transfecção de células 293T com os plasmídeos adequados e são 67 adicionados às células alvo como descrito nos exemplos anteriores. As células são divididas, pelo menos, três vezes antes da sua análise para assegurar que não se verifica qualquer pseudotransdução. A expressão dos genes TH, AADC e GTP-CH1 é analisada por transferência de Western (Figura 16) e imunocitoquímica (Figura 17) . São detectadas bandas de peso molecular aparente adequado em extractos celulares de células Dl 7 transduzidas: HA-hAADC, ~53kDa; cmyc-hTHt, -42kDa e FLAG-GTP/CH1, -30kDa. Foram utilizados anticorpos monoclonais de murganho que reconhecem as proteínas marcadas como descrito anteriormente. Os anticorpos ligados às proteínas são detectados com uma IgG de coelho anti-murganho conjugada com HRP. As cassetes bicistrónicas e tricistrónicas expressam, respectivamente, duas ou três das enzimas (Figura 16). A transdução de células Dl 7 é determinada por imunocitoquímica utilizando anticorpo HA monoclonal de murganho (Roche) e IgG de cabra anti-murganho conjugada com Alexa 488 (Molecular Probes) (Figura 17). Foram transduzidas células D17 com EIAV lacZ, como controlo.

As catecolaminas produzidas nas células transduzidas são extraídas em 0,5 mL de PCA 0,4 Me EDTA 0,1 mM, são separadas por HPLC e detectadas electroquímicamente como descrito anteriormente nos exemplos acima. São produzidas L-dopa, Dopamina e DOPAC pelas células HEK 293T transduzidas com vectores EIAV TRIC (Figura 18). 68

Exemplo 11: Os vectores EIAV originam expressão de TH, AADC e GTP-CH1 no Núcleo Caudado de ratos adultos. A doença de Parkinson (PD) é um distúrbio neurodegenerativo caracterizado pela perda da via nigrostriatal e responde a tratamentos que facilitam a transmissão dopaminérgica no caudado-putâmen. Em animais experimentais, as células modificadas geneticamente que expressam hidroxilase da tirosina e que, deste modo, sintetizam di-hidroxifenilalanina (L-dopa), induzem a recuperação comportamental em modelos de roedor da PD (Wolff et al. (1989) PNAS (USA) 86:9011-14; Freed et al. (1990) Arch. Neurol. 47:505-12; Jiao et al. (1993) Nature 262:4505). Uma abordagem alternativa consiste na transferência directa in vivo de genes para células somáticas pela qual as células do estriato são convertidas em células produtoras de dopamina por transdução com um vector expressando TH, AADC e GTP-CH1. São microinjectados estereotaxicamente EIAV-TRIC e EIAVlacZ no estriato de rato adulto como se segue, para examinar a expressão génica codificada viralmente. Os ratos são anestesiados com hypnorm e hypnovel (Wood et al., (1994) Gene Therapy 1:283-291) e são injectados com 2 x 1 pL de armazenamentos virais (tipicamente 1-5 x 109 t.u./mL para EIAV lacZ) no estriato, nas coordenadas: 3,5 mm lateral no bregma, 4.75 mm vertical a partir da dura e 1 mm rostral, 3,5 mm lateral 4.75 mM vertical utilizando uma micropipeta fina afilada de vidro durante um período de 2 min. A pipeta foi puxada 1 mm para cima e foi deixada durante mais 2 min antes de retrair lentamente até à superfície. Os animais são analisados 1 e 2 semanas após a injecção. Os ratos são perfundidos com paraformaldeído a 4% (PFA) contendo MgCl2 2 mM e ácido etilenoglicol bis (beta-aminoeter etílico)-N,N,N',N'- 69 tetra-acético 5 mM. Os cérebros são removidos e colocados em fixador, de um dia para o outro, são submergidos em sacarose a 30% a 4 °C, de um dia para o outro, e congelados em composto de inclusão Tissue-Tech OCT (Miles IN USA). São cortadas secções de cinquenta micrómetros num microtomo de congelamento e são feitas flutuar brevemente em PBS-MgCl2 2 mM < 4 °C como lavagem. A expressão de lacZ é determinada colocando as secções em solução de coloração X-gal durante 3-5 horas. É injectado EIAV TRIC no estriato de rato utilizando as mesmas coordenadas descritas acima. Além disso foram realizados mais dois locais de injecção a 2,5 mm lateral, 4,75 mm vertical no bregma e 1,8 mm rostral, 2,5 mm lateral e 5 mm vertical. A expressão de AADC, TH e GTP-CH1 é detectada por imuno-histoquímica utilizando anticorpos monoclonais de murganho desenvolvidos, respectivamente, contra as marcações de epitopo, HA, c-myc e FLAG. Estes anticorpos irão distinguir entre as proteínas de rato e humanas. São incubadas secções de cérebros com anticorpos de murganho anti-HA (Santa Cruz), anti-c-myc (Santa Cruz) ou anti-FLAG (Sigma) (diluições 1:100) a 4 °C, de um dia para o outro, em soro de cabra a 10% em PBS e TritonX-100 a 0,5%. As secções são lavadas com PBS e depois incubadas com IgG de cabra anti-murganho ou anti-coelho conjugada com Alexa 488 (Molecular Probes) ou com FITC (Jackson Laboratories) (diluições 1/1000), à temperatura ambiente, durante 2-3 horas. Após lavagem as secções são examinadas sob um microscópio de fluorescência. As secções coradas com DAB foram reveladas, utilizando o sistema avidina-biotina (kit Vectastain (Vactor Laboratories)). A TH não é expressa no interior dos neurónios ou na glia do estriato de rato (Chatterjee et al. (1992) Science 258:1485-88). A imunorreactividade da TH endógena (TH-IR) no interior do estriato está limitada aos terminais dopaminérgicos das fibras 70 aferentes da substância negra. É utilizado um anticorpo contra TH em conjunto com anticorpos que reconhecem marcadores neuronais (NeuN) ou gliais (GFAP) para determinar se as células transduzidas são neurónios ou células gliais. É realizada imunocoloração dupla em secções cerebrais. As secções são incubadas com um anticorpo contra TH policlonal de coelho (1/100; Affinitti) e anticorpo monoclonal contra neurofilamento de murganho (NeuN) (1/50; Chemicon) ou monoclonal GFAP de murganho (1/50; Chemicon) a 4 °C, de um dia para o outro, em soro de cabra a 10% em PBS e TritonX-100 a 0,5%. As secções são lavadas com PBS e depois incubadas com IgG de cabra anti coelho conjugada com Alexa 488 (1/200; Molecular Probes) ou IgG de cabra anti-murganho conjugada com CY3 (1/200; Jackson Laboratories) à temperatura ambiente durante 2-3 horas. Após lavagem as secções são examinadas sob um microscópio de fluorescência. A Figura 19 mostra a transdução do estriato de rato adulto com pONY8Z sete dias após a injecção. A figura 20 mostra a transdução do estriato de rato com pONY8TRIC duas semanas após a injecção.

Exemplo 12: Eficácia de vectores EIAV-TRIC num modelo de roedor da Doença de Parkinson: comportamento rotacional induzido por apomorfina O objectivo do presente estudo consiste em substituir a dopamina no estriato do modelo animal da doença de Parkinson. Os ratos recebem lesões 6-OHDA do feixe direito médio do cérebro anterior (MFB). São realizadas injecções estereotáxicas sob anestesia utilizando uma seringa Hamilton de 10 pL com uma 71 agulha de calibre 33 de ponta romba. Cada rato recebe 4 pL de 6-OHDA HC1 4 pg/pL (Sigma) dissolvida em ascorbato-soro fisiológico 2 mg/mL (ácido ascórbico a 0,2%, NaCl a 0,9%). A solução é infundida lentamente a uma velocidade de 0,5 pL/min. Três semanas após a lesão com 6-OHDA, os ratos são testados para a rotação induzida por anfetamina. Os animais são injectados i. p. com D-benzedrina 2,5 mg/kg (Sigma). A anfetamina é diluída em PBS. A assimetria rotacional é controlada ao longo de 90 minutos. São apenas utilizados na experiência seguinte ratos com > 7 rotações por min. Para a rotação induzida por apomorfina, os animais são testados duas vezes com 0,05 mg/kg sc com 4 dias de intervalo. Quinze ratos apresentam uma boa homogeneidade no que respeita à extensão das lesões com 6-OHDA. São realizadas duas experiências com vectores EIAV-TRIC. São unilateralmente injectados no estriato (ipsilateral à lesão) vectores lentivirais baseados no EIAV contendo os genes envolvidos na síntese dopamina, três semanas após as lesões com 6-OHDA. São incluídos dois grupos de animais em cada estudo: na primeira experiência ρΟΝΥδ.ΙΖ n = 5; pONY8.1T n = 4; no segundo estudo ρΟΝΥδ.ΙΖ n = 4; pONY8.1T n = 7. A rotação induzida por apomorfina é testada semanalmente após a injecção virai (Figura 24. A) para avaliar um possível benefício funcional do tratamento. Dois animais injectados com pONY8.1T (C3R5 & C5R4) apresentaram redução da rotação contralateral em relação à rotação pré-apo2 durante a totalidade do período da experiência, atingindo uma diminuição de 65 e 70% 3 semanas após a injecção virai (a presente requerente sugere que os 70% sejam provavelmente um artefacto, uma vez que um rato saiu do arnês durante esta rotação) . É observada uma redução de 60 e 35% 10 semanas após a injecção da solução virai nestes dois ratos. No segundo estudo, a substituição da dopamina reduziu de facto o número de rotações induzidas por apomorfina verificadas em 6 72 animais (em 7 ratos) injectados com pONY8.1T (Figura 24. B). A média da redução das rotações 6 semanas após a injecção virai é cerca de 45% em comparação com a pré-apomorfina 2.

No final de cada experiência, os ratos são perfundidos com PBS gelado contendo ácido ascórbico a 0,02% e 5000 unidades de heparina seguido por uma solução de paraformaldeido a 4%. Os cérebros são dissecados e são colocados em solução de paraf ormaldeido a 4%, de um dia para o outro, seguido por crioprotecção em solução de sacarose a 30%. A marcação imuno-histoquímica da TH é realizada em secções negrais e estriatais para testar a extensão da lesão. A imunocoloração da TH é realizada utilizando anticorpos policlonais de Coelho anti-TH em secções negrais (Figura 25. A) e estriatais (Figura 25. B) . São determinadas as catecolaminas produzidas pelos vectores EIAV TRIC no estriato desinervado de ratos 6-OHDA por HPLC e detecção electroquimica, como descrito nos exemplos anteriores. Os resultados são mostrados na Figura 26 e 27.

Exemplo 13: Vectores EIAV-TRIC utilizados para corrigir o modelo primata 6-OHDA da doença de Parkinson

Este modelo compreende a injecção unilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) no feixe nigrostriatal do pequeno macaco do Novo Mundo o sagui comum (Callithrix jacchus). Como no modelo de roedor, a assimetria causada pela toxina na sensibilidade do receptor entre o estriato desinervado e o intacto resulta no comportamento rotacional após a administração i. m. de factores domapinérgicos, tal como apomorfina (Annett et ai., (1997) . A velocidade das rotações induzidas por anfetamina está directamente relacionada com a disfunção dopaminérgica 73 estriatal e é utilizada para avaliar a eficácia terapêutica de diferentes tratamentos para a PD (Annett et al. (1994) Exp Neurol. 125:228-246; Annett et ai. (1992) Brain, 115:825-856). São lesionados saguis com 18-24 meses de idade sob anestesia por distribuição de 6-OHDA 4 mg/mL em peso de base livre (Sigma) dissolvida em ascorbato-soro fisiológico a 0,01%. Foi injectada 6-OHDA estereotaxicamente em cinco locais no feixe nigrostriatal num lado do cérebro (coordenadas: AP+6,5; L +/-1,2, V+6 e +7: L+/-2,2, V+6,5 e V+7,5, L+/- 3,2, V+7,5, como descrito em Stephan et al. (1980) Berlim: Springer-Verlag). São injectados três microlitros no local mais lateral e dois microlitros nos outros quatro locais. Os animais lesionados com 6-OHDA são examinados para o comportamento rotacional antes da lesão, após a lesão antes da injecção de vectores virais e um mês após serem injectados os vectores. As rotações são registadas durante 30 sessões de min que se iniciam 30 min após a injecção do fármaco. Os saguis são filmados mantidos numa caixa de Perspex transparente e é contado o número de rotações completas. São injectados quatro animais lesionados com 6-OHDA com 30 pL de armazenamentos virais EIAV-TRIC ou EIAVlacz no Caudado-putâmen em 6 locais (5 pL/local). Irá ser realizada uma avaliação comportamental dos macacos na realização de tarefas e testes de rotação induzida por apomorfina um mês após a injecção e em intervalos regulares durante vários meses para um seguimento a longo prazo. Os animais são sacrificados e as secções de tecido cerebrais são analisadas para imunorreactividade à TH como descrito anteriormente. O nível de catecolaminas no estriato desinervado é determinado por HPLC e detecção electroquímica (como descrito acima). 74

Exemplo 14; Vectores EIAV-TRIC utilizados para corrigir o modelo de primata MPTP da doença de Parkinson. 0 modelo primata da doença de Parkinson é considerado o modelo de referência na avaliação de terapias potenciais antes da entrada em ensaios clinicos humanos. Este modelo foi originalmente desenvolvido a partir da observação no inicio dos anos 1980 de que grupos de indivíduoss jovens estavam a desenvolver um distúrbio neurodegenerativo surpreendentemente semelhante à doença de Parkinson idiopática. A origem deste distúrbio foi seguida até à utilização de um estupefaciente de rua e especificamente ao produto químico conhecido como 1-metil-4-fenil-1,2,3,β-tetra-hidropiridina (MPTP) (Langston (1985)

Trends in Pharmacol. Sei. 6:375-378). Quando a MPTP é administrada a primatas, os animais desenvolvem um distúrbio de parkinson que se tornou o modelo principal para testar agentes anti-parkinson. A MPTP administrada perifericamente irá atravessar a barreira hematoencefálica, após o que é convertida em MPP+ pela oxidase de monoamina B (MAO-B) . A MPP+ é uma neurotoxina potente que acaba por causar a degenerescência da via nigro-estriatal da dopamina, como observado na doença de Parkinson. São tornados parkinsonianos macacos Cynomolgus (Macaca fascicularis) por injecções intravenosas semanais de MPTP 0,5-1 mg/kg durante dez meses consecutivos. Os animais são treinados para realizar tarefas motoras precisas antes da administração da MPTP. Os macacos com parkinson são testados para a redução significativa da actividade espontânea, tremor de acção bilateral, entorpecimento e dificuldades de postura e de equilíbrio para avaliar a eficácia da lesão. Os déficites motores são avaliados de acordo com uma escala de classificação 75 de deficiência para primatas não-humanos (Herrero et al., (1993) Neuroscience 56:965-72). Além disso, é também administrada apomorfina (0,1 mg/kg, i. m.) cada duas semanas para testar a aparência do comportamento rotacional. É permitido aos macacos recuperem da última administração de MPTP durante 3 meses antes da transdução intrastriatal. Os animais são anestesiados com uma mistura de cetamina (10 mg/kg) e midazolano (1 mg/kg) e colocados na grelha estereotáctica. É perfurado um orifício no crânio ao nível do ventrículo frontal direito de acordo com o atlas de Szabo e Cowan (Szabo e Cowan (1984) J. Comp. Neurol. 222:265-300) e é realizada uma ventriculografia injectando 0,4 mL de Omnigrass no ventrículo direito. É medida a linha intercomisural (linha AC-PC) e as coordenadas do núcleo do putâmen são ajustadas de acordo com o atlas.

Os vectores virais EIAV-TRIC e EIAVIacZ (5 pL de ~l-5 x 109 t.u./mL) são injectados estereotaxicamente unilateralmente no putâmen esquerdo em dois locais ao longo do eixo rostrocaudal utilizando uma seringa de Hamilton. Resumidamente, são injectados 2 X 5 pL de ~1-5χ109 t.u./mL no núcleo do putâmen como se segue: putâmen rostral, AP +3,4mm a partir do ponto central da linha AC-PC; ML 12 mm a partir do seio longitudinal e VD 15 mm abaixo da dura mater. O animal recebe antibióticos (ampicilina 250 mg/dia, i. m.) profilacticamente durante duas semanas e analgesia com fármacos anti-inflamatórios não-esteróides (flunixina, 2,5 mg/kg). Os animais são seguidos periodicamente (cada duas semanas) durante 3-5 meses para determinar se os vectores terapêuticos melhoram o comportamento parkinsoniano (During et al. (1994)). Estes são testados para déficites motores como descrito acima. No final do período experimental, os animais são perfundidos transcardialmente com PFA a 4% em PBS. Os cérebros são fixados, de um dia para o 76 outro, no mesmo fixador a 4 °C e são depois imersos em sacarose a 30% em PBS. Foram cortadas secções coronais do cérebro (30 pm de espessura) num micrótomo glacial e recolhidas em PBS. É analisada a imunorreactividade a TH e os niveis de catecolaminas no putâmen desinervado como descrito anteriormente.

Todas as publicações referidas na descrição acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações dos métodos descritos e do sistema da invenção irão ser evidentes para os especialistas na técnica sem se afastarem do âmbito e do espirito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em ligação com formas de realização preferidas especificas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a essas formas de realização especificas. De facto, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvias para os especialistas em química, biologia ou em campos relacionados pretendem estar dentro do âmbito das reivindicações seguintes. 77 TABELA 1 ADN L-DOPA DOPAC DA Controlo n. d. n. d. n. d. TRIC 0,745 +/- 0,047 n. d. 0,546 +/- 0,055 BIC+ AADC 0,729 +/- 0,045 0,531 +/- 0,10 11,31 +/- 1,01 BIC 58,65 +/- 6,20 n. d. n. d. hTHt 0, 845 n. d. n. d. TABELA 2 ADN L-DOPA DOPAC DA Controlo n. d. n. d. n. d. TRIC 0,745 +/- 0,047 n. d. 0,545 +/- 0,055 BIC+ AADC 0,728 +/- 0,045 0,531 +/- 0,10 11,31 +/- 1,01 BIC 58,55 +/- 6,20 n. d. n. d. hTHt 0, 845 n. d. n. d. 78

Tabela 3: Eficiência de Integração Relativa MOI pONY8G pONY8T-l pONY8T-2 pONY 8,1Z pONY8,1T Integrase- 100X 10,61 11,44 10,6 11,6 11, 6 2,1 10X 7 6,16 5,7 8,67 6,63 2,4 IX 4,37 4,8 n. d. 7, 09 4, 6 n. d. As células D17 foram transduzidas com vectores EIAV em diferentes MOI. Os valores dCT representam a proporção de genomas β-actina/EIAV em 100 ng de ADN total (dCt = pacção Ct-CMVp Ct) . A reacção de PCR amplifica a região do promotor do CMV presente no genoma EIAV integrado. Os valores dCT de células não transduzidas foram de -1,85. São obtidos resultados semelhantes utilizando o sinal de empacotamento EIAV.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

SEQ ID N° 1: pONY8G

AGATCTTGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATTTCTGTCGCC

GACTAAATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCGATATTGGAA

AAATTGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGATGTGAGTTTCTGTGTAAC

TGATATCGCCAÍII MCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGATATCTGGCGATAGCGCT

TATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATTCTGTGTGTC

GCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGCCGATAGAGG

CGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCAATATTGGCC

ATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCA

TACGTTGTATCCATATCGTAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCC

ATGTTGACATrGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCA

TAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACC

GCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAAT

AGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGT

ACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCC

CGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTA

CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTriTGGCAGTACACCAATGGGCGTGG

ATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTT

GTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCC

CCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGT

TTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGG

CCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATC 79

CTACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGG

CTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTC

CTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATTGGGAGACCCTTTGACATTGGAGCAAGGCG

CTCAAGAAGTTAGAGAAGGTGACGGTACAAGGGTCTCAGAAATTAACTACTGGTAACTGT

AATTGGGCGCTAAGTCTAGTAGACTTATTTCATGATACCAACTTTGTAAAAGAAAAGGAC

TGGCAGCTGAGGGATGTCATTCCATTGCTGGAAGATGTAACTCAGACGCTGTCAGGACAA

GAAAGAGAGGCCTTTGAAAGAACATGGTGGGCAATTTCTGCTGTAAAGATGGGCCTCCAG

ATTAATAATGTAGTAGATGGAAAGGCATCATTCCAGCTCCTAAGAGCGAAATATGAAAAG

AAGACTGCTAATAAAAAGCAGTCTGAGCCCTCTGAAGAATATCTCTAGAACTAGTGGATC

CCCCGGGCTGCAGGAGTGGGGAGGCACGATGGCCGCTTTGGTCGAGGCGGATCCGGCCAT

TAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATA

CGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCAT

GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATA

GCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGC

CCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG

GGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTAC

ATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG

CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACG

TATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGAT

AGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGT

TTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGC

AAATGGGCGGTAGGCATGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACC

GTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACC

GATCCAGCCTCCGCGGCCCCAAGCTTGTTGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAA

GGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAA

CGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGAC

CCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCAC

CCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTT

CTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGA

CGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCAT

CGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTA

CAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGT

GAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCA

GCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAC

CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTT

CGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGCCGCGA

CTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTCAGCTGCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCA

GCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGGGAAGTATTTATCACTAATCAAGCAC

AAGTAATACATGAGAAACTTTTACTACAGCAAGCACAATCCTCCAAAAAATTTTGTTTTT

ACAAAATCCCTGGTGAACATGATTGGAAGGGACCTACTAGGGTGCTGTGGAAGGGTGATG

GTGCAGTAGTAGTTAATGATGAAGGAAAGGGAATAATTGCTGTACCATTAACCAGGACTA

AGTTACTAATAAAACCAAATTGAGTATTGTTGCAGGAAGCAAGACCCAACTACCATTGTC

AGCTGTGTTTCCTGACCTCAATATTTGTTATAAGGTTTGATATGAATCCCAGGGGGAATC

TCAACCCCTATTACCCAACAGTCAGAAAAATCTAAGTGTGAGGAGAACACAATGTTTCAA

CCTTATTGTTATAATAATGACAGTAAGAACAGCATGGCAGAATCGAAGGAAGCAAGAGAC

CAAGAATGAACCTGAAAGAAGAATCTAAAGAAGAAAAAAGAAGAAATGACTGGTGGAAAA

TAGGTATGTTTCTGTTATGCTTAGCAGGAACTACTGGAGGAATACTTTGGTGGTATGAAG

GACTCCCACAGCAACATTATATAGGGTTGGTGGCGATAGGGGGAAGATTAAACGGATCTG

GCCAATCAAATGCTATAGAATGCTGGGGTTCCTTCCCGGGGTGTAGACCATTTCAAAATT

ACTTCAGTTATGAGACCAATAGAAGCATGCATATGGATAATAATACTGCTACATTATTAG

AAGCTTTAACCAATATAACTGCTCTATAAATAACAAAACAGAATTAGAAACATGGAAGTT

AGTAAAGACTTCTGGCATAACTCCTTTACCTATTTC7TCTGAAGCTAACACTGGACTAAT

TAGACATAAGAGAGATTTTGGTATAAGTGCAATAGTGGCAGCTATTGTAGCCGCTACTGC

TATTGCTGCTAGCGCTACTATGTCTTATGTTGCTCTAACTGAGGTTAACAAAATAATGGA

AGTACAAAATCATACTTTTGAGGTAGAAAATAGTACTCTAAATGGTATGGATTTAATAGA

ACGACAAATAAAGATATTATATGCTATGATTCTTCAAACACATGCAGATGTTCAACTGTT

AAAGGAAAGACAACAGGTAGAGGAGACATTTAATTTAATTGGATGTATAGAAAGAACACA

TGTATTTTGTCATACTGGTCATCCCTGGAATATGTCATGGGGACATTTAAATGAGTCAAC

ACAATGGGATGACTGGGTAAGCAAAATGGAAGATTTAAATCAAGAGATACTAACTACACT

TCATGGAGCCAGGAACAATTTGGCACAATCCATGATAACATTCAATACACCAGATAGTAT

AGCTCAATTTGGAAAAGACCTTTGGAGTCATATTGGAAATTGGATTCCTGGATTGGGAGC

TTCCATTATAAAATATATAGTGATGTmTGCTTATTTATTTGTTACTAACCTCTTCGCC

TAAGATCCTCAGGGCCCTCTGGAAGGTGACCAGTGGTGCAGGGTCCTCCGGCAGTCGTTA

CCTGAAGAAAAAATTCCATCACAAACATGCATCGCGAGAAGACACCTGGGACCAGGCCCA

ACACAACATACACCTAGCAGGCGTGACCGGTGGATCAGGGGACAAATACTACAAGCAGAA

GTACTCCAGGAACGACTGGAATGGAGAATCAGAGGAGTACAACAGGCGGCCAAAGAGCTG 80

GGTGAAGTCAATCGAGGCATTTGGAGAGAGCTATATTTCCGAGAAGACCAAAGGGGAGAT

TTCTCAGCCTGGGGCGGCTATCAACGAGCACAAGAACGGCTCTGGGGGGAACAATCCTCA

CCAAGGGTCCTTAGACCTGGAGATTCGAAGCGAAGGAGGAAACATTTATGACTGTTGCAT

TAAAGCCCAAGAAGGAACTCTCGCTATCCCTTGCTGTGGATTTCCCTTATGGCTATTTTG

GGGACTAGTAATTATAGTAGGACGCATAGCAGGCTATGGATTACGTGGACTCGCTGTTAT

AATAAG G ATTT GTATT AG AGGCTTAAATTT G ATATTT G AAATAAT CAG AAAAATGCTT GA

TTATATTGGAAGAGCTTTAAATCCTGGCACATCTCATGTATCAATGCCTCAGTATGTTTA

GAAAAACAAGGGGGGAACTGTGGGGI I I I IATGAGGGGTTTTATAAATGATTATAAGAGT

AAAAAGAAAGTTGCTGATGCTCTCATAACCTTGTATAACCCAAAGGACTAGCTCATGTTG

CTAGGCAACTAAACCGCAATAACCGCATTTGTGACGCGAGTTCCCCATTGGTGACGCGTT

AACTTCCTGTTTTTACAGTATATAAGTGCTTGTATTCTGACAATTGGGCACTCAGATTCT

GCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTA

CTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTTGGCGTAA

TCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATA

CGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTA

ATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAA

TGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCG

CTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAG

GCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAA

AAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCA

TCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACA

GGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCG

ACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCT

CATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGT

GTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAG

TCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGC

AGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTAC

ACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGA

gttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggi I I ITTTGTTTGC

AAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACG

GGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCA

AAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGT

ATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCA

GCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACG

ATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCA

CCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGT

CCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGT

AGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCA

CGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACA

TGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGA

AGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACT

GTCATGCCATCCGTAAGATGCmTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGA

GAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCG

CCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTC

TCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGA

TCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAAT

GCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTT

CAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGT

ATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAA

TTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAA111 M GTTAAATCAGCTCATTTT

TTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAG

GGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACG

TCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAAT

CAAGII I I I IGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCC

GATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCAACCTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATA

GGGAGACCGGC 81

SEQ ID N° 2: P0NY8.1G

AGATCTTGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATTTCTGTCGCCGACTAAATTCA

TGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCGATATTGGAAAAATTGATATTTGAAAATATG

GCATATTGAAAATGTCGCCGATGTGAGTTTCTGTGTAACTGATATCGCCATTTTTCCAAAAGTGATmTG

GGCATACGCGATATCTGGCGATAGCGCTTATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGAC

TTGGGCGATTCTGTGTGTCGCAAATATCGCAGnTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGC

CGATAGAGGCGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCAATATTGGCCA

TTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCA

TATCGTAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGT

TATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTAC

GGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCC

CATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTG

GCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCC

TGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCG

CTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGAT

TTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAA

ATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGT

CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGG

GCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCC

TACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGGCTGATCGTA

GGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTCCTGGCCAGAACACAGGA

GGACAGGTAAGATTGGGAGACCCTTTGACATTGGAGCAAGGCGCTCAAGAAGTTAGAGAAGGTGACGG

TACAAGGGTCTCAGAAATTAACTACTGGTAACTGTAATTGGGCGCTAAGTCTAGTAGACTTATTTCATGAT

ACCAACTTTGTAAAAGAAAAGGACTGGCAGCTGAGGGATGTCATTCCATTGCTGGAAGATGTAACTCAGA

CGCTGTCAGGACAAGAAAGAGAGGCCTTTGAAAGAACATGGTGGGCAATTTCTGCTGTAAAGATGGGCC

TCCAGATTAATAATGTAGTAGATGGAAAGGCATCATTCCAGCTCCTAAGAGCGAAATATGAAAAGAAGAC

TGCTAATAAAAAGCAGTCTGAGCCCTCTGAAGAATATCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGG

AGTGGGGAGGCACGATGGCCGCTTTGGTCGAGGCGGATCCGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTAT

ATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATT

GGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG

GTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGA

CCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACT

TTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATA

TGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGA

CCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTT

TGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGAC

GTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCAT

TGACGCAAATGGGCGGTAGGCATGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTC

AGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCC

GCGGCCCCAAGCTTGTTGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACC

GGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCG

AGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCC

GTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCA

CATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTT

CAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGC

ATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTA

CAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCG

CCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACG

GCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAG

AAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCT

GTACAAGTAAAGCGGCCGCGACTCTAGAGTCGACCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGT

CGAATTGGAAGAGCTTTAAATCCTGGCACATCTCATGTATCAATGCCTCAGTATGTTTAGAAAAACAAGG

GGGGAACTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAAATGATTATAAGAGTAAAAAGAAAGTTGCTGATGCT

CTCATAACCTTGTATAACCCAAAGGACTAGCTCATGTTGCTAGGCAACTAAACCGCAATAACCGCATTTG

TGACGCGAGTTCCCCATTGGTGACGCGTTAACTTCCTGI I I IIACAGTATATAAGTGCTTGTATTCTGACA

ATTGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATA

ATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTTGGCGTAATCA

TGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCA 82

TAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCG

CTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGT

TTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCG

AGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAA

CATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAG

GCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGAC

TATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTA

CCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATC

TCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGC

TGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCA

GCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCC

TAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAA

AGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGIII IT ΓI GTTTGCAAGCAG

CAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGT

GGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTA

AATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTA

ATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGT

AGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCT

CACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCA

ACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATA

GTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATT

CAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTC

CTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACT

GCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCAT

TCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCAC

ATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACC

GCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACC

AGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAA atgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcgg

ATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAC

CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAAI111 IGTTAAATCAGCTCATrrTTTAACCAA

TAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAG

TTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGG

GCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAA

ATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCAACCTGGCTTATCGAAATTA

ATACGACTCACTATAGGGAGACCGGC

SEQ ID N° 3: P0NY8Z

AGATCTTGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATTTCTGTCGCC

GACTAAATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCGATATTGGAA

AAATTGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGATGTGAGT7TCTGTGTAAC

TGATATCGCCATTTTTCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGATATCTGGCGATAGCGCT

TATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATTCTGTGTGTC

GCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGCCGATAGAGG

CGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCAATATTGGCC

ATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCA

TACGTTGTATCCATATCGTAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCC

ATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCA

TAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACC

GCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAAT

AGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGT

ACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCC

CGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTA

CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGG

ATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTT

GTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGATCGCCCGCC

CCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGT

TTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGG

CCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATC 83

CTACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACCCTACCTGTTGAACCTGG

CTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAAGTCTTCTGGAGGTGTTC

CTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATTGGGAGACCCTTTGACATTGGAGCAAGGCG

CTCAAGAAGTTÁGAGAAGGTGACGGTACAAGGGTCTCAGAAATTAACTACTGGTAACTGT

AATTGGGCGCTAAGTCTAGTAGACTTATTTCATGATACCAACTTTGTAAAAGAAAAGGAC

TGGCAGCTGAGGGATGTCATTCCATTGCTGGAAGATGTAACTCAGACGCTGTCAGGACAA

GAAAGAGAGGCCTTTGAAAGAACATGGTGGGCAATTTCTGCTGTAAAGATGGGCCTCCAG

ATTAATAATGTAGTAGATGGAAAGGCATCATTCCAGCTCCTAAGAGCGAAATATGAAAAG

AAGACTGCTAATAAAAAGCAGTCTGAGCCCTCTGAAGAATATCTCTAGAACTAGTGGATC

CCCCGGGCTGCAGGAGTGGGGAGGCACGATGGCCGCTTTGGTCGAGGCGGATCCGGCCAT

TAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATA

CGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCAT

GTTGACATT G ATTATT GACTAGTTATTAATAGTAAT C AATTACGGGGTCATTAGTT CATA

GCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGC

CCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG

GGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTAC

ATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG

CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACG

TATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGAT

AGCGGTTTGACTCACGGGGATTTGCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGT

TTT GGCACCAAAAT CAACGGGACTTTCCAAAATGTCGT AACAACTCCGCCCCATT GACGC

AAATGGGCGGTAGGCATGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACC

GTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACC

GATCCAGCCTCCGCGGCCCCAAGCTTCAGCTGCTCGAGGATCTGCGGATCCGGGGAATTC

CCCAGTCTCAGGATCCACCATGGGGGATCCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAA

CCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAA

TAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATG

GCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCT

TCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCC

CATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAA

TCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCA

GACGCGAATTAI I I I IGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTG

GGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACG

CGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGTTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGA

AGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACC

GACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGC

TGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGT

TTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAAT

TATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCC

GAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGC

CGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGA

AAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGA

GCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCT

GATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTG

GTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCA

CGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGA

ACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCT

GGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGT

CGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATAT

TATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATG

GTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATA

CGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCA

GTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATA

TGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGA

TCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGAC

GGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGT

GACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCT

GGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACA

GTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGT

ACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCA

GCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCC

GCATCTGACCACCAGCGAAATGGA11IIΊ GCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATT

TAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGAC

GCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGC

GACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGC

CGAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGAC 84

CGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGAT

TGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCA

TCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCT

CGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTG

GGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCG

CTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAA

CATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGC

GGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTC

CTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTT

GGTCTGGTGTCAAAAATAATAATAACCGGGCAGGGGGGATCCGCAGATCCGGCTGTGGAA

TGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAG

CATGCCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCG

GTACCCAGCTTrrGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGGGAAGTATTTATCACTAAT

CAAGCACAAGTAATACATGAGAAACTTTTACTACAGCAAGCACAATCCTCCAAAAAATTT

TGmTTACAAAATCCCTGGTGAACATGATTGGAAGGGACCTACTAGGGTGCTGTGGAAG

GGTGATGGTGCAGTAGTAGTTAATGATGAAGGAAAGGGAATAATTGCTGTACCATTAACC

AGGACTAAGTTACTAATAAAACCAAATTGAGTATTGTTGCAGGAAGCAAGACCCAACTAC

CATTGTCAGCTGTGTTTCCTGACCTCAATATTTGTTATAAGGTTTGATATGAATCCCAGG

GGGAATCTCAACCCCTATTACCCAACAGTCAGAAAAATCTAAGTGTGAGGAGAACACAAT

GTTTCAACCTTATTGTTATAATAATGACAGTAAGAACAGCATGGCAGAATCGAAGGAAGC

AAGAGACCAAGAATGAACCTGAAAGAAGAATCTAAAGAAGAAAAAAGAAGAAATGACTGG

TGGAAAATAGGTATGTTTCTGTTATGCTTAGCAGGAACTACTGGAGGAATACTTTGGTGG

TATGAAGGACTCCCACAGCAACATTATATAGGGTTGGTGGCGATAGGGGGAAGATTAAAC

GGATCTGGCCAATCAAATGCTATAGAATGCTGGGGTTCCTTCCCGGGGTGTAGACCATTT

CAAAATTACTTCAGTTATGAGACCAATAGAAGCATGCATATGGATAATAATACTGCTACA

TTATTAGAAGCTTTAACC AATATAACTGCTCTATAAATAACAAAACAGAATTAGAAACAT

GGAAGTTAGTAAAGACTTCTGGCATAACTCCTTTACCTATTTCTTCTGAAGCTAACACTG

GACTAATTAGACATAAGAGAGATTTTGGTATAAGTGCAATAGTGGCAGCTATTGTAGCCG

CTACTGCTATTGCTGCTAGCGCTACTATGTCTTATGTTGCTCTAACTGAGGTTAACAAAA

TAATGGAAGTACAAAATCATACTTTTGAGGTAGAAAATAGTACTCTAAATGGTATGGATT

TAATAGAACGACAAATAAAGATATTATATGCTATGATTCTTCAAACACATGCAGATGTTC aactgttaaaggaaagacaacaggtagaggagacatttaatttaattggatgtatagaaa

GAACACATGTATTTTGTCATACTGGTCATCCCTGGAATATGTCATGGGGACATTTAAATG

AGTCAACACAATGGGATGACTGGGTAAGCAAAATGGAAGATTTAAATCAAGAGATACTAA

CTACACTTCATGGAGCCAGGAACAATTTGGCACAATCCATGATAACATTCAATACACCAG

ATAGTATAGCTCAATTTGGAAAAGACCTTTGGAGTCATATTGGAAATTGGATTCCTGGAT

TGGGAGCTTCCATTATAAAATATATAGTGATGTmTGCTTATTTATTTGTTACTAACCT

CTTCGCCTAAGATCCTCAGGGCCCTCTGGAAGGTGACCAGTGGTGCAGGGTCCTCCGGCA

GTCGTTACCTGAAGAAAAAATTCCATCACAAACATGCATCGCGAGAAGACACCTGGGACC

AGGCCCAACACAACATACACCTAGCAGGCGTGACCGGTGGATCAGGGGACAAATACTACA

AGCAGAAGTACTCCAGGAACGACTGGAATGGAGAATCAGAGGAGTACAACAGGCGGCCAA

AGAGCTGGGTGAAGTCAATCGAGGCATTTGGAGAGAGCTATATTTCCGAGAAGACCAAAG

GGGAGATTTCTCAGCCTGGGGCGGCTATCAACGAGCACAAGAACGGCTCTGGGGGGAACA

ATCCTCACCAAGGGTCCTTAGACCTGGAGATTCGAAGCGAAGGAGGAAACATTTATGACT

GTTGCATTAAAGCCCAAGAAGGAACTCTCGCTATCCCTTGCTGTGGATTTCCCTTATGGC

TATTTTGGGGACTAGTAATTATAGTAGGACGCATAGCAGGCTATGGATTACGTGGACTCG

CTGTTATAATAAGGATTTGTATTAGAGGCTTAAATTTGATATTTGAAATAATCAGAAAAA

TGCTTGATTATATTGGAAGAGCTTTAAATCCTGGCACATCTCATGTATCAATGCCTCAGT

ATGTTTAGAAAAACAAGGGGGGAACTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAAATGATTA

TAAGAGTAAAAAGAAAGTTGCTGATGCTCTCATAACCTTGTATAACCCAAAGGACTAGCT

CATGTTGCTAGGCAACTAAACCGCAATAACCGCATTTGTGACGCGAGTTCCCCATTGGTG

ACGCGTTAACTTCCTGTTTTTACAGTATATAAGTGCTTGTATTCTGACAATTGGGCACTC

AGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAA

TTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTT

GGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACA

CAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACT

CACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCT

GCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGC

TTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCA

CTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTG

AGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCA

TAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAA

CCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCC 85

TGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGC

GCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCT

GGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCG

TCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAG

GATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTA

CGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGG

AAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTT

TGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTT

TTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAG

ATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAAT

CTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACC

TATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGAT

AACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCC

ACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAG

AAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAG

AGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGT

GGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCG

AGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGT

TGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTC

TCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTC

ATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAA

TACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCG

AAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACC

CAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAG

GCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTT

CCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATT

TGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCC

ACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAAI I I I IGTTAAATCAGC

TCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACC

GAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGAC

TCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCA

CCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGG

AGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCAACCTGGCTTATCGAAATTAATACGACT

CACTATAGGGAGACCGGC

SED ID N° 4 P0NY8-BIC

GTCACCAAGTTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTAC

CGCCAGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATT

CCCCGTGTGGAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTG

AAGGGCCTCTACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGGTTTGCTGGAG

CGCTTCAGCGGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTG

AAGGAGCGCACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTC

CTGGCCAGCCTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCG

CCCATGCACTCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTG

GCCGACCGCACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCG

GATGAGGAAATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTCATGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGT

AAGCAGAACGGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTC

CTGCACTGCCTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTG

CAGCCCTACCAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGAC

GCCAAGGACAAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTC

GACCCGTACACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTG

GAGGGTGTCCAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGCTGGAAT

TCTGCAGATATCTTAAAACAGCTCTGGGGTTGTACCCACCCCAGAGGCCCACGTGGCGGC

TAGTACTCCGGTATTGCGGTACCTTTGTACGCCTGTTTTATACTCCCTTCCCCCGTAACT

TAGAAGCACAATGTCCAAGTTCAATAGGAGGGGGTACAAACCAGTACCACCACGAACAAG

CACTTCTGTTCCCCCGGTGAGGCTGTATAGGCTGTTTCCACGGCTAAAAGCGGCTGATCC

GTTATCCGCTCATGTACTTCGAGAAGCCTAGTATCACCTTGGAATCTTCGATGCGTTGCG

CTCAACACTCAACCCCAGAGTGTAGCTTAGGTCGATGAGTCTGGACGTTCCTCACCGGCG

ACGGTGGTCCAGGCTGCGTTGGCGGCCTACCTGTGGCCCAAAGCCACAGGACGCTAGTTG

TGAACAAGGTGTGAAGAGCCTATTGAGCTACCTGAGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGC 86

TAATCCTAACCACGGAGCAGGCAGTGGCAATCCAGCGACCAGCCTGTCGTAACGCGCAAG

TTCGTGGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTTTTACAATGGCTGC

TTATGGTGACAATCATTGATTGTTATCATAAAGCAAATTGGATTGGCCATCCGGTGAGAA

TTTGATTATTAAATTACTCTCTTGTTGGGATTGCTCCTTTGAAATCTTGTGCACTCACAC

CTATTGGAATTACCTCATTGTTAAACGCGTCTAGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTAC

CGAGCTCGGATCTGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACGAGAAGGGCCCTGTGCG

GGCACCGGCGGAGAAGCCGCGGGGCGCCAGGTGCAGCAATGGGTTCCCCGAGCGGGATCC

GCCGCGGCCCGGGCCCAGCAGGCCGGCGGAGAAGCCCCCGCGGCCCGAGGCCAAGAGCGC

GCAGCCCGCGGACGGCTGGAAGGGCGAGCGGCCCCGCAGCGAGGAGGATAACGAGCTGAA

CCTCCCTAACCTGGCAGCCGCCTACTCGTCCATCCTGAGCTCGCTGGGCGAGAACCCCCA

GCGGCAAGGGCTGCTCAAGACGCCCTGGAGGGCGGCCTCGGCCATGCAGTTCTTCACCAA

GGGCTACCAGGAGACCATCTCAGATGTCCTAAACGATGCTATATTTGATGAAGATCATGA

TGAGATGGTGATTGTGAAGGACATAGACATGTTTTCCATGTGTGAGCATCACTTGGTTCC

ATTTGTTGGAAAGGTCCATATTGGTTATCTTCCTAACAAGCAAGTCCTTGGCCTCAGCAA

ACTTGCGAGGATTGTAGAAATCTATAGTAGAAGACTACAAGTTCAGGAGCGCCTTACAAA

ACAAATTGCTGTAGCAATCACGGAAGCCTTGCGGCCTGCTGGAGTCGGGGTAGTGGTTGA

AGCAACACACATGTGTATGGTAATGCGAGGTGTACAGAAAATGAACAGCAAAACTGTGAC

CAGCACAATGTTGGGTGTGTTCCGGGAGGATCCAAAGACTCGGGAAGAGTTCCTGACTCT

CATTAGGAGCTGAAAGCTTCGATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCTCGAGGGGGGGCCCGG

TACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGGGAAGTATTTATCACTAATC

AAGCACAAGTAATACATGAGAAACTTTTACTACAGCAAGCACAATCCTCCAAAAAATnT

GTTTTTACAAAATCCCTGGTGAACATGATTGGAAGGGACCTACTAGGGTGCTGTGGAAGG

GTGATGGTGCAGTAGTAGTTAATGATGAAGGAAAGGGAATAATTGCTGTACCATTAACCA

GGACTAAGTTACTAATAAAACCAAATTGAGTATTGTTGCAGGAAGCAAGACCCAACTACC

ATTGTCAGCTGTGTTTCCTGACCTCAATATTTGTTATAAGGTTTGATATGAATCCCAGGG

GGAATCTCAACCCCTATTACCCAACAGTCAGAAAAATCTAAGTGTGAGGAGAACACAATG

TTTCAACCTTATTGTTATAATAATGACAGTAAGAACAGCATGGCAGAATCGAAGGAAGCA

AGAGACCAAGAATGAACCTGAAAGAAGAATCTAAAGAAGAAAAAAGAAGAAATGACTGGT

GGAAAATAGGTATGTTTCTGTTATGCTTAGCAGGAACTACTGGAGGAATACTTTGGTGGT

ATGAAGGACTCCCACAGCAACATTATATAGGGTTGGTGGCGATAGGGGGAAGATTAAACG

GATCTGGCCAATCAAATGCTATAGAATGCTGGGGTTCCTTCCCGGGGTGTAGACCATTTC

AAAATTACTTCAGTTATGAGACCAATAGAAGCATGCATATGGATAATAATACTGCTACAT

TATTAGAAGCTTTAACCAATATAACTGCT CTATAAATAAC AAAACAG AATTAGAAAC AT G

GAAGTTAGTAAAGACTTCTGGCATAACTCCTTTACCTATTTCTTCTGAAGCTAACACTGG

ACTAATTAGACATAAGAGAGATTTTGGTATAAGTGCAATAGTGGCAGCTATTGTAGCCGC

TACTGCTATTGCTGCTAGCGCTACTATGTCTTATGTTGCTCTAACTGAGGTTAACAAAAT

AATGGAAGTACAAAATCATACTTTTGAGGTAGAAAATAGTACTCTAAATGGTATGGATTT

AATAGAACGACAAATAAAGATATTATATGCTATGATTCTTCAAACACATGCAGATGTTCA

ACTGTTAAAGGAAAGACAACAGGTAGAGGAGACATTTAATTTAATTGGATGTATAGAAAG

AACACATGTATTTTGTCATACTGGTCATCCCTGGAATATGTCATGGGGACATTTAAATGA

GTCAACACAATGGGATGACTGGGTAAGCAAAATGGAAGATTTAAATCAAGAGATACTAAC

TACACTTCATGGAGCCAGGAACAATTTGGCACAATCCATGATAACATTCAATACACCAGA

TAGTATAGCTCAATTTGGAAAAGACCTTTGGAGTCATATTGGAAATTGGATTCCTGGATT

GGGAGCTTCCATTATAAAATATATAGTGATG1' 1111GCTTATTTATTTGTTACTAACCTC

TTCGCCTAAGATCCTCAGGGCCCTCTGGAAGGTGACCAGTGGTGCAGGGTCCTCCGGCAG

TCGTTACCTGAAGAAAAAATTCCATCACAAACATGCATCGCGAGAAGACACCTGGGACCA

GGCCCAACACAACATACACCTAGCAGGCGTGACCGGTGGATCAGGGGACAAATACTACAA

GCAGAAGTACTCCAGGAACGACTGGAATGGAGAATCAGAGGAGTACAACAGGCGGCCAAA

GAGCTGGGTGAAGTCAATCGAGGCATTTGGAGAGAGCTATATTTCCGAGAAGACCAAAGG

GGAGATTTCTCAGCCTGGGGCGGCTATCAACGAGCACAAGAACGGCTCTGGGGGGAACAA

TCCTCACCAAGGGTCCTTAGACCTGGAGATTCGAAGCGAAGGAGGAAACATTTATGACTG

TTGCATTAAAGCCCAAGAAGGAACTCTCGCTATCCCTTGCTGTGGATTTCCCTTATGGCT

ATTTTGGGGACTAGTAATTATAGTAGGACGCATAGCAGGCTATGGATTACGTGGACTCGC

TGTTATAATAAGG ATTT GTATTAGAGGCTTAAATTT G ATATTT G AAATAAT C AG AAAAAT

GCTTGATTATATTGGAAGAGCTTTAAATCCTGGCACATCTCATGTATCAATGCCTCAGTA

TGTTTAGAAAAACAAGGGGGGAACTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAAATGATTAT

AAGAGTAAAAAGAAAGTTGCTGATGCTCTCATAACCTTGTATAACCCAAAGGACTAGCTC

ATGTTGCTAGGCAACTAAACCGCAATAACCGCATTTGTGACGCGAGTTCCCCATTGGTGA

CGCGTTAACTTCCTGTTTTTACAGTATATAAGTGCTTGTATTCTGACAATTGGGCACTCA

GATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAAT

TCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTTG

GCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACAC

AACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTC

ACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTG

CATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCT 87

TCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCAC

TCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGA

GCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCAT

AGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAAC

CCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCT

GTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCG

CTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTG

GGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGT

CTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGG

ATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTAC

GGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGA AAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGG111 I I 11

GTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTT

TCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGA

TTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATC

TAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCT

ATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATA

ACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCA

CGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGA

AGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGA

GTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTG

GTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGA

GTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTT

GTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCT

CTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCA

TTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAAT

ACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGA

AAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCC

AACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGG

CAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTC

CTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTT

GAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCA

CCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCT

CATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCG

AGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACT

CCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCAC

CCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGA

GCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCAACCTGGCTTATCGAAATTAATACGACTC

ACTATAGGGAGACCGGCAGATCTTGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTT

TTGAGATTTCTGTCGCCGACTAAATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAG

AGATGGCGATATTGGAAAAATTGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGAT

GTGAGTTTCTGTGTAACTGATATCGCCA I ΓΙTTCCAAAAGTGA riTTTGGGCATACGCGA

TATCTGGCGATAGCGCTTATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTT

GGGCGATTCTGTGTGTCGCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGC

TATATCGCCGATAGAGGCGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACA

TTGAATCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATT

GGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCGTAATATGTACATTTATATTGGCTCA

TGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATT

ACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAAT

GGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTT

CCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAA

ACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTC

AATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCT

ACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAG

TACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATT

GACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAAC

AACTGCGATCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCT

ATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTGCGGTCTGAGTCCCTTCT

CTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACTCAGTCCCTGTCTCTAG

TTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGTTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAGAGGGGCGCAGACC

CTACCTGTTGAACCTGGCTGATCGTAGGATCCCCGGGACAGCAGAGGAGAACTTACAGAA

GTCTTCTGGAGGTGTTCCTGGCCAGAACACAGGAGGACAGGTAAGATTGGGAGACCCTTT

GACATTGGAGCAAGGCGCTCAAGAAGTTAGAGAAGGTGACGGTACAAGGGTCTCAGAAAT

TAACTACTGGTAACTGTAATTGGGCGCTAAGTCTAGTAGACTTATTTCATGATACCAACT

TTGTAAAAGAAAAGGACTGGCAGCTGAGGGATGTCATTCCATTGCTGGAAGATGTAACTC

AGACGCTGTCAGGACAAGAAAGAGAGGCCTTTGAAAGAACATGGTGGGCAATTTCTGCTG

TAAAGATGGGCCTCCAGATTAATAATGTAGTAGATGGAAAGGCATCATTCCAGCTCCTAA

GAGCGAAATATGAAAAGAAGACTGCTAATAAAAAGCAGTCTGAGCCCTCTGAAGAATATC

TCTAGAACTAGTGGATCTCCCGÀTCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGAT

GCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGC

GCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTG

CTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACAT

TGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATAT

ATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGAC

CCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTC

CATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTG

TATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCAT

TATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTC

ATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTT

GACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCAC

CAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGC

GGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCC

ACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAG

CGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGGAACAAAAACTCATCT

CAGAAGAGGATCTGAAGGTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTC

ATCACCTG

SEQ ID N° 5 P0NY8TRIC

TACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAG

CTCGGATCTGCCACCATGTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCAACGCAAGTGAATTC

CGAAGGAGAGGGAAGGAGATGGTGGATTACGTGGCCAACTACATGGAAGGCATTGAGGGA

CGCCAGGTCTACCCTGACGTGGAGCCCGGGTACCTGCGGCCGCTGATCCCTGCCGCTGCC

CCTCAGGAGCCAGACACGTTTGAGGACATCATCAACGACGTTGAGAAGATAATCATGCCT

GGGGTGACGCACTGGCACAGCCCCTACTTCTTCGCCTACTTCCCCACTGCCAGCTCGTAC

CCGGCCATGCTTGCGGACATGCTGTGCGGGGCCATTGGCTGCATCGGCTTCTCCTGGGCG

GCAAGCCCAGCATGCACAGAGCTGGAGACTGTGATGATGGACTGGCTCGGGAAGATGCTG

GAACTACCAAAGGCATTTTTGAATGAGAAAGCTGGAGAAGGGGGAGGAGTGATCCAGGGA

AGTGCCAGTGAAGCCACCCTGGTGGCCCTGCTGGCCGCTCGGACCAAAGTGATCCATCGG

CTGCAGGCAGCGTCCCCAGAGCTCACACAGGCCGCTATCATGGAGAAGCTGGTGGCTTAC

TCATCCGATCAGGCACACTCCTCAGTGGAAAGAGCTGGGTTAATTGGTGGAGTGAAATTA

AAAGCCATCCCCTCAGATGGCAACTTCGCCATGCGTGCGTCTGCCCTGCAGGAAGCCCTG

GAGAGAGACAAAGCGGCTGGCCTGATTCCTTTCTTTATGGTTGCCACCCTGGGGACCACA

ACATGCTGCTCCTTTGACAATCTCTTAGAAGTCGGTCCTATCTGCAACAAGGAAGACATA

TGGCTGCACGTTGATGCAGCCTACGCAGGCAGTGCATTCATCTGCCCTGAGTTCCGGCAC

CTTCTGAATGGAGTGGAGTTTGCAGATrCATTCAACTTTAATCCCGACAAATGGCTATTG

GTGAATTTTGACTGTTCTGCCATGTGGGTGAAAAAGAGAACAGACTTAACGGGAGCCTTT

AGACTGGACCCCACTTACCTGAAGCACAGCCATCAGGATTCAGGGCTTATCACTGACTAC

CGGCATTGGCAGATACCACTGGGCAGAAGATrrCGCTCTTTGAAAATGTGGTTTGTATTT

AGGATGTATGGAGTCAAAGGACTGCAGGCTTATATCCGCAAGCATGTCCAGCTGTCCCAT

GAGTTTGAGTCACTGGTGCGCCAGGATCCCCGCTTTGAAATCTGTGTGGAAGTCATTCTG

GGGCTTGTCTGCTTTCGGCTAAAGGGTTCCAACAAAGTGAATGAAGCTCTTCTGCAAAGA

ATAAACAGTGCCAAAAAAATCCACTTGGTTCCATGTCACCTCAGGGACAAGTTTGTCCTG

CGCTTTGCCATCTGTTCTCGCACGGTGGAATCTGCCCATGTGCAGCGGGCCTGGGAACAC

ATCAAAGAGCTGGCGGCCGACGTGCTGCGAGCAGAGAGGGAGTAGAAGCTTCGATCACTA

GTGAATTCTGCAGATGGGCTGCAGGAATTCTGATCACGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCT

AACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTT

TCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTG

ACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTC

GTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTT

TGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTA

TAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTG

GAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAG 89

GTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAG

TCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAA

CACGATGATAAGCTTGCCACAACCATGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAG

GTCCCCTGGTTCCCAAGAAAAGTGTCAGAGCTGGACAAGTGTCATCACCTGGTCACCAAG

TTCGACCCTGACCTGGACTTGGACCACCCGGGCTTCTCGGACCAGGTGTACCGCCAGCGC

AGGAAGCTGATTGCTGAGATCGCCTTCCAGTACAGGCACGGCGACCCGATTCCCCGTGTG

GAGTACACCGCCGAGGAGATTGCCACCTGGAAGGAGGTCTACACCACGCTGAAGGGCCTC

TACGCCACGCACGCCTGCGGGGAGCACCTGGAGGCCTTTGCTTTGCTGGAGCGCTTCAGC

GGCTACCGGGAAGACAATATCCCCCAGCTGGAGGACGTCTCCCGCTTCCTGAAGGAGCGC

ACGGGCTTCCAGCTGCGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGTCCGCCCGGGACTTCCTGGCCAGC

CTGGCCTTCCGCGTGTTCCAGTGCACCCAGTATATCCGCCACGCGTCCTCGCCCATGCAC

TCCCCTGAGCCGGACTGCTGCCACGAGCTGCTGGGGCACGTGCCCATGCTGGCCGACCGC

ACCTTCGCGCAGTTCTCGCAGGACATTGGCCTGGCGTCCCTGGGGGCCTCGGATGAGGAA

ATTGAGAAGCTGTCCACGCTGTCATGGTTCACGGTGGAGTTCGGGCTGTGTAAGCAGAAC

GGGGAGGTGAAGGCCTATGGTGCCGGGCTGCTGTCCTCCTACGGGGAGCTCCTGCACTGC

CTGTCTGAGGAGCCTGAGATTCGGGCCTTCGACCCTGAGGCTGCGGCCGTGCAGCCCTAC

CAAGACCAGACGTACCAGTCAGTCTACTTCGTGTCTGAGAGCTTCAGTGACGCCAAGGAC

AAGCTCAGGAGCTATGCCTCACGCATCCAGCGCCCCTTCTCCGTGAAGTTCGACCCGTAC

ACGCTGGCCATCGACGTGCTGGACAGCCCCCAGGCCGTGCGGCGCTCCCTGGAGGGTGTC

CAGGATGAGCTGGACACCCTTGCCCATGCGCTGAGTGCCATTGGCTAGGAATTCTGCAGA

TATCTTAAAACAGCTCTGGGGTTGTACCCACCCCAGAGGCCCACGTGGCGGCTAGTACTC

CGGTATTGCGGTACCTTTGTACGCCTGTTTTATACTCCCTTCCCCCGTAACTTAGAAGCA

CAATGTCCAAGTTCAATAGGAGGGGGTACAAACCAGTACCACCACGAACAAGCACTTCTG

TTCCCCCGGTGAGGCTGTATAGGCTGTTTCCACGGCTAAAAGCGGCTGATCCGTTATCCG

CTCATGTACTTCGAGAAGCCTAGTATCACCTTGGAATCTTCGATGCGTTGCGCTCAACAC

TCAACCCCAGAGTGTAGCTTAGGTCGATGAGTCTGGACGTTCCTCACCGGCGACGGTGGT

CCAGGCTGCGTTGGCGGCCTACCTGTGGCCCAAAGCCACAGGACGCTAGTTGTGAACAAG

GTGTGAAGAGCCTATTGAGCTACCTGAGAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTA

ACCACGGAGCAGGCAGTGGCAAT CCAGCGACCAGCCT GTCGT AACGCGCAAGTTCGTGGC

GGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTTTTACAATGGCTGCTTATGGTG

ACAATCATTGATTGTTATCATAAAGCAAATTGGATTGGCCATCCGGTGAGAATTTGATTA

TTAAATTACTCTCTTGTTGGGATTGCTCCTTTGAAATCTTGTGCACTCACACCTATTGGA

ATTACCTCATTGTTAAACGCGTCTAGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCG

GATCTGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACGAGAAGGGCCCTGTGCGGGCACCGG

CGGAGAAGCCGCGGGGCGCCAGGTGCAGCAATGGGTTCCCCGAGCGGGATCCGCCGCGGC

CCGGGCCCAGCAGGCCGGCGGAGAAGCCCCCGCGGCCCGAGGCCAAGAGCGCGCAGCCCG

CGGACGGCTGGAAGGGCGAGCGGCCCCGCAGCGAGGAGGATAACGAGCTGAACCTCCCTA

ACCTGGCAGCCGCCTACTCGTCCATCCTGAGCTCGCTGGGCGAGAACCCCCAGCGGCAAG

GGCTGCTCAAGACGCCCTGGAGGGCGGCCTCGGCCATGCAGTTCTTCACCAAGGGCTACC

AGGAGACCATCTCAGATGTCCTAAACGATGCTATATTTGATGAAGATCATGATGAGATGG

TGATTGTGAAGGACATAGACATGTTTTCCATGTGTGAGCATCACTTGGTTCCATTTGTTG

GAAAGGTCCÁTATTGGTTATCTTCCTAACAAGCAAGTCCTTGGCCTCAGCAAACTTGCGA

GGATTGTAGAAATCTATAGTAGAAGACTACAAGTTCAGGAGCGCCTTACAAAACAAATTG

CTGTAGCAATCACGGAAGCCTTGCGGCCTGCTGGAGTCGGGGTAGTGGTTGAAGCAACAC

ACATGTGTATGGTAATGCG AGGT GTACAGAAAAT G AAC AGCAAAACT GTGACCAGCAC AA

TGTTGGGTGTGTTCCGGGAGGATCCAAAGACTCGGGAAGAGTTCCTGACTCTCATTAGGA

GCTGAAAGCTTCGATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAGC

TTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGGGAAGTATTTATCACTAATCAAGCACAA

GTAATACATGAGAAACTTTTACTACAGCAAGCACAATCCTCCAAAAAATTTTGTTTTTAC

AAAATCCCTGGTGAACATGATTGGAAGGGACCTACTAGGGTGCTGTGGAAGGGTGATGGT

GCAGTAGTAGTTAATGATGAAGGAAAGGGAATAATTGCTGTACCATTAACCAGGACTAAG

TTACTAATAAAACCAAATTGAGTATTGTTGCAGGAAGCAAGACCCAACTACCATTGTCAG

CTGTGTTTCCTGACCTCAATATTTGTTATAAGGTTTGATATGAATCCCAGGGGGAATCTC

AACCCCTATTACCCAACAGTCAGAAAAATCTAAGTGTGAGGAGAACACAATGTTTCAACC

TTATTGTTATAATAATGACAGTAAGAACAGCATGGCAGAATCGAAGGAAGCAAGAGACCA

AGAATGAACCTGAAAGAAGAATCTAAAGAAGAAAAAAGAAGAAATGACTGGTGGAAAATA

GGTATGTTTCTGTTATGCTTAGCAGGAACTACTGGAGGAATACTTTGGTGGTATGAAGGA

CTCCCACAGCAACATTATATAGGGTTGGTGGCGATAGGGGGAAGATTAAACGGATCTGGC

CAATCAAATGCTATAGAATGCTGGGGTTCCTTCCCGGGGTGTAGACCATTTCAAAATTAC

TTCAGTTATGAGACCAATAGAAGCATGCATATGGATAATAATACTGCTACATTATTAGAA

GCTTTAACCAATATAACTGCTCTATAAATAACAAAACAGAATTAGAAACATGGAAGTTAG

TAAAGACTTCTGGCATAACTCCTTTACCTATTTCTTCTGAAGCTAACACTGGACTAATTA

GACATAAGAGAGATTTTGGTATAAGTGCAATAGTGGCAGCTATTGTAGCCGCTACTGCTA

TTGCTGCTAGCGCTACTATGTCTTATGTTGCTCTAACTGAGGTTAACAAAATAATGGAAG

TACAAAATCATACTTTTGAGGTAGAAAATAGTACTCTAAATGGTATGGATTTAATAGAAC

GACAAATAAAGATATTATATGCTATGATTCTTCAAACACATGCAGATGTTCAACTGTTAA 90

AGGAAAGACAACAGGTAGAGGAGACATTTAATTTAATTGGATGTATAGAAAGAACACATG

TATTTTGTCATACTGGTCATCCCTGGAATATGTCATGGGGACATTTAAATGAGTCAACAC

AATGGGATGACTGGGTAAGCAAAATGGAAGATTTAAATCAAGAGATACTAACTACACTTC

ATGGAGCCAGGAACAATTTGGCACAATCCATGATAACATTCAATACACCAGATAGTATAG

CTCAÀTTTGGAAAAGACCTTTGGAGTCATATTGGAAATTGGATTCCTGGATTGGGAGCTT

CCATTATAAAATATATAGTGATGTTTTTGCTTATTTATTTGTTACTAACCTCTTCGCCTA

AGATCCTCAGGGCCCTCTGGAAGGTGACCAGTGGTGCAGGGTCCTCCGGCAGTCGTTACC

TGAAGAAAAAATTCCATCACAAACATGCATCGCGAGAAGACACCTGGGACCAGGCCCAAC

ACAACATACACCTAGCAGGCGTGACCGGTGGATCAGGGGACAAATACTACAAGCAGAAGT

ACTCCAGGAACGACTGGAATGGAGAATCAGAGGAGTACAACAGGCGGCCAAAGAGCTGGG

TGAAGTCAATCGAGGCATTTGGAGAGAGCTATATTTCCGAGAAGACCAAAGGGGAGATTT

CTCAGCCTGGGGCGGCTATCAACGAGCACAAGAACGGCTCTGGGGGGAACAATCCTCACC

AAGGGTCCTTAGACCTGGAGATTCGAAGCGAAGGAGGAAACATTTATGACTGTTGCATTA

AAGCCCAAGAAGGAACTCTCGCTATCCCTTGCTGTGGATTTCCCTTATGGCTATTTTGGG

GACTAGTAATTATAGTAGGACGCATAGCAGGCTATGGATTACGTGGACTCGCTGTTATAA

TAAGGATTTGTATTAGAGGCTTAAATTTGATATTTGAAATAATCAGAAAAATGCTTGATT

ATATTGGAAGAGCTTTAAATCCTGGCACATCTCATGTATCAATGCCTCAGTATGTTTAGA

AAAACAAGGGGGGAACTGTGGGGTTTTTATGAGGGGTTTTATAAATGATTATAAGAGTAA

AAAGAAAGTTGCTGATGCTCTCATAACCTTGTATAACCCAAAGGACTAGCTCATGTTGCT

AGGCAACTAAACCGCAATAACCGCATTTGTGACGCGAGTTCCCCA7TGGTGACGCGTTAA

CTTCCTGTTTTTACAGTATATAAGTGCTTGTATTCTGACAATTGGGCACTCAGATTCTGC

GGTCTGAGTCCCTTCTCTGCTGGGCTGAAAAGGCCTTTGTAATAAATATAATTCTCTACT

CAGTCCCTGTCTCTAGTTTGTCTGTTCGAGATCCTACAGAGCTCATGCCTTGGCGTAATC

ATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACG

AGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAAT

TGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATG

AATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCT

CACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGC

GGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGG

CCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCG

CCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGG

ACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGAC

CCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCA

TAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGT

GCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTC

CAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAG

AGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACAC

TAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGT

TGGTAGCTCTTGATCCGGCAAAGAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAA

GCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGG

GTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAA

AAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTT7TAAATCAATCTAAAGTAT

ATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGC

GATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGAT

ACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACC

GGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCC

TGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAG

TTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACG

CTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATG

ATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAG

TAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGT

CATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGA

ATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCC

ACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTC

AAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATC

TTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGC cgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcAtactcttcctttttca

ATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTAT

TTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATT

GTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTT

AACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGG

TTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTC

AAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCA

AGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGA

TTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCAACCTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGG

GAGACCGGCAGATCTTGAATAATAAAATGTGTGTTTGTCCGAAATACGCGTTTTGAGATT 91

TCTGTCGCCGACTAAATTCATGTCGCGCGATAGTGGTGTTTATCGCCGATAGAGATGGCG

ATATTGGAAAAATTGATATTTGAAAATATGGCATATTGAAAATGTCGCCGATGTGAGTTT

CTGTGTAACTGATATCGCCATTTTTCCAAAAGTGATTTTTGGGCATACGCGATATCTGGC

GATAGCGCTTATATCGTTTACGGGGGATGGCGATAGACGACTTTGGTGACTTGGGCGATT

CTGTGTGTCGCAAATATCGCAGTTTCGATATAGGTGACAGACGATATGAGGCTATATCGC

CGATAGAGGCGACATCAAGCTGGCACATGGCCAATGCATATCGATCTATACATTGAATCA

ATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTG

GCCATTGCATACGTTGTATCCATATCGTAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAAC

ATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC

ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCC

TGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGT

AACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCA

CTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGG

TAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCA

GTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAA

TGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAA

TGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTGCGA

TCGCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGC

AGAGCTCGTTTAGT GAAC

Lisboa, 19 de Agosto de 2010 92

Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Genoma de vector lentiviral compreendendo três ou mais sequências nucleotídicas de interesse, ligadas operativamente por dois ou mais Locais de Entrada de Ribossomas Internos, em que as sequências nucleotídicas de interesse codificam uma proteína seleccionada do grupo seguinte: Hidroxilase de Tirosina, ciclo-hidrolase I do GTP, Descarboxilase Dopa de Aminoácidos Aromáticos e Transportador 2 da Monoamina Vesicular.
2. 2. Genoma de acordo com a reivindicação 1, em que as sequências nucleotídicas de interesse codificam Hidroxilase de Tirosina, ciclo-hidrolase I do GTP e Descarboxilase Dopa de Aminoácidos Aromáticos.
3. 3 . Genoma de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que é derivável < do HIV. 4. Genoma de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que é derivável < do EIAV. 5. Genoma de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o vector lentiviral é um vector lentiviral de nao-primata. 6. Genoma de acordo com qualquer reivindicação anterior em que, pelo menos, uma das sequências nucleotídicas de interesse está operativamente ligada a um promotor ou a elemento(s) promotor(es). 1
4. 7. Genoma de vector lentiviral de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que foram eliminados os intensificadores da transcrição ou os intensificadores e o promotor na região U3 da LTR 3', de forma a que após um ciclo de transcrição reversa e integração, estas modificações sejam copiadas para as LTR 5' e para as 3' produzindo um provírus transcricionalmente inactivo, para que o vector lentiviral seja auto-inactivante.
5. 8. Genoma de acordo com qualquer reivindicação anterior, que não apresenta o elemento de resposta a rev.
6. 9. Genoma de acordo com qu qualquer reivindicação anterior, que compreende uma sequência cPPT.
7. 10. Genoma de acordo com qualquer reivindicação anterior, que compreende um elemento regulador pós-transcrição ou um intensificador da tradução.
8. 11. Genoma de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que, pelo menos, uma das sequências nucleotidicas de interesse é uma sequência de ARN/ADN optimizada em termos de codões.
9. 12. Genoma de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que uma das sequências nucleotidicas de interesse compreende uma forma truncada do gene da Hidroxilase de Tirosina, não apresentando o domínio regulador.
10. 13. Sistema de vector compreendendo um genoma de acordo com qualquer reivindicação anterior. 2
11. 14. Sistema de vector de acordo com a reivindicação 13, compreendendo (i) um genoma de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12; (ii) uma sequência nucleotidica codificando para as proteínas gag e pol lentivirais; (iii) sequências nucleotídicas codificando outros componentes de empacotamento virai essenciais não codificados pela sequência nucleotidica de ii).
12. 15. Genoma do vector de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12 ou um sistema de acordo com a reivindicação 13 ou 14 para utilização num método de produção de partículas lentivirais.
13. 16. Método para produzir uma partícula lentiviral método esse que compreende introduzir numa célula produtora: i) um genoma como definido em qualquer das reivindicações 1 a 12, ii) uma sequência nucleotidica codificando para as proteínas gag e pol lentivirais; e iii) sequências nucleotídicas codificando outros componentes de empacotamento virais essenciais, não codificados por uma ou mais das sequências nucleotídicas de ii). 3
14. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a sequência nucleotidica codificando para gag e pol está optimizada em termos de codões para a expressão na célula produtora.
15. 18. Partícula virai produzida pelo sistema da reivindicação 13 ou 14 ou pelo método da reivindicação 16 ou 17.
16. 19. Partícula virai de acordo com a reivindicação 18 que é pseudotipada com um gene env heterólogo.
17. 20. Partícula virai de acordo com a reivindicação 19 que é pseudotipada com um gene codificando, pelo menos, parte da proteína VSV-G.
18. 21. Composição farmacêutica compreendendo o genoma de qualquer das reivindicações 1 a 12, o sistema da reivindicação 13 ou 14 ou a partícula virai de qualquer das reivindicações 18 a 20, em conjunto com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
19. 22. Utilização de um genoma como definido em qualquer das reivindicações 1 a 12, um sistema da reivindicação 13 ou 14 ou a partícula virai qualquer das reivindicações 18 a 20, na preparação de uma composição farmacêutica para tratar e/ou prevenir uma doença num indivíduo.
20. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 22, em que a composição farmacêutica se destina a tratar e/ou a prevenir uma doença neurodegenerativa. 4
21. 24. Utilização de acordo com a reivindicação 23, em que a composição farmacêutica se destina a tratar e/ou a prevenir a doença de Parkinson.
22. 25. Sistema de vector EIAV de acordo com a reivindicação 13, compreendendo um genoma que compreende três sequências nucleotidicas de interesse ligadas operativamente a dois IRES, em que as sequências nucleotidicas de interesse codificam as proteínas seguintes: Hidroxilase de Tirosina; ciclo-hidrolase I do GTP; e Descarboxilase Dopa de Aminoácidos Aromáticos. Lisboa, 19 de Agosto de 2010 5 1/29 Figura 1 5ΉΤΗ2 5 -GC GGATCC GCC ACC ATG GAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT BamH I CTG CCC ACCCCC GAC GCC ACC ACG -3’ 3ΉΤΗ2 5’- GAA CCG CGG GGA CTG CCC TCT TAC C- 3’ 5’hTH3 5 -GGT AAA GAG GGC AGT CCC CGC GGT TC- 3’ 3’-hTH1 5'- CG AAGCTT CTA GCC AATGGC ACT CAG CGC ATG GGC-3’ Hindlll 2/29

    Figura 2 3/29 Figura 3 5’hAADC 5'- CG AGA TCT GCC ACC ATG TAC CCC TAC GAC GTG CCC GAC TAC Bglll GCC AAC GCA AGT GAA TTC CGA AGG-3' 3’hAADC 5’- CG AAG CTT CTA CTC CCT CTC TGC TCG C-3’ Hindi II 4/29

    Stul Figura 4 5/29 Figura 5 5’hGTP 5 - CG AGA TCT GCC ACC ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC GAG Bgl II AAG GGC CCT GTG CGG CG-3’ 3’hGTP 5’- CG AAG CTT TC A GCT CCT AAT GAG AGT CAG GAA-3' Hindi II 6/29

    Bsml Figura 6 SgrAI Bbel Ehel Kasl Narl Bsgl 7/29 Figura 7 5’hTHt 5 -CG AAG CTT GGA TCC GCC ACC ATG GAA CAA AAA CTC ATC TCA Hindlll BamHI GAA GAG GAT CTG AAG GTC CCC TGG TTC CCA AGA AAA-3’ 3’hTHt 5'- CG GAA TTC CTA GCC AAT GGC ACT CAG CGC ATG GGC-3’ EcoRI 8/29

    Nhel Aflll Hindlll Asp718l Kpnl BamHI Eco RI Pstl EcoRV BstXI Notl Xhol Xbal Apal Bsp120l Figura 8 9/29 EcoRV,

    Figura 9 10/29 Blnl Sbfl. Sphl. Tcv' IO¥emcv PpuMI BstEII Eco47lll / BsmBI ;/ Fsel HAxhAADd 8000 SnaBI ptricis Nrul, Muni . Sall, Xbal Psil 2000 pólio 6000 8629 pb j jr Flag-hGTP È /¾ Bbel / \v^Ehel 4000 / V: Kasl W- y amp ' A A \ Narl Srfl - BbvCI \ BsrGI Clal Figura 10 11/29 Figura 11 1 2 3 4 5 — 64 — 39 — 52

    Anti-HA Anti-omyc Anti-FLAG 12/29 ρΟΝΥ8 ρΟΝΥ8.1 CMVIE I

    -6MVI! CMVIE O». Figura 12 Atat Δ env GFP ou LacZ

    GFP ou LacZ -ewviíí Arev

    Δ32 l1 LTR X rev

    LTR m 13/29 Figura 13 Ψ EIAVTRIC EIAV BIC M WMBBCMVpl 11 Ψ CMVp

    c-Myc FLAG IRES\ LTR1] CMVp| BBCMVp! LTR CH1

    14/29 Figura 14 EIAV TRIC 5’cppt EIAV TRIC 3’cppt CMVp I CMVppH Ψ HA w cppt c-Myc ......A/R£S W FLAG IRESφ LTR CNIVp HBB th I CH1 1 Ψ HA c-Myc IRES U cppt A FLAG IRESφ LTR m CMVp ngi!!£ - Th 1 CH1 1 15/29 Figura 15 Comparação entre preparações Lentivirais pela proporção PERT/ARN

    □ pONY8TRIC- RNA pONY8G- RNA B| pONY8TRIC- PERT B pONY8G- PERT 16/29 Figura 16 abcdefg hijklmnop '53 kOa '42 kDa

    a-HA a-cmyc ~30 kDa

    a-FLAG 17/29 Figura 17 A UNT | pONY8-1Z P0NY8.T B

    &' T &

    18/29 Figura 18 900 800 roo 600 500 400 300 200 100

    « L-Dop a aiDOPAC SI Dopamina Controlo pONY8T pONY8.1T 0 19/29

    20/29 Figura 20 20/29

    21/29 Dralll Bglll Muni

    , BsmBI Sacll Bpu 11021 Bsml BstBI BstXI Nrul / BstEII Bsu36l Xcml .Sgfl Bbel i Ehel ?Kasl £Narl BbvCI EIAV R-U5-H+B/ /.Tth1111 TATT1V.BstAPI 1¾ Notl++ U\Sall lUBspMI i; Sbfl } Xhol ;Acc65l Kpnl Figura 21 22/29

    23/29 Figura 23

    24/29 Figura 24A -1 1 2 3 5 8 9 10 (/) <D O O iS o cc

    H8.1Z 8.1T Semanas -12 25/29 Figura 24B 25/29 -2-1456

    Semanas 26/29Figura 25A ρΟΝΥ8.1Ζ ρΟΝΥβ.ΟΤ C5R3 C1R2

    Controlo 6-OHDA pONY8.1T C5R4

    27/29 Figura 25Β ρΟΝΥβ.ΟΤ C5R5 ρΟΝΥ8.1Ζ C3R4

    Controlo 6-0 Η DA 28/29 Figura 26: Catecolaminas (pg/mg de tecido fresco)

    Estriatos Vírus Volume L-Dopa opamina DOPAC DOPAC/DA C1R2 Direito pony8.T 8 ul 194 423 247,6 0,58 C2R2 Direito pony8.1T 8 ul - 50,9 8,7 0,17 C5R3 Direito pony8.1Z 8 ul 402,4 415,6 46 0,11 C5R4 Direito pony8.1T 6 ul - 284,4 14 0,05 Estriatos Vírus Volume L-Dopa Dopamina DOPAC DOPAC/DA C1R2 Esquerdo - - 3600 5274 1612 0,31 C2R2 Esquerdo - - - 4216 1424 0,34 C5R3 Esquerdo - - - 8112 1532 0,18 C5R4 Esquerdo - - - 5112 1586 0,31 29/29 Figura 27: Proporção DOPAC/Dopamina

    0 Esquerdo Direito Esquerdo Direito Direito/Esquerdo Estriatos Dopamina DOPAC C1R2 0,31 0,58 C1R2 8% 15,40% C2R2 0,34 0,17 02 R2 1,20% 0,60% C5R3 0,18 0,11 C5R3 5,10% 3% C5R4 0,31 0,05 C5R4 5,60% 0,90%