CN112088216A

CN112088216A - 调节nkx6.3的方法

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Publication number: CN112088216A
Application number: CN201980030936.XA
Authority: CN
Inventors: A·瓦尔塞西亚; J·哈格尔; N·格尔多夫
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2020-12-15
Also published as: US20210095288A1; JP2021526361A; EP3794121A1; WO2019219308A1

Abstract

本发明公开了一种试剂，所述试剂能够降低NKX6.3的活性，用于(i)减少脂肪积聚和/或(ii)保持或增加个体的去脂体重的用途。还提供了一种方法，该方法用于预测通过向个体施加一种或多种膳食干预来减少脂肪积聚的程度和/或预测通过向个体施加一种或多种膳食干预来保持或增加去脂体重的程度。

Description

调节NKX6.3的方法

技术领域

本发明涉及能够调节NKX6.3的活性的试剂以及此类试剂在治疗中，尤其是在(i)减少脂肪积聚和/或(ii)保持或增加个体的去脂体重中的用途。本发明还涉及鉴定此类试剂的方法。

背景技术

肥胖是一种慢性代谢障碍，在世界上的许多地区已达到了流行病程度。肥胖是诸如2型糖尿病、心血管疾病、血脂异常和某些类型的癌症等严重并存病的主要风险因素(World Health Organ.Tech.Rep.Ser.(2000)894:i-xii,1-253)。

肥胖是指来自碳水化合物、脂肪等的能量过量蓄积而导致个体体重超过正常值的病症。附加体重通常以脂肪的形式保留于皮肤下方或内脏周围。

经验数据表明，初始体重的至少10％的体重减轻导致肥胖相关并存病的风险的显著降低(World Health Organ.Tech.Rep.Ser.(2000)894:i-xii,1-253)。然而，体重减轻能力显示出较大的个体间波动性。

当能量摄入量超过能量消耗量时，引起肥胖。因此为了减轻肥胖，需要降低来自脂肪、碳水化合物等的能量摄入量的方法，或通过促进体内代谢来增加能量消耗量的方法。因此，膳食习惯和运动的改善被视为预防和减轻肥胖症和肥胖症相关障碍的有效方法。例如，人们早已认识到，低热量饮食(LCD)干预可以非常有效地减轻体重，并且这种体重减轻通常伴随肥胖症相关并存病尤其是2型糖尿病的风险的改善(World HealthOrgan.Tech.Rep.Ser.(2000)894:i-xii,1-253)。

虽然已知多种方法用于促进体重减轻，但个体一旦完成体重减轻干预期，就面临着恢复所减轻体重风险。此类回归冒着减小或潜在地完全消除与体重减轻相关的任何有益效果的风险。

因此，不仅仍然迫切需要促进体重减轻的改善的方法，而且还需要用于支持体重维持的方法(预防或减少所减轻体重的恢复，并因此以类似于体重减轻干预后所实现的水平支持维持体重)。此类改善将为肥胖症提供更完整的治疗，因此降低肥胖症相关障碍的风险。

肥胖与身体的许多生理变化相关联，包括某些基因产物水平的差异，肥胖个体的该水平高于或低于正常体重的个体(Singla,Bardoloi和Parkash,World J Diabetes(2010))。此外，已经证明许多这些基因产物的血液水平在体重减轻干预期间显著变化(VanDijk等人，Plos One(2010)，Viguerie等人，Plos Genetics(2012))。

然而，对于基因表达水平的这些变化与肥胖症和体重减轻是否有因果关系，或者它们是否只是肥胖状态和体重减轻干预的反映，人们知之甚少。探索基因表达水平变化的可能因果关系的一种方法是研究在动物模型中的敲落实验中是否可以改变这些基因的水平。使用现代分子生物学技术，这些技术可以对几种动物进行和重复。当这样的敲落导致非致死表型时，可以使用生理学、形态学或分子读数来评估减少的基因表达的影响。由于若干原因，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(通常被称为果蝇)已被证明是用以研究特定基因在脂肪生物学中的功能的良好遗传模型系统(Hong和Park,Exp.Molec.Medicine,2010；Pospisilik等人，Cell,2010；Guo等人，Nature 2008)。首先，遗传筛选很容易，因为对于大多数基因，RNAi敲落飞蝇系很容易获得。其次，飞蝇发育迅速，并且它们能够以高吞吐量的方式进行研究。第三，人类和飞蝇基因之间的同源性相当高。重要的是，脂质储存和利用的基本人体成分和调节机制在飞蝇中是进化上保守的。此外，飞蝇可经受膳食干预，包括高蔗糖饮食、饥饿，并且因此可以模仿人类膳食生活方式。

为了评估特定基因的敲落对飞蝇代谢和脂肪发育的影响，最确定和最好的读数是通过总甘油三酯水平测量的脂肪积聚。作为读数，体重本身不太可靠，因为这可能受许多因素影响，包括身长，但更重要的是去脂体重或肌肉质量的差异。

发明内容

本发明人在黑腹果蝇中进行NKX6.3直系同源物的全身RNAi敲落。与野生型相比，该敲落导致具有显著减少的脂肪积聚(如通过甘油三酯水平测量)的品种。使用不同的全身RNAi敲落(使用不同的RNAi发夹)来重现该特异性表型。重要的是，成体诱导的敲落成功地重现了表型，从而展示了该效应不是由于发育效应。随后的组织特异性敲落实验表明该效应在绛色细胞中最为显著(其中绛色细胞敲落飞蝇具有比野生型显著减少的脂肪积聚)。在飞蝇中，绛色细胞负责脂质加工和解毒。与人类相比，这些细胞具有与肝细胞类似的作用。最后，飞蝇中胰岛素mRNA水平的分析证实了敲落对胰岛素代谢的显著影响。具体地讲，发现与野生型相比，胰岛素样肽3(Ilp3)在敲落飞蝇中显著下调。

因此，在一个方面，本发明提供了试剂，所述试剂能够降低NKX6.3的活性，用于(i)减少脂肪积聚和/或(ii)保持或增加个体的去脂体重的用途。

在一个实施方案中，通过甘油三酯水平测量脂肪积聚。

在另一方面，本发明提供了一种试剂，该试剂能够降低NKX6.3的活性，用于支持体重维持和/或治疗或预防肥胖症的用途。

在另一方面，本发明提供了能够降低NKX6.3的活性的试剂在支持体重维持方面的用途。

在另一方面，本发明提供了能够降低NKX6.3的活性的试剂在增加去脂体重与脂体重的比率方面的用途。

在另一方面，本发明提供了能够降低甘油三酯水平的试剂的用途。

在另一方面，本发明提供了能够降低NKX6.3的活性的试剂在改善血脂异常方面的用途。

在另一方面，本发明提供了能够减少心血管疾病(CVD)的风险的试剂的用途。

在另一方面，本发明提供了减少脂肪积聚的方法，该方法包括将本发明的试剂施用给对其有需要的个体。在另一方面，本发明提供了保持去脂体重的方法，该方法包括将本发明的试剂施用给对其有需要的个体。在另一方面，本发明提供了增加去脂体重的方法，该方法包括将本发明的试剂施用给对其有需要的个体。在另一方面，本发明提供了支持体重维持的方法，该方法包括将本发明的试剂施用于对其有需要的个体。在另一方面，本发明提供了减少个体脂肪沉积的方法，该方法包括将本发明的试剂施用于对其有需要的个体。在另一方面，本发明提供了治疗或预防肥胖的方法，该方法包括将本发明的试剂施用于对其有需要的个体。

相比于不存在本发明的试剂时的活性，NKX6.3的活性可能降低。NKX6.3的活性可例如降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、50％、75％或100％。

试剂可为例如NKX6.3拮抗剂或抑制剂，或者试剂可降低细胞(优选地为肝细胞)中NKX6.3的水平。

在一个实施方案中，在体重减轻干预期间或之后将试剂施用于个体。在优选的实施方案中，在体重减轻干预期间将试剂施用于个体。体重减轻干预可为例如饮食方案(例如低热量饮食)和/或锻炼方案。

在一个实施方案中，试剂降低个体中NKX6.3的水平。在该上下文中，“水平”是指NKX6.3的量，并且可例如通过分析所表达蛋白质的量和/或通过分析所存在的对应mRNA的量进行测量。优选地，试剂降低NKX6.3的表达。例如，siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA可降低NKX6.3的表达。

在一个实施方案中，siRNA可降低NKX6.3的表达。

相比于不存在本发明的试剂时的水平，NKX6.3的水平可能降低。NKX6.3的水平可例如降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、50％、75％或100％。

在一个实施方案中，试剂选自表1中列出的试剂。

在另一个优选的实施方案中，试剂选自siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、多核苷酸、多肽或小分子。多肽可为例如抗体。因此，本发明的试剂可为编码靶向NKX6.3的siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA的多核苷酸或者多肽(例如抗体)形式。多核苷酸可为载体诸如病毒载体的形式。

本发明的试剂可为由本发明的方法鉴定的试剂。

在另一方面，本发明提供了鉴定能够(i)减少脂肪积聚和/或(ii)保持或增加个体的去脂体重的试剂的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使包含NKX6.3多肽或多核苷酸的制备物与候选试剂接触；以及

(b)检测所述候选试剂是否影响所述NKX6.3多肽或多核苷酸的活性。

可通过将存在和不存在(即对照实验)候选试剂时NKX6.3多肽或多核苷酸的活性进行比较来分析对NKX6.3多肽或多核苷酸的活性的影响。

在另一方面，本发明提供了鉴定降低NKX6.3的活性的试剂的方法，该方法包括以下步骤：

本发明的方法可为用于鉴定能够抑制个体食欲，增加或延长饱腹感，减少个体食物摄入和/或减少个体脂肪沉积的试剂的方法。

在一个实施方案中，包含NKX6.3多肽或多核苷酸的制备物包括包含NKX6.3多肽或多核苷酸的细胞。

在一个实施方案中，细胞是肌细胞。在一个实施方案中，细胞是脑细胞。在一个优选的实施方案中，细胞是肝细胞。

在一个实施方案中，该方法用于鉴定降低NKX6.3的表达的试剂，优选地在肝细胞中。

在一个实施方案中，候选试剂是天然产物，优选天然存在于植物中的化合物。

在另一方面，本发明提供了NKX6.3或编码其的多核苷酸在鉴定试剂的方法中的用途，该试剂减少脂肪积聚，保持或增加去脂体重，促进脂质代谢，支持体重维持，抑制食欲，增加或延长饱腹感，减少个体食物摄入，减少个体脂肪沉积，和/或治疗或防止个体肥胖症。

在另一方面，本发明提供了能够降低NKX6.3的活性的试剂在制造药物方面的用途，其用于减少脂肪积聚，保持或增加去脂体重，促进脂质代谢，支持体重维持，抑制个体食欲，增加或延长饱腹感，减少个体食物摄入，减少个体脂肪沉积，和/或治疗或预防个体肥胖症。

在一个实施方案中，脂质代谢的促进通过较低的三酰基甘油水平来推断。

在另一方面，本发明提供一种鉴定降低NKX6.3的表达的试剂的方法，该方法包括以下步骤：

(a)使细胞(优选地为表达NKX6.3的细胞)与候选试剂接触；以及

(b)检测候选试剂是否降低NKX6.3的表达。

在另一方面，本发明提供了一种方法，该方法通过向个体施加一种或多种膳食干预来预测脂肪积聚的减少程度和/或预测通过向个体施加一种或多种膳食干预来保持或增加去脂体重的程度；所述方法包括确定所述个体的在与NKX6.3遗传连锁的一个或多个多态性位置处的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种方法，该方法用于预测能够通过向个体施加一种或多种膳食干预而获得的体重减轻的程度和/或通过向个体施加一种或多种膳食干预来维持体重减轻的程度；所述方法包括确定所述个体的在与NKX6.3遗传连锁的一个或多个多态性位置处的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种方法，该方法用于预测能够通过向个体施加一种或多种膳食干预而获得的去脂体重与脂体重的比率增加的程度和/或预测通过向个体施加一种或多种膳食干预而降低甘油三酯水平的程度；所述方法包括确定所述个体的在与NKX6.3遗传连锁的一个或多个多态性位置处的核苷酸序列。

在一个实施方案中，膳食干预是低热量饮食。

在一个实施方案中，低热量饮食包含约600千卡/天至约1200千卡/天的热量摄入。

在一个实施方案中，低热量饮食包括施用至少一种饮食产品。

在一个实施方案中，该方法还包括将以下项组合：确定个体的在与NKX6.3遗传连锁的一个或多个多态性位置处的核苷酸，一个或多个人体测量指标和/或个体生活方式特征。

在一个实施方案中，人体测量指标选自性别、体重、身高、年龄、身体脂肪成分和体质量指数，并且其中所述生活方式特征为个体是吸烟者还是不吸烟者。

本发明还提供了用于优化个体的一种或多种膳食干预的方法，该方法包括根据本发明的方法预测(i)脂肪积聚的减少程度和/或(ii)个体能够获得的去脂体重的保持或增加的程度；以及向个体施加膳食干预。

在另一方面，本发明提供了用于选择对个体的生活方式的改变的方法，所述方法包括：

a.执行根据本发明的方法；以及

b.基于步骤(a)中预测的体重减轻程度来选择对生活方式的合适改变。

在另一方面，本发明提供了用作减轻体重的低热量饮食的一部分的饮食产品，其中将该饮食产品施用给个体，通过根据本发明的方法预测将获得一定程度的(i)脂肪积聚减少和/或(ii)去脂体重保持或增加。

在另一方面，本发明提供一种用于治疗肥胖症或肥胖症相关障碍的用途的饮食产品，其中将该饮食产品施用给个体，通过根据本发明的方法预测将获得一定程度的(i)脂肪积聚减少和/或(ii)去脂体重保持或增加。

在另一方面，本发明提供了饮食产品在用于减轻体重的低热量饮食中的用途，其中将该饮食产品施用给个体，通过根据本发明的方法预测将获得一定程度的(i)脂肪积聚减少和/或(ii)去脂体重保持或增加。

在另一方面，本发明提供了一种能够检测与NKX6.3遗传连锁的多态性位置的等位基因特异性寡核苷酸探针，其用于预测通过向个体施加一种或多种膳食干预来减少脂肪积聚的程度和/或预测一种或多种膳食干预后保持或增加去脂体重的程度的用途。

在另一方面，本发明提供一种等位基因特异性寡核苷酸探针，该等位基因特异性寡核苷酸探针能够检测与NKX6.3遗传连锁的多态性位置，其用于预测能够通过向个体施加一种或多种膳食干预而获得的去脂体重与脂体重的比率增加的程度和/或预测通过向个体施加一种或多种膳食干预而降低甘油三酯水平的程度的用途。

在另一方面，本发明提供了诊断试剂盒，该诊断试剂盒包含根据本发明的两种或更多种等位基因特异性寡核苷酸引物和/或等位基因特异性寡核苷酸探针。

与NKX6.3(例如SNP)遗传连锁的多态性位置可在物理上位于距NKX6.3基因座小于200、150、100、75、50、25、20、15、10、5、4、3、2、1个千碱基(kb)的位置。LD r平方大于40％的任何SNP也可被认为是遗传连锁的。

附图说明

图1：鉴定8号染色体上NKX6.3基因的区域的曼哈顿图。变体位置在X轴上指示，统计显著性(-log10 p值)在Y轴上指示。每个点都对应于变体。基因位置在下图中指示。上图中的峰线(右侧的次级Y轴)指示重组率(以每兆碱基厘摩为单位)。顶部相关联变体用菱形及其染色体坐标指示。

图2：HGTX的全身RNAi敲落减少了果蝇属中的甘油三酯。分图A和B示出了使用两种不同的RNAi发夹时全身敲落的代谢效应。

图3：HGTX的成体诱导的RNAi敲落对于甘油三酯的显著减少显示出类似的代谢效应。

图4：HGTX诱导型全身RNAi飞蝇中，HGTX mRNA表达降低了60％。

图5：对胰岛素样肽3mRNA水平的影响(HGTX诱导型全身RNAi飞蝇中的水平降低)。

图6：脂肪体(Ppl-Gal4)、肌肉(Mef2-Gal4)、脑(nSyb-Gal4)和肝/绛色细胞(Oeno-Gal4)中的组织特异性HTGX RNAi敲落显示出绛色细胞特异性代谢表型。

对于所有图，数据以平均值±SEM表示。灰色条显示亲本野生型飞蝇(肌动蛋白-Gal4/+和UAS-HGTX/+)的数据，并且黑色条显示RNAi敲落飞蝇(肌动蛋白-Gal4>UAS-HGTX)非配对t检验的数据。*，p<0.05；****，p<0.0001；n.s.，无显著性差异。

具体实施方式

本文中所用，术语“包含”和“由......构成”与“包括”或“含有”同义，并且包括端值在内或是开放式的，并且不排除另外的未列举的成员、要素或步骤。术语“包含”和“由......构成”也包括术语“由......组成”。

NKX6.3

同源结构域蛋白的NKX家族控制许多发育过程。NKX6亚家族的成员，包括NKX6-3，参与中枢神经系统(CNS)、胃肠道和胰腺的发育(Alanentalo等人；Gene ExpressionPatterns(2006))。

已发现NKX6.3在发育中的小鼠的后脑和肠道中表达(Nelson等人；Journal ofHistochemistry Cytochemistry(2005))。

NKX6.3是直接结合至Wnt/β-连环蛋白和Rho-GTPase路径相关基因的特定启动子区域的转录因子，导致癌细胞迁移和侵入的抑制(Yoon等人；EBioMedicine(2017))。其表达已被发现为调节胃癌进展(Yoon等人；Oncotarget(2015)，Yoon等人，EBioMedicine(2017))。

在果蝇中，NKX6.3直系同源物是HGTX(以前称为Nk6)(Uhler等人，Mechanisms ofDevelopment(2002))。

在一个实施方案中，NKX6.3是人NKX6.3。

NKX6.3的示例性氨基酸序列是以NCBI登录号NP_689781.1保藏的序列。

NKX6.3的示例性氨基酸序列为：

MQQGQLAPGSRLCSGPWGLPELQPAAPSSSAAQLPWGESWGEEADTPACLSASGVWFQNRRTKWRKKSALEPSSSTPRAPGGAGAGAGGDRAPSENEDDEYNKPLDPDSDDEKIRLLLRKHRAAFSVLSLGAHSV

(SEQ ID NO:1)

编码NKX6.3的示例性核苷酸序列(mRNA)是以NCBI登录号NM_152568.3保藏的序列。

编码NKX6.3的示例性核苷酸序列为：

AAGGATGCAGCAGGGGCAGCTGGCACCTGGGTCTAGGCTTTGCTCAGGGCCCTGGGGCCTCCCCGAGCTCCAACCCGCTGCGCCCTCCTCATCAGCCGCTCAGCTGCCCTGGGGCGAGAGCTGGGGGGAAGAAGCAGACACTCCTGCATGTCTTTCTGCTTCTGGGGTGTGGTTCCAGAACCGCAGGACCAAGTGGCGGAAGAAGAGCGCCCTGGAGCCCTCGTCCTCCACGCCCCGGGCCCCGGGCGGCGCGGGTGCAGGCGCAGGCGGGGACCGCGCACCCTCGGAGAACGAGGACGACGAGTACAACAAGCCGCTGGACCCCGACTCGGACGACGAGAAGATCCGCCTGCTGCTGCGCAAGCACCGCGCCGCCTTCTCGGTGCTCAGCCTGGGAGCGCACAGCGTCTGACGCCCGCCGTCCAGGCCCGGGATCCTGGCTGCAGCCTGCGGGGGGACGCCGAGGAGCCTACCTTCCCCTCCCCTTCCCCACGCTCCTGGGGGCGCAGGGACTGAGTCTTTCTTTGGATGAGGGGCGCGTGGAGGAGGAGCAGCAGGTGCAGGGGAGGAGGAGGGGAGGCGGGGGAGGAGGAGGAAAAGGAGGGAAAGGGGACAGGCATCCTAGCTAAGGGAGGAGGAGGCCAGGAGGGAGGCACAGCACTCCTGAGACCTGGAAGCCGCTGCCCCTTGCACCTCCTCGGGCCTCGCCTGCCAGTTCTGCAGATTCACAAGTGGACAGAGGACTAAAATGACCAGGCTCTGCAGCCAAGAAACTGGCTGTGGGGTCCCAGACATGCCACTGTGATCCAGCTGTTGGGGCGGGGGGAGTGGGCAGGACTTCCCAGGGAGGGAGGCAGCTGGCTGGGGAGTCAGAAGTCCAGAGTCTTGGGCCCCAAGCCAGCTGCTGGCTGCAGAAGAAAAGACAGGTGAGTGGCCAGGTGCACTCCTCAGACCTGTGCACAGGAAGGGTCCCACTGGAGGGGCCAGAGCTGAGCACCTAACCCAGGCTGCAGGAAATCTGCCTCCAGGAGGGGAAGTGGGACATCCCAGTGGAGAAAAAATGCCCCTGACACTGCAGGATGACGGCCCCTGAGCTGCGGAAATCCCCCTGGCCTCCTTTCTCCGATTTACCCTCAGGGTCAATACCTCTGAGACCGCTGTGCCCTCCTCATCCTGACAGCCGGGGAAAAGGGGAGGGTGCAGGGAGAGGGGAGGCGGGGACGGTGTGCCCAAGGGCCACCCACCTGGGCATCATTTGGTGCTGATATAAGGACAGGCCCACCCAGAGAGAAAAAGCATCCCACCTGGGGAGGAAAGGAAGGGCTGGGAAAGACCCCAGAACGGCACCCCTCCAACAAGGCAGGAAGGGAGAAGGACAGCCCCTCCGGCTGGGTGGAGGATGCCAGGAAGGGGCTGAACCACGGCCTGCTGGGAATCACGGCCCTTCCTTTCCTCAGATCGCCTTGCGGCCTGGCACTGGAGCTGGTGCTGACAGGGACGCTGGCCAACAGGGTGGTATTTTTCACCCGGGTGATCTGAGCTGCTGGCAGGTAGGGGGTGGGCTGGGGGAGGCGGGTGAGGGCTGGTCTTAGATAGGAATGCAGCCCAGAAGGGACCAAGCACTTGCCCATCCTCACTGGCTTTCAAAAAATAAACAGTAAAAATAAAAGTCCCATGAACCTT

(SEQ ID NO:2)

在一个实施方案中，NKX6.3包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选其中氨基酸序列基本上保留SEQ ID NO:1所表示的蛋白质的天然功能。

在一个实施方案中，编码NKX6.3的核苷酸序列包括与SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列，优选其中核苷酸序列编码的蛋白质基本上保留SEQ ID NO:1所表示的蛋白质的天然功能。

在一个实施方案中，编码NKX6.3的核苷酸序列包括编码与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，优选其中氨基酸序列基本上保留SEQ ID NO:1所表示的蛋白质的天然功能。

体重减轻和体重维持

如本文所用，术语“体重减轻”可以指诸如体重(例如，单位为千克)、身体质量指数(kg/m2)、腰臀比(例如，单位为厘米)、脂体重(例如，单位为千克)、臀围(例如，单位为厘米)或腰围(例如，单位为厘米)等参数的减小。

体重减轻可通过以下方式计算：将干预(例如饮食和/或锻炼方案)结束时上述参数中一个或多个的值从干预开始时该参数的值中减去。

体重减轻的程度可表示为上述体重表型参数之一的百分比变化(例如，个体体重(例如，单位为千克)或身体质量指数(kg/m²)的百分比变化)。例如，个体可减轻其初始体重的至少10％，其初始体重的至少8％，或其初始体重的至少5％。仅以举例说明的方式，个体可减轻其初始体重的5％和10％之间。

在一个实施方案中，体重减轻程度为初始体重的至少10％可导致肥胖相关并存病的风险显著降低。

如本文所用，术语“体重维持”可以指诸如体重(例如，单位为千克)、身体质量指数(kg/m²)、腰臀比(例如，单位为厘米)、脂体重(例如，单位为千克)、臀围(例如，单位为厘米)或腰围(例如，单位为厘米)等参数的维持。体重维持可指例如在干预(例如饮食和/或锻炼方案)后维持体重减轻。

体重维持的程度可通过以下方式来计算：确定在一段时间内一种或多种上述参数的变化。该段时间可为例如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50周。

本发明试剂所支持的体重维持可导致例如一段时间内一个或多个上述参数少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的变化(例如增加)。

体重维持的程度可表示为在实现体重减轻后的一段时间期间恢复的体重，例如表示为在实现体重减轻期间减轻的体重的百分比。

本发明试剂所支持的体重维持可通过施用试剂后抑制个体的食欲引起。因此，相比于不存在本发明试剂时的食欲，个体可因此食欲下降。

本发明试剂所支持的体重维持可通过施用试剂后控制个体的食欲引起。个体可因此维持对其食欲的控制，并因此例如在体重减轻干预时段后维持其体重。

具体地，本发明的试剂可通过在体重减轻干预(例如饮食或锻炼方案)时段期间和/或之后抑制或控制食欲来支持体重维持。

在一个方面，本发明提供了本发明的试剂例如在体重减轻时间段之后维持健康身体组成的非治疗性用途。

肥胖

如本文所用，术语“超重”被定义为成人的身体质量指数(BMI)介于25和30之间。

如本文所用，术语“身体质量指数”是指体重(千克)除以身高(米)的平方所得的比值。

如本文所用，术语“肥胖”是指储存在动物(尤其是人类和其它哺乳动物)脂肪组织中的天然能量储备增至与某些健康状况或死亡率上升有关的程度的病症。如本文所用，术语“肥胖”被定义为成人的BMI大于30。

如本文所用，对成人而言，术语“正常体重”被定义为具有18.5至25的BMI，而“体重不足”可被定义为BMI小于18.5。

肥胖是一种慢性代谢障碍，在世界上的许多地区已达到了流行病程度，并且是诸如2型糖尿病、心血管疾病、血脂异常和某些类型的癌症等严重并存病的主要风险因素(World Health Organ.Tech.Rep.Ser.(2000)894:i-xii,1-253)。

如本文所用，术语“肥胖症相关障碍”是指肥胖个体有增高的发病风险的任何病症。肥胖症相关障碍包括糖尿病(例如，2型糖尿病)、中风、高胆固醇、心血管疾病、胰岛素抗性、冠心病、代谢综合征、高血压和脂肪肝。

筛选的方法

本发明提供能够降低NKX6.3的活性的试剂，并且附加地提供用于鉴定此类试剂的方法。

本发明的试剂可用提供定性或定量结果的方法来鉴定。此外，此类方法可用于表征和鉴定本发明的试剂。

候选试剂可为任何具有潜在利益的试剂，例如肽、多肽(例如抗体)、核酸或小分子。优选，候选试剂为具有潜在治疗利益的化合物或混合物。优选，候选试剂对哺乳动物，特别是人类具有低毒性。在一些实施方案中，候选试剂可包括营养剂和/或食品成分，包括天然存在的化合物或化合物的混合物例如植物或动物提取物。

候选试剂可构成试剂库的一部分，例如由组合化学产生的库或噬菌体展示库。在一个实施方案中，候选试剂构成植物生物活性分子库的一部分。

NKX6.3活性

候选试剂减少蛋白质例如酶的活性的能力可以IC50值表示。IC50为使得蛋白质的活性产生50％减少(例如酶活性的50％减少)所需试剂的浓度。IC50值的计算在本领域中是已知的。

优选地，本发明的试剂对NKX6.3的抑制的IC50值小于100μM，更优选地小于10μM，例如小于1μM、小于100nM或小于10nM。

测量NKX6.3活性的技术可应用于已从细胞分离出的NKX6.3。可使用重组技术来表达NKX6.3。优选地，NKX6.3已被纯化。

NKX6.3结合

本发明还提供鉴定能够与NKX6.3结合的试剂，以及另选地或除此之外表征此类结合的方法。例如，该方法允许测量绝对或相对结合亲和力，和/或结合的焓和熵。结合亲和力可以平衡解离(K_d)或缔合(K_a)常数表示。

本领域中已知许多测定技术用于鉴定候选试剂与蛋白质之间的结合。所采用的测定技术优选为适于对候选试剂进行自动化和/或高通过量筛选的测定技术。可在诸如微量滴定板、微珠、树脂或类似物的固体载体上进行测定。

例如，靶NKX6.3可固定在固体载体例如微珠、树脂、微量滴定板或阵列上。然后可使候选试剂与固定的靶蛋白接触。任选地，可应用洗涤工序以去除弱特异性或非特异性结合试剂。然后可检测并鉴定任何与靶蛋白结合的试剂。为有利于结合试剂的检测，可用可易于检测的标志物标记候选试剂。标志物可包括例如放射性标记、酶标记、抗体标记、荧光标记，颗粒(例如乳胶或金)标记或类似物。

或者，可将上述工序颠倒，并且可将候选试剂固定并可使靶NKX6.3与所述固定的试剂接触。任选地，可应用洗涤工序以去除弱特异性或非特异性结合的靶蛋白。然后可检测并鉴定任何与NKX6.3结合的试剂。为有利于结合的检测，可用如上所述的易于检测的标志物标记NKX6.3。

除了上述测定之外，其他合适的测定技术也是本领域中已知的。此类技术的示例包括放射性测定、荧光测定、ELISA、荧光偏振、荧光各向异性、等温滴定量热法(ITC)、表面等离子体共振(SPR)等。可应用这些测定来鉴定与NKX6.3结合的试剂。实际上，用于对许多这些技术进行自动化以有利于高通过量筛选的平台是本领域中广泛已知的。

可使用不止一种测定技术来提供对候选试剂与NKX6.3结合的详细理解。例如，可将提供定性结合信息的测定用作方法中的第一步骤，然后进行使用不同技术的另外的测定以提供定量结合数据和/或对靶蛋白活性影响数据。

上述测定技术可适于进行竞争结合研究。例如，这些技术同样适于分析蛋白质与底物或辅因子在存在候选试剂的情况下的结合。因此，将可能的是使用上述技术来筛选并鉴定调节蛋白质与其底物或辅因子之间的结合，因此对蛋白质的活性具有影响的试剂。

优选，本发明的试剂将以高亲和力结合。例如，本发明的试剂将以小于100μM，更优选地小于10μM，例如小于1μM、小于100nM或小于10nM的K_d与NKX6.3结合。

结合亲和力可使用本领域已知的标准技术例如表面等离子体共振、ELISA等等(例如如上所述)来测量，并且可以解离(K_d)或缔合(K_a)常数定量。

例如在计算机结构指导的筛选中，基于生物信息学的方法也可用于鉴定本发明的试剂。

NKX6.3水平

本发明提供用于降低NKX6.3的水平的试剂。NKX6.3的水平可等同于细胞或生物体中蛋白质的表达水平。可例如通过分析编码蛋白质的mRNA水平来直接或间接地分析蛋白质水平。

本发明中可采用分析NKX6.3的表达的方法来筛选候选试剂对蛋白质水平的效应。

本领域中已知许多技术用于测定蛋白质的表达水平。可应用这些技术来测试候选试剂对NKX6.3的表达水平的效应。所采用的技术优选为适于对候选试剂进行自动化和/或高通过量筛选的技术。

例如，筛选可使用携带编码NKX6.3的多核苷酸的细胞来进行，NKX6.3有效连接至报告基因部分。报告基因部分可有效连接至内源NKX6.3编码基因。或者，可操作地连接至报告基因部分的NKX6.3的外源拷贝可插入细胞中。在此实施方案中，细胞可被工程化为对天然NKX6.3表达具有缺陷。合适的报告基因部分包括荧光标记，例如荧光蛋白如绿色、黄色、樱桃红色、青色或橙色荧光蛋白。

如本文所用，术语“有效连接”是指所述的组分处于允许使它们按照本身预期的方式发挥作用的关系。

可使此类细胞与候选试剂接触，并且可通过分析细胞中报告基因部分表达的水平来监测NKX6.3的表达水平。可通过本领域中已知的许多技术例如流式细胞计量术、荧光激活细胞分选术(FACS)和荧光显微镜法来分析荧光报告基因部分。可对与候选试剂接触之前和之后的NKX6.3的表达水平进行比较。或者，可对与候选试剂接触的细胞与对照细胞之间的NKX6.3的表达水平进行比较。

其他方法可用于分析蛋白质例如NKX6.3的表达。可直接分析蛋白质表达。例如，可使用诸如SDS-PAGE分析通过考马斯(Coomassie)或银染色进行可视化的方法来对表达进行定量分析。或者，使用蛋白质印迹法或酶联免疫吸附测定(ELISA)通过结合蛋白质产物的抗体探针来对表达进行定量分析。在这些方法中，还可使用如上所述的用报告基因部分标记的NKX6.3。或者，可例如通过研究与蛋白质对应的mRNA的量来间接分析蛋白质表达，所述mRNA在细胞中转录。这可使用诸如定量逆转录PCR和Northern印迹法的方法来实现。

类似的技术也可用于分析瘦素蛋白质表达。

试剂

本发明的试剂可为例如肽、多肽(例如抗体)、核酸(例如siRNA、shRNA、miRNA和反义RNA)或小分子。优选，试剂对哺乳动物，特别是人类具有低毒性。在一些实施方案中，试剂可包括营养剂和/或食品成分，包括天然存在的化合物或化合物的混合物例如植物或动物提取物。

降低或以其他方式影响NKX6.3活性的示例性试剂包括表1中列举的试剂。

化学名称	化学ID	CAS RN	相互作用
				对乙酰氨基酚	D000082	103-90-2	降低表达
双酚A	C006780	80-05-7	降低表达
				双(三正丁基锡)氧化物	C005961		降低表达
花萼海绵诱癌素A	C059041	101932-71-2	降低表达
				丙硫氧嘧啶	D011441	51-52-5	降低表达

表1:降低或以其他方式影响NKX6.3的活性的试剂。(Davis AP,等人，TheComparative Toxicogenomics Database:2017年更新，Nucleic Acids Res.2016年9月19日)

在一个实施方案中，试剂通常被认为是安全的(GRAS)。

在一个实施方案中，试剂在口服施用时具有不小于50％的生物利用率。

用于所述用途的根据本发明的试剂可选自表1。

在一个实施方案中，试剂是对乙酰氨基酚。在一个实施方案中，试剂是双酚A。在一个实施方案中，试剂是双(三正丁基锡)氧化物。在一个实施方案中，试剂是花萼海绵诱癌素A。在一个实施方案中，试剂是丙基硫氧嘧啶。

用于所述用途的根据本发明的试剂可例如作为盐或酯，特别是药学上可接受的盐或酯存在。

siRNA、shRNA、miRNA和反义DNA/RNA

可使用转录后基因沉默(PTGS)来调节NKX6.3的表达。双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默为控制外源基因表达的保守细胞防御机制。据认为，诸如转座子或病毒之类的元件的随机整合引起dsRNA的表达，该表达激活同源单链mRNA或病毒基因组RNA的序列特异性降解。沉默效应被称为RNA干扰(RNAi)(Ralph等人(2005)Nat.Medicine 11:429-433)。RNAi的机制涉及将长dsRNA加工成约21-25核苷酸(nt)RNA的双链体。这些产物被称为小干扰或沉默RNA(siRNA)，是mRNA降解的序列特异性介导物。在分化的哺乳动物细胞中，已发现dsRNA>30bp可活化干扰素响应，导致蛋白质合成关闭和非特异性mRNA降解(Stark等人(1998)Ann.Rev.Biochem.67:227-64)。然而，可使用21nt siRNA双链体来绕过此响应(Elbashir等人(2001)EMBO J.20:6877-88；Hutvagner等人(2001)Science 293:834-8)，从而允许在培养的哺乳动物细胞中分析基因功能。

shRNA由小环序列组成的短的反向RNA重复序列组成。这些shRNA被细胞机器快速加工成19-22nt siRNA，从而抑制靶基因表达。

微小RNA(miRNA)为小的(长度为22-25个核苷酸)非编码RNA，该小的非编码RNA可通过与它们的3′非翻译区(UTR)结合而有效地减少靶mRNA的翻译。微小RNA是生物体中自然产生的一大群小RNA，其中的至少一些调控靶基因的表达。微小RNA家族的基础成员为let-7和lin-4。let-7基因编码高度保守的小RNA种类，其在蠕虫发育期间调节内源性蛋白编码基因的表达。活性RNA种类开始被转录成～70nt的前体，在转录后加工成成熟的～21nt的形式。let-7和lin-4被转录成为发夹RNA前体，该前体通过Dicer酶被处理成其成熟形式。

反义概念是使细胞中的短的可能修饰的DNA或RNA分子与信使RNA选择性地结合并预防编码的蛋白质的合成。

用于设计调节靶蛋白质表达的siRNA、shRNA、miRNA和反义DNA/RNA的方法，以及用于将这些试剂递送至所关注的细胞的方法是本领域中熟知的。此外，本领域中熟知的是例如通过使用组织特异性启动子来对生物体内某些细胞类型的蛋白质表达进行特异性调节(例如降低)。

抗体

如本文所用，术语“抗体”是指能够结合所选靶标的完全抗体或抗体片段，并且包括Fv\ScFv\F(ab’)和F(ab’)₂、单克隆和多克隆抗体、工程化抗体(包括嵌合抗体、CDR-移植抗体和人源化抗体)以及使用噬菌体展示或其它技术产生的人工选择抗体。

此外，本发明中还可使用经典抗体的替代形式，例如“阿维体(avibody)”、“阿维聚体(Avimer)”、“抗转运蛋白(anticalins)”、“纳体(nanobody)”和“锚蛋白重复蛋白(DARPin)”。

用于产生抗体的方法是技术人员已知的。或者，抗体可源自商业来源。

如果需要多克隆抗体，则可对选定的哺乳动物(例如小鼠、兔子、山羊或马)进行免疫。可收集来自免疫的动物的血清并根据已知工序进行处理。如果血清含有针对其他抗原的多克隆抗体，则多克隆抗体可通过免疫亲和层析来纯化。用于制备并加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。

针对本发明中使用的抗原(例如蛋白质)的单克隆抗体也可由技术人员容易地制备。通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的。永生化抗体生成细胞系可通过细胞融合产生，并且也通过其他技术如利用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)转染来产生。可筛选产生的针对抗原的单克隆抗体的图谱(panel)的各种性质，例如同种型和表位亲和力。

一种可选的技术涉及筛选噬菌体展示文库，其中例如噬菌体在其衣壳表面表达scFv片段以及各种互补性决定区(CDR)。此技术是本领域众所周知的。

针对抗原的抗体(单克隆和多克隆抗体两者)具体可用于诊断中，其中中和型的那些抗体可用于被动免疫疗法中。单克隆抗体具体可用于激发抗独特型抗体。抗独特型抗体是携带需要针对提供保护的传染剂抗原的“内部图像”的免疫球蛋白。

用于激发抗独特型抗体的技术是本领域已知的。这些抗独特型抗体也可用于治疗，以及用于阐明抗原的致免疫区。

向细胞中引入多肽和多核苷酸

用于本发明中的试剂可例如为多肽或多核苷酸。还需要将多核苷酸和多肽引入细胞中来作为本发明的方法或筛选测定的一部分。

在本发明利用多肽的情况下，可将多肽直接施用于细胞(例如，可施用多肽本身)，或通过将编码多肽的多核苷酸在允许于所关注的细胞中表达该多肽的条件下引入细胞中来施用多肽。可使用载体将多核苷酸引入细胞中。

载体是允许或有利于将实体从一种环境转移到另一种环境的工具。根据本发明并且以举例的方式，用于重组DNA技术的一些载体允许实体，诸如核酸区段(例如异源DNA区段，诸如异源cDNA区段)被转移至靶细胞。载体可用于维持细胞内的异源核酸(例如DNA或RNA)，从而有利于包含核酸区段的载体的复制，或有利于核酸区段所编码的蛋白质的表达。载体可为非病毒载体或病毒载体。用于重组核酸技术中的载体的示例包括但不限于质粒、染色体、人工染色体和病毒。载体还可为例如裸核酸(例如，DNA)。当载体呈其最简单的形式时，载体本身可为所关注的核苷酸。

可用于本发明中的载体可为例如质粒或病毒载体并且可包括用于多核苷酸表达的启动子以及任选的启动子的调控因子。

可使用多种本领域中已知的技术例如转导和转染将用于本发明中的包含多核苷酸的载体引入细胞中。适用于该目的的几种技术在本领域中是已知的，例如用重组病毒载体(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯性疱疹病毒载体)感染；以及直接注射核酸和基因枪转化。非病毒递送体系包括但不限于DNA转染方法。转染包括使用非病毒载体来将基因递送至靶细胞的方法。

多肽或多核苷酸的转移可通过本领域中已知的以物理方式或以化学方式使细胞膜透化的任意方法来进行。细胞穿透肽还可用于将多肽转移到细胞中。

此外，本发明可采用基因靶向方案，例如DNA修饰剂的递送。

载体可为表达载体。本文描述的表达载体可包含核酸区，所述核酸区包含能够被转录的序列。因此，编码mRNA、tRNA和rRNA的序列包括在此定义内。

表达载体优选包含用于本发明中的多核苷酸，该多核苷酸有效连接至控制序列，该控制序列能够通过宿主细胞提供对编码序列的表达。“有效连接”至编码序列的调控序列的连接方式使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。可例如通过添加另外的转录调控元件来修饰控制序列，以使得由控制序列引导的转录的水平更易于响应转录调节因子。

多核苷酸

本发明的多核苷酸可包括DNA或RNA。它们可为单链的或双链的。本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸可编码相同的多肽。此外，应当理解，本领域技术人员可使用常规技术进行下述核苷酸置换，该置换不影响本发明的多核苷酸编码的多肽序列，以反映其中将表达本发明的多肽的任何特定宿主生物体的密码子应用。

可通过本领域中可用的任何方法对多核苷酸进行修饰。可进行此类修饰以增强本发明多核苷酸的体内活性或存活期(life span)。

多核苷酸，例如DNA多核苷酸可通过重组、合成或通过技术人员可用的任何方法来制备。还可通过标准技术对它们进行克隆。

通常使用重组方法来制备较长的多核苷酸，例如使用聚合酶链反应(PCR)克隆技术。这将包括制备一对旁侧具有期望被克隆的靶序列的引物(例如大约15至30个核苷酸)，使该引物与mRNA或cDNA例如获自动物或人类细胞的mRNA或cDNA进行接触，在引起所期望的区扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片断(例如通过琼脂糖凝胶纯化反应混合物)以及回收扩增的DNA。引物可被设计为含有合适的限制性酶识别位点，使得扩增的DNA可被克隆到合适的载体中。

蛋白质

如本文所用，术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多个多肽的复合物，在该复合物中，各个组成多肽通过共价方式或非共价方式连接。如本文所用，术语“多肽”和“肽”是指其中单体为氨基酸并通过肽键或二硫键接合在一起的聚合物。

变体、衍生物、类似物、同源物和片段

除本文提到的具体蛋白质和核苷酸之外，本发明还涵盖它们的变体、衍生物、类似物、同系物以及片段。

在本发明的上下文中，任何给定序列的变体是这样的序列，其中各残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的具体序列已被修饰，修饰的方式为使得所讨论的多肽或多核苷酸保持其内源功能中的至少一种。可通过对天然存在的多肽或多核苷酸中存在的至少一个残基进行添加、缺失、置换、修饰、替代和/或变异来获得变体序列。

与本发明的蛋白质或多肽相关的本文所用的术语“衍生物”包括对来自序列的一个(或多个)氨基酸残基进行的任何置换、变异、修饰、替代、缺失和/或将一个(或多个)氨基酸残基添加至序列，前提条件是所产生的蛋白质或多肽保持其内源功能中的至少一种。

与多肽或多核苷酸相关的本文所用的术语“类似物”包括任何模拟物，即具有其所模拟的多肽或多核苷酸的内源功能中的至少一种的化合物。

通常，可例如从1、2或3至10或20个置换作出氨基酸置换，前提条件是被修饰的序列保持所需的活性或能力。氨基酸置换可包括使用非天然存在的类似物。

用于本发明中的蛋白质还可具有这样的氨基酸残基缺失、插入或置换，即所述缺失、插入或置换产生沉默变化并且得到功能上等同的蛋白质。还可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲特性的相似性做出有意的氨基酸置换，只要内源功能得以保持即可。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；包含具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。

保守置换可例如按下表进行。第二列同一格中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可互相置换：

如本文所用，术语“同源物”是指与野生型氨基酸序列或野生型核苷酸序列具有一定同源性的实体。术语“同源性”可等同于“同一性”。

在本发明上下文中，同源序列旨在包括可与个体序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性，优选具有至少95％或97％或99％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与个体氨基酸序列相同的活性位点等。尽管还可以相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但在本发明的上下文中，优选地以序列同一性表达同源性。

在本发明上下文中，同源序列旨在包括可与个体序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性，优选具有至少95％或97％或99％同一性的核苷酸序列。尽管还可以相似性考虑同源性，但在本发明的上下文中，优选地以序列同一性表达同源性。

优选，提及与本文详述的任何一个SEQ ID NO具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。

同源性比较可通过肉眼进行，或更通常地，借助于易得序列比较程序进行。这些商购计算机程序可计算两个或更多个序列之间的同源性或同一性百分比。

同源性百分比可通过连续的序列来计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸或核苷酸与另一条序列中的相应氨基酸或核苷酸直接比较，一次一个残基。这称为“无空位”比对。通常，此类无空位比对仅在相对短数目的残基范围内进行。

尽管这是十分简单和可靠的方法，但其未能考虑例如在原本相同的序列对中，氨基酸或核苷酸序列中的一个插入或缺失可导致后面的残基或密码子不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致同源性百分比有大的下降。因此，大多数序列比较方法被设计为产生最佳比对，所述最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会过度罚掉整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。

然而，这些更复杂的方法向比对结果中出现的每个空位赋予“空位罚分”，使得对于同样数目的相同氨基酸或核苷酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间具有较高的相关性)将获得比具有许多空位的序列比对结果更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap cost)”，其对空位的存在收取相对较高的成本，对空位中每一个后续残基收取较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。例如当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时，氨基酸序列的默认空位罚分为：空位：-12,每个延伸：-4。

因此，最大同源性百分比的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit程序包(University ofWisconsin,USA；Devereux等人(1984)Nucleic Acids Research 12:387)。可进行序列比较的其它软件的示例包括但不限于例如：BLAST软件包(参见Ausubel等人(1999)出处同上–第18章)、FASTA(Atschul等人(1990)J.Mol.Biol.403-410)和比较工具的GENEWORKS套件。BLAST和FASTA可用于离线和在线检索(参见Ausubel等人(1999)出处同上，第7-58页至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。另一种工具即BLAST 2Sequences也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(FEMS Microbiol.Lett.(1999)174(2):247-50；FEMSMicrobiol.Lett.(1999)177(1):187-8)。

尽管最终的同源性百分比也可以同一性来量度，但比对过程本身通常不是基于全有或全无的(all-or-nothing)成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。通常使用的这种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵(BLAST程序套件的默认矩阵)。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(关于进一步的细节参见用户手册)。对于一些应用而言，优选的是使用GCG软件包的公共默认值，或就其他软件而言，使用默认矩阵，诸如BLOSUM62。

一旦该软件产生了最佳比对，则可计算同源性百分比，优选序列同一性百分比。作为序列比较的一部分，该软件通常进行这些计算并产生数值结果。

“片段”也是变体，该术语通是常指多肽或多核苷酸中的在功能上或在例如测定中所关注的选定区域。“片段”因此是指属于全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。

此类变体可使用标准重组DNA技术如定点诱变来制备。在要制备插入物的情况下，可制备编码该插入物的合成DNA以及与天然序列对应的位于插入位点任一侧的5'和3’旁侧区。旁侧区将包含对应于天然序列中的位点的适宜的限制性位点，使得该序列可用适当的酶进行切割并且合成DNA可连接到切口中。然后根据本发明表达DNA以制备所编码的蛋白质。这些方法仅仅是说明许多本领域已知的用于操纵DNA序列的标准技术，其他已知的技术也可使用。

密码子优化

本发明中所用的多核苷酸可经过密码子优化。密码子优化此前在WO1999/41397和WO 2001/79518中已有描述。不同的细胞在它们对特定密码子的用法上存在差异。此密码子偏向与特定tRNA在细胞类型中的相对丰度的偏向对应。通过改变序列中的密码子，使得将它们受到调控以匹配对应的tRNA的相对丰度，则有可能提高表达。同样，通过有意选择已知其对应的tRNA在特定细胞类型中稀有的密码子，有可能降低表达。因此，可获得额外程度的翻译控制。本领域已知哺乳动物细胞以及多种其他生物体的密码子用法表。

治疗方法

本文对治疗的所有提及包括治愈性、姑息性和预防性治疗。优选哺乳动物，特别是人类的治疗。人类治疗和兽医治疗均在本发明的范围之内。

施用

虽然用于本发明中的试剂可单独施用，但它们通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合施用，特别是对于人类疗法而言。

在一些实施方案中，试剂为营养剂、食品添加剂或食品成分，并可因此调配在合适的食品组合物中。因此，试剂可例如以食物产品、饮料、食品补充剂、营养剂、营养配方产品或宠物食物产品的形式施用。

剂量

无需进行过多实验，技术人员即可容易地确定向个体施用的本发明试剂的适当剂量。通常，医师会确定对个体患者最适合的实际剂量，并且该剂量将取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用模式和时间、排泄速度、药物组合、特定病症的严重程度和个体正接受的疗法。当然也可存在有益的较高或较低剂量范围的个别情况，这在本发明的范围之内。

个体

如本文所用，术语“个体”是指人类或非人类动物。

非人类动物的示例包括脊椎动物例如哺乳动物，如非人类灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、狗、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠或豚鼠)、猪和猫。非人类动物可为伴侣动物。

优选，个体是人类。

技术人员将理解，在不脱离所公开的本发明范围的前提下，他们可以组合本文所公开的本发明的所有特征。

现将通过非限制性实施例来描述本发明的优选特征和实施方案。

除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有所阐述。参见：例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.，1989年，《MolecularCloning：A Laboratory Manual》，第二版，冷泉港实验室出版社；Ausubel,F.M.等人，(1995年和定期补充)，《Current Protocols in Molecular Biology》,第9、13和16章,JohnWiley&Sons；Roe,B.、Crabtree,J.和Kahn,A.，1996年，《DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques》，John Wiley&Sons；Polak,J.M.和McGee,J.O’D.，1990年，《InSitu Hybridization:Principles and Practice》，牛津大学出版社；Gait,M.J.，1984年，《Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach》,IRL出版社；以及Lilley,D.M.AndDahlberg,J.E.，1992年，《Methods in Enzymology:DNA Structures Part A:Synthesisand Physical Analysis of DNA》,学术出版社。这些一般性文本中的每一个以引用的方式并入本文。

实施例

实施例1：NKX6.3遗传变体与体重减轻之间的联系

该研究涉及对Diogenes体重减轻干预数据和加拿大Optifast900研究进行的遗传关联。

Diogenes研究是一项泛欧洲、随机化和对照膳食干预研究，这项研究在八个欧洲中心调查膳食蛋白和血糖指数对肥胖和超重家庭体重减轻和体重维持的作用(Larsen等人(2009)Obesity Rev.11:76-91)。简而言之，Diogenes研究包括遵循8周低热量饮食(LCD)的超重/肥胖个体。LCD通过使用代餐产品(Modifast，Nutrition et SantéFrance)每天提供800kcal。

加拿大Optifast900研究由加入体重管理诊所的患者组成，他们已完成6至12周的代餐方案，所述方案由加拿大独有的产品Optifast900(NestléHealth Science，Switzerland)组成。

这是在致力于与身体质量指数(BMI)变化相关的蛋白质的干预期间，测试Illumina芯片上基因分型的常见变体与蛋白质表达变化之间关联的第一项研究。

使用HumanCoreExome-12v1.1生成基因型数据，其具有264,909个标签SNP标志物和244,593个外显子组聚焦标志物(www.illumina.com)。根据制造商的说明，按照

HD Assay Ultra,Manual使用Illumina TM平台处理它们。使用GenomeStudio软件(Illumina)调用基因型。质量控制程序遵循来自GenABEL包的建议(Aulchenko,Y.S.,Ripke,S.,Isaacs,A.&van Duijn,C.M.Bioinforma.Oxf.Engl.23,1294–1296(2007)，并且排除了调用率<95％，违反Hardy-Weinberg平衡(FDR<20％)，低次要等位基因频率<1％的SNP。如果个体具有低调用率(<95％)，异常高的常染色体杂合性(FDR<1％)，XXY核型或基因型数据与临床记录之间的性别不一致，则排除个体。对于具有高状态一致性(IBS>95％)的个体，仅保留具有最高调用率的个体。主成分分析(PCA)在每个群组上独立进行，以丢弃在遗传结构方面为异常值的个体。来自两个群组的个体都是欧洲血统，并且这两个群组具有相似的遗传结构。在所有遗传QC上，保留了1166名渥太华和798名DiOGenes个体以用于后续分析。基因型填补然后使用SHAPEIT(Delaneau,O.,Marchini,J.&Zagury,J.-F.Nat Meth9,179–181(2012))和IMPUTE2(Howie,B.N.,Donnelly,P.&Marchini,J.PLoS Genet.5,e1000529(2009))，基于来自1000基因组计划的欧洲参考小组(Abecasis,G.R.等人，Nature491,56–65(2012))(2012年3月发布，第1阶段第3版)进行。填补后过滤去除SNP，其中参考等位基因频率小于1％且INFO得分<0.8。单SNP分析使用BOLT-LMM来进行(Loh,P.-R.等人，Nat.Genet.47,284–290(2015))，该BOLT-LMM是用以调整人口结构和个体之间的隐秘相关性的贝叶斯线性混合效应模型。根据性别、年龄和起始BMI调整体重减轻率。随后使用全基因组关联荟萃分析(GWAMA)软件对来自两个群组的结果进行荟萃分析(

R.&Morris,A.BMC Bioinformatics 11,288(2010))，该软件具有随机效应建模和双基因组控制(GC)校正(Devlin,B.&Roeder,K.Biometrics 55,997–1004(1999))(研究水平和荟萃分析水平的GC校正)。

发现NKX6.3基因附近和之内的SNP与热量限制时的体重减轻相关联(图1)。

实施例2：NKX6.3遗传变体的优先化

使用贝叶斯框架进行GWA信号的优先化，以对关联p值与大规模表观基因组注释的联合可能性进行建模。使用RiVIERA-β框架(Li,Y.&Kellis,M.Nucleic Acids Res.44,e144(2016))与450个表观基因组注释进行这样的风险方差推断(包括组蛋白标记、脱氧核糖核酸酶I超敏反应、转录因子结合和外显子内的定位)。该框架的目标是针对每个输入SNP推断疾病的后验概率，给定其关联p值和功能注释中的重叠。从Pickrell等人检索了表观基因组注释(Am.J.Hum.Genet.94,559–573(2014))。

这样的建模的益处是确定哪些变体在因果/调节效应方面可能是最合理的，即使这些变体不一定是最关联的变体(即，具有最极端的p值)。事实上，通过这样的建模，rs6981587SNP(全局MAF＝34％并且位于8号染色体上的位置41516915(GRCh37坐标)处)作为最可能的因果变量出现。具体地讲，来自rs6981587的每个添加的C等位基因拷贝与更好的体重减轻相关联。正如预期的那样，与rs6981587连锁不平衡的其它变体也被排列为具有因果SNP的良好概率。

实施例3：NKX6.3的体内功能

飞蝇种族：用琼脂、糖和酵母在标准饮食中维持飞蝇库存，并在12/12日夜循环中在25℃培养箱中饲养。肌动蛋白-Gal4来自Bloomington，并且w1118和UAS-HGTX^IR来自VDRC。

甘油三酯测定：将10只(4-7天龄)雄性飞蝇称重并在冰上在200μl dH₂O中匀化，然后使用探针超声波仪在冰上超声处理10秒。在超声处理后，加入800μl冰冷的dH₂O并充分混合。使用Roche甘油三酯试剂盒(11730711216)根据制造商的说明书将50μl混合物用于测定甘油三酯。通过分析天平测量体重。甘油三酯被标准化为体重。

用于RNAi敲落效率的qPCR：从4-7日龄雄性飞蝇中提取RNA作为标准方案。所有提取的RNA均符合qPCR的质量(A260/A280>2.0,A260/A230>2.0)。使用

III第一链合成系统(英杰公司(Invitrogen))将1μg的mRNA逆转成cDNA。对所有引物针对效率和特异性进行预筛选。使用Sensimix^TM探针试剂盒(比奥立公司(Bioline))进行RT-PCR。过程如下：95℃10分钟，95℃的40个循环，15秒；55℃，15秒；72℃，15秒。反应在

(罗氏公司(Roche))上进行。

为了研究体内NKX6.3基因功能，在果蝇(Drosophila melanogaster)中使用转基因RNAi。使用全身(肌动蛋白-Gal4)驱动子，观察到与亲本对照相比HGTX mRNA的敲落(肌动蛋白-Gal4>UAS-HGTX^IR)中的显著甘油三酯降低(图2A)。使用第二RNAi发夹重复该观察结果(图2B)。

为了排除HGTX敲落的发育效应，使用诱导型TubGal80ts系统进行了HGTX的全身诱导敲落。肌动蛋白-Gal4；在发育阶段期间，将TubGal80ts>UAS-HGTX动物在18℃提升，然后将孵化的飞蝇在29℃转移6天，并且这些动物表现出与组成型HGTX敲落动物相似的TAG降低水平(图3)。

qPCR用于确认诱导型RNAi敲落效率，并且观察到HGTX mRNA水平降低了大约60％(图4)。

HGTX诱导型敲落导致飞蝇胰岛素样肽Ilp3的表达降低(图5)，表明其在胰岛素信号传导中的作用。

为了找到HGTX在其中发挥作用的特定组织，进行了脂肪体(Ppl-Gal4)、肌肉(Mef2-Gal4)、脑(nSyb-Gal4)和绛色细胞(Oeno-Gal4)中靶向表达的组织特异性HGTXRNAi。发现与亲本对照相比，仅绛色细胞特异性敲落HGTX导致TAG显著降低(图6)。这证实了在脂质代谢中的作用(在昆虫中，绛色细胞是负责脂质加工和解毒的特化细胞)。

上述数据共同支持HGTX/Nkx6.3在飞虫绛色细胞中发挥作用以调节体内胰岛素途径和甘油三酯含量。

在上述说明书中提到的所有出版物均以引用方式并入本文。本发明所公开的试剂、用途和方法的各种修改和变型在不脱离本发明范围和实质的情况下对技术人员将是显而易见的。虽然已结合具体优选的实施方案对本发明进行了公开，但是应当理解，受权利要求书保护的本发明不应不当地受限于此类具体实施方案。实际上，对技术人员显而易见的对用于实践本发明所公开的模式的各种修改旨在落在以下权利要求书的范围内。

Claims

1.试剂，所述试剂能够降低NKX6.3的活性，用于(i)减少脂肪积聚和/或(ii)保持或增加个体的去脂体重的用途。

2.根据权利要求1的试剂用于所述用途，其中所述试剂能够降低NKX6.3的活性以用于改善血脂异常。

3.根据任一前述权利要求的试剂用于所述用途，其中所述试剂能够降低心血管疾病(CVD)的风险。

4.根据任一前述权利要求的试剂用于所述用途，其中所述试剂在体重减轻干预期间或之后，优选地在体重减轻干预期间施用于个体。

5.根据任一前述权利要求的试剂用于所述用途，其中所述试剂降低个体中NKX6.3的水平。

6.根据任一前述权利要求的试剂用于所述用途，其中所述试剂选自表1中列出的试剂。

7.根据权利要求1至5中任一项的试剂用于所述用途，其中所述试剂选自siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、多核苷酸、多肽或小分子。

8.鉴定能够(i)减少脂肪积聚和/或(ii)保持或增加个体的去脂体重的试剂的方法，包括以下步骤：

9.鉴定降低NKX6.3的活性的试剂的方法，包括以下步骤：

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中包含所述NKX6.3多肽或多核苷酸的所述制备物包括包含所述NKX6.3多肽或多核苷酸的细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。

12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述方法用于鉴定降低NKX6.3的表达的试剂。

13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中所述候选试剂是天然产物。

14.方法，所述方法用于预测通过向个体施加一种或多种膳食干预来减少脂肪积聚的程度和/或预测通过向个体施加一种或多种膳食干预来保持或增加去脂体重的程度；所述方法包括确定所述个体的在与NKX6.3遗传连锁的一个或多个多态性位置处的核苷酸序列。

15.等位基因特异性寡核苷酸探针或等位基因特异性引物，其能够检测与NKX6.3遗传连锁的多态性位置，用于预测通过向个体施加一种或多种膳食干预来减少脂肪积聚的程度和/或预测通过向个体施加一种或多种膳食干预来保持或增加去脂体重的程度的用途。

16.等位基因特异性寡核苷酸探针或等位基因特异性引物，其能够检测与NKX6.3遗传连锁的多态性位置，用于预测能够通过向个体施加一种或多种膳食干预而获得的去脂体重与脂体重的比率增加的程度和/或预测通过向个体施加一种或多种膳食干预来降低甘油三酯水平的程度的用途。