JP2021526361A

JP2021526361A - Ｎｋｘ６．３を調節する方法

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Publication number: JP2021526361A
Application number: JP2020563772A
Authority: JP
Inventors: アルマンドヴァルセシア，; ジョーグハーガー，; ネレゲルドフ，
Original assignee: ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2021-10-07
Also published as: US20210095288A1; EP3794121A1; WO2019219308A1; CN112088216A

Abstract

対象における（ｉ）脂肪蓄積の低減及び／又は（ｉｉ）除脂肪量の維持若しくは増加に使用するための、ＮＫＸ６．３の活性を低下させることができる作用物質。１つ以上の食事介入を対象に適用することによる脂肪蓄積の低減度を予測するための、及び／又は１つ以上の食事介入を対象に適用することによる除脂肪量の維持度若しくは増加度を予測するための、方法も提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、ＮＫＸ６．３の活性を調節することができる作用物質、並びに治療における、特に対象の（ｉ）脂肪蓄積の低減、及び／又は（ｉｉ）除脂肪量の維持若しくは増加における、このような作用物質の使用に関する。本発明はまた、このような作用物質を同定する方法に関する。

肥満は、世界の多くの地域で蔓延している慢性的な代謝異常である。肥満は、重度の併存症、例えば２型糖尿病、心臓血管疾患、脂質代謝異常、及び特定のタイプのがんに関する主要な危険因子である（ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎ．Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ（２０００）８９４：ｉ−ｘｉｉ、１−２５３）。

肥満とは、炭水化物及び脂肪などに由来する過剰なエネルギーの蓄積の結果として、個体の重量が通常より重い状態を意味する。余剰体重は、典型的には、皮下又は内臓の周囲に脂肪の形態で保持されている。

経験的データにより、初期体重の少なくとも１０％の減量が、肥満関連の併存症のリスクを大幅に低下させることが示唆されている（ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎ．Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ（２０００）８９４：ｉ−ｘｉｉ、１−２５３）。しかしながら、減量能力は、対象間で非常に様々である。

エネルギー摂取量がエネルギー消費量を超える場合に、肥満が生じる。したがって、肥満の改善を目的とした、脂肪及び炭水化物などからのエネルギー摂取量を減少させる方法、又はｉｎｖｉｖｏ代謝を促進することによってエネルギー消費量を増加させる方法が望まれる。したがって、食習慣及び運動の改善は、肥満及び肥満関連疾患の予防及び改善のための有効な方法であると考えられる。例えば、低カロリー食（ＬＣＤ）による介入は減量に非常に有効であり得るものであり、この減量は概して肥満関連の併存症、特に２型糖尿病のリスクの改善を伴うと長い間認識されてきた（ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎ．Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ（２０００）８９４：ｉ−ｘｉｉ、１−２５３）。

減量を促進する数多くの方法が知られているが、減量介入の期間が終了すると、対象は減少した体重が再増加するというリスクに直面する。体重が再増加してしまうと、それまでの減量に関連した効果を減少させる恐れがあり、又は可能性としては完全に元に戻してしまう恐れがある。

したがって、減量を促進するための改良法だけでなく、体重維持を支援する（減量分の再増加を防止又は低減させ、したがって減量介入後に達成されたものと同様のレベルでの体重の維持をサポートする）ための方法も、依然として強く必要とされている。このような改善は、肥満に対してより完全な治療を提供し、したがって肥満関連疾患のリスクを減少させるであろう。

肥満は、肥満個体においては特定の遺伝子産物のレベルが標準体重の個体と比較して高い又は低いといった違いをはじめとした、身体における数多くの生理的変化を伴う（Ｓｉｎｇｌａ，ＢａｒｄｏｌｏｉａｎｄＰａｒｋａｓｈ，ＷｏｒｌｄＪＤｉａｂｅｔｅｓ（２０１０））。更に、これらの遺伝子産物の多くの血中レベルは、減量介入中に劇的に変化することが示されている（ＶａｎＤｉｊｋｅｔａｌ．ＰｌｏｓＯｎｅ（２０１０），Ｖｉｇｕｅｒｉｅｅｔａｌ．ＰｌｏｓＧｅｎｅｔｉｃｓ（２０１２））。

しかしながら、これらの遺伝子発現レベルの変化が肥満及び減量と因果関係があるものなのか、又は肥満の状態及び減量介入をまさしく反映したものなのかは、ほとんど分かっていない。遺伝子発現レベルの変化について可能性のある因果関係を調べる方法の１つに、モデル生物のノックダウン実験において、これらの遺伝子のレベルが変化し得るかを研究するというものがある。現代の分子生物的手法を用いて、複数の生物でこのような実験を実施し、繰り返すことができる。かかるノックダウンにより生じる表現型が非致死性のものである場合、遺伝子発現の低減の影響は、生理学的、形態学的、又は分子的なリードアウトを使用して評価することができる。ショウジョウバエとして一般に知られているキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）は、幾つかの理由から、脂肪の生物学において特定の遺伝子の機能を研究するのに優れた遺伝モデルシステムであることが実証されている（ＨｏｎｇａｎｄＰａｒｋ，Ｅｘｐ．Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０；Ｐｏｓｐｉｓｉｌｉｋｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ，２０１０；Ｇｕｏｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ２００８）。第１に、ほとんどの遺伝子に関してＲＮＡｉノックダウンしたハエ系統が容易に入手可能であるため、遺伝的スクリーニングが容易である。第２に、ハエの発達は早く、ハイスループットな方法で研究することができる。第３に、ヒト遺伝子とハエ遺伝子との間の相同性はかなり高い。重要なことに、脂質の貯蔵及び利用に関する基本的なヒトの要素及び調節機序は、ハエにおいて進化的に保存されている。加えて、ハエには、高スクロース食及び飢餓を含む食事介入を受けさせることができ、したがって、ヒトの食生活習慣を模倣することができる。

ハエにおける代謝及び脂肪の発達に対する特定の遺伝子のノックダウンの影響を評価するために、最も確立された最良のリードアウトは、総トリグリセリドレベルによって測定される脂肪の蓄積である。体重そのものは、体長、より重要なことには除脂肪量又は筋量の違いを含む多くの因子により影響を受け得るため、リードアウトとして信頼性が低い。

本発明者らは、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＮＫＸ６．３オルソログの全身性ＲＮＡｉノックダウンを実施した。このノックダウンにより、野生型と比較して、（トリグリセリドレベルによって測定した）脂肪蓄積が有意に低減された株が得られた。この特定の表現型を、異なる全身性ＲＮＡｉノックダウンを使用して（異なるＲＮＡｉヘアピンを使用して）再現した。重要なことに、成体誘導型のノックダウンにより、この表現型が上手く再現されたことから、この効果が発達効果に起因するものではないことが実証された。その後の組織特異的なノックダウン実験により、効果が扁桃細胞において最も顕著であることを実証した（扁桃細胞をノックダウンしたハエは野生型よりも脂肪蓄積が有意に低減した）。ハエにおいて、扁桃細胞は、脂質処理及び解毒の役割を担う。ヒトと比較すると、これらの細胞は、肝細胞と同様の役割を有する。最終的に、ハエにおけるインスリンｍＲＮＡレベルの分析により、インスリン代謝に対するノックダウンの有意な効果が実証された。具体的には、インスリン様ペプチド３（Ｉｌｐ３）は、ノックダウンしたハエにおいて、野生型と比較して有意に下方調節されることが見出された。

したがって、一態様では、本発明は、対象における（ｉ）脂肪蓄積の低減及び／又は（ｉｉ）除脂肪量の維持若しくは増加に使用するための、ＮＫＸ６．３の活性を低下させることができる作用物質を提供する。

一実施形態では、脂肪蓄積は、トリグリセリドレベルによって測定される。

別の態様では、本発明は、体重維持の支援及び／又は肥満の治療若しくは予防に使用するための、ＮＫＸ６．３の活性を低下させることができる作用物質を提供する。

別の態様では、本発明は、体重維持を支援するための、ＮＫＸ６．３の活性を低下させることができる作用物質の使用を提供する。

別の態様では、本発明は、脂肪量に対する除脂肪量の比率を増加させるための、ＮＫＸ６．３の活性を低下させることができる作用物質の使用を提供する。

別の態様では、本発明は、トリグリセリドレベルを低下させることができる作用物質の使用を提供する。

別の態様では、本発明は、脂質異常症を改善するための、ＮＫＸ６．３の活性を低下させることができる作用物質の使用を提供する。

別の態様では、本発明は、心血管疾患（ＣＶＤ）のリスクを低減することができる作用物質の使用を提供する。

別の態様では、本発明は、脂肪蓄積の低減を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、脂肪蓄積を低減する方法を提供する。別の態様では、本発明は、除脂肪量の維持を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、除脂肪量を維持する方法を提供する。別の態様では、本発明は、除脂肪量の増加を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、除脂肪量を増加する方法を提供する。別の態様では、本発明は、体重維持の支援を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、体重維持を支援する方法を提供する。別の態様では、本発明は、脂肪沈着の低減を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、対象における脂肪沈着を低減する方法を提供する。別の態様では、本発明は、肥満の治療又は予防を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、肥満を治療又は予防する方法を提供する。

ＮＫＸ６．３の活性は、本発明の作用物質の非存在下での活性と比較して低下し得る。ＮＫＸ６．３の活性は、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％又は１００％低下し得る。

作用物質は、例えば、ＮＫＸ６．３拮抗物質若しくは阻害物質であってもよく、又は作用物質は、細胞、好ましくは肝細胞におけるＮＫＸ６．３レベルを低下し得る。

一実施形態では、作用物質は、減量介入中又は減量介入後に対象に投与される。好ましい実施形態では、作用物質は、減量介入中に対象に投与される。減量介入は、例えば、食事療法（例えば、低カロリー食）及び／又は運動療法であり得る。

一実施形態では、作用物質は、対象におけるＮＫＸ６．３レベルを低下させる。本文脈において、「レベル」は、ＮＫＸ６．３の量を意味し、例えば、発現したタンパク質の量を分析することによって、及び／又は存在する対応するｍＲＮＡの量を分析することによって測定することができる。好ましくは、作用物質はＮＫＸ６．３の発現を低下させる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡは、ＮＫＸ６．３の発現を低下させ得る。

一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＮＫＸ６．３の発現を低下させ得る。

ＮＫＸ６．３レベルは、本発明の作用物質が存在しない場合のレベルと比較して低下し得る。ＮＫＸ６．３レベルは、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％又は１００％低下し得る。

一実施形態では、作用物質は、表１に掲載される作用物質から選択される。

別の好ましい実施形態では、作用物質は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は小分子からなる群から選択される。ポリペプチドは、例えば、抗体であり得る。したがって、本発明の作用物質は、ＮＫＸ６．３を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又はポリペプチド（例えば、抗体）の形態であり得る。ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターなどのベクターの形態であり得る。

本発明の作用物質は、本発明の方法によって同定される作用物質であり得る。

別の態様では、本発明は、対象における（ｉ）脂肪蓄積を低減すること、及び／又は（ｉｉ）除脂肪量を維持若しくは増加させることができる作用物質を同定する方法であって、
（ａ）ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む調製物を、候補となる作用物質と接触させる工程と、
（ｂ）候補となる作用物質が、ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかを検出する工程と、を含む、方法を提供する。

ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に対する効果は、候補となる作用物質の存在下及び非存在下（すなわち、対照実験）におけるＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を比較することによって分析することができる。

別の態様では、本発明は、ＮＫＸ６．３の活性を低下させる作用物質を同定する方法であって、
（ａ）ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む調製物を、候補となる作用物質と接触させる工程と、
（ｂ）候補となる作用物質が、ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかを検出する工程と、
を含む、方法を提供する。

本発明の方法は、対象の食欲を抑制すること、満腹感を増大又は持続させること、対象による食物摂取を低減すること、及び／又は、対象における脂肪沈着を低減すること、ができる、作用物質を同定するための方法であり得る。

一実施形態では、ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む調製物は、ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む細胞を含む。

一実施形態では、細胞は筋細胞である。一実施形態では、細胞は脳細胞である。好ましい実施形態では、細胞は肝細胞である。

一実施形態では、本方法は、ＮＫＸ６．３の発現、好ましくは肝細胞における発現を低下させる作用物質を同定するためのものである。

一実施形態では、候補となる作用物質は天然産物であり、好ましくは植物に天然に存在する化合物である。

別の態様では、本発明は、脂肪蓄積の低減、除脂肪量の維持又は増加、脂質代謝の促進、体重維持の支援、食欲抑制、満腹感の増大又は持続、対象による食物摂取の低減、対象における脂肪沈着の低減、及び／又は対象における肥満の治療又は予防を行う作用物質を同定する方法における、ＮＫＸ６．３の使用、又はＮＫＸ６．３をコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。

別の態様では、本発明は、脂肪蓄積の低減、除脂肪量の維持若しくは増加、脂質代謝の促進、体重維持の支援、対象の食欲抑制、満腹感の増大若しくは持続、対象による食物摂取の低減、対象における脂肪沈着の低減、及び／又は対象における肥満の治療若しくは予防に使用するための薬剤を製造するための、ＮＫＸ６．３の活性を低下させることができる作用物質の使用を提供する。

一実施形態では、脂質代謝の促進は、トリアシルグリセロールレベルの低下によって推測される。

別の態様では、本発明は、ＮＫＸ６．３の発現を低下させる作用物質を同定する方法であって、
（ａ）細胞、好ましくは、ＮＫＸ６．３を発現する細胞を、候補となる作用物質と接触させる工程と、
（ｂ）候補となる作用物質がＮＫＸ６．３の発現を低下させるかを検出する工程と、
を含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、１つ以上の食事介入を対象に適用することによる脂肪蓄積の低減度、及び／又は１つ以上の食事介入を対象に適用することによる除脂肪量の維持度若しくは増加度、を予測するための方法を提供し；この方法は、ＮＫＸ６．３に遺伝的に関連した１つ以上の多型位置において、対象のヌクレオチド配列を決定することを含む。

別の態様では、本発明は、１つ以上の食事介入を対象に適用することによって達成可能な減量度、及び／又は１つ以上の食事介入を対象に適用することによる減量維持度、を予測するための方法を提供し；この方法は、ＮＫＸ６．３に遺伝的に関連した１つ以上の多型位置において、対象のヌクレオチド配列を決定することを含む。

別の態様では、本発明は、１つ以上の食事介入を対象に適用することによって達成可能な、脂肪量に対する除脂肪量の比率の増加度、及び／又は１つ以上の食事介入を対象に適用することによるトリグリセリドレベルの低下度を予測するための方法を提供し；この方法は、ＮＫＸ６．３に遺伝的に関連した１つ以上の多型位置において、対象のヌクレオチド配列を決定することを含む。

一実施形態において、食事介入は低カロリー食療法である。

一実施形態では、低カロリー食は、約６００〜約１２００ｋｃａｌ／日のカロリー摂取量を含む。

一実施形態では、低カロリー食は、少なくとも１種のダイエット食品の投与を含む。

一実施形態では、本方法は、ＮＫＸ６．３に遺伝的に関連した１つ以上の多型位置における対象のヌクレオチドの決定と、対象の１つ以上の人体計測値及び／又は生活習慣の特徴とを組み合わせることを更に含む。

一実施形態では、人体計測値は、性別、体重、身長、年齢、体脂肪組成、及び体格指数からなる群から選択され、生活習慣の特徴は、対象が喫煙者又は非喫煙者のいずれであるかである。

本発明はまた、対象の１つ以上の食事介入を最適化するための方法であって、本発明の方法により対象が達成可能な（ｉ）脂肪蓄積の低減度、及び／又は（ｉｉ）除脂肪量の維持度若しくは増加度を予測することと、該食事介入を対象に適用することと、を含む、方法も提供する。

別の態様では、本発明は、対象の生活習慣の改善を選択するための方法であって、
ａ．本発明による方法を実行する工程と、
ｂ．工程（ａ）で予測される減量度に基づいて、生活習慣における適切な改善を選択する工程と、
を含む、方法を提供する。

別の態様では、本発明は、減量のための低カロリー食の一部として使用するためのダイエット食品を提供し、このダイエット食品は、本発明の方法によって、ある度合いの（ｉ）脂肪蓄積の低減、及び／又は（ｉｉ）除脂肪量の維持若しくは増加を達成すると予測される対象に投与される。

別の態様では、本発明は、肥満又は肥満関連疾患の治療に使用するためのダイエット食品を提供し、このダイエット食品は、本発明の方法によって、ある度合いの（ｉ）脂肪蓄積の低減、及び／又は（ｉｉ）除脂肪量の維持若しくは増加を達成すると予測される対象に投与される。

別の態様では、本発明は、減量のための低カロリー食におけるダイエット食品の使用を提供し、このダイエット食品は、本発明の方法によって、ある度合いの（ｉ）脂肪蓄積の低減、及び／又は（ｉｉ）除脂肪量の維持若しくは増加を達成すると予測される対象に投与される。

別の態様では、本発明は、１つ以上の食事介入を対象に適用することによる脂肪蓄積の低減度の予測、及び／又は１つ以上の食事介入後の除脂肪量の維持度若しくは増加度の予測、に使用するための、ＮＫＸ６．３に遺伝的に関連した多型位置を検出することができる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを提供する。

別の態様では、本発明は、１つ以上の食事介入を対象に適用することによって達成可能な、脂肪量に対する除脂肪量の比率の増加度の予測、及び／又は１つ以上の食事介入を対象に適用することによるトリグリセリドレベルの低下度の予測において使用するための、ＮＫＸ６．３に遺伝的に関連した多型位置を検出することができる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを提供する。

別の態様では、本発明は、本発明による２つ以上の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー及び／又は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む、診断キットを提供する。

ＮＫＸ６．３（例えばＳＮＰ）に遺伝的に関連した多型位置（複数可）は、ＮＫＸ６．３遺伝子座から２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、１キロベース（ｋｂ）未満に物理的に位置してもよい。ＬＤ値、ｒ^２が４０％超である任意のＳＮＰもまた、遺伝的に関連しているものと考えることができる。

８番染色体上のＮＫＸ６．３遺伝子の領域を同定するマンハッタンプロットである。多様体の位置がＸ軸上に示され、統計的有意性（−ｌｏｇ_１０ｐ値）がＹ軸上に示される。各点は多様体に対応する。遺伝子の位置は下側のパネルに示す。上側のパネル内のピーク線（右側の第２のＹ軸）は組換え率（メガ塩基当たりのセンチモルガン）を示す。最も関係のある多様体を、ダイヤモンド形状及びその染色体座標で示す。ＨＧＴＸの全身性ＲＮＡｉノックダウンは、ショウジョウバエのトリグリセリドを低減させる。パネルＡ及びＢは、２つの別個のＲＮＡｉヘアピンを使用した全身性ノックダウンによる代謝効果を示す。ＨＧＴＸの成体誘導型ＲＮＡｉノックダウンは、トリグリセリドの有意な低減おいて同様の代謝効果を示す。ＨＧＴＸのｍＲＮＡ発現は、ＨＧＴＸ誘導型の全身性ＲＮＡｉハエにおいて６０％低減される。インスリン様ペプチド３のｍＲＮＡレベルに対する効果（ＨＧＴＸ誘導型全身性ＲＮＡｉハエにおけるレベルの低減）。脂肪体（Ｐｐｌ−Ｇａｌ４）、筋肉（Ｍｅｆ２−Ｇａｌ４）、脳（ｎＳｙｂ−Ｇａｌ４）、及び肝臓／扁桃細胞（Ｏｅｎｏ−Ｇａｌ４）における組織特異的ＨＴＧＸＲＮＡｉノックダウンは、扁桃細胞特異的な代謝表現型を示す。全ての図で、データは、平均±ＳＥＭとして表される。灰色のバーは、野生型の親ハエ（アクチン−Ｇａｌ４／＋及びＵＡＳ−ＨＧＴＸ／＋）のデータを示し、黒色のバーは、ＲＮＡｉノックダウンしたハエ（（アクチン−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−ＨＧＴＸ）の対応のないｔ検定のデータを示す。^＊は、ｐ＜０．０５；^＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．は、有意ではないことを意味する。

本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的、すなわちオープンエンドであり、かつ追加の、列挙されていない構成、要素、又は工程を除外しない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄｏｆ）」はまた、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」を含む。

ＮＫＸ６．３
ホメオドメインタンパク質のＮＫＸファミリーは、多数の発達プロセスを制御する。ＮＫＸ６−３を含むＮＫＸ６サブファミリーのメンバーは、中枢神経系（ＣＮＳ）、胃腸管、及び膵臓の発達に関与する（Ａｌａｎｅｎｔａｌｏｅｔａｌ．ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰａｔｔｅｒｎｓ（２００６））。

ＮＫＸ６．３は、発生中のマウスの後脳及び腸で発現されることが判明している（Ｎｅｌｓｏｎｅｔａｌ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＣｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００５））。

ＮＫＸ６．３は、Ｗｎｔ／β−カテニン及びＲｈｏ−ＧＴＰａｓｅ経路関連遺伝子の特定のプロモーター領域に直接結合して、がん細胞の遊走及び浸潤の阻害をもたらす転写因子である（Ｙｏｏｎｅｔａｌ．ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ（２０１７））。その発現は、胃がんの進行を調節することが判明している（Ｙｏｏｎｅｔａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１５），Ｙｏｏｎｅｔａｌ．ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ（２０１７））。

ショウジョウバエでは、ＮＫＸ６．３オルソログはＨＧＴＸ（以前はＮｋ６として知られていた）である（Ｕｈｌｅｒｅｔａｌ．ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００２））。

一実施形態では、ＮＫＸ６．３はヒトＮＫＸ６．３である。

ＮＫＸ６．３のアミノ酸配列の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿６８９７８１．１で寄託された配列である。

ＮＫＸ６．３のアミノ酸配列の例は次のものである：
MQQGQLAPGSRLCSGPWGLPELQPAAPSSSAAQLPWGESWGEEADTPACLSASGVWFQNRRTKWRKKSALEPSSSTPRAPGGAGAGAGGDRAPSENEDDEYNKPLDPDSDDEKIRLLLRKHRAAFSVLSLGAHSV（配列番号１）

ＮＫＸ６．３をコードするヌクレオチド配列の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１５２５６８．３で寄託された配列である。

ＮＫＸ６．３をコードするヌクレオチド配列の例は次のものである：
AAGGATGCAGCAGGGGCAGCTGGCACCTGGGTCTAGGCTTTGCTCAGGGCCCTGGGGCCTCCCCGAGCTCCAACCCGCTGCGCCCTCCTCATCAGCCGCTCAGCTGCCCTGGGGCGAGAGCTGGGGGGAAGAAGCAGACACTCCTGCATGTCTTTCTGCTTCTGGGGTGTGGTTCCAGAACCGCAGGACCAAGTGGCGGAAGAAGAGCGCCCTGGAGCCCTCGTCCTCCACGCCCCGGGCCCCGGGCGGCGCGGGTGCAGGCGCAGGCGGGGACCGCGCACCCTCGGAGAACGAGGACGACGAGTACAACAAGCCGCTGGACCCCGACTCGGACGACGAGAAGATCCGCCTGCTGCTGCGCAAGCACCGCGCCGCCTTCTCGGTGCTCAGCCTGGGAGCGCACAGCGTCTGACGCCCGCCGTCCAGGCCCGGGATCCTGGCTGCAGCCTGCGGGGGGACGCCGAGGAGCCTACCTTCCCCTCCCCTTCCCCACGCTCCTGGGGGCGCAGGGACTGAGTCTTTCTTTGGATGAGGGGCGCGTGGAGGAGGAGCAGCAGGTGCAGGGGAGGAGGAGGGGAGGCGGGGGAGGAGGAGGAAAAGGAGGGAAAGGGGACAGGCATCCTAGCTAAGGGAGGAGGAGGCCAGGAGGGAGGCACAGCACTCCTGAGACCTGGAAGCCGCTGCCCCTTGCACCTCCTCGGGCCTCGCCTGCCAGTTCTGCAGATTCACAAGTGGACAGAGGACTAAAATGACCAGGCTCTGCAGCCAAGAAACTGGCTGTGGGGTCCCAGACATGCCACTGTGATCCAGCTGTTGGGGCGGGGGGAGTGGGCAGGACTTCCCAGGGAGGGAGGCAGCTGGCTGGGGAGTCAGAAGTCCAGAGTCTTGGGCCCCAAGCCAGCTGCTGGCTGCAGAAGAAAAGACAGGTGAGTGGCCAGGTGCACTCCTCAGACCTGTGCACAGGAAGGGTCCCACTGGAGGGGCCAGAGCTGAGCACCTAACCCAGGCTGCAGGAAATCTGCCTCCAGGAGGGGAAGTGGGACATCCCAGTGGAGAAAAAATGCCCCTGACACTGCAGGATGACGGCCCCTGAGCTGCGGAAATCCCCCTGGCCTCCTTTCTCCGATTTACCCTCAGGGTCAATACCTCTGAGACCGCTGTGCCCTCCTCATCCTGACAGCCGGGGAAAAGGGGAGGGTGCAGGGAGAGGGGAGGCGGGGACGGTGTGCCCAAGGGCCACCCACCTGGGCATCATTTGGTGCTGATATAAGGACAGGCCCACCCAGAGAGAAAAAGCATCCCACCTGGGGAGGAAAGGAAGGGCTGGGAAAGACCCCAGAACGGCACCCCTCCAACAAGGCAGGAAGGGAGAAGGACAGCCCCTCCGGCTGGGTGGAGGATGCCAGGAAGGGGCTGAACCACGGCCTGCTGGGAATCACGGCCCTTCCTTTCCTCAGATCGCCTTGCGGCCTGGCACTGGAGCTGGTGCTGACAGGGACGCTGGCCAACAGGGTGGTATTTTTCACCCGGGTGATCTGAGCTGCTGGCAGGTAGGGGGTGGGCTGGGGGAGGCGGGTGAGGGCTGGTCTTAGATAGGAATGCAGCCCAGAAGGGACCAAGCACTTGCCCATCCTCACTGGCTTTCAAAAAATAAACAGTAAAAATAAAAGTCCCATGAACCTT（配列番号２）

一実施形態では、ＮＫＸ６．３は、配列番号１に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、該アミノ酸配列は、配列番号１によって表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。

一実施形態では、ＮＫＸ６．３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、該ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、配列番号１によって表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。

一実施形態では、ＮＫＸ６．３をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、該アミノ酸配列は、配列番号１によって表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持する。

減量及び体重維持
本明細書で使用される場合、用語「減量」は、体重（例えば、キログラム）、体格指数（ｋｇ／ｍ^２）、ウェスト・ヒップ比（例えば、センチメートル）、体脂肪量（例えば、キログラム）、殿囲（例えば、センチメートル）、又は腹囲（例えば、センチメートル）などのパラメータの減少を意味し得る。

減量は、介入（例えば、食事療法及び／又は運動療法）の開始時のパラメータの値から介入の終了時の上述のパラメータのうちの１つ以上の値を差し引くことによって計算され得る。

減量度は、上述の体重の表現型パラメータ（例えば、対象の体重（例えば、キログラム）又は体格指数（ｋｇ／ｍ^２）における変化率）のうちの１つの変化率として表現され得る。例えば、対象は、その初期体重の少なくとも１０％、その初期体重の少なくとも８％、又はその初期体重の少なくとも５％を減じ得る。単に一例として、対象は、その初期体重の５〜１０％を減じ得る。

一実施形態では、初期体重の少なくとも１０％の減量は、肥満関連の併存症のリスクの大幅な低下をもたらす。

本明細書で使用される場合、用語「体重維持」は、体重（例えば、キログラム）、体格指数（ｋｇ／ｍ^２）、ウェスト・ヒップ比（例えば、センチメートル）、体脂肪量（例えば、キログラム）、殿囲（例えば、センチメートル）、又は腹囲（例えば、センチメートル）などのパラメータにおける維持を意味し得る。体重維持は、例えば、介入（例えば、食事療法及び／又は運動療法）後に減量体重を維持することを意味し得る。

体重維持度は、ある期間にわたって上述のパラメータのうちの１つ以上の変化を測定することによって計算され得る。期間は、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０週であり得る。

本発明の作用物質によって支援される体重維持は、例えば、ある期間にわたって上述のパラメータのうちの１つ以上において、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満の変化（例えば、増加）をもたらし得る。

体重維持度は、減量達成後の期間中に再増加した体重として表すことができ、例えば、減量達成中の減量に関するパーセンテージとして表すことができる。

本発明の作用物質によって支援される体重維持は、作用物質の投与後の対象の食欲の抑制によってもたらされ得る。したがって、対象は、本発明の作用物質の非存在下での食欲と比較して、食欲が低減され得る。

本発明の作用物質によって支援される体重維持は、作用物質の投与後の対象の食欲の制御によってもたらされ得る。したがって、対象は、彼らの食欲の制御を維持することができ、したがって、例えば減量介入の期間後に、その体重を維持することができる。

特に、本発明の作用物質は、減量介入（例えば、食事療法又は運動療法）の期間中及び／又は後に、食欲抑制又は制御により体重維持を支援し得る。

一態様では、本発明は、例えば減量期間後の、健康な身体組成を維持するための本発明の作用物質の非治療的使用を提供する。

肥満
本明細書で使用する場合、用語「過体重」は、成人に関して、体格指数（ＢＭＩ）が２５〜３０であるものとして定義される。

本明細書で使用する場合、用語「体格指数」は、体重のｋｇ値を身長のメートル値の二乗で除算した比率を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「肥満」は、動物、特にヒト及び他の哺乳類の脂肪組織に蓄えられた自然エネルギーが、一定の健康状態又は死亡率の増加に関係する点まで増加した状態を意味する。本明細書で使用する場合、用語「肥満」は、成人のヒトに関して、３０を超えるＢＭＩを有するものとして定義される。

本明細書で使用する場合、用語「正常体重」は、成人に関して、１８．５〜２５のＢＭＩを有するものとして定義されるが、本明細書で使用する場合、用語「低体重」は、１８．５未満のＢＭＩとして定義され得る。

肥満は、世界中の多くの地域で蔓延している慢性的な代謝疾患であり、２型糖尿病、循環器疾患、脂質代謝異常、及びある種のがんなどといった深刻な併存症の主要なリスク因子である（ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎ．Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ（２０００）８９４：ｉ−ｘｉｉ、１−２５３）。

本明細書で使用する場合、用語「肥満関連疾患」は、肥満個体が発症するリスクが高い任意の状態を意味する。肥満関連疾患としては、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、脳卒中、高コレステロール、心血管疾患、インスリン抵抗性、冠動脈心疾患、メタボリックシンドローム、高血圧及び脂肪肝が挙げられる。

スクリーニング方法
本発明は、ＮＫＸ６．３の活性を低下させることができる作用物質を提供し、加えて、このような作用物質を同定するための方法を提供する。

本発明の作用物質は、定性的結果又は定量的結果のいずれかを提供する方法によって同定され得る。更に、このような方法を使用して、本発明の作用物質の特性評価並びに同定ができる。

候補となる作用物質は、対象となる可能性のある任意の作用物質、例えばペプチド、ポリペプチド（例えば抗体）、核酸、又は小分子であり得る。好ましくは、候補となる作用物質は、治療目的に関し可能性がある化合物又は混合物である。好ましくは、候補となる作用物質は、哺乳動物、特にヒトにとって低毒性のものである。いくつかの実施形態では、候補となる作用物質は、植物又は動物抽出物などの天然化合物又は化合物の混合物を含む栄養剤及び／又は食品成分を含み得る。

候補となる作用物質は、作用物質のライブラリ、例えば、コンビナトリアル化学により作製されるライブラリ又はファージディスプレイライブラリの一部を形成し得る。一実施形態では、候補となる作用物質は、植物生理活性分子のライブラリの一部を形成する。

ＮＫＸ６．３活性
タンパク質、例えば酵素の活性を低下させる候補となる作用物質の性能は、ＩＣ５０値で表すことができる。ＩＣ５０は、タンパク質の活性を５０％低下（例えば、酵素活性を５０％低下）させるのに必要とされる作用物質の濃度である。ＩＣ５０値の計算は、当該技術分野において周知である。

好ましくは、本発明の作用物質は、ＮＫＸ６．３の阻害について、１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、例えば１μＭ未満、１００ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満のＩＣ５０値を有する。

ＮＫＸ６．３活性を測定するための技術は、細胞から分離したＮＫＸ６．３に適用することができる。組換え技術を用いて、ＮＫＸ６．３を発現させてもよい。好ましくは、ＮＫＸ６．３は精製されている。

ＮＫＸ６．３の結合
本発明はまた、ＮＫＸ６．３に結合することができる作用物質を同定する方法、あるいは、又はそれに加えて、このような結合を特性評価する方法も提供する。例えば、この方法は、絶対的な若しくは相対的な結合親和性、並びに／又は結合のエンタルピー及びエントロピーの測定を可能にし得る。結合親和性は、平衡解離（Ｋ_ｄ）定数又は会合（Ｋ_ａ）定数で表すことができる。

候補となる作用物質とタンパク質との間の結合を同定するための、多くのアッセイ法が当該技術分野において既知である。使用されるアッセイ法は、好ましくは、候補となる作用物質の自動スクリーニング及び／又はハイスループットスクリーニングに適したものである。アッセイは、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、樹脂、又は同様のものなどの使い捨て固体支持体上で実施され得る。

例えば、固体支持体、例えば、マイクロビーズ、樹脂、マイクロタイタープレート、又はアレイ上に標的ＮＫＸ６．３を固定できる。次いで、この固定した標的タンパク質に候補となる作用物質を接触させてもよい。任意に、洗浄手順を適用して、結合が弱い作用物質又は非特異的に結合している作用物質を除去してもよい。次いで、標的タンパク質に結合する何らかの作用物質を検出し、同定することができる。結合した作用物質の検出を容易にするために、候補となる作用物質を、容易に検出可能なマーカーで標識することもできる。マーカーは、例えば、放射性標識、酵素標識、抗体標識、蛍光標識、粒子（例えば、ラテックス又は金）標識、又は同様のものを含み得る。

あるいは、上記の手順を逆転させてもよく、候補となる作用物質を固定してもよく、標的ＮＫＸ６．３を上記固定した作用物質と接触させてもよい。任意に、洗浄手順を適用して、弱く結合した標的タンパク質又は非特異的に結合した標的タンパク質を除去してもよい。次いで、ＮＫＸ６．３が結合する何らかの作用物質を検出し、同定することができる。結合の検出を容易にするために、ＮＫＸ６．３を、上記のように容易に検出可能なマーカーで標識してもよい。

上記のアッセイに加えて、他の好適なアッセイ法が当該技術分野において既知である。このような手法の例としては、放射アッセイ、蛍光アッセイ、ＥＬＩＳＡ、蛍光偏光、蛍光異方性、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などが挙げられる。これらのアッセイは、ＮＫＸ６．３に結合する作用物質を同定するために適用され得る。実際、これらの手法の多くを自動化するためのプラットフォームは、ハイスループットスクリーニングを容易にすることが当該技術分野において広く知られている。

２つ以上のアッセイ法を使用して、候補となる作用物質のＮＫＸ６．３に対する結合について詳細な理解を提供することができる。例えば、定性的な結合情報を提供するアッセイを、本方法における第１ステップとして使用することができ、続いて、定量的結合データ及び／又は標的タンパク質の活性に対する効果についてのデータを提供するために、異なる技術を使用して更なるアッセイを行うことができる。

競合結合試験を実施するために、上記のアッセイ法を適用してもよい。例えば、これらの手法は、候補となる作用物質の存在下で、基質又は補因子へのタンパク質の結合を分析するのにも同様に好適である。したがって、タンパク質とその基質又は補因子との間の結合を調節し、これによりタンパク質の活性に影響を及ぼす作用物質をスクリーニング及び同定するために、上記手法を使用することが可能である。

好ましくは、本発明の作用物質は、高い親和性で結合するであろう。例えば、本発明の作用物質は、１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、例えば１μＭ未満、１００ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満のＫ_ｄでＮＫＸ６．３に結合する。

結合親和性は、当該技術分野において既知の標準的な手法、例えば、表面プラズモン共鳴、及びＥＬＩＳＡなど（例えば上記のようなもの）を使用して測定することができ、解離（Ｋ_ｄ）定数又は会合（Ｋ_ａ）定数のいずれかで定量することができる。

ｉｎｓｉｌｉｃｏでの構造に指南されたスクリーニングなどのバイオインフォマティクスに基づくアプローチもまた、本発明の作用物質を同定するために使用され得る。

ＮＫＸ６．３レベル
本発明は、ＮＫＸ６．３レベルを低下させるための作用物質を提供する。ＮＫＸ６．３レベルは、細胞又は生物におけるタンパク質の発現レベルと同等であり得る。タンパク質レベルは、例えば、タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルの分析によって、直接又は間接的に分析され得る。

ＮＫＸ６．３の発現を分析するための方法は、タンパク質のレベルに対する、候補となる作用物質の効果をスクリーニングするために、本発明で使用され得る。

タンパク質の発現レベルを決定するための多くの手法が当該技術分野において既知である。これらの手法を適用して、ＮＫＸ６．３の発現レベルに対する、候補となる作用物質の効果が試験され得る。使用される手法は、好ましくは、候補となる作用物質の自動スクリーニング及び／又はハイスループットスクリーニングに適したものである。

例えば、レポーター部分に操作可能に連結されたＮＫＸ６．３をコードするポリヌクレオチドを保有する細胞を使用して、スクリーニングを実施してもよい。レポーター部分は、内因性ＮＫＸ６．３コード遺伝子に操作可能に連結されてもよい。あるいは、細胞外で生成された、レポーター部分に操作可能に連結されたＮＫＸ６．３のコピーを、細胞に挿入してもよい。この実施形態では、天然のＮＫＸ６．３発現を欠損するように細胞を遺伝子操作することができる。好適なレポーター部分としては、蛍光標識、例えば、緑、黄、チェリー、シアン、又はオレンジ蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質が挙げられる。

本明細書で使用する場合、用語「操作可能に連結された」は、記載される構成要素が、意図された様式での機能を可能にする関係にあることを意味する。

このような細胞は、候補となる作用物質と接触させることができ、ＮＫＸ６．３の発現レベルは、当該細胞におけるレポーター部分の発現レベルを分析することによって監視することができる。蛍光レポーター部分は、当該技術分野において既知の多くの手法、例えばフローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）及び蛍光顕微鏡法によって分析することができる。ＮＫＸ６．３の発現レベルは、候補となる作用物質との接触前後で比較することができる。あるいは、ＮＫＸ６．３の発現レベルは、候補となる作用物質と接触した細胞と対照細胞との間で比較してもよい。

タンパク質、例えばＮＫＸ６．３の発現を分析するために、他の方法を使用してもよい。タンパク質発現は、直接分析され得る。例えば、発現は、クマシー染色又は銀染色による可視化を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析などの方法を使用して定量的に分析することができる。あるいは、発現は、タンパク質生成物に結合する抗体プローブによるウエスタンブロット法又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、定量的に分析することができる。上記のように、レポーター部分で標識されたＮＫＸ６．３もまた、これらの方法で使用することができる。あるいは、タンパク質発現は、例えば、細胞内で転写されるタンパク質に相当するｍＲＮＡの量を調査することによって間接的に分析されてもよい。これは、定量的逆転写ＰＣＲ及びノーザンブロットなどの方法を使用して達成することができる。

同様の手法を、レプチンタンパク質の発現の分析に使用することができる。

作用物質
本発明は、ＮＫＸ６．３の活性を低下させることができる作用物質を提供し、加えて、このような作用物質を同定するための方法を提供する。

本発明の作用物質は、例えば、ペプチド、ポリペプチド（例えば抗体）、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡ）又は小分子であり得る。好ましくは、作用物質は、哺乳動物、特にヒトにとって低毒性である。いくつかの実施形態では、作用物質は、植物又は動物抽出物などの天然化合物又は化合物の混合物を含む栄養剤及び／又は食品成分を含んでもよい。

ＮＫＸ６．３の活性を低下させるか又はさもなければ影響を及ぼす作用物質の例としては、表１に記載の作用物質が挙げられる。

表１．ＮＫＸ６．３の活性を低下させる、又はさもなければ影響を及ぼす作用物質。（ＤａｖｉｓＡＰ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＴｏｘｉｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓＤａｔａｂａｓｅ：ｕｐｄａｔｅ２０１７．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０１６Ｓｅｐ１９）

一実施形態では、作用物質は、一般に安全であるとみなされる（ＧＲＡＳ）。

一実施形態では、作用物質は、経口投与される場合、５０％以上の生物学的利用能を有する。

本発明による使用のための作用物質は、表１から選択され得る。

一実施形態では、作用物質はアセトアミノフェンである。一実施形態では、作用物質はビスフェノールＡである。一実施形態では、作用物質はビス（トリ−ｎ−ブチルスズ）オキシドである。一実施形態では、作用物質はカリクリンＡである。一実施形態では、作用物質はプロピルチオウラシルである。

本発明による使用のための作用物質は、例えば、塩又はエステル、特に薬剤として許容される塩又はエステルとして存在し得る。

ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ
ＮＫＸ６．３の発現は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を用いて調節することができる。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって介在される転写後遺伝子サイレンシングは、外来遺伝子の発現を制御するために保存されている細胞防御機構である。トランスポゾン又はウイルスなどの配列のランダムな組み込みは、相同な一本鎖ｍＲＮＡ又はウイルスゲノムＲＮＡの配列特異的な分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を生じさせると考えられる。サイレンシング効果は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている（Ｒａｌｐｈｅｔａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１１：４２９−４３３）。ＲＮＡｉの機序は、長いｄｓＲＮＡを約２１〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡ二本鎖にプロセシングすることを含む。これらの産物は、ｍＲＮＡの分解の配列特異的メディエータである、低干渉又はサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。分化した哺乳類細胞において、３０ｂｐより長いｄｓＲＮＡは、タンパク質合成の停止及び非特異的ｍＲＮＡ分解をもたらすインターフェロン応答を活性化することが見出されている（Ｓｔａｒｋｅｔａｌ．（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：２２７−６４）。しかしながら、この応答を、２１ｎｔのｓｉＲＮＡ二本鎖を使用することによって回避して（Ｅｌｂａｓｈｉｒｅｔａｌ．（２００１）ＥＭＢＯＪ．２０：６８７７−８８；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒｅｔａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９３：８３４−８）、培養哺乳動物細胞での遺伝子機能の分析を可能にすることができる。

ｓｈＲＮＡは、小さなループ配列によって隔てられた短い逆方向反復ＲＮＡからなる。これらは、細胞の機序によって１９〜２２ｎｔのｓｉＲＮＡに迅速にプロセシングされ、それによって標的遺伝子発現が抑制される。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合することにより標的ｍＲＮＡの翻訳を効果的に減少させることができる、小さな（長さ２２〜２５ヌクレオチドの）ノンコーディングＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、生物において天然に産生される小さなＲＮＡからなる非常に大きな群であり、そのうちの少なくともいくつかは標的遺伝子の発現を調節する。マイクロＲＮＡファミリーの基本構成要素は、ｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４である。ｌｅｔ−７遺伝子は、虫の発生の間、内因性タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する、高度に保存された小さなＲＮＡ分子をコードする。活性のあるＲＮＡ分子は、まず約７０ｎｔの前駆体として転写され、この前駆体は、転写後に約２１ｎｔの成熟型へとプロセシングされる。ｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４はいずれも、Ｄｉｃｅｒ酵素によってそれらの成熟型にプロセシングされるヘアピンＲＮＡ前駆体として転写される。

アンチセンスの概念は、短くて場合によっては修飾されているＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を、細胞内で選択的にメッセンジャーＲＮＡに結合させ、かかるメッセンジャーＲＮＡにコードされているタンパク質の合成を防止するというものである。

標的タンパク質の発現を調節するためのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡの設計方法、並びにこれらの作用物質を対象となる細胞に送達する方法は、当該技術分野において周知である。更に、例えば組織特異的プロモーターを使用することによって、生物中の特定の細胞型におけるタンパク質の発現を特異的に調節する（例えば、低下させる）ための方法が、当該技術分野において周知である。

抗体
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、選択された標的に結合することができる完全な抗体又は抗体断片を意味し、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）_２、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、改変抗体、例えば、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体及びヒト化抗体、並びにファージディスプレイ又は代替技術を用いて産生される人工的に選択された抗体が挙げられる。

加えて、本発明ではまた、典型的な抗体の代替物、例えば、「アビボディ」、「アビマー」、「アンチカリン」、「ナノボディ」、及び「ＤＡＲＰｉｎ」も使用され得る。

抗体の製造方法は、当業者に既知である。あるいは、抗体は、民間の供給元に由来するものでもよい。

ポリクローナル抗体が所望される場合、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、又はウマ）を免疫できる。既知の手順に従って、当該免疫動物から血清を回収し、処理することもできる。血清が他の抗原に対するポリクローナル抗体を含有する場合、ポリクローナル抗体は、免疫親和性クロマトグラフィによって精製され得る。ポリクローナル抗血清を製造及びプロセシングするための手法は、当該技術分野において既知である。

本発明で使用される抗原（例えば、タンパク質）に対するモノクローナル抗体は、当業者によって容易に産生され得る。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法は周知である。不死化抗体産生細胞株は、細胞融合によって、また、腫瘍形成性のＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、又はエプスタイン・バール・ウイルスによるトランスフェクションなどの他の手法によって作製することができる。抗原に対して産生されるモノクローナル抗体の集団は、様々な特性、例えば、アイソタイプ及びエピトープ親和性についてスクリーニングすることができる。

代替的な手法は、例えば、ファージが自身のコートの表面上に、多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するｓｃＦｖ断片を発現する、ファージディスプレイのライブラリをスクリーニングすることを含む。この手法は、当該技術分野において周知である。

抗原に対するモノクローナル及びポリクローナルいずれの抗体も、診断において特に有用であり、中和抗体は、受動免疫療法において有用である。モノクローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を産生するために使用され得る。抗イディオタイプ抗体は、防御が所望される感染病原体に関する抗原の「インターナルイメージ（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｍａｇｅ）」を有する免疫グロブリンである。

抗イディオタイプ抗体を産生するための手法は、当該技術分野において既知である。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、抗原の免疫病原性領域の解明に加えて、治療に有用であり得る。

ポリペプチド及びポリヌクレオチドの細胞への導入
本発明で使用するための作用物質は、例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチド及びポリペプチドはまた、本発明の方法又はスクリーニングアッセイの一環として細胞内へ導入することが必要な場合がある。

本発明がポリペプチドを使用する場合、細胞に直接ポリペプチドが投与されてよく（例えば、ポリペプチド自体が投与されてよい）、又は対象とする細胞においてポリペプチドの発現を可能にする条件下で、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、ポリペプチドが投与されてもよい。ポリヌクレオチドは、ベクターを使用して細胞に導入され得る。

ベクターは、ある環境から別の環境への対象物の移動を可能にする又は容易にするツールである。本発明によれば、及び一例として、組換え核酸法で使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（例えば、異種ｃＤＮＡセグメントなどの異種ＤＮＡセグメント）などの対象物を標的細胞に移動させることができる。ベクターは、細胞内で異種核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を維持する核酸断片を含むベクターの複製を促進する、又は核酸断片によってコードされるタンパク質の発現を促進する目的を果たし得る。ベクターは、非ウイルス又はウイルスであってもよい。組換え核酸法で使用されるベクターの例としては、プラスミド、染色体、人工染色体及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、例えば、そのままの（ｎａｋｅｄ）核酸（例えば、ＤＮＡ）であってもよい。最も単純な形態では、ベクターそのものが、目的のヌクレオチドであってもよい。

本発明で使用されるベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスベクターであり得、ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び任意にプロモーターのレギュレーターを含み得る。

本発明で使用されるポリヌクレオチドを含むベクターは、形質導入及びトランスフェクションなど、当該技術分野において既知の様々な手法を使用して細胞に導入することができる。例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、バキュロウイルス、及び単純ヘルペスウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターを用いた感染；核酸の直接注入、並びに遺伝子銃による形質転換など、この目的に好適ないくつかの手法が、当該技術分野で既知である。非ウイルス送達系としては、ＤＮＡトランスフェクション法が挙げられるが、これに限定されない。トランスフェクションは、非ウイルスベクターを使用して標的細胞に遺伝子を送達するプロセスを含む。

ポリペプチド又はポリヌクレオチドの移動は、物理的又は化学的に細胞膜を透過させ得る当該技術分野において既知の方法のいずれかによって実施され得る。ポリペプチドを細胞内に移動させるために、細胞膜透過ペプチドも使用され得る。

加えて、本発明は、遺伝子ターゲティングプロトコル、例えば、ＤＮＡ修飾剤の送達を用いてもよい。

ベクターは、発現ベクターであり得る。本明細書に記載される発現ベクターは、転写可能な配列を含有する核酸領域を含む。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡをコードする配列が、この定義に含まれる。

発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞によるコーディング配列の発現をもたらすことが可能であり、制御配列に操作可能に連結された、本発明で使用するためのポリヌクレオチドを含む。コーディング配列に「操作可能に連結される」調節配列は、制御配列に適した条件下でコーディング配列の発現が達成されるように連結される。例えば、制御配列によって指示される転写レベルを、より転写調節因子に応答したものにする追加の転写調節配列を付加することによって、制御配列が修飾されてもよい。

ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。これらは、一本鎖又は二本鎖であり得る。数多くの異なるポリヌクレオチドが、遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることが、当業者には理解されるであろう。加えて、本発明のポリペプチドを発現させる任意の具体的な宿主生物のコドン使用を反映するように、常法を用いて、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換をすることが、当業者に可能であることが理解されるべきである。

ポリヌクレオチドは、当該技術分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得る。このような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのｉｎｖｉｖｏ活性又は使用可能時間を向上させるために実施され得る。

ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、組換えにより、合成により、又は当業者に利用可能な任意の手段によって産生され得る。これらはまた、標準的な技術によってクローン化され得る。

より長いポリヌクレオチドは、一般的に、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を用いて、組換え手法を使用して産生される。この手法には、クローン化の対象とする標的配列に隣接する一対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチド）を作製することと、当該プライマーを、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ、例えば、動物又はヒト細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させることと、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施することと、（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することによって）増幅された断片を単離することと、増幅されたＤＮＡを回収することと、を含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡを好適なベクターにクローン化することができるように、好適な制限酵素認識部位を含有させて設計することができる。

タンパク質
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」は、単鎖ポリペプチド分子、加えて個々の構成ポリペプチドが共有結合又は非共有結合によって連結される複数のポリペプチドの複合体を含む。本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、モノマーがアミノ酸であり、当該モノマーがペプチド結合又はジスルフィド結合を介してともに連結している、ポリマーを意味する。

多様体、誘導体、類似体、相同体、及び断片
本明細書で言及される特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本発明は、多様体、誘導体、類似体、相同体、及びこれらの断片を包含する。

本発明の文脈において、任意の所与の配列の多様体は、対象とするポリペプチド又はポリヌクレオチドが、その内在的な機能のうちの少なくとも１つを保持するような方法で、特定配列の残基（アミノ酸残基又は核酸残基のいずれか）が修飾された配列である。多様体配列は、天然ポリペプチド又はポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、修飾、交換、及び／又は変異によって得ることができる。

本明細書で使用する場合、本発明のタンパク質又はポリペプチドに関し、用語「誘導体」は、得られるタンパク質又はポリペプチドがその内在的な機能のうちの少なくとも１つを保持するのであれば、配列から又は配列への１つ（又は１つ以上）のアミノ酸残基の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失及び／又は付加を含む。

本明細書で使用する場合、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関し、用語「類似体」は、任意の模倣化合物を含み、すなわち、当該化合物が模倣するポリペプチド又はポリヌクレオチドの内在的な機能のうちの少なくとも１つを有する化合物を含む。

典型的には、必要な活性又は能力を被修飾配列が保持するのであれば、アミノ酸置換が行われてもよく、例えば、１、２、又は３〜１０、又は２０個の置換が行われてもよい。アミノ酸置換は、非天然に生じる類似体の使用を含み得る。

本発明で使用されるタンパク質は、サイレントな変化をもたらし、結果として機能的に等価なタンパク質が得られる、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も含み得る。内在的な機能が保持されるという条件で、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性を基に、意図的なアミノ酸置換がなされ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に帯電したアミノ酸としてはリジン及びアルギニンが挙げられ、並びに帯電しておらず同様の親水性値をもつ極性頭部を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、及びチロシンが挙げられる。

保存的置換は、例えば、下表によりなされ得る。第２欄の同じブロックにおけるアミノ酸、及び好ましくは第３欄の同じ行内にあるアミノ酸は、互いに置換され得る。

本明細書で使用する場合、用語「相同体」は、野生型アミノ酸配列又は野生型ヌクレオチド配列と特定の相同性を有する対象物を意味する。用語「相同性」は、「同一性」と同一視可能である。

本文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、又は９７％、又は９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むものとみなされる。典型的には、相同体は、対象とするアミノ酸配列と同じ活性部位等を含み得る。相同性は、類似性（すなわち、類似する化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点で考慮することもできるが、本発明の文脈では、相同性を配列同一性の観点で表現することが好ましい。

本文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、又は９７％、又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むものとみなされる。相同性は、類似性の観点で考慮することもできるが、本発明の文脈では、相同性を配列同一性の観点で表現することが好ましい。

好ましくは、本明細書に記載の配列番号のうちのいずれか１つに対しある程度の同一性（％）を有する配列についての言及は、参照する配列番号の全長に対し記載の同一性（％）を有する配列を指すものである。

相同性比較は、目で行うこともでき、又はより一般的には、容易に利用できる配列比較プログラムを使用して実施できる。これらの市販のコンピュータプログラムにより、２つ以上の配列間の相同性（％）又は同一性（％）を計算することができる。

相同性（％）は、連続的な配列にわたって計算することができる。すなわち、一方の配列を他方の配列とアラインメントし、一方の配列中の各々のアミノ酸又はヌクレオチドを他方の配列中の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと一度に１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれている。典型的には、こうしたギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数に対してのみ行われる。

これは非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、アミノ酸又はヌクレオチド配列中の１箇所の挿入又は欠失を除き同一である配列のペアにおいて、それに後続する残基又はコドンがアラインメントから外れる場合があることを考慮していないため、グローバルアラインメントを実施する場合に、相同性（％）が大きく減少する可能性がある。そのため、ほとんどの配列比較法は、総合的な相同性スコアに過度にペナルティを適用せずに、考えられる挿入及び欠失を考慮に入れた最適アラインメントを生成するように設計されている。これは、局所相同性を最大にするように、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。

しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一のアミノ酸又はヌクレオチドに対して、２つの比較配列間の関係性がより高いことを反映している可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多数のギャップを有する配列アラインメントよりも高いスコアを達成するように、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てている。典型的に、ギャップの存在には比較的高いコストを課し、ギャップ中の後続するそれぞれの残基には小さなペナルティを課す、「アフィンギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。当然のことながら、ギャップペナルティが高いと、ギャップのより少ない最適化アラインメントが生成される。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｅｓｔｆｉｔパッケージを用いる場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップについては−１２であり、各伸長については−４である。

したがって、最大相同性（％）の算出には、まず、ギャップペナルティを考慮した最適アラインメントの生成が必要である。このようなアラインメントを実施するのに好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｅｓｔｆｉｔパッケージである（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２：３８７）。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（１９９９）同書１８章参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ式の比較ツールが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡとはいずれもオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．（１９９９）同書７−５８〜７−６０頁参照）。しかしながら、いくつかの用途については、ＧＣＧＢｅｓｔｆｉｔプログラムを使用するのが好ましい。ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと称する別のツールもまた、タンパク質とヌクレオチド配列との比較に使用できる（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７７（１）：１８７−８）。

最終的な相同性（％）を同一性の点から測定することができるが、アラインメントプロセスそのものは、典型的には、イエスかノーかのペア比較に基づいていない。むしろ、化学的類似性又は進化距離に基づいて各々のペアワイズ比較にスコアを割り当てる、スケール化された類似性スコア行列が通常使用される。一般的に使用されるこのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴ式プログラムのデフォルト行列）である。ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、通常、パブリックデフォルト値、又は提供される場合はカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザマニュアル参照）。いくつかの用途については、ＧＣＧパッケージ用のパブリックデフォルト値を用いることが、又は他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。

ソフトウェアにより最適アラインメントが生成されたら、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を算出することができる。典型的に、ソフトウェアは、配列比較の一部としてこれを行い、計算結果を生成する。

「断片」は、多様体でもあり、当該用語は、典型的には、機能的に又は例えばアッセイにおいてのいずれかで、対象となるポリペプチド又はポリヌクレオチドについて選択された領域を意味する。したがって、「断片」は、完全長のポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部分であるアミノ酸配列又は核酸配列を指す。

このような多様体は、部位特異的変異導入などの標準的な組換えＤＮＡ法を用い調製され得る。挿入がなされる場合、挿入部位のいずれかの側の天然に生じる配列に相当する５’及び３’隣接領域（flanking region）と合わせて挿入部位をコードしている、合成ＤＮＡが作製され得る。隣接領域は、適切な酵素（複数可）により配列が切断されて、合成ＤＮＡが切断部分にライゲートされ得るよう、天然に生じる配列中の部位に相当する適当な制限部位を含有し得る。次に、このＤＮＡを本発明により発現させて、コードされているタンパク質を作製する。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作について当該技術分野で既知の数多くの標準法について単に例示するものであり、その他の既知の手法も使用され得る。

コドン最適化
本発明で使用されるポリヌクレオチドは、コドンの最適化がなされ得る。コドン最適化は、国際公開第１９９９／４１３９７号及び同第２００１／７９５１８号に既に記載されている。細胞が異なると、特定のコドンの使用に相違がある。このコドンバイアスは、その細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量におけるバイアスに対応している。対応するｔＲＮＡの相対的存在量と一致するように調整されるように、配列中のコドンを変更することにより、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型で稀であることが分かっているコドンを意図的に選択することによって発現を低下させることが可能である。このように、翻訳度合いの追加的な制御が可能である。哺乳類細胞のコドン使用表は、他の多様な生物と同様に当業者に知られている。

治療方法
治療についての本明細書の全参照は、治癒的、緩和的、予防的治療を含む。哺乳類、特にヒトの治療が好ましい。ヒト及び動物の治療の両方が、本発明の範囲内である。

投与
本発明で使用される作用物質は単独で投与され得るが、特にヒトの治療法において、それらは一般的には医薬担体、賦形剤又は希釈剤との混合物で投与されるであろう。

いくつかの実施形態では、作用物質は栄養剤、食品添加物、又は食品成分であり、したがって好適な食品組成物に配合され得る。そのため、作用物質は、例えば食料品、飲料、栄養補助食品、機能性食品、栄養配合物又はペットフード製品の形態で投与され得る。

投与量
当業者は、本発明の作用物質について、過度の実験を行わずとも、対象への投与に適切な投与量を容易に決定することができる。典型的には、医師が個々の患者に最も好適な実際の投与量を決定し、その投与量は、用いる具体的な化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用期間、齢、体重、健康状態、性別、食生活、投与の方法及び時期、排出率、併用する薬剤、特定の状態についての重症度、並びに個々に受けている治療を含む様々な因子によるであろう。当然ではあるが、より高い又はより低い投与量範囲が優れている個別の場合があり得、そのような場合も本発明の範囲内にある。

対象
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒト又はヒト以外の動物のいずれかを意味する。

ヒト以外の動物の例としては、脊椎動物、例えば、ヒト以外の霊長類（特に高等霊長類）、イヌ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、又はモルモット）、ブタ及びネコなどの哺乳類が挙げられる。ヒト以外の動物は、コンパニオンアニマルであってもよい。

好ましくは、対象は、ヒトである。

当業者は、開示される本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明の全ての特徴を組み合わせることができることを理解されたい。

本発明の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例によってこれより記述する。

本発明の実施は、特に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は文献で説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９５ａｎｄｐｅｒｉｏｄｉｃｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３ａｎｄ１６，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｒｏｅ，Ｂ．，Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．ａｎｄＫａｈｎ，Ａ．（１９９６）ＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＥｓｓｅｎｔｉａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄＭｃＧｅｅ，Ｊ．Ｏ’Ｄ．（１９９０）ＩｎＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ、並びに、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄＤａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．（１９９２）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓＰａｒｔＡ：ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｈｙｓｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＮＡ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓを参照されたい。これらの一般的なテキストの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１：ＮＫＸ６．３遺伝子多様体と減量との関連性
本研究は、Ｄｉｏｇｅｎｅｓ減量介入データ及びＯｐｔｉｆａｓｔ９００で実施された遺伝的関連性についてのカナダのグループよる試験に関する。

このＤｉｏｇｅｎｅｓによる研究は、汎ヨーロッパの、ランダム化し、制御した食事介入研究であり、８箇所のヨーロッパセンターにおいて、肥満及び過体重家族における減量及び体重維持に対する食事タンパク質及び血糖指数の効果を詳しく調べている（Ｌａｒｓｅｎｅｔａｌ．（２００９）ＯｂｅｓｉｔｙＲｅｖ．１１：７６−９１）。要約すると、Ｄｉｏｇｅｎｅｓ研究には、低カロリー食（ＬＣＤ）を８週間継続した過体重／肥満対象が含まれた。ＬＣＤは、食事代替食品（Ｍｏｄｉｆａｓｔ，ＮｕｔｒｉｔｉｏｎｅｔＳａｎｔｅＦｒａｎｃｅ）の使用により１日当たり８００ｋｃａｌを提供した。

カナダのグループによるＯｐｔｉｆａｓｔ９００での研究は、カナダでのみ（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）入手可能な製品Ｏｐｔｉｆａｓｔ９００（ＮｅｓｔｌｅＨｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からなる６〜１２週間の食事代替療法を完了した、体重管理クリニックに登録された患者からなった。

この研究を、体格指数（ＢＭＩ）変化に関連するタンパク質に着目し、イルミナチップ上で遺伝子型を同定された共通の多様体と、介入中のタンパク質発現の変化との間の関連性を試験した第１の研究とする。

遺伝子型データは、２６４，９０９のタグＳＮＰマーカー及び２４４，５９３のエクソームフォーカスマーカーを用いＨｕｍａｎＣｏｒｅＥｘｏｍｅ−１２ｖ１．１（ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ）を使用して生成した。製造元の指示によるＩｎｆｉｎｉｕｍ（登録商標）ＨＤＡｓｓａｙＵｌｔｒａ，Ｍａｎｕａｌに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）プラットフォームで処理した。遺伝子型は、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によってコールした。品質管理手順は、ＧｅｎＡＢＥＬパッケージ（Ａｕｌｃｈｅｎｋｏ，Ｙ．Ｓ．，Ｒｉｐｋｅ，Ｓ．，Ｉｓａａｃｓ，Ａ．＆ｖａｎＤｕｉｊｎ，Ｃ．Ｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．Ｏｘｆ．Ｅｎｇｌ．２３，１２９４−１２９６（２００７）の推奨に従い、コールレート９５％未満、ハーディ・ワインベルグ平衡からの逸脱（ＦＤＲ２０％未満）、１％未満の低マイナーアレル頻度に該当するＳＮＰを除外した。対象は、低コールレート（９５％未満）、異常に高い常染色体のヘテロ接合性（ＦＤＲ１％未満）、ＸＸＹ核型、又は遺伝子型データと臨床記録との間の性別の不一致を有した場合に除外された。対立遺伝子の共有度（ｉｄｅｎｔｉｔｙ-ｂｙ-ｓｔａｔｅ）（ＩＢＳ９５％超）が高い対象については、最も高いコールレートを有するもののみを維持した。主成分分析（ＰＣＡ）を各コホートで個別に実施し、遺伝子構造の観点から外れる対象は除いた。両方のコホートの対象は全て欧州系の祖先をもち、２つのコホートは類似した遺伝的構造を有した。全遺伝子のＱＣを基に、１１６６のＯｔｔａｗａ及び７９８のＤｉＯＧｅｎｅｓ対象にその後の分析を行った。次いで、ＳＨＡＰＥＩＴ（Ｄｅｌａｎｅａｕ，Ｏ．，Ｍａｒｃｈｉｎｉ，Ｊ．＆Ｚａｇｕｒｙ，Ｊ．−Ｆ．ＮａｔＭｅｔｈ９，１７９−１８１（２０１２））及びＩＭＰＵＴＥ２（Ｈｏｗｉｅ，Ｂ．Ｎ．，Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｐ．＆Ｍａｒｃｈｉｎｉ，Ｊ．ＰＬｏＳＧｅｎｅｔ．５，ｅ１０００５２９（２００９））を使用して、１０００ゲノムプロジェクトの欧州参照パネル（Ａｂｅｃａｓｉｓ，Ｇ．Ｒ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４９１，５６−６５（２０１２））（Ｍａｒｃｈ２０１２ｒｅｌｅａｓｅ，ｐｈａｓｅ１ｖｅｒｓｉｏｎ３）をベースとして、遺伝子型インピュテーションを実施した。フィルタリング後のインピュテーションにより、参照アレル頻度が１％未満で、ＩＮＦＯスコアが０．８未満のＳＮＰを除去した。集団構造及び個体間の潜在的な関連性を調整するためのベイジアン線形混合効果モデル、ＢＯＬＴ−ＬＭＭを使用して単一ＳＮＰ分析を実施した（Ｌｏｈ，Ｐ．−Ｒ．ｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４７，２８４−２９０（２０１５））。減量率は、性別、年齢、及び開始ＢＭＩに応じて調整した。２つのコホートの結果を、続いてランダム効果モデリング及び二重ゲノム制御（ＧＣ）補正（Ｄｅｖｌｉｎ，Ｂ．＆Ｒｏｅｄｅｒ，Ｋ．Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ５５，９９７−１００４（１９９９））（試験レベル及びメタ分析レベルでもＧＣ補正）を用いてゲノムワイド関連メタ解析（ＧＷＡＭＡ）ソフトウェア（Ｍａｇｉ，Ｒ．＆Ｍｏｒｒｉｓ，Ａ．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１１，２８８（２０１０））を使用してメタ解析した。

ＮＫＸ６．３遺伝子の付近及び当該遺伝子中のＳＮＰは、カロリー制限時の減量と関連することが見出された（図１）。

実施例２：ＮＫＸ６．３遺伝子多様体の優先順位付け
ベイジアンフレームワークを使用してＧＷＡシグナルの優先順位付けを行い、大規模なエピゲノムアノテーションについて相関ｐ値の結合尤度（ｊｏｉｎｔｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）をモデル化した。かかるリスク変分推論（ｒｉｓｋｖａｒｉａｎｃｅｉｎｆｅｒｅｎｃｅ）は、ＲｉＶＩＥＲＡ−ｂｅｔａフレームワーク（Ｌｉ，Ｙ．＆Ｋｅｌｌｉｓ，Ｍ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４４，ｅ１４４（２０１６））及び４５０エピゲノムアノテーション（ヒストンマーク、ＤＮａｓｅＩ高感受性、転写因子の結合、及びエキソン内の局在化を含む）を用い実施した。このフレームワークの目標は、入力したＳＮＰ毎に、機能アノテーションにおけるその相関ｐ値及び重複をふまえて疾患の事後確率を推定することである。エピゲノムアノテーションは、Ｐｉｃｋｒｅｌｌらから取得した（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．９４，５５９−５７３（２０１４））。

このようなモデリングによる利点は、どの多様体（複数可）が因果効果／調節効果の観点で最も信頼できるものなのかを、これらの多様体が必ずしも最も関連した（すなわち、最も極端なｐ値を有する）ものでなかった場合であっても同定することである。また実際に、このようなモデリングから、ｒｓ６９８１５８７ＳＮＰ（グローバルＭＡＦ＝３４％を有し、８番染色体（ＧＲＣｈ３７座標）上の位置４１５１６９１５に存在する）が、因果関係のある多様体である可能性が最も高いことが明らかとなった。具体的には、ｒｓ６９８１５８７からのＣアレルの追加のコピーは、それぞれより良好な減量に関連した。予想通り、ｒｓ６９８１５８７と連鎖不平衡にある他の多様体もまた、因果関係のあるＳＮＰである可能性が高いとして評価された。

実施例３：ＮＫＸ６．３のｉｎｖｉｖｏ機能
ハエ系統ハエ系統を、寒天、砂糖及び酵母を用いた標準食で維持し、２５℃のインキュベータ内で１２時間：１２時間の明暗周期で飼育した。アクチン−Ｇａｌ４は、Ｂｌｏｌｏｍｉｎｇｔｏｎから得、ｗ１１１８及びＵＡＳ−ＨＧＴＸＩＲはＶＤＲＣから得た。

トリグリセリドアッセイ１０匹（４〜７日齢）の雄性ハエを秤量し、氷上で２００μＬのｄＨ_２Ｏにホモジナイズし、次いでプローブ超音波処理装置を使用して氷上で１０秒間超音波処理した。超音波処理後、８００μＬの氷冷したｄＨ_２Ｏを加え、十分に混合した。５０μＬの混合物を使用して、製造業者の指示下でＲｏｃｈｅトリグリセリドキット（１１７３０７１１２１６）を使用してトリグリセリドを評価した。体重は、分析天秤によって測定した。トリグリセリドは体重に対して正規化した。

ＲＮＡｉノックダウン効率を求めるｑＰＣＲ。標準的なプロトコルとして、４〜７日齢の雄性ハエからＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡは、全てｑＰＣＲの品質を満たした（Ａ２６０／Ａ２８０＞２．０、Ａ２６０／Ａ２３０＞２．０）。１μｇのｍＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに逆転写させた。全てのプライマーを効率及び特異性について事前にスクリーニングした。Ｓｅｎｓｉｍｉｘ（商標）プローブキット（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。プログラムは次のとおりである：９５℃１０分、４０サイクルの９５℃１５秒；５５℃１５秒；７２℃１５秒。反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ）で行った。

ｉｎｖｉｖｏでＮＫＸ６．３の遺伝子機能を調査するために、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のトランスジェニックＲＮＡｉを使用した。全身（アクチン−Ｇａｌ４）ドライバーを使用すると、親対照と比較して、ＨＧＴＸｍＲＮＡ（Ａｃｔｉｎ−Ｇａｌ４＞ＵＡＳ−ＨＧＴＸ^ＩＲ）のノックダウンにおいてトリグリセリドの有意な低減が観察された（図２Ａ）。この観察を、第２のＲＮＡｉヘアピンを使用して反復した（図２Ｂ）。

ＨＧＴＸノックダウンによる発達に対する影響を排除するために、誘導型ＴｕｂＧａｌ８０ｔｓシステムを使用して、ＨＧＴＸの全身誘導型ノックダウンを実施した。Ａｃｔｉｎ−Ｇａｌ４；ＴｕｂＧａｌ８０ｔｓ＞ＵＡＳ−ＨＧＴＸのハエを発生段階の間１８℃で飼育し、次いで、孵化したハエを２９℃に６日間移した。これらのハエは、恒常的にＨＧＴＸをノックダウンしたハエと同様のレベルのＴＡＧ低減を示した（図３）。

ｑＰＣＲを使用して、誘導型ＲＮＡｉノックダウン効率を確認したところ、ＨＧＴＸのｍＲＮＡレベルの約６０％の減少が観察された（図４）。

ＨＧＴＸ誘導型ノックダウンは、ハエインスリン様ペプチドＩｌｐ３発現の低下をもたらしたことから（図５）、インスリンシグナル伝達における役割が示される。

ＨＧＴＸが役割を果たす具体的な組織を見つけるために、脂肪体（Ｐｐｌ−Ｇａｌ４）、筋肉（Ｍｅｆ２−Ｇａｌ４）、脳（ｎＳｙｂ−Ｇａｌ４）及び扁桃細胞（Ｏｅｎｏ−Ｇａｌ４）における発現を標的とする組織特異的ＨＧＴＸＲＮＡｉを実施した。ＨＧＴＸの扁桃細胞特異的ノックダウンのみが、親対照と比較して有意なＴＡＧ低減をもたらすことが判明した（図６）。これにより、脂質代謝における役割が確認された（昆虫では、扁桃細胞は、脂質のプロセシング及び解毒の役割を担う特殊な細胞である）。

まとめると、上記データは、ＨＧＴＸ／Ｎｋｘ６．３が、ｉｎｖｉｖｏでハエ扁桃細胞に作用してインスリン経路とトリグリセリド含有量とを調節するよう働くことを裏付ける。

上記明細書で言及した全ての刊行物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明に開示される作用物質、使用及び方法の様々な改変及び変更は、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく、当業者には明白であろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して開示されているが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者には自明であり、本発明を実施するために開示された様式の種々の改変は以下の特許請求の範囲の範囲内であることを意図している。

Claims

対象における（ｉ）脂肪蓄積の低減及び／又は（ｉｉ）除脂肪量の維持若しくは増加に使用するための、ＮＫＸ６．３の活性を低下させることができる作用物質。
前記作用物質が、脂質異常症を改善するためＮＫＸ６．３の活性を低下させることができるものである、請求項１に記載の使用のための作用物質。
前記作用物質が、心血管疾患（ＣＶＤ）のリスクを低減することができるものである、請求項１又は２に記載の使用のための作用物質。
前記作用物質が、減量介入中又は減量介入後、好ましくは減量介入中に対象に投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための作用物質。
前記作用物質が、対象におけるＮＫＸ６．３レベルを低下させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための作用物質。
前記作用物質が、表１に掲載される前記作用物質から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための作用物質。
前記作用物質が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は小分子からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための作用物質。
対象における（ｉ）脂肪蓄積を低減すること、及び／又は（ｉｉ）除脂肪体重を維持若しくは増加させることができる作用物質を同定する方法であって、
（ａ）ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む調製物を、候補となる作用物質と接触させる工程と、
（ｂ）前記候補となる作用物質が、ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかを検出する工程と、
を含む、方法。
ＮＫＸ６．３の活性を低下させる作用物質を同定する方法であって、
（ａ）ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む調製物を、候補となる作用物質と接触させる工程と、
（ｂ）前記候補となる作用物質が、ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかを検出する工程と、
を含む、方法。
前記ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む前記調製物が、前記ＮＫＸ６．３ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む細胞を含む、請求項８又は９に記載の方法。
前記細胞が肝細胞である、請求項１０に記載の方法。
前記方法が、ＮＫＸ６．３の発現を低下させる作用物質を同定するためのものである、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
前記候補となる作用物質が天然の生成物である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
１つ以上の食事介入を対象に適用することによる脂肪蓄積の低減度を予測するための、及び／又は１つ以上の食事介入を対象に適用することによる除脂肪量の維持度若しくは増加度を予測するための、方法であって、前記方法は、ＮＫＸ６．３に遺伝的に関連した１つ以上の多型位置において、前記対象のヌクレオチド配列を決定することを含む、方法。
１つ以上の食事介入を対象に適用することによる脂肪蓄積の低減度の予測、及び／又は１つ以上の食事介入を対象に適用することによる除脂肪量の維持度若しくは増加度の予測、に使用するための、ＮＫＸ６．３に遺伝的に関連した多型位置を検出することができる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ又は対立遺伝子特異的プライマー。
１つ以上の食事介入を対象に適用することによって達成可能な、脂肪量に対する除脂肪量の比率の増加度の予測、及び／又は１つ以上の食事介入を対象に適用することによるトリグリセリドレベルの低下度の予測において使用するための、ＮＫＸ６．３に遺伝的に関連した多型位置を検出することができる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ又は対立遺伝子特異的プライマー。