TW202334402A - 包含整合ｃａｓ９基因以產生穩定整合位點的哺乳動物細胞，以及包含穩定整合位點及其他位點的哺乳動物細胞 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含多個穩定整合位點之哺乳動物細胞。本發明提供基因體學地引入至基因體安全港中且在該特定基因體安全港，包括但不限於另一基因體安全港之外基因體學地引入的位點。編碼所關注多肽或RNA之所關注多核苷酸可插入至根據本發明提供之該等穩定整合位點中。本發明之細胞及方法可用於高產率產生任何蛋白質，包括病毒蛋白。此外，本發明之細胞及方法適用於產生病毒載體，諸如AAV、抗體及其他蛋白質。

Description

包含整合CAS9基因以產生穩定整合位點的哺乳動物細胞，以及包含穩定整合位點及其他位點的哺乳動物細胞
本申請案主張2021年10月18日申請之美國申請案第63/256,675號之優先權，該案特此以全文引用之方式併入。
本發明提供包含多個穩定整合位點(Stable Integration Sites，SIS)之哺乳動物細胞(包括細胞株)，哺乳動物細胞包括人類及嚙齒動物細胞(包括細胞株)，該等穩定整合位點可使用整合Cas9基因產生。本發明提供以下之穩定整合位點：(1)基因體學地引入至基因體安全港(Genomic Safe Harbor；GSH)，例如AAVS1 (腺相關病毒整合位點1)及AAVS1樣中，及(2)在該特定基因體安全港，諸如不同基因體安全港或不為基因體安全港之其他區域之外基因體學地引入。編碼所關注多肽或RNA之所關注聚去氧核糖核苷酸可插入至根據本發明提供之該穩定整合位點中。 電子序列表之參考
本申請案含有序列表，該序列表已按.XML格式以電子方式提交且特此以全文引用之方式併入。2022年10月7日創建的該.XML複本被命名為「135975-97402.xml」且大小為709,205位元組。此.XML檔案中所含之序列表為說明書之部分且特此以全文引用之方式併入本文中。
哺乳動物細胞株為用於產生商業數量之治療蛋白(諸如抗體)的較佳途徑。然而，已報導，由於遺傳及表觀遺傳不穩定性，導致經修飾之哺乳動物細胞通常表現產量減少。Hilliard及Lee, Biotech.Bioeng.118:659-75 (2021)。
多核苷酸之整合為用於產生且維持轉化細胞之較佳途徑。將特定序列整合至人類AAVS1中論述於Liu等人, BMC Research Note, 7:626 (2014)及Ramachandra等人, Nucl.Acids Res.39: e107 (2011)中。人類AAVS1稱為基因體安全港。Papapetrou等人, Molecular Therapy24:678-84 (2016)。Gaidukov等人, Nucl.Acids Res.46:4072-86 (2018)已揭示整合至著陸墊(landing pad)中之DNA位點。
中國倉鼠卵巢(CHO)細胞及嬰兒倉鼠腎細胞用於產生治療蛋白，且已廣泛研究倉鼠基因體。Hamaker及Lee已報導CHO染色體基因座作為穩定整合之潛在位點且將其稱為「基因體熱點(genomic hot spot)」。 Curr.Op.Chem.Eng.22:152-60 (2018), 在153。在表1處，Hamaker及Lee鑑別30個熱點基因座，其中17個藉由基因鑑別且13個未經標註。 Curr.Op.Chem.Eng.22:152-60 (2018), 在154。此研究之後，Hilliard及Lee試圖使用表觀基因體分析鑑別CHO中之安全港區域。Hilliard及Lee, Biotech.Bioeng.118:659-75 (2021)。作者確定10.9%之CHO基因體含有具有增強之遺傳及表觀遺傳穩定性的染色質結構。作者進一步確定在由Hamaker及Lee鑑別表1中之30個熱點中，其中五個與藉由高通量染色體構形捕獲(Hi-C)確定之穩定區域重疊。最接近該等區域之基因為 ALDH5A1、 SMAD6及 CLCN3，且兩個其他區域未經標註。Hilliard及Lee, Biotech.Bioeng.118:659-75 (2021)，見補充表3(S3)。Gaidukov等人 , Nucl.Acids Res.46:4072-86 (2018)在表1亦鑑別用於在CHO細胞中整合之基因座。Lee等人 , Scientific Reps.5:8572 (2015)鑑別 COSMC基因座。
本發明有利地採用整合Cas9基因來有效地產生哺乳動物細胞中間物，該等哺乳動物細胞中間物進一步經修飾以提供具有多個穩定整合位點之哺乳動物細胞以用於穩定整合多個DNA卡匣及其他所關注聚去氧核糖核苷酸。根據本發明，穩定整合位點可位於基因體安全港或其他區域中，包括新鑑別的基因體安全港。
本發明提供一種哺乳動物細胞，其中其任何細胞可包含位於基因體安全港中之第一穩定整合位點及不位於基因體安全港中之第二穩定整合位點，其中第一穩定整合位點包含編碼第一報導蛋白之第一報導基因且第二穩定整合位點包含編碼第二報導蛋白之第二報導基因，其中第一報導蛋白及第二報導蛋白不同。第一穩定整合位點及第二穩定整合位點可包含重組酶識別位點(RRS)。第一報導基因及第二報導基因可處於SV40啟動子之控制下。第一報導基因及第二報導基因可為螢光蛋白。細胞可進一步包含編碼處於CMV啟動子之控制下之抑制蛋白的多核苷酸。細胞可為人類羊膜上皮細胞(Human Amniotic Epithelial)、HEK 293細胞、CHO細胞或BHK細胞。編碼所關注蛋白質之多核苷酸可插入至第一穩定整合位點或第二穩定整合位點中。第二穩定整合位點可位於與第一基因體安全港不同之第二基因體安全港中或位於不為基因體安全港之區域中。
本發明亦提供哺乳動物細胞，其中其任何細胞可包含位於基因體安全港中之第一穩定整合位點及不位於第一基因體安全港中之第二穩定整合位點，其中第一穩定整合位點包含編碼第一蛋白質之第一多核苷酸且第二穩定整合位點包含編碼第二蛋白質之第二多核苷酸。第一蛋白質及第二蛋白質可為病毒蛋白，諸如腺病毒相關病毒蛋白或腺病毒蛋白。舉例而言，哺乳動物細胞可包含編碼腺相關病毒蛋白之多核苷酸及編碼腺病毒蛋白之多核苷酸。編碼蛋白質之其他多核苷酸包括但不限於例如抗體基因。細胞可具有第二穩定整合位點，該第二穩定整合位點位於與第一穩定整合位點所位於之第一基因體安全港不同的第二基因體安全港中，或位於不為基因體安全港之區域中。
本發明進一步提供一種哺乳動物細胞，其中其任何細胞可包含位於基因體安全港中之第一穩定整合位點及不位於基因體安全港中之第二穩定整合位點，其中第一穩定整合位點包含編碼第一報導基因之多核苷酸，該第一報導基因編碼第一報導蛋白，且第二穩定整合位點包含編碼Cas9之多核苷酸及編碼第二報導基因之多核苷酸，該第二報導基因編碼第二報導蛋白，其中第一報導蛋白及第二報導蛋白不同。第二穩定整合位點可進一步包含選擇標記基因及內部核糖體進入位點(IRES)。第一穩定整合位點及第二穩定整合位點可包含重組酶識別位點。第一報導基因及第二報導基因可處於SV40啟動子之控制下。第一報導基因及第二報導基因可為螢光蛋白。細胞可進一步包含編碼處於啟動子(例如，CMV)之控制下之抑制因子(例如，TetR)的多核苷酸。細胞可為人類羊膜上皮細胞、HEK293細胞、CHO細胞或BHK細胞。編碼所關注蛋白質之多核苷酸可插入至第一穩定整合位點或第二穩定整合位點中。選擇標記蛋白可賦予抗藥性。第二報導基因、選擇標記基因、IRES及SV40啟動子可佈置於DNA卡匣上。細胞可進一步包含編碼處於啟動子(例如，CMV)之控制下之抑制蛋白的多核苷酸。第二穩定整合位點可位於與第一穩定整合位點所位於的第一基因體安全港不同之第二基因體安全港中，或位於不為基因體安全港之區域中。第一報導基因可由5'基因體安全港同源臂及3'基因體安全港同源臂側接。5'基因體安全港同源臂可包含CRISPR sgRNA目標位點且3'基因體安全港同源臂可包含CRISPR sgRNA目標位點。
本發明進一步提供用於製備至少一種所關注蛋白質之方法，其中其任何方法可包含：(a)提供哺乳動物細胞，其包含位於基因體安全港中之第一穩定整合位點及不位於第一基因體安全港中之第二穩定整合位點，其中第一穩定整合位點包含編碼第一報導蛋白之第一報導基因且第二穩定整合位點包含編碼第二報導蛋白之第二報導基因，其中第一報導蛋白及第二報導蛋白不同，且其中第一及第二穩定整合位點包含重組酶識別位點；(b)藉由重組酶介導之卡匣交換盒式交換（cassette exchange）將編碼所關注蛋白質之多核苷酸引入至穩定整合位點中，及(c)在允許表現編碼所關注多核苷酸之多核苷酸的條件下培養哺乳動物細胞。第一報導基因及第二報導基因可處於SV40啟動子之控制下。第一報導基因及第二報導基因可為螢光蛋白。細胞可進一步包含編碼處於CMV啟動子之控制下之抑制蛋白的多核苷酸。細胞可為人類羊膜上皮細胞、HEK 293細胞、CHO細胞或BHK細胞。編碼所關注蛋白質之多核苷酸可插入至第一穩定整合位點或第二穩定整合位點中。第二穩定整合位點可位於與第一穩定整合位點所位於的第一基因體安全港不同之第二基因體安全港中，或位於不為基因體安全港之區域中。第一穩定整合位點包含編碼第一蛋白質之第一多核苷酸且第二穩定整合位點包含編碼第二蛋白質之第二多核苷酸。第一蛋白質及第二蛋白質可為病毒蛋白，諸如腺病毒相關病毒蛋白或腺病毒蛋白。舉例而言，哺乳動物細胞可包含編碼腺相關病毒蛋白之多核苷酸及編碼腺病毒蛋白之多核苷酸。編碼蛋白質之其他多核苷酸包括但不限於例如抗體基因。第二穩定整合位點亦可位於不為基因體安全港之區域中。
本發明進一步提供產生具有多個穩定整合位點之哺乳動物細胞的方法，其中其任何方法可包含：(A)提供哺乳動物細胞，其包含第一DNA卡匣，該第一DNA卡匣以5'至3'順序包含編碼第一lox位點的多核苷酸、啟動子、編碼選擇標記蛋白之選擇標記基因、IRES、編碼第一報導蛋白之第一報導基因、可操作地連接至操縱子之啟動子、Cas9基因及第二lox位點；(B)整合第二DNA卡匣，其包含多核苷酸，該多核苷酸以5'至3'順序包含含有CRISPR sgRNA目標位點的第一基因體安全港同源臂、第三lox位點、編碼第二報導蛋白之第二報導基因、第四lox位點及CRISPR sgRNA目標位點的第二基因體安全港同源臂，其中第一lox位點、第二lox位點、第三lox位點及第四lox位點不同，其中第一導引臂及第二導引臂可含有具有變異之區域(若需要，以避免重新創造可靶向位點)，且其中第二報導蛋白與第一報導蛋白不同；(C)將第一DNA卡匣與第三DNA盒式交換，其中第三DNA卡匣以5'至3'順序包含編碼第一lox位點的多核苷酸、啟動子、編碼第三報導蛋白之第三報導基因及第二lox位點，其中第三報導蛋白與第二報導蛋白不同，藉此提供具有多個穩定整合位點之哺乳動物細胞。哺乳動物細胞可為人類羊膜上皮細胞、HEK 293細胞、CHO細胞或BHK細胞。供使用之報導基因可為螢光蛋白。步驟(A)之細胞可進一步包含編碼處於啟動子(例如，CMV)之控制下之抑制因子(例如，TetR)的多核苷酸。步驟(B)之細胞可進一步包含編碼處於啟動子(例如，CMV)之控制下之抑制因子(例如，TetR)的多核苷酸。步驟(C)之細胞可進一步包含編碼處於啟動子(例如，CMV)之控制下之抑制因子(例如，TetR)的多核苷酸。選擇標記蛋白可賦予抗藥性。Lox位點為最常用類型之RRS；然而，亦可使用不同RRS。
本發明亦提供產生具有多個重組酶介導之盒式交換位點之哺乳動物細胞的方法，其中其任何方法可包含：(A)將啟動子及編碼抑制因子之多核苷酸隨機整合至細胞基因體中，其中抑制因子可結合於配位體；(B)將第一DNA卡匣隨機整合至細胞基因體中，該第一DNA卡匣以5'至3'順序包含編碼第一lox位點、啟動子及視情況存在之操縱子、編碼第一報導蛋白之第一報導基因、IRES、編碼第一選擇標記蛋白之第一選擇標記基因及第二lox位點的多核苷酸，其中第一lox位點及第二lox位點不同；(C)將第一DNA卡匣與第二DNA盒式交換，其中第二DNA卡匣以5'至3'順序包含編碼第一lox位點、啟動子、編碼第二選擇標記蛋白之第二選擇標記基因、IRES、編碼第二報導蛋白之第二報導基因、啟動子及視情況存在之操縱子、Cas9基因及第二lox位點的多核苷酸，其中第一選擇標記蛋白及第二選擇標記蛋白不同且第一報導蛋白及第二報導蛋白不同；(D)整合第三DNA卡匣，該第三DNA卡匣以5'至3'順序包含多核苷酸，該多核苷酸包含含有sgRNA (單導引RNA)目標位點、第三lox位點、編碼第三報導蛋白之第三報導基因、第四lox位點的第一基因體安全港(GSH)同源臂及含有sgRNA目標位點的第二GSH同源臂，其中第一lox位點、第二lox位點、第三lox位點及第四lox位點不同，其中第一導引臂及第二導引臂可含有至少一個具有變異之區域(若需要，以避免重新創造可靶向位點)，且其中第三報導蛋白與第二報導蛋白不同且可與第一報導蛋白相同或不同；及(E)將第二DNA卡匣與第四DNA盒式交換，其中第四DNA卡匣以5'至3'順序包含編碼第一lox位點、啟動子、編碼第四報導蛋白之第四報導基因及第二lox位點的多核苷酸，其中第四報導蛋白與第三報導蛋白不同且第二報導蛋白較佳與第一報導蛋白不同，藉此提供具有多個穩定整合位點之細胞。Lox位點為最常用類型之RRS；然而，亦可使用不同RRS。
本發明進一步提供包含經修飾基因體之哺乳動物細胞，其中給定基因體藉由在基因體之不同區域插入至少三個DNA卡匣而經修飾，其中經修飾基因體包含(1)在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 1及2所組成之群組的至少一者至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的第一去氧核糖核酸序列；(2)在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的第二去氧核糖核酸序列；及(3)在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致的第三去氧核糖核酸序列，其中第一去氧核糖核酸序列藉由插入第一DNA卡匣而經修飾，第二去氧核糖核酸序列藉由插入第二DNA卡匣而經修飾，且第三去氧核糖核酸序列藉由插入第三DNA卡匣而經修飾。哺乳動物細胞可各自具有(a)第一DNA卡匣，其包含啟動子及選自由可選標記基因及報導基因所組成之群組的至少一者；(b)第二DNA卡匣，其包含啟動子及選自由可選標記基因及報導基因所組成之群組的至少一者；及(c)第三DNA卡匣，其包含啟動子及選自由可選標記基因及報導基因所組成之群組的至少一者。此外，哺乳動物細胞可各自具有(a)第一DNA卡匣，其包含啟動子、可選標記基因及報導基因；(b)第二DNA卡匣，其包含啟動子、可選標記基因及報導基因；及(c)第三DNA卡匣，其包含啟動子、可選標記基因及報導基因。第一去氧核糖核酸序列包含穩定整合位點及其中插入之所關注基因。所關注基因可編碼選自由以下所組成之群組的所關注多肽：抗體、抗體鏈、受體、含Fc蛋白、阱蛋白（trap protein）、酶、因子、抑制因子、活化因子、配位體、報導蛋白、選擇蛋白、蛋白賀爾蒙（protein hormone）、蛋白毒素、結構蛋白、儲存蛋白、轉運蛋白、神經傳導物質（neurotransmitter）及收縮性蛋白。哺乳動物細胞可為人類細胞且第一去氧核糖核酸序列與SEQ ID NO: 1至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。替代地，哺乳動物細胞可為CHO細胞且第一去氧核糖核酸序列與SEQ ID NO: 2至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。第一去氧核糖核酸序列可包含使用選自由SEQ ID NO: 13至419所組成之群組之導引序列產生的穩定整合位點。此外，第一去氧核糖核酸序列可包含藉由使用在選自由以下所組成之群組的核苷酸位置範圍處與SEQ ID NO: 2中之目標序列結合及/或互補的導引序列產生的穩定整合位點：(a) 1至2000；(b) 2001至4000；(c) 4001至6000；(d) 6001至8000；(e) 8001至10,000；(f) 10,001至12,000；(g) 12,001至14,000；(h) 14,001至16,000；(i) 16,001至18,000；(j) 18,001至20,000；(k) 20,001至22,000；(l) 22,001至24,000；(m) 24,001至26,000；(n) 26,001至28,000；(o) 28,001至30,000；(p) 30,001至32,000；(q) 32,001至34,000；(r) 34,001至36,000；(s) 36,001至38,000；(t) 38,001至40,000；(u) 40,001至42,000；及(v) 42,001至末端(44,232)。
此外，提供包含經修飾基因體之哺乳動物細胞，其中經修飾基因體包含去氧核糖核酸序列，該去氧核糖核酸序列包含藉由插入至少一個DNA卡匣而經修飾的AAVS1樣區域，且其中選自由SEQ ID NO: 13至419所組成之群組的導引序列與AAVS1樣區域之有義股或反義股結合及/或互補。哺乳動物細胞可進一步包含在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的第二去氧核糖核酸序列；及在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的第三去氧核糖核酸序列，其中第一去氧核糖核酸序列藉由插入第一DNA卡匣而經修飾，第二去氧核糖核酸序列藉由插入第二DNA卡匣而經修飾，且第三去氧核糖核酸序列藉由插入第三DNA卡匣而經修飾。第二去氧核糖核酸序列在修飾之與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致；且第三去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。第一去氧核糖核酸序列包含藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之目標序列結合及/或互補的導引序列產生的穩定整合位點而產生：(a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
亦提供包含經修飾基因體之哺乳動物細胞，其中經修飾基因體包含AAVS1樣區域中之穩定整合位點，其中穩定整合位點係藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之目標序列結合及/或互補的導引序列產生：(a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
進一步提供根據前述一段落之哺乳動物細胞，其進一步包含在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的第二去氧核糖核酸序列；及在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的第三去氧核糖核酸序列，其中第一去氧核糖核酸序列藉由插入第一DNA卡匣而經修飾，第二去氧核糖核酸序列藉由插入第二DNA卡匣而經修飾，且第三去氧核糖核酸序列藉由插入第三DNA卡匣而經修飾。哺乳動物細胞可具有在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的第二去氧核糖核酸序列；及在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的第三去氧核糖核酸序列。
此外，提供產生所關注蛋白質之方法，其中該方法包含以下步驟：(1)培養上述哺乳動物細胞；及(2)收穫所關注蛋白質。亦提供根據上述方法中之任一者製備的細胞，以及使用所揭示細胞之方法。
定義
除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之具有通常知識者通常所理解相同的含義。
在數值及範圍之情形下，術語「約」係指近似或接近所陳述值或範圍之值或範圍，使得本發明可執行，諸如具有所尋求之速率、量、程度、增加、減少或表現程度、濃度或時間，如自本文中所含有之教示內容顯而易見。因此，此術語涵蓋之值超出僅由系統誤差引起之值。舉例而言，視執行能力而定，「約」可表示高於或低於在大約+/-10%或更大或更小之範圍內之所陳述值的值。
「AAVS1」可為基因體安全港且係指腺相關病毒整合位點1，且據報導，其實質上位於人類染色體19上且含有大約4.7千鹼基。根據本發明，可使用AAVS1基因座。
「AAVS1樣」係指CHO細胞中發現之AAVS1同源物且揭示於本文中。可根據本發明使用含有AAVS1樣基因體安全港(GSH)之AAVS1樣區域。SEQ ID NO: 2為AAVS1樣區域之實例。
「DNA卡匣」或「卡匣」為一種類型之核酸部分，其包含至少一啟動子、至少一個開放閱讀框架及視情況存在之聚腺苷酸化訊號(例如SV40聚腺苷酸化訊號)。其他核酸部分(諸如操縱子)亦為視情況存在的。DNA卡匣因此為多核苷酸，其包含兩種或更多種較短多核苷酸。卡匣可包含一個或多個基因及啟動子、強化子、操縱子、抑制因子、轉錄終止訊號、核糖體進入位點、內含子及聚腺苷酸化訊號。
據報導，「COSMC」已發現於倉鼠細胞中。部分或整個COSMC基因座之同源物為根據本發明使用之候選物。
「CCR5」係指C-C趨化因子受體5型基因，且據報導已發現於人類、小鼠及大鼠細胞中。部分或整個CCR5基因座之同源物為根據本發明使用之候選物。
「基因體安全港」或「GSH」係指可接納多核苷酸(諸如DNA卡匣)之插入且准許插入多核苷酸以起作用且不對轉化細胞造成不當負擔的細胞基因體中之位點。因此，基因體安全港為經由本發明之實踐產生用於插入DNA卡匣之穩定整合位點的理想位置。本文中可利用的基因體安全港包括但不限於AAVS1及AAVS1樣。作為候選物之所報導基因座包括但不限於CCR5、COSMC及Rosa26。
「基因體安全港同源臂」或「GSH同源臂」衍生自基因體安全港且與基因體安全港具有同源性。較佳地，基因體安全港同源臂包含約100至2000個鹼基，更佳約300至1800個鹼基，更佳約400至1600個鹼基，更佳約500至1500個鹼基，更佳約500至1300個鹼基，更佳約500至1100個鹼基，更佳約500至1000個鹼基，更佳約600至1000個鹼基，更佳約700至1000個鹼基，更佳約800至1000個鹼基，且仍更佳約900至1000個鹼基。通常，待插入至基因體安全港中之多核苷酸將由5' GSH同源臂及3' GSH同源臂側接。舉例而言，參見圖4及5，其展示進一步由GSH同源臂側接的lox位點側接之DNA卡匣。
「hRosa26」係指鼠類Rosa26基因座之人類同源物(「反向定向剪接受體」)。「Rosa26」係指部分或整個Rosa26基因座，且據報導，除小鼠及人類細胞以外，已發現於之倉鼠細胞中。部分或整個Rosa26基因座之同源物為根據本發明使用之候選物。
「內含子」為位於外顯子之間的DNA區段。內含子經移除以形成成熟信使RNA。較佳的內含子為可影響轉譯起點之彼等內含子，且範例為hCMV-IE內含子(人類巨細胞病毒即刻早期蛋白)及FMDV內含子(口蹄疫病毒)。
「核酸部分」包括單股或雙股核苷酸序列之任何佈置。核酸部分可包括但不限於多核苷酸、啟動子、強化子、操縱子、抑制因子、轉錄終止訊號、核糖體進入位點及聚腺苷酸化訊號。
「可操作地連接」係指與一個或多個其他核苷酸序列處於功能性關係的一個或多個核苷酸序列。根據選定設計，此類功能關係可直接地或間接地控制、引起、調節、增強、促進、准許、衰減、抑制或阻斷作用或活性。範例包括單股或雙股核酸部分，且可包含兩個或更多個以使得序列可對其他序列發揮至少一種功能作用之方式佈置於給定部分內的核苷酸序列。舉例而言，可操作地連接至DNA多核苷酸序列之編碼區的啟動子可促進編碼區之轉錄。諸如強化子、操縱子、抑制因子、轉錄終止訊號、核糖體進入位點及聚腺苷酸化訊號之其他元件亦可與所關注多核苷酸可操作地連接以控制其表現。達成可操作連接之佈置及間距可藉由本領域具有通常知識者可獲得之方法，諸如使用西方墨點及RT-PCR之篩選來確定。
視具體情況而定，「操縱子」表示以使得多核苷酸序列可藉由能夠結合於操縱子之分子之相互作用調節的方式引入多核苷酸序列中或附近的DNA序列，且因此防止或允許多核苷酸序列之轉錄。本領域具有通常知識者將認識到操縱子必須充分接近啟動子定位，使得其能夠控制或影響啟動子之轉錄，此可被視為一種類型的可操作連接。操縱子可置放於啟動子之下游或上游。此等包括但不限於大腸桿菌( E. coli)之Lex A基因之操縱子區域，其結合Lex A肽及乳糖及45個色胺酸操縱子，其結合由大腸桿菌之Lad及trpR基因編碼的抑制蛋白。噬菌體操縱子來自λ Pi及噬菌體P22 Mnt及Arc。較佳的操縱子為Tet (四環素)操縱子(TetO或TO)及Arc操縱子(ArcO或AO)。操縱子可具有天然序列或突變序列。舉例而言，Tet操縱子之突變序列揭示於Wissmann等人, Nucleic Acids Res.14:4253-4266 (1986)中。
Tet操縱子為較佳的，且可用於使用抑制因子控制轉錄，諸如四環素抑制因子(TetR)。抑制因子之合適配位體為四環素(tet)、去氧羥四環素(dox)及其衍生物。當配位體結合於TetR時，Tet抑制因子對Tet操縱子之親和力減弱且Tet抑制因子自操縱子分離，且藉此操縱子變得准許轉錄。其他抑制因子可經配對以供其自身各別操縱子使用。
當描述序列時，呈其各種文法形式之片語「百分比一致性」或「一致%」意謂包括沿連續同源區域顯示所陳述一致性的同源序列，但在計算百分比一致性時不考慮比較序列中不具有同源物的空隙、缺失或插入之存在。如本文所使用，同源物之間的「百分比一致性」或「一致%」測定將不包括同源物不具有同源序列以在比對中比較的序列之比較。因此，「百分比一致性」及「一致%」不包括空隙、缺失及插入之罰分(penalties)。
在核酸序列之情形下呈其各種文法形式的「同源序列」係指實質上與參考核酸序列同源的序列。在一些實施例中，若兩個序列中至少50%至99%、75%至99%、85%至99%、90%至99%、95%至98%、98%至99%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多其對應核苷酸在相關殘基片段上一致，則將兩個序列視為實質上同源。在一些實施例中，相關片段為完整(亦即，完全)序列。
「多核苷酸」包括共價接合之核苷酸序列，且包括RNA及DNA。將寡核苷酸視為較短多核苷酸。基因為最終編碼多肽之DNA多核苷酸(聚去氧核糖核苷酸)，該等多肽通常自DNA轉錄之RNA (聚核糖核酸)轉譯。DNA多核苷酸亦可編碼不轉譯但實際上充當RNA「產物」之RNA多核苷酸。多核苷酸之類型(亦即，DNA或RNA)自術語之使用之情形中顯而易見。藉由其編碼之多肽提及或鑑別的多核苷酸根據密碼簡併闡述且涵蓋所有適合序列。包括本文中所揭示之彼等的多核苷酸在指示時包括一致性百分比序列及同源序列。
「多肽」及「肽」係指共價接合之胺基酸序列。多肽包括天然、半合成及合成蛋白質及蛋白質片段。「多肽」及「蛋白質」可互換使用。將寡肽視為較短多肽。
「啟動子」表示DNA序列，其引起與其可操作地連接(亦即，以使得在適當訊號存在且抑制因子不存在時轉錄所關注核苷酸序列之方式連接)的DNA序列之轉錄。可將所關注多核苷酸之表現置於本領域中已知之任何啟動子或強化子元件之控制下。真核啟動子可與TATA盒可操作地連接。TATA盒通常位於轉錄起始位點之上游。
可使用的適用啟動子包括但不限於SV40早期啟動子區、SV40 E/L (早期/晚期)啟動子、含於勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複序列中之啟動子、金屬硫蛋白基因之調節序列、小鼠或人類巨細胞病毒主要即刻早期(CMV-MIE)啟動子及其他CMV啟動子，包括CMVmin啟動子。植物表現載體包含胭脂鹼(nopaline)合成酶啟動子區、花椰菜嵌紋病毒35S RNA啟動子及光合成酶核酮糖二磷酸羧化酶之啟動子；來自酵母或其他真菌之啟動子元件，諸如Gal 4啟動子、ADC (乙醇脫氫酶)啟動子、PGK (磷酸甘油激酶)啟動子、鹼性磷酸酶啟動子及以下動物轉錄控制區(其展現組織特異性且已用於轉殖基因動物中)：彈性蛋白酶I；胰島素；免疫球蛋白；小鼠乳房腫瘤病毒；白蛋白；C.-胎蛋白；C.1-抗胰蛋白酶；3-血球蛋白；及肌凝蛋白輕鏈-2。根據本發明可使用各種形式之CMV啟動子。
諸如CMVmin啟動子之最小啟動子可為截斷啟動子或核心啟動子且較佳用於受控表現系統中。最小啟動子及開發方法為廣泛已知的且揭示於例如Saxena等人, Methods Molec.Biol.1651:263-73 (2017)；Ede等人 , ACS Synth Biol.5:395-404 (2016)；Brown等人 , Biotech Bioeng.111:1638-47 (2014)；Morita等人 , Biotechniques0:1-5 (2012)；Lagrange等人 , Genes Dev.12:34-44(1998)中。存在此項技術中描述之許多CMVmin啟動子。
「所關注蛋白質」或「所關注多肽」可具有任何胺基酸序列且包括任何蛋白質、多肽或肽，及其衍生物、組分、域、鏈及片段。包括但不限於病毒蛋白、細菌蛋白、真菌蛋白、植物蛋白及動物(包括人類)蛋白。蛋白質類型可包括但不限於抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、抗體鏈(包括重鏈及輕鏈)、抗體片段、Fv片段、Fc片段、含Fc蛋白、Fc融合蛋白、受體Fc融合蛋白、受體、受體域、阱蛋白及微型阱蛋白、酶、因子、抑制因子、活化因子、配位體、報導蛋白、選擇蛋白、蛋白賀爾蒙、蛋白毒素、結構蛋白、儲存蛋白、轉運蛋白、神經傳導物質及收縮性蛋白。亦包括上述之衍生物、組分、鏈及片段。序列可為天然的、半合成的或合成的。所關注蛋白質及所關注多肽由「所關注基因」編碼，其亦可稱為「所關注多核苷酸」。在整合多個基因(相同或不同)的情況下，如自使用之情形顯而易見，其可稱為「第一」、「第二」、「第三」、「第四」、「第五」、「第六」、「第七」、「第八」、「第九」、「第十」等。
亦稱為「異種特異性重組位點」之「重組酶識別位點」(RRS)用於重組酶介導之盒式交換(RMCE)中。舉例而言，Cre/Lox、Dre/Rox、Vre/Vlox、SCre/Slox及Flp/Frt為適合的RRS系統。根據本發明使用之適合RRS包括Lox P、Lox 66、Lox 71、Lox 511、Lox 2272、Lox 2372、Lox 5171、Lox M2、Lox M3、lox M7及Lox M11。如自使用之情形顯而易見，此等位點一般可稱為第一(1)、第二(2)、第三(3)、第四(4)、第五(5)、第六(6)、第七(7)、第八(8)、第九(9)、第十(10)等。Cre/Lox為最常用之RRS，但根據本發明可使用其他RRS代替Cre/Lox。
如本文所使用之「報導蛋白」係指能夠直接地或間接地產生可偵測訊號之任何蛋白質。報導蛋白通常發螢光或催化比色或螢光反應，且通常稱為「螢光蛋白」或「顏色蛋白」。然而，報導蛋白亦可為非酶促及非螢光的，只要其可藉由另一種蛋白質或部分偵測，諸如用螢光配位體偵測到之細胞表面蛋白。報導蛋白亦可是經由與發螢光或催化反應之另一種蛋白質相互作用而起作用的非活性蛋白。因此，可使用如由本領域中具有通常知識者所瞭解到任何適合的報導蛋白。在一些範疇中，報導蛋白可選自螢光蛋白、螢光素酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖、β-內醯胺酶、二氫葉酸還原酶、泛蛋白及其變異體。視具體情況而定，螢光蛋白適用於識別已經或尚未成功插入及/或置換之基因卡匣。流式細胞測量術及螢光活化細胞分選適用於偵測。螢光蛋白之實例為本領域中熟知的，包括但不限於迪斯科馬珊瑚(Discosoma coral) (DsRed)、綠色螢光蛋白(GFP)、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、氰基螢光蛋白(CFP)、增強型氰基螢光蛋白(eCFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、增強型黃色螢光蛋白(eYFP)及遠紅螢光蛋白(例如，mKate、mKate2、mPlum、mRaspberry或E2-緋紅)。參見例如美國專利第9,816,110號。報導蛋白由多核苷酸編碼且在本文中稱為「報導基因」或「報導蛋白基因」。如自使用之情形顯而易見，報導基因及蛋白一般可稱為第一(1)、第二(2)、第三(3)、第四(4)、第五(5)、第六(6)、第七(7)、第八(8)、第九(9)、第十(10)等。可將報導子視為一種類型之標記。「顏色(Color)」或「螢光」以其各種文法形式，亦可更特定言之係指報導蛋白或基因。
亦稱為「抑制因子」之「抑制因子蛋白」為可結合於DNA以便抑制因子轉錄之蛋白質，且由多核苷酸編碼，在本文中亦稱為「抑制因子基因」或「抑制因子蛋白基因」。抑制因子屬於真核及原核來源。原核抑制因子為較佳的。抑制因子家族之實例包括：TetR、LysR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR、DeoR、GntR及Crp家族。TetR家族中之抑制因子蛋白包括：ArcR、ActII、AmeR、AmrR、ArpR、BpeR、EnvR、EthR、HemR、HydR、IfeR、LanK、LfrR、LmrA、MtrR、Pip、PqrA、QacR、RifQ、RmrR、SimReg2、SmeT、SrpR、TcmR、TetR、TtgR、TrgW、UrdK、VarR YdeS、ArpA、BarA、Aur1B、CalR、CprB、FarA、JadR*、JadR2、MphB、NonG、PhlF、TylQ、VanT、TarA、TylP、BM1P1、Bm3R1、ButR、CampR、CamR、DhaR、KstR、LexA樣、AcnR、PaaRR、PsbI、Th1R、UidR、YDH1、BetI、McbR、MphR、PhaD、Q9ZF45、TtK、Yhgd、YixD、CasR、IcaR、LitR、LuxR、LuxT、OpaR、Orf2、SmcR、HapR、Ef0113、HlyIIR、BarB、ScbR、MmfR、AmtR、PsrA及YjdC蛋白。參見Ramos等人, Microbiol.Mol.Biol.Rev.,69:326-56 (2005)。另外其他抑制因子包括PurR、LacR、MetJ及PadR、
「可選」或「選擇」標記蛋白包括賦予某些性狀之蛋白質，包括但不限於抗藥性或其他選擇性優勢。選擇標記可使細胞接受針對某一毒素、藥物、抗生素或其他化合物之可選標記基因抗性，且准許細胞產生蛋白質且在毒素、藥物、抗生素或其他化合物之存在下傳播，且通常稱為「陽性可選標記」。抗生素抗性標記之適合實例包括但不限於對各種抗生素賦予抗性之蛋白質，該等抗生素諸如卡那黴素(kanamycin)、觀黴素(spectinomycin)、新黴素(neomycin)、健大黴素(gentamycin) (G418)、胺苄青黴素(ampicillin)、四環素、氯胺苯醇(chloramphenicol)、嘌呤黴素(puromycin)、潮黴素(hygromycin)、吉歐黴素(zeocin)及/或殺稻瘟菌素(blasticidin)。存在其他可選標記，通常稱為「陰性可選標記」，其引起細胞在陰性可選標記蛋白之存在下終止傳播、終止蛋白質產生及/或使細胞致死。胸苷激酶及某些融合蛋白可充當陰性可選標記，包括但不限於GyrB-PKR。參見White等人 , Biotechniques, 50:303-309 (May 2011)。如自使用之情形顯而易見，可選標記蛋白及對應基因(可選標記基因)可一般稱為第一(1)、第二(2)、第三(3)、第四(4)、第五(5)、第六(6)、第七(7)、第八(8)、第九(9)、第十(10)等。在圖式中，除非另外規定為陰性(neg.)標記，否則可選標記為陽性可選標記。
「單導引RNA」或「sgRNA」用於將Cas9靶向至一位點且通常長度為17-24個核苷酸。
「穩定整合位點」或「SIS」為用於對所關注DNA多核苷酸進行位點特異性整合之區域，包括包含基因及/或其他開讀框、啟動子及視情況存在之其他元件的卡匣。穩定整合位點包含外源DNA卡匣，且可根據本文所描述及描繪之本發明方法，較佳在GSH中產生。構築體可藉由多種方法插入至SIS中。可產生多個穩定整合位點且位於不同染色體、相同染色體之不同區域或染色體之相同區域中之不同位置上。
「四環素反應元件」或「TRE」包含由包含17-18個核苷酸之間隔子隔開的19個核苷酸TetO之七個複本且為可商購的。TetO序列可變化且核苷酸取代為已知的。舉例而言，基於Tet操縱子之經變異序列揭示於Wissmann等人, Nucleic Acids Res.14:4253-66 (1986)中。間隔子不為序列特異性的。間隔子可為類似的，但不應全部相同。將TRE視為如本文所使用的一種類型之操縱子。
本文所闡述之所有數值限制及範圍包括範圍或限制之數值周圍或其間的所有數值或值。本文所描述之範圍及限制明確地命名且闡述了由範圍或限制定義且涵蓋之所有整數、小數及分數值。本文所描述之範圍及限制明確地命名且闡述了由範圍或限制定義且涵蓋之所有整數、小數及分數值。因此，除非本文另外指出，否則本文對值範圍之敍述僅意欲用作個別地提及屬於該範圍內之各個別值的簡寫方法，且各個別值係併入本說明書中，如同其在本文中個別地敍述一般。 詳細描述
本發明提供具有多個穩定整合位點之哺乳動物細胞，且適用於產生包括病毒蛋白之所關注蛋白，及產生包括腺相關病毒載體(AAV)之病毒載體。一個或多個穩定整合位點可在基因體安全港內且一個或多個穩定整合位點可在特定基因體安全港之外。可產生多個穩定整合位點且位於不同染色體、相同染色體之不同區域或染色體之相同區域中之不同位置上。
基因體安全港論述於Pellenz等人, Hum.Gene Therapy30:814-28 (2019)；Papapetrou等人 , Molecular Therapy24:678-84 (2016)中。
較佳地，穩定整合位點含有允許重組酶介導之盒式交換(RMCE)的識別位點。細胞基因體之穩定修飾可用已知方法採用異種特異性重組位點(亦稱為RRS)進行，諸如Cre/Lox、Flp/Frt、轉錄活化子樣效應物核酸酶(TALEN)、TAL效應子域融合蛋白、鋅指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚體或RNA導引之DNA核酸內切酶系統，諸如CRISPR/Cas9。參見美國專利第9,816,110號，第17-18欄；Sajgo等人 , PLoS ONE9: e91435 (2014)；Suzuki等人 , Nucl.Acids.Res.39: e49 (2011)。亦可進行在人類、小鼠及大鼠細胞中使用Bxb1整合酶進行之整合。Russell等人 , Biotechniques40:460-64 (2006)。
如自使用之情形顯而易見，亦稱為異種特異性重組位點之重組酶識別位點一般稱為第一(1)、第二(2)、第三(3)、第四(4)、第五(5)、第六(6)、第七(7)、第八(8)、第九(9)、第十(10)等。根據本發明使用之適合lox位點包括但不限於Lox P、Lox 66、Lox 71、Lox 511、Lox 2272、Lox 2372、Lox 5171、Lox M2、Lox M3、lox M7及Lox M11。亦可使用其他RRS。Lox位點為最常用類型之RRS；然而，亦可使用不同RRS。
同源臂較佳在切割位點之約10至20個鹼基、更佳10至15個鹼基內開始。亦可使用較大距離，但其效率較低。為了確保插入至基因體安全港中之DNA卡匣在同源性修復有可能重建可靶向位點之情況下維持穩定性，如由熟練的具有通常知識者所確定，可使DNA卡匣之導引臂區含有破壞CRISPR目標位點之功能的變異(例如，鹼基錯配)。存在可獨立或一起採用之兩種方法。第一種方法為插入鹼基取代以在CRISPR二十個鹼基目標位點或原間隔子相鄰模體(protospacer adjacent motif，PAM)中產生鹼基錯配，其通常為2至6個鹼基。第二種方法為產生供體質體，其中插入分隔CRISPR目標位點或將CRISPR目標位點與PAM分隔。
人類細胞株包括羊膜細胞(諸如人類羊膜上皮細胞)、希拉細胞(Hela cell)、Per.C6細胞及HEK 293細胞。HEK 293細胞之實例包括但不限於HEK 293、HEK 293A、HEK 293E、HEK 293F、HEK 293FT、HEK 293FTM、HEK 293H、HEK 293MSR、HEK 293S、HEK 293SG、HEK 293SGGD、HEK 293T及其突變體及變異體。根據本發明，亦可使用嚙齒動物細胞株，諸如Sp2/0細胞、BHK細胞及CHO細胞及其突變體及變異體。CHO細胞包括但不限於CHO-ori、CHO-K1、CHO-s、CHO-DHB11、CHO-DXB11、CHO-K1SV及其突變體及變異體。
本發明之哺乳動物細胞係藉由有利地產生且利用具有卡匣之細胞中間物來產生，該卡匣包含由重組酶識別位點側接且經由RCME整合至基因體中的Cas9核酸內切酶基因。以不受任何理論束縛為前提，當表現時，本發明之整合Cas9基因之用途似乎藉由增加由Cas9核酸內切酶引起之基因體DNA中之切割之出現來增加整合至基因體安全港中之同源臂之效率。使用本發明之穩定整合之Cas9基因提供比不具有穩定整合之Cas9基因的HDR大10、10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8、10 9或10 10的HDR效率。最終，此中間細胞可進一步經歷RMCE以移除含有Cas9基因之卡匣。
作為用於工程改造細胞之起點，所關注多核苷酸序列以及可操作地連接之啟動子及視情況存在之操縱子可藉由轉染含有該等多核苷酸序列及元件之質體引入細胞中。因此，本發明包括如所描述之細胞之產生。
適合質體構築體可由本領域的具有通常知識者製得。先前所描述或本領域中已知之適用調節元件亦可包括在用於轉染細胞之質體構築體中。適用調節元件之一些非限制性實例包括但不限於啟動子、強化子、編碼適合mRNA核糖體結合位點之序列以及控制轉錄及轉譯終止之序列。適合質體構築體亦可包含非轉錄元件，諸如複製起點、其他5'或3'側接非轉錄序列及5'或3'非轉譯序列，諸如剪接供體及受體位點。亦可併入一個或多個可選標記基因。與本發明一起使用的適用可選標記蛋白及報導蛋白為已知的且可容易地由本領域的具有通常知識者鑑別。
編碼所關注基因之質體構築體可使用病毒載體或經由轉移之非病毒方法遞送至細胞。
核酸轉移之非病毒方法包括裸核酸、脂質體及蛋白質/核酸結合物。引入細胞中之質體構築體可為直鏈或環狀的，可為單股或雙股的，且可為DNA、RNA或其任何修飾或組合。
質體構築體可藉由轉染引入細胞中。本領域中具有通常知識者瞭解許多不同轉染方案，且可選擇適用於轉染細胞之合適系統。一般而言，轉染方法包括但不限於病毒轉導、陽離子轉染、脂質體轉染、樹枝狀聚合物轉染、電穿孔、熱衝擊、核轉染、磁轉染、奈米粒子、基因槍粒子遞送(基因槍)及專用轉染試劑，諸如脂染胺(Lipofectamine)、Dojindo Hilymax、Fugene、jetPEI、Effectene或DreamFect。
本發明藉由以下實例進一步描述，該等實例說明本發明之許多實施例及範疇，但不以任何方式限制本發明。在實例中，除非另外規定為陰性(neg。)標記，否則可選標記為陽性可選標記。 實例 1
此實例係關於在啟動子(諸如CMV啟動子)之控制下產生包含抑制因子(諸如TetR)之哺乳動物細胞。參見圖1。細胞經包含啟動子及抑制因子基因之多核苷酸轉染。將多核苷酸隨機插入至細胞基因體中。西方墨點及Taqman可用於細胞池中，以鑑別轉形體且測定平均複本數。抑制因子(諸如TetR)之整合允許控制處於啟動子及操縱子之控制下的多核苷酸之轉錄。 實例 2
此實例係關於進一步工程改造實例1之細胞。DNA卡匣1示意性地描繪於圖2中且包含側接lox位點(1及2)且進一步以5'至3'順序包含啟動子、編碼報導蛋白(1)之報導基因(1)、IRES及編碼選擇標記蛋白(1)之選擇標記基因(1)以及聚腺苷酸化訊號。DNA卡匣(1)視情況可包括與啟動子可操作地連接之操縱子。DNA卡匣(1)隨機或位點特異性地插入至細胞基因體中。DNA卡匣(1)上之第一lox位點及第二lox位點不同。
在tet操縱子用於DNA卡匣(1)中之情況下，多輪-配位體/+配位體分選及單細胞分選將鑑別用於dox調節之表現的Lox位點穩定細胞。因此，當存在配位體(諸如去氧羥四環素或四環素)時，TetR將不結合於操縱子，且藉此准許報導基因(1)及選擇標記多核苷酸(1)之轉錄的條件。 實例 3
在此實例中，進行RMCE以用實例2之細胞中之DNA卡匣(2)置換DNA卡匣(1)。如圖3中所示意性地描繪，DNA卡匣(2)包含側接lox位點(1及2)，且進一步以5'至3'順序包含啟動子、編碼選擇標記蛋白(2)之選擇標記基因(2)、IRES及編碼報導蛋白(2)之報導基因(2)及處於第二啟動子(視情況可操作地連接至操縱子)之控制下的Cas9基因。
在一實施例中，CMV啟動子可操作地連接至tet操縱子以控制Cas9基因之轉錄。當細胞處於存在去氧羥四環素或四環素之情況下時，TetR不再能夠結合tet操縱子，且因此允許Cas9基因發生轉錄。報導蛋白(1)與報導蛋白(2)不同，且選擇標記蛋白(1)與選擇標記蛋白(2)不同。 實例 4
此實例係關於將DNA卡匣(3)整合至基因體安全港中。參見圖4。DNA卡匣(3)以5'至3'順序包含多核苷酸，其包含含有sgRNA目標位點、lox位點(3)、可操作地連接至編碼報導蛋白(3)之報導基因(3)之啟動子、聚腺苷酸化訊號、lox位點(4)的第一基因體安全港同源臂及含有sgRNA目標位點的第二基因體安全港同源臂，其中第一導引臂目標位點及第二導引臂目標位點在需要時可各自含有具有變異之區域，以避免重新創造可靶向位點。Lox位點(1)、lox位點(2)、lox位點(3)及lox位點(4)彼此不同。報導蛋白(3)與報導蛋白(2)不同。報導蛋白(3)及報導蛋白(1)可相同或不同。在此實例中使用約1000個鹼基之同源臂。
當表現Cas9核酸內切酶時，增加DNA卡匣3整合之效率。以不受任何理論束縛為前提，本發明之整合Cas9基因之用途似乎藉由增加由Cas9核酸內切酶引起之基因體DNA中之切割之出現來增加整合之效率。使用本發明之穩定整合之Cas9基因提供比不具有穩定整合之Cas9基因的HDR大10、10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8、10 9或10 10的HDR效率。
若需要，則第一及第二基因體安全港同源臂之變異確保DNA卡匣(3)將藉由避免重新創造可靶向位點而保持整合。其中之較小卡匣(亦即lox位點(3)與lox位點(4)之間的區域)可用於RMCE且稱為穩定整合位點。 實例 5
此實例係關於細胞株之最終形式且示意性地描繪於圖5中。為確保細胞株隨時間推移之穩定性，較佳移除Cas9基因。因此，DNA卡匣(2)係藉由RMCE置換為DNA卡匣(4)，且移除Cas9基因。DNA卡匣(4)包含側接lox位點(1及2)及處於啟動子之控制下的編碼報導蛋白(4)之報導基因(4)。報導蛋白(4)與報導蛋白(2)及報導蛋白(3)不同且較佳與報導蛋白(1)不同。
所得細胞將在基因體內具有兩個整合位點，一個整合位點在基因體安全港(例如，穩定整合位點)內，且一個整合位點在特定基因體安全港之外。有可能藉由應用上文所描述之方法，包括使用整合Cas9基因及使用額外及不同GSH同源臂來創造又其他整合位點。 實例 6
此實例為相較於習知HDR使用如本文所揭示的具有同源定向修復(HDR)之Cas9之效率的比較。如文獻中所報導，HDR為精確的，但不頻繁地發生所需重組事件：1/10 6-10 9個細胞(0.0001%至0.0000001%)。Hsu等人 , Cell157:1262-78 (2014)。
為評定穩定整合之Cas9基因之優勢，修飾具有美國專利第7,771,997號(「穩定位點1」)及第9,816,110號(「穩定位點2」)中所揭示之位點的CHO細胞。Regeneron提供一套稱為EESYR®之貨物及服務。在穩定位點1及穩定位點2中具有整合序列之CHO細胞揭示於US 2019/0233544 A1中，且在其中各自稱為「增強型表現基因座」。可根據本文中描述及描繪之本發明使用此等專利及實例11及12中所闡述之序列。
CHO細胞經修飾以包括處於穩定位點1中之啟動子之控制下的氰基螢光蛋白報導基因及處於穩定位點2中之相同啟動子之控制下的選擇標記基因及黃色螢光蛋白報導基因。此外，處於第二啟動子與操縱子之控制下的Cas9基因亦插入至穩定位點2中。可根據本文中所含有之教示內容最終移除Cas9基因。
氰基螢光蛋白可藉由將位置66處之酪胺酸殘基改變為色胺酸來變為發綠色螢光。sgRNA遞送質體包含選擇標記(胺苄青黴素抗性)、POL III啟動子(RNA聚合酶III啟動子)、目標序列及gRNA架構、POL III終止子及消化位點1及2。Pol III啟動子包括H1及U6。
如圖6中所描繪，構築含有HDR模板之sgRNA遞送質體：104聚體插入物(具有57 bp臂及45 bp臂)、含有同源臂之401聚體(具有198 bp臂及201 bp臂)或1030聚體(具有524 bp臂及504 bp臂)插入物及實現自氰基變為綠色之序列，其在此實例中由2個核苷酸(「修復核苷酸」)構成。將HDR模板插入至sgRNA遞送質體之消化位點(例如，NotI及/或其他適當位點)中以形成sgRNA目標質體。不具有插入物(無HDR模板)之sgRNA遞送質體用作對照。
圖7展示對照在Q1中不展現綠色陽性。具有HDR模板之細胞在Q1中展現綠色陽性，且Q1中之綠色陽性群體隨HDR模板之大小增加而一致地增加(自左向右)。具有1030聚體HDR模板之細胞展示最大修復效率，其為約6.5%。
此實例之細胞具有穩定位點1及穩定位點2以及在根據本發明之GSH中產生之SIS。因此，此細胞具有三個用於穩定整合所關注基因之位點。 實例 7 - 產生包含基因體安全港 (AAVS1) 中之穩定整合位點的中間人類細胞
在此實例中，起點為具有由lox位點3及4側接之穩定整合之Cas9基因的HEK293細胞。Cas9基因處於至少啟動子(未描繪)之控制下。亦示意性地描繪AAVS1。參見圖8。可根據實例1至實例4及圖1至圖4製得此細胞。
靶向質體含有sgRNA目標位點、用於插入至諸如基因體安全港(此處為AAVS1)之區域中的左同源臂(此處為GSH同源臂)、Lox 1位點、報導基因(顏色1)、Lox 2位點、用於插入至諸如基因體安全港(此處為AAVS1)之區域中的右同源臂(此處為GSH同源臂)。關於替代靶向質體，參見圖9A及圖9B。在3'端處，一種靶向質體具有報導基因(顏色2)，參見圖9A。其他靶向質體在3'端處具有陰性選擇基因(陰性選擇1)。參見圖9B。啟動子及視情況存在之其他部分(諸如操縱子)由圖9A及圖9B中以5'至3'方向指向之箭頭表示。兩種質體均將顏色1插入至諸如基因體安全港(此處為AAVS1)之區域中。
Cas9介導之靶向質體(例如，圖9A或圖9B)整合至HEK293細胞之基因體安全港(AAVS1)中示意性地描繪於圖10中。顏色1由Lox 1及Lox 2側接。所關注基因可經由RMCE置換顏色1。
當根據圖9A之靶向質體經恰當整合時，細胞將為顏色1陽性及顏色2陰性。當根據圖9B之靶向質體經恰當整合時，細胞將為顏色1陽性且將能夠傳播，因為陰性選擇基因經移除。將此細胞視為中間物。最終，細胞可在lox位點3及4處進一步經歷RMCE以移除含有Cas9基因之卡匣，如圖8中所展示。參見例如實例5。
本發明方法之精確度展示於圖10及圖11中。圖11更詳細地描繪圖10之插入。細胞基因體(包括AAVS1)側接插入物及5'端及3'端。顏色1由Lox 1及Lox 2側接。圖11左側鑑別與5'接合點PCR一起使用的5'基因體引子及3'插入引子之位置。圖11右側鑑別與3'接合點PCR一起使用的5'插入引子及3'基因體引子之位置。
接合點PCR展示將正確大小片段擴增且標記為「穩定Cas9靶向細胞」。參見圖12及圖13。獲得且偵測穩定Cas9靶向細胞及5'接合點及3'接合點，其建立正確插入。陽性及陰性對照在各凝膠之右手側管柱處。 實例 8 - CHO 區域及序列
對於CHO細胞，可採用美國專利第7,771,997號(穩定位點1)及第9,816,110號(穩定位點2)中所闡述之序列。美國專利第7,771,997號及第9,816,110號之一致性百分比值內的序列及同源序列特此以引用之方式併入。本文中所揭示之AAVS1樣區域可用於產生根據本發明之穩定整合位點。
根據本發明使用之候選基因座報導於文獻中。Hamaker及Lee, Curr.Op.Chem.Eng.22:152-60 (2018)鑑別30個熱點基因座。Hilliard及Lee, Biotech.Bioeng.118:659-75 (2021)尋求使用針對Hi-C穩定區域之表觀基因體分析鑑別CHO中之安全港區域，且發現與由Hamaker及Lee鑑別之30個區域中之5個重疊。參見Hilliard及Lee之補充表3。Gaidukov等人 , Nucl.Acids Res.46:4072-86 (2018)亦鑑別用於CHO細胞中之整合的基因座，包括假定的Rosa26。Lee等人 , Scientific Reps.5:8572 (2015)報導倉鼠細胞中之COSMC基因座。總之，此等論文鑑別CHO中之若干未標註區域及基因區域，且該等基因區域闡述於以下：
BMP5 SSBP2 TRMT6 CLCC1 FAM114A1 (NOXP20)
LRBA DCN CEP128 AACS ALDH5A1
SMAD6 PTPRQ ROSA26 ADGRL4 GPM6A
K1AA1551 (C12ORF35) HPRT CLCN3 FER1L4 COSMC
實例 9 - 具有三個或更多個插入位點之 CHO 細胞
使用US 2019/0233544 A1中所揭示之細胞引用含有多個插入之CHO細胞。穩定位點1及穩定位點2可首先根據本文中含有的利用整合Cas9基因之教示內容使用。一旦一個或多個穩定整合位點被創造於基因體安全港中，諸如AAVS1樣區域(參見例如SEQ ID NO: 2)及對應體導引序列(參見例如SEQ ID NO:13至419)中。導引序列可在選自由以下所組成之群組的核苷酸位置範圍處結合於SEQ ID NO: 2中之目標序列：(a) 1至2000；(b) 2001至4000；(c) 4001至6000；(d) 6001至8000；(e) 8001至10,000；(f) 10,001至12,000；(g) 12,001至14,000；(h) 14,001至16,000；(i) 16,001至18,000；(j) 18,001至20,000；(k) 20,001至22,000；(l) 22,001至24,000；(m) 24,001至26,000；(n) 26,001至28,000；(o) 28,001至30,000；(p) 30,001至32,000；(q) 32,001至34,000；(r) 34,001至36,000；(s) 36,001至38,000；(t) 38,001至40,000；(u) 40,001至42,000；及(v) 42,001至44,232。
美國專利第7,771,997號及第9,816,110號之穩定位點1及穩定位點2可用於表現所關注基因以編碼所關注蛋白質。具有SIS之細胞最終可具有3、4、5、6、7、8、9、10或更多個位點以供表現所關注基因。
較佳地，包含穩定位點1及2之CHO細胞經修飾以在基因體安全港中產生第三位點，亦即穩定整合位點。用於產生此類CHO細胞之較佳基因體安全港在AAVS1樣區域中。根據本文中所含有之教示內容，可使用其他CHO細胞類型來產生多個位點。
圖14示意性地描繪包含整合至具有側接RRS (此處為lox 1及lox 2)之基因體之區域中的三個卡匣的例示性細胞。視細胞類型而定，三個卡匣中之各者可整合至不同穩定整合位點及示意性地描繪為位置A、B及C之其他可用位點(諸如穩定位點1及穩定位點2)中。報導基因可相同或不同。陰性選擇基因可相同或不同，但較佳相同。根據本文中所含有之教示內容，細胞可含有額外穩定整合位點及整合卡匣。
圖15示意性地描繪在位置A、B及C處示意性地描繪的圖14之細胞之修飾。三個卡匣各自包含側接RRS (此處為lox 1及lox 2)、所關注基因、陽性選擇標記基因及報導*基因。陽性選擇標記基因可相同或不同，但較佳相同。報導*基因可相同或不同，但各自必須與圖14之細胞中的報導基因中之任一者不同。所關注基因可相同或不同。圖14之卡匣藉由RMCE由圖15之卡匣置換。根據本文中所含有之教示內容，細胞可含有額外穩定整合位點及整合卡匣。
陰性及陽性選擇之組合確保經歷所有位點中之重組的細胞之分離。若所關注基因在三個卡匣中之各者中相同，則細胞可引起高產率蛋白質表現。舉例而言，7、8、9、10或更多公克/公升(g/l)之蛋白質產量為可能的。
圖16展示來自使用Cre-lox重組穩定整合至經2個整合位點(穩定位點1及2)或3個整合位點(穩定位點1、穩定位點2及AAVS1樣(參見SEQ ID NO: 2))工程改造之CHO K1衍生之宿主中的五個不同人類IgG抗體之結果。使用流式細胞測量術分離同基因型細胞株(ICL)。將進料分批生產之ICL接種至化學成分確定的生產培養基中，且生產培養進行13天。使用基於蛋白A 的HPLC之方法測定經調節之培養基中之抗體效價，且表現給定抗體(1、2、3、4或5)之各三位點細胞相較於比較兩位點細胞表現更大量的蛋白質。相較於兩位點細胞，三位點細胞可提供10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%或更大之增加。
替代地，不同所關注基因可用於卡匣中。舉例而言，抗體之重鏈及輕鏈序列可為所關注基因。
轉變為四位點細胞，較佳包含穩定位點1及2之CHO細胞經修飾以在基因體安全港中產生第三及第四位點，亦即穩定整合位點。用於產生此類CHO細胞之較佳基因體安全港在AAVS1樣區域中，其可為第三位點。第四位點可產生於其他基因座中，包括但不限於：
BMP5 SSBP2 TRMT6 CLCC1 FAM114A1 (NOXP20)
LRBA DCN CEP128 AACS ALDH5A1
SMAD6 PTPRQ ROSA26 ADGRL4 GPM6A
K1AA1551 (C12ORF35) HPRT CLCN3 FER1L4 COSMC
根據本文中所含有之教示內容，可使用其他CHO細胞類型來產生多個位點。
圖17示意性地描繪包含整合至具有側接RRS (此處為lox 1及lox 2，或lox 3及lox 4)之基因體之區域中的四個卡匣的例示性細胞。視細胞類型而定，四個卡匣中之各者可整合至不同穩定整合位點及示意性地描繪為位置A、B、C及D之其他可用位點(諸如穩定位點1及穩定位點2)中。報導基因可相同或不同。陰性選擇基因可相同或不同，但較佳相同。根據本文中所含有之教示內容，細胞可含有額外穩定整合位點及整合卡匣。
圖18示意性地描繪在位置A、B、C及D處示意性地描繪的圖17之細胞之修飾。四個卡匣各自包含側接RRS (此處為lox 1及lox 2，或lox 3及lox 4)、所關注基因、陽性選擇標記基因及報導*基因。陽性選擇標記基因可相同或不同，但較佳相同。報導*基因可相同或不同，但各自必須與圖17之細胞中的報導基因中之任一者不同。所關注基因可相同或不同。在此圖中，存在兩個所關注基因1之複本及兩個所關注基因2之複本。圖17之卡匣藉由RMCE置換為圖18之卡匣。根據本文中所含有之教示內容，細胞可含有額外穩定整合位點及整合卡匣。
陰性及陽性選擇之組合確保經歷所有位點中之重組的細胞之分離。四位點細胞適用於製造雙特異性抗體，其中兩種不同重鏈/輕鏈質體可靶向不同位點。
實例 10 - 基因體安全港序列
基因體安全港序列及類似者為本文中所描述的，且許多在文獻中且可公開獲得。例示性序列闡述於以下。 人類 AAVS1 序列人類AAVS1 ( 表示 安全港插入之天然RBS及導引RNA位點) (SEQ ID NO:1) GAATTCCTAACTGCCCCGGGGCAGTCTGCTATTCATCCCCTTTACGCGGTGCTACACACACTTGCTAGTATGCCGTGGGGACCCCTCCGGCCTGTAGACTCCATTTCCCAGCATTCCCCGGAGGAGGCCCTCATCTGGCGATTTCCACTGGGGGCCTCGGAGCTGCGGACTTCCCAGTGTGCATCGGGGCACAGCGACTCCTGGAAGTGGCCACTTCTGCTAATGGACTCCATTTCCCAGGCTCCCGCTACCTGCCCAGCACACCCTGGGGCATCCGTGACGTCAGCAAGCCGGGCGGGGACCGGAGATCCTTGGGGCGGTGGGGGGCCAGCGGCAGTTCCCAGGCGGCCCCCGGGGCGGGCGGGCGGGCGGGTGGTGGCGGC GGTTGGGGCTCCGGGCGCGTCGCTCGCTCGCTCGCTG GGCGGGCGGGCGGTGCGATGTCCGGAGAGGATGGCCGGCGGCTGGCCCGGGGGCGGCGGCGCGGCTGCCCGGGAGCGGCGACGGGAGCAGCTGCGGCAGTGGGGCGCGGGCGGGCGCCGAGCCTGGCCCCGGAGAGCGCCGCGCCCGCACCGTCCGCTTCGAGCGCGCCGCCGAGTTCCTGGCGGCCTGTGCGGGCGGCGACCTGGACGAGGCGCGTCTGATGCTGCGCGCCGCCGACCCTGGCCCCGGCGCCGGAGCTCGACCCCGCCGGCCGCCGCCCGCCCGCGCCGTGCTGGACTCCACCAACGCCGACGGTATCAGCGCCCTGCACCAGGTCAGCGCCCCCCGCGGCGTCTCCCGGGGCCAGGTCCACCCTCTGCGCCACCTGGGGCATCCTCCTTCCCCGTTGCCAGTCTCGATCCGCCCCGTCGTTACTGGCCCTGGGTTTNCACCCTATGCTGACACCCCGTTCCAGTCCCCTTACCATTCCCTTCGACCACCCCACTTCCGAATTGGAGCGCTTCAACTGGCTGGGCTAGCACTCTGTGTGACACTCTGAAGCTCTACATTCCCTTCGACCTACTCTCTTCGATTGGAGTCGCTTTAACTGGCCCTGGCTTTGGCAGCCTGTGCTGACCCATCGAGTCCTCCTTACCATCCCTCCCTCGACTTCCCCTCTTCCGATGTTGAGCCCCTCCAGCCGGTCCTGGACTTTGTCTCCTTCCCTGCCCTGCCCTCTCCTGAACCTGAGCCAGCTCCCATAGCTCAGGTCTGGTCTATCTGCCTGGCCCTGGCCATTGTCACTTTGCGCTGCCCTCCTCTCGCCCCCGAGTGCCCTTGCTGTGCCGCCGGAACTCTGCCCTCTAACGCTGCCGTGCCGTCTCTCTCCTGAGTCCGGACCACTTTGAGCTCTACTGGCTTCTGCGCGCCTCTGGCCCACTGTTTCCCCTTCCCAGGCAGGTCCTGCTTTCTCTGACCAGCATTCTCTCCCCTGGGCCTGTGCCGCTTTCTGTCTGCAGCTTGTGGCCTGGGTCACCTCTACGGCTGGCCCAAGATCCTTCCCTGCCGCCTCCTTCAGGTTCCGTCTTCCTCCACTCCCTCTTCCCCTTGCTCTCTGCTGTGTTGCTGCCCAAGGATGCTCTTTCCGGAGCACTTCCTTCTCGGCGCTGCACCACGTGATGTCCTCTGAGCGGATCCTCCCCGTGTCTGGGTCCTCTCCGGGCATCTCTCCTCCCTCACCCAACCCCATGCCGTGTTCACTCGCTGGGTTCCCTTTTCCTTCTCCTTCTGGGGCCTGTGCCATCTCTCGTTTCTTAGGATGGCCTTCTCCGACGGATGTCTCCCTTGCGTCCCGCCTCCCCTTCTTGTAGGCCTGCATCATCACCGTTTTTCTGGACAACCCCAAAGTACCCCGTCTCCCTGGCTTAGCACCTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTTGCCTGGACACCCCGTTCTCCTGTGGATTCGGGTCACCTCTCACTCCTTTCATTTGGGCAGCTCCCCTACCCCCCTTACCTCTCTAGTCTGTGCTAGCTCTTCCAGCCCCCTGTCATGGCATCTTCCAGGGGTCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCCCTATGTCCACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCACCTTATATTCCCAGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGT GGGGCCACTAGGGACAGGAT TGGTGACAGAAAAGCCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTCGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGAGCCATCTCTCTCCTTGCCAGAACCTCTAAGGTTTGCTTACGATGGAGCCAGAGAGGATCCTGGGAGGGAGACTTGGCAGGGGGTGGGAGGGAAGGGGGGGATGCGTGACCTGCCCGGTTCTCAGTGGCCACCCTGCGCTACCCTCTCCCAGAACCTGAGCTGCTCTGACGCGGCTGTCTGGTGCGTTTCACTGATCCTGGTGCTGCAGCTTCCTTACACTTCCCAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAGTTGGTCCTGAGTTCTAACTTTGGCTCTTCACCTTTCTAGNCCCCAATTTATATTGTTCCTCCGTGCGTCAGTTTTACCTGTGAGATAAGGCCAGTAGCCACCCCCGTCCTGGCAGGGCTGTGGTGAGGAGGGGGGTGTCCGTGTGGAAAACTCCCTTTGTGAGAATGGTGCGTCCTAGGTGTTCACCAGGTCGTGGCCGCCTCTACTCCCTTTCTCTTTCTCCATCCATCCTTCTTTCCTTAAAGAGCCCCCAGTGCTATCTGGACATATTCCTCCGCCCAGAGCAGGGTCCGCTTCCCTAAGGCCCTGCTCTGGGCTTCTGGGTTTGAGTCCTTGCAAGCCCAGGAGAGCGCTAGCTTCCCTGTCCCCCTTCCTCGTCCACCATCTCATGCCCTGGCTCTCCTGCCCCTTCCTACAGGGGTTCCTGGCTCTGCTCTTCAGACTGAGCCCCGTTCCCCTGCATCCCCGTTCCCCTGCATCCCCCTTCCCCTGCATCCCCCAGAGCCCCAGGCCACCTACTTGGCCTGGAACCCCACGAGAGGCCACCCCAGCCCTGTCTACCAGGCTGACCTTTTGGGTGATTCTCCTCCAACTGTGGGGTGACTGCTTGGGCAAACTCACTCTTCGGGGTATCCCAGGAGGCCTGGAGCATTGGGGTGGGCTGGGGTTCAGAGAGGAGGGATTCCCTCCAGGTTACGTGGCCAAGAAGCAGGGGAGCTGGGTTTGGGTCAGGCTGGGTGTGGGGTGACCAGCTTATGCTGTTTGCCCAGGACAGCCTAGTTTTAGCGCTGAAACCCTCAGTCCTAGGAAAACAGGGATGGTTGGTCACTGTCTCTGGGTGACTCTTGATTCCCGGCCAGTTTCTCCACCTGGGGCTGTGTTTCTCGTCCTGCATCCTTCTCCAGGCAGGTCCCCAAGCATCGCCCCCCTGGCTGTTCCCAAGTTCTTAGGTACCCCACGTGGGTTTATGAACCACTTGGTGAGGCTGGTACCCTGCCCCCATTCCTGCACCCCAATTGCCTTAGTGGCTAGGGGGTTGGGGGCTAGAGTAGGAGGGGCTGGAGCCAGGATTCTTAGGGCTGAACAGAGCCGAGCTGGGGGCCTGGGCTCCTGGGTTTGAGAGAGGAGGGGCTGGGGCCTGGACTCCTGGGTCCGAGGGAGGAGGGGCTGGGGCCTGGACTCCTGGGTCTGAGGGTGGAGGGACTGGGGGCCTGGACTCCTGGGTCCGAGGGAGGAGGGGCTGGGGCCTGGACTCGTGGGTCTGAGGGAGGAGGGGTCGGGGGCCTGGACTTCTGGGTCTTAGGGAGGCGGGGCTGGGCCTGGACCCCTGGGTCTGAATGGGGAGAGGCTGGGGGCCTGGACTCCTTCATCTGAGGGCGGAAGGGCTGGGGCCTGGCCTCCTGGGTTGAATGGGGAGGGGTTGGGCCTGGACTCTGGAGTCCCTGGTGCCCAGGCCTCAGGCATCTTTCACAGGGATGCCTGTAC CHO AAVS1 樣區域序列(插入之導引物進一步展示於以下實例13中) (SEQ ID NO:2) CCAGCACCCACATGGTGGCTCACAACTGTCCGTAACTCCAGTTCCAGAGGATCTGATGCCCTCTTCTGTCTCCCGCGAGCACCTGGCACACACGTGATGCACACTTAAACACATGCAAGCAAACCATCAGACACATAACTTTTTTTTCCAATTTTTTAAAGATTTAGTTATTATTATTTACTTAATAAATATTTATTATATTTATTACATATACAGTTTCTGCCTACATGCCAGCAGAGGGCACCAGATTGAATTGTAGATGGTTGTGAGCCACCATGTGGTTGCTGGGAATTGAACTCAGGACCCCTGGAAGAGCAGTCAGTGCTCTTAACCTCTGAGCCATCTCTCCAGCCCCTCCATTTTTTTTTTTTTAAATAAAGAAATGTAATGTCCTAAGTGGGGCTTAGAGAGTGGAAGCAGATAAAGAAAGATGGAGTTAAGAATTTTAAGAAGCCAGTTGGCGGTTGTGCATGCCAGCACTCAGGAGGCAGAGGCAGGTGGATGGATCTCTATGAGTTCGAGGCCAGCCTGGTCTACAGAGAGAGAGTTCCAGGACAGACTTCTCCAAAGCTACAGAGAAACCCTGTCTGAACCCACCACGACCACCACAAAGAAAAAAAGGATTTCAAGAGGAGAGCCAGGTTTATAGCAAGAGAGAAAGTTGTGAACTAATGCCCAGGGCTTAGTGTGGCCTACCTCTGGGCTGGGTCTCTCTCTGAACACAGGGTGGAGCTGCCCCGGGAGGAAGAAGCGGCTCCGTACAGTCCCGAATTCTACAGTGGCTGGGAGCCTCCCGCCACTGACCCGCAGGGCCGCGCCTGGGAGGACCCGGTGGAAAAACAGCTACAGCATGAGAAGAGGCGCAGGCAGGTGAGGCAGGGTTGCCGGGGGAGCACTGGGCTCCCCGTTTCTGCACAACATGGGCGAGCAGGACGTCTGAGGTCTAGCCTGCCTGACCCCAAGCTCTCTCTCTTCCCGCAGCAAAGCGCCCCCCAGATCGCTGTCAATGGGTGAGTGACCGCTGCAGGGTGGCCAGGGATGGGGTTGGGAGGACTGAGTCCCGGGGTCACCCCGGCTCTGACTCCGACCCTCCCCCTTTTTTCTTGTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACCTCTGCCTTCCCGGCTCTTTGCAGGTGGGTGAGGTGGTGAGGAGGCGGGGCTGGGGTGGGGGTGGGGGAGGAGCCAGGAGGGAGGGGGGGAGGAGCCCAGAACTCTGGGTCCAAGGGAAGAGGGAAAGGAGGCTTAGTTTGCTGAAGCTATGAGAGTTAGGGGCTGAAAGTGGGTGGGTCTAAAGGCTTGGACCCCACACCCCCACCCCCGGCATCCTCAAAAGATTGAAAAGGTGCAGTTTGGTGTTCTAGGACCTGGGAGAGCACCATGCTTGAGTCCCCAGAGCACAGAGCACTGGGTGTCAGAGAAAAAAAAAAAATGGAGACCAAAAAGCAGGGTTGGGACTTCCGAGGATTCAGGGACAAGTTTGAGGAAACGTGAGAAAGTGCTGGCATCCCTGGACCACTAACTGAGGTGGGACTTCCGGCTTCCTAATGCGCAAAGGAATAGCACGTACTGAGCAAACTGGAATGCTCCCAGGGCTGAAAGAATGGAGGAAATTGAAGGTCAAGGCACGGACTCCTGCCTAGGTCCCTGGGAAGGAAAGAACTAGGGACCTAAATTTACAGTTCTACCAAACTATGGAAGCTGAGGGCTGCAGGTCCAGGTGAGGAAGTGATGGAGAGGGGGTCACAGCCCTAGGATCCTTGGGGAAATAGGGGCCAGGAGTGGAGGGCGTGGATGTGGCTTGAGAACAAAATGATAGACTTGGAGGAGAGGAATTGGGGGCCTAGGTGAGAGCCCCAGCAGAGGGTCTCAGCAGGGACGGCATACTGGGAGCTGTCAGTCCCACACATGGGGCGCCGAGGCCCTGAAGAGTCCCCTCCTCCCTTCCACAGGTAGGCCTGATCCGGGATGAGGTCTCTCTTGCTGGGGGCGCCAGAGCTAATCGTCCCCCAGGCTGCCTGGTGCTGCAGGGCCCTCTTGTCTGTCTGTCTGCTTCTGAATCTTGGGCTCAGCACCTGCAAGCTGTTTACTCGCCTTCTCTGGCTGTAATTTCTTTGCCTGGAAGGGTGAGGACTCTCTGGCGCTGTAAGGGGCTTGCAAAGAGCTCAGTGCCGTGACTCAGCCTGAGTTCAAATCCAGCTGCATGAAGAACAGTACAGAGTGACCCTGACAAGGGCAGCCTAGGGCCAGCTCAGTCACACCTTTCTCTTTCTTGTGCACTGGCCGTTACTACAGTATCCCTCGGTTCCTTCATATAGAAAGAGAAATAGTGAGCCGGGCAGTGGTGGCGCACACCTTTAATCCCAGCACTTGGGAGGCAAAGGCAGGTGGACCTCTGTGAGTTCAAGACCAGCCTGGTCTACAAGAGCTAGTTCCAGGATAGTCTCCAAAGCCACAGAGAAACCCTGTCTCGAAAAACCAAAAAAGAAAAAAGAAAGAAAGAGAAATAGTGAGACCGGCAGTGGTGGTGCACGTCTTTAGTCCCAGCACTGGGGAGGCAGAGGCAGCCGGATTTCTGTGAGTTCAAGGATAGACTGGTCTACAGAGTGAGTTCCAAGACAGCCAGAACTAAACAGTGAAACCCTGTCTTGGAAAAAAAAAAAAGTGAAATAATGGCCATATTCTGGTGATGGTGTAGGCCTGTGGTCCCAGCTACTCAGAGACATGAAGCAGGAGAATAAAAATCAAGGCCTGCTTTGACTACAAAGTGAGCTTCAAAGGCCAGCCTGGGCAAAGCAACAAGGCCTTGCCTCAAAATGAAAAAATAAAAATAAAAGAGGCTGGAGAAATGGCTTAGTGGTTAAGAGTACTGGCCGCTCTTCCAGGGGACCAGGGTTCAATTCCCAGCACCCAGACATACAGCAGCTCACAACTCCAGTTTCAGGGAATCCGGTGTTCTCTCTGGTCTCTGTAGGCACCAGGCACTCAAGTTGTGCAGACATAAAATAACACAGAGGGCTGGGCTGGGGCTCAGTGGCAGGCATTTGCCCAGAATCCCCCAGTAAAGACATAGCTCAGTGAATCCAGAGCTGAGGGGCTGGGCGTATATTAATGGTGGAATCCTTGCCTAGAATTCAACCAGCGAAGGGCTGTGGCCGTGGCTCGGCTGTAGAACCCTGTCCTGGTATCTACCATGAAGGGCTGGGACATGGCTCAGAGATAAAACACTTGCCTAGACTCTACCGCTGAGAGCCTGGGGTGTGGATCAGTGGACAGTGCCCGCCTAGCATGCACAAGGCCCCTGGGTTCAATCCCCTGTACCACAAAAAAAAGGGGGGGTGGAGGGAGGGTAAGAGTGAGATCTCAGGAGAAGGAAGGAACCAAATTCATGGAACTACAAGGGAACTCCAGGAGAATCGAAGCGTTTCTGGCGTACGTTGCTGTGTAAGCACAAGGGTCGGCTATTTTTGCACCCTGTTCATTATCCTAGCGGGTGATGGGAATAGATCTGCTGTCTCTAGCCGATTCCTCATGATCCTCACTGATGAAAATGCAGGTGAGGGGCTGGAGAGATTAAGAACACTGTCTGCTCTGGCACTGGACCTAGGTTCATTCAGCTCCCCACAGCACATGGTGGCCCACAAATATCTGTAACTCCAGCTCTAAGAACCCAGGTCTAGGACACCCTCTCCTGGACTCTGTGGCTACTGCACACAGGTGATGCACATACACACACATGCATGCAGGCAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAATGCATGTGAACGACTGGGGATGAAGCTCGGAAGCTAAGCACTTCCCTGGCATGCACGGGCCCTGGGTTCAATCCCCAGCACCCCATAATGAATTAAATCGTTATCATGATACGGTGTGTTTACTGCATGGTGCCAGGCAAGGAAATGAGCTAACTCCATTCAAGCTGTGACTCCAGTGTCAAGCCTGTATTAACATATTAACCTGGGCCTCTGCTCTGACCCCCTGCTTGGCTCTAACCCCACCTCACACCTTAGAGTCCAGACCAGCAGGGCTGGCTACCTCCTAATCTCCTGCTGGTTTCTTTCTCCCCAGTCATCAAGATCCAGACCTGGAAGCCGCCGAGCTAGAAGAGAGAGCCAGAAAGTGGGTTCTGTGTAACTATGACTTCCAGGCCCGAAATAGCAGCGAGCTGTCTGTCAAGCACGGAGATGTGTTGGAGGTTAGCGGTGTGGGGGGCCTGAGACCCTGAAATTGGTCAATTTAGCCCTAGGTATAGAACCGGAGCGTGAATTCTCTCCTTATACGCCACCTAGGTCCTGGATGACAGGCGCAAGTGGTGGAAGGTTCGGGACCATCAGGGACAGGAGGGTTATGTACCCTATAACATCCTGACACCCCACCCTGGACCTCAGGTGCACCGCAGCCAAAGTCCTGCAGGAAACCTAGTAAGTCGGCGTGTTCTTGCTTCTTCGGGGAGAAAGGGGGGCAAGATCCTAGGTCCTGGGGATGAGGACAGAGAAAATCAGGTGTGAAGGTTGCTGTTTGGAAAGGGGGGGGGGTGGTCAGATGTTTATTGGGAAAGGAGCTGGAAGCCTCTCTTCATTCCCTTCCAGGAGACGAGTACTCCTCCTCCCCCACCCGCACCAGCTCCAGCCCCTGCTCAGGTGCGACCCCACTGGGACAGTTGCGACAGTCTCAACAATTTGGACCCCAGCGAGAAGGGTGAGTGGTGGAGCGTCACTCTGGGAAGTGATCCTTGTCTTCGCTTTTCAGGCTCCACCCTGGGCACCCTAGCGGCTCCCAGCCCCCTGACCCCAGAACCCCTGAGCGCGCACTCCCCTCCGCCCCCCCCCCTCACGGTTTCGCTTCTGCAGAGAAATTCTCCCAGATGCTCAGTGTCAATGAGGAGCTGCAGGCGCGCCTTGCGCAGGGCCGTTCGGGTCCCAGCCGGGTAGCCCCGGGA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CCR5 序列( 表示 用於插入整合位點之假定導引物) (SEQ ID NO:3) 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hRosa26 序列(SEQ ID NO:4) ( 表示 用於插入整合位點之假定導引物) ACCATTTAAACCTCAAATTAAGCAACCCACAGAACCAGGAAGTTCAAGGACCATGTCTGTTTTCACCACGATGTCTTTCCCCACCCCCCCACCCCCCACTCCACCCCCCACTAAGGGCAGGGTATTGTATCTGCCAGACTGGGTATTTGTTGAACAAGCGAGTATTTTCGCCTATTAGCTTAGTTTTTAAGGAAATCATTTTTTACTTGATTCATCATAGCTTTAATTCTATTACATACTACAATAAAAATTTGACAAGACTGATACAAATATGTAGTGGGCAATAGTTTGCCGTCTTCTTCCCTAGTATGGTGTTTTTCAATCTGGTGACTAGAATAGGCAGTGGGCTATAAGCAGGATTCATAAGGCCTGGAGCTGAGTTATATGTGACACTGCCACCTATTCATTGTGTGACCTTGGTTTTAACCTTCAAAGTGGGTCTCCTGGACTAAAAGAATGTGAAAAGATGGGGAAATAAATCTGTAATCTGAACATGGAATGACTTAGTTACAGACCAGACATATTGTTACTGGGAATGAAAAAGTCAATATATTTGAGGGGAAAAAAATGTAAATAAATATTGAGAAAGATTTTACAAATCTAATTAGGGGAAGATAGTTATCTCCCAATACTAGAGGGTACCAGAGTGCTTTTAAGGGGAACATTTGGTTACCCTTATTTCTTTAAAAAATGGCAGTTTAGGAAATTCTGCCCTAACTGTAGTCCCAATGTCAGATAGGACTCAGGTCTCCACTGCAAGGACCAAAATGTTAAGTTGAAGACTGAAAATGGGAAAATTTGGAAATGTCTTTGGAACCTCAAGTACATAAAAGCCTGTAAGTGCTTCATACTCATTAACAACATAGGCATAGAAAAAAGATATCCTTATTCTCAAGCATAGCCTTTTCTAATAAGTTCATGTTAGATGTCATGAAGTTTAGTGAGGAGTGAAAATCTATGAGGAAAAACATGAACCATTCTACTCTGGCAAAAGTTCAGGACAAACACCATAGGCCTGTATACCAAATTTTAAACCATGTTGAATAATGTGAAAAAAAGCATCACATTGCTTATGAAAGGCTTTCCTGTCGCCCCTTAATACTTCTGTCTCAGGCTAACATGTTTGTTAATGAGTTACAGTGGTGAAGTTAAGGAAATCTGCTTCCTGTCCTAGCATGCCCATTATCCCAGCCATACAGATTTAATACCAGGAGTCACTTTAACTCCATGAAGTCATTCAACAGGTACTTGAGTATTTACTATGTGCGTTTGTGCTAGAGTAGCCATTTCTTAAACTTTGTGGCCTCAGAGAATCCCTTCACATTCTTAAAGATTGAGGGCCCCAAATCACTTTACTAGTATCTTACCATATTAGAAAGTAAAATATTTAAATATTATAGCAACAAATGCATATTTTTAAAAAAATAGGTGCATTGTTTTACATTTTGGCAATTGTTTCCCTAAATGTCTGACTTAAATAGAAGACAACTGAATTGTTTCTTTTGCATTCAATTGGTTACAATGTTACTAGCAGTTTTCTATAATCTCACGTATTAGTCATTAGGAAAATATAGCTTCACTGAGTTATGTCAATCTCCCAAATGTTGGCCCATTTTACTGTATACTACCTAAAATATCATTGGCCGGGCACAGTGGCTTAAACCTGTAATCCTAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCAAGACCACCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGTACAGTGGTACACACCTGTAGTCCCAGTTATGCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGACAGAGGTTGCAGTCAGCCAGATGTCCCAAAAAAAAAAAAAAATTATTTTCAATATCACTATCTCATGAAGTATTGGGAAGCTGTCAAGTTCCTGATATTAGACACAAGTTTTCCCGAAATTCTGATTTTGACTCAACGTTTGGATTTTATCATTGAAAACAATTGCTGTCAGTTGTTAGGCTCCAAGGAAATAGCAGATAATTCAGCTTACATGAGTGCTTTTTCTTGAGACAACCATTTCAAAAAGTTATGTACTGTAGGGTTTAAGATTTAACAAAATGTCACTGCTTTCACAAGGACATTCTTGAGTGAAACTGGTTTTTTTCTTTTGTGGGGGTTCACACCACAAATGCATGGCAGTGAAAAATAACTTAGAGTTTGATGCCACTGCCACAGTTTGTGCCAAGGTGCCTGAAATTTTACTTTTACCTACTGTTGCCTTATCACCACTCTTATGTCAACATATAGTTTAGCATAAACCATGAGATTTTAAAAAGTTATTCTACACTTGCATTATTTCAGGACATGTGTTTGTTGCCAAGCTTTCACGTAAGAGTATCTTTAACTAGTTGGTGCTGATGCCTGGCAAATACAAGCCAAGTAACAAGTCCAGCCATGTTTATGCACGCATCCATTGATAACGTATTAGCACAGTCAGCCCTCCATATCCTCAGGTTCTGCATCTGCAGATTCAACCAAATGTGCTTGAAAATATTTGAGAATATTTAATACAATAGTACAAATATAAGTACACAATGTAACAACTATTTATATAGCATTCACATTGTATGAAGTATAAGAAATCTGGAAATGATTTAAAGTATATGGGAGGATGTGTGTAAGTTGTATGCAGATACAGCGCCATTTTATAAAAGGGAATTCAACATCCTTGGGTTTTGGTGTCCTTGGCAAATGGCCAGCAAGGGTGGGGGAGTGCTGTCCAGAAACCAATCCCAAAGCAAGGGACAAATATATACTTCTACAGATGAGATATTAACTCAGAATCCATGTCTGCACACACATCTTTAATGACAAGTTGCTTTATCACTCAACAGCGGCACTACTATGATCTTTTACTTACACTTCAGCCAGCAGAGACATTCAGCAGTGTGAGATTTTTTAAGTTTTTCAGCTATTGTGTATGTTTCTAGTGTATAATAAAGTAACTTATCCTTTAAGATACTTAAGTAGCTTTTCATTTCTAGCTTTAAAACCTGTTTTTTTTTTTTTCCCAGTAGTGGCATACCTGCATTAAAAAATAATGCCTTACCAAAAAAAGCACTCTGAATGATTGGTTTCAAAATGATGCCACAACATAGGTGGCACCAACACTATTCAAGATCATTCCATTCCCATCTCTAAAAAAATTTTTGGCTGGGTATGGTGGCTCACGCCTATTAACTCAACATTTTGAGAGGCCCAAAGCAAGATCACTCAGGGCTAGGAGTTGAAGACTAGCCTGAGCAACATGGCAAGATCCTGTCTCAAAATTCTTTTTAAAATTTTTTTAAAAGCCCAGGCTTGGTGGCGCATGCCTATAGTTCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGAAGGATCTCTTGAACCCAGGAGTTTCAGGCTGTAGTTCACTATGATGGCAGCTGTGAATAGCCTGGGCAACACAGCAAGACCTCATCTCCAAAAAAAGACAAAAGAACTAAATTATTCTACTGCAGAACATGATTAGGTAAATATCTCCAAAGCAGAAAGACAGGTTTCATATTTTCGTTAGTTTGAGTCAGTCCTTCCAAATCAAATCTTGTTTTTTATTAGTATACAGATGGTATAGCCAGTAAGTAAATGAGAAGCAGTCTTTTTAAGCCGATCCATTCTTAAATGAAAAAATATATAAATATTTTAGAATAAATTTATTAAATTCTAAAGTTGTAGAATTTTTAAATTTGGATATTTTGGGAAAATATTTAAACCACTATTGCAAACAAAACAACAAAATGTACTTATGTTTATACTTAGGCACAAAGAAAACTACAGTATTTTAAAGTAACCATTACACAATATTGAGGTTGCAAAGATTACTGAAGGCATAACCTAAAAAATGAGTTGATTTCTAAAAATGGGAAAAAGGAAAAAAATAATTTCTAAAAACAAGTATGCATACCTAAACCTACCTAATGACACCTTAGAAAATTCAAGTATAGCACCATTCATTAACATCAATGAGGATGTCATCACACATCATGTAGCCTCTGCACACCGTGAGAATAAATGAAAAAGACAGGCATCTTGCTATCATGACAATAGTTTTGACCTCGCAGACCTCTCTGTGCTTACGCAACGGATAAAGCCATAAGAACTGTCCTGCCCTCAAGGAGCAACCTAAAGTAGGAAAAAAAAAACAAAATTACACAATTATTATTTACAATTGTGAGAAGAGCTCTTGACAACATTCAAATGGAGGATACAGTGTAGTAAGGGTGAGGGTATCAAGGCTTCCTTGAGAAGTGATGTTTTGAGGCCATTCTTTCTTCTCAATAACTGGTATTTGGTTCCTGAATCCTTTAACTTCCTTACCATTGTCACTCCTAAGCCAAATCTCATTACGTCATGTCTAGACTACTGTTAAGAGAACCACTTAAGTGGTCTCTGCAGCCCTCAATTTATTGGTGTTATCTATGGGAAAATTGCTCAAACTCTAAGCCTTAGTTTCCTACCCTATAAAATGGGGTTTTATATACAAGGAACATACTAAATACACAGGTATACCTCAGAAACACGGCAGGCTCAATTCCAGAGCACTACAATAAAGCGAATCTCATGAATTTGTTGGTTTCCCAGTGCATAAATTATGGTTACACTATACCATAGTCTATTAAGAAGTGTACAATAGCATTATGTATAATTGATAAATACATCACTGCTAAAAAAATGCTAACAATCTTTTTGCTGGTGGAGGGTCTTACGCCAACGTTAACGATGGCTACTGACTCATCAGGGTGGTGGTGGTTGAAGATTACGATAGCTGTGGCAATTTCTTAAAAGACAATGAAGTTTGCCACACTGACATCCTTTCACAAGACTTCTCTGTAGCATGTGATGCTGTTTGATAGCATGATAGCATTTTACCCACAGTAGAACTTTTTTTTCCTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTAAACG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實例 11 - CHO 及小鼠穩定位點 1 序列 - 美國專利第 7,771,997 號211＞ 6473 ＜212＞ DNA ＜213＞ 灰倉鼠 ＜400＞ 1 (SEQ ID NO:5 ) tctagaaaca aaaccaaaaa tattaagtca ggcttggctt caggtgctgg ggtggagtgc 60 tgacaaaaat acacaaattc ctggctttct aaggcttttt cggggattca ggtattgggt 120 gatggtagaa taaaaatctg aaacataggt gatgtatctg ccatactgca tgggtgtgta 180 tgtgtgtgta tgtgtgtctg tgtgtgtgcc cagacagaaa taccatgaag gaaaaaaaca 240 cttcaaagac aggagagaag agtgacctgg gaaggactcc ccaatgagat gagaactgag 300 cacatgccag aggaggtgag gactgaacca ttcaacacaa gtggtgaata gtcctgcaga 360 cacagagagg gccagaagca ctcagaactc cagggggtca ggagtggttc tctggaggct 420 tctgcccttg gaggttcctg aggaggaggc ttccatattg aaaatgtagt tagtggccgt 480 ttccattagt acagtgacta gagagagctg agggaccact ggactgaggc ctagatgctc 540 agtcagatgg ccatgaaagc ctagacaagc acttccgggt ggaaaggaaa cagcaggtgt 600 gaggggtcag gggcaagtta gtgggagagg tcttccagat gaagtagcag gaacggagac 660 gcactggatg gccccacttg tcaaccagca aaagcttgga tcttgttcta agaggccagg 720 gacatgacaa gggtgatctc ggtttttaaa aggctttgtg ttacctaatc acttctatta 780 gtcagatact ttgtaacaca aatgagtact tggcctgtat tttagaaact tctgggatcc 840 tgaaaaaaca caatgacatt ctggctgcaa cacctggaga ctcccagcca ggccctggac 900 ccgggtccat tcatgcaaat actcagggac agattcttca ctaggtactg atgagctgtc 960 ttggatgcaa atgtggcctc ttcattttac tacaagtcac catgagtcag gaggtgctgt 1020 ttgcacagtg tgactaagtg atggagtgtt gactgcagcc attcccggcc ccagcttgtg 1080 agagagatcc ttttaaattg aaagtaagct caaagttacc acgaagccac acatgtataa 1140 actgtgtgaa taatctgtgc acatacacaa accatgtgaa taatctgtgt acatgtataa 1200 actgtgtgaa taatctgtgt gcagcctttc cttacctact accttccagt gatcaggttt 1260 ggactgcctg tgtgctactg gaccctgaat gtccccaccg ctgtcccctg tcttttacga 1320 ttctgacatt tttaataaat tcagcggctt cccctctgct ctgtgcctag ctataccttg 1380 gtactctgca ttttggtttc tgtgacattt ctctgtgact ctgctacatt ctcagatgac 1440 atgtgacaca gaaggtgttc cctctggaga catgtgatgt ccctgtcatt agtggaatca 1500 gatgccccca aactgttgtc cagtgtttgg gaaagtgaca cgtgaaggag gatcaggaaa 1560 agaggggtgg aaatcaagat gtgtctgagt atctcatgtc cctgagtggt ccaggctgct 1620 gacttcactc ccccaagtga gggaggccat ggtgagtaca cacacctcac acatactata 1680 tccaacacac acacacacac acacacacac acgcacgcac gcacgcacgc acgcacacat 1740 gcacacacac gaactacatt tcacaaacca catacgcata ttacacccca aacgtatcac 1800 ctatacatac cacacataca cacccctcca cacatcacac acataccaca cccacacaca 1860 gcacacacat acataggcac acattcacac accacacata tacatttgtg tatgcataca 1920 tgcatacaca cacaggcaca cagacaccac acacatgcat tgtgtacgca cacatgcata 1980 cacacacata ggcacacatt gagcacacac atacatttgt gtacgcacac tacatagaca 2040 tatatgcatt tgtatatgca cacatgcatg cacacataca taggcacaca tagagcacac 2100 acatacattt gtgtatgcac acatgcacac accaatcaca tgggaagact caggttcttc 2160 actaaggttc acatgaactt agcagttcct ggttatctcg tgaaacttgg aagattgctg 2220 tggagaagag gaagcgttgg cttgagccct ggcagcaatt aaccccgccc agaagaagta 2280 ggtttaaaaa tgagagggtc tcaatgtgga acccgcaggg cgccagttca gagaagagac 2340 ctacccaagc caactgagag caaaggcaga gggatgaacc tgggatgtag tttgaacctc 2400 tgtaccagct gggcttcatg ctattttgtt atatctttat taaatattct tttagtttta 2460 tgtgcgtgaa taccttgctt gcataaatgt atgggcactg tatgtgttct tggtgccggt 2520 ggaggccagg agagggcatg gatcctccgg agctggcgtt tgagacagtt gtgacccaca 2580 gtgtggggtc tgggaactgg gtcttagtgt tccgcaagtg cagctggggc tcttaacctc 2640 tgagccatcc ctccagcttc aagaaactta ttttcttagg acatggggga agggatccag 2700 ggctttaggc ttgtttgttc agcaaatact cttttcgtgt attttgaatt ttattttatt 2760 ttactttttt gggatagaat cacattctgc agctcaggct gggcctgaac tcatcaaaat 2820 cctcctgtct cagtctacca ggtgataaga ttactgatgt gagcctggct ttgacaagca 2880 ctttagagtc cccagccctt ctggacactt gttccaagta taatatatat atatatatat 2940 atatatatat atatatatat atatattgtg tgtgtgtgtt tgtgtgtgta tgagacactt 3000 gctctaaggg tatcatatat atccttgatt tgcttttaat ttatttttta attaaaaatg 3060 attagctaca tgtcacctgt atgcgtctgt atcatctata tatccttcct tccttctctc 3120 tctttctctc ttcttcttct cacccccaag catctatttt caaatccttg tgccgaggag 3180 atgccaagag tctcgttggg ggagatggtg agggggcgat acaggggaag agcaggagga 3240 aagggggaca gactggtgtg ggtctttgga gagctcagga gaatagcagc gatcttccct 3300 gtccctggtg tcacctctta cagccaacac cattttgtgg cctggcagaa gagttgtcaa 3360 gctggtcgca ggtctgccac acaaccccaa tctggcccca agaaaaggca cctgtgtgtg 3420 actctggggt taaaggcgct gcctggtcgt ctccagctgg acttgaaact cccgtttaat 3480 aaagagttct gcaaaataat acccgcagag tcacagtgcc aggttcccgt gctttcctga 3540 agcgccaggc acgggttccc taggaaatgg ggccttgctt gccaagctcc cacggcttgc 3600 cctgcaaacg gcctgaatga tctggcactc tgcgttgcca ctgggatgaa atggaaaaaa 3660 gaaaaagaag aagtgtctct ggaagcgggc gcgctcacac aaacccgcaa cgattgtgta 3720 aacactctcc attgagaatc tggagtgcgg ttgccctcta ctggggagct gaagacagct 3780 agtgggggcg gggggaggac cgtgctagca tccttccacg gtgctcgctg gctgtggtgc 3840 atgccgggaa ccgaaacgcg gaactaaagt caagtcttgc tttggtggaa ctgacaatca 3900 acgaaatcac ttcgattgtt ttcctctttt tactggaatt cttggatttg atagatgggg 3960 gaggatcaga gggggagggg aggggcgggg agacggaggg aggaggggag gaggggagga 4020 ggggaggagg ggaggagggg aagggatgga ggaaaatact aacttttcta attcaacatg 4080 acaaagattc ggagaaagtg caccgctagt gaccgggagg aggaatgccc tattgggcat 4140 tatattccct gtcgtctaat ggaatcaaac tcttggttcc agcaccaagg attctgagcc 4200 tatcctattc aagacagtaa ctacagccca cacggaagag gctatacaac tgaagaaata 4260 aaattttcac tttatttcat ttctgtgact gcatgttcac atgtagagag ccacctgtgt 4320 ctaggggctg atgtgctggg cagtagagtt ctgagcccgt taactggaac aacccagaac 4380 tcccaccaca gttagagctt gctgagagag ggaggccctt ggtgagattt ctttgtgtat 4440 ttatttagag acagggtctc atactgtagt ccaagctagc ctccagctca cagaaattct 4500 cctgttccgg tttccaaagt actggagtta tgagtgtgtg ttaattgaac gctaagaatt 4560 tgctgattga agaaaacctc aagtgggttt ggctaatccc cacgacccca gaggctgagg 4620 caggaggaat gagagaattc aaggtttgcc agagccacag ggtgagctca atgtggagac 4680 tgtgagggtg agctcaatgt ggagactgtg agggtgagct caatgtggag actgtgaggg 4740 tgagctcaat gtggagactg tgagggtgag ctcaatgtgg agactgtgag ggtgagctca 4800 atgtggagac ctgtatcaag ataataatag tagtagtaac aatgcaggcg agggtgtggt 4860 tgagtggtag agcagttagt tgatttgaca tgcttgaggt ctcccggtcc atctgtggcc 4920 ctgcaacagg aagggaggga ggaagggggg gaacgagaga gaggaaagag agacagaagc 4980 taagataggg aatgagagag gaaggaagaa acgggaagaa attcagactc cttcctgagt 5040 tccgccaacg cctagtgaca tcctgtgcac accctaaggt ggcctttgtg tggcactggc 5100 ttgggtggtc gggaaaggca ttttcagctt gttgcagaac tgccacagta gcatgctggg 5160 tccgtgaaag tttctgcccg ttaacaagaa gtctctacta cttgtgacct caccagtgaa 5220 aatttcttta attgtctcct ggtgttctgg gttttgcatt tttgtttcta aggatacatt 5280 cctgggtgat gtcatgaagt ccccaaagac acagtggggc tgtgttggat tgggaaagat 5340 gatttatctg gggtgtcaaa aggaaaagaa gggaaacagg cacttgggaa aatgtcctcc 5400 cgcccacccg aattttggct tggcaaccgt ggtggaggag caagaaacac gtggacgttt 5460 gaggaggcat ggggtcctag gaggacagga agcagaagga gagagctggg ctgacagcct 5520 gcaggcattg cacagtttca gaaggagatt acagcatgac tgagttttta gggatccaac 5580 agggacctgg gtagagattc tgtgggctct gaggcaactt gacctcagcc agatggtatt 5640 tgaataacct gctcttagag ggaaaacaga catagcaaac agagccacgt ttagtgatga 5700 aactctcact ttgcctgagt catgtgcggc catgcccagg ggtcaggctg acactcaact 5760 caaaaacaag tgagaaattg aagacaatcc gtggtggcag ctactggaag ggccaccaca 5820 tccccagaaa gagtggagct gctaaaaagc catttgtgat aggcacagtt atcttgaatg 5880 catggagcag agattacgga aaaatcgaga atgttaatga ggcaacattc gagttgagtc 5940 attcagtgtg ggaaacccag acgcttccat cccctaaaag gaacatcttg ctctcagtca 6000 aaatggaaat aaaaattggg gcttgaattt ggcaaatgat tcagaactct gtgtaggtat 6060 tttcacacgc acagtggata attttcatgt tggagtttat ttgtgctaaa aggcagaaaa 6120 gggtaaaaag cacatcttaa gagttatgag gttctacgaa taaaaataat gttacttaca 6180 gctattcctt aattagtacc cccttccacc tgtggtaatt tcctgagata gtcagtgggg 6240 aaaagatctc tccttctctt ctttctcccc ctcccctcct ctccctccct ccctccctcc 6300 ctccctcctc tccctccctc cccctttcct tctttctttg ctccttctcc tctgcctcct 6360 tctccctttc ttcttcattt attctaagta gcttttaaca gcacaccaat tacctgtgta 6420 taacgggaaa  acacaggctc aagcagctta gagaagattg atctgtgttc  act      6473 ＜211＞ 7045 ＜212＞ DNA ＜213＞ 灰倉鼠 ＜400＞ 2 (SEQ ID NO:6) actagcgtgc aattcagagg tgggtgaaga taaaaggcaa acatttgagg ccatttcctt 60 atttggcacg gcacttagga agtggaacat gcctaatcta ctggtttgta ccacctttcc 120 ctataatgga ctgtttggga 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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 2700 gtatggattc taagaaagcc gtaacagctg gagctgtgta cggagttcag cgtggtacta 2760 gaagaacaga cattcatgat gaaacacccc aggattttta cttagtatct agtttccatt 2820 gttgttttga gaccggctct tatgctctcc aggctggcct caaactgctg atcttcccgc 2880 ctctacctct caagtcctgg gactacttgg ctcataaaac agtttttgtc gggctccctg 2940 aagttatggt tgtacaaacc gtgggggtca atatactcac ttgggcagag agagaaggtc 3000 tgaatcccag acaatgactg catctcagga cagttgggaa gaggacaatg gcagaaggac 3060 ttagaaaaga tagactggag ggtggaaaag cagcaggaac agagaaacaa aacaggaagc 3120 ttgctatcca gggccactct ggagtcctgt ggcaagatgg aagcgggcta ggggaataca 3180 tttgtgctac tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgat caatgcctat 3240 caatgttgaa ggggaaatat gtataccaca ttgattctgg gagcaattct cagtatctgg 3300 cctagagaaa ggaatggccc ctgcagaata gacagagtga atggtgccct ttatcatttg 3360 ctaaagtgaa ggagaaataa acatccttcc atagagtttc aggtaaatga accccacagt 3420 tcatctgtgc cgtggtggag gcctggccaa cagttaaaaa gattagacac ggacaaagtc 3480 tgaaggaaac acctcgaata ggaagaggag 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7045 ＜212＞ DNA ＜213＞ 灰倉鼠 ＜400＞ 4 (SEQ ID NO: 8) caattgatta tagatggatg atagatagat agatagatag atagatagat agatagatga 60 tggatagaca gatgatggat agttagagga tagataatga ctgaataata agtacataaa 120 tagatgatag agcggggcgt tggtggtgca cgtctttaac cccagcacca gagaggcaga 180 ggcagttgga tctctgtgag tttgaggaca gcctggttac agaatgggtt ccaggacagc 240 caaggctgtc actcagagaa atactgtctc aaataaaaaa agtaagtaaa caaataaata 300 aatgataact agttagaaga tagatgattg aatgataggt agataaatag aagatagata 360 gatagatgat tgatagatga tagacagata gacagacaga cagacagaca gacagcagaa 420 agataatgca cggtgaaaca tggtctgatt tagttagcaa gatcagagaa gccttctttg 480 aaagtgacat ttgagagcat ttcaaacgct gttcatgtca ggcatgccaa tggggagaga 540 agggcttgca gaaagcaggc ccggcaagcc atggggagca agctaggagg cagcattcct 600 tgcatttgcc tctgcctcag ctgcttcctg gagttccccg gtttttatca caacagtaga 660 aataaaacca ggacaatgtt gtttccatgc atacatctgc aagaacttac tccggttcaa 720 tagacagacc aaggcacctg tgtttgctca agaagcacgg agggaggtgt gtgcacctgc 780 tgggtgctgg tgctctggct gtgccagaca gagagcaaga 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atatatatat atatattgtg tgtgtgtgtt tgtgtgtgta tgagacactt 3000 gctctaaggg tatcatatat atccttgatt tgcttttaat ttatttttta attaaaaatg 3060 attagctaca tgtcacctgt atgcgtctgt atcatctata tatccttcct tccttctctc 3120 tctttctctc ttcttcttct cacccccaag catctatttt caaatccttg tgccgaggag 3180 atgccaagag tctcgttggg ggagatggtg agggggcgat acaggggaag agcaggagga 3240 aagggggaca gactggtgtg ggtctttgga gagctcagga gaatagcagc gatcttccct 3300 gtccctggtg tcacctctta cagccaacac cattttgtgg cctggcagaa gagttgtcaa 3360 gctggtcgca ggtctgccac acaaccccaa tctggcccca agaaaaggca cctgtgtgtg 3420 actctggggt taaaggcgct gcctggtcgt ctccagctgg acttgaaact cccgtttaat 3480 aaagagttct gcaaaataat acccgcagag tcacagtgcc aggttcccgt gctttcctga 3540 agcgccaggc acgggttccc taggaaatgg ggccttgctt gccaagctcc cacggcttgc 3600 cctgcaaacg gcctgaatga tctggcactc tgcgttgcca ctgggatgaa atggaaaaaa 3660 gaaaaagaag aagtgtctct ggaagcgggc gcgctcacac aaacccgcaa cgattgtgta 3720 aacactctcc attgagaatc tggagtgcgg ttgccctcta ctggggagct gaagacagct 3780 agtgggggcg 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atgcctgaca tgaacagcgt ttgaaatgct 13020 ctcaaatgtc actttcaaag aaggcttctc tgatcttgct aactaaatca gaccatgttt 13080 caccgtgcat tatctttctg ctgtctgtct gtctgtctgt ctgtctatct gtctatcatc 13140 tatcaatcat ctatctatct atcttctatt tatctaccta tcattcaatc atctatcttc 13200 taactagtta tcatttattt atttgtttac ttactttttt tatttgagac agtatttctc 13260 tgagtgacag ccttggctgt cctggaaccc attctgtaac caggctgtcc tcaaactcac 13320 agagatccaa ctgcctctgc ctctctggtg ctggggttaa agacgtgcac caccaacgcc 13380 ccgctctatc atctatttat gtacttatta ttcagtcatt atctatcctc taactatcca 13440 tcatctgtct atccatcatc tatctatcta tctatctatc tatctatcta tctatcatcc 13500 atctataatc  aattg                                                 13515 ＜211＞ 14553 ＜212＞ DNA ＜213＞ 小家鼠 ＜400＞ 6 (SEQ ID NO:10 ) cttgaagaac acatgttttc caagagggag cacccatgtt ggaatgacaa tgtagttagt 60 gctcctctcc tgtaggttag tgctcctttg ctataggtaa gtgctcctct cctataggtc 120 agtgctcctc tcctataggt tagtgctcct ctcctatagg ttagtgctcc tctcctacag 180 gttagtgctc ctctgctcta ggttagtcct gctctcctat 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agaatgcgag 5280 agagggagga agagagaaaa aggaaaagag agaggaaagg aaaaaggaaa atgaggaaag 5340 cgagaaagaa gaaatgagaa agaggaaagg gagaaagaaa tgagagagag aaaagaaaag 5400 acagaatgcg agagagggag gaagagagaa aaaggaaaag agagaggaag ggaaaaagga 5460 aaatgaggaa agcgagaaag aagaaatgag aaagaggaaa gggagaaaga aatgagagag 5520 agaaaagaaa agacagaatg cgagagaggg aggaagagag aaaaaggaaa agagagagga 5580 agggaaaaag gaaaatgagg aaagcgagaa agaagaaatg agaaagagga aagggagaaa 5640 gaaatgagag agagaaaaga aaagacagaa tgcgagagag ggaggaagag agaaaaagga 5700 aaagagagag gaagggaaaa tggaaaatga ggaaagcgag aaagaagaaa tgagaaagag 5760 gaaagggaga aagaaatgag cgagataaaa gacagaattt gagagaggga ggaagaaata 5820 ggaaaagaga ggaaaggatg gagaaaagag agaaagaaag agagatgaaa gagagaaagg 5880 agaaatgaaa tgagagagag agagagacac aaagagccag agagagaaga aaaaagggga 5940 aagagaaaga gaaagaggaa ggctcctctt ggacacatct tcctttatct ttccctgggg 6000 accgccaaag cctggtggca tactgtacat tctgtacact gttcattcaa aacaggctct 6060 gtcttaaaga tggtctgagc ggtcagaaaa gggtattgtt aacttgtttg caaaactgcc 6120 tcaggagagt gctgagtgcg tgaaagttgc tgcccgttaa ggagaagtct ctactacttg 6180 tgatctcacc atcgaaaatt tctttaattg tctcctggtg ttctgggttt tgcagttttg 6240 tttctaagga tacattcttg ggtgatgtca caaagtcccc aaagacacgg tggagctgtg 6300 ttagatgggg aaagacagtc tgctgaggat ttatctggaa ctgtcagaag gaaaagaagg 6360 taaatggggc acttgggaaa gtggcctcta gtttgacttc tggcttagca aaggttgtgg 6420 ggagataagg catacacagt agttagcagg aggcaacagg gtcctgggag gacgcgaggc 6480 agaaggagag gctgggctga cagcatgcaa tcattgcata gtctccaaag gagattgcaa 6540 catggctgag ttttcagagg tcctacagag cccgtggtag agattctgtg ggttctgaga 6600 caacttgact ttagccagat ggtatttgag taatctggga gagagaaaac agctacagca 6660 aacagggcca catttagtga cgaaactctc actttgactg ttgagtcatt tgcagtgggc 6720 cctgaggtca ggctggccct cagctcaaaa acaagcgagg aactgaagca attactcaga 6780 taatccacag ccacagccac tggaaagggc cacatcccca gagacagcac agcaggggtg 6840 ggggtggggc tatgagaaag ttagtgattg tagcagttat ctagaatgtg cggagcagag 6900 gaggttacac aaaaacctag aatgtcattc aatgtgggaa accgagaggc tcccaagccc 6960 taaaaggaac agtttgcttt cagccaaaat ggaaataaaa tttggggctt aaatctggca 7020 aatgattcag accttctgtg taggtgtctt taaatgcaca gcagattgat tttcatgttg 7080 gagtttattt gaactaaaag acagaaatgg tgaaaagcac acctgaagaa attgagatgc 7140 tatgaataaa atcatttact tacagctatc acttaattag tacctccttc caccttgctg 7200 atttattggg ctagtcaagg aagaaaagat cttccctcct ccttctctcc tcctccccct 7260 cctctcctcc tcccctcccc tccttgacct tcctctcctc cttttccctc ctccccctct 7320 tcttctcttc accccctcct cccctcccct cctctgtact cctccccttt cctcccaatc 7380 tcttttttct cccccttctt ctctttctcc cccctcctct tccctcctct tcctccctcc 7440 ctccctcctc ctcctcatcc tcctcttcct cttcatcctc ttctccttcc tccctctcct 7500 cctcctcctt ttccagccct acctaccttc cctttcttct tcatttattc aaagtagctt 7560 tgaacagcac tactcggttt agttgtgtat aaaaggaaaa tgcaggtcca agcagcttgg 7620 ggaagattgc tttttgctct ctggaggcag atgatgacag ttcaagatca ttccttttgc 7680 tccatgtcac aggaaggggg acatgccgaa tctaccagtt tgcagccacc tacacaggat 7740 ccaccttcac ttctaaggaa atgtttggga agctacctac caaccacttc tggcatctca 7800 tgggctagag gactcttaaa tggcactctt atttgtttaa taaaggaggt tgtgacgtgt 7860 agttttaaat cccttccaca caacaattgc tactctctga ccaaaaaaga agggagacag 7920 gatacggcta ggtgtctagt agactttacc actttgaaaa gccttaatat aaatcaggta 7980 gatacatctt tttaacttat tcttgtaaag acaaaaacaa aactttattt ttatttgtgt 8040 gtatgcttgt gtgtgtgtgc ctgtgtgtat accacatgtc gctggtgccg gagaacacca 8100 gaagagggga cctgatctcc tggagctaaa gctatccatg gttctgagct gcctgatgtg 8160 ggtgctggga acagaactct ggtcttctgc aagagcaaca agcctcctct taactacgaa 8220 tctcctcccc atccccccaa atacatttaa ttattcattt tagcagcttt atttcgtaac 8280 tacttatcac agcataaaac aaggatttta tatatattac atgcaatcga ggataagagt 8340 tgaggggaga tgcgtgtgct ccttctgggt gtctgtgctt ttgaagaatg taagcagtgc 8400 acaagggacc gaggcgtgcc tgtctgccag gagctgtctt cttcccttgg actctgagct 8460 gagtgcagtg ctccgaagaa gtaaaagacg acctcatgaa gcaatgtctt caacccaaac 8520 atgctgtcca gacaaagtcc agcttcatta gtgctctgag gagagactta ctgagcctca 8580 ggaaagcccc cctcagcatg gcgaaagtcc actttgattg aagtgactcg aaagccatgg 8640 cagtgcggcg gcggccgcgt ggagcttgtg ctcgagtcgg aagcggcatc tttgtcaggc 8700 ggctgtgatt agcacgggga ggcaggactg gagtgaagga agagttgggg gcggggctta 8760 gcgctctggt ctcctaagct gtagtcagcg cctcaagatt tgtaacctgc cttctgcctt 8820 cccagccagg cagtcaagtg gctccaagct gaagactgca aagtgcccct aaccttttgg 8880 ttatagcgag gctgaagaca ccgtgctctt tcatgaaagc cggatgtctg aaatccgatt 8940 tgataaatat ggataaaacg tataacgctc gatcaatcga atcgaaggag ctcacgattg 9000 gcaccacggc tttggggaca acagagtact gactcgttgg gaggacttgg atacttcccc 9060 tcctcttcca tctcttcccc tttcctcact tcctcctcct tccttctcca ttttctccct 9120 cttcactgtt tcttactatt tttacaaaag attttattta tttatttatt tatttattta 9180 tttatttatt tatttattta tttatttaat gtatgcgagt acactgtagc tgtcttcaga 9240 cacaccagaa gagggcgtca agttccatta gagatggttt cgagccacca tgtggttgct 9300 ggggcctctg gaaggaccgc cagtgctctt aacccctgag ccatttctcc agtacccttc 9360 tcaccgtttc tcttcaatct tcttcctctt ccttctccac tttccttgtc ttcttggttt 9420 cattatcttt ctccctttct tcctcttctc cccttcttcc tcctccactg tagttttcct 9480 tccctactct tttcctgcct ccctcctcct cccctctcat tccccctcct ctttcctcct 9540 tctccctcct cctccttcct tctccctctc ccctctcccc tctcccttct cccttctccc 9600 cctcctcttc ctctttctcc ttctccaccc ctcctgtcac agtatcaatg gcaagggtgt 9660 tctagaatgg aggagtgtcc cctaggcact aacgaaagcc agttaggatg ctctgagacg 9720 ggtacaattc agggagggcc gtggggatgg aagggttgtg ctgcgattca ttctggagca 9780 acccccaggc agaatcatga ggttggttcc ggattcgcag ggcacaattc agaagaggaa 9840 ggtttcagga aggacgagtt tgtctgagat aggagttaca tctgatgtct tggcagcaga 9900 gccactgtac aagcgtgctt tattaaccac gtgggattaa atcttctttt aaatttattt 9960 tcaactctta aggaaacgtg aactttcaca ttcaaattta gacttgcagc tcttatgggg 10020 aaaaaaaggg gatcttaaga atattaagca taggcggctg gagagatggc tcagcggtta 10080 agagcactct ctgctctccc agaggtcctg agttcaattc ctagcaacca cataatagtt 10140 aacaacagtc tttaatgaat tctaatgccc tcttctggtg tgtctgaaga cagttacagt 10200 gtactcatat aaataaaata aagaaattta aaaaaatgaa tattaggcat agattcctgg 10260 atcctaagaa agccatcaga gctggagcca tgtgtgggat cctgcttggt gctggagggg 10320 cagagttcat gcccccgggg tttttactta ttatcacatt ttcatcgttg ttttgaaaca 10380 gggtcttgtg tggtccaggc tggccttgaa ctcatctttc agcctctacc tcacaggttc 10440 tgggattact tggttcctaa aagtatctcc gtcaagctcc ctggtgttat ggctgtgcca 10500 accaggaggg tctatacact cgctcaggta gagggagaag atccgaatct ctgacaggga 10560 ctgctgcctc tcggggcaaa tggagtgaag gacagcggca gaaggattta ggaaagatgg 10620 acgggagagt ggaaatgctg cagaagccag aaaacaaagc aggaagcctg ctgtccagtg 10680 gggctcaaga gcggagggat gcgagggggc tgcgcaggaa catttagcgt ctgcgtctat 10740 gggggtaggg gcggggtgcc agcacctagt cacctgaagg ggaaatgctt gcccagggag 10800 caggtctcag tagctgacct agagaaagga gcggccccta cagaggagac acgggtcact 10860 gtttgttaaa gtgaaggaga aataaatatt ctttcaaaga atcttaggtg agcccagttc 10920 atctgcgctg tggaggcctg gggaacagtt aaaaagaccc tgacacacac ccaaggcaaa 10980 caagcaacac acggctcctt ccgtaagggt ccatgattct ctgaagaatc agccccggaa 11040 tcagccccgg aatcaggtag tccgtaaaca caatgagtgt tttactctgc agaagtccag 11100 cctgctggcg tctcccatta ccaaaataga gggatagtca cgtgagctca ccggctcgat 11160 ttaaggcacg tggttttcca gggtagatga gctttggctt ctggaaccat tatggggcac 11220 gaaggatgga gccaggattt tttttttttt tttttttttc tattagcaat tgatttgctt 11280 gggcttggct ggacttgccc agttcttagg cccagtcttc ttaactgccg atctgaagtc 11340 tgtcatggag tcagcctagc cttctcactt cccttcagct cgaataggaa gaggaggtgc 11400 acaccagatg gtctgagagc agggataaat ggtgtgcctt tgtctttcag tatttcgtta 11460 ttttaagtag gaagatgctt ttctgtatta cattgcttgt gaaaccggaa gttgattcgg 11520 ggcacaggac aatggatttg gtgttttgca aggactgttt cagaagagag aggagtggaa 11580 gggtggttag agtgaggagt ggggtgggac gggatggggg aagagaagga agggccagac 11640 aggctaggta gggctgagag gaggcggtgg gaacttcttg agttagcgca gcagtaaact 11700 tggatgtgcg tgtatctttg tgatatatga cccggagccg tgtagctggc tccgatagta 11760 ctgctaatgt cagtgtcggg gggggggggt cccatactgt tccacagggg ctgcacattc 11820 ccatcgagag caggagggct cctctctcca tacatcctcg ccagcattcc ttgttgtttc 11880 tgtgatgaca gggggtggga tgaaatctct ctgttggttt gagagaccgt gaagaagctc 11940 aaccccagga cattttgcag tcttggaagg cagtgcctcc atgtggagcc gtggagccca 12000 tctctgagtc caggtcactc ttgcagttcg cactcagctc ttcagatgca ggagagacgt 12060 tggtgggaaa gcaagattgt ttgcttgttg agatagacac attctccaca caaaggctca 12120 cgtggggcaa aggctgattg acgtacagcg ttcaggaacg cctgtggtag agctatgatt 12180 agctgtctcc atctatgaag cagacaaaga gttataaaaa aaatcaatgt tttcaaattg 12240 tcaaactttt aacccgacag caagcgctct gtccctgggc taatccctag ccctggtttc 12300 ttgagatggg gtcttttgtg cactagactg gcctagaact cacgatctta gtgttccagc 12360 ctcccagctg ctgggatgag ccgctataac cagtctgcct gccttcctaa attttaagtg 12420 atgggaagtg ggggagaata cagtttaaag tatgcagatc tgagagcagg aacctggcaa 12480 agccaagggg ccggagttac aggcggctaa catgggtgct gggaactgac ccaggtcctt 12540 gagaggagca gtgtgtactc ttgaccaaac aggtccgtct ctccagtccc cgtagtatta 12600 aaaataggta ctacgggcat ggtggtgcac acctttaatc ccagcactag ggaggcagag 12660 gcaggtggat ttctgagttt gaggccagcc tggtctacaa aatgagttcc aggacagcca 12720 cggctataca gagaaaccct gtcttgaaaa caaaacaaca acaaaatagg tactacaaag 12780 cgatgtaatt gtgctcaaac atgcaaaccg aggggactgt atgcataaga aagagaaaga 12840 cggccacact ggttctatct gggtgacagg aaatcagtat ttttattttt cacattcatt 12900 tttttgttgt tgttgttgac acagtgattt ttctatcaaa aacattattt cttttatagt 12960 tcccctgagg agctgttttt aaagccgtgc tttgaaaaac cattgaagga gcagaggcag 13020 ggagactcct gtgtggcagt cggtgaagca ggccctctgc aggcaggctg gccctggact 13080 tgggagtctc tttccctccc tcctgtgctc aaatagcaaa tgtcaggctt caatgtagct 13140 agaaggttct agaatgatta agtttccaag gctgaagagc ttccctgttt gcctttcact 13200 tccctggaga ggtcgttgtg tgttccggag tctgcaaggt gcctttggtg atgcgggtgg 13260 ttcatctcgg gagattccgc ctggaggacc caagttcaag ccctgcctga gctacagagt 13320 gactttcagg tcttctgcgc aattcagtga gacccagtct acaaataaaa agtaaaaaga 13380 aggctgtgga tggaactcgg tggtagagtt ctgggtttac tccctagagg aggggagaag 13440 gaggaggagg gaggaggaag aggaagaaag aagaagagaa gggaagagga gaaggaaggg 13500 agggaagggg ctgacaagaa gagagaagag ggagggaggg gagggaaagg aaggggaaag 13560 gaagggaggg aaggggctga caagaagaga gaagagggag ggaggggagg gaaaggaagg 13620 ggaaagaaga gaagggtaag aagaaactgt tccaatggtc tgggccacag agtgatggcc 13680 ttttgtggtg atcagctgta atccttgatt tgacacaacc tagaatctgg gaagcgagtt 13740 tctgtgaagg agcattcaca ctggctggcc tgtgggcgtg catgtgggag actgtcataa 13800 ttaggttcat taatacagga agtcccagcc cactacaaat ggcttcgttc catacccaag 13860 agatgctaac tgtagacggt tggagaaagc aagcaagctg tggatacccc acgctctttc 13920 acctcggctc ctggggggtg ggtgcactgt gtctcttggt attttaaagt cctgccttga 13980 cgtccctgct gtgacagact gtaactggaa ttgtgagctt tagtccttta gttttctacg 14040 ttggtttttc tcaggatatt ttatcgcagt aacagaaaca agaccaggac acttgatctc 14100 ctctgatcaa cactgaagag ttacaaaaca ggctgaggaa acaaactttc ttctccctct 14160 cccccttctg tccctcccct tccttctcgc tccctccctt gccccctctc tccctgtctc 14220 tgtctctgtc tctgtctctg tctctgtctc tgtctctgcc tctcccctcc cctcccctcc 14280 ctctgtctct gtctctgtct ctgtctctgt ctctgtctct gtctctgtcc ctttctcctc 14340 tatctcctaa atggctggag gccatgctag ctcaatgttg aactttgaac acgtatttag 14400 gaaatctttg ttcttaacag ttctgaagtg ctgaagtggt ggtttagtct ctcggcctga 14460 caagctcact tcctctcact ctgtcttaat gaccaaatct gccatttccc taaaacagca 14520 caggctccag         ctccaggttg ctccggagcg gag                              14553 實例 12 - CHO 穩定位點 2 序列 - 美國專利第 9,816,110 號＜211＞  4001 ＜212＞  DNA ＜213＞  灰倉鼠 ＜400＞  1 (SEQ ID NO:11 ) ccaagatgcc catcaactga ttaatagatg ataaaattat tgtacatttc agtgtaatat       60 tattcagttt ttaagaaaaa tgaaattatg taataagcat gtaaatggat atatcttgaa      120 acaaccattc cccattatat tacctaaaca ttgaaagtcc aaaatcatat gatcttttta      180 gtggatctac taatcttttg ctatatgtat tttattgaac tacccatgga tgtgagataa      240 ttggtaacaa cagcacatgg gagagcatgg gatcattcaa ggaagattag agagaatgca      300 ttttttagga gataatggag gagcaataga aaggattaaa tgaggttact gatgaaagtg      360 atggttagag aaggcaatat gaggagggat aactagcact tagggccttt tgaaaaagac      420 atagagaaaa tactattgta gaaacttcct ataattggtg tatagttata tacaccaaag      480 agctcagatg gagttaccct ataatggaaa tattaactac tttttatcac tgtgataaaa      540 catcctgaac agagcaacat agattgggaa gcatttactt tggcttacag ttctaacggg      600 ataaaaattc atgatgaaag aatgaatatg tcagcaaaca gcagtagcaa tggcctgaga      660 agcaggtgag agctcacatc ttgaagtgta agaatgtagc agagagaaca aactgcaaat      720 gaccagaaaa tgcttttgga tcagagccca tacccctctg actgacttct ccagaaattc      780 tgaacaaata aaactcccca aacagagcca taactgaagg tccagtgtct gagactacta      840 ggggtatttc ttattcaaac cactacaatg gggtgggggg agcaatcctc caagtaggca      900 ctacacacag acaaataaaa actctagtaa ctggaatgga ttgacttatt tgaattactt      960 gccagtggag ctacatagag cacaattatt gtatttaaat taccctttat gatcttacaa     1020 aacttgacag taagatcata ttgctaaaga aaccacatat ttgaatcagg gaacatggtg     1080 atatctagtt gttcttcaac tggaaacttc atgctttctg cccagcattc atgttgctgg     1140 aaagagcaat gtacactacc agtgtagaaa ttaaatcatc aatcttatca agatgtggat     1200 cctataagtt acaataaaaa ttagcctgat aagatatccc caccagaaga atattcacat     1260 aaatgctatg ggagcaacaa gctattttct aaattagctt taatcctatt ctacaagaga     1320 gaatccatat ctagaatagt tatagggatc aagaacccat ggcttgattg gtcataggcc     1380 caatgggaga tcctaatatt attgttctac aaaatgaaaa taactcctaa tgacttgttg     1440 ctgcagtaat aagttagtat gttgctcaac tctcacaaga gaagttttgt cttacaataa     1500 atggcaatta aagcagcccc acaagattta tatcataccg atctcctcat ggcctatgca     1560 tctagaagct aggaaacaaa gaggacccta agagagacat acatggtccc cctggagaag     1620 gggaaggggg caagacctcc aaagctaatt gggagcatgg gggaggggag agggagttag     1680 aagaaagaga aggggataaa aggagggaga ggaggacaag agagagaagg aagatctagt     1740 caagagaaga tagaggagag caagaaaaga gataccatag tagagggagc cttgtatgtt     1800 taaatagaaa actggcacta gggaattgtc caaagatcca caaggtccaa ctaataatct     1860 aagcaatagt cgagaggcta ccttaaaagc ctttctctga taatgagatt gatgactacc     1920 ttatatacca tcctagagcc ttcatccagt agctgatgga agcagaagca gacatctaca     1980 gctaaacact gagctagttg cagacaggga ggagtgatga gcaaagtcaa gaccaggctg     2040 gagaaacaca cagaaacagc agacctgaaa aaaatgttgc acatggaccc cagactgata     2100 gctgggagtc cagcatagga cttttctaga aaccctgaat gaggatatca gtttggaggt     2160 ctggttaatc tatggggaca ctggtagtgg atcaatattt atccctagtt catgactgga     2220 atttgggtac ccattccaca tggaggaatt ctctgtcagc ctagacacat gggggaggtt     2280 ctaggtcctg ctccaaataa tgtgttagac tttgaagaac tcccttgaga agactcaccc     2340 tccctgggga gcagaaaggg gatgggatga gggttggtga gggacaggag aggaggggag     2400 ggtgagggaa ctgggattga caagtaaatg atgcttgttt ctaatttaaa tgaataaagg     2460 aaaagtaaaa gaagaaaaga aaacaggcca aaagattata aaagacagag gtggtgggtg     2520 actataaaga aacactatta tctaaataaa aacatgtcag aagcacacat gaacttatag     2580 tgtttatgaa agtatgtata ataactacat aatctcaagc caagaaaaaa atatcatctt     2640 tcagtgatga aggtgatttt atttctccca gaattaaagc caaagaccta atgaaagtaa     2700 ttatcttcaa aaggttgaaa atacatactt tgcaatacac agatctgcct agaaatctca     2760 tgttcacaat acacatgatg ctcaattgaa ttccattcaa tgttacagtt tagataaaca     2820 gtttgtagat aaactcacaa tgtatcattt ctttttattt tttgaccaaa cagcttctca     2880 tctgttattc agaataattc ctcgatggca ggatatccat cccaattggg ggaaggggag     2940 aatttgaaga aaacctagac cacatacata tttgccattg ggaaacaaag tctaaaatga     3000 tgttgttcac atcttctcta ctagtcctct ccccgtccca aagaaccttg gtatatgtgc     3060 ctcattttac agagagagga aagcaggaac tgagcatccc ttacttgcca tcctcaaccc     3120 aaaatttgca tcattgctca gctctgccct tctcatatga cagttacaag tcaaggcttc     3180 caaagtccct ctgtcatgtt tggtgtcaat agtttataca gatgacttca tgtcttcata     3240 tctaatgtct tatatagatt aatattaaac aatgttattt ctctaaccac attttaaatt     3300 aatttaaaaa tccattaatt gtgtctataa aatgcagaca gagtgctgag acacaatata     3360 agcctgatga tctgaatttg aaactcacac ccaccacatg gagaatcaac ttccaaaaat     3420 tttcctatta cttccacact tacaccattg tacaaacaca ataataatga acaaaatgaa     3480 atgaaataaa aaattaagtc tctgtaggta atgctactgt gcagcaaaag taaaaatggc     3540 agcttaagct tgctttatgg ttacacttta ccatcttcca ttaattataa ggacttcaat     3600 catggcagaa ctatgctgtt attgtctcag tgtaacctaa ccaggtgttc cagatgttct     3660 taatgtggac acctaaacta tttgatattt gggttaagat ctttccctct ttcagaagaa     3720 acctcaggac agagggaatc ttgtctttta attttgagtc tgtagacttt ttccatttca     3780 aatatacatg aaacaagtga tgaagaaaat taatcaaaag gtgggaattg caatgatatt     3840 aggttcaata ttaagcttca atattatcat ggaatcgcct gttatacact gagtgtttgg     3900 caataaggga tttttagaag aaggagtttt tattctcaac aggttcctta agtttagctc     3960 aaataaatct aagcaatcca ctctagaatt aaatagtttc c                         4001 ＜211＞  14931 ＜212＞  DNA ＜213＞  灰倉鼠 ＜220＞ ＜221＞  misc_feature ＜222＞  (2176)..(2239) ＜223＞  n為a、c、g、t或核苷酸缺失 ＜400＞  4 (SEQ ID NO:12 ) catgtacact tatgcaagta tgatatggcc caacacagta ttttacacca atttttatct       60 ataaaatata catgtacatc aaaatatatt attaataata acatcattat tctttctttc      120 caagtaataa acacatacac tgaaattttg gttcttgtgg ataattttaa tgaaacagga      180 aatgcaaatt tatcttagca tgtttacttc actttctttg catagataac cagtaatcac      240 attgatggat catgtagtga aatgtatttt taggtatcta aggaattttg gcttcgtttt      300 gtgcttgttg acactgaatt ctattcctaa caacagtgtg taaggattct gtctgatttc      360 ttttaccagt atttgtccat ttgcattttc tttattattc atggctgctg ttctagaaag      420 tggaaggtag tgtgtcaagt ctgtttaaca tgtttccctg atgatcagtg tcttaacacc      480 tctctgagta catgttggcc aatgtcgttt ctagacccat ctattcttgc ttgacttatc      540 ctggtacatg cctgccaaga aatttctcct catcctttct gtctcttcac tgatttactt      600 gatgtgtgga tttcacattg atcatatgga aatagaagat acaattttct ttattcacag      660 tttggaagac tttcaatctc atagatcatc attatttttt gctactgttc cctatgctat      720 ggtgaaattt ccatttgaat aattgcttaa acaattaaca agaaagaatc tatttttact      780 tgcaataact tccatttcag aacatttact acactgttac tatatccaaa aactagtttt      840 atatatcatg tgagaaatga ctaattcata atttggccat gacatttttt tcagaaacag      900 aaaaagtgac caatacatac acaatgctat aaatattaag acttcagcaa attaaatatt      960 tattcatgat atcacataaa attcatttat tatgttttat ttaaatgtgt ttttaaaaca     1020 gtggtatcac taaatattaa gttagatgtg tttatgtgct taatgaattt atattttaga     1080 atgttataag ttgtatatag tcaaatatgt aataaatttt attttttagg tctttctcat     1140 taaggtattt taattttggg tcccttttcc agagtgactc tagctcatga tgagttgaca     1200 taaaaactaa acagtacaaa atgtacattg cattcagtat tgcacttgat ctttgcactg     1260 aagtttgagt cagttcatac atttagtact tgggaagtac attaagctaa ctttcattgc     1320 tctggcaaaa tgctcgataa gataagagtc tattgtggaa agccatggca gcaggaaagt     1380 aagactgctg atgatgttta atccatagtc aagacgcaga aggagatgaa tgctggtatc     1440 caacattttt tgctgttcat tttctctaga accctagtcc ataaagatgt atgacttgca     1500 ttcaaaatgc gtccccttca gttgttcaac ttttctgtaa atatcctttc aggcatgtct     1560 agaagattgt ttcgcaaata cttctcaatc cattcaagtt gatagtgcag attaatcact     1620 gcagaataaa agcctgtaac ttggctcacg tgccaaggaa tatgcacact cctgacacat     1680 caataagtaa atcaaagtgt agcttttgcc tttaacattg ccagacttat gtaatgttct     1740 gcacgttctt cctccatcac tttttattct aatggtgttt ccttgacatt gaatcacgct     1800 gtggaagctg cttagaatta acattgaaat ctactgatat atttatgatg cagcaattta     1860 gatttactat tttacttaga attttttata attgagagaa tataatattt tcacagttat     1920 ctatctgctg taaatagagg attttaaaaa aaatctctat aacttttttt tacaacacac     1980 agtaaaatta agttaaaatt taataaagtc actatgttga tttcaaagtg tgctacgccc     2040 acggtggtca cgcaggtgta gcagaagatg ccactaaggt gggctaaggc cgatgggttg     2100 gggtctgcgc tccctggaga tgagccccag gcggttccct ggcaatcagc tgcgatcatg     2160 atgcccgatg agccannnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     2220 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc tgggtgactt tatggaaaga atttgataga tttcatgatg     2280 tagaagaatt ttattaggct tattttacag gagactaaga ccctgggacc taaagatatc     2340 tgggtcctga gaatcaggaa atgggtagag acgtggttga tggtatgaga cagattttag     2400 agaactctta gatcatgggc aatgaccgca atctgatgct tagaatagat catctataaa     2460 caattatgct gttctttttc tttctgttgt atgatctgat gatgtagccc ccttgccaag     2520 ttccctgatc ccccttgcca agttccctga ttgtaacagt atataagcat tgcttgagag     2580 catattcaac tacattgagt gtgtctgtct gtcatttcct cgccgattcc tgatttctcc     2640 ttgagccttt tcccttgttc tccctcggtc ggtggtctcc acgagaggcg gtccgtggca     2700 aaagtgtata aatgttctaa aacatttgaa ctctaaaaca tgcaaaatga aaaattaaaa     2760 taaataaaca tgaaaattaa aatatattag ctgctaaaag ttaaacaata ctatataata     2820 ttttgttatt agaattcaaa atcacattag ttggatttaa tttgaacatt gcattctttc     2880 aataataatt tcaataaaaa aagtttcccc atgatagtag aaaataataa catatgtatc     2940 tatctattta tttaactaca catatatagc atttgtttca actaaaataa atgaatgagc     3000 aaagcaccta agtaattggt gtctattata tttatgaagc caatagtttc aaataaatta     3060 tcatgcataa ggaggtattg caaatgttaa accttttttg aaacagatat tcccagttac     3120 agaaattata atttctaatc tttcctataa gtagaatgat gataattaat ataggccatt     3180 tgtaaataat gttcagatta aaatattctc tatttcacta gagaagaatg atattaaatg     3240 tattatattt tatttcccat tttgtttgca ccactattct atatccctca gcagtttaaa     3300 tttgtttcac catatgtgtg tgtgtttgta tcttaaatat ggcactaaaa ttagaataat     3360 ttaatataaa tctttaggag aaaagatatt gaattatttt atgttgatag gaaaatatct     3420 tttaattgtc caagaatact ttttcttcta ttttaggact gatcagaccc aggactaata     3480 ttttatatgt actaattcta tgtaccaaaa tatgttatta tctcatgaat tctgtctcaa     3540 tattgaggta ataaaaatag tccatcatga actttaaaat taaaataatg attaattaat     3600 ttttattcat attttgtttg tatgaatggt tatacatcac atgtgtgcct ggtgactgtg     3660 aatgtcagga gaaggtatga aagccactgg aattggaata agagataata tttgagatgt     3720 tatgtgggtg ctgagaatta gacgcaagcc atcttcaaga atagccagca tactatacca     3780 ctgagtaatc cattcatccc tcaataatta tctttgtaga cagtaaatat atttctaaac     3840 tataaatgac cagaaaaatt aatgtattat taatgaagac attcatctca tgtgacacac     3900 ttcacctgtc taaatcagta acactctctc cactaattaa gattttctaa gtgcatgaca     3960 cttactattt ctaaagctgt ccaatggggg ccagtcccca gtcagcaccc agtgagataa     4020 tccatgaatg catttatatc ttaggaaaaa ttcttatcta tgtagtattt agaacatttt     4080 catgtgaggg gataaacaag gaagcacaga tgctttctga tagaaacttt ctctttaatt     4140 catctagaaa aaaaaaacct ctcaggaaaa tctctcttgc tctcctccca atgctctatt     4200 cagcatcttc tccctactta attctagatc tttttctcta tgcctccttg ctgctgccct     4260 gctggctctg ctctatgcct ccccatgtca cttttctttg ctatctcacc gttaccttct     4320 ctgcctcact ctctgccttc ttctctgctt ctcacatggc caggctctgg acaattatag     4380 ttatatgtta cattctcata acacatgata tgtcacatag tttctctcag gctagggata     4440 tcacaatgac 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tcaattttca gaccataatg caaactattg     5280 accaaaacat gtgaagatga aaaatagaaa tgtagaataa tattacatat aaaaagaaaa     5340 ggcggactta ttttgtttta tttcttagca tgcatagcaa tacatgattt gaggtttata     5400 taataaaggg acaataaatc ttcaagaaac ttacccctac tgaattaaaa tattaaagaa     5460 ggtcacacat ttactcaaat atattagact actgggcaaa tagacatgaa aagtagagtt     5520 aatattgagg taggccttct gtgaaatgtc taaggaaatt atgtttcata cagtgtgtaa     5580 ccaagtggga atcatatcag aaagcagtca aaagcttata ttacaagtaa cagatgcttg     5640 gttatatgac ctcccagagc ttgactgtct atacacaaaa agtggtgtta ataaaactgt     5700 aatttgggct atgttttttt aaatggcttc accaacatga aaggaaggga atgagcatgt     5760 catggatgct tagagattat gcttccagca agaagaattg agctttggct cttattacag     5820 aaacatgaca aggtgtgagt tttatttatt agaaattata taatatttta agctggggac     5880 taaaaatttt attgaaacaa acaggcaagg gataggcatg tactagaagc aaaaatagga     5940 tgtcaatgct gtaatgttat tttttggacc aaaatagtat ttcctataga aatgacaatg     6000 atcttaggtt attattcttc ataaagatga caagttcaca agatatccta 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tgaggttact gatgaaagtg atggttagag aaggcaatat     7680 gaggagggat aactagcact tagggccttt tgaaaaagac atagagaaaa tactattgta     7740 gaaacttcct ataattggtg tatagttata tacaccaaag agctcagatg gagttaccct     7800 ataatggaaa tattaactac tttttatcac tgtgataaaa catcctgaac agagcaacat     7860 agattgggaa gcatttactt tggcttacag ttctaacggg ataaaaattc atgatgaaag     7920 aatgaatatg tcagcaaaca gcagtagcaa tggcctgaga agcaggtgag agctcacatc     7980 ttgaagtgta agaatgtagc agagagaaca aactgcaaat gaccagaaaa tgcttttgga     8040 tcagagccca tacccctctg actgacttct ccagaaattc tgaacaaata aaactcccca     8100 aacagagcca taactgaagg tccagtgtct gagactacta ggggtatttc ttattcaaac     8160 cactacaatg gggtgggggg agcaatcctc caagtaggca ctacacacag acaaataaaa     8220 actctagtaa ctggaatgga ttgacttatt tgaattactt gccagtggag ctacatagag     8280 cacaattatt gtatttaaat taccctttat gatcttacaa aacttgacag taagatcata     8340 ttgctaaaga aaccacatat ttgaatcagg gaacatggtg atatctagtt gttcttcaac     8400 tggaaacttc atgctttctg cccagcattc atgttgctgg 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9240 ttcatccagt agctgatgga agcagaagca gacatctaca gctaaacact gagctagttg     9300 cagacaggga ggagtgatga gcaaagtcaa gaccaggctg gagaaacaca cagaaacagc     9360 agacctgaaa aaaatgttgc acatggaccc cagactgata gctgggagtc cagcatagga     9420 cttttctaga aaccctgaat gaggatatca gtttggaggt ctggttaatc tatggggaca     9480 ctggtagtgg atcaatattt atccctagtt catgactgga atttgggtac ccattccaca     9540 tggaggaatt ctctgtcagc ctagacacat gggggaggtt ctaggtcctg ctccaaataa     9600 tgtgttagac tttgaagaac tcccttgaga agactcaccc tccctgggga gcagaaaggg     9660 gatgggatga gggttggtga gggacaggag aggaggggag ggtgagggaa ctgggattga     9720 caagtaaatg atgcttgttt ctaatttaaa tgaataaagg aaaagtaaaa gaagaaaaga     9780 aaacaggcca aaagattata aaagacagag gtggtgggtg actataaaga aacactatta     9840 tctaaataaa aatatgtcag aagcacacat gaacttatag tgtttatgaa agtatgtata     9900 ataactacat aatctcaagc caagaaaaaa atatcatctt tcagtgatga aggtgatttt     9960 atttctccca gaattaaagc caaagaccta atgaaagtaa ttatcttcaa aaggttgaaa    10020 atacatactt tgcaatacac agatctgcct agaaatctca tgttcacaat acacatgatg    10080 ctcaattgaa ttccattcaa tgttacagtt tagataaaca gtttgtagat aaactcacaa    10140 tgtatcattt ctttttattt tttgaccaaa cagcttctca tctgttattc agaataattc    10200 ctcgatggca ggatatccat cccaattggg ggaaggggag aatttgaaga aaacctagac    10260 cacatacata tttgccattg ggaaacaaag tctaaaatga tgttgttcac atcttctcta    10320 ctagtcctct ccccgtccca aagaaccttg gtatatgtgc ctcattttac agagagagga    10380 aagcaggaac tgagcatccc ttacttgcca tcctcaaccc aaaatttgca tcattgctca    10440 gctctgccct tctcatatga cagttacaag tcaaggcttc caaagtccct ctgtcatgtt    10500 tggtgtcaat agtttataca gatgacttca tgtcttcata tctaatgtct tatatagatt    10560 aatattaaac aatgttattt ctctaaccac attttaaatt aatttaaaaa tccattaatt    10620 gtgtctataa aatgcagaca gagtgctgag acacaatata agcctgatga tctgaatttg    10680 aaactcacac ccaccacatg gagaatcaac ttccaaaaat tttcctatta cttccacact    10740 tacaccattg tacaaacaca ataataatga acaaaatgaa atgaaataaa aaattaagtc    10800 tctgtaggta atgctactgt gcagcaaaag 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tttaatgatt    11640 attttaatat aaataacaaa gatgatggat aatgtaactt tgtacagttc atagacgctg    11700 aactactttg tgcttaaaat gttagttccc tatcataaat gataggtgat aagtgtatgt    11760 ttaatacttt ccctctgagc tatattcatg tactagagaa ttattttaaa catgaaaaga    11820 ctgtgtttat agtctcagct cctgagaact ggtccaacct taggcaggtg aatgccagga    11880 gcaacgtttt tcttctacag aggatgcttt gctgccaagc aacctggttg tgtggaaatg    11940 ttcctttttt aatcaagttt aaagggtctt catcatgctg ttgctccaca tattttcagg    12000 ttagagcttg gtccttggag tattatcttt taccagaaaa ttcatagtat tctttcaata    12060 actaacaact aaacttttcg ataaaaaaga attggaattt caattttaaa gcctgagtaa    12120 aattcttgtg aatcaggata ttttatttta agtcttatct tttaaaaagt tattttattt    12180 tttaaaaaat tataatatac tttcataatt tccctccttc acttttcttt acaaacactt    12240 ctatagatca ccatgtgttt ttttttttac atttatggcc tctttctgtt cattgttatt    12300 acatacaaat agtcttgcct atagaagaac accacaattt gttacctgat aacaaattat    12360 caacccttaa aacctacaaa ctattgatat tactgaaaag actatactta tagatgtaaa    12420 gatatatgtg tgtgcacata tatagataca catatatgta ggatttttaa ttttagattt    12480 tagacatcaa aattatttat atgactgaga aactagacac tataaatgag cattcagtat    12540 tcaacaccgt gattttagat attgtcacaa tgacagaaaa ttttcttata gaaaatttta    12600 agttttgtga ttgctctgtg cacttagtga agtctcacag aaaaagaatc atagtatttt    12660 tagtttataa taaaaagtac atataattaa aatggttggc acaaaacaac atttgagcat    12720 ttttcctatt tactatcaag tagtatcatt ttgaaataat aatttgacta gtttcaaaaa    12780 tgaaaacaaa atttaaacta aatgcctaat ctagcctgat aacattttta tgaatgaaat    12840 tattcaatag tgttatcaat taggggccca aaacttttcc taaaataaaa cttttaattt    12900 ttttccattt ttatttaaat tagaaacaaa attgttttac atgtaaatca gagtttcctc    12960 accctcccct tctccctgtc cctcactaac accctacttg tcccatacca tttctgctcc    13020 ccagggaggg tgaggccttc catggggaaa cttcagagtc tgtctatcct ttcggatagg    13080 gcctaggccc tcacccattt gtctaggcta aggctcacaa agtttactcc tatgctagtg    13140 ataagtactg atctactaca agagacacca tagatttcct aggcttcctc actgacaccc    13200 atgttcatgg ggtctggaac aatcatatgc tagtttccta ggtatcagtc tggggaccat    13260 gagctccccc ttgttcaggt caactgtttc tgtgggtttc accaccctgg tcttgactgc    13320 tttgctcatc actcctccct ttctgtaact gggttccagt acaattccgt gtttagctgt    13380 gggtgtctac ttctactttc atcagcttct gggatggagc ctctaggata gcatacaatt    13440 agtcatcatc tcattatcag ggaagggcat ttaaagtagc ctctccattg ttgcttggat    13500 tgttagttgg tgtcatcttt gtagatctct ggacatttcc ctagtgccag atatctcttt    13560 aaacctacaa gactacctct attatggtat ctcttttctt gctctcgtct attcttccag    13620 acaaaatctt cctgctccct tatattttcc tctcccctcc tcttctcccc ttctcattct    13680 cctagatcca tcttcccttc ccccatgctc ccaagagaga tgttgctcag gagatcttgt    13740 tccttaaccc ttttcttggg gatctgtctc tcttagggtt gtccttgttt cctagcttct    13800 ctggaagtgt ggattgtaag ctggtaatca tttgctccat gtctaaaatc catatatgag    13860 tgatgtttgt ctttttgtga ctgggttacc tcactcaaaa tggtttcttc catatgtctg    13920 tggatttcaa tagcacaaac aacatacagt atcttggggc aacactaacc aaacaagtga    13980 aagaccagta tagcaagaac tttgagttta aagaaagaaa ttaaagaaga taccagaaaa    14040 tggaaagatc tcccatgctc tttgataggc agaatcaaca tagtaaaaat ggcaatcttg    14100 ccaaaatcca tctacagact caatgcaatc cccattaaat accagcacac ttcttcacag    14160 acctgaaaga ataatactta actttatatg gagaaacaaa agacccagga taggccaaac    14220 aaccctgtac aatgaaggca cttccagagg catccccatc cctgacttca agctctatta    14280 tagagtaata atcctgaaaa cagcttggta atggcacaaa aatagacagg tagaccaatg    14340 gaattgagtt gaaaaccctg atattaaccc acatatctat gaacacctga ctttgacaaa    14400 gaagctaagg ttatacaatg taagaaagaa agcatcttca acaaatcgtg ctggcataac    14460 tggatgctgg catgtagaag actgcagata gatccatgtc taatgccatg cacaaaactt    14520 aagtccaaat ggatcaaaaa cctcaacata aatccagcca cactgaacct catagaagag    14580 aaagtgggaa gtatccttga ataaattggt acaggagacc acatcttgaa cttaacacca    14640 gtagcacaga caatcagatc aataatcaat aaatgggacc tcctgaaact gagaagcttc    14700 tgtaaggcaa tggataagtc aacaggacaa aatggcagcc cacggaatgg gaaaagatat    14760 tcaccaatcc tatatctgac agagggctgc tctctatttg caaagaacac aataagctag    14820 tttttaaaac accaattaat ccgattataa agttgggtag agaactaaat aaagaattgt    14880 taacagagca atctaacttg gcagaaagac acataagaaa gtgctcacca t             14931 實例 13 - CHO 中之 AAVS1 樣區域序列之導引序列(以下導引物可為有義導引序列或反義導引序列)
SEQ ID NO
CCCCGCTGGCGCCGGGATCGGGG 13
GAGTCGAGCACCGCTCGGGCAGG 14
TTCCCCGCTGGCGCCGGGATCGG 15
GTGTGCGGAAGACGCCGCCGGGG 16
CGGTGACAGCGCGGATGACAGGG 17
CAGCGCGGATGACAGGGGCGAGG 18
GCCGGCGTCCGATTCCCCGCTGG 19
CGTGTGCGGAAGACGCCGCCGGG 20
GAGGCGCTCCACCGTCTGTTGGG 21
GTCCGATTCCCCGCTGGCGCCGG 22
GACCCCGGGGGCCCCGATCCCGG 23
CGGCGTCTTCCGCACACGGATGG 24
TCGAGCACCGCTCGGGCAGGCGG 25
AGCTCACGCCGGCCCCATAAAGG 26
CATCGTCCTCTATATATAGCAGG 27
AGAGGCGCTCCACCGTCTGTTGG 28
GGTCGGCTGCGCGAAGCATCAGG 29
TGCTTCGCGCAGCCGACCCCGGG 30
GGCCCCGATCCCGGCGCCAGCGG 31
TCCGATTCCCCGCTGGCGCCGGG 32
TCCCGGCGCCAGCGGGGAATCGG 33
TGGTGGAGTCGAGCACCGCTCGG 34
CAAGATGGTCCTCACTCTCGGGG 35
GCTTCGCGCAGCCGACCCCGGGG 36
GTGGAGCGCCTCTTCTCCAGGGG 37
GACGTGTCAGCCTTCCAGGTGGG 38
GCCAGCGGGGAATCGGACGCCGG 39
TCTCCCCGTCATCCAAAAGCTGG 40
GGTGGAGTCGAGCACCGCTCGGG 41
GCTGCCCAAATATAGTCCATGGG 42
ATGCTTCGCGCAGCCGACCCCGG 43
GCGGTGACAGCGCGGATGACAGG 44
ATGCTCGGGGGCCGCTGACCTGG 45
TTGTATTGCCGGGATCCTTCTGG 46
TCCCCGCTGGCGCCGGGATCGGG 47
CTCGACTCCACCAACGCCGACGG 48
GGTGGCAAGATCACCAAAAGGGG 49
GGCGCTGATGCCGTCGGCGTTGG 50
TCCACGAGCATCCTAGCAAGAGG 51
AGGCTGACACGTCAGGCCTGAGG 52
GGGTGTAAGCCATCCGTGTGCGG 53
AGGATCCCGGCAATACAAGATGG 54
GGATGGGGCCCAACAGACGGTGG 55
GAGGACCATCTTGTATTGCCGGG 56
AGTCGCCCAGGGTCCTGGTGGGG 57
GGCGGGAGGAGAGTCCCACCTGG 58
ACCTACCCCACCAGGACCCTGGG 59
TCAGCGTCTTTGACCAGTCCAGG 60
CGTCCCGCCGCCTGCCCGAGCGG 61
GTCCCCGGGATCCCCGGGGTCGG 62
AGCACCGCTCGGGCAGGCGGCGG 63
CGGTGGAGCGCCTCTTCTCCAGG 64
GCCCCGATCCCGGCGCCAGCGGG 65
ATCGGGGCCCCCGGGGTCCCCGG 66
ATTCTCGGCTCATCCCCTTTTGG 67
ACCACCCCATGGACTATATTTGG 68
TAGCAAGAGGACGACAACCCAGG 69
GCTGATGCCGTCGGCGTTGGTGG 70
TACAAGATGGTCCTCACTCTCGG 71
TGCCGGGATCCTTCTGGATTCGG 72
CCCAAATATAGTCCATGGGGTGG 73
TACCTGTAGAATGGGACCAGTGG 74
TCTTGCTAGGATGCTCGTGGAGG 75
ATGCCAGCTTTTGGATGACGGGG 76
ATAGTCCATGGGGTGGTAGGTGG 77
CAGGACCCTGCTATATATAGAGG 78
GGGGCCGGCGTGAGCTGTGTGGG 79
ACCTGGAAGGCTGACACGTCAGG 80
CAGCGGACAGCACGGGTCACAGG 81
CGCCGGGATCGGGGCCCCCGGGG 82
GCGCCGGGATCGGGGCCCCCGGG 83
GCCGGGATCCTTCTGGATTCGGG 84
GCTGTCACCGCTCTCCCCGGCGG 85
GGTGACAGCGCGGATGACAGGGG 86
GAAGACGCCGCCGGGGAGAGCGG 87
AAGGGGTACACTGCCTTGGAGGG 88
CTTCTAGAACCTACCCCACCAGG 89
GGGGCCGCTGACCTGGTGCAGGG 90
TCCCGAATCCAGAAGGATCCCGG 91
TCACAGTGTCTGAGTCGCCCAGG 92
GCTAGGATGCTCGTGGAGGTGGG 93
CTCGTGGAGGTGGGGAATAAAGG 94
TGATCTGTGCCCCGAGAGTGAGG 95
TGAATTAATAGGACATGGGGAGG 96
ACTCTCGGGGCACAGATCACTGG 97
GACCACTGGTCCCATTCTACAGG 98
TGAGGACCATCTTGTATTGCCGG 99
AGAATCCGTCTGTCCTGGGCTGG 100
TGACGTGTCAGCCTTCCAGGTGG 101
AAAAGCATCCCGAATCCAGAAGG 102
TTTTCCCGAGGCCACACTCAGGG 103
AGCGCCCTGCACCAGGTCAGCGG 104
TGAGTCGCCCAGGGTCCTGGTGG 105
CACGTCAGGCCTGAGGTCACAGG 106
GTTTTCCCGAGGCCACACTCAGG 107
GAGTCGCCCAGGGTCCTGGTGGG 108
GAATCCGTCTGTCCTGGGCTGGG 109
CCGGGGAGGGAGGATGCTCGGGG 110
GAGCCGAGAATTGAATTAATAGG 111
GTGACCCGTGCTGTCCGCTGTGG 112
GGGGGCGTCAAGTCAGAGCTGGG 113
CGCGCTGTCACCGCTCTCCCCGG 114
TGCTGCCCAAATATAGTCCATGG 115
AGTTGAGGAGAAACCTATGGGGG 116
ATCGTCCTCTATATATAGCAGGG 117
GAGTTGAGGAGAAACCTATGGGG 118
AGGGGTACACTGCCTTGGAGGGG 119
ATAGAGTCCCTCTGGGGACAGGG 120
CTAGGATGCTCGTGGAGGTGGGG 121
CGCGGATGACAGGGGCGAGGCGG 122
AAAACAGAATCCGTCTGTCCTGG 123
TGCTAGGATGCTCGTGGAGGTGG 124
GAGTGTGGCCTCGGGAAAACAGG 125
CGAGGCGGCCCCTGCAGGGCAGG 126
CTTACACCCCGTGCCTTTCCAGG 127
CTGCCCAAATATAGTCCATGGGG 128
AGGGGCAAAGGACCCTCCTGAGG 129
TCTCACCATAGAGTCCCTCTGGG 130
AGTGTACCCCTTTGTTCCCCTGG 131
GTTGAGGAGAAACCTATGGGGGG 132
CACAGTGTCTGAGTCGCCCAGGG 133
TCCTCTTGCTAGGATGCTCGTGG 134
CACATGATCACCAAAGTCCCTGG 135
AAACAGAATCCGTCTGTCCTGGG 136
GTGCAGGGCGCTGATGCCGTCGG 137
CAGCACGGACTTTTTTTGTTTGG 138
CAGCCGACCCCGGGGATCCCGGG 139
TTTGGTCAAGATTTTGCAACTGG 140
TTGGTCAAGATTTTGCAACTGGG 141
CCTGTCAGAGAGGATGCTCTAGG 142
TGGGTTGTCGTCCTCTTGCTAGG 143
CTCACCATAGAGTCCCTCTGGGG 144
AGACGCTGACACCCTGAGTGTGG 145
GGTGGAGCGCCTCTTCTCCAGGG 146
AACAAAGGGGTACACTGCCTTGG 147
CTGTCCCCAGAGGGACTCTATGG 148
GTCTCTGACCCCCTCATTTGTGG 149
GTCTGAGTCGCCCAGGGTCCTGG 150
GCCTGACGTGTCAGCCTTCCAGG 151
ATGTCCCACACAGCTCACGCCGG 152
GGCTGTGCCGCAGGCTTCCAGGG 153
CACCCCGTGCCTTTCCAGGCTGG 154
TCACCAAGGTGTCTGCATGGCGG 155
GAATTGAATTAATAGGACATGGG 156
AATATAGTCCATGGGGTGGTAGG 157
CAGGGCATAGTTTTTAAAGCAGG 158
CGGCATCAGCGCCCTGCACCAGG 159
GCAGCCGACCCCGGGGATCCCGG 160
ACAGGACCTGTATTTGAGGTTGG 161
GGGGCGAGGCGGCCCCTGCAGGG 162
AACCTACCCCACCAGGACCCTGG 163
GCACCGCTCGGGCAGGCGGCGGG 164
TGGAAGCCTGCGGCACAGCCAGG 165
GAACCAACACTGTGGCCAGGAGG 166
AGCAGGGTCCTGTTTTCCCGAGG 167
TGGGTGGCAAGATCACCAAAAGG 168
AGCCGACCCCGGGGATCCCGGGG 169
CATGGCAACTTCCATCTCCTGGG 170
ACAGCACGGGTCACAGGAAGTGG 171
GGGGGCCGCTGACCTGGTGCAGG 172
AGGGGCGAGGCGGCCCCTGCAGG 173
GTGGTCACCCCTGTCCCCAGAGG 174
TGGGGCCGGCGTGAGCTGTGTGG 175
GGAAGCCTGCGGCACAGCCAGGG 176
CCTGAGCTGATCTCCTGGACTGG 177
ATCCAAAAGCTGGCATTGTCAGG 178
CTCTCACCATAGAGTCCCTCTGG 179
GGGGGGCGTCAAGTCAGAGCTGG 180
GGGTGGAAATCTAAGAGACAGGG 181
CGGGGAGAGCGGTGACAGCGCGG 182
AGAATTGAATTAATAGGACATGG 183
CCATAAAGGAAGTTTTCCACAGG 184
AGTGAACCAACACTGTGGCCAGG 185
GTTGGGAGGGAACTCTTGGGAGG 186
CGGGTCACAGGAAGTGGGGTAGG 187
GGCCTGGCTAGCCTCAGAGGAGG 188
GGTAGGTTCTAGAAGGTGACAGG 189
ACAAGATGGTCCTCACTCTCGGG 190
CAAGGTGTCTGCATGGCGGGAGG 191
TGTTTCACTCATCCAGGCAGAGG 192
TGTGGAAAACTTCCTTTATGGGG 193
GAGGACGACAACCCAGGAGATGG 194
GGGTGGCAAGATCACCAAAAGGG 195
CTGGTGGGGTAGGTTCTAGAAGG 196
ACTCTTCAGGCCTTTGCAGGAGG 197
CAGAGGGACTCTATGGTGAGAGG 198
AGCACGGGTCACAGGAAGTGGGG 199
CTATGGTGAGAGGCGTCCTGTGG 200
CAGCACGGGTCACAGGAAGTGGG 201
ATGGGATGGGGCCCAACAGACGG 202
CTCCCGCCATGCAGACACCTTGG 203
GGGGATCCCGGGGACCCCGGGGG 204
TGTCCGCTGTGGCCTCAGGAGGG 205
GCAGTTGGGAGGGAACTCTTGGG 206
GCCTGGCTAGCCTCAGAGGAGGG 207
GAGAGTTGAGGAGAAACCTATGG 208
ACCTGTATTTGAGGTTGGCCTGG 209
TCGGGCAGGCGGCGGGACGCCGG 210
TAGAGTCCCTCTGGGGACAGGGG 211
GAAGTGACACTGAAGGGCCTGGG 212
AGCAGCCTGAGCTGATCTCCTGG 213
TCATGGCAACTTCCATCTCCTGG 214
GTCACAGGTTCCTGTCAGAGAGG 215
CACCAAGGTGTCTGCATGGCGGG 216
GTAGGTTCTAGAAGGTGACAGGG 217
AATTGAATTAATAGGACATGGGG 218
TTCCAAGCACCTGATTTCTGTGG 219
CTGTCAGAGAGGATGCTCTAGGG 220
GTGCTGTCCGCTGTGGCCTCAGG 221
CCCGGGGAGGGAGGATGCTCGGG 222
GGGGTGGCTCGGGGGGCCCCGGG 223
GTCAAGTCAGAGCTGGGCCCTGG 224
GACACTGAAGGGCCTGGGCCTGG 225
CTGAAAGTGAACCAACACTGTGG 226
AAAGGGGTACACTGCCTTGGAGG 227
TCTGGAAACTTCTAAGCATTCGG 228
AGAGTTGAGGAGAAACCTATGGG 229
CTCTGAGGCTAGCCAGGCCCAGG 230
AGGGGTGGCTCGGGGGGCCCCGG 231
TCCACATTGATTTGCCTTTCTGG 232
AGGGTGGAAATCTAAGAGACAGG 233
CTGTCCGCTGTGGCCTCAGGAGG 234
AGACACAGGACCTGTATTTGAGG 235
GGGTGGCTCGGGGGGCCCCGGGG 236
TGGCTGTGCCGCAGGCTTCCAGG 237
TCCAGAAAGGCAAATCAATGTGG 238
CACCAGCCTGGAAAGGCACGGGG 239
CGGGGTCCCCGGGATCCCCGGGG 240
ACACTGCCTTGGAGGGGCAAAGG 241
TGACAGGAACCTGTGACCTCAGG 242
TCTCATGTGGGCTATCAAGATGG 243
GGGAACTCTTGGGAGGGCCAGGG 244
GAGGCCACAGCGGACAGCACGGG 245
TGTCCTATTAATTCAATTCTCGG 246
AGGGAACTCTTGGGAGGGCCAGG 247
GCACCTGATTTCTGTGGTATTGG 248
GTATCTTGAGTGTCTTTTCTCGG 249
CTGTGGAAAACTTCCTTTATGGG 250
GGGACCTCCAGCAGATGCAGAGG 251
CTGGGGACAGGGGTGACCACTGG 252
TTCAGTGTCACTTCTTTTGGGGG 253
TCCCTCCTCTGAGGCTAGCCAGG 254
GGCGCCGGGATCGGGGCCCCCGG 255
GGTTCTAGAAGGTGACAGGGTGG 256
TTGGGAGGGAACTCTTGGGAGGG 257
ATCAGGTGCTTGGAAAGTAGAGG 258
CGGGGAGGGAGGATGCTCGGGGG 259
TGAGGCCACAGCGGACAGCACGG 260
TGGTCACCCCTGTCCCCAGAGGG 261
TCCCCGCCTCCTGCCCTGCAGGG 262
GGCTGCCCTGGCTGTGCCGCAGG 263
TCCAAAAGCTGGCATTGTCAGGG 264
CAATGCCAGCTTTTGGATGACGG 265
CTGGGCCTGGCTAGCCTCAGAGG 266
GGTTCACTTTCAGTCTTTCATGG 267
AGGAGAAACCTATGGGGGGTGGG 268
TCTAAAAGACAGCCCAGCCCAGG 269
CGGGGATCCCGGGGACCCCGGGG 270
TCTTCTCCAGGGGAACAAAGGGG 271
ACTGACACAAAAAGTCAGCACGG 272
CCTGAAGAGTCAGGTCACCAAGG 273
GGAGGAGAGTCCCACCTGGAAGG 274
GGGCAGCCACCAGCCTGGAAAGG 275
AGCCCTATTTCTCTCTCCTCTGG 276
GCCACCAGCCTGGAAAGGCACGG 277
TGACACCCTGAGTGTGGCCTCGG 278
AATTAATAGGACATGGGGAGGGG 279
GGCTCGGGGGGCCCCGGGGAGGG 280
TAATAGGACATGGGGAGGGGAGG 281
CTCTTCTCCAGGGGAACAAAGGG 282
TCGGGGCCCCCGGGGTCCCCGGG 283
TCCCTGACAATGCCAGCTTTTGG 284
GAATTAATAGGACATGGGGAGGG 285
AATGAGGGGGTCAGAGACACAGG 286
GAAAACTTCCTTTATGGGGCCGG 287
CTTGGGAGGGCCAGGGACTTTGG 288
CCCCTGCAGGGCAGGAGGCGGGG 289
TCAGTGTCACTTCTTTTGGGGGG 290
ATCCCCGTTCTTCTTCCTCCTGG 291
CTTCCTCCTGGCCACAGTGTTGG 292
TGCAGTTGGGAGGGAACTCTTGG 293
TGGCTCGGGGGGCCCCGGGGAGG 294
CTGCAAAGGCCTGAAGAGTCAGG 295
CCGTGTGCGGAAGACGCCGCCGG 296
CCCCGGGGAGGGAGGATGCTCGG 297
TTCCAGGCTGGTGGCTGCCCTGG 298
AGGTCACCAAGGTGTCTGCATGG 299
GGCGGCCCCTGCAGGGCAGGAGG 300
TCGGGGGGCCCCGGGGAGGGAGG 301
CCAAAAGAAGTGACACTGAAGGG 302
GGCCAGGAGGAAGAAGAACGGGG 303
GCCCAGGGTCCTGGTGGGGTAGG 304
GCTAGCCTCAGAGGAGGGAGTGG 305
GAGGGTCCTTTGCCCCTCCAAGG 306
CCACCAGCCTGGAAAGGCACGGG 307
GATTTCTGTGGTATTGGGGTTGG 308
CTAGCCTCAGAGGAGGGAGTGGG 309
CCCGGGGTCCCCGGGATCCCCGG 310
CATGGGGTGGTAGGTGGAGTGGG 311
AATGCCAGCTTTTGGATGACGGG 312
GCCCCTGCAGGGCAGGAGGCGGG 313
GAGGAGAAACCTATGGGGGGTGG 314
AGAAGTGACACTGAAGGGCCTGG 315
CCTCCAGCAGATGCAGAGGAAGG 316
CCTCTTCTCCAGGGGAACAAAGG 317
CCGGGGTCCCCGGGATCCCCGGG 318
TAGCCTCAGAGGAGGGAGTGGGG 319
CAGAGGAAGGGGATGCAGTTGGG 320
CTCCAGCAGATGCAGAGGAAGGG 321
GATTCTGTTTTTCCTCTGCCTGG 322
CTTCAGTGTCACTTCTTTTGGGG 323
CATAGAGTCCCTCTGGGGACAGG 324
GGACCCTCCTGAGGCCACAGCGG 325
CCATGGGGTGGTAGGTGGAGTGG 326
GACACCCTGAGTGTGGCCTCGGG 327
ATGCTTAGAAGTTTCCAGAAAGG 328
AGCTGGGCCCTGGAAGCCTGCGG 329
TACCACAGAAATCAGGTGCTTGG 330
ACCCCAATACCACAGAAATCAGG 331
TTCTACAGGTAAAAAAACTAAGG 332
GGCCCCTGCAGGGCAGGAGGCGG 333
CTCCCCGCCTCCTGCCCTGCAGG 334
TCTCTGACCCCCTCATTTGTGGG 335
GGAGAAACCTATGGGGGGTGGGG 336
ACAGCCCAGCCCAGGACAGACGG 337
CCTGTATTTGAGGTTGGCCTGGG 338
AGCCAGGGCAGCCACCAGCCTGG 339
AGCCTCAGAGGAGGGAGTGGGGG 340
GTTCAGTGTTTCACTCATCCAGG 341
CTGACTCTTCAGGCCTTTGCAGG 342
ATCCCCCACTCCCTCCTCTGAGG 343
CCCAAAAGAAGTGACACTGAAGG 344
TGGCCAGGAGGAAGAAGAACGGG 345
GGGAGGAAGGTTATGGGATGGGG 346
CCTGAGGCTTCCTGCACTCTAGG 347
TAGTTTTTTTACCTGTAGAATGG 348
AAGTGGGGTAGGGAACAAGGTGG 349
GGGTCACAGGAAGTGGGGTAGGG 350
CACCTGATTTCTGTGGTATTGGG 351
TTTGCAACTGGGTCTCATGTGGG 352
GAGAAACCTATGGGGGGTGGGGG 353
GAGGGAGGAGGGGTGGCTCGGGG 354
GCCTGTAATCCCACAAATGAGGG 355
GCAGAGGAAGGGGATGCAGTTGG 356
ACCTGATTTCTGTGGTATTGGGG 357
AAACCAGAGGAGAGAGAAATAGG 358
AACCAGAGGAGAGAGAAATAGGG 359
GAGGAGAGAGAAATAGGGCTTGG 360
CTGCAGGGCAGGAGGCGGGGAGG 361
AGGAAGGGGATGCAGTTGGGAGG 362
GGTATTGGGGTTGGAACCTGAGG 363
TTTTGCAACTGGGTCTCATGTGG 364
GGGAGGAGGGGTGGCTCGGGGGG 365
TCCCCTTCCTCTGCATCTGCTGG 366
AGGAAGTGGGGTAGGGAACAAGG 367
AGGGGAGGAAGGTTATGGGATGG 368
CCTGTAATCCCACAAATGAGGGG 369
AGTTTTTTTACCTGTAGAATGGG 370
AGGAAGAAGAACGGGGATGGGGG 371
TGCAGGGCAGGAGGCGGGGAGGG 372
GGAAGGGGATGCAGTTGGGAGGG 373
CAAAGTCACTGTGTAGATGAAGG 374
GTGGCCAGGAGGAAGAAGAACGG 375
TCCAGCAGATGCAGAGGAAGGGG 376
AGGGAGGAGGGGTGGCTCGGGGG 377
AACCTATGGGGGGTGGGGGTGGG 378
GGGGAGGGGAGGAAGGTTATGGG 379
CACCCACCCCCACCCCCCATAGG 380
AAACCTATGGGGGGTGGGGGTGG 381
GGAGGAAGAAGAACGGGGATGGG 382
GAGGAAGAAGAACGGGGATGGGG 383
GGAGGGAGGAGGGGTGGCTCGGG 384
GGTTGGCCTGGGCTACACAGGGG 385
AGAGGAGGGAGTGGGGGATTGGG 386
GAGGTTGGCCTGGGCTACACAGG 387
AGGTTGGCCTGGGCTACACAGGG 388
TGGGGAGGGGAGGAAGGTTATGG 389
GAAAGTAGAGGCAGGAGGGTTGG 390
GAGGAGGGAGTGGGGGATTGGGG 391
GGGGAGGAAGGTTATGGGATGGG 392
AGAGTGCTTGCCTAGAGTGCAGG 393
AGGAGGGAGTGGGGGATTGGGGG 394
CAGAGGAGGGAGTGGGGGATTGG 395
AGGAGGAAGAAGAACGGGGATGG 396
TTTTTTCCCCTGTGTAGCCCAGG 397
GGTGCTTGGAAAGTAGAGGCAGG 398
CTTGGAAAGTAGAGGCAGGAGGG 399
CTGTAATCCCACAAATGAGGGGG 400
AGGACATGGGGAGGGGAGGAAGG 401
TCATCTACACAGTGACTTTGAGG 402
GAGGGAGTGGGGGATTGGGGGGG 403
GGGAGGGAGGAGGGGTGGCTCGG 404
AGGGAGTGGGGGATTGGGGGGGG 405
AACAACAAAAACAAAACCAGAGG 406
CTATGGGGGGTGGGGGTGGGTGG 407
GGAGGGAGTGGGGGATTGGGGGG 408
TGCCTGTAATCCCACAAATGAGG 409
GAGTGGGGGATTGGGGGGGGGGG 410
AGGGCAGGAGGCGGGGAGGGAGG 411
CAGGAGGCGGGGAGGGAGGAGGG 412
AGGAGGCGGGGAGGGAGGAGGGG 413
GGAGTGGGGGATTGGGGGGGGGG 414
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應理解，雖然顯示例示性實施例，但本說明書、特定實例及資料係藉助於說明給出，且並不意欲限制本發明。本發明內之各種變化及修改(包括整個及部分地組合實施例)對於熟練的具有通常知識者而言將自本文中所含有之論述、揭示內容及資料變得顯而易見，且因此被視為本發明之部分。
以下圖式說明可用於在基因體之不同區域中產生具有穩定整合位點之細胞及此後在基因體之不同區域中產生具有穩定整合位點之細胞的中間細胞(intermediate cell)之例示性進展及產生。此等圖式說明本發明之實施例，且不以任何方式限制本發明。
圖 1示意性地描繪具有在啟動子之轉錄控制下編碼抑制蛋白之多核苷酸及聚腺苷酸化訊號的細胞之修飾，其中將該多核苷酸隨機插入於細胞基因體中。
圖 2示意性地描繪在DNA卡匣(1)隨機或位點特異性地插入至細胞基因體中之後圖1之細胞之修飾。DNA卡匣(1)包含側接lox位點(1及2)、啟動子、報導基因(1)、IRES、選擇標記基因(1)及聚腺苷酸化訊號。亦可使用其他RRS代替lox位點。
圖 3示意性地描繪圖2之細胞之修飾，其中DNA卡匣(1)係藉由重組酶介導之卡匣與DNA卡匣(2)交換而經置換。DNA卡匣(2)包含側接lox位點(1及2)、啟動子、選擇標記基因(2)、IRES及報導基因(2)及聚腺苷酸化訊號，以及處於第二啟動子之控制下的Cas9基因與第二聚腺苷酸化訊號(操縱子為視情況存在的)。亦可使用其他RRS代替lox位點。
圖 4示意性地描繪圖3之細胞之修飾，該細胞具有包含側接基因體安全港(GSH)同源臂、lox位點(3及4)及處於插入至基因體安全港中之啟動子之控制下的報導基因(3)與聚腺苷酸化訊號的DNA卡匣(3)。插入為位點特異性整合且在Lox3與Lox4之間產生穩定整合位點。亦可使用其他RRS代替lox位點。
圖 5示意性地描繪圖4之細胞之修飾，其中DNA卡匣(2)藉由重組酶介導之卡匣與DNA卡匣(4)交換而經置換。DNA卡匣(4)包含側接lox位點(1及2)、處於啟動子之控制下的報導基因(4)及聚腺苷酸化訊號。此交換移除Cas9基因。亦可使用其他RRS代替lox位點。
圖 6示意性地描繪實例6中使用之sgRNA質體。
圖 7描繪展示無HDR模板(對照)、104聚體HDR模板、401聚體HDR模板及1030聚體HDR模板之綠色螢光蛋白陽性群體(Q1)的實例6之標繪圖。GFP陽性為縱軸且CFP陽性為橫軸。
圖 8示意性地描繪具有由Lox位點3及4側接之穩定整合Cas9基因的哺乳動物細胞(例如，HEK293)。Cas9基因處於至少啟動子(未描繪)之控制下。亦示意性地描繪AAVS1。亦可使用其他RRS代替lox位點。啟動子存在於基因之5'，但未描繪。
圖 9A 及圖 9B示意性地描繪含有sgRNA目標位點、用於插入至諸如基因體安全港(此處為AAVS1)之區域中的左同源臂(此處為GSH同源臂)、Lox 1位點、報導基因(顏色1)、Lox 2位點、用於插入至諸如基因體安全港(此處為AAVS1)之區域中的右同源臂(此處為GSH同源臂)的靶向質體。在3'端， 圖 9A示意性地描繪報導基因(顏色2)，且 圖 9B示意性地描繪3'端處之陰性選擇基因(陰性選擇1)。啟動子及視情況存在之其他部分(諸如操縱子)係由以5'至3'方向指向之箭頭表示。兩種質體將顏色1插入至諸如基因體安全港之區域中。亦可使用其他RRS代替lox位點。
圖 10示意性地展示在Cas9介導整合至哺乳動物細胞(例如，HEK293)之基因體安全港(AAVS1)中之後的結果。顏色1由Lox 1及Lox 2側接。所關注基因可經由RMCE置換顏色1。當根據 圖 9A之靶向質體經恰當整合時，細胞將為顏色1陽性及顏色2陰性。當根據 圖 9B之靶向質體經恰當整合時，細胞將為顏色1陽性且將能夠傳播(propagate)，因為陰性選擇基因經移除。亦可使用其他RRS代替lox位點。啟動子及視情況存在之其他部分(諸如操縱子)係由以5'至3'方向指向之箭頭表示。
圖 11更詳細地示意性地描繪 圖 10之插入。細胞基因體(包括AAVS1)側接插入物及5'端及3'端。顏色1由Lox 1及Lox 2側接。 圖 11左側指示與5'接合點PCR一起使用的5'基因體引子及3'插入引子之位置。 圖 11右側指示與3'接合點PCR一起使用的5'插入引子及3'基因體引子之位置。亦可使用其他RRS代替lox位點。顏色1基因5'之啟動子描繪為5'箭頭。
圖 12展示藉由 圖 11中示意性地描繪之接合點PCR在HEK 293細胞中擴增的正確大小片段。獲得且偵測穩定Cas9靶向之HEK293細胞以及5'接合點及3'接合點，此建立正確插入。
圖 13展示藉由 圖 11中示意性地描繪之接合點PCR在CHO細胞中擴增的正確大小片段。獲得且偵測穩定Cas9靶向之CHO細胞以及5'接合點及3'接合點，此建立正確插入。亦可使用其他RRS代替lox位點。
圖 14示意性地描繪包含整合至具有側接RRS (此處為lox 1及lox 2)之基因體之區域中的三個卡匣的例示性細胞。視細胞類型而定，三個卡匣中之各者可整合至在位置A處示意性地描繪之不同穩定整合位點(例如，AAVS1樣)中及在位置B及C處示意性地描繪之其他可用的位點(諸如穩定位點1及穩定位點2)。報導基因可相同或不同。陰性選擇基因可相同或不同，但較佳相同。根據本文中所含有之教示內容，細胞可含有額外穩定整合位點及整合卡匣。啟動子存在於基因之5'，但未描繪。
圖 15示意性地描繪在位置A、B及C處示意性地描繪的 圖 14之細胞之修飾。三個卡匣各自包含側接RRS (此處為lox 1及lox 2)、所關注基因、陽性選擇標記基因及報導*基因。陽性選擇標記基因可相同或不同，但較佳相同。報導*基因可相同或不同，但各自必須與 圖 14之細胞中的報導基因中之任一者不同。所關注基因可相同或不同。 圖 14之卡匣藉由RMCE由 圖 15之卡匣置換。根據本文中所含有之教示內容，細胞可含有額外穩定整合位點及整合卡匣。啟動子存在於基因之5'，但未描繪。
圖 16為相較於兩位點CHO-K1細胞(B及C)，比較由三位點CHO-K1細胞(A、B及C)產生之蛋白質的條形圖。
圖 17示意性地描繪包含整合至具有側接RRS (此處為lox 1及lox 2，或lox 3及lox 4)之基因體之區域中的四個卡匣的例示性細胞。視細胞類型而定，四個卡匣中之各者可整合至不同穩定整合位點(及其他可用位點(諸如穩定位點1及穩定位點2))中，且示意性地描繪為位置A及B (SIS)以及C及D (穩定位點1及2)。報導基因可相同或不同。陰性選擇基因可相同或不同，但較佳相同。根據本文中所含有之教示內容，細胞可含有額外穩定整合位點及整合卡匣。啟動子存在於基因之5'，但未描繪。
圖 18示意性地描繪在位置A、B、C及D處示意性地描繪的圖17之細胞之修飾。四個卡匣各自包含側接RRS (此處為lox 1及lox 2，或lox 3及lox 4)、所關注基因、陽性選擇標記基因及報導*基因。陽性選擇標記基因可相同或不同，但較佳相同。報導*基因可相同或不同，但各自必須與 圖 17之細胞中的報導基因中之任一者不同。所關注基因可相同或不同。在此圖中，存在兩個所關注基因1之複本及兩個所關注基因2之複本。 圖 17之卡匣藉由RMCE由 圖 18之卡匣置換。根據本文中所含有之教示內容，細胞可含有額外穩定整合位點及整合卡匣。啟動子存在於基因之5'，但未描繪。
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Claims (89)

  1. 一種哺乳動物細胞，其包含位於基因體安全港(Genomic Safe Harbor)中之第一穩定整合位點及不位於該基因體安全港中之第二穩定整合位點，其中該第一穩定整合位點包含編碼第一報導蛋白之第一報導基因且該第二穩定整合位點包含編碼第二報導蛋白之第二報導基因，其中該第一報導蛋白及該第二報導蛋白不同。
  2. 如請求項1之哺乳動物細胞，其中該第一及第二穩定整合位點包含重組酶識別位點。
  3. 如請求項1之哺乳動物細胞，其中該第一報導基因處於SV40啟動子之控制下。
  4. 如請求項1之哺乳動物細胞，其中該第二報導基因處於SV40啟動子之控制下。
  5. 如請求項1之哺乳動物細胞，其中該第一報導基因編碼螢光蛋白。
  6. 如請求項1之哺乳動物細胞，其中該第二報導基因編碼螢光蛋白。
  7. 如請求項1之哺乳動物細胞，其中該細胞進一步包含編碼處於CMV啟動子之控制下之抑制因子的多核苷酸。
  8. 如請求項1之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為人類細胞。
  9. 如請求項8之哺乳動物細胞，其中該人類細胞為人類羊膜上皮細胞(Human Amniotic Epithelial Cell)。
  10. 如請求項8之哺乳動物細胞，其中該人類細胞為HEK293細胞。
  11. 如請求項1之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為CHO細胞。
  12. 如請求項2之哺乳動物細胞，其中該重組酶識別位點為lox位點。
  13. 如請求項1之哺乳動物細胞，其中將編碼所關注蛋白質之多核苷酸插入至該第一穩定整合位點或該第二穩定整合位點中。
  14. 如請求項1之哺乳動物細胞，其中該第二穩定整合位點位於與該第一基因體安全港不同之第二基因體安全港中。
  15. 如請求項1之哺乳動物細胞，其中該第二穩定整合位點位於不為基因體安全港之區域中。
  16. 一種哺乳動物細胞，其包含位於基因體安全港中之第一穩定整合位點及不位於該基因體安全港中之第二穩定整合位點，其中該第一穩定整合位點包含編碼第一蛋白質之第一多核苷酸且該第二穩定整合位點包含編碼第二蛋白質之第二多核苷酸。
  17. 如請求項16之哺乳動物細胞，其中該第一蛋白質為病毒蛋白。
  18. 如請求項16之哺乳動物細胞，其中該第二蛋白質為病毒蛋白。
  19. 如請求項16之哺乳動物細胞，其中該第一蛋白質為腺病毒相關病毒蛋白。
  20. 如請求項17之哺乳動物細胞，其中該第二蛋白質為腺病毒相關病毒蛋白。
  21. 如請求項17之哺乳動物細胞，其中該第一蛋白質為腺病毒蛋白。
  22. 如請求項17之哺乳動物細胞，其中該第二蛋白質為腺病毒蛋白。
  23. 如請求項16之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞包含編碼腺相關病毒蛋白之多核苷酸及編碼腺病毒蛋白之多核苷酸。
  24. 如請求項16之哺乳動物細胞，其中該第二穩定整合位點位於與該第一基因體安全港不同之第二基因體安全港中。
  25. 如請求項16之哺乳動物細胞，其中該第二穩定整合位點位於不為基因體安全港之區域中。
  26. 如請求項16之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為人類細胞。
  27. 如請求項16之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為CHO細胞。
  28. 一種哺乳動物細胞，其包含位於基因體安全港中之第一穩定整合位點及不位於該基因體安全港中之第二穩定整合位點，其中該第一穩定整合位點包含編碼第一報導基因的多核苷酸，該第一報導基因編碼第一報導蛋白，且該第二穩定整合位點包含編碼Cas9之多核苷酸及編碼第二報導基因的多核苷酸，該第二報導基因編碼第二報導蛋白，其中該第一報導蛋白及該第二報導蛋白不同。
  29. 如請求項28之哺乳動物細胞，其中該第二穩定整合位點進一步包含選擇標記基因及內部核糖體進入位點(IRES)。
  30. 如請求項28之哺乳動物細胞，其中該第一及第二穩定整合位點包含重組酶識別位點。
  31. 如請求項28之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為人類羊膜上皮細胞。
  32. 如請求項28之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為HEK293細胞。
  33. 如請求項28之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為BHK細胞。
  34. 如請求項28之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為CHO細胞。
  35. 一種用於製備至少一種所關注蛋白質之方法，其包含： (a)提供哺乳動物細胞，其包含位於第一基因體安全港中之第一穩定整合位點及不位於該第一基因體安全港中之第二穩定整合位點，其中該第一穩定整合位點包含編碼第一報導蛋白之第一報導基因且該第二穩定整合位點包含編碼第二報導蛋白之第二報導基因，其中該第一報導蛋白及該第二報導蛋白不同，且其中該第一及第二穩定整合位點包含重組酶識別位點； (b) 藉由重組酶介導之盒式交換（cassette exchange）將編碼該所關注蛋白質之多核苷酸引入至穩定整合位點中，及 (c) 在允許表現編碼該所關注多核苷酸之該多核苷酸的條件下培養該哺乳動物細胞。
  36. 如請求項35之方法，其中該哺乳動物細胞為人類羊膜上皮細胞。
  37. 如請求項35之方法，其中該哺乳動物細胞為HEK293細胞。
  38. 如請求項35之方法，其中該哺乳動物細胞為CHO細胞。
  39. 如請求項35之方法，其中該第一穩定整合位點包含編碼第一蛋白質之第一多核苷酸且該第二穩定整合位點包含編碼第二蛋白質之第二多核苷酸。
  40. 如請求項39之方法，其中該第一蛋白質為病毒蛋白。
  41. 如請求項39之方法，其中該第二蛋白質為病毒蛋白。
  42. 如請求項35之方法，其中該哺乳動物細胞包含編碼腺相關病毒蛋白之多核苷酸及編碼腺病毒蛋白之多核苷酸。
  43. 如請求項35之方法，其中該第二穩定整合位點位於與該第一基因體安全港不同之第二基因體安全港中。
  44. 一種產生具有多個穩定整合位點之哺乳動物細胞的方法，其中該方法包含： (A)       提供哺乳動物細胞，其包含第一DNA卡匣，該第一DNA卡匣以5'至3'順序包含編碼第一lox位點的多核苷酸、啟動子、編碼選擇標記蛋白之選擇標記基因、IRES、編碼第一報導蛋白之第一報導基因、可操作地連接至操縱子之啟動子、Cas9基因及第二lox位點； (B) 整合第二DNA卡匣，其包含多核苷酸，該多核苷酸以5'至3'順序包含含有CRISPR sgRNA目標位點的第一基因體安全港同源臂、第三lox位點、編碼第二報導蛋白之第二報導基因、第四lox位點及CRISPR sgRNA目標位點的第二基因體安全港同源臂，其中該第一lox位點、該第二lox位點、該第三lox位點及該第四lox位點不同，其中第一導引臂及第二導引臂可含有具有變異之區域，且其中該第二報導蛋白與該第一報導蛋白不同； (C) 將該第一DNA卡匣與第三DNA盒式交換，其中該第三DNA卡匣以5'至3'順序包含編碼第一lox位點的多核苷酸、啟動子、編碼第三報導蛋白之第三報導基因及第二lox位點，其中該第三報導蛋白與該第二報導蛋白不同，藉此提供具有多個穩定整合位點之該哺乳動物細胞。
  45. 如請求項44之方法，其中該等變異防止重新產生可靶向位點。
  46. 如請求項44之方法，其中該哺乳動物細胞為HEK293細胞。
  47. 如請求項44之方法，其中該哺乳動物細胞為CHO細胞。
  48. 如請求項44之方法，其中步驟(A)之該細胞進一步包含編碼處於CMV啟動子之控制下之抑制因子的多核苷酸。
  49. 如請求項44之方法，其中步驟(B)之該細胞進一步包含編碼處於CMV啟動子之控制下之抑制因子的多核苷酸。
  50. 如請求項44之方法，其中步驟(C)之該細胞進一步包含編碼處於CMV啟動子之控制下之抑制因子的多核苷酸。
  51. 一種哺乳動物細胞，其包含經修飾基因體，其中該基因體藉由在該基因體之不同區域內插入至少三個DNA卡匣而經修飾，其中該經修飾基因體包含 (1) 第一去氧核糖核酸序列，其在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 1及2所組成之群組的至少一者至少90%一致； (2) 第二去氧核糖核酸序列，其在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少90%一致；及 (3) 第三去氧核糖核酸序列，其在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少90%一致， 其中該第一去氧核糖核酸序列藉由插入第一DNA卡匣而經修飾，該第二去氧核糖核酸序列藉由插入第二DNA卡匣而經修飾，且該第三去氧核糖核酸序列藉由插入第三DNA卡匣而經修飾。
  52. 如請求項51之哺乳動物細胞，其中 (1) 該第一去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 1及2所組成之群組的至少一者至少95%一致； (2) 該第二去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少95%一致；及 (3) 該第三去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少95%一致。
  53. 如請求項51之哺乳動物細胞，其中 (1) 該第一去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 1及2所組成之群組的至少一者至少98%一致； (2) 該第二去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少98%一致；及 (3) 該第三去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少98%一致。
  54. 如請求項51之哺乳動物細胞，其中 (1) 該第一去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 1及2所組成之群組的至少一者至少99%一致； (2) 該第二去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少99%一致；及 (3) 該第三去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少99%一致。
  55. 如請求項51至54中任一項之哺乳動物細胞，其中 (a) 該第一DNA卡匣包含啟動子及選自由可選標記基因及報導基因所組成之群組的至少一者； (b) 該第二DNA卡匣包含啟動子及選自由可選標記基因及報導基因所組成之群組的至少一者；及 (c) 該第三DNA卡匣包含啟動子及選自由可選標記基因及報導基因所組成之群組的至少一者。
  56. 如請求項55之哺乳動物細胞，其中 (a) 該第一DNA卡匣包含啟動子、可選標記基因及報導基因； (b) 該第二DNA卡匣包含啟動子、可選標記基因及報導基因；及 (c) 該第三DNA卡匣包含啟動子、可選標記基因及報導基因。
  57. 如請求項55或56之哺乳動物細胞，其中該第一去氧核糖核酸序列包含穩定整合位點。
  58. 如請求項57之哺乳動物細胞，其中所關注基因係被插入至該穩定整合位點中。
  59. 如請求項57之哺乳動物細胞，其中該所關注基因編碼選自由以下所組成之群組的所關注多肽：抗體、抗體鏈、受體、含Fc蛋白、阱蛋白（trap protein）、酶、因子、抑制因子、活化因子、配位體、報導蛋白、選擇蛋白、蛋白賀爾蒙（protein hormone）、蛋白毒素、結構蛋白、儲存蛋白、轉運蛋白、神經傳導物質（neurotransmitter）及收縮性蛋白。
  60. 如請求項51至59中任一項之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為人類細胞且該第一去氧核糖核酸序列與SEQ ID NO: 1至少90%一致。
  61. 如請求項51至59中任一項之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為CHO細胞且該第一去氧核糖核酸序列與SEQ ID NO: 2至少90%一致。
  62. 如請求項60之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為人類細胞且該第一去氧核糖核酸序列與SEQ ID NO: 1至少95%一致。
  63. 如請求項61之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為CHO細胞且該第一去氧核糖核酸序列與SEQ ID NO: 2至少95%一致。
  64. 如請求項62之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為人類細胞且該第一去氧核糖核酸序列與SEQ ID NO: 1至少98%一致。
  65. 如請求項63之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為CHO細胞且該第一去氧核糖核酸序列與SEQ ID NO: 2至少98%一致。
  66. 如請求項64之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為人類細胞且該第一去氧核糖核酸序列與SEQ ID NO: 1至少99%一致。
  67. 如請求項65之哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為CHO細胞且該第一去氧核糖核酸序列與SEQ ID NO: 2至少99%一致。
  68. 如請求項61、63、65或67中任一項之哺乳動物細胞，其中該第一去氧核糖核酸序列包含使用選自由SEQ ID NO: 13至419所組成之群組之導引序列產生的穩定整合位點。
  69. 如請求項61、63、65或67中任一項之哺乳動物細胞，其中該第一去氧核糖核酸序列包含藉由使用在選自由以下所組成之群組的核苷酸位置範圍處與SEQ ID NO: 2中之目標序列互補的導引序列產生的穩定整合位點：(a) 1至2000；(b) 2001至4000；(c) 4001至6000；(d) 6001至8000；(e) 8001至10,000；(f) 10,001至12,000；(g) 12,001至14,000；(h) 14,001至16,000；(i) 16,001至18,000；(j) 18,001至20,000；(k) 20,001至22,000；(l) 22,001至24,000；(m) 24,001至26,000；(n) 26,001至28,000；(o) 28,001至30,000；(p) 30,001至32,000；(q) 32,001至34,000；(r) 34,001至36,000；(s) 36,001至38,000；(t) 38,001至40,000；(u) 40,001至42,000；及(v) 42,001至44,232。
  70. 一種哺乳動物細胞，其包含經修飾基因體， 其中該經修飾基因體包含去氧核糖核酸序列，該去氧核糖核酸序列包含藉由插入至少一個DNA卡匣而經修飾的AAVS1樣區域，及 其中選自由SEQ ID NO: 13至419所組成之群組的導引序列與該AAVS1樣區域之有義股或反義股互補。
  71. 如請求項70之哺乳動物細胞，其進一步包含 第二去氧核糖核酸序列，其在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少90%一致；及 第三去氧核糖核酸序列，其在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少90%一致， 其中該第一去氧核糖核酸序列藉由插入第一DNA卡匣而經修飾，該第二去氧核糖核酸序列藉由插入第二DNA卡匣而經修飾，且該第三去氧核糖核酸序列藉由插入第三DNA卡匣而經修飾。
  72. 如請求項71之哺乳動物細胞，其中該第二去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少90%至99%、95%至99%或98%至99%一致；且該第三去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少90%至99%、95%至99%或98%至99%一致。
  73. 如請求項70至72中任一項之哺乳動物細胞，其中該第一去氧核糖核酸序列包含藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少50%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生的穩定整合位點： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  74. 如請求項73之哺乳動物細胞，其中該第一去氧核糖核酸序列包含藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少75%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生的穩定整合位點： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  75. 如請求項74之哺乳動物細胞，其中該第一去氧核糖核酸序列包含藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少85%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生的穩定整合位點： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  76. 如請求項75之哺乳動物細胞，其中該第一去氧核糖核酸序列包含藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少90%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生的穩定整合位點： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  77. 如請求項76之哺乳動物細胞，其中該第一去氧核糖核酸序列包含藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少95%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生的穩定整合位點： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  78. 如請求項77之哺乳動物細胞，其中該第一去氧核糖核酸序列包含藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少98%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生的穩定整合位點： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  79. 一種哺乳動物細胞，其包含經修飾基因體， 其中該經修飾基因體包含AAVS1樣區域中之穩定整合位點，其中該穩定整合位點係藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少50%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  80. 如請求項79之哺乳動物細胞，其中該經修飾基因體包含AAVS1樣區域中之穩定整合位點，其中該穩定整合位點係藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少75%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  81. 如請求項80之哺乳動物細胞，其中該經修飾基因體包含AAVS1樣區域中之穩定整合位點，其中該穩定整合位點係藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少85%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  82. 如請求項81之哺乳動物細胞，其中該經修飾基因體包含AAVS1樣區域中之穩定整合位點，其中該穩定整合位點係藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少90%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  83. 如請求項82之哺乳動物細胞，其中該經修飾基因體包含AAVS1樣區域中之穩定整合位點，其中該穩定整合位點係藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少95%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  84. 如請求項83之哺乳動物細胞，其中該經修飾基因體包含AAVS1樣區域中之穩定整合位點，其中該穩定整合位點係藉由使用在以下核苷酸位置處與至少一個與SEQ ID NO: 2具有至少98%至99%一致性之目標序列互補的導引序列產生： (a) 1至2000；或(b) 2001至4000；或(c) 4001至6000；或(d) 6001至8000；或(e) 8001至10,000；或(f) 10,001至12,000；或(g) 12,001至14,000；或(h) 14,001至16,000；或(i) 16,001至18,000；或(j) 18,001至20,000；或(k) 20,001至22,000；或(l) 22,001至24,000；或(m) 24,001至26,000；或(n) 26,001至28,000；或(o) 28,001至30,000；或(p) 30,001至32,000；或(q) 32,001至34,000；或(r) 34,001至36,000；或(s) 36,001至38,000；或(t) 38,001至40,000；或(u) 40,001至42,000；或(v) 42,001至44,232。
  85. 如請求項78至84中任一項之哺乳動物細胞，其進一步包含 第二去氧核糖核酸序列，其在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少90%一致；及 第三去氧核糖核酸序列，其在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少90%一致， 其中該第一去氧核糖核酸序列藉由插入第一DNA卡匣而經修飾，該第二去氧核糖核酸序列藉由插入第二DNA卡匣而經修飾，且該第三去氧核糖核酸序列藉由插入第三DNA卡匣而經修飾。
  86. 如請求項85之哺乳動物細胞，其中該第二去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO: 5至10所組成之群組的至少一者至少90%至99%、95%至99%或98%至99%一致；且該第三去氧核糖核酸序列在修飾之前與選自由SEQ ID NO:11及SEQ ID NO: 12所組成之群組的至少一者至少90%至99%、95%至99%或98%至99%一致。
  87. 一種產生蛋白質之方法，其中該方法包含以下步驟： (1) 培養如請求項51至86之哺乳動物細胞；及 (2) 收穫該蛋白質。
  88. 一種細胞，其根據上述方法中之任一者。
  89. 一種方法，其使用上述細胞中之任一者。
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