DE19625188A1 - System zur Herstellung von AAV-Vektoren - Google Patents

System zur Herstellung von AAV-Vektoren

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein System, das sich zur Herstellung von AAV- Vektoren eignet, und seine Verwendung.
Zur Durchführung gentherapeutischer Maßnahmen ist es wichtig, Vektoren zu haben, die Fremd-Gene in das Genom von Zellen einführen können und für diese nicht toxisch sind. Ein Beispiel für solche Vektoren sind Adeno-assoziierte Viren (AAVs).
AAVs sind einzelsträngige, zur Familie der Parvoviren gehörende DNA-Viren. Für ihre Replikation benötigen AAVs Helferviren, insbesondere Adenoviren oder Herpesviren. In Abwesenheit von Helferviren integrieren AAVs in das Wirtszell­ genom, insbesondere an einer spezifischen Stelle von Chromosom 19.
Das Genom von AAVs ist linear und weist eine Länge von ca. 4680 Nukleotiden auf. Dieses umfaßt zwei Leserahmen, die für ein strukturelles und ein nicht­ strukturelles Gen kodieren. Das strukturelle Gen wird mit cap-Gen bezeichnet. Dieses steht unter der Kontrolle des P40-Promotors und kodiert für drei Capsid- Proteine. Das nicht-strukturelle Gen wird mit rep-Gen bezeichnet und kodiert für die Rep-Proteine, Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40. Die beiden ersteren werden unter der Kontrolle des P5 Promotors exprimiert, während die Expres­ sion von Rep 52 und Rep 40 unter der Kontrolle des P1 9 Promotors steht. Die Funktionen der Rep-Proteine liegen u. a. in der Regulation der Replikation und Transkription des AAV-Genoms.
Die Herstellung von AAVs stellt sich allerdings als äußerst problematisch dar. Insbesondere ist es schwierig, rekombinante AAVs (rAAVs), d. h. AAVs, die eine Fremd-DNA enthalten, in großen Mengen herzustellen. Selbst der Versuch, Adenoviren als Vektoren für rAAVs zu verwenden, führt zu keinen befriedigen­ den Ergebnissen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem rAAVs in großen Mengen bereitgestellt werden können.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein System, umfassend einen, eine Fremd-DNA enthaltenden AAV-Vektor, und rep 68/78-Sequenzen von AAV, deren Expression bezüglich der DNA-Replikation des AAV-Vektors oder eines Teils davon verzögert ist, wobei die rep 68/78 Sequenzen (a) in cis oder (b) in trans vorliegen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß die Rep- Proteine 68 und 78 von AAV die Replikation von AAV-DNA beeinträchtigen, diese Beeinträchtigung aber durch eine verzögerte Expression der die Rep-Protei­ ne 68 und 78 kodierenden Sequenzen verhindert werden kann.
Der Ausdruck "AAV-Vektor" betrifft jeglichen AAV-Vektor, der keine rep 68/7 8- Sequenzen von AAV enthält, die bezüglich der DNA-Replikation des AAV-Vek­ tors oder eines Teils davon nicht verzögert exprimiert werden. Der Ausdruck "ein Teil des AAV-Vektors" betrifft jeglichen Teil des AAV-Vektors, insbesondere seine cap-Sequenzen und die für die Rep-Proteine 40 und 52 kodierenden Sequenzen.
Der Ausdruck "rep 68/78-Sequenzen von AAV" weist darauf hin, daß das erfindungsgemäße System rep 68- und/oder rep 78-Sequenzen von AAV um­ faßt, deren Expression bezüglich der DNA-Replikation des AAV-Vektors oder eines Teils davon verzögert ist.
Der Ausdruck "Fremd-DNA" betrifft jegliche Fremd-DNA, die in einem vorstehen­ den AAV-Vektor integriert sein kann. Die Fremd-DNA kann nicht-kodierend oder kodierend sein. In ersterem Fall kann die Fremd-DNA ein Regulator-Element der DNA-Replikation und/oder Transkription sein. In letzterem Fall ist es günstig, wenn die Fremd-DNA exprimierbar ist, wobei es besonders vorteilhaft ist, wenn die Expression unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promo­ tors, wie eines Gewebe- oder Tumor-spezifischen Promotors, steht. Ferner kann die Fremd-DNA für ein diagnostisches und/oder therapeutisches Protein kodie­ ren. Beispiele eines therapeutischen Proteins sind Tumornekrosefaktor, Inter­ ferone, Interleukine, Lymphokine, Wachstumsfaktoren, Plasmaproteine, wie Gerinnungsfaktoren und Stoffwechselenzyme, und Rezeptoren. Insbesondere kann die Fremd-DNA für Proteine kodieren, welche die Immunogenität von Zellen steigern können. Dies können Proteine sein, die Tumorzellen fehlen, z. B. Zytoki­ ne, wie IL-2, Interferone und GM-CSF, und kostimulierende Moleküle, wie B7-1, tumorassoziierte Antigene, z. B. MAGE1, Tyrosinasen, Lymphon-spezifische Idiotypen und virale Proteine, z. B. E7-Protein von humanem Papillomvirus und EBNA 3-Protein von Epstein-Barr-Virus. Die Fremd-DNA kann an beliebiger Stelle des AAV-Vektors integriert sein. Günstig kann es sein, wenn mehrere Fremd- DNAs in einem AAV-Vektor vorliegen.
Ein erfindungsgemäßes System umfaßt in (a) einen AAV-Vektor und in cis, d. h. auf dem AAV-Vektor, vorliegende rep 68/78-Sequenzen von AAV, die bezüglich der DNA-Replikation des AAV-Vektors oder eines Teils davon, verzögert ex­ primiert werden. Ein solcher AAV-Vektor kann durch übliche Verfahren erhalten werden. Günstig ist es, von einem AAV-Vektor auszugehen, der eine für Rep- Proteine von AAV kodierende DNA aufweist. In einem solchen AAV-Vektor kann der endogene P5-Promotor der rep 68- und rep 78-Sequenzen von AAV durch einen solchen ersetzt werden, der nach der DNA-Replikation des AAV-Vektors oder eines Teils davon aktiv ist. Ein solcher Promotor ist z. B. der "major late promoter" von Adenovirus oder ein Derivat davon. Auch kann ein induzierbarer Promotor, z. B. der Metallothionein-Promotor oder ein Derivat davon, anstelle des endogenen P5-Promotors der rep 68- und rep 78-Sequenzen von AAV eingesetzt werden.
In bevorzugter Ausführungsform liegt der AAV-Vektor in (a) in einem Mittel (I) vor. Dieses kann jegliches Mittel sein, das die Funktionalität des AAV-Vektors, insbesondere seine Replikation, nicht beeinträchtigt. Günstigerweise ist das Mittel (I) ein Vektor, z. B. ein Virus- oder ein Plasmid-Vektor, oder eine Zelle.
Ein erfindungsgemäßes System umfaßt in (b) einen AAV-Vektor und in trans, d. h. getrennt von dem AAV-Vektor, vorliegende rep 68/78-Sequenzen von AAV, die bezüglich der DNA-Replikation des AAV-Vektors oder eines Teils davon, verzögert exprimiert werden. Vorzugsweise liegen die rep 68/78-Sequenzen von AAV in einem Mittel (II) vor. Dieses kann jegliches Mittel sein, das die Funktiona­ lität der rep 68/78-Sequenzen von AAV, insbesondere ihre verzögerte Expres­ sion, nicht beeinträchtigt. Letztere kann, wie in (a) beschrieben, erhalten wer­ den. Ein Mittel (II) ist vorteilhafterweise ein Vektor, z. B. ein Virus- oder ein Plasmid-Vektor, oder eine Zelle.
Besonders günstig ist es, wenn in (b) der AAV-Vektor in einem Mittel (I) und die rep 68/78-Sequenzen von AAV in einem Mittel (II) vorliegen. Die Mittel (I) und (II) können die vorstehenden Bedeutungen haben, wobei sie gleichzeitig aber nicht Zellen sein können. Vorteilhaft ist es, wenn die Mittel (I) und (II) Virus- Vektoren, z. B. Adenovirus-Vektoren oder eine Kombination aus Adenovirus- und Vacciniavirus-Vektoren sind. Besonders günstig ist es, wenn sich die Virus- Vektoren komplementieren können. Nachstehend werden Virus-Vektoren als Mittel (I) und (II) beschrieben. Dies ist beispielhaft anzusehen.
Mittel (I) ist ein Adenovirus-Vektor, der anstelle der E1-Sequenzen von Adenovi­ rus einen AAV-Vektor mit ITR-Sequenzen von AAV und einer Fremd-DNA enthält.
Mittel (II) ist ein Adenovirus-Vektor, der anstelle der E3-Sequenzen von Adenovi­ rus rep- und cap-Sequenzen von AAV enthält, wobei die rep 68/78-Sequenzen von AAV unter der Kontrolle eines nach der DNA-Replikation des AAV-Vektors oder eines Teils davon aktiven Promotors, z. B. des "major late promoter" von Adenovirus, die rep 40- und rep 52-Sequenzen von AAV unter der Kontrolle des endogenen p19-Promotors, und die cap-Sequenzen von AAV unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors, z. B. des CMV-Promotors, stehen;
oder
Mittel (II) ist eine Kombination aus zwei Adenovirus-Vektoren, von denen der eine anstelle der E3-Sequenzen von Adenovirus rep-Sequenzen von AAV enthält, wobei die rep 68/78-Sequenzen von AAV unter der Kontrolle des "major late promoter" von Adenovirus und die rep 40- und rep 52-Sequenzen von AAV unter der Kontrolle des endogenen p19-Promotors stehen, und der andere anstelle der E4-Sequenzen von Adenovirus cap-Sequenzen von AAV enthält, die unter der Kontrolle des CMV-Promotors stehen;
oder
Mittel (II) ist eine Kombination aus einem Adenovirus-Vektor und einem Vacci­ niavirus-Vektor, von denen ersterer anstelle der E3-Sequenzen von Adenovirus rep 40- und rep 52-Sequenzen von AAV unter der Kontrolle des endogenen p19- Promotors und cap-Sequenzen von AAV unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält, und der zweite rep 68/78-Sequenzen von AAV enthält. Der Vacciniavi­ rus-Vektor wird erst zugefügt, nachdem die DNA-Replikation der Adenovirus- Vektoren ganz oder teilweise abgelaufen ist.
Ein erfindungsgemäßes System eignet sich, rekombinante AAVs (rAAVs) in großen Mengen herzustellen. Hierzu wird das erfindungsgemäße System in Zellen eingebracht, welche die Replikation von rAAVs erlauben. Dies sind z. B. 293-Zellen. Die Zellen werden dann mit Helferviren, wie Adenoviren, infiziert. Dies kann unterbleiben, wenn das erfindungsgemäße System alle für die Replika­ tion von rAAVs notwendigen Elemente bereitstellt. Solches findet sich insbeson­ dere dann, wenn das erfindungsgemäße System in der Alternative (b) vorliegt, in der die Mittel (I) und (II) Virus-Vektoren, insbesondere Adenovirus-Vektoren oder eine Kombination aus Adenovirus- und Vacciniavirus-Vektoren, sind, die sich komplementieren. Auch kann die Komplementation gegeben sein, wenn eines der Mittel ein Virus-Vektor und das andere Mittel eine Zelle ist, die das Protein bereitstellt, dessen DNA im Virus-Vektor deletiert ist.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, rAAVs bereitzustellen, die für diagnostische und/oder therapeutische Maßnahmen verwendet werden können. Durch die Auswahl der Fremd-DNA können gezielt solche Maßnahmen ergriffen werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch das Beispiel erläutert.
Beispiel Herstellung eines erfindungsgemäßen Systems
(a) Herstellung eines rekombinanten Adenovirus, in den rep/cap-Sequenzen von AAV (rep/cap-Expressionskassette) in den E1-Bereich des Adeno­ viralen Genoms integriert sind. Es wird auf die Methode von Bett et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 1994, 8802-8806 verwiesen. Rep 68/78-Sequenzen von AAV werden unter die Kontrolle des "major late promoter" gestellt, um eine verzögerte Expression zu erreichen. Rep 40/52-Sequenzen von AAV verbleiben unter der Kontrolle des endogenen p19-Promotors. Cap-Sequenzen von AAV werden unter die Kontrolle des CMV-Promotors gestellt. Ferner enthalten die cap-Sequenzen im 5′-un­ translatierten Bereich der mRNAs Sequenzen aus dem 5′-untranslatierten Bereich der späten Adeno-viralen mRNAs.
Herstellung einer rep/cap-Expressionskassette
Eine Teilsequenz des rep-Gens (Positionen 1882 bis 2280) wird durch PCR mit den Primern 5′-CGCCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAG- 3′ und 5′-GCGGGCGTCGACTTTGAGCTTCCACCACTGTCTTAT-3′ von einer das AAV-Genom enthaltenden Matrize (z. B. pSVOriAAV) amplifi­ ziert, mit HindIII/Sall geschnitten und in das mit den gleichen Enzymen geschnittene Plasmid pUC19 inseriert. Es wird pUC19Repdupl erhalten. Die cDNA-Sequenz der 5, untranslatierten Leader der späten Adenovirus­ mRNAs wird mit PCR unter Verwendung der Primer 5′-CGGGGTACCCAG- CTGACTCTCTTCCGCATCGCTG-3′ und 5′-CGCGGATCCGAATT- CAAGCTTCTCGAGAGGTTTTCCGATC-3′ aus dem Plasmid pM PCV2 (Logan und Shenk, 1984) amplifiziert, wobei für weitere Klonierungen passende flankierende Restriktionsschnittstellen entstehen. Das Amplifikat wird mit Kpnl/BamHl geschnitten und in das mit den gleichen Enzymen geschnittene Plasmid pCEP4 (Firma Invitrogen) inseriert, wobei der Vektor pCEP4-CMVL entsteht. Mit EcoRI/Sall wird der CMV-Promotor zusammen mit dem Leader aus pCEP4-CMV-Leader herausgeschnitten und in das mit den selben Restriktionsenzymen linearisierte pUC19Repdupl inseriert; es entsteht pRepdupl-CMVL. Der Bereich mit der rep-Teilsequenz und dem CMV-Promotor und dem Adeno-Leader wird mit HindIII aus dem resultie­ renden pRepdupl-CMV-Leader geschnitten und in partiell mit HindIII ge­ schnittenen pSVOriAAV (Chiorini et al., 1995) inseriert. Es entsteht pRepCMVLCap. Die Insertion an der richtigen Stelle in der richtigen Orien­ tierung wird mit adäquaten Restriktionsspaltungen überprüft.
In pRepCMVLCap wird durch dieses Vorgehen der CMV-Promotor zwi­ schen die rep- und die cap-Sequenzen inseriert, wobei die Unterbrechung des rep-Leserasters durch Duplikation einer Teilsequenz verhindert wird und der CMV-Promotor in die HindIII-Schnittstelle an Pos. 1883 der AAV- Sequenz des pSVOriAAV inseriert wird. Diese HindIII-Schnittstelle befin­ det sich zwischen dem Transkriptionsstartpunkt des p40-Promotors und dem 5′-Splicing-Signal der cap-Sequenzen.
pRepCMVLCap wird mit Spel linearisiert und mit T4-Exonuklease behan­ delt. Eine Zeitreihe der T4-Exonuklease-Behandlung ermöglicht das Ent­ stehen unterschiedlicher Größen des deletierten Bereichs. Es wird mit einem Konstrukt weitergearbeitet, bei dem der 5′-Bereich des AAV-Ge­ noms bis zu einer Stelle zwischen den Position 288 und 321 deletiert ist, so daß die verbleibende Sequenz zwischen dem Transkriptionsstart der rep68/78-Sequenzen, Pos. 288, und dem Startkodon dieser Sequenzen, Pos. 321, beginnt. In den deletierten Bereich wird mit synthetischen Linkern eine Polylinkersequenz mit Xbal, Notl, Spel, und BgIII-Schnitt­ stellen eingebaut, so daß pRepCMVLCap entsteht. Der major-late-Promo­ tor wird durch Verwendung der Primer 5′-CGTCTA- GAGCGGCCGCCCGCGGTCCTCCTCGTATAGAAACT-3′ und 5′-GCA- GATCTACTAGTCTCGAGAGGTTTTCCGATCCGGTCG-3′ aus pMPCV2 (Logan und Shenk, 1984) amplifiziert und mit BgIII/Xbal nachgeschnitten. pRepCMVLCap wird mit BgIII/Xbal geschnitten und der major late-Promo­ tor wird in der richtigen Orientierung inseriert, so daß pMLPRepCMVLCap entsteht.
Die rep-Kassette weist den endogenen p19-Promotor auf, der in die rep- Sequenz eingebettet ist und weiterhin die Expression der Proteine rep40 und rep52 kontrolliert, während nur die Sequenzen für rep68/78 unter der Kontrolle des major late-Promotors stehen.
Herstellung eines rekombinanten Adenovirus mit rep/cap-Expressions­ kassette
Die rep/cap-Expressionskassette wird mit Xbal/Clal aus pMLPRep- CMVLCap ausgeschnitten und in den mit den gleichen Enzymen lineari­ sierten Vektor pΔE1 sp1 A (Bett el al., 1995) inseriert. Dieses Plasmid enthält die Sequenzen des Adenovirus Typ 5 zwischen den Karteneinhei­ ten 0 und 0,9 sowie 9,8 und 15,8 wobei der E1A-Bereich durch eine Polylinker-Sequenz zur Insertion von Fremdgenen substituiert wurde.
Genome infektiöser rekombinanter Adenoviren können durch in vivo- Rekombination zwischen überlappenden Bereichen Adeno-viraler Sequen­ zen auf pBHG10, welches die Adenovirus-Sequenzen zwischen den Karteneinheiten 0 und 0,5, von 3,7 bis 78,3 und von 85,8 bis 100, sowie dem pΔE1sp1A-Derivat, welches rep/cap-Sequenzen enthält, entstehen. Zur Komplementation des E1A-Gens wird die Kotransfektion der beiden Plasmide in 293-Zellen durchgeführt. Ein zytopathischer Effekt, der sich einige Tage nach der Transfektion manifestiert, deutet auf das Entstehen rekombinanter Adenoviren hin. Die 293-Zellen, die einen zytopathischen Effekt zeigen, werden durch Einfrieren und Auftauen aufgebrochen und aus dem Lysat werden durch zweifache Plaque-Reinigung rekombinante Viren (Adrep/cap) vereinzelt. Einzelklone werden durch sukzessive Passa­ ge über 293-Kulturen amplifiziert. Die Expressionsmuster von rep und cap werden durch Western-Blotting charakterisiert.
b) Herstellung eines rekombinanten Adenovirus, in den ein rAAV-Genom integriert ist
Es wird eine Fremd-DNA, z. B. ein Luciferase-Reportergen mit flankie­ renden AAV-ITR-Sequenzen, in die E1A-Region eines Adenovirus inte­ griert. Aus dem Vektor pAAVCMVLuc (vgl. Maass et al., in Vorbereitung), der das Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle des CMV-Promotors, flankiert von AAV-ITR-Sequenzen in einem pEMBL8-Vektor enthält, wird die Expressionskassette mit den ITR-Sequenzen mit Pvull herausgeschnit­ ten. Dieses Fragment wird in EcoRV-geschnittenen pΔE1sp1A über die glatten Enden integriert. Es entsteht pΔE1sp1A-Luc. Die Herstellung der rekombinanten Adenoviren (AdAALuc) erfolgt durch Kotransfektion von pΔE1sp1A-Luc und pBHG10 in 293-Zellen durch in vivo-Rekombination, wie unter (a) beschrieben.
(c) Herstellung von rekombinanten AAV-Vektoren durch Infektion von 293- Zellen mit Adrep/cap und AdAAVLuc
4×10⁸ 293-Zellen werden zu 80% Konfluenz kultiviert und mit einer m.o.i. von jeweils 10 gleichzeitig mit Adrep/cap und AdAAVLuc in einem geringen Volumen serumfreien Mediums infiziert. 2 Stunden nach Infek­ tion wird Vollmedium zugegeben. 3 Tage nach Infektion werden die Zellen mit einem Zell-Kratzer von der Oberfläche der Kulturgefäße entfernt; die Suspension wird 5 min bei 200 g und Raumtemperatur abzentrifugiert. Die Zellpellets werden in 28 ml TD-Puffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM K₂HPO₄, 25 mM Tris/Cl pH 7,4) suspendiert und es werden 2 ml 10% (w/v) Natriumdesoxycholat und 2 ml 0,25% Trypsinlösung zugegeben. Das Lysat wird zum Zellaufschluß 30 min bei 37°C inkubiert und an­ schließend mit einem Dounce-Homogenisator behandelt. Mit CsCl wird eine Dichte von 1,4 g/ml eingestellt und das Lysat wird 24 h einer iso­ pyknischen Dichtegradientenzentrifugation bei 130000 g und 20°C unterzogen. Fraktionen mit einem refraktorischen Index zwischen 1,3705 und 1,3750 werden mit einem Fraktionssammler gesammelt, vereinigt und einer weiteren Dichtegradientenzentrifugation unter den gleichen Bedingungen unterzogen. Fraktionen mit einem refraktorischen Index zwischen 1,3705 und 1,3750 werden erneut gesammelt und gegen 0,9%ige NaCl-Lösung dialysiert. Das resultierende AAV-Lysat kann bei biologischen Tests, z. B. einem Luciferase-Expressionstest, verwendet werden.

Claims (12)

1. System, umfassend einen, eine Fremd-DNA enthaltenden AAV-Vektor, und rep 68/78-Sequenzen von AAV, deren Expression verzögert ist, wobei diese Sequenzen (a) in cis oder (b) in trans vorliegen.
2. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fremd-DNA exprimierbar ist.
3. System nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fremd- DNA unter der Kontrolle eines konstitutiven oder induzierbaren Promotors steht.
4. System nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß in (a) der AAV-Vektor und die rep 68/78-Sequenzen von AAV in einem Mittel (I) vorliegen.
5. System nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel (I) eine Zelle oder ein Vektor ist.
6. System nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Virus- oder ein Plasmid-Vektor ist.
7. System nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß in (b) der AAV-Vektor in einem Mittel (I) und die rep 68/78-Sequenzen von AAV in einem Mittel (II) vorliegen.
8. System nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel (I) und das Mittel (II) eine Zelle und/oder ein Vektor sind, wobei das Mittel (I) und das Mittel (II) gleichzeitig keine Zelle sind.
9. System nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Virus- und/oder ein Plasmid-Vektor ist.
10. System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Virus-Vektor ein Adenovirus-Vektor ist.
11. System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Virus-Vektor in Mittel (I) ein Adenovirus-Vektor und in Mittel (II) ein Vacciniavirus- Vektor ist.
12. Verwendung des Systems nach einem der Ansprüche 1-11 zur Herstel­ lung von AAV-Vektoren.
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