JP2024505575A - Ｄｕｘ４過剰発現に関連する疾患を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

Ｄｕｘ４過剰発現に関連する疾患を治療するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、又はＤＵＸ４発現若しくは過剰発現に関連するがんを含むがこれらに限定されない、筋ジストロフィー又はがんを治療、改善、進行を遅延、及び／又は予防するための生成物、方法、及び使用が本明細書に開示される。より具体的には、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）の発現を阻害又は下方制御するためのＲＮＡ干渉ベースの生成物、方法、及び使用が本明細書に開示される。更により具体的には、本開示は、ＤＵＸ４の発現を阻害又は下方制御するためのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、並びに細胞における、及び／あるいはＦＳＨＤ、又はＤＵＸ４発現若しくは過剰発現に関連するがんを含むがこれらに限定されない、筋ジストロフィー又はがんを有する対象の細胞における、ＤＵＸ４発現を阻害又は下方制御するために当該ｍｉＲＮＡを使用する方法を提供する。加えて、本開示は、マイクロＲＮＡ－６７５の発現を上方制御してＤＵＸ４発現を阻害するための、並びにＦＳＨＤ、又はＤＵＸ４発現若しくは過剰発現に関連するがんを含むがこれらに限定されない、筋ジストロフィー又はがんを治療、改善、進行を遅延、及び／又は予防するための、エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせを提供する。【選択図】なし

Description

配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５３４４５＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：６１，５５７バイト、作成：２０２２年２月１日）を含有し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の過剰発現に関連する疾患の治療の分野に関する。より具体的には、本開示は、ＤＵＸ４発現若しくはＤＵＸ４遺伝子の過剰発現に関連する筋ジストロフィー又はがんを治療、改善、進行を遅延、及び／又は予防するためのＲＮＡ干渉ベースの生成物、方法、及び使用を提供する。具体的には、本開示は、ＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害又は下方制御するための生成物及び方法を提供する。より具体的には、本開示は、ＤＵＸ４の発現を阻害若しくは下方制御するためのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、並びに細胞における、及び／又は顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を含むがそれに限定されない筋ジストロフィー、若しくは過剰発現したＤＵＸ４に関連するがんを有する対象における、ＤＵＸ４の発現を阻害若しくは下方制御するために当該ｍｉＲＮＡを使用する方法を提供する。加えて、本開示は、マイクロＲＮＡ－６７５の発現を上方制御してＤＵＸ４発現を阻害するための、並びに／あるいはＦＳＨＤ又はＤＵＸ４発現若しくは過剰発現に関連するがんを含むがこれらに限定されない筋ジストロフィー又はがんを治療、改善、進行を遅延、及び／又は予防するための、エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせを提供する。
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、遺伝性疾患のグループである。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱及び変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの形態は乳児期又は小児期に発症するが、他は中年以降まで出現し得ない。障害は、筋力低下の分布及び程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、並びに遺伝形式の点で異なる。
顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、なかでも最も一般的に遺伝する筋ジストロフィーであり、８７万人にも影響を及ぼすと推定されている。ＦＳＨＤの症状の古典的な説明には、顔、肩帯、及び腕における進行性の筋力低下が含まれるが、疾患は、胴体及び下肢の筋肉を含む、より広範囲に現れ得る。可変性はまた個人内に一般的に認められ、非対称的な衰弱が一般的である。発症年齢は幼児期から成人期までの範囲であり得、通常は疾患の重症度に関連しており、より早い発症は、多くの場合より重度の筋力低下に関連する。ＦＳＨＤを有するほとんどの患者は、通常の寿命を有するが、呼吸不全が発生する可能性があり、疾患が衰弱させ得、罹患した個人の約２５％がその５０歳代までに車椅子に依存することになり得、より重症な疾患形態では更に早いが、一方、他は生涯歩行を維持する。
ＦＳＨＤは、二重ホメオボックス４遺伝子（ＤＵＸ４）の異常な発現によって引き起こされ、骨格筋にとって有毒な転写因子を産生する。ＤＵＸ４は、通常、ヒトの発達の２細胞期の期間中に機能するが、その後、おそらく精巣を除いて、基本的に他の全ての組織で抑制される。ＦＳＨＤを有する人々の骨格筋では、特定の遺伝的及びエピジェネティック因子が同時にＤＵＸ４脱抑制を可能にし、次いでそれが、分化異常、酸化ストレス、炎症性浸潤、細胞死、及び筋萎縮に関与するものを含む、いくつかの異常な遺伝子発現カスケードを開始する。
効果的なＦＳＨＤ標的化療法は、患者の生活の質を劇的に改善するであろうが、現在、ＦＳＨＤの進行を遅らせるか、又は筋力低下を改善する承認された治療はない。ＦＳＨＤはＤＵＸ４脱抑制から生じるため、療法への最も直接的な経路には、筋肉におけるＤＵＸ４を阻害することが含まれる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による遺伝子サイレンシングは、ＤＵＸ４を阻害する１つの強力なアプローチである。歴史的に、ＲＮＡｉベースの療法は、優性疾患遺伝子を沈黙させるための２つの主要な戦略に依存してきている：（１）ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド薬物の寛容な標的細胞若しくは組織への送達、又は（２）設計されたマイクロＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ発現カセットがウイルスベクター内にパッケージングされ、送達後に細胞内で発現する遺伝子療法。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、真核細胞における遺伝子調節のメカニズムであり、様々な疾患の治療のために考慮されている。ＲＮＡｉは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によって媒介される遺伝子発現の転写後制御を指す。ｍｉＲＮＡは、同族メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域と配列相同性を共有し、塩基対形成する、小さい（２１～２５ヌクレオチド）、非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相互作用は、ｍＲＮＡの翻訳を防止するために細胞遺伝子サイレンシング機構を導く。ＲＮＡｉ経路は、（非特許文献１）に要約されている。
天然のＲＮＡｉ経路の理解が進むにつれて、研究者は、疾患を治療するために、標的遺伝子の発現の調節に使用するための人工ｍｉＲＮＡを設計した。上記のＤｕａｎのＳｅｃｔｉｏｎ７．４に記載されるように、人工ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡ発現カセットから転写することができる。標的遺伝子に対して特異的なｍｉＲＮＡ配列は、細胞におけるｍｉＲＮＡのプロセシングを指示するために必要な配列と一緒に転写される。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターが、ｍｉＲＮＡを筋肉に送達するために使用されてきている［非特許文献２］。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞傷害性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を与える。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）として本質的にそれらの細胞の生涯にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成、及び組み込みを誘導するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部又は全てを、外来ＤＮＡで置き換えることができる。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した耐久性のあるウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥することもできる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性がない。
ＦＳＨＤなどの筋ジストロフィー及びがんを含む、過剰発現したＤＵＸ４に関連する疾患を治療するための生成物及び方法について当技術分野で依然として必要とされ続けている。
Ｄｕａｎ（Ｅｄ．），Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ７，Ｓｅｃｔｉｏｎ７．３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ（２０１０） Ｆｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，８６：９８７－９９７（２００８）
本開示は、ＤＵＸ４発現を阻害するための、並びにＤＵＸ４の発現若しくは過剰発現に関連する筋ジストロフィー又はがんを治療、改善、進行を遅延、及び／又は予防するための、生成物、方法、及び使用を提供する。
本開示は、ＤＵＸ４発現を阻害するように設計された核酸、核酸を含むウイルスベクター、核酸及びベクターを含む組成物、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉するためにこれらの生成物を使用するための方法、並びにＤＵＸ４の上昇した発現から生じる疾患に罹患している対象における疾患を治療又は改善するための方法を提供する。
本開示は、（ａ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は（ｄ）配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的化マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、又はＣＫ１である。いくつかの態様において、核酸は、（ａ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む。
本開示は、（ａ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は（ｄ）配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的化マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスを提供する。いくつかの態様において、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、又はＣＫ１である。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、（ａ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、又はＡＡＶ－Ｂ１である。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ－９である。
本開示は、（ａ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は（ｄ）配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的化マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を含むナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソームを提供する。いくつかの態様において、ナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームは、配列番号９４～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列を含む核酸を含む。いくつかの態様において、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、又はＣＫ１である。いくつかの態様において、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソームは、（ａ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの態様において、ナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームは、配列番号９４～１０５のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含む核酸を含む。
本開示は、本開示で本明細書に記載される、核酸、アデノ随伴ウイルス、又はナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソームと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物を提供する。
本開示は、細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉する方法を提供し、方法は、細胞を、（ａ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は（ｄ）配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的化マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸と接触させることを含む。いくつかの態様において、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、又はＣＫ１である。いくつかの態様において、方法は、（ａ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
本開示は、細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉する方法を提供し、方法は、細胞を、（ａ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は（ｄ）配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的化マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスと接触させることを含む。いくつかの態様において、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、又はＣＫ１である。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、（ａ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、又はＡＡＶｒｈ．７４である。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ－９である。
本開示は、細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉する方法を提供し、細胞を、（ａ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は（ｄ）配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的化マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を含むナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームと接触させることを含む。いくつかの態様において、本開示は、細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉する方法を提供し、方法は、細胞を、配列番号９４～１０５のいずれか１つに示される配列を含む核酸を含むナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームと接触させることを含む。いくつかの態様において、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、又はＣＫ１である。いくつかの態様において、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソームは、（ａ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの態様において、ナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームは、配列番号９４～１０５のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性又は１００％の同一性を含む核酸を含む。
本開示は、細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉する方法を提供し、方法は、細胞を、本開示で本明細書に記載の核酸、アデノ随伴ウイルス、又はナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソームと、薬学的に許容される担体と、を含む組成物と接触させることを含む。
本開示は、筋ジストロフィー又はがんを有する対象を治療する方法を提供し、方法は、対象に、（ａ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、（）配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は（ｄ）配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、有効量の二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的化マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を投与することを含む。いくつかの態様において、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、又はＣＫ１である。いくつかの態様において、本方法は、（ａ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
本開示は、筋ジストロフィー又はがんを有する対象を治療する方法を提供し、方法は、対象に、（ａ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は（ｄ）配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的化ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を含む有効量のアデノ随伴ウイルスを投与することを含む。いくつかの態様において、治療する方法は、配列番号９４～１０５のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含む核酸を含むナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームを投与することを含む。いくつかの態様において、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、又はＣＫ１である。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、（ａ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、又はＡＡＶｒｈ．７４である。いくつかの態様において、アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ－９である。
本開示は、筋ジストロフィー又はがんを有する対象を治療する方法を提供し、対象に、（ａ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は（ｄ）配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的化マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を含む、有効量のナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームを投与することを含む。いくつかの態様において、核酸は、プロモーター配列を更に含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６又はＨ１である。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、又はＣＫ１である。いくつかの態様において、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソームは、（ａ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、又は（ｂ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。いくつかの態様において、ナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームは、配列番号９４～１０５のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含む核酸を含む。
本開示は、筋ジストロフィー又はがんを有する対象を治療する方法を提供し、方法は、対象に、本開示で本明細書に記載される、核酸、アデノ随伴ウイルス、又はナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソームと、薬学的に許容される担体と、を含む有効量の組成物を投与することを含む。
いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。いくつかの態様において、がんは、ＤＵＸ４の発現又は過剰発現に関連するがんである。いくつかの態様において、がんは、肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、又は副腎、胆管、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭頸部、肝臓、脳、肺、中皮質、神経堤、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、皮膚、軟組織、胃、精巣、若しくは胸腺のＤＵＸ４発現性がんである。
本開示は、細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害するための医薬品の調製のための、筋ジストロフィー若しくはがんを治療若しくは改善するための、及び／又は筋ジストロフィー若しくはがんを治療若しくは改善するための医薬品の調製のための、本開示で本明細書に記載される、核酸、アデノ随伴ウイルス、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は組成物の使用を提供する。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕筋ジストロフィーである。いくつかの態様において、がんは、ＤＵＸ４の発現又は過剰発現に関連するがんである。いくつかの態様において、がんは、肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、又は副腎、胆管、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭頸部、肝臓、脳、肺、中皮質、神経堤、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、皮膚、軟組織、胃、精巣、若しくは胸腺のＤＵＸ４発現性がんである。
本開示は、本開示で本明細書に記載される、核酸、アデノ随伴ウイルス、ナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、又は組成物を提供し、核酸、アデノ随伴ウイルス、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、組成物、又は医薬品は、筋肉内注射、皮下注射、経口投与、皮下、皮内、若しくは経皮輸送、血流への注入のために、又はエアロゾル投与のために製剤化される。
本開示は、細胞におけるマイクロＲＮＡ－６７５の発現を上方制御する方法を提供し、有効量のエストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン若しくはその誘導体、ピラジンアミド若しくはその誘導体、ソラフェニブ（４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－メチルピリジン－２－カルボキサミド）、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせと接触させることを含む。
いくつかの態様において、誘導体は、ブレオマイシン誘導体である。かかるブレオマイシン誘導体には、ブレオマイシンＡ２、デグリコ－ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＡ５、ブレオマイシンＡ６、ブレオマイシンＢ２が含まれるが、これらに限定されず、また、ブレオマイシンの同義語である薬物、例えば、ブレオシン、ブレオミイシン、Ｂｌｅｏｍｉｃｉｎａ（スペイン語）、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ（フランス語）、及びＢｌｅｏｍｙｃｉｎｕｍ（ラテン語）が含まれる。
いくつかの態様において、誘導体は、ピラジンアミド誘導体である。かかるピラジンアミド誘導体には、ピラジン－２－カルボン酸クロリド、Ｎ－（１－臭素メチル）ピラジンホルムアミド、Ｎ－（ブロモメチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（２－ブロモエチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（３－ブロモプロピル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（ピペリジン－１－イルメチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（ピペラジン－１－イルメチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（チオモルホリノメチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（２－（ピペリジン－１－イル）エチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（２－（ピペラジン－１－イル）エチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（２－チオモルホリノエチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（３－（ピペリジン－１－イル）プロピル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（３－（ピペラジン－１－イル）プロピル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（３－モルホリノプロピル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（３－チオモルホリノプロピル）ピラジン－２－カルボキサミド、３－クロロピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－メチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－ベンジルピラジン－２－カルボキサミド、ピラジン－１，２，３－トリアゾール、Ｎ－アルキル置換３－アミノピラジン－２－カルボキサミド、ピラジン酸ｎ－オクチルエステル、ピラジンチオカルボキサミド、Ｎ－ヒドロキシメチルピラジン、チオカルボキサミド、ピラジン酸ピバロイルオキシメチルエステル、３－（ベンジルアミノ）ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（３－クロロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（３，４－ジクロロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（３－トリフルオロメチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－クロロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（２－メチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－メトキシベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－メチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－アミノベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（２－クロロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（２－フルオロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－トリフルオロメチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（２－トリフルオロメチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（２，４－ジメトキシベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（３－ニトロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－（ベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（４－メチルベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（４－メトキシベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（４－アミノベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（３－クロロベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（４－クロロベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（３，４－ジクロロベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（３－ニトロベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（３－トリフルオロメチルベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（ベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（４－メチルベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（４－メトキシベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（４－アミノベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（３－クロロベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（４－クロロベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（３，４－ジクロロベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（３－ニトロベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（３－トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（２－メチルベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリルが含まれるが、これらに限定されず、また２－カルバミルピラジン、２－ピラジンカルボキサミド、アルジンアミド、ピラジンカルボキサミド、ピラジン－２－カルボキサミド、ピラジンアミド、ピラジンカルボキサミド、ピラジン酸アミド、ピリジンアミド、Ｐｉｒａｚｉｎａｍｉｄａ又はＰｙｒａｚｉｎａｍｉｄａ（スペイン語）、Ｐｙｒａｚｉｎａｍｉｄ（ドイツ語）、及びＰｙｒａｚｉｎａｍｉｄｕｍ（ラテン語）などのピリジンアミドの類義語である薬物が含まれる。
いくつかの態様において、誘導体は、ソラフェニブ誘導体である。かかるソラフェニブ誘導体には、４－クロロピリジン－２－カルボニルクロリド塩酸塩、４－クロロ－Ｎ－シクロペンチルピリジン－２－カルボキサミド、４－クロロ－Ｎ－シクロヘキシルピリジン－２－カルボキサミド、４－クロロ－Ｎ－シクロヘキシルメチルピリジン－２－カルボキサミド、４－クロロ－Ｎ－ベンジルピリジン－２－カルボキサミド、４－クロロ－Ｎ－フェニルエチルピリジン－２－カルボキサミド、４－（４－アミノフェノキシ）－Ｎ－シクロペンチルピリジン－２－カルボキサミド、４－（４－アミノフェノキシ）－Ｎ－シクロヘキシルピリジン－２－カルボキサミド、４－（４－アミノフェノキシ）－Ｎ－シクロヘキシルメチルピリジン－２－カルボキサミド、４－（４－アミノフェノキシ）－Ｎ－ベンジルピリジン－２－カルボキサミド、４－（４－アミノフェノキシ）－Ｎ－フェニルエチルピリジン－２－カルボキサミド、４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－シクロペンチル－ピリジン－２－カルボキサミド、４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－シクロヘキシル－ピリジン－２－カルボキサミド、４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－シクロヘキシルメチル－ピリジン－２－カルボキサミド、４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－ベンジル－ピリジン－２－カルボキサミド、４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－フェニルエチル－ピリジン－２－カルボキサミド、フェニルシアノ基を含むソラフェニブ誘導体、窒素複素環を含むソラフェニブ誘導体、キノキサリンジオン構造を有するソラフェニブ誘導体、カルコン部分を含むソラフェニブ誘導体、チオエーテル及びニコチンアミドを含むソラフェニブ誘導体、ソラフェニブのジアリールチオ尿素誘導体のクラス、ジチオカルバメート部分を含むオラフェニブ誘導体、ピラゾール足場を有するオラフェニブ誘導体、シクロヘキシル部分を含むソラフェニブ誘導体、キノリン核を含むソラフェニブ誘導体、二量体ベースの構造を含むソラフェニブ誘導体、ソラフェニブのａ，ｂ－不飽和ケトン誘導体、１，２，３－トリアゾールフレームワークを含むオラフェニブ誘導体、１，３，４－トリアリールピラゾールフレームワークを含むオラフェニブ誘導体、ソラフェニブのイミダゾ［２，１－ｂ］チアゾール誘導体、４－（４－（５－（２，４－ジクロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（５－（３－ブロモフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（５－（３，４，５－トリメトキシフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、４－（４－（５－（４－シアノフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（５－（２－クロロ－４－フルオロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（５－（４－ニトロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（５－（３－ニトロフェニル）－４，５－ジヒドロ）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、４－（４－（５－（４－メトキシフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（５－フェニル－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、４－（４－（５－（３，４－ジクロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（５－（４－フルオロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（５－（４－ブロモフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（５－（２，３，４－トリメトキシフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、４－（４－（５－（２，３－ジクロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（３－（４－ニトロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、４－（４－（３－（４－ブロモフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（３－（４－クロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－５－（３－ニトロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－５－（４－フルオロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－５－（４－クロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－５－（２，３－ジクロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－５－（４－シアノフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－３－（４－ニトロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、ＨＬＣ－０８０、ピロリジン側鎖を有するベンズイミダゾール誘導体、Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）－２－（２－オキソインドリン－３－イリデン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）－２－（２－オキソインドリン－３－イリデン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）－２－（５－メチル－２－オキソインドリン－３－イリデン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（３－ブロモフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（１Ｈ－インドール－３）－イル）メチレン）－Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（ｐ－トリル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（３－クロロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（３－ブロモフェニル）－２－（（２－クロロ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－メトキシフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－フルオロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（３－ブロモフェニル）－２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（２－フルオロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（３－フルオロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－メトキシフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（３－クロロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（３－ブロモフェニル）－２－（（２－クロロ－１－プロピル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ））フェニル）－４－フェニルピコリンアミド、４－（４－フルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、４－（２，４－ジフルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、４－（４－クロロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、４－（４－メトキシフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－４－ｐ－トリルピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－４－ｍ－トリルピコリンアミド、４－（３－フルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－４－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）ピコリンアミド、４－（４－エチルフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、４－（２，４－ジメチルフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－５－フェニルピコリンアミド、５－（４－フルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン）－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、５－（２，４－ジフルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、５－（４－クロロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、５－（４－メトキシフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－５－ｐ－トリルピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－５－ｍ－トリルピコリンアミド、５－（３－フルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン
－４－イルオキシ）フェニル）－５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）ピコリンアミド、５－（４－エチルフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、５－（２，４－ジメチルフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミドが含まれるが、これらに限定されず、またＳｏｒａｆｅｎｉｂ（フランス語）又はＳｏｒａｆｅｎｉｂｕｍ（ラテン語）などのソラフェニブの類義語である薬物も含まれる。
本開示は、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子又はタンパク質の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉する方法を提供し、細胞を、有効量のエストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせと接触させることを含む。
本開示は、ＤＵＸ４発現若しくは過剰発現に関連する筋ジストロフィー又はがんを有する対象を治療する方法を提供し、対象に、有効量のエストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせを投与することを含む。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。いくつかの態様において、がんは、肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、又は副腎、胆管、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭頸部、肝臓、脳、肺、中皮質、神経堤、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、皮膚、軟組織、胃、精巣、若しくは胸腺のＤＵＸ４発現性がんである。
本開示は、細胞におけるマイクロＲＮＡ－６７５の発現を上方制御するための、エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせの使用を提供する。
本開示は、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子及び／又はタンパク質の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉するための、エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせの使用を提供する。
本開示は、ＤＵＸ４発現若しくは過剰発現に関連する筋ジストロフィー又はがんを有する対象を治療するための、エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせの使用を提供する。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕筋ジストロフィーである。いくつかの態様において、がんは、肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、又は副腎、胆管、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭頸部、肝臓、脳、肺、中皮質、神経堤、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、皮膚、軟組織、胃、精巣、若しくは胸腺のＤＵＸ４発現性がんである。
本開示のいくつかの態様において、エストロゲン又は合成エストロゲンは、エストロン、エストラジオール、エストリオール、エステトロール、２７－ヒドロキシコレステロール、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、７－オキソ－ＤＨＥＡ、７α－ヒドロキシ－ＤＨＥＡ、１６α－ヒドロキシ－ＤＨＥＡ、７β－ヒドロキシエピアンドロステロン、アンドロステンジオン（Ａ４）、アンドロステンジオール（Ａ５）、３α－アンドロスタンジオール、及び３β－アンドロスタンジオール、２－ヒドロキシエストラジオール、２－ヒドロキシエストロン、４－ヒドロキシエストラジオール、４－ヒドロキシエストロン、１６α－ヒドロキシエストロン、エチニルエストラジオール、吉草酸エストラジオール、エストロピペート、コンジュゲートエステル化エストロゲン、並びにキネストロールである。
本開示のいくつかの態様において、プロゲステロン又はプロゲスチンは、酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）、１７α－ヒドロキシプロゲステロン、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ゲストデン、又はエトノゲストレルである。
いくつかの更なる態様において、エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせは、筋肉内注射、経口投与、皮下、皮内、若しくは経皮輸送、血流への注射のために、又はエアロゾル投与のために製剤化される。
本開示の更なる態様及び利点は、図面と併せて得られる、以下の詳細な説明のレビューから、当業者には明らかであろう。しかしながら、詳細な説明（図面及び特定の実施例を含む）は、開示される主題の実施形態を示すが、例示としてのみ与えられ、それは本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるためである。
長５’及び３’隣接配列を有するＵ６．ｍｉｒ－６７５が、ＤＵＸ４タンパク質レベルをわずか４０％の阻害効率で低下させることを示す。図１Ａ。ＤＵＸ４を標的とするＵ６．ｍｉｒ－６７５の能力を試験するためのデュアル－ルシフェラーゼアッセイ。この試験で使用されるｍｉｒ－６７５発現プラスミドがここに示される。この構築物では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ Ｕ６プロモーター（Ｕ６ｐ）が、ｍｉｒ－６７５の発現を制御する。６つのＴヌクレオチドの伸長から形成される末端シグナルは、転写の終結を可能にする。右側には、ｍｉｒ－６７５の二次構造が、その５’及び３’末端の隣接配列（枠囲い）とともに示されている。５’末端では、隣接配列は４０ヌクレオチド長であり、３’末端では、隣接配列は１１４位のヌクレオチドから始まる４７ヌクレオチド長である。デュアル－ルシフェラーゼアッセイを使用して、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５を標的ＤＵＸ４に対して試験した。これを行うために、ＤＵＸ４をＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４－ＦＬ発現プラスミドにクローニングし（図１Ａ）、すなわち、ＤＵＸ４－ＦＬ（Ｖ５タグ＋３’ＵＴＲを有しないＤＵＸ４ ＯＲＦ）を、鋳型としてＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬΔＶ５を使用して、以下のプライマー：フォワード：５’ＣＣＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＣＣＣＧＡＣＡＣ３’（配列番号１２５）、リバース：５’ＡＣＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＡＴＴＴＴＡＡＴＡＴＡＴＣＴＣ３’（配列番号１２６）を用いてＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ制限部位及びＲｅｎＬｕｃ．ＳＤ５変異体ＤＵＸ４ ３’ＵＴＲプラスミド骨格を使用して、事前に設計したＲｅｎＬｕｃ ＳＤ５変異体プラスミドにクローニングした。ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子は、ＤＵＸ４－ＦＬ ｍＲＮＡの代替的なスプライシングを防止するスプライシングドナー変異（＊ＳＤ５）を有する（Ａｎｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１０，ｅ０１１８８１３）。デュアル－ルシフェラーゼアッセイは、ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４－ＦＬ及びＵ６．ｍｉｒ－６７５発現プラスミドをヒト胚性腎臓ＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトすることによって行った。トランスフェクションの４８時間後、ウミシイタケ及びホタルルシフェラーゼ活性の両方を測定した。後者を使用して、ウミシイタケルシフェラーゼ活性について正規化した。非標的化ＲｅｎＬｕｃ対照骨格プラスミド（ＲｅｎＬｕｃ）を、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５及びＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４－ＦＬとともに共トランスフェクトし、陰性対照反応として、Ｕ６．ｍｉｌａｃＺとともに共トランスフェクトした。他の反応では、ｍｉｒ－６７５は、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５：ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４－ＦＬ（ｎ：ｎ）が１０対１、２０対１、又は４０対１のモル比で、それぞれ２４±３％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、２８±２％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、及び３３±３％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）減少させた。読み取りは全て、Ｕ６．ｍｉｌａｃＺ（陰性対照）に対して正規化した。実験ごとに６回の反復データを平均化し、個々の実験を三重測定で行った（Ｎ＝３）。結果は、全ての組み合わせた実験について平均相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性±ＳＥＭとして報告した。Ｕ６．ｍｉＤＵＸ４．４０５発現プラスミドを陽性対照として使用した［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８ Ｍａｒ １６；８：１２１－１３０］。Ｕ６．ｍｉＤＵＸ４．４０５は、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を８０±２％低下させた（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）。図１Ｂ。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５は、ウェスタンブロットで試験したとき、ＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させた。ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ及びＵ６．ｍｉｒ－６７５又はヒト長鎖非コードＨ１９発現プラスミド（ＣＭＶ．Ｈ１９）を用いた共トランスフェクションの２４時間後にＨＥＫ２９３細胞から採取した総タンパク質抽出物１５μｇで行った３回の独立したウェスタンブロット反復（Ｎ＝３）の代表的なウェスタンブロットゲル及び定量結果がここに示される。全長ＤＵＸ４は、ＣＯＯＨ末端Ｖ５エピトープに融合されている。したがって、ＤＵＸ４を検出するために、抗Ｖ５一次抗体を使用した。正規化物質として使用したβ－アクチンタンパク質を検出する抗体も使用した。結果として、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５及びＣＭＶ．Ｈ１９は、ＤＵＸ４タンパク質レベルをそれぞれ４６±１１％（Ｐ＜０．０２、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）及び４８±１２％（Ｐ＜０．０２、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させた。全ての値は、ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ及びＵ６．ｍｉｌａｃＺで共トランスフェクトした細胞からのＤＵＸ４タンパク質レベルに正規化した。結果は、３回の独立した反復の平均ＤＵＸ４タンパク質レベルパーセント±ＳＥＭとして報告される。 Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈが、インビトロで残りのｍｉｒ－６７５構築物と比較したとき、ＤＵＸ４タンパク質レベルの最も高い阻害効率を示したことを示す。図２Ａは、右側で、ステムループ構造の５’及び３’末端に異なる隣接配列を有するｍｉｒ－６７５構築物の二次構造を示す。図２Ａは、左側で、これらの構築物のための発現プラスミドを示す。Ｈ１．ｍｉｒ－６７５及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２発現プラスミドは、通常、核輸入ＨＩＶレンチウイルスゲノムを増加するために使用されるｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を含む。設計されたｍｉｒ－６７５構築物では、５’末端隣接配列は、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５について４０ｍｅｒと、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５ＮＦ（ＮＦ＝隣接なし）Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．２、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１について１ｍｅｒとの間のサイズ範囲を有する。３’末端隣接配列は、４７ｍｅｒ（Ｕ６．ｍｉｒ－６７５）とｍｅｒなし（Ｕ６．ｍｉｒ－６７５ＮＦ）との間のサイズ範囲を有する。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５ステムループでは、強調されたヌクレオチドは、制限部位ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ／ＸｂａＩ縮重部位に対応する。「ＣＮＮＣ」モチーフは、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）の効率的な切断に必要なセリン／アルギニンリッチスプライシング因子３（ＳＲＳＦ３）部位に対応する。Ｎヌクレオチドは、全てのヌクレオチドを表す。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５は、５つのＣＮＮＣモチーフを有する。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５ＮＦ、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２，Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．２、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１では、Ｈ１プロモーターが使用される場合、５’末端のヌクレオチドは「Ｃ」であり、Ｕ６プロモーターが使用される場合、「Ｇ」である。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈは、潜在的なＤｒｏｓｈａ認識部位として「ＵＡ」（枠囲い）ジヌクレオチドを有する。しかしながら、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．３、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５－２．４、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．３．１、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－２．５は、通常、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの基底ステムに認められるＤｒｏｓｈａ認識部位として「ＵＧ」（枠囲い）を有する。図２Ｂ。１４例全てのｍｉｒ－６７５構築物を使用したウェスタンブロット及びノーザンブロット。２例の代表的なウェスタンブロット及び３～８の独立したウェスタンブロット反復（Ｎ＝３～８）の定量結果である。トランスフェクション及びタンパク質抽出は、図１Ａ～Ｂと同様だった。Ｕ６／Ｈ１．ｍｉｒ－６７５とＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ発現プラスミドとのモル比は、全てのトランスフェクションにおいて１～３だった。右側のグラフは、ｍｉｒ－６７５トランスフェクション後の平均ＤＵＸ４タンパク質レベルを示す。１３例全てのｍｉｒ－６７５構築物が、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５（４３±４％、Ｎ＝６）よりも良好な阻害効率を有した（表２）。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈは、それぞれ、８３±３（Ｎ＝３の独立した反復）及び８９±６（Ｎ＝３の独立した反復）の阻害効率を有した。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈは、ＤＵＸ４タンパク質レベルの最も高い阻害効率を有し、これは、他の全てのｍｉｒ－６７５構築物と比較したとき統計的に有意だった（Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３～８の独立した反復）。ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ発現プラスミドでは、全長ＤＵＸ４がＣＯＯＨ末端Ｖ５エピトープに融合される。したがって、ＤＵＸ４は、図１Ａ～Ｂと同様に抗Ｖ５一次抗体を使用して検出した。抗体を使用して、ＤＵＸ４を発現する同じプラスミドから共発現され、正規化物質として使用されたｅＧＦＰも検出した。全ての値は、ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ及びＵ６－ｍｉｌａｃＺで共トランスフェクトした細胞からのＤＵＸ４タンパク質レベルに正規化した。ＤＵＸ４タンパク質レベルパーセントを定量化する各ｍｉｒ－６７５構築物に対応するカラムの上に、各構築物について完全なＲＮＡプロファイルを表すノーザンブロット結果が示される。抗ｍｉｒ－６７５－５ｐ二重ビオチン化プローブを使用した。２１～２５ｍｅｒ成熟配列が、ゲルブロットの右側に示される。結果は、３～８の独立した反復の平均ＤＵＸ４タンパク質レベルパーセント±ＳＥＭとして報告される。 Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆが、元のＵ６．ｍｉ４０５構築物と比較したとき、ＤＵＸ４発現のより高い阻害効率を示したことを示す。図３Ａは、左側で、ステムループ構造の５’及び３’末端に異なる隣接配列を有する３例のＵ６．ｍｉ４０５構築物の二次構造を示す。Ｕ６．ｍｉ４０５は、５’及び３’末端にそれぞれ３４ｍｅｒ及び４１ｍｅｒ長の隣接配列を有する。この構築物では、３’末端隣接配列は、ＳＲＳＦ３スプライシング因子によって認識することができる５つの「ＣＮＮＣ」モチーフを有する。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆは、５’末端に１つのヌクレオチド、及び３’末端に１６ｍｅｒ長の３’隣接配列を有する。後者は、単一の「ＣＮＮＣ」モチーフを有する。Ｕ６．ｍｉ４０５ＮＦは、５’末端に１つのヌクレオチドのみを有し、３’末端に「ＣＮＮＣ」モチーフを有しない。下線付き配列は、ｍｉ４０５ガイド鎖に対応する。右側には、これらの構築物の発現プラスミド、並びにＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４ ＯＲＦデュアル－ルシフェラーゼ構築物の発現プラスミドが示される。デュアル－ルシフェラーゼアッセイ及びウェスタンブロットを使用して、３例のｍｉ４０５構築物の阻害効率を評価した。デュアル－ルシフェラーゼアッセイにおいて、ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４ ＯＲＦ構築物に対して試験したとき、Ｕ６．ｍｉ４０５は相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を８５±１％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆは８９±１％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、及びＵ６．ｍｉ４０５ＮＦは６６±１％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させた。読み取りは全て、ｍｉＧＦＰ陰性対照に対して正規化した。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆは、１：４のＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比で試験したとき、Ｕ６．ｍｉ４０５よりも統計的に有意な高い阻害効率を有した（Ｐ＜０．０４ ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した反復）。ウェスタンブロットを使用して、ＨＥＫ２９３細胞におけるＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させるｍｉ４０５構築物の効率も試験した。同じ１：４のＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比を使用した。トランスフェクションの２４時間後、Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、及びＵ６．ｍｉ４０５ＮＦは、ＤＵＸ４タンパク質レベルをそれぞれ７９±１％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝２）、９９±１％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝２）、及び７０±１３％（Ｐ＜０．００３６、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝２）低下させた。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆは、Ｕ６．ｍｉ４０５と比較したとき、阻害効率が平均２０％増加した（Ｐ＜０．００７９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝２の独立した反復）。定量は全て、ｍｉＧＦＰ陰性対照に対して正規化した。結果は、２回の独立した反復の平均ＤＵＸ４タンパク質レベルパーセント±ＳＥＭとして報告される。図３Ｂ。［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８ Ｍａｒ １６；８：１２１－１３０］によって既に特定されている１０例のｍｉＤＵＸ４候補の阻害効率を、ｍｉ４０５Ｆ隣接配列を使用して試験するデュアル－ルシフェラーゼアッセイ。後者の使用は、試験した１０例のｍｉＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡのいずれの阻害効率も増強しなかった。それどころか、ｍｉ１８５Ｆ、ｍｉ１８６Ｆ、ｍｉ３１８Ｆ、ｍｉ５９９Ｆ、ｍｉ１１５６Ｆ、及びｍｉ１３１１Ｆは、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性におけるそれぞれ１６０±８％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、２７±９％（Ｐ＜０．０２６、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、４４±１５％（Ｐ＜０．０１８、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、２４±９％、（Ｐ＜０．０３９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、３４±８％（Ｐ＜０．００７１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、及び２７±９％（Ｐ＜０．０２１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）の増加によって示されるように、元の対応物よりも低い阻害効率を有した。読み取りは全て、ｍｉＧＦＰ陰性対照に対して正規化した。結果は、３回の独立した反復の平均相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性±ＳＥＭとして報告される。 ＤＵＸ４対ｍｉＤＵＸ４モル比の減少が、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆの阻害効率を増加させたが、他の１０例のＵ６．ｍｉＤＵＸ４Ｆ構築物の阻害効率は増加しなかったことを示す。図４Ａは、１：１、１：２、１：３、及び１：４．のＤＵＸ４対ｍｉＤＵＸ４モル比を使用して、１０例のｍｉＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ及びそれらの同族ｍｉＤＵＸ４Ｆ構築物の阻害効率を試験するために使用したデュアル－ルシフェラーゼアッセイからの結果を示す。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆは、Ｕ６．ｍｉ４０５と比較したとき、全ての比率で増強された阻害効率を示した（相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性は、１：１、１：２、１：３、及び１：４比で、それぞれ３３±２％、３２±２％、３４±１％、及び３２±１％減少した）（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した反復）。図４Ｂは、トランスフェクションの２４時間後、ＨＥＫ２９３細胞におけるデュアル－ルシフェラーゼアッセイを使用した、ｍｉ４０５、ｍｉ４０５ＮＦ、及びｍｉ４０５Ｆの用量漸減試験の結果を示す。ＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比は、１：４～４０：１の範囲だった。Ｕ６．ｍｉ４０５及びＵ６．ｍｉ４０５Ｆのサイレンシング効率は、用量依存的だった。しかしながら、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆの阻害効率は、全てのモル比でＵ６．ｍｉ４０５の阻害効率よりも常に優れていた（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆは、８：１のモル比で最も効率的であり、Ｕ６．ｍｉ４０５と比較したとき、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性に４８±６％の減少を有した（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）。読み取りは全て、ｍｉＧＦＰ陰性対照に対して正規化した。結果は、３回の独立した反復の平均相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性±ＳＥＭとして報告される。 ｍｉ４０５ステムループ構造に隣接する５’及び３’末端配列を変更することが、ｍｉＲＮＡのサイレンシング効率に影響することを示す。図５Ａは、右側で、ステムループ構造の５’及び３’末端に異なる隣接配列を有する１０例のｍｉ４０５構築物の二次構造を示す。図５Ａは、左側で、ｍｉ４０５構築物のための発現プラスミド、デュアル－ルシフェラーゼアッセイ（ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４－ＯＲＦ）、及びウェスタンブロット（ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ）を示す。注釈は、図１Ａ及び図２Ａと同様である。図５Ｂは、ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４ ＯＲＦ並びに２対１及び１２対１のＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比を有するＵ６．ｍｉ４０５構築物を用いたデュアル－ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。トランスフェクションの２４時間後、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。２対１比の場合、ウミシイタケルシフェラーゼ活性をそれぞれ、３．６±１．８％（Ｐ＞０．８０、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）及び２５±３（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させたＵ６．ｍｉ４０５ＮＦ及びＵ６．ｍｉ４０５Ｂを除き、全てのＵ６．ｍｉ４０５構築物が、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を効率的に低下させた。しかし、Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ａ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｃ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｄ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｅ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性をそれぞれ６２±２％、７２±１％、６４±１％、７１±１％、７３±１％、７７±１％、８１±１％、及び８０±１％低下させた（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆと比較したとき、他のＵ６．ｍｉ４０５構築物のいずれも、統計的に有意に高められた阻害効率を有しなかった。１２対１のＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比を使用した場合、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、それぞれ、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を４５±４％、５９±２％、及び５８±２％低下させた（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した反復）。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆと比較した場合、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、それぞれ、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を更に２６±５％（Ｐ＜０．０３３、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）及び２５±６％（０．０４２、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させた。読み取りは全て、Ｕ６．ｍｉＧＦＰ陰性対照に対して正規化した。結果は、３回の独立した反復の平均相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性±ＳＥＭとして報告される。図５Ｃは、Ｕ６．ｍｉＧＦＰ、Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、又はＵ６．ｍｉ４０５Ｈ及びＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ発現プラスミドを１２対１のＵ６．ｍｉＲＮＡ対ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰのモル比で用いて２４時間早く共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から抽出した総タンパク質のウェスタンブロットを示す。グラフは、４回の独立した実験の平均ＤＵＸ４タンパク質レベルを示す。Ｕ６．ｍｉ４０５と比較した場合、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、ＤＵＸ４タンパク質レベルの有意な低下を、それぞれ４０±５％（Ｐ＜０．０２０９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）、７１±５％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）、及び６０±８％（Ｐ＜０．０００９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）で誘導した。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆと比較した場合、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、ＤＵＸ４タンパク質レベルの有意な低下を、それぞれ５２±９％（Ｐ＜０．０００９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）及び３３±１４％（Ｐ＜０．０４９８、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）で誘導した。結果は、４回の独立した反復の平均ＤＵＸ４タンパク質レベルパーセント±ＳＥＭとして報告される。 成熟ｍｉ４０５の差次的な発現が、５’及び３’末端隣接配列の変更後に検出されることを示す。図６Ａは、標準ＴａｑＭａｎ ｃＤＮＡ合成反応を使用して、全てのＵ６．ｍｉ４０５発現プラスミドからの成熟ｍｉ４０５マイクロＲＮＡ配列の発現を評価するために使用されたＱＰＣＲを示す。後者は、ステムループプライマーベースの小ＲＮＡ検出原理（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従って成熟ｍｉ４０５配列を検出するリバースプライマーを使用する［Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ（２０１３）１９：１－１０］。次いで、ｍｉ４０５に特異的な標準ＴａｑＭａｎプローブを増幅ステップに使用した。このプローブ塩基は、ｍｉ４０５成熟配列の３’末端とリバースプライマー配列の５’末端との間の接合部で対形成する。ＨＥＫ２９３細胞におけるトランスフェクションの２４時間後に、ＱＰＣＲ分析を全てのＵ６．ｍｉ４０５構築物で実行した。全ての値は、Ｕ６．ｍｉ４０５に対して正規化した。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｂ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｃは、それらの成熟ｍｉ４０５配列発現を、それぞれ８５±５％（Ｐ＜０．００１９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した反復）、７１±９％（Ｐ＜０．００３８、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）、及び６３±２７％（Ｐ＜０．０１３３、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させた。しかしながら、Ｕ６．ｍｉ４０５Ａ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｄ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｅ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、Ｕ６．ｍｉ４０５から発現されたレベルと比較したとき、最小限に増加した（統計的に有意ではない）レベルで成熟ｍｉ４０５配列を発現した。遺伝子発現は、ｈｓａ－ＲＰＬ１３Ａに対して正規化した。結果は、３～４回の独立した反復の相対ｍｉ４０５発現±ＳＥＭとして報告される。Ｑ：クエンチャー。Ｆ：フルオロフォア。図６Ｂは、ｍｉ４０５、ｍｉ４０５Ｆ、ｍｉ４０５Ｂ、ｍｉ４０５Ｃ、ｍｉ４０５Ｇ、及びｍｉ４０５Ｈの発現レベルを定量する液滴デジタルＰＣＲを示す。ｃＤＮＡは、ＴａｑＭａｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）（ｄｄＰＣＲグラフの上に示されるｃＤＮＡ結果）及び２つのＴａｑＭａｎ ａｄｖａｎｃｅｄ カスタムメイドｍｉ４０５プローブ（埋め込みｍｉ４０５プローブ及び重複ｍｉ４０５プローブ）を使用して生成した。埋め込みプローブ塩基は、ｍｉ４０５配列内でのみ対形成する。重複プローブ塩基は、ｍｉ４０５ ３’末端配列及びアダプタ領域の一部と塩基対形成する。このアッセイでは、ｍｉ４０５レベルは、ｍｉｒ－１９１－５ｐ内因性対照ｍｉＲＮＡレベルに対して正規化した。結果は、３回の独立した反復のｍｉｒ－１９１－５ｐと比較したｍｉ４０５コピー±ＳＥＭとして報告される。Ｒ：レポーター色素。ＮＦＱ：非蛍光クエンチャー色素。ＭＧＢ：マイナーグルーブバインダー。 図１Ａ～Ｂを補完する非クロップ化ウェスタンブロット反復を示す。 図２Ａ～Ｂを補完する非クロップ化ウェスタンブロット反復を示す。 Ｕ６．ｍｉｒ－６７５と比較した成熟ｍｉｒ－６７５レベルの定量化を示す。図９Ａは、ＨＥＫ２９３細胞における１４例のｍｉｒ－６７５構築物のトランスフェクション後の２３ｍｅｒ成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐレベルを定量化するために使用されるＲＴ－ｑＰＣＲを示す（図２Ａ～Ｂを参照）。トランスフェクションの２４時間後、ｍｉｒＶａｎａ全ＲＮＡ単離キットを製造業者のプロトコルに従って使用して、ＲＮＡを抽出した。結果は、成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐ及びｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５発現レベルに関するｍｉｒ－６７５構築物間の差を示す。Ｈ１．ｍｉｒ－６７５（２３２±３５％、Ｐ＜０．０００２、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した実験）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２（８８２±１０８％、Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈ（７７４±９３％、Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）は、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５と比較したとき、最高レベルのｍｉｒ－６７５－５ｐを生成した。しかしながら、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５（３２０±４３％、Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５ＮＦ（２１３±２８％、Ｐ＜０．００８７、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．３．１（２７４±４９％、Ｐ＜０．０００７、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈ（２５６±３７％、Ｐ＜０．０００８、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）は、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５と比較したとき、最高レベルのｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５を生成した。ｍｉｒ－６７５－５ｐ／ｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５の比を見ると、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２（９１８±１６９％、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１（２０７±３８％、Ｎ＝３）、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈ（３０３±５７％、Ｎ＝３）は、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５と比較したとき、最も高い比率を有した（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）。図９Ｂは、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ合成方法を使用して、全ての成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐ配列を定量化するために使用したｄｄＰＣＲを示す。全ての構築物を、図９ＡのようにＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。結果として、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５ＮＦ（１７６±６０％、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ（１３３±３８％、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２（１８１±３４％、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１（１４２±４５％、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１（２１３±５１％、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．３（１１４±８％、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．３．１（１８７±４０％、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．５（１５３±５２％、Ｎ＝３）、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈ（２０１±３８％、Ｎ＝３）は、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５と比較したとき、より高い倍率変化レベルを示した。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１（Ｐ＜０．０１４、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．３．１（Ｐ＜０．０２４、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈ（Ｐ＜０．００７、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）のみが、統計的に有意に高い倍率変化を有する。 Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、及びＵ６．ｍｉ４０５ＮＦを使用した、ＤＵＸ４タンパク質レベルのウェスタンブロットを示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ及びＵ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、又はＵ６．ｍｉ４０５ＮＦ発現プラスミドと１対３のモル比で共トランスフェクトした。総タンパク質をトランスフェクションの２４時間後に抽出した。 ウェスタンブロットを使用してＵ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈの阻害効率を試験するデータを示す。ＤＵＸ４：ｍｉ４０５を、２対１のモル比で使用した。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ６．ｍｉＧＦＰ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、又はＵ６．ｍｉ４０５Ｈ及びＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ発現プラスミドで２４時間共トランスフェクトした。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、陰性対照（Ｕ６．ｍｉＧＦＰ）でトランスフェクトした試料と比較したとき、ＤＵＸ４タンパク質レベルをそれぞれ８１±９％、８８±２％、及び７９±６％低下させた（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した反復）。３つの試験したｍｉ４０５構築物間で統計的に有意な差は、使用したＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比で測定されなかった。結果は、３回の独立した反復の平均ＤＵＸ４タンパク質レベルパーセント±ＳＥＭとして報告した。 図５Ｃを補完する４回の独立したウェスタンブロット反復を示し、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈが、Ｕ６．ｍｉ４０５と比較して、ＤＵＸ４タンパク質レベルの有意な低下を４０±５％（Ｐ＜０．０２０９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）、７１±５％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）、及び６０±８％（Ｐ＜０．０００９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）で誘導したことを示す。加えて、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆと比較したとき、ＤＵＸ４タンパク質レベルの有意な低下を５２±９％（Ｐ＜０．０００９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）及び３３±１４％（Ｐ＜０．０４９８、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）で誘導した。 図１３Ａ～Ｄは、ｍｉｒ－６７５がＤＵＸ４ ＯＲＦ及び３’ＵＴＲにおける部位を高効率で標的とすることを示した分子ビーコン結合アッセイ（ＭＢＢアッセイ）からの結果を示す。図１３Ａは、ｍｉｒ－６７５－５ｐについて予測される標的部位（ＴＳ）位置を示すＤＵＸ４配列の概略図を提供する。図１３Ｂ（左）は、ＤＵＸ４配列とのｍｉｒ－６７５－５ｐ結合を決定するために使用された蛍光ベースの分子ビーコン結合アッセイを説明する概略図を提供する。非結合では、分子ビーコン（ＭＢ）は、クエンチャー（ｚｅｎＢＨＱ）をフルオロフォア（６ＦＡＭ）に近接させるステムループ構造に折り畳み、それによって６ＦＡＭの蛍光発光を消光する。ｍｉｒ－６７５－５ｐの成熟配列を、ＭＢループ配列に組み込んだ。ＭＢの相補的なＴＳ配列とのハイブリダイゼーションは、フルオロフォアとクエンチャーとを分離させ、蛍光発光を可能にし、次いで、結合の尺度として定量化される。図１３Ｂ（右）は、成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐ分子ビーコンの図１３Ａに示される標的部位との結合を示すグラフを提供する。各データポイントは、３つの別々の実験の平均値±ＳＤを表す。ｍｉｒ－６７５－５ｐは、全長ＤＵＸ４配列内の８つの標的部位（ＴＳ５２７、ＴＳ６４９、ＴＳ６６８、ＴＳ７５４、ＴＳ７８０、ＴＳ１００４、ＴＳ１３４０、及びＴＳ１４７１）に結合することができた。最初の６つのＴＳは、ＤＵＸ４ ＯＲＦ中にあり、残りの２つのＴＳは、３’ＵＴＲ中に認められる。６つの予測されたＴＳは、ｍｉｒ－６７５－５ｐに結合しなかった（ＴＳの位置及び配列について、図１７Ａ－Ｂ及び図１３Ｄを参照されたい）。ＴＳ ｎｅｇ．ｃｔｒｌは、ランダム配列である。図１３Ｃは、各標的部位に対するｍｉｒ－６７５－５ｐ分子ビーコンの結合親和性（Ｋｄ）が、分子ビーコンシグナル（ＭＢＳ）からバックグラウンド蛍光シグナルを減算することによって決定されたことを示し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表される。Ｋｄは、最大蛍光の半分に達するために必要なＴＳ濃度（μＭ）に対応する。ｍｉｒ－６７５－５ｐとそのＴＳとの間の塩基対形成（ＲＮＡハイブリッドアルゴリズムによって予測される）、並びにそれらの対応するＫｄ値も示される。ＲＮＡ「模倣」塩基がｍｉｒ－６７５－５ｐ：ＴＳ対で生成され、「Ｇ」が「Ｔ」に面するときは、「Ｇ」ヌクレオチドを「Ａ」ヌクレオチド（灰色）に置き換えられた。 図１３Ａ～Ｄは、ｍｉｒ－６７５がＤＵＸ４ ＯＲＦ及び３’ＵＴＲにおける部位を高効率で標的とすることを示した分子ビーコン結合アッセイ（ＭＢＢアッセイ）からの結果を示す。図１３Ｄは、５’タグ（６ＦＡＭ色素）及び３’タグ（Ｚｅｎ ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑＴｅｎｃｈｅｒ（ＺｅｎＢＨＱ））を有するｍｉＲＮＡ－５ｐの分子ビーコン、並びにＤＵＸ４標的部位の各々の位置、名称、及び配列を示す。 ｍｉｒ－６７５プロセシングを調べるための、異なるｍｉｒ－６７５構築物でのノーザンブロットを示す。ノーザンブロットを、Ｕ６．ｍｉＧＦＰ（ｇｆｐ ｍＲＮＡを標的とする陰性対照ｍｉＲＮＡ）、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－３ｐ、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐ構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から抽出したＲＮＡで行った。Ｕ６．ｍｉＧＦＰ及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－３ｐ陰性対照構築物は、いかなるバンドも示さなかった。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５構築物は、２１～２５ｍｅｒのサイズを有する低レベルの成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐを生成した。Ｈ１．ｍｉｒ－６７５構築物は、２５ｍｅｒに近いサイズを有する多量レベルの成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐを生成した。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐ構築物はまた、２１ｍｅｒに近いサイズを有する多量レベルの成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐをもたらした。Ｈ１．ｍｉｒ－６７５生成した成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐは、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５生成した成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐよりも、トランスフェクション後２４及び４８時間でそれぞれ１３倍及び２３倍多い存在量だった。Ｈ１．ｍｉｒ－６７５の場合、１．４倍多い成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐが、トランスフェクション後２４時間に対して４８時間で生成された。 ｍｉｒ－６７５が、ＤＵＸ４誘導性筋肉損傷からマウス骨格前脛骨筋（ＴＡ）筋肉を保護することができることを示す。図１５Ａは、示された用量のベクターを用いた筋肉内（ＩＭ）注射の２週間後、ＡＡＶ注射された成体マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）ＴＡ筋肉のＨ＆Ｅ染色、中心核数、及び遺伝子発現（ｄｄＰＣＲ）分析を示す。画像は、Ｈ＆Ｅで染色した１０μｍの凍結切片を高出力（２０×）及び低出力（４×）で示す。低出力画像上の潜在的な病変の幅を視覚化するのを助けるために、中心核（ＣＮ）又は活動的な変性及び炎症の領域を有する線維を、紫色のデジタルオーバーレイを用いて意図的に影で覆った。ＤＵＸ４発現性筋肉は、炎症浸潤を伴う筋線維、中心核、及び可変線維サイズを含む、変性の組織病理学的証拠を示す（左上）。ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ及びｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５ベクター（それぞれ右上）の同時注射は、組織学的に正常である。高出力写真は、ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５及びＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬで同時注射されたＮ＝６ ＴＡ、ＡＡＶ．ｍｉｌａｃＺ及びＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬで同時注射されたｎ＝３ ＴＡ、並びにＡＡＶ．ｍｉｌａｃＺ及びｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５で同時注射されたｎ＝３ ＴＡの示されたベクター投与量での代表的な画像を示す。後者のＴＡ筋肉は組織学的に正常（左下）であり、ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５が筋肉に対して毒性ではないことを示した。スケールバーは、高出力では１００μｍ、低出力画像では５００μｍ。２０×Ｈ＆Ｅ染色したＴＡ筋肉連続切片（１０μｍ）の２０倍の中心核数。ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５処置した筋肉は、ＡＡＶ．ｍｉｌａｃＺ及びＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ（Ｎ＝３）で同時注射されたＴＡ筋肉と比較したとき、中心核を有する８５±１４％（Ｎ＝６、両側独立ｔ検定、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）少ない筋線維を有した。ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５処置及び未処置のＴＡ筋肉におけるＤＵＸ４－ＦＬ発現の液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）。処置したＴＡ筋肉では、ＤＵＸ４－ＦＬレベルは、未処置筋肉と比較したとき、５６±３２％低下した（Ｎ＝６、両側独立ｔ検定、＊、Ｐ＜０．０３８）。ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５処置及び未処置のＴＡ筋肉におけるｍｉｒ－６７５及びＤＵＸ４応答性マウスバイオマーカー（Ｔｒｉｍ３６及びＷｆｄｃ３）のｄｄＰＣＲ。Ｔｒｉｍ３６及びＷｆｄｃ３の発現は、それぞれ９０±３１％（Ｎ＝６、ＡＮＯＶＡ、＊＊＊、Ｐ＜０．０００３）及び５４±２０％（Ｎ＝６、ＡＮＯＶＡ、＊、Ｐ＜０．０３９）低下した。図１５Ｂは、ＤＵＸ４（Ｖ５エピトープ、赤色）又は核（ＤＡＰＩ、青色）について免疫蛍光染色した１０μｍの凍結切片を示す画像を提供する。高出力写真は、ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５及びＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬで同時注射されたＮ＝６ ＴＡ、ＡＡＶ．ｍｉｌａｃＺ及びＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬで同時注射されたＮ＝３ ＴＡの示されたベクター投与量での代表的な画像を示す。ｍｉｒ－６７５が存在しない場合、高レベルのＤＵＸ４タンパク質が検出される。白色矢印は、ＤＵＸ４タンパク質を発現する代表的な線維及び筋核を示す。 ｍｉｒ－６７５－５ｐが、ＤＵＸ４を標的とする成熟ｍｉＲＮＡ鎖であることを示す。図１６Ａは、ｈｓａ－Ｈ１９ｌｎｃＲＮＡ（ＣＭＶ．Ｈ１９）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるｍｉｒ－６７５発現のＱＰＣＲ分析を示す。ｍｉＲ－６７５－５ｐ発現は、ｍｉＲ－６７５－３ｐの発現と関連する。ＱＰＣＲは、ｍｉｒ－６７５－５ｐ及び－３ｐの成熟配列を認識するように設計されたＴａｑｍａｎプローブを使用して行った。ｍｉｒ－６７５－３ｐの発現は、ｍｉｒ－６７５－５ｐの発現よりも２．２０±０．１５倍高かった（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａに対して正規化した。結果は、３回反復の平均相対遺伝子発現±ＳＥＭとして報告した（Ｎ＝３）。図１６Ｂは、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－３ｐ、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐ（グラフの横にあるｍｉｒ－６７５－３ｐ及びｍｉｒ－６７５－５ｐの対応するステムループ構造を参照）、及びＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４－ＦＬ構築物を用いたデュアル－ルシフェラーゼアッセイを示す。ｍｉＲＮＡ（ｐｍｏｌｅ）を、ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４－ＦＬ（ｐｍｏｌｅ）の４０倍で使用した。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－３ｐ構築物を試験したとき、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－３ｐは、陰性対照ｍｉｒ－６７５－５ｐレベルと比較して高レベルのｍｉｒ－６７５－３ｐを発現したにもかかわらず、相対ウミシイタケルシフェラーゼは、その活性の平均９５％（Ｐ＜０．２、ＡＮＯＶＡ）を維持した。一方、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐは、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を平均３３±３％低下させることができた（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）。読み取りは全て、ｍｉｌａｃＺ陰性対照に対して正規化した。結果は、３回反復の平均相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性±ＳＥＭとして報告した（Ｎ＝３）。図１６Ｃは、標的配列（ｍｉｒ－６７５Ｒ）としてｍｉｒ－６７５－５ｐの逆相補的配列を使用したデュアル－ルシフェラーゼアッセイを示す。この配列を、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の下流の３’ＵＴＲとしてクローニングした。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５構築物を、ｍｉｒ－６７５完全標的部位（ＰＴＳ）ｍｉｒ－６７５Ｒに対する標的化効率について、対応する相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性の阻害効率を測定することによって試験した。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５は、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を用量依存的に低下させ、４１±１２％（Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）の最大阻害率に達し、ＣＭＶ．Ｈ１９は、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を４０±６％（Ｐ＜０．００４８、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させた。読み取りは全て、ｍｉｌａｃＺ陰性対照に対して正規化した。結果は、３回反復の平均相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性±ＳＥＭとして報告した。 ＤＵＸ４配列におけるｍｉｒ－６７５結合部位を示す。図１７Ａは、ｍｉｒ－６７５、ｍｉｒ－６７５－５ｐ、及びｍｉｒ－６７５－３ｐのステムループ構造を示す。成熟配列は、赤色で強調表示されている。図１７Ｂは、ＤＵＸ４配列（イントロンを有しないＤＵＸ４ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲ）を示す。検証されたｍｉｒ－６７５－５ｐ結合部位は、赤色で強調表示されている。ここでは、ｍｉｒ－６７５－５ｐ結合部位のみが示されている。 Ｕ６．ｍｉｒ－６７５、ＣＭＶ．ｍｉｒ－６７５、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＣＭＶ．Ｈ１９、及びｍｉｒ－６７５模倣体（成熟二本鎖ｍｉｒ－６７５配列）が、ＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させることを示す。 図１８の反復であり、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐが、ＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させることを示す。しかしながら、図１９はまた、これらのｍｉｒ－６７５構築物が、ｍｉｒ－６７５耐性ＤＵＸ４構築物（ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ：この発現プラスミドはＤＵＸ４変異体配列をコードする）に対して試験したとき、ＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させることができなかったことを示す。この配列は、ＯＲＦに認められるｍｉｒ－６７５標的部位７８０（ＴＳ７８０）で変異し（図１７Ｂを参照）、その３’ＵＴＲを欠失しており、このＤＵＸ４変異体の発現をｍｉｒ－６７５依存性阻害に対して耐性にする）。 ＣＭＶプロモーター下のｍｉｒ－６７５構築物が、ＤＵＸ４発現の約５０％の阻害を誘発したことを示し、ＣＤＳ ｍＲＮＡを発現するために主に使用されるプロモーターからのｍｉｒ－６７５の頑強な発現を示す。図２０は、図１８の反復であり、ブラインド化ウェスタンブロットにおいて、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５、ＣＭＶ．ｍｉｒ－６７５、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＣＭＶ．Ｈ１９、及びｍｉｒ－６７５模倣体がＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させることを示す。図２０はまた、これらのｍｉｒ－６７５構築物が、ｍｉｒ－６７５耐性ＤＵＸ４構築物に対して試験したとき、ＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させることができなかったことを示す。３回の反復したブラインド化ウェスタンブロットを、ｍｉｒ－６７５を発現する様々な構築物及び全長Ｖ５タグ付きＤＵＸ４構築物（ＤＵＸ４－ＦＬ ＷＴ：ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ及びＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ：ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ）で共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのタンパク質抽出物で行った。後者は、同じプラスミド骨格からのｅＧＦＰを共発現する。ｅＧＦＰを、トランスフェクション対照及び定量化目的のための参照遺伝子として使用した。ＤＵＸ４タンパク質レベルは、グラフに示されるように、ｍｉｌａｃＺ試料と比較して定量化した。 図１８の別の反復であり、ブラインド化ウェスタンブロットにおいて、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５、ＣＭＶ．ｍｉｒ－６７５、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐ、及びＣＭＶ．Ｈ１９が、ＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させることを示す。図２１はまた、これらのｍｉｒ－６７５構築物が、ｍｉｒ－６７５耐性ＤＵＸ４構築物に対して試験したとき、ＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させることができなかったことを示す。３回の反復したブラインド化ウェスタンブロットを、ｍｉｒ－６７５を発現する様々な構築物及び全長Ｖ５タグ付きＤＵＸ４構築物（ＤＵＸ４－ＦＬ ＷＴ：ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ及びＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ：ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ）で共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのタンパク質抽出物で行った。後者は、同じプラスミド骨格からのｅＧＦＰを共発現する。ｅＧＦＰを、トランスフェクション対照及び定量化目的のための参照遺伝子として使用した。ＤＵＸ４タンパク質レベルは、グラフに示されるように、ｍｉｌａｃＺ試料と比較して定量化した。 図１８の他の反復を提供し（左及び右パネル（ブロット）を参照）、ブラインド化ウェスタンブロットにおいて、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５及びＣＭＶ．Ｈ１９が、ＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させることを示す。加えて、図２２（右パネル）は、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５、ＣＭＶ．ｍｉｒ－６７５、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＣＭＶ．Ｈ１９、及びｍｉｒ－６７５模倣体が、ＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させることを示す。３回の反復したブラインド化ウェスタンブロットを、ｍｉｒ－６７５を発現する様々な構築物及び全長Ｖ５タグ付きＤＵＸ４構築物（ＤＵＸ４－ＦＬ ＷＴ：ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ及びＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ：ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのタンパク質抽出物で行った（図２０～２２）。後者は、同じプラスミド骨格からのｅＧＦＰを共発現する。ｅＧＦＰを、トランスフェクション対照及び定量化目的のための参照遺伝子として使用した。ＤＵＸ４タンパク質レベルは、グラフに示されるように、ｍｉｌａｃＺ試料と比較して定量化した。図２０では、ＣＭＶプロモーター下のｍｉｒ－６７５構築物を試験し、ＤＵＸ４発現の約５０％阻害を示し、ＣＤＳ ｍＲＮＡを発現するために主に使用されるプロモーターからのｍｉｒ－６７５の頑強な発現を示した。３回の反復したブラインド化ウェスタンブロットを、ｍｉｒ－６７５を発現する様々な構築物及び全長Ｖ５タグ付きＤＵＸ４構築物（ＤＵＸ４－ＦＬ ＷＴ：ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ及びＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ：ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ）で共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からのタンパク質抽出物で行った。後者は、同じプラスミド骨格からのｅＧＦＰを共発現する。ｅＧＦＰを、トランスフェクション対照及び定量化目的のための参照遺伝子として使用した。ＤＵＸ４タンパク質レベルは、グラフに示されるように、ｍｉｌａｃＺ試料と比較して定量化した。 ＤＵＸ４ ｍＲＮＡレベルが、ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ発現プラスミドで共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＨ１．ｍｉｒ－６７５の過剰発現で低下することを示す。図２３Ａは、ＤＵＸ４発現のＱＰＣＲ測定を示す。Ｈ１．ｍｉｒ－６７５構築物を、ＨＥＫ２９３細胞でＤＵＸ４構築物と３対１の比率でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４及び４８時間後にＲＮＡ抽出物を収集した。ｍｉＲＶＡＮＡ単離キットを使用して、全ＲＮＡを調製した。ＤＵＸ４及びｅｇｆｐ（参照遺伝子として使用）ｍＲＮＡレベルは、材料及び方法に記載されるＳＹＢＲグリーンマスターミックスを使用して決定した。全ての値は、ｅｇｆｐに対して正規化し、ｍｉｌａｃＺ処置した試料と比較して報告した。トランスフェクションの２４及び４８時間後、ＤＵＸ４レベルは、それぞれ、平均３７±２％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）及び５１±２％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下した。結果は、３回の反復平均相対ＤＵＸ４発現±ＳＥＭとして報告した。図２３Ｂは、ｍｉｒ－６７５－５ｐ発現の測定を、ＱＰＣＲによるＨＥＫ２９３細胞におけるその過剰発現後に示す。ｍｉｌａｃＺ試料と比較したとき、ｍｉｒ－６７５－５ｐの過剰発現レベルは、約２０００倍高かった（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）。結果は、３回反復の平均相対ｍｉｒ－６７５－５ｐ発現（２－ΔＣｑ）±ＳＥＭとして報告した。 ｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５及びｍｉｒ－６７５－３ｐが、ヒト対照（１５Ｖ）及びＦＳＨＤ罹患（１５Ａ及び１７Ａ）筋芽細胞及び筋管において発現されることを示す。ｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５及びｍｉｒ－６７５－３ｐの発現を、３つの異なるヒト骨格筋由来筋芽細胞株１５Ｖ、１５Ａ及び１７Ａにおいて測定した。ＲＮＡを調製し、ｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５（一次ｍｉｒ－６７５転写物）及びｍｉｒ－６７５－３ｐの遺伝子発現を、筋芽細胞及び４日間分化した（４ＤＤ）筋管において測定した。結果として、ｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５及びｍｉｒ－６７５－３ｐは、１５Ｖ、１５Ａ、及び１７Ａの筋芽細胞及び分化した筋管において様々なレベルで発現された。特に、ｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５及びｍｉｒ－６７５－３ｐの両方のレベルは、全ての試験した細胞株における分化で増加した。より正確には、ｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５の発現は、１５Ｖでは２．３±０．１倍（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、１５Ａでは２．３±０．２倍（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、１７Ａでは３．３±０．４倍（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）増加した。一方、ｍｉｒ－６７５－３ｐ発現は、１５Ｖでは７．７±１．０倍（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、１５Ａでは７．９±０．２倍（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、及び１７Ａでは１．４±０．１倍（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）増加した。結果は、１５Ｖの筋芽細胞における遺伝子発現と比較して、３回反復（Ｎ＝３）の相対遺伝子発現（ΔΔＣｑ）±ＳＥＭとして報告し、各ＱＰＣＲアッセイは、三重測定で行った。全ての結果を、参照遺伝子としてハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａを使用して定量化した。 ｍｉｒ－６７５が、ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＣＤＣ６を標的にすることを示す。ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＣＤＣ６の発現は、各調査した遺伝子に特異的なＴａｑＭａｎプローブを使用して、ＨＥＫ２９３細胞でＱＰＣＲによって測定した。それを行うために、Ｕ６．ｍｉｌａｃＺ（陰性対照）、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－３ｐ、又はＵ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐ発現構築物をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に全ＲＮＡを抽出した。結果として、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－３ｐは、ＳＭＡＤ１レベルを平均３２±６％（Ｐ＜０．０４４、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、ＳＭＡＤ５レベルを平均３５±６％（Ｐ＜０．００１３、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させた。一方、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐは、ＣＤＣ６レベルを、それぞれ、平均３８±４％（Ｐ＜０．００３４、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）及び３６±７％（Ｐ＜０．００４８、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）抑制した。結果は、Ｕ６．ｍｉｌａｃＺでトランスフェクトした細胞における遺伝子発現と比較して、３回反復（Ｎ＝３）の相対遺伝子発現（ΔΔＣｑ）±ＳＥＭとして報告し、各ＱＰＣＲアッセイは、三重測定で行った。全ての結果を、参照遺伝子としてハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａを使用して定量化した。 １５Ｖ Ｃｔｒｌ筋管中のＣｄｃ６タンパク質の検出のための非クロップ化ウェスタンブロットゲルを示す。Ｃｄｃ６は、ｍｉｒ－６７５に対する天然標的である。したがって、この図は、抗ｍｉｒ－６７５アンタゴミルを使用したｍｉｒ－６７５の阻害は、抗ｍｉｒ－６７５を用いた１５Ｖ対照（Ｃｔｒｌ）筋管のトランスフェクションがＣｄｃ６タンパク質の発現の誘導をもたらしたため、機能していることを示す。 抗ｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＤＵＸ４－ＦＬ（ＷＴ）、及びＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ構築物で共トランスフェクトした１５Ａ ＦＳＨＤ筋管からのタンパク質抽出物で行われた３回反復した非クロップ化ウェスタンブロットを示す。この図は、ＤＵＸ４発現プラスミド（ＤＵＸ４－ＦＬ ＷＴ）でトランスフェクトした１５Ａ ＦＳＨＤ筋管における抗ｍｉｒ－６７５－５ｐ（別名、抗ｍｉｒ－６７５）のトランスフェクションが、ＤＵＸ４の誘導された発現をもたらすことを示し、内因的に発現されたｍｉｒ－６７５が、ＤＵＸ４の発現を阻害することができることを示す。筋管を分化の４日後に収集した。反復１及び２では、アルファ－チューブリンを参照遺伝子として使用し、アルファ－チューブリンウサギポリクローナル抗体（５％ミルクＴＢＳＴ緩衝液中に１：５００、ａｂ１５２４６、Ａｂｃａｍ）を使用して検出した。ＤＵＸ４タンパク質を、抗Ｖ５抗体（５％ミルクＴＢＳＴ緩衝液中に１：５，０００で使用したＨＲＰ結合マウスモノクローナル抗体）を使用して検出した。反復３では、１５Ａ筋芽細胞を、ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ又はＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓプラスミドでトランスフェクトし、両方ともｅＧＦＰを共発現する。後者を、トランスフェクション対照及び定量目的のための参照遺伝子として使用した。この反復ウェスタンブロットでは、ＤＵＸ４タンパク質も、抗Ｖ５抗体を使用して検出された。 β－エストラジオール、β－エストラジオール＋酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）、又はメラトニンが、対照、すなわち、１００％エタノール処理したＤＵＸ４トランスフェクト細胞と比較したとき、ｍｉｒ－６７５レベルを有意に増加させたことを示す。β－エストラジオール、ＭＰＡ、及びメラトニンは、ＨＥＫ２９３細胞におけるｍｉｒ－６７５の発現を増加させ、ＤＵＸ４及びＤＵＸ４誘導バイオマーカーＴＲＩＭ４３の発現を減少させた。液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を実行して、ｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＤＵＸ４、及びＴＲＩＭ４３レベルを測定した。ＨＥＫ２９３細胞をＤＵＸ４でトランスフェクトし、トランスフェクション時に、２つの薬物（すなわち、β－エストラジオール及びメラトニン）で個別に、又はβ－エストラジオール及びＭＰＡの組み合わせで、１０、２０、若しくは４０μＭで処置した。これらの薬物の効果を、エタノール（ビヒクル）処置細胞との比較によって評価した。数は、ｎ＝３の独立した実験に対応する（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）。β－エストラジオール、β－エストラジオール＋ＭＰＡ、又はメラトニンで処理したＨＥＫ２９３細胞からの遺伝子発現の定量化（変化パーセント）を、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して測定し、本明細書に提供される表３に報告される。 １５Ａ（図２９Ａ）、１７Ａ（図２９Ｂ）、及び１８Ａ（図２９Ｃ）のＦＳＨＤ分化筋細胞株（筋管）における内因性ｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＤＵＸ４、及びＴＲＩＭ４３の発現に対する、３つの治療レジメンである、β－エストラジオール、β－エストラジオール＋ＭＰＡ、又はメラトニンの効果を示す。これらのＦＳＨＤ細胞株は、それらが低（１５Ａ）、中（１８Ａ）、及び高（１７Ａ）ＤＵＸ４発現を示すために選択された［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２１：４４１９－３０（２０１２）］。β－エストラジオール、β－エストラジオール＋ＭＰＡ、及びメラトニンの各々は、ｍｉｒ－６７５発現を増加させ、３つのＦＳＨＤ罹患筋管株におけるＤＵＸ４及びＤＵＸ４誘導バイオマーカーＴＲＩＭ４３の発現を低下させた。全ての処置を、エタノール（ビヒクル）処置対照細胞と比較した（１５Ａについてｎ＝６の独立した実験、並びに１７Ａ、及び１８ＡについてＮ＝３の独立した実験。＊、Ｐ＜０．０５。＊＊、Ｐ＜０．０１。＊＊＊、Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。５日間分化した１５Ａ、１７Ａ、及び１８Ａ筋管における遺伝子発現（ｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＤＵＸ４、及びＴＲＩＭ４３）の定量化は、本明細書で表４に報告される。 内因性ｍｉｒ－６７５が、対照の非罹患分化筋細胞株（１５Ｖ筋細胞株の筋管）におけるＣＤＣ６遺伝子発現を標的とし、１５Ａ ＦＳＨＤ罹患ヒト筋管におけるＤＵＸ４誘導性毒性を防止することを示す。ＣＤＣ６遺伝子発現の標的化は、特異的な抗ｍｉｒ－６７５アンタゴミルを使用することによって、及び４日間分化した１５Ｖ対照筋管におけるＣｄｃ６タンパク質レベルを測定することによって試験した。Ｃｄｃ６は、抗ｍｉｒ－６７５でトランスフェクトした筋管でのみ検出された（非クロップ化ゲルについて図２６も参照）。ハウスキーピングタンパク質α－チューブリンを参照として使用した。 ｍｉｒ－６７５がＤＵＸ４ ＯＲＦ及び３’ＵＴＲにおける部位を高効率で標的とすることを示した分子ビーコン結合アッセイ（ＭＢＢアッセイ）からの結果を示す（及び図１３Ａ～Ｃの更新を提供する）。図３１Ａは、ｍｉｒ－６７５－５ｐについて予測される標的部位（ＴＳ）位置を示すＤＵＸ４配列の概略図を提供する。図３１Ｂ（左パネル）は、ＤＵＸ４配列とのｍｉｒ－６７５－５ｐ結合を決定するために使用された蛍光ベースの分子ビーコン結合アッセイを説明する概略図を提供する。非結合では、分子ビーコン（ＭＢ）は、クエンチャー（ｚｅｎＢＨＱ）をフルオロフォア（６ＦＡＭ）に近接させるステムループ構造に折り畳み、それによって６ＦＡＭの蛍光発光を消光する。ｍｉｒ－６７５－５ｐの成熟配列を、ＭＢループ配列に組み込んだ。ＭＢの相補的なＴＳ配列とのハイブリダイゼーションは、フルオロフォアとクエンチャーとを分離させ、蛍光発光を可能にし、次いで、結合の尺度として定量化した。図３１Ｂ（右パネル）は、成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐ分子ビーコンの図３１Ａに示される標的部位との結合を示すグラフを提供する。各データポイントは、３つの別々の実験の平均値±ＳＤを表す。ｍｉｒ－６７５－５ｐは、全長ＤＵＸ４配列内の８つの標的部位（ＴＳ５２７、ＴＳ６４９、ＴＳ６６８、ＴＳ７５４、ＴＳ７８０、ＴＳ１００４、ＴＳ１３４０、及びＴＳ１４７１）に結合することができた。最初の６つのＴＳは、ＤＵＸ４ ＯＲＦ中にあり、残りの２つのＴＳは、３’ＵＴＲ中に認められる。６つの予測されたＴＳは、ｍｉｒ－６７５－５ｐに結合しなかった（ＴＳの位置及び配列について、図１７Ａ～Ｂ及び図１３Ｄを参照されたい、図１３Ｄは、５’タグ（６ＦＡＭ色素）及び３’タグ（Ｚｅｎ ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑＴｅｎｃｈｅｒ（ＺｅｎＢＨＱ））を有するｍｉＲＮＡ－５ｐの分子ビーコン、並びにＤＵＸ４標的部位の各々の位置、名称、及び配列を示す）。ＴＳ ｎｅｇ．ｃｔｒｌは、ランダム配列である。図３１Ｃは、各標的部位に対するｍｉｒ－６７５－５ｐ分子ビーコンの結合親和性（Ｋｄ）が、分子ビーコンシグナル（ＭＢＳ）からバックグラウンド蛍光シグナルを減算することによって決定されたことを示し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表される。Ｋｄは、最大蛍光の半分に達するために必要なＴＳ濃度（μＭ）に対応する。ｍｉｒ－６７５－５ｐとそのＴＳとの間の塩基対形成（ＲＮＡハイブリッドアルゴリズムによって予測される）、並びにそれらの対応するＫｄ値も示される。ＲＮＡ「模倣」塩基がｍｉｒ－６７５－５ｐ：ＴＳ対で生成され、「Ｇ」が「Ｔ」に面するときは、「Ｇ」ヌクレオチドを「Ａ」ヌクレオチド（灰色）に置き換えられた。 ｍｉｒ－６７５が、ＤＵＸ４誘導性筋肉損傷からマウス骨格前脛骨（ＴＡ）筋肉を保護することができることを示す（及び図１５Ａ～Ｂの更新を提供する）。図３２Ａは、示された用量のベクターを用いた筋肉内（ＩＭ）注射の２週間後、ＡＡＶ注射された成体マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）ＴＡ筋肉のＨ＆Ｅ染色、中心核数、及び遺伝子発現（ｄｄＰＣＲ）分析を示す。画像は、Ｈ＆Ｅで染色した１０μｍの凍結切片を高出力（２０×）及び低出力（４×）で示す。低出力画像上の潜在的な病変の幅を視覚化するのを助けるために、中心核（ＣＮ）又は活動的な変性及び炎症の領域を有する線維を、紫色のデジタルオーバーレイを用いて意図的に影で覆った。ＤＵＸ４発現性筋肉は、炎症浸潤を伴う筋線維、中心核、及び可変線維サイズを含む、変性の組織病理学的証拠を示す（左上）。ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ及びｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５ベクター（それぞれ右上）の同時注射後、筋肉は組織学的に正常だった。高出力写真は、ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５及びＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬで同時注射されたＮ＝８ ＴＡ、陰性対照ＡＡＶ（ＡＡＶ．ｍｉｌａｃＺ又はＡＡＶ．ｅＧＦＰ）及びＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬで同時注射されたＮ＝５ ＴＡ、並びにＡＡＶ．ｍｉｌａｃＺ及びｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５で同時注射されたＮ＝３ ＴＡの指示されたベクター投与量での代表的な画像を示す。後者のＴＡ筋肉は組織学的に正常（左下）であり、ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５が筋肉に対して毒性ではないことを示した。スケールバーは、高出力では１００μｍ、低出力画像では５００μｍ。２０×Ｈ＆Ｅ染色したＴＡ筋肉連続切片（１０μｍ）の２０倍の中心核数。ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５処置した筋肉は、陰性対照ＡＡＶ及びＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ（Ｎ＝５）で同時注射されたＴＡ筋と比較したとき、中心核を有する８１±６％（Ｎ＝８、両側独立ｔ検定、＊＊＊、Ｐ＝０．０００４）少ない筋線維を有した。ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５処置及び未処置のＴＡ筋肉におけるＤＵＸ４－ＦＬ発現の液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）。処置したＴＡ筋肉では、ＤＵＸ４－ＦＬレベルは、未処置筋肉と比較したとき、５６±１２％低下した（Ｎ＝８、両側独立ｔ検定、＊、Ｐ＝０．０１）。ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５処置及び未処置のＴＡ筋肉におけるｍｉｒ－６７５及びＤＵＸ４応答性マウスバイオマーカー（Ｔｒｉｍ３６及びＷｆｄｃ３）のｄｄＰＣＲ。Ｔｒｉｍ３６及びＷｆｄｃ３の発現は、それぞれ８８±４％（Ｎ＝８、ＡＮＯＶＡ、＊＊＊、Ｐ＝０．０００４）及び５７±１３％（Ｎ＝８、ＡＮＯＶＡ、＊、Ｐ＜０．０１１）低下した。図３２Ａ、右中央、陰性対照ＡＡＶ及びＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ又はＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ及びｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５で同時注射したＴＡ筋肉から収集したタンパク質でのウェスタンブロット。抗Ｖ５エピトープ抗体を使用して、Ｖ５タグ付きＤＵＸ４を検出した。アルファ－チューブリン（α－チューブリン）を負荷対照として使用した。図３２Ｂは、ＤＵＸ４（Ｖ５エピトープ、赤色）又は核（ＤＡＰＩ、青色）について免疫蛍光染色した１０μｍの凍結切片を示す画像を提供する。高出力写真は、ｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５及びＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬで同時注射されたＮ＝８ ＴＡ、陰性対照ＡＡＶ及びＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬで同時注射されたＮ＝５ ＴＡの示されたベクター投与量での代表的な画像を示す。ｍｉｒ－６７５が存在しない場合、高レベルのＤＵＸ４タンパク質が検出された。白色矢印は、代表的なＤＵＸ４タンパク質を発現する線維及び筋核を示す。これらのデータは、ｍｉｒ－６７５による標的会合が、ＡＡＶ．ｍｉｒ－６７５及びＡＡＶ．ＤＵＸ４で同時注射されたＴＡ骨格筋におけるＤＵＸ４タンパク質レベルを低下させたことを示す。 抗ｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＤＵＸ４－ＦＬ（ＷＴ）、及びＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ構築物で共トランスフェクトした１５Ａ ＦＳＨＤ筋管からのタンパク質抽出物で行われた３回反復した非クロップ化ウェスタンブロットを示す（及び図２７の更新を提供する）。筋芽細胞を、トランスフェクションの２４及び４８時間後に収集した。次いで、筋管を、分化の４日後（トランスフェクションの５日後）に収集した。アルファ－チューブリンを反復１及び２の参照遺伝子として使用した。ＤＵＸ４タンパク質を、抗Ｖ５抗体（５％ミルクＴＢＳＴ緩衝液中に１：５，０００で使用したＨＲＰ結合マウスモノクローナル抗体）を使用して検出した。反復３では、１５Ａ筋芽細胞を、ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ又はＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｍｉＲ－６７５Ｒｅｓプラスミドでトランスフェクトした（両方とも同じプラスミドからｅＧＦＰを共発現する）。定量化のために、ｅＧＦＰをトランスフェクション対照及び参照遺伝子として使用した。この反復したウェスタンブロットでは、ＤＵＸ４タンパク質も、抗Ｖ５抗体を使用して検出した。β－アクチンを、内因的に発現されたタンパク質参照として使用した。β－アクチンを、抗マウスモノクローナル抗体（５％ミルクＴＢＳＴ緩衝液中に１：１０００、ＳＩＧＭＡ）を使用して検出した。グラフは、全ての試験した条件におけるＤＵＸ４タンパク質レベルの定量化を示す。ソースデータは、ソースデータファイルとして提供される。この図は、ＤＵＸ４発現プラスミド（ＤＵＸ４－ＦＬ ＷＴ）でトランスフェクトした１５Ａ ＦＳＨＤ筋管における抗ｍｉｒ－６７５－５ｐ（別名、抗ｍｉｒ－６７５）のトランスフェクションが、ＤＵＸ４の誘導された発現をもたらすことを示し、内因的に発現されたｍｉｒ－６７５が、ＤＵＸ４の発現を阻害することができることを示す。 ５×１０９ＤＲＰのＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ又はＡＡＶ．Ｕ６．ｍｉ４０５又はＡＡＶ．Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ又はＡＡＶ．Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ又はＡＡＶ．Ｕ６．ｍｉ４０５Ｈのいずれかで８週間注射したＣ５７ＢＬ／６ ＴＡ筋肉から収集した１０μｍの筋肉切片のＨ＆Ｅ染色を示す。この図はまた、５×１０９ＤＲＰのＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ及び５×１０９ＤＲＰの４つのｍｉ４０５構築物（すなわち、ＡＡＶ．Ｕ６．ｍｉ４０５又はＡＡＶ．Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ又はＡＡＶ．Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ又はＡＡＶ．Ｕ６．ｍｉ４０５Ｈ）の各々で８週間同時注射したＴＡ筋肉からの筋肉切片を示す。これらのデータは、低用量では、ｍｉ４０５Ｇ及びｍｉ４０５Ｈが、単核細胞浸潤及び中心核を有する筋線維を特徴とするＤＵＸ４誘導性筋毒性を排除することにおいて、ｍｉ４０５よりも効率的であることを示す。 分化の４日目に増加する濃度のピラジンアミド又はソラフェニブで処置した１８Ａ ＦＳＨＤ罹患筋管からのＤＵＸ４、ＴＲＩＭ４３、及びＺＳＣＡＮ４におけるｄｄＰＣＲ遺伝子発現データを示す。遺伝子発現は、参照遺伝子ＲＰＬ１３Ａのコピーに対する各遺伝子のコピーとして示される。これらのデータは、ピラジンアミド又はソラフェニブの濃度が増加するにつれて、ＤＵＸ４及びＤＵＸ４応答性バイオマーカー、例えば、ＴＲＩＭ４３及びＺＳＣＡＮ４の濃度が、１８Ａ ＦＳＨＤ罹患筋管において減少したことを示す。
本開示は、筋肉中の二重ホメオボックスタンパク質４（ＤＵＸ４）の発現が、がん及び顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を含むがこれらに限定されない筋ジストロフィーを引き起こすことが知られているため、ＤＵＸ４タンパク質産生を抑制又は阻害することによって転写後のＤＵＸ４遺伝子発現を果たす新規戦略を提供する。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の生成物及び方法は、肉腫及びＦＳＨＤを含むがこれらに限定されない、がん及び筋ジストロフィーを治療、改善、進行の遅延、及び／又は予防する際に使用される。
ＤＵＸ４遺伝子は、約４５ｋＤＡのタンパク質をコードする（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＵＢＸ２（ＤＵＸ４＿ＨＵＭＡＮ）を参照）。ＤＵＸ４遺伝子の脱抑制は、ＦＳＨＤの疾患発症に関与する。脱抑圧は、２つの既知の機構：Ｄ４Ｚ４反復収縮、又はクロマチン変更遺伝子であるＳＭＣＨＤ１若しくはＤＮＭＴ３Ｂにおける変異、を通して発生し得る。前者では、非罹患対象では、Ｄ４Ｚ４配列は１１～１００反復で構成されるが、ＦＳＨＤ１患者では、配列は１～１０反復に減少する（Ｍｏｓｔａｃｃｉｕｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｊｕｎ；７５（６）：５５０－５（２００９）；ＰｕｂＭｅｄ：１９３２０６５６）。いずれの状態も、染色体４ｑ３５でＤＮＡ低メチル化を引き起こし得、それによって、ＤＵＸ４発現を許す染色体環境を生じる。
ＤＵＸ４は、体細胞組織においてエピジェネティックに抑制されるＤ４Ｚ４マクロサテライトに位置する。ＦＳＨＤ１におけるＤ４Ｚ４クロマチン弛緩は、ＤＵＸ４の非効率的なエピジェネティック抑制及び骨格筋核のサブセットにおけるＤＵＸ４タンパク質発現の多様化パターンをもたらす。骨格筋におけるＤＵＸ４の異所性発現は、幹細胞及び生殖細胞遺伝子の発現を活性化し、体細胞で過剰発現すると、ＤＵＸ４は最終的に細胞死をもたらし得る。
各Ｄ４Ｚ４反復単位は、２つのホメオボックスをコードするオープンリーディングフレーム（ＤＵＸ４と名付けられた）を有し、反復配列及びＯＲＦは他の哺乳動物で保存されている。コードされたタンパク質は、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ１２、ＴＲＩＭ４３、及びＭＢＤ３Ｌ２を含むＦＳＨＤ疾患バイオマーカーであると考えられるいくつかを含む、多くの遺伝子の転写活性化因子として機能することが報告されている（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１４ Ｏｃｔ１５；２３（２０）：５３４２－５２；ＰＭＩＤ：２４８６１５５１）。マクロサテライト反復の収縮は、常染色体優性ＦＳＨＤを引き起こす。代替的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。
いくつかの態様において、ヒトＤＵＸ４をコードする核酸は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列で示される。いくつかの態様において、ヒトＤＵＸ４のアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列で示される。様々な態様において、本開示の方法はまた、配列番号１に示されるヌクレオチド配列のアイソフォーム及びバリアントも標的とする。いくつかの態様において、バリアントは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を含む。いくつかの態様において、本開示の方法は、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸のアイソフォーム及びバリアントを標的とする。いくつかの態様において、バリアントは、配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を含む。
現在、ＦＳＨＤのための治療はなく、筋ジストロフィーの中でのその相対的多数にもかかわらず、ＦＳＨＤ標的化翻訳の試験はほとんど公表されてきていない。いくつかのＦＳＨＤ候補遺伝子が特定されているが、最近の多くの試験は、ＦＳＨＤ発症の主な寄与因子が、転写因子をコードするアポトーシス促進性ＤＵＸ４遺伝子であることを裏付けている。したがって、最も簡単に言うと、ＤＵＸ４過剰発現は、ＦＳＨＤの根底にある主要な病原性損傷である［Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２４：１４０５－１４１１、Ａｎｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｇｅｎｅｓ ８（３）：９３、Ｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １２（５３６）、Ｈｉｍｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２４：５２７－５３５、ＤｅＳｉｍｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｓｃｉ Ａｄｖ ５：１２、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１７：１６５０９－１６５１５、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１８），上記、Ｒｏｊａｓ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．３７４（３）：４８９－４９８］。
本開示は、ＤＵＸ４を標的として、ＤＵＸ４の発現を阻害する、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を提供する。本開示は、プロモーター配列を更に含む、ＤＵＸ４の発現を含み、阻害する、ＤＵＸ４を標的とするマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を提供する。本開示は、ｍｉＲＮＡによって標的化されるＲＮＡ配列を含む核酸を提供する。本開示は、ｍｉＲＮＡ配列が標的化するように設計されるＤＵＸ４配列を提供する。本開示は、本明細書に記載の様々なヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる様々な核酸を含む。いくつかの態様において、核酸は、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、本質的にヌクレオチド配列からなる。いくつかの態様において、核酸は、ヌクレオチド配列からなる。
本明細書に記載のＤＵＸ４のｍｉＲＮＡ標的化に使用される例示的なヌクレオチド配列には、以下の表１に特定されるものが含まれるが、これらに限定されない。
例示的なヌクレオチド配列が、上記の表１に示される。様々な配列は、異なるプロモーター及び／又は異なる隣接配列を有する。いくつかの例において、ｍｉＲＮＡは、ＤＵＸ４に１つの結合部位を有する。他の例において、ｍｉＲＮＡは、ＤＵＸ４上に複数の結合部位を有する。例えば、マイクロＲＮＡ６７５（ｍｉＲ－６７５）は、結合部位、すなわち、ＤＵＸ４標的配列に対して１００％の相補性を有しないため、その標的遺伝子上の複数の結合部位に結合する天然のマイクロＲＮＡである。
いくつかの態様において、本開示の核酸は、配列番号１～１２４のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本開示の核酸は、配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、本開示は、ＤＵＸ４発現を下方制御するか又は阻害するためのＲＮＡ干渉の使用を含む。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、真核細胞における遺伝子調節のメカニズムであり、様々な疾患の治療のために考慮されている。ＲＮＡｉは、ｍｉＲＮＡによって媒介される遺伝子発現の転写後制御を指す。ｍｉＲＮＡは、同族メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列標的部位と配列相同性を共有し、それと塩基対形成する、小さい（２１～２５ヌクレオチド）、非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相互作用は、ｍＲＮＡ崩壊を誘導する、かつ／又はタンパク質へのｍＲＮＡ翻訳を妨げる細胞遺伝子サイレンシング機構を導く。
天然のＲＮＡｉ経路の理解が進むにつれて、研究者は、疾患を治療するために、標的遺伝子の発現の調節に使用するための人工ｓｈＲＮＡ及びｓｎＲＮＡを設計してきている。いくつかのクラスの小分子ＲＮＡは、哺乳類細胞でＲＮＡｉプロセスを誘発することが知られており、これには、短（又は小）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、並びに短（又は小）ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれ、類似のクラスのベクター発現トリガーを構成する［Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１２：３２９－４０，２０１１；Ｈａｒｐｅｒ，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６６：９３３－８，２００９］。ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、プラスミド又はウイルスベースのベクターからインビトロで発現され、そのため、ベクターが標的細胞核内に存在し、駆動プロモーターが活性である限り、単回投与で長期の遺伝子サイレンシングを達成し得る（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９２：１４５－７３，２００５）。重要なことに、このベクター発現アプローチは、筋肉遺伝子療法の分野で既に数十年にわたって行われてきた進歩を活用しているが、タンパク質をコードする遺伝子を発現させる代わりに、ＲＮＡｉ療法戦略におけるベクターカーゴは、目的の疾患遺伝子を標的化する人工ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡカセットである。この戦略は、天然のｍｉＲＮＡを発現させるために使用される。マイクロＲＮＡ６７５は、それ自体の構造を有する。本明細書に記載の他の各ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ配列及び構造に基づいている。天然のｍｉｒ－３０ａ成熟配列は、標的遺伝子に由来する独自のセンス及びアンチセンス配列によって置き換えられる。
いくつかの実施形態では、本開示の生成物及び方法は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現を調節する上で重要な役割を果たす非コードＲＮＡのクラスである。大多数のｍｉＲＮＡは、ＤＮＡ配列から一次ｍｉＲＮＡに転写され、前駆ｍｉＲＮＡへと処理され、最終的に成熟ｍｉＲＮＡになる。ほとんどの場合、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と相互作用して、ｍＲＮＡの分解及び翻訳抑制を誘導する。しかしながら、５’ＵＴＲ、コード配列、及び遺伝子プロモーターを含む他の領域とのｍｉＲＮＡの相互作用も報告されている。特定の条件下で、ｍｉＲＮＡはまた、翻訳を活性化するか、又は転写を調節することができる。ｍｉＲＮＡとそれらの標的遺伝子との相互作用は、動的であり、ｍｉＲＮＡの細胞内位置、ｍｉＲＮＡ及び標的ｍＲＮＡの存在量、並びにｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ相互作用の親和性などの多くの要因に依存する。
現在までのほとんどの試験は、ｍｉＲＮＡが、それらの標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲで特異的配列に結合して、翻訳抑制並びにｍＲＮＡ脱アデニル化及び脱キャッピングを誘導することを示している。ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’ＵＴＲ及びコード配列を含む他のｍＲＮＡ領域、並びにプロモーター領域内でも検出されている。５’ＵＴＲ及びコード領域とのｍｉＲＮＡの結合は、遺伝子発現に対してサイレンシング効果を有しているが、プロモーター領域とのｍｉＲＮＡ相互作用は、転写を誘導することが報告されている。
様々な態様において、Ｕ６及びＨ１などのポリメラーゼＩＩプロモーター及びポリメラーゼＩＩＩプロモーターが使用される。いくつかの態様において、Ｕ６ ｍｉＲＮＡが使用される。いくつかの態様において、Ｈ１ ｍｉＲＮＡが使用される。そのため、いくつかの態様において、Ｕ６ ｍｉＲＮＡ又はＨ１ ｍｉＲＮＡは、ＤＵＸ４遺伝子発現を更に阻害するか、ノックダウンするか、又はそれに干渉するために使用される。従来の小／短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列は、通常、Ｕ６などのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを含むベクターから細胞核内で転写される。内因性Ｕ６プロモーターは、通常、スプライシングに関与する小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）であるＵ６ＲＮＡの発現を制御し、十分に特徴付けられている［Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３２２（６０７４）：７３－７（１９８６）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２（２）：１９６－２０４（１９８８）、Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００）］。いくつかの態様において、Ｕ６又はＨ１プロモーターは、哺乳類細胞におけるｓｈＲＮＡ分子のベクターベースの発現を制御するために使用され［Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９（３）：１４４３－８（２００２）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（５）：５０５－８（２００２）、Ｍｅｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：５８０－９４（１９９９）］、それは、（１）プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌｙＩＩＩ）によって認識され、ｓｈＲＮＡの高レベルな構成的発現を制御し、（２）Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが、高収率のｓｈＲＮＡを合成するＲＮＡポリメラーゼＩＩよりも大きな能力を有し［Ｂｏｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：１１５４－８（２００４）、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓ．２：２２０－３１（２００５）］、（３）Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターが、扱い易いコンパクトな配列及び単純なターミネーターと一貫しており［Ｍｅｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）同上］、かつ（２）プロモーターが、ほとんどの哺乳類細胞型において活性であるためである。いくつかの態様において、プロモーターは、ｓｈＲＮＡの発現を制御するために必要な全てのエレメントが転写開始部位の上流に位置する、ＩＩＩ型Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである［Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（６）：１２８３－９８（２０００）］。本開示は、マウス及びヒトの両方のＵ６プロモーターを含む。ループによって接続された標的遺伝子からのセンス及びアンチセンス配列を含むｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、そこでＤｉｃｅｒが、それを小／短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に処理する。
本開示は、本明細書に記載の核酸のうちのいずれかを、希釈剤、賦形剤、又は緩衝剤と組み合わせて含む、組成物を含む。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸のうちのいずれかを含むベクターを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の核酸のうちのいずれかを含むベクターを含む。そのため、本開示の実施形態は、ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルス、例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、若しくは偽型ウイルス、及び／又は外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、若しくは小分子を含有するウイルスなどのウイルスベクター）を利用して、本明細書に開示の核酸を送達する。
いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、一本鎖ＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶである。
したがって、いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１（すなわち、ＡＡＶ１逆末端反復（ＩＴＲ）及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ２（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ２カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ３（すなわち、ＡＡＶ３ ＩＴＲ及びＡＡＶ３カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ４（すなわち、ＡＡＶ４ ＩＴＲ及びＡＡＶ４カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ５（すなわち、ＡＡＶ５ ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ６（すなわち、ＡＡＶ６ ＩＴＲ及びＡＡＶ６カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ７（すなわち、ＡＡＶ７ ＩＴＲ及びＡＡＶ７カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ８（すなわち、ＡＡＶ８ ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ９（すなわち、ＡＡＶ９ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ７４（すなわち、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．８（すなわち、ＡＡＶｒｈ．８ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．１０（すなわち、ＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ１１（すなわち、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ及びＡＡＶ１１カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ１２（すなわち、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ及びＡＡＶ１２カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ１３（すなわち、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ及びＡＡＶ１３カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、又はＡＡＶ－Ｂ１などのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
いくつかの態様において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を利用して、ｍｉＲＮＡをコードする核酸を送達する。ＡＡＶは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチド逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む長さが約４．７ｋｂである。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されている。ＡＡＶ２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）で提供され、ＡＡＶ３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９で提供され、ＡＡＶ４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００ １８２９で提供され、ＡＡＶ５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供されて、ＡＡＶ７及びＡＡＶ８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され（ＡＡＶ８に関連する米国特許第７，２８２，１９９号及び同第７，７９０，４４９号も参照）、ＡＡＶ９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されている。ＡＡＶ１０のゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されている。ＡＡＶ１１のゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶ１２のゲノムは、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００８ Ｆｅｂ；８２（３）：１３９９－４０６に提供されている。ＡＡＶ１３のゲノムは、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００８；８２：８９１１に提供されている。ウイルスのＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体への組み込みを誘導するシス作用性配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置にちなんでｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられている）は、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部のオープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と共役した、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を保有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２））でレビューされている。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は、非細胞傷害性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を与える。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞及び非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）として本質的にそれらの細胞の生涯にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成、及び組み込みを誘導するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれているため、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部又は全てを、外来ＤＮＡで置き換えることができる。いくつかの態様において、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供される。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性ではない。
いくつかの実施形態において、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む、本開示のＤＮＡプラスミドが提供される。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染が許容される細胞に導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能を細胞に提供するｒＡＡＶ粒子を生成する技術は、当該技術分野において標準である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来することができる任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、及びＡＡＶ－Ｂ１を含むが、これらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来することができる、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、及びＡＡＶ－Ｂ１を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型からである。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも、本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）］。上述のとおり、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。同族成分の使用が具体的に企図される。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている（その全体が参照により本明細書に援用される）。
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのＤＵＸ４標的化ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、ＤＵＸ４を標的とする他のポリヌクレオチド構築物とともに投与される。様々な態様において、ｍｉＲＮＡは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＣＫ８プロモーター、ミニＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンプロモーターなどのプロモーターを含むが、これらに限定されない様々なプロモーター下で発現され、ｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来することができる、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、及びＡＡＶ－Ｂ１を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型からであり得る。上記に示されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。
本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）の感染が許容される細胞に導入される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能を細胞に提供するｒＡＡＶ粒子を生成する技術は、当該技術分野において標準である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来することができる任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、又はＡＡＶ－Ｂ１を含むがこれらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来することができる、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、又はＡＡＶ－Ｂ１を含むがこれらに限定されない、任意のＡＡＶ血清型からである。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも、本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）］。上述のとおり、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。同族成分の使用が具体的に企図される。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている（その全体が参照により本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態において、パッケージング細胞が提供される。パッケージング細胞は、ＡＡＶ粒子産生に必要な全ての構成要素を安定して発現する細胞株を有するために作製される。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を除去することによって作製される。これらは、治療用遺伝子によって置き換えられる。ベクター粒子を産生するためには、パッケージング細胞が不可欠である。パッケージング細胞株は、カプシド産生及びベクターのビリオン成熟に必要な全てのウイルスタンパク質を提供する。そのため、パッケージング細胞株は、それらがｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含有するように作製される。レトロウイルスＤＮＡベクターに所望の遺伝子を挿入し、適切なパッケージング細胞株を維持した後、レトロウイルスベクターを調製することは、今や簡単なことである。
例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びに選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）を含む、プラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング［Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１］、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加［Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３］、又は直接的な平滑末端ライゲーション［Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６］などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の核酸のうちのいずれか又はベクターのうちのいずれかを、希釈剤、賦形剤、又は緩衝剤と組み合わせて含む、組成物を含む。
したがって、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子産生に必要な全ての構成要素を安定して発現する細胞株を生じるパッケージング細胞を作製する方法が提供される。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びに選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）を含む、プラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング［Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１］、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。
ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９）にレビューされている。様々なアプローチが以下に記載されている：Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第Ｎｏ．５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４－１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、米国特許第６，２５８，５９５号、及びＭｃＣａｒｔｙ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６（１０）：１６４８－１６５６（２００８）］。前述の文書は、それらの全体が参照により本明細書に援用され、特に、ｒＡＡＶ産生に関する文書のセクションに重点を置く。様々なタイプのｒＡＡＶの産生及び使用が具体的に企図され、例示される。そのため、組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）が本明細書に提供される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いており、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ ｒｅｐ又はｃａｐ ＤＮＡが存在しない。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、組換え直鎖ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）、又は組換え自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。
そのため、本開示は、いくつかの実施形態において、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３株）などの、安定して形質転換されたがん細胞である。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代数の２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配によって精製される。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるような、核酸又はベクター、例えばウイルスベクターなどを含む組成物又は複数の組成物を提供する。そのため、本明細書に記載の送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を含む組成物が提供される。様々な態様において、かかる組成物はまた、薬学的に許容される担体を含む。一般に、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、全ての水性及び非水性溶液、無菌溶液、溶媒、緩衝液、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、懸濁液、油／水エマルションなどのエマルション、様々なタイプの湿潤剤、リポソーム、分散媒体、及びコーティングを意味し、これらは、薬学的投与、特に非経口投与に適合する。医薬組成物におけるかかる媒体及び薬剤の使用は当該技術分野で周知であり、かかる担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。
本発明はまた、ＤＵＸ４の発現若しくは過剰発現に関連する筋ジストロフィー又はがんの治療においてＤＵＸ４を下方制御するための様々な小分子化合物及びかかる小分子化合物を含む組成物を提供する。以前の試験によって、ｍｉｒ－６７５は、メラトニン、及びエストロゲン単独で、又はプロゲステロンとの併用で誘導されたことが示された［Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｐｉｎｅａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：８２－９５（２０１６）、Ｇａｕｂｅ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７：１１（２００７）、Ｈａｎｉｆｉ－Ｍｏｇｈａｄｄａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８５：４７１－４８０（２００７）］。エストロゲン又はその誘導体β－エストラジオールは、以前にＦＳＨＤの病因と関連付けられていたが、ＦＳＨＤにおけるエストロゲンの役割は決定的ではない。いくつかの以前の報告は、エストロゲンがＦＳＨＤ疾患において保護的であり得ることが示唆され、女性は男性よりも重症度が低いと報告されており、出産及び閉経後に症状の持続的な悪化を有し得る［Ａｗａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ， Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．１６２：１５３－９（２０１２）、Ｓａｃｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１８５２：６０７－１４（２０１５）、Ｚａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７７：１５５－６１（１９９８）］。１つの試験は、エストロゲンの有益な効果は、エストロゲン受容体（ＥＲβ）によって媒介され、エストロゲンによって活性化されると、細胞の細胞質内にＤＵＸ４タンパク質を隔離し、核内でのその毒性効果を防止することを示唆した［Ｔｅｖｅｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １２７：１５３１－４５（２０１７）］。エストロゲンの保護効果を示唆するこれらの報告とは対照的に、ＦＬＥｘＤＵＸ４マウスの最近の試験では、いくつかの転帰尺度において雌が雄よりも悪化することが報告された［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｋｅｌｅｔ．Ｍｕｓｃｌｅ １０：８（２０２０）。しかしながら、これらの動物を生成するために使用されたＥＲＴ２システムは、抗エストロゲン薬物タモキシフェンを利用して、高レベルのＤＵＸ４発現を誘導しており、それによって、これらの動物における表現型に対するエストロゲンの影響の解釈を複雑にしている。加えて、８５名の女性ＦＳＨＤ患者の最近の臨床試験では、エストロゲン曝露と疾患重症度との間の差に有意な相関は見出されなかった［Ｍｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ２８， ５０８－１１（２０１８）］。興味深いことに、それらの臨床アプローチは、生殖寿命から高いプロゲステロンレベルの期間を減算することで構成されていたため、プロゲステロンを含む他の生殖ホルモンとの相互作用によって引き起こされる保護効果を排除することができなかった。本開示の本明細書に提供されるデータは、エストロゲン、並びに／又はエストロゲン及びプロゲステロンが、ｍｉｒ－６７５上方制御を介してＤＵＸ４発現を相殺することによって、ＦＳＨＤ疾患から細胞を少なくとも部分的に保護することができる新規メカニズムを示唆する。メラトニンは、その抗炎症及び抗酸化特性のために、神経筋疾患のための有望な薬物療法として以前に特定されている。この目的のために、ｍｄｘ５Ｃｖデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）マウスモデルで試験され、それは筋肉機能を改善し、筋肉の酸化還元状態を高めた［Ｈｉｂａｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｉｎｅａｌ Ｒｅｓ．５１：１６３－７１（２０１１）］。別の試験では、メラトニンは、心臓疾患で発生する心臓前駆細胞の早期老化を防止した［Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｉｎｅａｌ Ｒｅｓ．６１：８２－９５（２０１６）］。
本開示は、β－エストラジオール、β－エストラジオール＋酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）、及びメラトニンが全て、ｍｉｒ－６７５上方制御を介してＤＵＸ４発現を下方制御することができることを示す。したがって、本開示は、本明細書に記載のＤＵＸ４発現若しくは過剰発現に関連する筋ジストロフィー又はがんを治療する方法において、β－エストラジオール＋メラトニン、メラトニン＋ＭＰＡ、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、ブレオマイシン＋ピラジンアミド、ブレオマイシン＋ソラフェニブ、及びピラジンアミド＋ソラフェニブなどの様々な化合物及び化合物の組み合わせを含む。
遺伝子発現試験は、ブレオマイシン［Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７：４５０－６１（２０１１）］、ピラジンアミド［Ｍａｎｃａ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ．８：ｅ７４０８２（２０１３）］、及びソラフェニブ（ｈｔｔｐｓ＿ｃｏｌｏｎ＿ｆｏｒｗａｒｄ ｓｌａｓｈ＿ｆｏｒｗａｒｄ ｓｌａｓｈ＿ｍａａｙａｎｌａｂ．ｃｌｏｕｄ／Ｈａｒｍｏｎｉｚｏｍｅ／ｇｅｎｅ＿ｓｅｔ／ｓｏｒａｆｅｎｉｂ＿ｈｏｍｏ＋ｓａｐｉｅｎｓ＿ｇｐｌ６２４４＿ｇｓｅ３５９０７／ＧＥＯ＋Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ＋ｏｆ＋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ＋Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ＋Ｇｅｎｅｓ＋ｆｏｒ＋Ｓｍａｌｌ＋Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ） ［Ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１１９：５１３３－４３（２０１２）］がｍｉｒ－６７５発現を上方制御したことを示した。したがって、本開示は、本明細書に記載される、ＦＳＨＤを治療する様々な方法において、いくつかの態様において、相乗効果のために、ブレオマイシン、ピラジンアミド、及びソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、及び／又はそれらの組み合わせを含む。
したがって、本開示は、ブレオマイシン若しくはその誘導体、ピラジンアミド若しくはその誘導体、ソラフェニブ（４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－メチルピリジン－２－カルボキサミド）若しくはその誘導体、又はそれらのうちのいずれかの組み合わせを含む。
いくつかの態様において、誘導体は、ブレオマイシン誘導体である。かかるブレオマイシン誘導体には、ブレオマイシンＡ２、デグリコ－ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＡ５、ブレオマイシンＡ６、ブレオマイシンＢ２が含まれるが、これらに限定されず、また、ブレオマイシンの同義語である薬物、例えば、ブレオシン、ブレオマイシン、Ｂｌｅｏｍｉｃｉｎａ（スペイン語）、Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ（フランス語）、及びＢｌｅｏｍｙｃｉｎｕｍ（ラテン語）が含まれる。
いくつかの態様において、誘導体は、ピラジンアミド誘導体である。かかるピラジンアミド誘導体には、ピラジン－２－カルボン酸クロリド、Ｎ－（１－臭素メチル）ピラジンホルムアミド、Ｎ－（ブロモメチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（２－ブロモエチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（３－ブロモプロピル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（ピペリジン－１－イルメチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（ピペラジン－１－イルメチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（チオモルホリノメチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（２－（ピペリジン－１－イル）エチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（２－（ピペラジン－１－イル）エチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（２－モルホリノエチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（２－チオモルホリノエチル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（３－（ピペリジン－１－イル）プロピル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（３－（ピペラジン－１－イル）プロピル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（３－モルホリノプロピル）ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－（３－チオモルホリノプロピル）ピラジン－２－カルボキサミド、３－クロロピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－メチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、Ｎ－ベンジルピラジン－２－カルボキサミド、ピラジン－１，２，３－トリアゾール、Ｎ－アルキル置換３－アミノピラジン－２－カルボキサミド、ピラジン酸ｎ－オクチルエステル、ピラジンチオカルボキサミド、Ｎ－ヒドロキシメチルピラジン、チオカルボキサミド、ピラジン酸ピバロイルオキシメチルエステル、３－（ベンジルアミノ）ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（３－クロロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（３，４－ジクロロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（３－トリフルオロメチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－クロロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（２－メチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－メトキシベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－メチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－アミノベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（２－クロロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（２－フルオロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（４－トリフルオロメチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（２－トリフルオロメチルベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（２，４－ジメトキシベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－［（３－ニトロベンジル）アミノ］ピラジン－２－カルボキサミド、３－（ベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（４－メチルベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（４－メトキシベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（４－アミノベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（３－クロロベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（４－クロロベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（３，４－ジクロロベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（３－ニトロベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（３－トリフルオロメチルベンジルアミノ）－５－シアノピラジン－２－カルボキサミド、３－（ベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（４－メチルベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（４－メトキシベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（４－アミノベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（３－クロロベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（４－クロロベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（３，４－ジクロロベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（３－ニトロベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（３－トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリル、３－（２－メチルベンジルアミノ）ピラジン－２，５－ジカルボニトリルが含まれるが、これらに限定されず、また２－カルバミルピラジン、２－ピラジンカルボキサミド、アルジンアミド、ピラジンカルボキサミド、ピラジン－２－カルボキサミド、ピラジンアミド、ピラジンカルボキサミド、ピラジン酸アミド、ピリジンアミド、Ｐｉｒａｚｉｎａｍｉｄａ又はＰｙｒａｚｉｎａｍｉｄａ（スペイン語）、Ｐｙｒａｚｉｎａｍｉｄ（ドイツ語）、及びＰｙｒａｚｉｎａｍｉｄｕｍ（ラテン語）などのピリジンアミドの類義語である薬物が含まれる。
いくつかの態様において、誘導体は、ソラフェニブ誘導体である。かかるソラフェニブ誘導体には、４－クロロピリジン－２－カルボニルクロリド塩酸塩、４－クロロ－Ｎ－シクロペンチルピリジン－２－カルボキサミド、４－クロロ－Ｎ－シクロヘキシルピリジン－２－カルボキサミド、４－クロロ－Ｎ－シクロヘキシルメチルピリジン－２－カルボキサミド、４－クロロ－Ｎ－ベンジルピリジン－２－カルボキサミド、４－クロロ－Ｎ－フェニルエチルピリジン－２－カルボキサミド、４－（４－アミノフェノキシ）－Ｎ－シクロペンチルピリジン－２－カルボキサミド、４－（４－アミノフェノキシ）－Ｎ－シクロヘキシルピリジン－２－カルボキサミド、４－（４－アミノフェノキシ）－Ｎ－シクロヘキシルメチルピリジン－２－カルボキサミド、４－（４－アミノフェノキシ）－Ｎ－ベンジルピリジン－２－カルボキサミド、４－（４－アミノフェノキシ）－Ｎ－フェニルエチルピリジン－２－カルボキサミド、４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－シクロペンチル－ピリジン－２－カルボキサミド、４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－シクロヘキシル－ピリジン－２－カルボキサミド、４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－シクロヘキシルメチル－ピリジン－２－カルボキサミド、４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－ベンジル－ピリジン－２－カルボキサミド、４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－フェニルエチル－ピリジン－２－カルボキサミド、フェニルシアノ基を含むソラフェニブ誘導体、窒素複素環を含むソラフェニブ誘導体、キノキサリンジオン構造を有するソラフェニブ誘導体、カルコン部分を含むソラフェニブ誘導体、チオエーテル及びニコチンアミドを含むソラフェニブ誘導体、ソラフェニブのジアリールチオ尿素誘導体のクラス、ジチオカルバメート部分を含むオラフェニブ誘導体、ピラゾール足場を有するオラフェニブ誘導体、シクロヘキシル部分を含むソラフェニブ誘導体、キノリン核を含むソラフェニブ誘導体、二量体ベースの構造を含むソラフェニブ誘導体、ソラフェニブのａ，ｂ－不飽和ケトン誘導体、１，２，３－トリアゾールフレームワークを含むオラフェニブ誘導体、１，３，４－トリアリールピラゾールフレームワークを含むオラフェニブ誘導体、ソラフェニブのイミダゾ［２，１－ｂ］チアゾール誘導体、４－（４－（５－（２，４－ジクロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（５－（３－ブロモフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（５－（３，４，５－トリメトキシフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、４－（４－（５－（４－シアノフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（５－（２－クロロ－４－フルオロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（５－（４－ニトロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（５－（３－ニトロフェニル）－４，５－ジヒドロ）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、４－（４－（５－（４－メトキシフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（５－フェニル－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、４－（４－（５－（３，４－ジクロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（５－（４－フルオロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（５－（４－ブロモフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（５－（２，３，４－トリメトキシフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、４－（４－（５－（２，３－ジクロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、Ｎ－メチル－４－（４－（３－（４－ニトロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）フェノキシ）ピコリンアミド、４－（４－（３－（４－ブロモフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（３－（４－クロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－５－（３－ニトロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－５－（４－フルオロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－５－（４－クロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－５－（２，３－ジクロロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－５－（４－シアノフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、４－（４－（１－カルバモチオイル－３－（４－ニトロフェニル）－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）フェノキシ）－Ｎ－メチルピコリンアミド、ＨＬＣ－０８０、ピロリジン側鎖を有するベンズイミダゾール誘導体、Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）－２－（２－オキソインドリン－３－イリデン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）－２－（２－オキソインドリン－３－イリデン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）－２－（５－メチル－２－オキソインドリン－３－イリデン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（３－ブロモフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（１Ｈ－インドール－３）－イル）メチレン）－Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（ｐ－トリル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（３，４－ジフルオロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（３－クロロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（３－ブロモフェニル）－２－（（２－クロロ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－メトキシフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－フルオロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（３－ブロモフェニル）－２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（２－フルオロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（３－フルオロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（４－メトキシフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、２－（（２－クロロ－１－エチル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）－Ｎ－（３－クロロフェニル）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（３－ブロモフェニル）－２－（（２－クロロ－１－プロピル－１Ｈ－インドール－３－イル）メチレン）ヒドラジン－１－カルボキサミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ））フェニル）－４－フェニルピコリンアミド、４－（４－フルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、４－（２，４－ジフルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、４－（４－クロロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、４－（４－メトキシフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－４－ｐ－トリルピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－４－ｍ－トリルピコリンアミド、４－（３－フルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－４－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）ピコリンアミド、４－（４－エチルフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、４－（２，４－ジメチルフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－５－フェニルピコリンアミド、５－（４－フルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン）－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、５－（２，４－ジフルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、５－（４－クロロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、５－（４－メトキシフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－５－ｐ－トリルピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）－５－ｍ－トリルピコリンアミド、５－（３－フルオロフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン
－４－イルオキシ）フェニル）－５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）ピコリンアミド、５－（４－エチルフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミド、５－（２，４－ジメチルフェニル）－Ｎ－（４－（２－（メチルカルバモイル）ピリジン－４－イルオキシ）フェニル）ピコリンアミドが含まれるが、これらに限定されず、またＳｏｒａｆｅｎｉｂ（フランス語）又はＳｏｒａｆｅｎｉｂｕｍ（ラテン語）などのソラフェニブの類義語である薬物も含まれる。
したがって、本開示は、細胞におけるマイクロＲＮＡ－６７５の発現を上方制御する方法を提供し、方法は、細胞を、有効量のエストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせと接触させることを含む。本開示はまた、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子若しくはタンパク質の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉する方法を提供し、細胞を、有効量のエストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせと接触させることを含む。本開示は、ＤＵＸ４発現若しくは過剰発現に関連する筋ジストロフィー又はがんを有する対象を治療する方法を更に提供し、対象に、有効量のエストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせを投与することを含む。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。いくつかの態様において、がんは、肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、又は副腎、胆管、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭頸部、肝臓、脳、肺、中皮質、神経堤、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、皮膚、軟組織、胃、精巣、若しくは胸腺のＤＵＸ４発現性がんである。
いくつかの態様において、エストロゲン又は合成エストロゲンは、エストロン、エストラジオール、エストリオール、エステトロール、２７－ヒドロキシコレステロール、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、７－オキソ－ＤＨＥＡ、７α－ヒドロキシ－ＤＨＥＡ、１６α－ヒドロキシ－ＤＨＥＡ、７β－ヒドロキシエピアンドロステロン、アンドロステンジオン（Ａ４）、アンドロステンジオール（Ａ５）、３α－アンドロスタンジオール、及び３β－アンドロスタンジオール、２－ヒドロキシエストラジオール、２－ヒドロキシエストロン、４－ヒドロキシエストラジオール、４－ヒドロキシエストロン、１６α－ヒドロキシエストロン、エチニルエストラジオール、吉草酸エストラジオール、エストロピペート、コンジュゲートエステル化エストロゲン、並びにキネストロールである。
いくつかの態様において、プロゲステロン又はプロゲスチンは、酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）、１７α－ヒドロキシプロゲステロン、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ゲストデン、又はエトノゲストレルである。
いくつかの態様において、エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせは、筋肉内注射、経口投与、皮下、皮内、若しくは経皮輸送、血流への注射のために、又はエアロゾル投与のために製剤化される。いくつかの態様において、エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせが、組成物中に製剤化される。
様々な態様において、本開示の任意の組成物はまた、希釈剤、賦形剤、及び／又はアジュバントなどの他の成分を含む。許容される担体、希釈剤、賦形剤、及びアジュバントは、レシピエントに対して非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量及び濃度で不活性であり、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、若しくは他の有機酸）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、低分子量ポリペプチド、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、若しくはリジン）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、糖アルコール（例えば、マンニトール若しくはソルビトール）、塩形成カウンターイオン（例えば、ナトリウム）、並びに／又は非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、プルロニック（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が含まれる。
いくつかの態様において、核酸は、送達のためにベクターに導入される。いくつかの態様において、送達のためのベクターは、ＡＡＶ又はｒＡＡＶである。そのため、本開示の実施形態は、配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、ｒＡＡＶゲノムを含む。
いくつかの他の態様において、核酸は、非ベクター化送達を介して細胞に導入される。そのため、実施形態において、本開示は、ＤＵＸ４標的化ｍｉＲＮＡをコードする核酸の非ベクター化送達を含む。いくつかの態様において、この文脈では、核酸と複合体を形成し、細胞外及び細胞内ヌクレアーゼからそれらを保護することができる合成担体は、ウイルスベクターの代替物である。いくつかの態様において、かかる非ベクター化送達は、本開示の核酸を含むナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームの使用を含む。本開示はまた、本明細書に記載の構築物のうちのいずれかを単独又は組み合わせで含む組成物を含む。
滅菌注射用溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて、上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、滅菌した活性成分を、基本分散媒及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分に加えて予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方式、治療目標、個体、及び標的にされる細胞型に応じて異なり、当該技術分野で標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、ｍｌ当たり約１×１０６個、約１×１０７個、約１×１０８個、約１×１０９個、約１×１０１０個、約１×１０１１個、約１×１０１２個、約１×１０１３～約１×１０１４個、又はそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投与量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表され得る（例えば、それぞれ、１×１０７ｖｇ、１×１０８ｖｇ、１×１０９ｖｇ、１×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇ、１×１０１２ｖｇ、１×１０１３ｖｇ、及び１×１０１４ｖｇ）。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、細胞又は対象に、配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、任意の１つ以上の核酸を送達する方法を提供する。
いくつかの態様において、方法は、細胞又は対象に、配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、任意の１つ以上の核酸を含むＡＶＶを投与することを含む。
更に別の態様において、本開示は、細胞又は対象におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を減少させるか、又は機能的ＤＵＸ４の発現を減少させる方法を提供し、方法は、細胞又は対象を、配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示されるＤＵＸ４配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、任意の１つ以上の核酸と接触させることを含む。
いくつかの態様において、方法は、１つ以上のＡＡＶベクターで核酸を送達することを含む。いくつかの態様において、方法は、核酸を非ベクター化送達で細胞に送達することを含む。
いくつかの態様において、ＤＵＸ４の発現又は機能的ＤＵＸ４の発現は、本明細書に提供される方法によって、細胞又は対象において、少なくとも又は約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％減少する。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードする核酸の送達のためのＡＡＶ形質導入細胞を提供する。インビボ又はインビトロで、標的細胞をｒＡＡＶで形質導入する方法が、本開示に含まれる。方法は、有効用量又は有効複数用量の本開示のｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物（ヒトなど）を含む対象に投与するステップを含む。用量が筋ジストロフィーの発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が筋ジストロフィーの発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態において、有効用量は、治療される筋ジストロフィーに関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除又は低減）し、筋ジストロフィーの進行を遅延若しくは予防し、筋ジストロフィーの進行を遅延若しくは予防し、疾患の程度を軽減し、筋ジストロフィーの寛解（部分若しくは完全）をもたらし、かつ／又は生存を延長する用量である。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、ＦＳＨＤである。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードする核酸の非ベクター化送達が本開示で提供される。いくつかの態様において、核酸又は核酸を含む組成物は、ナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソームで送達される。
併用療法も本開示によって企図される。本明細書に使用される併用は、同時治療又は連続治療を含む。本開示の方法と、標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイド及び／又は免疫抑制剤）、又は他の阻害性ＲＮＡ構築物との組み合わせは、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第２０１３／０１６３５２号に開示されるものなどの他の療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。
本開示の組成物及び核酸を含むＡＡＶ、ナノ粒子、細胞外小胞、及びエクソソームを含む、有効用量の本開示の組成物の投与は、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、経鼻、経肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、経直腸、又は膣内が含まれるが、これらに限定されない。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される疾患状態、及びＤＵＸ４を発現する細胞などの標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合され得る。いくつかの実施形態において、組成物又は医薬品は、筋肉内注射、経口投与、皮下、皮内、若しくは経皮輸送、血流への注射のために、又はエアロゾル投与のために製剤化される。いくつかの実施形態において、投与経路は、筋肉内である。いくつかの実施形態において、投与経路は、静脈内である。
いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示による投与には、筋肉、血流、中枢神経系への注入、及び／又は脳若しくは他の器官への直接注入が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の成分に対する既知の制限はない（しかし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の方法において避ける必要がある）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。例えば、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい（その開示は、参照により本明細書に援用される）。医薬組成物は、経口投与のため、注射可能製剤として、又は皮下、比内、及び／若しくは経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本開示を実施に使用することができる。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
筋肉内注射を目的のために、セサミ油若しくはピーナッツ油などのアジュバント溶液、又は水性プロピレングリコール溶液、並びに滅菌水溶液を用いることができる。かかる水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水又はグルコースで等張にすることができる。遊離酸（ＤＮＡが酸性リン酸基を含む）又は薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に入手可能である。
注射用途に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射器での使用が可能性である程度に流動性でなければならない。製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。いくつかの態様において、適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持される。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖類又は塩化ナトリウム）を含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を使用することによってもたらされ得る。
いくつかの態様において、製剤は、安定剤を含む。「安定剤」という用語は、加熱又は凍結中に生じるものなどの有害な条件から製剤を保護し、かつ／又は安定状態で製剤の安定性若しくは有効期間を延長させる物質又は賦形剤を指す。安定剤の例としては、スクロース、ラクトース、及びマンノースなどの糖、マンニトールなどの糖アルコール、グリシン又はグルタミン酸などのアミノ酸、並びにヒト血清アルブミン又はゼラチンなどのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、製剤は、抗微生物保存剤を含む。「抗微生物保存剤」という用語は、使用されるバイアル又は容器の反復穿刺時に導入され得る微生物の増殖を阻害する組成物に添加される任意の物質を指す。抗微生物保存剤の例としては、チメロサール、２－フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、及びフェノールなどの物質が挙げられるが、これらに限定されない。
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるＤＵＸ４の減少した発現をもたらす本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボ又はインビトロのいずれかでのレシピエント細胞への本明細書に記載のＤＵＸ４標的化構築物、例えば、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ又はＤＵＸ ｍｉＲＮＡをコードする核酸のうちの１つ以上の投与／送達を指すために使用される。
一態様において、ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで実行される。一実施形態において、所望の標的細胞は、対象から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。代替的に、同系又は異種の細胞が、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生じない場合に使用することができる。
対象への形質導入及び形質導入した細胞の再導入のために好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態において、細胞は、例えば適切な培地中で、ｒＡＡＶを細胞と組み合わせることによってインビトロで形質導入され、サザンブロット及び／若しくはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、又は選択可能なマーカーを使用して、目的のＤＮＡを有するこれらの細胞についてスクリーニングする。次いで、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注入による、又は例えばカテーテルを使用した平滑筋及び心筋への注入によるなど、様々な技術によって対象に導入することができる。
本開示は、ＤＵＸ４の発現を下方制御又は阻害するように設計されたマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡを含む、有効用量（又は本質的に同時に投与される用量若しくは間隔をおいて投与される用量）のｒＡＡＶを、細胞又はそれを必要とする対象に投与する方法を提供する。いくつかの態様において、有効用量は、したがって、治療的に有効な用量である。
いくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量又は有効用量は、約１．０×１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１６ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、１．０×１０１０ｖｇ／ｋｇはまた、１．０ Ｅ１０ｖｇ／ｋｇで示され、これは単に科学的表記を示す代替的な方法である。同様に、１０１１は、Ｅ１１と同等である、などである。いくつかの態様において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、約１．０×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０１０ ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０１０ 約１．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０１６ｖｇ／ｋｇである。
いくつかの態様において、用量は、約１．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、用量は、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、用量は、約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０１３ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、用量は、約３．０×１０１３ｖｇ／ｋｇである。
いくつかの態様において、初回用量の後に、第２のより多い用量が続く。いくつかの態様において、初回用量の後に、第２の同じ用量が続く。いくつかの態様において、初回用量の後に、１つ以上のより少ない用量が続く。いくつかの態様において、初回用量の後に、同じ用量又はより多い用量である複数の用量が続く。
インビボ又はインビトロで、標的細胞に送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）を形質導入する方法が企図される。本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ配列の持続した発現をもたらす。そのため、本開示は、ｒＡＡＶ、及び対象における細胞でＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ配列をインビトロ又はインビボで発現するｒＡＡＶを投与／送達する方法を提供する。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。これらの方法は、細胞及び組織（筋肉などの組織を含むが、これらに限定されない）を本明細書に記載の１つ以上のｒＡＡＶで形質導入することを含む。形質導入は、細胞特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットを用いて行うことができる。「形質導入」という用語は、例として、標的細胞によるＤＵＸ４の減少した発現又は発現の阻害をもたらす本明細書に記載の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボ又はインビトロのいずれかでの標的細胞へのＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、例えば、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡの投与／送達を指すために使用される。
インビボ方法は、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を含む組成物の有効用量又は有効複数用量を、それを必要とする対象（ヒト対象を含む）に投与するステップを含む。そのため、有効用量（又は本質的に同時に投与される用量若しくは間隔をおいて投与される用量）の本明細書に記載のｒＡＡＶを、それを必要とする患者に投与する方法が提供される。用量又は複数用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量又は複数用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。有効用量は、治療される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除若しくは低減）する用量であり、障害／疾患状態への進行を遅延若しくは予防する用量であり、障害／疾患状態の進行を遅延若しくは予防する用量であり、疾患の程度を軽減する用量であり、疾患の寛解（部分若しくは完全）をもたらす用量であり、並びに／又は生存を延長する用量である。
いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、筋ジストロフィー（ＭＤ）などの疾患を治療、改善、又は予防する際に使用される。様々な態様において、かかるＭＤは、ＦＳＨＤである。ＦＳＨＤは、なかでも最も一般的に遺伝する筋ジストロフィーであり、８７万人にも影響を及ぼすと推定されている。ＦＳＨＤの症状の古典的な説明には、顔、肩帯、及び腕における進行性の筋力低下が含まれるが、疾患は、胴体及び下肢の筋肉を含む、より広範囲に現れ得る。可変性はまた個人内に一般的に認められ、非対称的な衰弱が一般的である。発症年齢は幼児期から成人期までの範囲であり得、通常は疾患の重症度に関連しており、より早い発症は、多くの場合より重度の筋力低下に関連する。ＦＳＨＤを有するほとんどの患者は、通常の寿命を有するが、呼吸不全が発生する可能性があり、疾患が衰弱させ得、罹患した個人の約２５％がその５０歳代までに車椅子に依存することになり得、より重症な疾患形態では更に早いが、一方、他は生涯歩行を維持する。
ＦＳＨＤは、二重ホメオボックス４遺伝子（ＤＵＸ４）の異常な発現によって引き起こされ、骨格筋にとって有毒な転写因子を産生する。ＤＵＸ４は、通常、ヒトの発達の２細胞期の期間中に機能するが、その後、おそらく精巣を除いて、基本的に他の全ての組織で抑制される。ＦＳＨＤを有する人々の骨格筋では、特定の遺伝的及びエピジェネティック因子が同時にＤＵＸ４脱抑制を可能にし、次いでそれが、分化異常、酸化ストレス、炎症性浸潤、細胞死、及び筋萎縮に関与するものを含む、いくつかの異常な遺伝子発現カスケードを開始する。
病理学的ＦＳＨＤを有することが知られている家族では、本開示の方法は、様々な態様において、疾患を予防する方法であり、それらは疾患の発症前に実行される。他の様々な態様において、本開示の方法は、診断後に実行され、したがって、疾患を治療又は改善する方法である。
いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、がんなどの疾患を治療、改善、又は予防する際に使用される。ＤＵＸ４は、いくつかのがんタイプで活性化されることが示されており、それは腫瘍細胞を免疫系からマスキングするように機能する［Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ５０（５）：６５８－７１（２０１９）］。例えば、ＤＵＸ４タンパク質融合は、横紋筋肉腫及びユーイング肉腫などのがんを引き起こすことが知られている。ＣＩＣ－ＤＵＸ４遺伝子融合は、肉腫を誘発し、肉腫転移を駆動する［Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７Ｊｕｎ１；７７（１１）：２９２７－２９３７、Ｏｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１９；１２９（８）：３４０１－３４０６）］。他のがん組織、例えば、副腎、Ｂ細胞リンパ腫、胆管、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭部／頸部、肝臓、脳（例えば、低悪性度神経膠腫）、肺、中皮、神経堤、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、皮膚、軟組織、胃、精巣、及び胸腺からのそれらの組織なども、ＤＵＸ４を発現することが示された［Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ５０（５）：６５８－７１（２０１９）］。そのため、本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶ、及び組成物は、がんの治療、改善、又は予防においてＤＵＸ４発現を阻害する際に使用される。
分子的、生化学的、組織学的、及び機能的な転帰尺度は、ＤＵＸ４遺伝子及びタンパク質の発現を減少させ、ＦＳＨＤなどの筋ジストロフィーを治療することにおける、本明細書に開示される生成物及び方法の治療有効性を実証する。転帰の尺度は、例えば、Ｄｙｃｋ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ３２， ３５ ａｎｄ ４３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ １（２００５）及びＢｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６０２：３４７－３９３（２０１０）］。転帰尺度には、罹患した組織におけるＤＵＸ４ ｍＲＮＡ又はタンパク質の低下又は除去が挙げられるが、これらに限定されない。細胞におけるＤＵＸ４の発現の欠如及び／又はＤＵＸ４の発現の下方制御は、改善を決定するためにｒＡＡＶ投与の前及び後の筋生検において、ＲＴ－ＰＣＲ、ＱＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｓｃｏｐｅ、ウェスタンブロット、免疫蛍光、又は免疫組織化学を含むが、これらに限定されない当該技術分野において既知の方法によって、ＤＵＸ４タンパク質のレベルを測定することによって検出される。
いくつかの実施形態において、対象の細胞におけるＤＵＸ４遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルは、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードする核酸又はベクター、例えば、ｒＡＡＶの投与前のＤＵＸ４遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルと比較して、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードする核酸又はＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードする核酸を含むベクター、例えば、ｒＡＡＶの投与後に減少する。いくつかの態様において、ＤＵＸ４の発現は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、又は少なくとも約１００％超減少する。様々な態様において、改善した筋力、改善した筋機能、及び／又は改善した可動性及びスタミナは、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、又は少なくとも約１００％超改善を示す。
他の転帰尺度には、治療の前及び後の対象における血清クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）のレベルを測定することが含まれる。増加したＣＫレベルは、筋肉損傷の特徴である。筋ジストロフィー患者では、ＣＫレベルは正常範囲（出生以来、正常レベルの１０～１００倍）を超えて有意に増加する。上昇したＣＫレベルが血液試料中に認められる場合、それは通常、筋肉が筋ジストロフィー又は炎症などのいくつかの異常なプロセスによって崩壊されていることを意味する。そのため、本開示の方法による治療における肯定的な治療転帰は、ｒＡＡＶの投与前の血清クレアチニンキナーゼのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後の血清クレアチニンキナーゼのレベルの低下である。
他の転帰尺度には、治療後の対象において、筋力の改善、筋機能の改善、可動性の改善、スタミナの改善、又はそれらの２つ以上の組み合わせが存在するかを決定するために測定することが含まれる。かかる転帰尺度は、対象における筋ジストロフィーの進行を決定する上で重要であり、当該技術分野で既知の様々な検査によって測定される。これらの検査のいくつかには、６分間歩行検査、立ち上がり時間検査、昇り４ステップ検査、昇り降り４ステップ検査、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）検査、１０メートル時限検査、１００メートル時限検査、ハンドヘルド筋力測定（ＨＨＤ）検査、時限アップアンドゴー検査、粗大運動サブ検査スケール（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコア、最大随意等尺性収縮検査（ＭＶＩＣＴ）、又はそれらの２つ以上の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
併用療法も本開示によって企図される。本明細書で使用される組み合わせは、同時治療及び逐次治療の両方を含む。本明細書に記載の方法と標準的な医学的治療及び支持療法との組み合わせは、グルココルチコイドなどの療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。全てのタイプのグルココルチコイドが、本明細書に開示の併用療法における使用のために含まれる。かかるグルココルチコイドには、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、デフラザコート、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、及びトリアムシノロンが含まれるが、これらに限定されない。
本開示に含まれる他の併用療法は、本明細書に記載される、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡと、他のｍｉＲＮＡとの組み合わせ、又はＵ７－ｓｎＲＮＡベースの遺伝子療法、ＤＵＸ４発現の小分子阻害剤、ＲＮＡｉを介してＤＵＸ４を阻害するオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡｓｅ Ｈ若しくはエクソンスキッピング機構との組み合わせ、Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラス理論的ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子療法アプローチである。
有効用量の本開示の核酸、ウイルスベクター、又は組成物の投与は、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、経鼻、経肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、経直腸、又は膣内が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、有効用量は、全身投与経路、すなわち、全身投与によって送達される。全身投与は、体全体が影響を受けるような循環系への投与の経路である。かかる全身投与は、様々な態様において、経腸投与（胃腸管を通した薬物の吸収）又は非経口投与（一般に、注射、注入、又は移植を介して）を介して行われる。様々な態様において、有効用量は、経路の組み合わせによって送達される。例えば、様々な態様において、有効用量は、静脈内及び／若しくは筋肉内、又は静脈内及び脳室内などで送達される。いくつかの態様において、有効用量は、順番に、又は連続して送達される。いくつかの態様において、有効用量は、同時に送達される。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ構成要素（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、様々な態様において、治療される疾患又は障害の状況又は状態、対象の状況、状態、又は年齢、並びに核酸又はタンパク質を発現すべき標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合される。
特に、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）の実際の投与は、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を動物の標的細胞に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。投与としては、筋肉への注射、血流への注入、及び／又は神経系若しくは肝臓への直接注射が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の成分に対する既知の制限はない（しかし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の方法において避ける必要がある）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが神経細胞などの目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。例えば、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい（その開示は、参照により本明細書に援用される）。薬学的組成物は、注射用製剤として、又は経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本開示を実施に使用することができる。送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）は、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）の分散液はまた、グリセロール、ソルビトール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に既知の標準的な技術に容易に得ることができる。
注射用途に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な通針性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、ソルビトールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合には、必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖類又は塩化ナトリウム）を含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を使用することによってもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて、上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、滅菌した活性成分を、基本分散媒及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分に加えて予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
「治療すること」は、筋肉消耗、筋力低下、筋緊張症、骨格筋の問題、網膜の異常、股関節の脱力、顔の脱力、腹部筋力低下、関節及び脊髄の異常、下肢の脱力、肩の脱力、聴力喪失、筋肉炎症、及び非対称的な衰弱を含むが、これらに限定されない、筋ジストロフィーの１つ以上の症状を改善又は阻害することを含む。
有効用量の本開示の核酸、ウイルスベクター、又は組成物の投与は、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、経鼻、経肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、経直腸、又は膣内が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、有効用量は、全身投与経路、すなわち、全身投与によって送達される。全身投与は、体全体が影響を受けるような循環系への投与の経路である。かかる全身投与は、様々な態様において、経腸投与（胃腸管を通した薬物の吸収）又は非経口投与（一般に、注射、注入、又は移植を介して）を介して行われる。様々な態様において、有効用量は、経路の組み合わせによって送達される。例えば、様々な態様において、有効用量は、静脈内及び／若しくは筋肉内、又は静脈内及び脳室内などで送達される。いくつかの態様において、有効用量は、順番に、又は連続して送達される。いくつかの態様において、有効用量は、同時に送達される。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ構成要素（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、様々な態様において、治療される疾患又は障害の状況又は状態、対象の状況、状態、又は年齢、並びに核酸又はタンパク質を発現すべき標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合される。
特に、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）の実際の投与は、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を動物の標的細胞に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。投与としては、筋肉への注射、血流への注入、及び／又は神経系若しくは肝臓への直接注射が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与され得る担体又は他の成分に対する既知の制限はない（しかし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の方法において避ける必要がある）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが神経細胞などの目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。例えば、ＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい（その開示は、参照により本明細書に援用される）。薬学的組成物は、注射用製剤として、又は経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本開示を実施に使用することができる。送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）は、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）の分散液はまた、グリセロール、ソルビトール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に既知の標準的な技術に容易に得ることができる。
注射用途に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な通針性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造及び保管の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、ソルビトールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合には、必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖類又は塩化ナトリウム）を含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を使用することによってもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて、上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、滅菌した活性成分を、基本分散媒及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分に加えて予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
本開示はまた、本開示の核酸、ベクター、又は組成物を含むか、又は本開示のプロセスに従って製造された、キットを提供する。本開示の文脈において、「キット」という用語は、２つ以上の構成要素を意味し、そのうちの１つは、本開示の核酸、ベクター、又は組成物に対応し、他は、容器、レシピエント、説明書、又は他のものに対応する。したがって、キットは、様々な態様において、特定の目標を達成するのに十分な一連の製品であり、単一のユニットとして販売することができる。
キットは、本開示の核酸、ベクター、又は組成物を投与のための適切な投与量（上記参照）で含有する、任意の適切な形状、サイズ、及び材料の１つ以上のレシピエント（バイアル、アンプル、容器、注射器、ボトル、バッグなど）を含み得る。キットは追加的に、使用のための指示若しくは説明書（例えば、リーフレット又は取扱説明書の形態で）、核酸、ベクター、若しくは組成物を投与するための注射器、ポンプ、注入器など手段、核酸、ベクター、若しくは組成物を再構成するための手段、及び／又は核酸、ベクター、若しくは組成物を希釈するための手段を含み得る。
いくつかの態様において、キットは、キットに提供される試薬の使用を説明するラベル及び／又は説明書を含む。キットはまた、本明細書に記載の方法で使用される組成物のうちの１つ以上を送達するためのカテーテル、注射器、又は他の送達デバイスを任意選択的に含む。
本発明はまた、単回用量の投与単位のための、又は複数回用量のためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、単一チャンバ型及び複数チャンバ型のプレフィルドシリンジを含むキットを提供する。
本文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせが本文書の同じ文章、又は段落、又はセクションで一緒に認められない場合でも、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。本開示はまた、例えば、上記で具体的に言及される変形よりもいくらか範囲が狭い本開示の全ての実施形態を含む。属として記載される本開示の態様に関して、全ての個々の種は、本開示の別個の態様とみなされる。「ａ」又は「ａｎ」で記載又は特許請求される本開示の態様に関して、これらの用語は、文脈がより限定された意味を明確に必要としない限り、「１つ以上」を意味することを理解されたい。
特に明記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連における全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、本明細書に記載の本開示の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識するか、又は定型的な実験を超えることなく使用して確認することができるであろう。かかる等価物は、本開示によって包含されることが意図される。
本明細書で使用される「及び／又は」という用語はいつでも、「及び」、「又は」、及び「当該用語によって接続された要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。しかしながら、それはまた、具体的な数字を含み、例えば、約１０は１０を含む。
本明細書及びその後の特許請求の範囲全体を通して、文脈で別段の要求がない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という単語、並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含めることを意味するが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外することを意味しないと理解されたい。本明細書で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」若しくは「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」という用語で、又は本明細書でときどき使用される場合、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」という用語で置き換えることができる。
本明細書で使用される場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素に指定されていないいかなる要素、ステップ、又は成分も除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的及び新規の特徴に実質的に影響を与えない材料又はステップを除外しない。
本明細書の各例では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれで置き換えられ得る。
本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、材料、試薬、及び物質などに限定されず、そのため変化することができることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、特許請求の範囲によってのみ定義される、本開示の主題の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書の本文全体で引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様、説明書などを含む）は、上記又は下記にかかわらず、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた材料が本明細書と一致しないか、又は矛盾する範囲では、本明細書は、いかなるかかる材料にも優先する。
本開示及びその利点のより良い理解は、例示的な目的のためのみに提供される以下の実施例から得られるであろう。実施例は、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示的な目的のみのためのものであり、それらの観点から様々な修正又は変更が当業者に示唆されるが、本出願の趣旨及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。
本開示の追加の態様及び詳細は、限定するのではなく例示的であることが意図されている以下の実施例から明らかであろう。
実施例１
材料及び方法
試験デザイン。試験の目的は、ＦＳＨＤなどの筋ジストロフィー、又はＤＵＸ４の発現若しくは過剰発現に起因するがんの治療のための新規戦略を探求することだった。ＦＳＨＤは、筋肉に有毒であるＤＵＸ４遺伝子の脱抑制によって引き起こされる。そのため、ＦＳＨＤ療法は、ＤＵＸ４を阻害することに焦点を当てており、それがこの試験の主な目的だった。この試験では、新規戦略は、ＤＵＸ４に対してＲＮＡｉを誘導するために開発された。具体的には、ＤＵＸ４に対するＲＮＡｉを自然に誘導する内因性ヒトマイクロＲＮＡを上方制御する薬物を、このアプローチがＲＮＡｉでＤＵＸ４遺伝子を阻害する新規戦略を提供するであろうという理論で試験した。この試験では、ｍｉｒ－６７５がＤＵＸ４を効率的に阻害し、ヒトＨＥＫ２９３細胞及びＦＳＨＤ筋細胞株におけるＤＵＸ４関連表現型を低減することが示された。ｍｉｒ－６７５はまた、以前に開発及び公開されたＡＡＶ．ＤＵＸ４マウスモデルにおいて、インビボでＤＵＸ４関連病理を阻害するように遺伝子療法ベクター内で機能することが示された［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６９：５４０－５５２（２０１１）］。インビトロ試験では、ｎ＝３～ｎ＝６の独立した実験を、アッセイに応じて実行した。ＤＵＸ４発現のｍｉｒ－６７５特異的阻害を試験するとき、６回の独立したブラインド化ウェスタンブロットを行った。小分子処理アッセイにおいて、３つの異なるＦＳＨＤ細胞株、すなわち、１５Ａ、１７Ａ、及び１８Ａを使用した。１５Ａ ＦＳＨＤ細胞株では、６回の独立した実験を行った。１７Ａ及び１８Ａ ＦＳＨＤ細胞株では、３回の独立した実験を行った。インビボ試験について、試料サイズは、以前に公開された試験に基づいて選択された［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：１４１７－２３（２０１２）、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．８：１２１－１３０（２０１８）］。
配列生成及びクローニング。この試験で使用した全てのｍｉＲＮＡは、［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．８：１２１－１３０（２０１８）］で以前に報告されたように設計した。全てのｍｉＤＵＸ４を、以前に報告されているように、ｍｉｒ－３０ベース／Ｕ６構築物にクローニングした［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：１４１７－２３（２０１２）］。マイクロＲＮＡ－６７５配列は、ｍｉＲＢａｓｅデータベース（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）から得られ、この試験で使用した全てのｍｉｒ－６７５構築物は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩクラスのプロモーター（Ｕ６又はＨ１プロモーター）の下流で発現プラスミドにクローニングした。ｍｉｒ－６７５、ｍｉｒ－６７５－５ｐ、及びｍｉｒ－６７５－３ｐ構築物のステムループ構造の配列が、図１７Ａ～Ｂに示される。ＣＭＶ．Ｈ１９構築物をＯｒｉＧｅｎｅから購入した。ｐｓｉ２－ＤＵＸ４Ｆｌを、鋳型としてＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４ΔＶ５構築物、並びに以下のプライマー：フォワードプライマー：ＣＣＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＣＣＣＧＡＣＡＣ（配列番号１２７）、及びリバースプライマー：ＡＣＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＡＴＴＴＴＡＡＴＡＴＡＴＣＴＣ（配列番号１２８）を使用してＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、事前に設計したｐｓｉｃｈｅｃｋ２（ｐｓｉ２）ＳＤ５変異体（ＳＤ５変異体を有するウミシイタケルシフェラーゼ）プラスミド［Ａｎｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １０：ｅ０１１８８１３（２０１５）］に、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ制限部位及びｐｓｉ２．ＳＤ５変異体－ＤＵＸ４ ３’ＵＴＲプラスミド骨格を使用してクローニングした。ＤＵＸ４ ＯＲＦ及び３’ＵＴＲを包含する全長ＤＵＸ４（ＤＵＸ４－ＦＬ）、並びにその３’末端のＶ５タグを発現するＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ構築物をＰＣＲ増幅し、以前に報告されているようにＡＡＶ６．ＣＭＶプロウイルス骨格プラスミドにクローニングした［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６９：５４０－５２（２０１１）］。元のＶ５ペプチドタグは、以前に報告されているように、組換えＰＣＲを介してＶ５及びＤＵＸ４停止コドンの誤接続を防止するために変異させた（Ｖ５．２）［Ａｎｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １０：ｅ０１１８８１３（２０１５）］。加えて、このプラスミドは、ＤＵＸ４オープンリーディングフレーム（ＤＵＸ４ ＯＲＦ）、ＤＵＸ４ ３’ＵＴＲ配列（ｐＬＡＭ配列）を包含するサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶｐ）駆動のＤＵＸ４全長配列を含む。後者は、エクソン１（Ｅｘ１）、エクソン２（Ｅｘ２）、及びエクソン３（Ｅｘ３）、並びに内因性ＤＵＸ４非従来型ポリＡ配列（ＡＴＴＡＡＡＡ（配列番号１２９））（ｅｐＡ）から形成される。ＣＭＶ．ｅＧＦＰをＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬプラスミドにクローン化するために、ＣＭＶ．ｅＧＦＰを、鋳型としてＡＡＶ．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ、並びに以下のプライマー：フォワードプライマー：ＴＴＡＣＴＡＧＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧ（配列番号１３０）、及びリバースプライマー：ＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴ（配列番号１３１）を使用してＰＣＲによって増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位を使用してプラスミド骨格内にクローニングした。ｍｉｒ－６７５阻害に耐性であるＤＵＸ４ ＯＲＦ変異体を発現するＣＭＶ．ＤＵＸ４ ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ構築物を、鋳型として野生型ＤＵＸ４、及び以下のプライマー：フォワード：５’ＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡ３’（配列番号１３２）、フォワード中央：５’ＡＣＣＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧＡ３’（配列番号１３３）、リバース中央：５’ＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＣＡＧＡＴＣＴＴＧＧＧＴＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡＧ３’（配列番号１３４）、リバース：５’ＣＧＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＧ３’（配列番号１３５）を使用して、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ制限部位を使用した組換えＰＣＲによってクローニングした。ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓは、点変異を高親和性で有するＣＭＶｐ駆動ＤＵＸ４ ＯＲＦ、ＯＲＦに位置するｍｉｒ－６７５結合部位（ＴＳ７８０Ｍ対ＴＳ７８０ＷＴ配列アラインメントを参照）を含み、ＤＵＸ４ ３’ＵＴＲを有しない。後者の非存在は、ＤＵＸ４転写物上の他のｍｉｒ－６７５標的部位を排除した。この構築物はまた、変異したＶ５エピトープ配列（Ｖ５．２）及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐＡ）を含む。ＣＭＶ．ｅＧＦＰをＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ及びＣＭＶ．ＤＵＸ４ ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓプラスミドにクローニングするために、ＣＭＶ．ｅＧＦＰを、鋳型としてＣＭＶ．ｅＧＦＰ、並びに以下のプライマー：フォワード：ＴＴＡＣＴＡＧＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧ（配列番号１３６）、リバース：ＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴ（配列番号１３７）を使用してＰＣＲによって増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位を使用してプラスミド骨格内にクローニングした。ＲｅｎＬｕｃ－ＰＴＳ（全ての成熟したｍｉＲＮＡ配列の逆相補体）を作製するために、全てのｍｉＲＢａｓｅ予測したｍｉＲＮＡの標的部位を含むオリゴヌクレオチドを商業的に作製し、この試験に使用し、組換えＰＣＲを使用して、それをｐｓｉＣｈｅｃｋ２（ＲｅｎＬｕｃ）デュアルルシフェラーゼプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）におけるウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲとして融合させた。同様の戦略を使用して、ＲｅｎＬｕｃ－ｍｉｒ－６７５Ｒにおけるウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲで、ｍｉｒ－６７５の完全な標的部位をクローニングした。ＤＵＸ４ ＯＲＦ、ＤＵＸ４ ３’ＵＴＲ、又は全長ＤＵＸ４（ＤＵＸ４－ＦＬ）がウミシイタケルシフェラーゼ３’ＵＴＲとして挿入されたデュアルルシフェラーゼプラスミド（ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４ ＯＲＦ、ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４ ３’ＵＴＲ、及びＤＵＸ４－ＦＬ）を作製するために、配列を、鋳型としてＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬΔＶ５プラスミドを使用してＰＣＲによって増幅し、ＲｅｎＬｕｃにクローニングした。ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４－ＦＬ発現プラスミド（図１Ａ）を作製するために、ＤＵＸ４－ＦＬ（Ｖ５タグなしのＤＵＸ４ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲ）を、鋳型としてＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬΔＶ５を使用して、以下のプライマー：フォワード：５’ＣＣＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＣＣＣＧＡＣＡＣ３’（配列番号１３８）５’ＡＣＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＡＧＧＧＧＧＣＡＴＴＴＴＡＡＴＡＴＡＴＣＴＣ３’（配列番号１３９）を用いてＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ制限部位及びＲｅｎＬｕｃ．ＳＤ５変異体ＤＵＸ４ ３’ＵＴＲプラスミド骨格を使用して、事前に設計したＲｅｎＬｕｃ ＳＤ５変異型プラスミドにクローニングした。ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子は、ＤＵＸ４－ＦＬ ｍＲＮＡの代替的なスプライシングを防止するスプライシングドナー変異（＊ＳＤ５）を有する［Ａｎｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ １０：ｅ０１１８８１３（２０１５）］。ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４ ＯＲＦ－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ発現プラスミドを作製するために、組換えＰＣＲを実行して、ＤＵＸ４ ＯＲＦにおける最強のｍｉｒ－６７５標的部位（ＴＳ７８０）のうちの１つを欠失させ、以下のプライマー：フォワード：５’ＣＣＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＣＣＣＧＡＣＡＣ３’（配列番号１４０）、フォワード中央：５’ＣＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧＡ３’（配列番号１４１）、リバース中央：５’ＴＣＣＴＣＣＣＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＣＧＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＧＡ３’（配列番号１４２）、及びリバース：５’ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣ３’（配列番号１４３）を使用してＤＵＸ４ ３’ＵＴＲを排除した。次いで、この構築物を、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ制限部位を使用してＲｅｎＬｕｃ骨格にクローニングした。
細胞培養。
ＨＥＫ２９３細胞培養。ＨＥＫ２９３細胞を、２０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１％Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地を使用して増殖させた。トランスフェクトした細胞を、同じだがペニシリン－ストレプトマイシンを欠いたＤＭＥＭ培地中で増殖させた。
一次細胞培養。１５Ａ、１７Ａ、及び１８Ａ ＦＳＨＤヒト筋芽細胞及び１５Ｖ対照ヒト筋芽細胞は、ＵＭＭＳ Ｗｅｌｌｓｔｏｎｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＦＳＨＤによって提供され、既に特徴付けられている［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２１：４４１９－４４３０（２０１２）］。事前に不死化した１５Ａ細胞株は、単一の４ｑＡ許容対立遺伝子を有する。免疫細胞化学（ＩＣＣ）を使用して、Ｊｏｎｅｓ（上記）は、１５Ａ細胞株が１：１０４のＤＵＸ４＋核を有することを示し、これは、他のＦＳＨＤ罹患細胞株（すなわち、１７Ａ及び１８Ａ）と比較して低い。１５Ｖ細胞株は、２つの４ｑＢ非許容対立遺伝子を有する。細胞は、新しいＬＨＣＮ培地［１５％高品質グレードＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、０．０２ＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．０３μｇ／ｍＬのＺｎＳＯ４（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ Ｆｌｕｋａ）、１．４μｇ／ｍＬのビタミンＢ１２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０５５μｇ／ｍＬのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％の抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）、２．５ｎｇ／ｍＬの肝細胞増殖因子（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充した４：１のＤＭＥＭ：培地１９９（Ｇｉｂｃｏ）］を２日ごとにそれらに供給することによって増殖させた。分化のために、細胞が＞９０％密集だったとき、筋芽細胞を分化培地［１５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％の抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した４：１のＤＭＥＭ：培地１９９（Ｇｉｂｃｏ）］に切り替えた。分化培地を添加する前に、細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄した。細胞を、３日ごとに新しい分化培地で最大７日間播種した。細胞を分離するために、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ、フェノールレッド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
デュアルルシフェラーゼアッセイ。（図１Ａ、３Ａ～Ｂ、４Ａ～Ｂ、５Ｂ、及び１６Ｂ～Ｃも参照）このアッセイは、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．８：１２１－３０（２０１８））によって既に報告されているように行い、いくつかの修正を加えたデュアル－ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）プロトコルに従った。全てのプラスミド構築物は、別個のウミシイタケ及びホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むｐｓｉＣｈｅｃｋ２デュアルルシフェラーゼレポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を骨格として有し、前者は本開示の実験で使用される様々な標的配列を含み、後者はトランスフェクション正規化物質（対照）として機能した。全てのＤＵＸ４及び対照配列を、３’ＵＴＲとして機能するウミシイタケルシフェラーゼ終止コドンの下流にクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクションの２４時間前に前播種した。次いで、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ルシフェラーゼＤＵＸ４レポーター及び個々のｍｉＲＮＡ発現プラスミドを、増加するルシフェラーゼＤＵＸ４レポーター：ｍｉＲＮＡモル比で用いて共トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの２４時間又は４８時間後に測定した。ＤＵＸ４遺伝子サイレンシングを、既に報告されているように決定した［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．８：１２１－３０（２０１８）］。三重測定データを実験ごとに平均化し、個々の実験を３回行った。結果は、全ての組み合わせた実験のウミシイタケ対ホタルルシフェラーゼ活性の平均比±ＳＥＭとして報告した。
ＲＮＡ抽出。ＨＥＫ２９３細胞からのＲＮＡを、ノーザンブロットアッセイ及びＱＰＣＲのために抽出した。ｍｉＲＶＡＮＡ ｍｉＲＮＡ単離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の指示に従って使用して、ｍｉＲＮＡなどの小ＲＮＡを包含する全ＲＮＡを抽出した。Ｃ５７ＢＬ／６骨格筋からＲＮＡを抽出するために、凍結保存された筋肉を、液体窒素を使用した最適以下の温度で、乳鉢及び乳棒を使用して粉砕した。次いで、６００μＬのｍｉＲＶＡＮＡ ｍｉＲＮＡ単離キット溶解緩衝液、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ、及び１．０ｍｍジルコニアビーズ（Ｂｉｏｓｐｅｃ）を使用して、粉砕した筋肉を溶解した。筋肉を３０Ｈｚで３０秒間均質化し、１０秒休止を伴った。これを３回繰り返した。
定量的ＲＴ－ＰＣＲアッセイ。（図６Ａ～Ｂ、図９Ａ～Ｂ、図１５Ａ、図１６Ａ～Ｂ、図２３Ａ～Ｂ、図２４、及び図２５も参照。）
ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ。ｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５、ｍｉｒ－６７５－５ｐ、及びｍｉ４０５の発現をＴａｑＭａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化するためにＱＲＴ－ＰＣＲを実行した。実験は、ＲＮＡ調製物からゲノムＤＮＡを除去することによって開始し、次いで、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の指示に従って使用してｃＤＮＡを作製した。同じｃＤＮＡ反応内で、１×ＲＴランダムヘキサマープライマーを使用して、参照遺伝子として使用したＲＰＬ１３Ａについて、及びｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５についてｃＤＮＡを作製した。ｍｉｒ－６７５についてｃＤＮＡを生成するために、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって提供されたＲＴ ｍｉｒ－６７５リバースプライマーを使用した。ｍｉ４０５では、ｍｉ４０５ ｑＰＣＲプロトコルは、既に報告されているように行った［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．８：１２１－３０（２０１８）］。ｍｉｒ－６７５及びｍｉ４０５レベルを定量化するために、ＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞から、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）における全ＲＮＡプロトコルを使用して抽出した。ｃＤＮＡは、ランダムヘキサマープライマーと、ｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５及びｍｉｒ－６７５－５ｐに対する特異的リバースプライマーとの混合物を使用して、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して作製した。ｍｉ４０５では、２００ｎＭのステムループ形成プライマー（５’－ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＡＧ－３’）（配列番号１４４）もＲＴステップのために使用した。次に、１．５μＭのフォワードプライマー（５’－ＣＧＧＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＴＣ－３’）（配列番号１４５）、０．７μＭのリバースプライマー（５’－ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ－３’）（配列番号１４６）、及び０．２μＭのｍｉ４０５プローブ（５’－６ＦＡＭ－ＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＴ－３’）（配列番号１４７）を含むカスタムＴａｑＭａｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅシステム装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して実行した。ＲＰＬ１３Ａ（Ｍｍ０２５２６７００＿ｇ１、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が参照遺伝子として機能した。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入したＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス及びＴａｑＭａｎプローブを使用することからなる。１×のプローブを、１×のＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び２０ｎｇのｃＤＮＡと混合した。ｍｉｒ－６７５－及びｍｉ４０５特異的プライマー並びにプローブは、ｍｉｒ－６７５－５ｐ及びｍｉ４０５成熟配列のみを定量化するように設計された（ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックスプロトコルを参照）。
デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）。ｍｉｒ－６７５及びｍｉ４０５構築物について、ＲＮＡ抽出は、上記ＱＰＣＲについて記載のように実行した。ｃＤＮＡ合成のために、ＴａｑＭａｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用し、ｃＤＮＡを製造業者の説明書に従って調製した。ｄｄＰＣＲは、プローブ用の１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ｄＵＴＰなし）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、１×市販ｍｉｒ－６７５ ａｄｖａｎｃｅｄ ＴａｑＭａｎプローブ、又はカスタムメイドｍｉ４０５ ａｄｖａｎｃｅｄ ＴａｑＭａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び５０ｎｇのｃＤＮＡを使用して実行した。ＤＵＸ４ ｃＤＮＡ合成では、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の説明書に従って使用した。同じｃＤＮＡ反応内で、１×ＲＴランダムヘキサマープライマー及び２５ｐｍｏｌのオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、ＤＵＸ４及びＤＵＸ４応答性バイオマーカー、並びに参照遺伝子として使用したマウスＲｐｌ１３ＡについてｃＤＮＡを作製した。ＤＵＸ４を定量化するために、ｄｄＰＣＲ反応混合物（２０μＬ）は、１×ｄｄＰＣＲ Ｅｖａｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、１μＭのフォワード及びリバースＤＵＸ４プライマー（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｓｙｎｄｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１６ Ａｕｇ；７（４）：３０３． ｄｏｉ：１０．４１７２／２１５７－７４１２．１０００３０３．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ａｕｇ ８）、並びに５０ｎｇのｃＤＮＡを含有した。Ｒｐｌ１３Ａ及びＤＵＸ４応答性バイオマーカー（Ｔｒｉｍ３６及びＷｆｄｃ３）を定量化するために、プローブ（ｄＵＴＰなし）及びＴａｑＭａｎ特異的プローブのための１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを、各々の遺伝子について使用した。液滴を、自動液滴生成装置ＱＸ２００ ＡｕｔｏＤＧ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して生成し、反応物を、９６－Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を備えたＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーで増幅した。サイクル条件は、ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲ Ｅｖａｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘプロトコルに従って設定した。全てのアッセイは、５８℃のアニーリング温度に適合する。次いで、液滴を、ＱＸ２００液滴リーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して読み取った。最後に、データは、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して分析した。定量化のために、２０μＬの各反応液は、許容される少なくとも１０，０００滴もたらすと推定された。
小転写ノーザンブロット。（図２Ｂ及び１４も参照。）このブロッティングは、いくつかの修正を加えて［ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００８）１０５（１５）：５８６８－７３］で既に報告されているように行った。ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を使用して、ｍｉＲ－６７５及びＨ１９転写物を過剰発現させた。後者の発現プラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＨＥＫ２９３にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの４８時間後に収集し、ｍｉＲＶＡＮＡ ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の使用説明書に従って使用して溶解した。ｍｉＲＮＡの豊富化は行わなかった。２０μｇを、８Ｍの尿素（４８％、重量／体積）及び１×Ｔｒｉｓ－ホウ酸－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）ＲＮａｓｅフリー溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１５％アクリルアミド－ビスアクリルアミド（１９：１）ゲルに加えた。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ）からのｍｉＲＮＡマーカーをｍｉＲＮＡラダーとして使用し、１：１０で希釈し、サイズ参照として１．５μＬをゲルに加えた。ｍｉＲ－６７５ガイド鎖（ｍｉＲ－６７５－５ｐ）に対して特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを、５’及び３’末端で２つのビオチンタグによって二重標識し、０．３ｐｍｏｌで使用した（ｍｉＲ－６７５－５ｐプローブ：５’ビオチン－ＣＡＣＴＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣＡＣＣＡ－３’ビオチン（配列番号１４８））。次いで、ブロットを、化学発光核酸検出モジュールキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を製造業者の使用説明書に従って使用して明らかにし、化学発光のために最適化されたＨｙｂｌｏｔ ＣＬオートラジオグラフィーフィルムに露光させた。
ウェスタンブロット：（図１Ｂ、２Ｂ、３Ａ、５Ｃ、７、８、１０～１２、１８～２２、２６、２７、及び３３も参照）。ｍｉｒ－６７５及びｍｉＤＵＸ４．４０５によるＤＵＸ４タンパク質発現の阻害を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ及びｍｉｒ－６７５発現プラスミドを様々なモル比で用いて共トランスフェクトした。総タンパク質をトランスフェクションの４８時間後に、緩衝液１０ｍｌ当たり５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５～８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ、０．５％（ｖ／ｖ）のデオキシコール酸、１％（ｖ／ｖ）のｔｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１錠のプロテアーゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液を使用して抽出した。総タンパク質抽出物を、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して定量化した。２０マイクログラムの試料を１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、湿式転写系を使用してニトロセルロース膜に移し、以下の抗体：Ｖ５に対するマウスモノクローナル抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］カップリング）［５％ミルクＴＢＳＴ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１：５，０００）、Ｒ９６１－２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ウサギポリクローナルｅＧＦＰ抗体（３％ＢＳＡ ＰＢＳに１：５０，０００、ａｂ２９０、Ａｂｃａｍ）、マウスモノクローナルβ－アクチン抗体（１：６０，０００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに４℃で一晩インキュベートした。ｅＧＦＰ抗体を使用する場合、膜はブロッティングの前に３％ＢＳＡ ＰＢＳで３０分間ブロッキングした。ｅＧＦＰプローブ化ブロットを、ＴＢＳＴ緩衝液中の０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で各５分間、５回洗浄し、次いで、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（３％ＢＳＡ ＰＢＳに１：２５０，０００、１１５－０３５－１４４、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに室温で２時間インキュベートした。Ｖ５プローブ化ブロットを、ＴＢＳＴ緩衝液中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で各５分間、５回洗浄した。洗浄後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してブロットを展開させ、フィルムに露光した。ＤＵＸ４．Ｖ５、及びｅＧＦＰ定量は、ＩｍａｇｅＪを使用して評価した。
Ｃｄｃ６タンパク質を検出するウェスタンブロット。（図２６も参照）ｍｉｒ－６７５及びＨ１９によるＣｄｃ６タンパク質発現の阻害を評価するために、トランスフェクトした１５Ａ ＦＳＨＤ筋芽細胞を、ｍｉｒ－６７５又はＨ１９発現プラスミドのいずれかでトランスフェクトし、筋芽細胞を７日間分化させた。Ｃｄｃ６ウサギモノクローナル抗体（Ｃ４２Ｆ７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を５％ＢＳＡ ＴＢＳＴ緩衝液に１：５００希釈で使用して、Ｃｄｃ６を検出した。Ｃｄｃ６プローブ化ブロットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＴＢＳＴ緩衝液で各１０分間、３回洗浄し、次いで、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（５％ＢＳＡ ＴＢＳＴ緩衝液で１：１００，０００）とともに室温で２時間インキュベートした。ＩｍａｇｅＪを使用してタンパク質レベルを定量化した。
アルファ－チューブリン（α－チューブリン）タンパク質を検出するウェスタンブロット。（図２７及び３３も参照）アルファ－チューブリン（α－チューブリン）タンパク質を、α－チューブリンウサギポリクローナル抗体（５％ミルクＴＢＳＴ緩衝液で１：５００、ａｂ１５２４６、Ａｂｃａｍ）を使用して検出した。アルファ－チューブリン－プローブ化ブロットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＴＢＳＴ緩衝液で各５分間、５回洗浄し、次いで、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（５％ミルクＴＢＳＴ緩衝液で１：１００，０００）とともに室温で２時間インキュベートした。全てのブロットは、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理した後、それらをＸ線フィルムに露光することによって現像した。ＩｍａｇｅＪを使用してタンパク質レベルを定量化した。
β－アクチンタンパク質を検出するウェスタンブロット。（図２７及び３３も参照）β－アクチンタンパク質は、マウスで産生されたモノクローナル抗体（５％ミルクＴＢＳＴ緩衝液で１：１０００、ＳＩＧＭＡ）を使用して検出した。ＩｍａｇｅＪを使用してタンパク質レベルを定量化した。
アポトーシスアッセイ。
ＨＥＫ２９３細胞におけるアポトーシス。ＨＥＫ２９３細胞におけるカスパーゼ３／７活性を測定するために、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、ｍｉｒ－６７５又はＨ１９発現プラスミド及びＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ ＷＴ発現プラスミド（ＣＭＶ．ｅＧＦＰを包含しない）で共トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞は、Ａｐｏ－ＯＮＥ（登録商標）ホモジニアスカスパーゼ－３／７アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明書に従って処理した。カスパーゼ３／７活性（ＲＦＵ）を蛍光マイクロプレートリーダーを使用して測定した。
ヒト筋芽細胞におけるアポトーシス。ヒト筋芽細胞におけるカスパーゼ３／７活性を測定するために、高効率エレクトロポレーションプロトコルを使用して、ｍｉｒ－６７５、Ｈ１９発現プラスミド、又はｍｉｒ－６７５アンタゴミル（抗ｍｉｒ－６７５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をこれらの細胞にエレクトロポレーションし、それらの増殖培地（ＬＨＣＮ培地）で２４時間回復させてから、ＫＯＳＲ（ＤＵＸ４発現を誘導する（７９））補充した分化培地を使用して分化を開始した。次いで、細胞を７日間分化させてから、カスパーゼ３／７活性を読み取った。
アルカリコメットアッセイ。ＨＥＫ２９３細胞を、上記で本明細書に記載されるアポトーシスアッセイと同様に共トランスフェクトし、トランスフェクトの２４又は４８時間後に収集した。アルカリコメットアッセイは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：９０－１０３（２０１４））及びＤｍｉｔｒｉｅｖ ｅｔ ａｌ．（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．９９：２４４－２５８（２０１６））で既に報告されているように実行し、ホルムアミドピリミジンＤＮＡ－グリコシラーゼ（ＦＰＧ）酵素処理は伴わなかった。ＤＮＡ損傷の定量化のために、Ｔｒｉｔｅｋ ＣｏｍｅｔＳｃｏｒｅソフトウェアを使用して、無作為に選択した非重複細胞の１０画像を分析した。ＤＮＡ損傷の程度を評価するために、コメット尾部モーメント（尾部長に尾部強度を乗じた尺度）を各核について測定し、３０～６０個の核の平均コメット尾部モーメントとして値を表した。
フローサイトメトリー。生存率では、細胞は、１：１００希釈のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）固定可能な近赤外線染色を含有するＰＢＳ中に懸濁させた。細胞を室温で３０分間インキュベートし、１％ホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。次いで、細胞を１回洗浄し、フローサイトメトリー分析の前に、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中に０．１％アジ化ナトリウムを添加した２％ＦＢＳ）中に再懸濁させた。生細胞は、６３３ｎｍの励起波長でＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）固定可能な近赤外線染色でそれらを染色することによってゲーティングした。４８８ｎｍの励起波長を使用してＧＦＰ蛍光シグナルを発現する生細胞をゲーティングした。全ての試料を、Ｂｅｈｅｍｏｔｈ ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。ＧＦＰ陽性細胞の割合は、フローサイトメーターソフトウェアＦｌｏｗＪｏを使用して、総生細胞数に基づいて計算した。
マウスへのＡＡＶベクター送達。（図１５Ａ～Ｂ及び図３２Ａ～Ｂも参照）生物活性を決定するために、６～９週齢のＣ５７ＢＬ／６雄及び雌マウスは、ＴＡに直接３５μＬのＩＭ注射を受けた。マウスは、１×１０１０ＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）のｓｃＡＡＶ６．ＣＭＶ．ｅＧＦＰとともに同時注射した５×１０９ＤＲＰのアデノ随伴ウイルスｓｃＡＡＶ６．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ、並びに１×１０９ＤＲＰ又は５×１０９ＤＲＰのｓｃＡＡＶ６．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ、及び５×１０１０ＤＲＰのｓｃＡＡＶ６．Ｕ６．ｍｉｒ－６７５の対側同時注射を受けた。ｍｉｒ－６７５の毒性を試験するために、前脛骨筋（ＴＡ）に、５×１０１０ＤＲＰ及び１×１０１１ＤＲＰの増加する用量のｓｃＡＡＶ６．Ｕ６．ｍｉｒ－６７５で筋肉内注射し、対側ＴＡに生理食塩水を注射した。ｍｉ４０５の毒性を試験するために、ＴＡに、５×１０８ＤＲＰ、５×１０９ＤＲＰ、及び５×１０１０ＤＲＰのｓｃＡＡＶ６．Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、ｓｃＡＡＶ６．Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、又はｓｃＡＡＶ６．Ｕ６．ｍｉ４０５Ｈを筋肉内に注射し、対側ＴＡに生理食塩水を注射した。ｍｉ４０５阻害効率を試験するために、ＴＡを、５×１０９ＤＲＰのｓｃＡＡＶ６．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬと、５×１０８ＤＲＰ、５×１０９ＤＲＰ、又は５×１０１０ＤＲＰのｓｃＡＡＶ６．Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｇ、又はＨとともに同時注射した。このために、５×１０９ＤＲＰのｓｃＡＡＶ６．Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｇ、若しくはＨ、又はｓｃＡＡＶ６．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬのいずれかの対側注射を実行した。ｍｉ４０５について、全ての注射をｓｃＡＡＶ６．Ｕ６．ｍｉ４０５と比較した。注射の２、４、又は８週間後に筋肉を採取した。全ての動物試験は、実験動物の管理と使用に関するＮＩＨ指針（ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従って行った。
組織学。（図１５Ａ～Ｂ及び図３２Ａ～Ｂも参照）解剖したＴＡ筋肉をＯ．Ｃ．Ｔに配置した。化合物（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）を、液体窒素で冷却したイソペンタン上で凍結させる。凍結切片を１０μｍで切断し、次いで標準プロトコルに従ってＨ＆Ｅで染色した［Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ（２００２）８（３）：２５３－６１］。
インサイチュ免疫蛍光。（図１５Ａ～Ｂ及び３２Ａ～Ｂも参照。）ＤＵＸ４タンパク質の遺伝子発現及び細胞内局在は、［Ｇｉｅｓｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ（２０１８）３（２２）：ｅ１２３５３８］で既に報告されているようにＶ５免疫蛍光を使用して可視化した。
実施例２
Ｕ６ｍｉｒ－６７５構築物（Ｕ６．ｍｉｒ－６７５）は、ＤＵＸ４を標的とし、低下した効率でＤＵＸ４発現を阻害する。
ｍｉｒ－６７５は、ＤＵＸ４を標的としてその発現を阻害する能力を有し、デュアル－ルシフェラーゼアッセイ及びウェスタンブロットを使用することによって示される（図１Ａ～Ｂ、２Ａ～Ｂ、７、８、１５Ａ～Ｂ、１６Ａ～Ｃ、１８～２３Ａ、及び２７）。両方のアッセイについて、潜在的に保持されるイントロンを含む、全てのＤＵＸ４ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列（ＯＲＦ及び３’ＵＴＲ）を含むＤＵＸ４構築物（ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４－ＦＬ、式中、ＦＬ＝全長）を使用した。次いで、共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＤＵＸ４をサイレンシングさせるｍｉｒ－６７５の能力を試験した。ｍｉｒ－６７５は、Ｕ６プロモーター駆動ｍｉｒ－６７５発現プラスミド（Ｕ６．ｍｉｒ－６７５）を使用して細胞に送達した（図１Ａ）。この構築物は、人工的に設計されたｍｉＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをクローニングするために以前に使用されたように、Ｕ６ベースの発現カセットを使用してクローニングした［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｊｕｌ；２０（７）：１４１７－１４２３］。したがって、その５’末端に隣接配列４０ヌクレオチド、及び３’末端に４７ヌクレオチドを有する。図１Ａに示されるように、これらの配列は、塩基対形成して、ステムループ構造を形成することができる。トランスフェクションの４８時間後、ウミシイタケ及びホタルルシフェラーゼ活性の両方を測定した。最初に、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５は、非標的化ＲｅｎＬｕｃ対照骨格プラスミド（ＲｅｎＬｕｃ）からの相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を低下することができなかった。しかしながら、ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４－ＦＬと共トランスフェクトした場合、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５は、用量依存的に相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を低下させることができた。結果として、ｍｉｒ－６７５は、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５：ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４－ＦＬ（ｎ：ｎ）が１０対１、２０対１、又は４０対１のモル比で、それぞれ２４±３％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、２８±２％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、及び３３±３％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させた（図１Ａ）。ルシフェラーゼアッセイに続いて、ＤＵＸ４発現のｍｉｒ－６７５媒介性サイレンシングは、ｍｉｒ－６７５又はＨ１９（ｍｉｒ－６７５前駆体）及びＤＵＸ４－ＦＬ野生型ｍＲＮＡ配列及びＤＵＸ４タンパク質を過剰発現する共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から抽出された総タンパク質でのウェスタンブロットを使用して確証された（図２Ａ～Ｂ、７、８、１５Ａ～Ｂ、及び１８～２２）。結果として、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５又はＣＭＶ．Ｈ１９、並びにＤＵＸ４ ＯＲＦ（ＤＵＸ４タンパク質ＣＯＯＨ末端に融合された）及びＤＵＸ４ ３’ＵＴＲ配列を下流にクローニングした改変Ｖ５エピトープ配列［Ａｎｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊａｎｕａｒｙ ２７，２０１６、ｈｔｔｐｓ－ｃｏｌｏｎ－ｓｌａｓｈ－ｓｌａｓｈ－ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４６８９３］を包含するＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ発現プラスミドとの共トランスフェクションの２４時間後に、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５及びＣＭＶ．Ｈ１９は、ＤＵＸ４タンパク質レベルをそれぞれ４６±１１％（Ｐ＜０．０２、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）及び４８±１２％（Ｐ＜０．０２、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させた（図１Ｂ及び図７）。これらの結果は、その標的部位に対して通常弱い塩基対形成を有する天然ｍｉＲＮＡについて有意であったが、それは通常、約２０～６０％の阻害効率が天然ｍｉＲＮＡで達成されるためである［Ｍｉｙａｍｏｔｏ－Ｍｉｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．３７：４１１－４１７（２０２０）、Ｄｕｓｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３４１８－２６（２０１５）、Ｓａｅｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９：７４５９－６５（２００９）、Ｃｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３８：８１３－８（２００６）、Ｍｅｎｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４１：６０９－１３（２００９）］。分子ビーコン結合アッセイ（ＭＢＢアッセイ）は、ｍｉｒ－６７５がＤＵＸ４ ＯＲＦ及び３’ＵＴＲの部位を高効率で標的とすることを示し（図１３Ａ～Ｃ及び３１Ａ～Ｃ）、ＤＵＸ４発現の比較的非常に高い阻害効率を説明する。しかしながら、５０％の阻害効率でさえ、ｍｉｒ－６７５をＦＳＨＤの治療に移す能力は最小限であり得る。したがって、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５発現プラスミドは、効率的に発現し、ｍｉｒ－６７５－５ｐ及びｍｉｒ－６７５－３ｐ成熟配列の両方の最適な処理を可能にするように合理的に設計されていない可能性があることが推論された。したがって、より効率的に発現し、ＤＵＸ４発現のより高い阻害効率に到達することを目的として、ｍｉｒ－６７５のより優れたプロセシングを可能にし得る市販のｍｉｒ－６７５発現プラスミドが求められた。したがって、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５（ＳＢＩ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を特定して試験し、それは、ＤＵＸ４発現のより高い阻害効率を示し、ノーザンブロットを使用して示されたように、より優れて処理された（図１４）。しかしながら、Ｃ５７ＢＬ／６前脛骨筋（ＴＡ）筋肉の筋肉内注射を使用してインビボで試験した場合、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５構築物を発現するｓｃＡＡＶ６．ｍｉｒ－６７５は、筋肉毒性を示した（データは示さず）。したがって、ＦＳＨＤのための実行可能なｍｉＲＮＡベースの遺伝子治療としてｍｉｒ－６７５を移す目的のため、更なるｍｉｒ－６７５発現カセットを、より優れたプロセシングのため、及びＤＵＸ４発現を阻害してＤＵＸ４誘導性毒性を低減させるｍｉｒ－６７５の効力を増加させるために、５’及び３’末端の隣接配列を変更することによって設計及び試験した。
実施例３
インビトロでのＤＵＸ４タンパク質レベルの阻害
多くの以前の刊行物は、良好なｍｉＲＮＡプロセシング及び発現に関連する構造及びモチーフを特定及び検証している（例えば、Ｔｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：５－２０（２０１９）を参照）。重要な構造及びモチーフのいくつかは、ｍｉＲＮＡのステムループ構造から分岐する５’及び３’末端隣接配列に存在する。例として「ＵＧ」ジヌクレオチドモチーフは、通常、５’ｍｉＲＮＡ鎖のＤｒｏｓｈａ切断部位から約１１塩基対の基底ステムに見出される。３’末端には、マイクロプロセッサによる切断を促進するために必要であると考えられる単一の「ＣＮＮＣ」ＳＲＳＦ３モチーフがある。これらの構造及びモチーフは高度に保存されているが、これらの構造及びモチーフのいくつかが存在せずにｍｉＲＮＡプロセシング及び発現を可能にする多くの例外が存在する。例えば、ｍｉｒ－６７５は、「ＵＧ」モチーフなどのこれらのモチーフが存在せずに、機能的ｍｉＲＮＡとしてプロセシング及び発現することができる。加えて、ｍｉｒ－６７５構造は、そのループの３’末端に、「ＵＧＧＵＧ」（配列番号１５０）に相応しい縮重した「ＵＧＵＧ」（配列番号１４９）ＤＧＣＲ８結合モチーフを包含し、理想的な３５ヌクレオチドの代わりに３３を有するより小さなステムによって形成される。ｍｉｒ－６７５はまた、不一致の「ＧＨＧ」モチーフを欠いており、複数の「ＣＮＮＣ」（配列番号１５１）ＳＲＳＦ３モチーフのいずれかの不存在又は存在下で発現され、ＤＵＸ４発現の阻害が可能であった（図２Ａ）。したがって、これらのモチーフのいくつかをｍｉｒ－６７５構造に加えることによって、ｍｉｒ－６７５プロセシング、発現、及び阻害効力が増強されると仮定された。
したがって、ステムループ構造の５’及び３’末端に９つの異なる隣接配列を包含する１４例のｍｉｒ－６７５構築物（図２Ａ）が設計された。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５を除く全ての構築物は、ｍｉｒ－６７５基底ステムの３’末端の下流に単一の「ＣＮＮＣ」モチーフ、３（Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５－２．２、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．３、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５－２．４、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．５、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－２．６）又は４（Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．３．１、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈ）ヌクレオチドを包含した。Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２は、類似の隣接配列を有するが、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、又はプロモーターの上流の追加の構造、すなわち、標的細胞感染中にＨＩＶレンチウイルスゲノムの核輸入を可能にする「ＤＮＡフラップ」を生成する中央ポリプリン配列／中央終結配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）を包含するＨ１．ｍｉｒ－６７５及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２の存在において異なる。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１及びＨ１．ｍｉｒ－６７５－２．２も同様の隣接配列を有するが、２つの異なるプロモーター（Ｕ６又はＨ１）から発現される。同様の事例は、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．３及びＨ１．ｍｉｒ－６７５－２．４で示される。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５ＮＦは、隣接配列を有しない。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５－２．２、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．５、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－２．３．１は、それらのステムループ構造の基部に「ＵＧ」Ｄｒｏｓｈａ認識モチーフを有する。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈに関しては、「ＵＡ」（枠囲い）ジヌクレオチドは、縮重Ｄｒｏｓｈａ認識部位を表し得る。全ての構築物について、隣接配列を設計するとき、それに応じてヌクレオチド配列を調整することによって、配列間に任意の塩基対形成構造を作製しないことを確実にした。
これらの構築物の阻害効率を評価するために、Ｈ１／Ｕ６．ｍｉｒ－６７５及びＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰ（全長ＤＵＸ４（ＯＲＦ＋３’ＵＴＲ）及びｅＧＦＰを共発現する）発現プラスミドで共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞から抽出された総タンパク質を使用したウェスタンブロットを実行した。１３例のｍｉｒ－６７５構築物は全て、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５（４３±４％、Ｎ＝６）よりも優れた阻害効率を示した（図２Ｂ、表２、及び図８）。
概して、Ｕ６制御したｍｉｒ－６７５は、Ｈ１制御したｍｉｒ－６７５構築物よりも良好な阻害効率を示した。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈは、それぞれ、８３±３（Ｎ＝３の独立した反復）及び８９±６（Ｎ＝３の独立した反復）の阻害効率を有し、ＤＵＸ４タンパク質レベルの最も高い阻害効率を有した（Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３～８の独立した反復）。ノーザンブロット結果は、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５ＮＦ、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．２、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１のみが、２１～２５ｍｅｒの範囲のサイズで検出可能なｍｉｒ－６７５成熟配列を有することを示した。これらの６例の構築物のうち４例は、典型的なｍｉＲＮＡプロセシングプロファイルを示した［Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６１：１３７４－８７（２０１５）］。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５ＮＦ及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２のみが、追加の処理したバンド：２１ｍｅｒ未満のサイズを有する１つのバンド、及び２５ｍｅｒに近いサイズを有する追加の１つのバンドを示した。加えて、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５ＮＦ、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１は、２１～２５ｍｅｒのサイズのバンドを示し、これは、ｍｉｒ－６７５－５ｐ成熟配列の２３ｍｅｒの予想されたサイズに対応し得る（図２Ｂ）。
このｍｉｒ－６７５成熟配列（ＵＧＧＵＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＣＡＧＵＧ（配列番号１５２））の発現を定量化するために、ＱＲＴ－ＰＣＲを実行し、核酸レベルを、ＨＥＫ２９３細胞へのＨ１／Ｕ６．ｍｉｒ－６７５構築物のトランスフェクション後に一次ｍｉｒ－６７５配列（ｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５）のレベルと比較した。Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．３．１、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈは、ｍｉｒ－６７５－５ｐレベルを、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５から発現したレベルよりも、それぞれ、２３２±３５％（Ｐ＜０．０００２、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した実験）、８８２±１０８％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、２８２±３４％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、２４１±２９％（Ｐ＜０．０００３、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、及び７７４±９３％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）倍高く発現した。ｍｉｒ－６７５－５ｐ／ｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５の比率を比較したとき、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈが最も高い相対的なｍｉｒ－６７５－５ｐ発現を、それぞれ、９１８±１６９％、２０７±３８％、及び３０３±５７％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）の倍率変化で示し、これらの構築物が、ｍｉｒ－６７５－５ｐ成熟配列へのｐｒｉ－ｍｉｒ－６７５の高いプロセシングを可能にすることを示した（図９Ａ～Ｂ）。しかしながら、ｍｉＲｂａｓｅデータベース（ｈｔｔｐ－ｃｏｌｏｎ－ｆｏｒｗａｒｄ ｓｌａｓｈ－ｆｏｒｗａｒｄ ｓｌａｓｈ－ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｍｉｒｎａ＿ｅｎｔｒｙ．ｐｌ？ａｃｃ＝ＭＩ０００５４１６）で見出されたディープ配列決定読み取りは、１６～２３ｍｅｒの範囲のサイズの複数の処理された成熟ｍｉｒ－６７５－５ｐ配列の存在を示した。
これら全ての成熟配列のレベルを定量化するために、ＴａｑＭａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡプローブを使用して定量化することができるｃＤＮＡテンプレートを合成するためにユニバーサル逆転写（ＲＴ）化学を使用するＴａｑＭａｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ合成方法を使用した。この方法では、処理した成熟ｍｉＲＮＡ配列のほとんどを定量した。結果として、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．３．１、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈは、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５と比較したとき、それぞれ、２１３±５１％（Ｐ＜０．０１４、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、１８７±４０％（Ｐ＜０．０２４、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、及び２０１±３８％（Ｐ＜０．００７４、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）の倍率変化で最も高いレベルを示した（図９Ａ～Ｂ）。１４例のｍｉｒ－６７５構築物のうちの２例（Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－２．１．１及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｈ）は、インビトロでＤＵＸ４タンパク質レベルの最も高い阻害効率を示した（図２Ａ～Ｂ及び８）。
実施例４
ｍｉ４０５の阻害効率は、５’及び３’末端隣接配列を変更することによって増加したが、他のｍｉＤＵＸ４では増加しなかった。
発現カセットの５’及び３’末端隣接配列の変更を介したｍｉｒ－６７５の阻害効率の増加における成功に続いて、同じ戦略をＦＳＨＤのためのｍｉＲＮＡベースの遺伝子療法として開発されている人工的に設計されたｍｉＤＵＸ４（ｍｉ４０５）ｍｉＲＮＡに適用した［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８ Ｍａｒ １６；８：１２１－１３０］。このｍｉＲＮＡ（Ｕ６．ｍｉ４０５）は、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５発現プラスミドに見出されたのと同じ隣接配列を有する。
したがって、２つの新規ｍｉ４０５構築物、すなわち、ｍｉ４０５Ｆ及びｍｉ４０５ＮＦを設計した。第１の構築物、ｍｉ４０５Ｆは、ステムループ構造の５’末端に隣接配列を欠き（Ｕ６転写開始部位のための１つの「Ｇ」ヌクレオチドのみ）、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ、及びＵ６．ｍｉｒ－６７５Ｆ２と同様である単一の「ＣＮＮＣ」（配列番号１５１）モチーフを有する１６ｍｅｒ長の３’末端隣接配列を有する。第２の構築物、ｍｉ４０５ＮＦは、５’末端に１つの「Ｇ」ヌクレオチドのみを有し、３’末端に隣接配列を有しない（図３Ａ）。３つのｍｉ４０５構築物の阻害効率を評価するために、ｍｉｒ－６７５について記載されたものと同様に、デュアル－ルシフェラーゼアッセイ及びウェスタンブロット分析を実行した。デュアル－ルシフェラーゼアッセイでは、Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、又はＵ６．ｍｉ４０５ＮＦをＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４ ＯＲＦ（ＤＵＸ４のオープンリーディングフレームをウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲ配列として発現する構築物）と一緒にＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、及びＵ６．ｍｉ４０５ＮＦは、ＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４ ＯＲＦ構築物に対して試験したとき、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、それぞれ８５±１％、８９±１％、及び６６±１％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させた。加えて、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆは、１：４のＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比で試験したとき、Ｕ６．ｍｉ４０５よりも有意に高い阻害効率を実証した（Ｐ＜０．０４ ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した実験）。ウェスタンブロット分析は、同様のトランスフェクション条件下で、Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、及びＵ６．ｍｉ４０５ＮＦがＤＵＸ４タンパク質レベルを、それぞれ、７９±１％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝２の独立した実験）、９９±１％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝２）、及び７０±１３％（Ｐ＜０．００３６、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝２）低下させたことを示した。同様に、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆは最も効率的であり、Ｕ６．ｍｉ４０５と比較したとき平均２０％の阻害効率の増加を示した（Ｐ＜０．００７９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝２）（図３Ａ及び図１０）。
Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆでの成功に続いて、ＤＵＸ４発現を阻害する際にｍｉ４０５よりも効率が低かった他の人工的に設計したｍｉＤＵＸ４の阻害効率について、新たな隣接配列の効果を試験した［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．２０１８ Ｍａｒ １６；８：１２１－１３０］。それらの阻害効率における向上を得ることを期待して、１０例のｍｉＤＵＸ４を、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆで使用したのと同じ隣接配列を使用してクローニングした。それらの阻害効率は、デュアル－ルシフェラーゼアッセイを使用して試験した（図４Ａ～Ｂ）。驚くべきことに、１０例のｍｉＤＵＸ４Ｆ構築物のいずれも、その阻害効率が向上しなかった。それどころか、ｍｉ１８５Ｆ、ｍｉ１８６Ｆ、ｍｉ３１８Ｆ、ｍｉ５９９Ｆ、ｍｉ１１５６Ｆ、及びｍｉ１３１１Ｆの阻害効率は、それらの元の対応物と比較したとき、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性におけるそれぞれ１６０±８％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、２７±９％（Ｐ＜０．０２６、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、４４±１５％（Ｐ＜０．０１８、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、２４±９％、（Ｐ＜０．０３９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、３４±８％（Ｐ＜０．００７１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、及び２７±９％（Ｐ＜０．０２１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）の増加によって示されるように、減少した。
共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるｍｉＤＵＸ４レベルの増加は、ｍｉ７０Ｆ、ｍｉ３１８、ｍｉ３１８Ｆ、ｍｉ３３３、ｍｉ５９９、ｍｉ５９９Ｆ、ｍｉ１１５５、及びｍｉ１１５５Ｆを除く、試験したｍｉＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡのほとんどの阻害効率において用量依存的増加を示した（図４Ａ）。加えて、ＤＵＸ４対ｍｉＤＵＸ４が１：４を超えるモル比では、ｍｉＤＵＸ４Ｆ ｍｉＲＮＡのいずれも、その同族よりも良好に行われなかったが、例外となるｍｉ４０５Ｆは、全ての比で増強された阻害効率を示した。後者は、１：１、１：２、１：３、及び１：４の比率で、それぞれ相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性の３３±２％、３２±２％、３４±１％、及び３２±１％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した反復）の減少によって表された。
次に、ＨＥＫ２９３細胞におけるデュアル－ルシフェラーゼアッセイを使用して、ｍｉ４０５Ｆについて用量漸減試験を実行した（図４Ｂ）。３つのｍｉＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ構築物、すなわち、Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５ＮＦ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｆを試験したとき、１：４から４０：１へのＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比の増加は、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性の用量依存的な増加をもたらした。Ｕ６．ｍｉ４０５ＮＦは、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性の有意な増加を７３±７％（Ｐ＜０．００９４、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）で示し、１：２のモル比から１：１のＤＵＸ４：ｍｉＤＵＸ４に切り替えると、８８±３％に達した。興味深いことに、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆは、４０：１のＤＵＸ４：ｍｉＤＵＸ４のモル比でさえ、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を依然として低下させることができ、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を低下させることにおいて、Ｕ６．ｍｉ４０５よりも１３±２％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）効率的だった。Ｕ６．ｍｉ４０５とＵ６．ｍｉ４０５Ｆとの間の最大の差は、８：１のＤＵＸ４：ｍｉＤＵＸ４モル比で観察され、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆは、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を減少させる際に４８±６％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）より効率的であり、３８±２％に達した（図４Ｂ）
実施例５
ｍｉ４０５ステムループ構造に隣接する５’及び３’末端配列の変更は、ｍｉＲＮＡのサイレンシング効率及び発現に影響を与えた。
ｍｉ４０５Ｆの阻害効率と、ｍｉ７０Ｆ、ｍｉ１８５Ｆ、ｍｉ１８６Ｆ、ｍｉ３１８Ｆ、ｍｉ３３３Ｆ、ｍｉ５９９Ｆ、ｍｉ１１５５Ｆ、ｍｉ１１５６Ｆ、ｍｉ１２３０Ｆ、及びｍｉ１３１１Ｆの阻害効率との間の相違は、ｍｉＲＮＡの阻害効率を向上させることが、その５’及び３’末端の隣接配列に関連するだけでなく、ｍｉＲＮＡ配列にも依存することを示唆した（図３Ａ～Ｂ）。ｍｉ４０５を除き、他のｍｉＤＵＸ４の５’及び３’末端隣接をｍｉ４０５Ｆのものと置き換えることが、それらの阻害効率を向上させなかったため、他の隣接配列を使用することによって実際の結果が変更されることを示唆する根拠はなかった。したがって、リードｍｉＲＮＡ ｍｉ４０５に焦点を当てて、その阻害効率の向上に関与する配列を特定した。Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５ＮＦ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｆに加えて、７例の追加の構築物、すなわち、Ｕ６．ｍｉ４０５Ａ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｂ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｃ，Ｕ６．ｍｉ４０５Ｄ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｅ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈ（図５Ａ）を設計した。
ステムループ構造から分岐する隣接配列において、「ＵＡ」モチーフが、５’末端隣接配列に見出されるＤｒｏｓｈａ認識部位の可能性があるとして、及び３’末端隣接配列に見出される「ＣＮＮＣ」（配列番号１５１）ＳＲＳＦ３モチーフに焦点が当てられた。Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ａ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｂ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈなどの構築物は、「ＵＡ」モチーフを有する。Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ａ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｃ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｄ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｅ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、１つ又は複数の「ＣＮＮＣ」（配列番号１５１）モチーフを有する（図５Ａ）。加えて、Ｕ６．ｍｉ４０５ＮＦなどのいくつかの構築物は、隣接配列を欠いている。これらの構築物全てをＵ６発現プラスミドにクローニングし、デュアルルシフェラーゼアッセイを使用してそれらの阻害効率について試験した。
したがって、Ｕ６．ｍｉ４０５及びＲｅｎＬｕｃ－ＤＵＸ４ ＯＲＦ発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に、２対１のＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比で共トランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を使用して測定した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性をそれぞれ、４±２％（Ｐ＞０．８０、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）及び２５±３（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させたＵ６．ｍｉ４０５ＮＦ及びＵ６．ｍｉ４０５Ｂを除き、全てのＵ６．ｍｉ４０５構築物が、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性を効率的に低下させた。しかしながら、Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ａ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｃ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｄ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｅ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性をそれぞれ６２±２％、７２±１％、６４±１％、７１±１％、７３±１％、７７±１％、８１±１％、８０±１％低下させた（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）。興味深いことに、２対１のＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比では、他のＵ６．ｍｉ４０５構築物のいずれも、相対ウミシイタケルシフェラーゼ活性の阻害においてＵ６．ｍｉ４０５Ｆより有意に強力ではなかった（図５Ｂ）。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈのみが、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆと比較したとき、それらの阻害効率に最小限の増強を示していた。したがって、ＨＥＫ２９３細胞において２４時間共トランスフェクトした同じＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比を使用したウェスタンブロット分析を使用して、それらの活性を更に試験することが決定された。発現プラスミドとして、ｍｉＲＮＡ陰性対照Ｕ６．ｍｉＧＦＰを使用した。Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、又はＵ６．ｍｉ４０５Ｈもまた、ｍｉ４０５を発現するために使用した。ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬ／ＣＭＶ．ｅＧＦＰを使用して、ＤＵＸ４－ＦＬ及びｅＧＦＰを発現させた。
Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、Ｕ６．ｍｉＧＦＰと比較したとき、ＤＵＸ４タンパク質レベルをそれぞれ８１±９％、８８±２％、及び７９±６％低下させた（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した反復）（図１１）。しかしながら、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆよりも有意に効率的ではなかった。したがって、ＤＵＸ４：ｍｉ４０５モル比を１２対１に増加させ、デュアルルシフェラーゼアッセイ及びウェスタンブロットを使用して３つのｍｉ４０５構築物を用いて再試験した（図５Ｂ～Ｃ）。デュアルルシフェラーゼアッセイは、本明細書に上記されるように実行した。結果として、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆと比較した場合、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、それぞれ、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を更に２６±５％（Ｐ＜０．０３３、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）及び２５±６％（Ｐ＜０．０４２、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させた（図１１）。これらの結果と併せて、ウェスタンブロット結果は、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈが、Ｕ６．ｍｉ４０５と比較して、ＤＵＸ４タンパク質レベルの有意な低下を４０±５％（Ｐ＜０．０２０９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）、７１±５％（Ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）、及び６０±８％（Ｐ＜０．０００９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）で誘導したことを示した。加えて、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆと比較したとき、ＤＵＸ４タンパク質レベルの有意な低下を５２±９％（Ｐ＜０．０００９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）及び３３±１４％（Ｐ＜０．０４９８、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）で誘導した（図５Ｃ及び図１２）。
ｍｉ４０５の阻害効率に対する効果とは別に、ｍｉＲＮＡの発現に対する隣接配列の効果も試験した。したがって、処理された成熟ｍｉ４０５配列の発現は、標準及びａｄｖａｎｃｅｄ ＴａｑＭａｎ ｃＤＮＡ合成反応を使用して定量化した。前者の反応では、リバースプライマーは、ステムループプライマーベースの小分子ＲＮＡ検出原理（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、成熟ｍｉ４０５配列を検出する（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ（２０１３）１９：１－１０）。次いで、ｍｉ４０５成熟配列とリバースプライマー配列との間の接合部で塩基対を形成するｍｉ４０５に特異的な標準ＴａｑＭａｎプローブを使用して、増幅及び定量ステップを行った（図６Ａ）。結果として、標準ＴａｑＭａｎ ｃＤＮＡ合成反応を使用して生成された全てのＵ６．ｍｉ４０５構築物からのｃＤＮＡで行ったＱＰＣＲ分析は、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｂ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｃが、Ｕ６．ｍｉ４０５と比較して、それぞれ、それらの成熟ｍｉ４０５配列よりも８５±５％（Ｐ＜０．００１９、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した反復）、７１±９％（Ｐ＜０．００３８、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝４）、及び６３±２７％（Ｐ＜０．０１３３、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）少ないか又は低い発現を有したことを示した。しかしながら、Ｕ６．ｍｉ４０５と比較するとき、Ｕ６．ｍｉ４０５Ａ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｄ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｅ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈから生じる成熟ｍｉ４０５配列のレベルは、統計的に有意ではない差で、より大きいか又はより高かった（Ｐ＞０．０５、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３～４の独立した実験）（図６Ａ）。ＴａｑＭａｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ合成反応では、成熟配列は、５’末端でのアダプタ配列の連結を介して、及び成熟ｍｉ４０５配列の３’末端でのポリＡ尾部の酵素的付加を介して伸長される。次に、通常、成熟ｍｉＲＮＡの３’末端及びアダプタ配列の一部と塩基対形成するｍｉ４０５に対して特異的なＴａｑＭａｎ ａｄｖａｎｃｅｄプローブを使用して、増幅及び定量ステップを行った。ここで、ｍｉ４０５の成熟配列（図６Ｂ）とのみ塩基対形成する追加のＴａｑＭａｎ ａｄｖａｎｃｅｄプローブ（埋め込みプローブ）を使用した。結果として、ＴａｑＭａｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃＤＮＡ合成反応後、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を行って、ｍｉ４０５、ｍｉ４０５Ｆ、ｍｉ４０５Ｂ、ｍｉ４０５Ｃ、ｍｉ４０５Ｇ、及びｍｉ４０５Ｈの発現レベルを定量した。これには、ＴａｑＭａｎ ａｄｖａｎｃｅｄ埋め込みプローブ及び重複ｍｉ４０５プローブ（図６Ｂ）を使用した。結果として、全ての試験したＵ６．ｍｉ４０５構築物は、同様のレベルで成熟ｍｉ４０５配列を生成したが、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｃ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈは、統計的に有意ではない、より高いレベルを示した。
実施例６
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡは、ＦＳＨＤのマウスモデルにおけるＤＵＸ４活性化バイオマーカーの発現を減少させる
本開示のＤＵＸ４ｍｉＲＮＡ構築物を含むＡＡＶを、新しいＦＳＨＤマウスモデル（ＴＩＣ－ＤＵＸ４）又はＦＳＨＤマウスの任意の他のマウスモデルに、筋肉内（ＩＭ）又は静脈内（ＩＶ）で注射する。４、８、１２、１６、２０、及び２４週間後、Ｗｆｄｃ３又はＴｒｉｍ３６などのＤＵＸ４バイオマーカーの発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｓｃｏｐｅ、又はｄｄＰＣＲによって測定する。
ＤＵＸ４バイオマーカー発現のレベルの低下が、未処置マウスの筋肉のレベルと比較して、ＤＵＸ４ｍｉＲＮＡで処置したマウスの筋肉で観察される。
実施例７
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡは、ＦＳＨＤのマウスモデルにおける筋肉中の内因性ＤＵＸ４発現を減少させる
本開示のＤＵＸ４ｍｉＲＮＡ構築物を含むＡＡＶを、新しいＦＳＨＤマウスモデル（ＴＩＣ－ＤＵＸ４）又はＦＳＨＤマウスの任意の他のマウスモデルに、筋肉内（ＩＭ）又は静脈内（ＩＶ）で注射する。４、８、１２、１６、２０、及び２４週間後、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡの発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｓｃｏｐｅ、又はｄｄＰＣＲによって測定する。
ＤＵＸ４ ｍＲＮＡのレベルの低下が、未処理マウスの筋肉のレベルと比較して、ＤＵＸ４ｍｉＲＮＡで処理したマウスの筋肉で観察される。
実施例８
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡは、筋肉における内因性ＤＵＸ４発現を減少させる
本開示のＤＵＸ４ｍｉＲＮＡ構築物含むＡＡＶを、ＦＳＨＤに罹患している患者に、筋肉内（ＩＭ）又は静脈内（ＩＶ）で注射する。治療前、並びに治療の４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、及び５２週間後、患者の筋肉中のＤＵＸ４ ｍＲＮＡの発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｓｃｏｐｅ、又はｄｄＰＣＲによって生検筋肉中で測定する。
ＤＵＸ４ ｍＲＮＡのレベルの低下が、治療前の同じ患者の筋肉中のＤＵＸ４ ｍＲＮＡのレベルと比較して、本開示のＤＵＸ４ｍｉＲＮＡ構築物を含むＡＡＶで治療した患者の筋肉中に観察される。ＦＳＨＤ疾患症状の改善も観察される。
実施例９
ｍｉｒ－６７５の低分子上方制御は、ＦＳＨＤ患者筋管におけるＤＵＸ４及びＤＵＸ４応答性バイオマーカーを低下させる。
ＤＵＸ４を調節するマイクロＲＮＡであるｍｉｒ－６７５は、全ての既知のヒトｍｉＲＮＡの０．０５％を表す。ｍｉｒ－６７５をＤＵＸ４調節因子として特定しており、この結果を、筋ジストロフィー、ＦＳＨＤ、及びがんなどのＤＵＸ４の発現若しくは過剰発現に関連する疾患を治療する際の薬物ベースの治療アプローチに活用するために実験的な作業を実行した。かかる薬物ベースの療法は、調整可能であり、望ましくない事象が生じた場合には、潜在的に中止される。ｍｉｒ－６７５をＤＵＸ４の強力な内因性調節因子として特定しており、ｍｉｒ－６７５の発現又はそのＨ１９前駆体を増加させることが示されている小分子薬物について以前に公開された遺伝子発現データをレビューするために研究を実行した。
３つの小分子候補（β－エストラジオール、β－エストラジオール＋酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）の組み合わせ、及びメラトニン）を、ＨＥＫ２９３細胞及びヒト筋管においてｍｉｒ－６７５－５ｐを上方制御するそれらの能力について試験した。ＨＥＫ２９３細胞は、通常、最小量のｍｉｒ－６７５を発現する。ＨＥＫ２９３細胞を、（１）２０μＭのβ－エストラジオール単独、（２）１０μＭ若しくは２０μＭのβ－エストラジオール＋ＭＰＡ、又は（３）２０μＭ若しくは４０μＭのメラトニンで処理した。処理の２４時間後、ｍｉｒ－６７５－５ｐの発現を、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定した。
３つの処置レジメン、例えば、β－エストラジオール、β－エストラジオール＋ＭＰＡ、又はメラトニンの各々は、対照、すなわち、１００％エタノール処理したＤＵＸ４トランスフェクト細胞と比較して、ｍｉｒ－６７５レベルを有意に増加させた（図２８及び表３）。図２８では、β－エストラジオール、酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）、及びメラトニンが、ＨＥＫ２９３細胞において、ｍｉｒ－６７５発現を増加させ、ＤＵＸ４及びＤＵＸ４誘導バイオマーカーＴＲＩＭ４３の発現を減少させた。液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を実行して、ｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＤＵＸ４、及びＴＲＩＭ４３レベルを測定した。ＨＥＫ２９３細胞をＤＵＸ４でトランスフェクトし、トランスフェクション時に、２つの薬物（すなわち、β－エストラジオール及びメラトニン）で個別に、又はβ－エストラジオール及びＭＰＡの組み合わせで、１０、２０、若しくは４０μＭで処置した。これらの薬物の効果を、エタノール（ビヒクル）処置細胞との比較によって評価した。数は、ｎ＝３の独立した実験に対応する（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）。β－エストラジオール、β－エストラジオール＋ＭＰＡ、又はメラトニンで処理したＨＥＫ２９３細胞からの遺伝子発現の定量化（変化率）が、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して測定され、以下に示される表３に報告される。抗ｍｉｒ－６７５は、ｍｉｒ－６７５－５ｐの成熟配列を標的とするアンタゴミルであり、ＤＵＸ４遺伝子発現の阻害剤としてその機能を阻害する。ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓは、ＤＵＸ４変異体配列をコードする発現プラスミドである。この配列は、ＯＲＦに見出されるｍｉｒ－６７５標的部位７８０（ＴＳ７８０）で変異し（図１７Ｂを参照）、その３’ＵＴＲが欠失して、このＤＵＸ４変異体の発現をｍｉｒ－６７５依存性阻害に対して耐性にする。
ＤＵＸ４レベルを各処置群の細胞で測定した。ＤＵＸ４でトランスフェクトした対照処理細胞は、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａと比較して、平均３３９±２コピー／μＬを有した。２０μＭのβ－エストラジオール、各２０μＭのβ－エストラジオール＋ＭＰＡ、並びに２０μＭ及び４０μＭのメラトニンの各々の添加は、ＤＵＸ４及びＤＵＸ４応答性バイオマーカーＴＲＩＭ４３のレベルに有意な減少をもたらした（図２８及び表３）。
抗ｍｉｒ－６７５アンタゴミルとの共トランスフェクションは、ＨＥＫ２９３細胞が１０μＭの組み合わせβ－エストラジオール＋ＭＰＡ及び２０μＭのメラトニンで処理されたとき、ＴＲＩＭ４３レベルを増加させ、使用した薬物が、ｍｉｒ－６７５の発現を直接誘導することによって、ＤＵＸ４及びＴＲＩＭ４３に対してそれらの効果を発揮したことを示した。
ｍｉｒ－６７５耐性ＤＵＸ４発現プラスミド（ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の４０μＭメラトニンによる処理は、ＴＲＩＭ４３発現の減少をもたらさず、メラトニンのｍｉｒ－６７５依存的効果を確証した（図２８及び表３）。
次に、３つの治療レジメンの効果を、１５Ａ、１７Ａ、及び１８Ａ ＦＳＨＤ分化筋細胞株（筋管）における内因性ｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＤＵＸ４、及びＴＲＩＭ４３の発現で試験した（図２９及び表４）。これらのＦＳＨＤ細胞株は、それらが低（１５Ａ）、中（１８Ａ）、及び高（１７Ａ）ＤＵＸ４発現を示すために選択された［Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２１：４４１９－３０（２０１２）］。図２９において、β－エストラジオール、酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）、及びメラトニンは、ｍｉｒ－６７５発現を増加させ、３つのＦＳＨＤ罹患筋管株において、ＤＵＸ４及びＤＵＸ４誘導バイオマーカーＴＲＩＭ４３の発現を低下させた。液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用して、分化５日後に、１５Ａ（Ａ）、１７Ａ（Ｂ）、及び１８Ａ（Ｃ）ＦＳＨＤ罹患筋管におけるｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＤＵＸ４、及びＴＲＩＭ４３レベルを測定した。２つの薬物（すなわち、β－エストラジオール及びメラトニン）を、分化の４日目に２０μＭで個別に又は組み合わせ（β－エストラジオール＋ＭＰＡ）として添加した。全ての処理を、エタノール（ビヒクル）処理対照細胞と比較した（１５Ａについてｎ＝６の独立した実験、並びに１７Ａ及び１８ＡについてＮ＝３の独立した実験。＊、Ｐ＜０．０５。＊＊、Ｐ＜０．０１。＊＊＊、Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ）。β－エストラジオール、β－エストラジオール＋ＭＰＡ、又はメラトニンで処理した５日間分化した１５Ａ、１７Ａ、及び１８Ａ筋管における遺伝子発現（ｍｉｒ－６７５－５ｐ、ＤＵＸ４、及びＴＲＩＭ４３）の定量化が、以下の表４及び図２９に報告される。
３つの処理レジメンを、分化の４日目に筋管に加えた。細胞を２４時間後に採取した。ＤＵＸ４発現の増強が分化段階で生じるため、ＦＳＨＤ細胞を分化段階で処理した［Ｂａｌｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：１１３３－４２（２０１５）］。
１５Ａ筋管では、３つの処理レジメン全てが、ｍｉｒ－６７５発現に増加を誘発した（図２９Ａ及び表４）。同時に、ＤＵＸ４及びＴＲＩＭ４３の発現は、１５Ａ筋管をβ－エストラジオール＋ＭＰＡ又はメラトニンで処理したときに有意に減少した。しかしながら、β－エストラジオール単独による処理は、ＴＲＩＭ４３発現の有意な減少を引き起こさなかった（図２９Ａ及び表４）。１７Ａ及び１８Ａの筋管では、β－エストラジオール、β－エストラジオール＋ＭＰＡ、又はメラトニンは、ｍｉｒ－６７５発現の有意な増加を誘発し、それはＤＵＸ４及びＴＲＩＭ４３発現の有意な減少に関連した（図２９Ｂ～Ｃ及び表４）。
本明細書に開示される治療戦略は、（１）内因性マイクロＲＮＡ遺伝子発現が、小分子処置に応答して変化することができること、及び（２）天然ＤＵＸ４標的化マイクロＲＮＡを、ＲＮＡｉ経路を介してＤＵＸ４発現が減少されるように上方制御することができることを示す。これらの２つの原理を組み合わせることによって、小分子を使用して、細胞内での分解のためにＤＵＸ４を標的とする天然マイクロＲＮＡの発現を増加させることができ、ＤＵＸ４の発現若しくはＤＵＸ４の過剰発現に関連する筋ジストロフィー又はがんに対する新規療法をもたらす。
重要なことに、抗ｍｉｒ－６７５アンタゴミルを用いてｍｉｒ－６７５を阻害すること、又はｍｉｒ－６７５耐性ＤＵＸ４構築物（ＣＭＶ．ＤＵＸ４ ｍｉｒ－６７５Ｒｅｓ）とのその結合を防止することは、３つの治療レジメン、すなわち、β－エストラジオール、β－エストラジオール＋ＭＰＡの組み合わせ、及びメラトニンが、ｍｉｒ－６７５作用を介してＤＵＸ４阻害効果を発揮することを裏付けた（図２８及び表３）。
この試験は、エストロゲン、エストロゲン及びプロゲステロン、並びにメラトニンが、ＤＵＸ４の発現を阻害することができ、ＦＳＨＤ若しくはがんなどのＤＵＸ４の発現及び／又は過剰発現に関連する疾患の治療に使用することができることを示す。
実施例１０
ｍｉｒ－６７５は、骨格筋の再生及び分化を増強する
損傷したマウス骨格筋の再生及び分化にｍｉｒ－６７５が有益な効果を示す以前の試験［Ｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２８：４９１－５０１（２０１４）］と併せて、この試験は、ｍｉｒ－６７５が、ヒト骨格筋及び非筋細胞株における骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）経路及びＤＮＡ複製開始因子Ｃｄｃ６にとって重要である、抗分化Ｓｍａｄ転写因子（Ｓｍａｄ１及び５）を標的として下方制御することができることが実証されたため、ｍｉｒ－６７５がヒト骨格筋の再生及び分化を増強するように出現することを示す（図２５、２６、及び３０）。図２５は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＣＤＣ６のｍｉｒ－６７５標的化を示す。ＱＰＣＲを使用し、調査した各遺伝子に特異的なＴａｑＭａｎプローブを使用して、ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＣＤＣ６の発現を測定した。それを行うために、Ｕ６．ｍｉｌａｃＺ（陰性対照）、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５、Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－３ｐ、又はＵ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐ発現構築物をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に全ＲＮＡを抽出した。Ｕ６．ｍｉｒ－６７５－３ｐは、ＳＭＡＤ１レベルを平均３２±６％（Ｐ＜０．０４４、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）、ＳＭＡＤ５レベルを平均３５±６％（Ｐ＜０．００１３、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）低下させた。一方、Ｈ１．ｍｉｒ－６７５及びＵ６．ｍｉｒ－６７５－５ｐは、ＣＤＣ６レベルを、それぞれ、平均３８±４％（Ｐ＜０．００３４、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）及び３６±７％（Ｐ＜０．００４８、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３）抑制した。結果は、Ｕ６．ｍｉｌａｃＺでトランスフェクトした細胞における遺伝子発現と比較して、３回反復（Ｎ＝３）の相対遺伝子発現（ΔΔＣｑ）±ＳＥＭとして報告し、各ＱＰＣＲアッセイは、三重測定で行った。全ての結果を、参照遺伝子としてハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａを使用して定量化した。図２６は、図３０の非クロップ化ウェスタンブロットゲルを示す。図３０では、内因性ｍｉｒ－６７５が、対照の非罹患分化筋細胞株（１５Ｖ筋細胞株の筋管）におけるＣＤＣ６遺伝子発現を標的とし、１５Ａ ＦＳＨＤ罹患ヒト筋管におけるＤＵＸ４誘導性毒性を防止することを示す。ＣＤＣ６遺伝子発現の標的化は、特異的な抗ｍｉｒ－６７５アンタゴミルを使用することによって、及び４日間分化した１５Ｖ対照筋管におけるＣｄｃ６タンパク質レベルを測定することによって試験した。Ｃｄｃ６は、抗ｍｉｒ－６７５でトランスフェクトした筋管でのみ検出された（非クロップ化ゲルについて図２６を参照）。ハウスキーピングタンパク質α－チューブリンを参照として使用した。
ＤＵＸ４発現のサイレンシングと並行して、再生におけるｍｉｒ－６７５の関与は、それが、ＤＵＸ４発現がその時に減少されている、新しい筋線維の再生を助けることができるため、ＦＳＨＤに罹患した骨格筋にとって有益であることが予想される。
要約すると、本明細書に提供されるｍｉｒ－６７５及びｍｉｒ－６７５類似体は、ＦＳＨＤ及びＤＵＸ４発現又は過剰発現に関連する他の疾患を治療するための治療適用を有するＤＵＸ４阻害剤として有用である。
実施例１１
ｍｉ４０５Ｇ及びＨは、低ＡＡＶ用量でインビボでのＤＵＸ４毒性を低減することにおいて、ｍｉ４０５よりも効率的である。
Ｕ６．ｍｉ４０５、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｆ、Ｕ６．ｍｉ４０５Ｇ、及びＵ６．ｍｉ４０５Ｈを、ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬを有するｓｃＡＡＶ６を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＴＡに等用量（５ｅ０９のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ））で同時注射した。この実験は、ＡＡＶ．ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ＦＬと同等の用量で、インビボでＤＵＸ４誘導性筋肉毒性を排除する４つのｍｉ４０５構築物の効率を調べるために行われた。以前に、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．［Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６９：５４０－５５２（２０１１）、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８Ｍａｒ１６；８：１２１－１３０］は、ＡＡＶ．Ｕ６．ｍｉ４０５がＡＡＶ．ＤＵＸ４よりも１ｌｏｇ高い用量でＤＵＸ４誘導性毒性に対抗するのに非常に効率的であるが、低用量で試験したＡＡＶ．Ｕ６．ｍｉ４０５ではそうでなかったことを示した。図３４のデータは、より低い用量で、ｍｉ４０５Ｇ及びｍｉ４０５Ｈが、単核細胞浸潤及び中心核を有する筋線維を特徴とするＤＵＸ４誘導性筋毒性を排除することにおいて、ｍｉ４０５よりも効率的だったが、ｍｉ４０５Ｆはそうでなかったことを示す。このデータは、ｍｉ４０５と比較したとき、インビボで増強された阻害効率を示さなかったｍｉ４０５Ｆの例外でのインビトロデータ（図５Ｃ及び１２）と一致する（図３４）。
実施例１２
ピラジンアミド及びソラフェニブは、ＦＳＨＤに罹患した筋細胞におけるＤＵＸ４及びＤＵＸ４応答性バイオマーカー（ＴＲＩＭ４３及びＺＳＣＡＮ４）の発現を低下させた。
１８Ａ ＦＳＨＤに罹患した筋細胞株を、筋管への分化の４日目に、増加する濃度のピラジンアミド又はソラフェニブで処理した。細胞を分化の５日目に採取した。ＲＮＡを抽出し、ＤＵＸ４、ＴＲＩＭ４３、及びＺＳＣＡＮ４でｄｄＰＣＲ遺伝子発現分析を実行した。結果として、４０μＭのピラジンアミドは、ＴＲＩＭ４３及びＺＳＣＡＮ４の発現を、それぞれ３５±７％（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０３７８、Ｎ＝３の独立した実験）及び４２±６％（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．００４３、Ｎ＝３の独立した実験）減少させた（図３５）。ソラフェニブは、ＤＵＸ４、ＴＲＩＭ４３、及びＺＳＣＡＮ４の発現を用量依存的に低下させ、４０μＭの濃度で使用したときに最大の阻害に達した。後者では、ソラフェニブは、ＤＵＸ４、ＴＲＩＭ４３、及びＺＳＣＡＮ４の発現を、それぞれ４０±１０％（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０４８６、Ｎ＝３の独立した実験）、７０±４％（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０００３、Ｎ＝３の独立した実験）、及び６８±３％（ＡＮＯＶＡ、Ｐ＝０．０００１、Ｎ＝３の独立した実験）減少させた（図３５）。
前述の説明は、理解の明確さのためだけに与えられ、本発明の範囲内の修正は、当業者には明らかであり得るため、不必要な制限がそこから理解されるべきではない。
本明細書及びその後の特許請求の範囲全体を通して、文脈で別段の要求がない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という単語、並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含めることを意味するが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外することを意味しないと理解されたい。
本明細書全体にわたって、組成物が成分又は材料を含むと記載される場合、別段の記載がない限り、組成物は、列挙された成分又は材料の任意の組み合わせから本質的になるか、又はそれらからなることもできることが企図される。同様に、方法が特定のステップを含むと記載される場合、別途記載されない限り、方法はまた、列挙されたステップの任意の組み合わせから本質的になるか、又はそれらからなることができることが企図される。本明細書に例示的に開示される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素又はステップが存在せずに適切に行われ得る。
本明細書に開示される方法の実施、及びその個々のステップは、マニュアルで、かつ／又は電子装置の支援若しくはそれによって提供される自動化を用いて、行うことができる。プロセスが特定の実施形態を参照して記載されているが、当業者であれば、方法に関連する行為を行う他の方法を使用し得ることを容易に理解するであろう。例えば、ステップの様々な順序は、別途記載されていない限り、本方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく変更され得る。加えて、個々のステップのうちのいくつかは、組み合わせるか、省略するか、又は更に追加のステップに細分化することができる。
本明細書に引用される全ての特許、刊行物、及び参考文献は、参照により完全に組み込まれる。本開示と組み込まれた特許、刊行物、及び参考文献との間に矛盾がある場合、本開示が優先されるべきである。

Claims (38)

  1. 二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的化マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸であって、
    （ａ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号５～４７のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号９５～１０５のうちのいずれか１つに示されるＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列、又は
    （ｄ）配列番号１０６～１２４のうちのいずれか１つに示される前記ＤＵＸ４配列と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含む、核酸。
  2. プロモーター配列を更に含む、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記プロモーターが、Ｕ６、Ｕ７、ｔＲＮＡ、Ｈ１、最小ＣＭＶ、Ｔ７、ＥＦ１－アルファ、最小ＥＦ１－アルファ、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである、請求項２に記載の核酸。
  4. 前記プロモーターが、Ｕ６又はＨ１である、請求項３又は４に記載の核酸。
  5. （ａ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、又は
    （ｂ）配列番号５０～９２のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、を含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の核酸。
  6. 前記筋肉特異的プロモーターが、ｕｎｃ４５ｂ、ｔＭＣＫ、最小ＭＣＫ、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、又はＣＫ１である、請求項３に記載の核酸。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸を含む、アデノ随伴ウイルス。
  8. 前記ウイルスが、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている、請求項７に記載のアデノ随伴ウイルス。
  9. 前記ウイルスが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補型組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項７又は８に記載のアデノ随伴ウイルス。
  10. 前記ウイルスが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、又はＡＡＶ－Ｂ１である、請求項７～９のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
  11. 前記ウイルスが、ＡＡＶ９である、請求項７～１０のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス。
  12. 請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸を含む、ナノ粒子、細胞外小胞、又はエクソソーム。
  13. 組成物であって、
    （ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項７～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、又は
    （ｃ）請求項１２に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソームと、
    薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
  14. 細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉する方法であって、前記細胞を、
    （ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項７～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、
    （ｃ）請求項１２に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、及び／又は
    （ｄ）請求項１３に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
  15. 筋ジストロフィー又はがんを有する対象を治療する方法であって、前記対象に、有効量の
    （ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項７～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、
    （ｃ）請求項１２に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、及び／又は
    （ｄ）請求項１３に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  16. 前記筋ジストロフィーが、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. 前記がんが、肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、又は副腎、胆管、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭頸部、肝臓、脳、肺、中皮質、神経堤、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、皮膚、軟組織、胃、精巣、若しくは胸腺のＤＵＸ４発現性がんである、請求項１４又は１５に記載の方法。
  18. 細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害するための医薬品の調製のための、
    （ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項７～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、
    （ｃ）請求項１２に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、及び／又は
    （ｄ）請求項１３に記載の組成物の、使用。
  19. 筋ジストロフィー又はがんを治療又は改善するための、
    （ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項７～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、
    （ｃ）請求項１２に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、及び／又は
    （ｄ）請求項１３に記載の組成物の、使用。
  20. 筋ジストロフィー又はがんを治療又は改善するための医薬品の調製のための、
    （ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項７～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス、
    （ｃ）請求項１２に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、及び／又は
    （ｄ）請求項１３に記載の組成物の、使用。
  21. 前記筋ジストロフィーが、顔面肩甲上腕筋ジストロフィーである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の使用。
  22. 前記がんが、肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、又は副腎、胆管、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭頸部、肝臓、脳、肺、中皮質、神経堤、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、皮膚、軟組織、胃、精巣、若しくは胸腺のＤＵＸ４発現性がんである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の使用。
  23. （ａ）請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項７～１１のいずれか一項に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、
    （ｃ）請求項１２に記載のナノ粒子、細胞外小胞、若しくはエクソソーム、
    （ｄ）請求項１３に記載の組成物、
    （ｅ）請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法、又は
    （ｆ）請求項１８～２２のいずれか一項の記載の使用であって、
    前記核酸、ＡＡＶ、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくは組成物、又は医薬品が、筋肉内注射、経口投与、皮下、皮内、若しくは経皮輸送、血流への注射のために、又はエアロゾル投与のために製剤化される、核酸、ＡＡＶ、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、組成物、方法、又は使用。
  24. 細胞におけるマイクロＲＮＡ－６７５の発現を上方制御する方法であって、前記細胞を、有効量のエストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせと接触させることを含む、方法。
  25. 細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉する方法であって、前記細胞を、有効量のエストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせと接触させることを含む、方法。
  26. ＤＵＸ４発現若しくは過剰発現に関連する筋ジストロフィー又はがんを有する対象を治療する方法であって、前記対象に、有効量のエストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせを投与することを含む、方法。
  27. 前記筋ジストロフィーが、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記がんが、肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、又は副腎、胆管、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭頸部、肝臓、脳、肺、中皮質、神経堤、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、皮膚、軟組織、胃、精巣、若しくは胸腺のＤＵＸ４発現性がんである、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記エストロゲン又は合成エストロゲンが、エストロン、エストラジオール、エストリオール、エステトロール、２７－ヒドロキシコレステロール、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、７－オキソ－ＤＨＥＡ、７α－ヒドロキシ－ＤＨＥＡ、１６α－ヒドロキシ－ＤＨＥＡ、７β－ヒドロキシエピアンドロステロン、アンドロステンジオン（Ａ４）、アンドロステンジオール（Ａ５）、３α－アンドロスタンジオール、及び３β－アンドロスタンジオール、２－ヒドロキシエストラジオール、２－ヒドロキシエストロン、４－ヒドロキシエストラジオール、４－ヒドロキシエストロン、１６α－ヒドロキシエストロン、エチニルエストラジオール、吉草酸エストラジオール、エストロピペート、コンジュゲートエステル化エストロゲン、並びにキネストロールである、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記プロゲステロン又はプロゲスチンが、酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）、１７α－ヒドロキシプロゲステロン、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ゲストデン、又はエトノゲストレルである、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
  31. 細胞におけるマイクロＲＮＡ－６７５の発現を上方制御するための、エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせの、使用。
  32. 細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害する、及び／又はそれに干渉するための、エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせの、使用。
  33. ＤＵＸ４発現若しくは過剰発現に関連する筋ジストロフィー又はがんを有する対象を治療するための、エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせの、使用。
  34. 前記筋ジストロフィーが、顔面肩甲上腕筋ジストロフィーである、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の使用。
  35. 前記がんが、肉腫、Ｂ細胞リンパ腫、又は副腎、胆管、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭頸部、肝臓、脳、肺、中皮質、神経堤、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、皮膚、軟組織、胃、精巣、若しくは胸腺のＤＵＸ４発現性がんである、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の使用。
  36. 前記エストロゲン又は合成エストロゲンが、エストロン、エストラジオール、エストリオール、エステトロール、２７－ヒドロキシコレステロール、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、７－オキソ－ＤＨＥＡ、７α－ヒドロキシ－ＤＨＥＡ、１６α－ヒドロキシ－ＤＨＥＡ、７β－ヒドロキシエピアンドロステロン、アンドロステンジオン（Ａ４）、アンドロステンジオール（Ａ５）、３α－アンドロスタンジオール、及び３β－アンドロスタンジオール、２－ヒドロキシエストラジオール、２－ヒドロキシエストロン、４－ヒドロキシエストラジオール、４－ヒドロキシエストロン、１６α－ヒドロキシエストロン、エチニルエストラジオール、吉草酸エストラジオール、エストロピペート、コンジュゲートエステル化エストロゲン、並びにキネストロールである、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の使用。
  37. 前記プロゲステロン又はプロゲスチンが、酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）、１７α－ヒドロキシプロゲステロン、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ゲストデン、又はエトノゲストレルである、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の使用。
  38. 前記エストロゲン、合成エストロゲン、プロゲステロン、プロゲスチン、メラトニン、ブレオマイシン、ピラジンアミド、ソラフェニブ、若しくはそれらの誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせが、筋肉内注射、経口投与、皮下、皮内、若しくは経皮輸送、血流への注射のために、又はエアロゾル投与のために製剤化される、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の方法、又は請求項３１～３７のいずれか一項に記載の使用。
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