KR20230138949A - Dux4 과발현과 연관된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Dux4 과발현과 연관된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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니자르 사드
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더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈
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Abstract

비제한적인 예로서 안면견갑상완 근 위축증(FSHD) 또는 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 암을 포함하는 근 위축증 또는 암을 치료하고/하거나 개선하고/하거나 이의 진행을 지연시키고/시키거나 이를 예방하기 위한 생성물, 방법 및 용도가 본원에 제공된다. 더 특히, 이중 호메오박스 4(DUX4)의 발현을 억제하거나 하향조절하기 위한 RNA 간섭 기반 생성물, 방법 및 용도가 본원에 제공된다. 훨씬 더 특히, 본 개시내용은 DUX4의 발현을 억제하거나 하향조절하기 위한 마이크로RNA(miRNA) 및 세포에서 및/또는 비제한적인 예로서 FSHD 또는 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 암을 포함하는 근 위축증 또는 암을 갖는 대상체의 세포에서 DUX4 발현을 억제하거나 하향조절하기 위해 상기 miRNA를 사용하는 방법을 제공한다. 추가적으로, 본 개시내용은 마이크로RNA-675의 발현을 상향조절하기 위한, DUX4 발현을 억제하기 위한 그리고 비제한적인 예로서 FSHD 또는 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 암을 포함하는 근 위축증 또는 암을 치료하고/하거나 개선하고/하거나 이의 진행을 지연시키고/시키거나 이를 예방하기 위한 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라지나미드, 소라페닙 또는 이의 유도체 또는 임의의 이들의 조합을 제공한다.

Description

DUX4 과발현과 연관된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
서열 목록의 참고에 의한 포함
본 출원은 본 개시내용의 별개의 부분으로서 본원에 그 전문이 참고로 포함된 컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록(파일명: 53445_Seqlisting.txt; 크기: 61,557 바이트; 생성일: 2022년 2월 1일)을 함유한다.
기술분야
본 개시내용은 이중 호메오박스 4(DUX4: double homeobox 4) 유전자의 과발현과 연관된 질환의 치료의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 개시내용은 DUX4 유전자의 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 근 위축증 또는 암을 치료하고/하거나 개선하고/하거나 이의 진행을 지연시키고/시키거나 이를 예방하기 위한 RNA 간섭 기반 생성물, 방법 및 용도를 제공한다. 구체적으로는, 본 개시내용은 DUX4 유전자의 발현을 억제하거나 하향조절하기 위한 생성물 및 방법을 제공한다. 더 구체적으로는, 본 개시내용은 DUX4의 발현을 억제하거나 하향조절하기 위한 마이크로RNA(miRNA) 및 세포 및/또는 비제한적인 예로서 안면견갑상완 근 위축증(FSHD: facioscapulohumeral muscular dystrophy)을 포함하는 근 위축증 또는 과발현된 DUX4와 연관된 암을 갖는 대상체에서 DUX4 발현을 억제하거나 하향조절하기 위해 상기 miRNA를 사용하는 방법을 제공한다. 추가적으로, 본 개시내용은 마이크로RNA-675의 발현을 상향조절하기 위한, DUX4 발현을 억제하기 위한 그리고/또는 비제한적인 예로서 FSHD 또는 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 암을 포함하는 근 위축증 또는 암을 치료하고/하거나 개선하고/하거나 이의 진행을 지연시키고/시키거나 이를 예방하기 위한 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라지나미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합을 제공한다.
근 위축증(MD)은 유전 질환의 그룹이다. 그룹은 이동을 제어하는 골격근의 진행성 약화 및 퇴행을 특징으로 한다. MD의 일부 형태는 유아 또는 아동에서 발생하지만, 다른 것은 중간 연령 또는 나중까지 나타나지 않을 수 있다. 그 장애는 근육 약화의 분포 및 정도(MD의 일부 형태는 또한 심장근에 영향을 미침), 발병의 연령, 진행 속도 및 유전성의 패턴의 면에서 다르다.
안면견갑상완 위축증(FSHD)은 870,000명의 개체만큼 많이 영향을 미치는 것으로 추정되는 가장 흔히 유전되는 근 위축증 중에 있다. FSHD 제시의 전통적인 설명은 얼굴, 견갑대 및 팔뚝에서의 진행성 근육 약화를 포함하지만, 질환은 몸통 및 하지의 근육을 포함하여 더 광범위하게 표출될 수 있다. 가변성은 또한 비대칭적 약화가 흔하면서 개체 내에 흔히 보인다. 발병 연령은 초기 사춘기에서 성인의 범위일 수 있고, 보통 질환 중증도와 관련되고, 여기서 조기 발병은 대개 더 심각한 근육 약화와 연관된다. FSHD를 갖는 대부분의 환자가 정상 수명 기간을 가지지만, 호흡기 부전이 발생할 수 있고, 이환된 개체의 대략 25%가 더 심각한 질환 형태에서 50대에 그리고 심지어는 그보다 일찍 휠체어에 의존하게 되고, 나머지는 평생 보행을 유지시킬 수 있으므로, 그 질환은 쇠약해질 수 있다.
FSHD는 골격근에 독성인 전사 인자를 생성하는 이중 호메오박스 4 유전자(DUX4)의 비정상 발현에 의해 야기된다. DUX4는 보통 인간 발생의 2 세포 단계 동안 기능적이지만, 이후 아마도 시험을 제외하고 본질적으로 모든 다른 조직에서 억제되었다. FSHD를 갖는 사람의 골격근에서, 특정 유전적 인자 및 후성적 인자는 DUX4 탈억제를 허용하도록 모의하고, 여기서 이것을 이후 분화 비정상, 산화 스트레스, 염증성 침윤, 세포사 및 근육 위축증에 관여된 것을 포함하는 몇몇 비정상 유전자 발현 캐스케이드를 개시시킨다.
효과적인 FSHD 표적화된 치료제는 환자 삶에 질을 극적으로 개선할 것이지만, 현재 FSHD 진행을 느리게 하거나 근육 약화를 개선하는 허가된 치료가 없다. FSHD가 DUX4 탈억제로부터 생기므로, 치료제에 대한 가장 직접적인 경로는 근육에서 DUX4를 억제하는 것을 수반할 것이다. RNA 간섭(RNAi)에 의한 유전자 침묵화는 DUX4를 억제하기 위한 하나의 강력한 접근법이다. 역사적으로, RNAi 기반 치료제는 (1) 허용 가능한 표적 세포 또는 조직으로의 siRNA 올리고뉴클레오타이드 약물의 전달; 또는 (2) 설계된 마이크로RNA 또는 shRNA 발현 카세트가 바이러스 벡터 내에 패키징되고 전달 후 세포내로 발현되는 유전자 치료인 우성 질환 유전자를 침묵화하기 위한 2가지 주요 전략에 의존하였다.
RNA 간섭(RNAi)은 다양한 질환의 치료에 고려되는 진핵 세포에서의 유전자 조절의 기전이다. RNAi는 마이크로RNA(miRNA)에 의해 매개된 유전자 발현의 전사후 제어를 지칭한다. miRNA는 서열 상동성을 공유하고 동족 메신저 RNA(mRNA)의 3' 비번역 영역과 염기쌍을 짓는 작은(21개 내지 25개의 뉴클레오타이드), 비암호화 RNA이다. miRNA와 mRNA 사이의 상호작용은 mRNA의 번역을 방지하도록 세포 유전자 침묵화 기계를 지시한다. RNAi 경로는 Duan (Ed.), Muscle Gene Therapy, Springer Science + Business Media, LLC (2010) 중 챕터 7의 7.3 부문에 요약되어 있다.
자연 RNAi 경로의 이해가 개발되면서, 조사자들은 질환을 치료하기 위한 표적 유전자의 발현을 조절하는 데 있어서의 용도를 위해 인공 miRNA를 설계하였다. 상기 Duan 문헌의 7.4 부문에 기재된 것처럼, 인공 miRNA는 DNA 발현 카세트로부터 전사될 수 있다. 표적 유전자에 특이적인 miRNA 서열은 세포에서 miRNA의 가공을 지시하는 데 필요한 서열과 함께 전사된다. 아데노 연관 바이러스(AAV)와 같은 바이러스 벡터는 근육에 miRNA를 전달하도록 사용되었다[Fechner 등, J. Mol. Med., 86: 987-997 (2008)].
AAV는 예를 들면 유전자 치료에서 외래 DNA를 세포로 전달하기 위한 벡터로서 이것이 매력적이게 하는 고유한 특징을 보유한다. 배양물에서의 세포의 AAV 감염은 비세포변성이고, 인간 및 다른 동물의 천연 감염은 침묵이고 무증상이다. 더욱이, AAV는 많은 포유류 세포를 감염시켜서 많은 상이한 조직을 생체내 표적화하는 가능성을 허용한다. 더욱이, AAV는 서서히 분열하는 세포 및 비분열하는 세포를 형질도입하고, 전사적으로 활성인 핵 에피솜(염색체외 요소)으로서 이 세포의 수명에 대해 본질적으로 지속할 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은, 재조합 게놈의 작제가 실행 가능하게 하는, 플라스미드에서 클로닝된 DNA로서 감염성이다. 더욱이, AAV 복제, 게놈 캡시드화 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 함유되므로, 게놈(복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap를 암호화)의 내부 대략 4.3 kb의 전부 또는 일부를 외래 DNA로 대체될 수 있다. rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공될 수 있다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 이것이 극도로 안정하고 다루기 어려운 바이러스라는 것이다. 이것은 아데노바이러스(몇 시간 동안 56℃ 내지 65℃)를 불활성화하도록 사용된 조건을 견뎌서, AAV의 차가운 보존이 덜 중요하게 한다. AAV는 심지어 동결건조될 수 있다. 마지막으로, AAV 감염된 세포는 초감염에 저항적이지 않다.
당해 분야에서 FSHD 및 암과 같은 근 위축증을 포함하는 과발현된 DUX4와 연관된 질환을 치료하기 위한 생성물 및 방법에 대한 수요가 있다.
요약
본 개시내용은 DUX4 발현을 억제하고 그리고 근 위축증 또는 DUX4의 발현 또는 과발현과 연관된 암을 치료하고/하거나 개선하고/하거나 이의 진행을 지연시키고/시키거나 이를 예방하기 위한 생성물, 방법 및 용도를 제공한다.
본 개시내용은 DUX4 발현을 억제하도록 설계된 핵산, 핵산을 포함하는 바이러스 벡터, 핵산 및 벡터를 포함하는 조성물, 세포에서의 DUX4의 발현을 억제하고/하거나 방해하기 위해 이 생성물을 사용하는 방법 및 DUX4의 발현 상승으로부터 생긴 질환을 겪는 대상체에서 질환을 치료하거나 개선하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 (a) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중 호메오박스 4(DUX4) 표적화 마이크로RNA(miRNA)를 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6, U7, tRNA, H1, 최소 CMV, T7, EF1-알파, 최소 EF1-알파 또는 근육 특이적 프로모터 중 어느 것이다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6 또는 H1이다. 일부 양태에서, 근육 특이적 프로모터는 unc45b, tMCK, 최소 MCK, CK6, CK7, CK8, MHCK7 또는 CK1이다. 일부 양태에서, 핵산은 (a) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (b) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 개시내용은 (a) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중 호메오박스 4(DUX4) 표적화 마이크로RNA(miRNA)를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노 연관 바이러스를 제공한다. 일부 양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6, U7, tRNA, H1, 최소 CMV, T7, EF1-알파, 최소 EF1-알파 또는 근육 특이적 프로모터 중 어느 것이다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6 또는 H1이다. 일부 양태에서, 근육 특이적 프로모터는 unc45b, tMCK, 최소 MCK, CK6, CK7, CK8, MHCK7 또는 CK1이다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 (a) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (b) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 rep 및 cap 유전자가 결여된다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 재조합 AAV(rAAV) 또는 자가 상보성 재조합 AAV(scAAV)이다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVanc80, AAVrh.74, AAVrh.8, AAVrh.10 또는 AAV-B1이다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 AAV-9이다.
본 개시내용은 (a) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중 호메오박스 4(DUX4) 표적화 마이크로RNA(miRNA)를 암호화하는 핵산을 포함하는 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀을 제공한다. 일부 양태에서, 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀은 서열 번호 94 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6, U7, tRNA, H1, 최소 CMV, T7, EF1-알파, 최소 EF1-알파 또는 근육 특이적 프로모터 중 어느 것이다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6 또는 H1이다. 일부 양태에서, 근육 특이적 프로모터는 unc45b, tMCK, 최소 MCK, CK6, CK7, CK8, MHCK7 또는 CK1이다. 일부 양태에서, 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀은 (a) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (b) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀은 서열 번호 94 내지 105 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 핵산을 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 것과 같은 본 개시내용 핵산, 아데노 연관 바이러스, 또는 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 세포를 (a) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중 호메오박스 4(DUX4) 표적화 마이크로RNA(miRNA)를 암호화하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하고/하거나 방해하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6, U7, tRNA, H1, 최소 CMV, T7, EF1-알파, 최소 EF1-알파 또는 근육 특이적 프로모터 중 어느 것이다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6 또는 H1이다. 일부 양태에서, 근육 특이적 프로모터는 unc45b, tMCK, 최소 MCK, CK6, CK7, CK8, MHCK7 또는 CK1이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 (a) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (b) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
본 개시내용은 세포를 (a) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중 호메오박스 4(DUX4) 표적화 마이크로RNA(miRNA)를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노 연관 바이러스와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하고/하거나 방해하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6, U7, tRNA, H1, 최소 CMV, T7, EF1-알파, 최소 EF1-알파 또는 근육 특이적 프로모터 중 어느 것이다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6 또는 H1이다. 일부 양태에서, 근육 특이적 프로모터는 unc45b, tMCK, 최소 MCK, CK6, CK7, CK8, MHCK7 또는 CK1이다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 (a) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (b) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 rep 및 cap 유전자가 결여된다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 재조합 AAV(rAAV) 또는 자가 상보성 재조합 AAV(scAAV)이다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-anc80 또는 AAV rh.74이다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 AAV-9이다.
본 개시내용은 세포를 (a) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중 호메오박스 4(DUX4) 표적화 마이크로RNA(miRNA)를 암호화하는 핵산을 포함하는 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하고/하거나 방해하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 세포를 서열 번호 94 내지 105 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하고/하거나 방해하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6, U7, tRNA, H1, 최소 CMV, T7, EF1-알파, 최소 EF1-알파 또는 근육 특이적 프로모터 중 어느 것이다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6 또는 H1이다. 일부 양태에서, 근육 특이적 프로모터는 unc45b, tMCK, 최소 MCK, CK6, CK7, CK8, MHCK7 또는 CK1이다. 일부 양태에서, 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀은 (a) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (b) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀은 서열 번호 94 내지 105 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성 또는 100%의 동일성을 포함하는 핵산을 포함한다.
본 개시내용은 세포를 본원에 기재된 것과 같은 본 개시내용 핵산, 아데노 연관 바이러스, 또는 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하고/하거나 방해하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 대상체에게 (a) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; ( ) 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중 호메오박스 4(DUX4) 표적화 마이크로RNA(miRNA)를 암호화하는 핵산의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 근 위축증 또는 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6, U7, tRNA, H1, 최소 CMV, T7, EF1-알파, 최소 EF1-알파 또는 근육 특이적 프로모터 중 어느 것이다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6 또는 H1이다. 일부 양태에서, 근육 특이적 프로모터는 unc45b, tMCK, 최소 MCK, CK6, CK7, CK8, MHCK7 또는 CK1이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 (a) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (b) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
본 개시내용은 대상체에게 (a) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중 호메오박스 4(DUX4) 표적화 마이크로RNA(miRNA)를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노 연관 바이러스의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 근 위축증 또는 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 치료하는 방법은 서열 번호 94 내지 105 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 핵산을 포함하는 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6, U7, tRNA, H1, 최소 CMV, T7, EF1-알파, 최소 EF1-알파 또는 근육 특이적 프로모터 중 어느 것이다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6 또는 H1이다. 일부 양태에서, 근육 특이적 프로모터는 unc45b, tMCK, 최소 MCK, CK6, CK7, CK8, MHCK7 또는 CK1이다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 (a) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (b) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 rep 및 cap 유전자가 결여된다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 재조합 AAV(rAAV) 또는 자가 상보성 재조합 AAV(scAAV)이다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-anc80 또는 AAV rh.74이다. 일부 양태에서, 아데노 연관 바이러스는 AAV-9이다.
본 개시내용은 대상체에게 (a) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (d) 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이중 호메오박스 4(DUX4) 표적화 마이크로RNA(miRNA)를 암호화하는 핵산을 포함하는 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 근 위축증 또는 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6, U7, tRNA, H1, 최소 CMV, T7, EF1-알파, 최소 EF1-알파 또는 근육 특이적 프로모터 중 어느 것이다. 일부 양태에서, 프로모터는 U6 또는 H1이다. 일부 양태에서, 근육 특이적 프로모터는 unc45b, tMCK, 최소 MCK, CK6, CK7, CK8, MHCK7 또는 CK1이다. 일부 양태에서, 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀은 (a) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 (b) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀은 서열 번호 94 내지 105 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 핵산을 포함한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 것과 같은 본 개시내용 핵산, 아데노 연관 바이러스, 또는 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 근 위축증 또는 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 근 위축증은 안면견갑상완 근 위축증(FSHD)이다. 일부 양태에서, 암은 DUX4의 발현 또는 과발현과 연관된 암이다. 일부 양태에서, 암은 육종, B 세포 림프종, 또는 부신, 담관, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 두부/경부, 간, 뇌, 폐, 중피, 신경능, 난소, 췌장, 전립선, 신장, 피부, 연조직, 위, 고환 또는 흉선의 DUX4 발현 암이다.
본 개시내용은 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제의 제조를 위한, 근 위축증 또는 암을 치료하거나 개선하기 위한 그리고/또는 근 위축증 또는 암을 치료하거나 개선하기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 것과 같은 본 개시내용 핵산, 아데노 연관 바이러스, 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀 또는 조성물의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 근 위축증은 안면견갑상완 근 위축증이다. 일부 양태에서, 암은 DUX4의 발현 또는 과발현과 연관된 암이다. 일부 양태에서, 암은 육종, B 세포 림프종, 또는 부신, 담관, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 두부/경부, 간, 뇌, 폐, 중피, 신경능, 난소, 췌장, 전립선, 신장, 피부, 연조직, 위, 고환 또는 흉선의 DUX4 발현 암이다.
본 개시내용은 본원에 기재된 것과 같은 본 개시내용 핵산, 아데노 연관 바이러스, 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀 또는 조성물을 제공하고, 핵산, 아데노 연관 바이러스, 나노입자, 세포외 베시클, 엑소좀, 조성물 또는 약제는 근육내 주사, 피하 주사, 경구 투여, 피하, 피내 또는 피부경유 수송, 혈류로의 주사를 위해 또는 에어로졸 투여를 위해 제형화된다.
본 개시내용은 세포를 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신 또는 이의 유도체, 피라진아미드 또는 이의 유도체, 소라페닙(4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-메틸피리딘-2-카복사미드) 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 마이크로RNA-675의 발현을 상향조절하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 유도체는 블레오마이신 유도체이다. 이러한 블레오마이신 유도체는 블레오마이신 A2, 데글리코-블레오마이신 A2, 블레오마이신 A5, 블레오마이신 A6, 블레오마이신 B2를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 또한 블레오마이신의 동의어인 약물, 예를 들면 블레오신(Bleocin), 블레오미신(Bleomicin), 블레오미시나(Bleomicina)(스페인어), 블레오마이신(Bleomycine)(프랑스어) 및 블레오마이시늄(Bleomycinum)(라틴어)을 포함한다.
일부 양태에서, 유도체는 피라지나미드 유도체이다. 이러한 피라지나미드 유도체는 피라진-2-카복실산 클로라이드, N-(1-브로민 메틸)피라진 포름아미드, N-(브로모메틸)피라진-2-카복사미드, N-(2-브로모에틸)피라진-2-카복사미드, N-(3-브로모프로필)피라진-2-카복사미드, N-(피페리딘-1-일메틸)피라진-2-카복사미드, N-(피페리딘-1-일메틸)피라진-2-카복사미드, N-(티오모르폴리노메틸)피라진-2-카복사미드, N-(2-(피페리딘-1-일)에틸)피라진-2-카복사미드, N-(2-(피페리딘-1-일)에틸)피라진-2-카복사미드, N-(2-모르폴리노에틸)피라진-2-카복사미드, N-(2-티오모르폴리노에틸)피라진-2-카복사미드, N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)피라진-2-카복사미드, N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)피라진-2-카복사미드, N-(3-모르폴리노프로필)피라진-2-카복사미드, N-(3-티오모르폴리노프로필)피라진-2-카복사미드, 3-클로로피라진-2-카복사미드, 3-[(4-메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, N-벤질피라진-2-카복사미드, 피라진-1,2,3-트리아졸, N-알킬 치환된 3-아미노피라진-2-카복사미드, 피라지노산 n-옥틸 에스테르, 피라진 티오카복사미드, N-하이드록시메틸 피라진, 티오카복사미드, 피라지노산 피발로일옥시메틸 에스테르, 3-(벤질아미노)피라진-2-카복사미드, 3-[(3-클로로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(3,4-디클로로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(3-트리플루오로메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(4-클로로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(2-메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(4-메톡시벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(4-메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(4-아미노벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(2-클로로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(2-플루오로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(4-트리플루오로메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(2-트리플루오로메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(2,4-디메톡시벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(3-니트로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-(벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(4-메틸벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(4-메톡시벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(4-아미노벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(3-클로로벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(4-클로로벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(3,4-디클로로벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(3-니트로벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(3-트리플루오로메틸벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(4-메틸벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(4-메톡시벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(4-아미노벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(3-클로로벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(4-클로로벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(3,4-디클로로벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(3-니트로벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(3-트리플루오로메틸벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(2-메틸벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 또한 피라지나미드의 동의어인 약물, 예컨대 2-카바밀피라진, 2-피라진카복사미드, 알딘아미드(Aldinamide), 피라진 카복사미드(Pyrazine carboxamide), 피라진-2-카복사미드, 피라진아미드(Pyrazineamide), 피라진카복사미드(Pyrazinecarboxamide), 피라지노산 아미드(Pyrazinoic acid amide), 피리진아미드(Pyrizinamide), 피라지나미다(Pirazinamida) 또는 피라지나미다(Pyrazinamida)(스페인어), 피라지나미드(Pyrazinamid)(독일어) 및 피라지나미듐(Pyrazinamidum)(라틴어)을 포함한다.
일부 양태에서, 유도체는 소라페닙 유도체이다. 이러한 소라페닙 유도체는 4-클로로피리딘-2-카보닐 클로라이드 하이드로클로라이드, 4-클로로-N-사이클로펜틸피리딘-2-카복사미드, 4-클로로-N-사이클로헥실피리딘-2-카복사미드, 4-클로로-N-사이클로헥실메틸피리딘-2-카복사미드, 4-클로로-N-벤질피리딘-2-카복사미드, 4-클로로-N-페닐에틸피리딘-2-카복사미드, 4-(4-아미노페녹시)-N-사이클로펜틸피리딘-2-카복사미드, 4-(4-아미노페녹시)-N-사이클로헥실피리딘-2-카복사미드, 4-(4-아미노페녹시)-N-사이클로헥실메틸피리딘-2-카복사미드, 4-(4-아미노페녹시)-N-벤질피리딘-2-카복사미드, 4-(4-아미노페녹시)-N-페닐에틸피리딘-2-카복사미드, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-사이클로펜틸-피리딘-2-카복사미드, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-사이클로헥실-피리딘-2-카복사미드, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-사이클로헥실메틸-피리딘-2-카복사미드, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-벤질-피리딘-2-카복사미드, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-페닐에틸-피리딘-2-카복사미드, 페닐시아노 기를 함유하는 소라페닙 유도체, 질소 헤테로사이클릭을 함유하는 소라페닙 유도체, 퀴녹살린디온 구조를 갖는 소라페닙 유도체, 칼콘 모이어티를 함유하는 소라페닙 유도체, 티오에테르 및 니코틴아미드를 함유하는 소라페닙 유도체, 소라페닙의 디아릴 티오우레아 유도체의 종류, 디티오카바메이트 모이어티를 함유하는 오라페닙 유도체, 피라졸 스캐폴드를 보유하는 오라페닙 유도체, 사이클로헥실 모이어티를 함유하는 소라페닙 유도체, 퀴놀린 핵을 함유하는 소라페닙 유도체, 이합체 기반 구조를 함유하는 소라페닙 유도체, 소라페닙의 a,b-불포화 케톤 유도체, 1,2,3-트리아졸 프레임워크를 함유하는 오라페닙 유도체, 1,3,4-트리아릴피라졸 프레임워크를 함유하는 오라페닙 유도체, 소라페닙의 이미다조 [2,1-b] 티아졸 유도체, 4-(4-(5-(2,4-디클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(5-(3-브로모페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(5-(3,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)피콜린아미드, 4-(4-(5-(4-시아노페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(5-(2-클로로-4-플루오로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(5-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(5-(3-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)피콜린아미드, 4-(4-(5-(4-메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(5-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)피콜린아미드, 4-(4-(5-(3,4-디클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(5-(4-플루오로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(5-(4-브로모페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(5-(2,3,4-트리메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)피콜린아미드, 4-(4-(5-(2,3-디클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(3-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-5-일)페녹시)피콜린아미드, 4-(4-(3-(4-브로모페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-5-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(3-(4-클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-5-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-5-(3-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-5-(4-플루오로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-5-(4-클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-5-(2,3-디클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-5-(4-시아노페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-3-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-5-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, HLC-080, 피롤리딘 측쇄를 보유하는 벤지미다졸 유도체, N-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-2-(2-옥소인돌린-3-일리덴)하이드라진-1-카복사미드, N-(3,4-디플루오로페닐)-2-(2-옥소인돌린-3-일리덴)하이드라진-1-카복사미드, N-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-2-(5-메틸-2-옥소인돌린-3-일리덴)하이드라진-1-카복사미드, 2-((1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3-브로모페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3,4-디플루오로페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(p-톨릴)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3,4-디플루오로페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3-클로로페닐)하이드라진-1-카복사미드, N-(3-브로모페닐)-2-((2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-메톡시페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-플루오로페닐)하이드라진-1-카복사미드, N-(3-브로모페닐)-2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(2-플루오로페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3-플루오로페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-메톡시페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3-클로로페닐)하이드라진-1-카복사미드, N-(3-브로모페닐)-2-((2-클로로-1-프로필-1H-인돌-3-일)메틸렌)하이드라진-1-카복사미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-4-페닐피콜린아미드, 4-(4-플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 4-(2,4-디플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 4-(4-클로로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 4-(4-메톡시페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-4-p-톨릴피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-4-m-톨릴피콜린아미드, 4-(3-플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-4-(4-(트리플루오로메틸)페닐)피콜린아미드, 4-(4-에틸페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 4-(2,4-디메틸페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-5-페닐피콜린아미드, 5-(4-플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 5-(2,4-디플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 5-(4-클로로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 5-(4-메톡시페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-5-p-톨릴피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-5-m-톨릴피콜린아미드, 5-(3-플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-5-(4-(트리플루오로메틸)페닐)피콜린아미드, 5-(4-에틸페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 5-(2,4-디메틸페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 소라페닙의 동의어인 약물, 예컨대 소라페닙()(프랑스어) 및 소라페니븀(라틴어)을 또한 포함한다.
본 개시내용은 세포를 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 DUX4 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하고/하거나 방해하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 근 위축증 또는 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 근 위축증은 안면견갑상완 근 위축증(FSHD)이다. 일부 양태에서, 암은 육종, B 세포 림프종, 또는 부신, 담관, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 두부/경부, 간, 뇌, 폐, 중피, 신경능, 난소, 췌장, 전립선, 신장, 피부, 연조직, 위, 고환 또는 흉선의 DUX4 발현 암이다.
본 개시내용은 세포에서 마이크로RNA-675의 발현을 상향조절하기 위한 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 세포에서 DUX4 유전자 및/또는 단백질의 발현을 억제하고/하거나 방해하기 위한 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 근 위축증 또는 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 용도를 제공한다. 일부 양태에서, 근 위축증은 안면견갑상완 근 위축증이다. 일부 양태에서, 암은 육종, B 세포 림프종, 또는 부신, 담관, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 두부/경부, 간, 뇌, 폐, 중피, 신경능, 난소, 췌장, 전립선, 신장, 피부, 연조직, 위, 고환 또는 흉선의 DUX4 발현 암이다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 에스트로겐 또는 합성 에스트로겐은 에스트론, 에스트라디올, 에스트리올, 에스테트롤, 27-하이드록시콜레스테롤, 데하이드로에피안드로스테론(DHEA), 7-옥소-DHEA, 7α-하이드록시-DHEA, 16α-하이드록시-DHEA, 7β-하이드록시에피안드로스테론, 안드로스텐디온(A4), 안드로스텐디올(A5), 3α-안드로스탄디올 및 3β-안드로스탄디올, 2-하이드록시에스트라디올, 2-하이드록시에스트론, 4-하이드록시에스트라디올, 4-하이드록시에스트론, 16α-하이드록시에스트론, 에티닐 에스트라디올, 에스트라디올 발러레이트, 에스트로피페이트, 공액 에스테르화 에스트로겐 및 퀴네스트롤이다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 프로게스테론 또는 프로게스틴은 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA), 17α-하이드록시프로게스테론, 클로르마디논 아세테이트, 시프로테론 아세테이트, 게스토덴 또는 에토노게스트렐이다.
일부 추가의 양태에서, 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합은 근육내 주사, 경구 투여, 피하, 피내 또는 피부경유 수송, 혈류로의 주사를 위해 또는 에어로졸 투여를 위해 제형화된다.
본 개시내용의 추가의 양태 및 이점은 도면과 함께 취해져 상기 상세한 설명의 검토로부터 당업자에게 자명할 것이다. 그러나, 본 개시내용의 정신 및 범위 내의 다양한 변경 및 변형이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명하므로, 상세한 설명(도면 및 특정 예를 포함)이 개시된 대상의 실시형태를 나타내면서 오직 예시의 방식으로 주어진다는 것이 이해되어야 한다.
도 1a-b는 긴 5' 및 3' 플랭킹 서열을 갖는 U6.mir-675가 불과 40% 억제 효율로 DUX4 단백질 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 1a. DUX4를 표적화하는 U6.mir-675의 능력을 시험하기 위한 이중 루시퍼라제 검정. 이 연구에 사용된 mir-675 발현 플라스미드가 본원에 도시되어 있다. 이 작제물에서, RNA 중합효소 III U6 프로모터(U6p)는 mir-675의 발현을 제어한다. 6개의 T 뉴클레오타이드의 스트레치로 형성된 말단 신호는 전사의 종결을 허용한다. 오른쪽에, 이의 5' 및 3' 말단 플랭킹 서열을 갖는 mir-675의 2차 구조(박스에 있음)가 도시되어 있다. 5' 말단에서, 플랭킹 서열은 40개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 3' 말단에서, 플랭킹 서열은 114번 위치에서의 뉴클레오타이드로부터 시작하는 47개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 이중 루시퍼라제 검정을 사용하여 DUX4를 표적화하도록 U6.mir-675를 시험하였다. 이를 하기 위해, RenLuc-DUX4-FL 발현 플라스미드에서 DUX4를 클로닝하였고(도 1a), 즉 하기 프라이머에 의해 주형으로서 CMV.DUX4-FLΔV5를 사용하여 DUX4-FL(V5 태그 + 3' UTR이 없는 DUX4 ORF)을 PCR 증폭시켰다: 정방향: 5' CCGGCTCGAGATGGCCCTCCCGACAC 3'(서열 번호 125), 역방향: 5' ACGACTAGTGGGAGGGGGCATTTTAATATATCTC 3'(서열 번호 126). 이후, XhoI/SpeI 제한 부위 및 RenLuc.SD5 돌연변이체-DUX4 3' UTR 플라스미드 골격을 사용하여 이전에 설계된 RenLuc SD5 돌연변이체 플라스미드로 PCR 산물을 클로닝하였다. 레닐라 루시퍼라제 유전자는 DUX4-FL mRNA의 대안적인 스플라이싱을 방지하는 스플라이싱 공여자 돌연변이(*SD5)를 갖는다(Ansseau 등 (2015) PLoS One, 10, e0118813). RenLuc-DUX4-FL 및 U6.mir-675 발현 플라스미드를 인간 배아 신장 HEK293 세포로 형질주입함으로써 이중 루시퍼라제 검정을 수행하였다. 형질주입 후 48시간에, 레닐라 및 반딧불이 루시퍼라제 활성 둘 다를 측정하였다. 후자를 레닐라 루시퍼라제 활성에 정규화하도록 사용하였다. 비표적화 RenLuc 대조군 골격 플라스미드(RenLuc)를 U6.mir-675에 의해 공동형질주입하고, RenLuc-DUX4-FL을 음성 대조군 반응으로서 U6.milacZ에 의해 공동형질주입하였다. 다른 반응에서, mir-675는 각각 10 대 1, 20 대 1 및 40 대 1의 U6.mir-675:RenLuc-DUX4-FL의 몰농도 비(n:n)로 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 24 ± 3%(P<0.0001, ANOVA, N=3), 28 ± 2%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 및 33 ± 3%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 감소시켰다. 모든 판독을 U6.milacZ(음성 대조군)으로 정규화하였다. 6개의 반복실험 데이터를 실험마다 평균하였고, 개별 실험을 3중 반복으로 수행하였다(N=3). 결과는 모든 조합된 실험에 대해 평균 상대 레닐라 루시퍼라제 활성 ± SEM으로서 보고되었다. 양성 대조군으로서 U6.miDUX4.405 발현 플라스미드를 사용하였다[Wallace 등, Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Mar 16; 8: 121-130]. U6.miDUX4.405는 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 80 ± 2% 감소시켰다(P<0.0001, ANOVA, N=3). 도 1b. U6.mir-675는 웨스턴 블롯에서 시험될 때 DUX4 단백질 수준을 감소시켰다. AAV.CMV.DUX4-FL 및 U6.mir-675 또는 인간 긴 비암호화 H19 발현 플라스미드(CMV.H19)에 의한 공동형질주입 후 24시간에 HEK293 세포로부터 수집된 15 μg의 전체 단백질 추출물에서 수행된 3개의 독립 웨스턴 블롯 반복실험(N=3)의 대표적인 웨스턴 블롯 겔 및 정량화 결과가 본원에 도시되어 있다. 전장 DUX4를 COOH-말단 V5 에피토프에 융합한다. 따라서, DUX4를 검출하기 위해, 항-V5 1차 항체를 사용하였다. 정규화군으로서 사용된 β-액틴 단백질을 검출하기 위한 항체를 또한 사용하였다. 그 결과, U6.mir-675 및 CMV.H19는 DUX4 단백질 수준을 각각 46 ± 11%(P<0.02, ANOVA, N=3) 및 48 ± 12%(P<0.02, ANOVA. N=3) 감소시켰다. 모든 값을 AAV.CMV.DUX4-FL 및 U6.milacZ에 의해 공동형질주입된 세포로부터의 DUX4 단백질 수준으로 정규화하였다. 결과는 3개의 독립 반복실험의 평균 퍼센트 DUX4 단백질 수준 ± SEM으로서 보고되어 있다.
도 2a-b는 U6.mir-675-2.1.1 및 U6.mir-675H가 시험관내 남은 mir-675 작제물과 비교할 때 DUX4 단백질 수준의 가장 높은 억제 효율을 나타냈다는 것을 보여준다. 도 2a는 오른쪽에서 줄기-루프 구조의 5' 말단 및 3' 말단에서의 상이한 플랭킹 서열을 갖는 mir-675 작제물의 2차 구조가 나타난다는 것을 도시한다. 도 2a는 왼쪽에서 이 작제물에 대한 발현 플라스미드를 보여준다. H1.mir-675 및 U6.mir-675F2 발현 플라스미드는 핵 이동 HIV 렌티바이러스 게놈을 증가시키도록 보통 사용된 cPPT/CTS 서열을 함유한다. 설계된 mir-675 작제물에서, 5' 말단 플랭킹 서열은 U6.mir-675에 대해 40합체와 U6.mir-675NF(NF = 플랭킹 무) H1.mir-675, U6.mir-675F, U6.mir-675F2, U6.mir-675-2.1, U6.mir-675-2.2 및 U6.mir-675-2.1.1에 대해 1합체 사이의 크기 범위를 갖는다. 3' 말단 플랭킹 서열은 47합체(U6.mir-675)와 무 합체(U6.mir-675NF) 사이의 크기 범위를 갖는다. U6.mir-675 줄기-루프에서, 강조된 뉴클레오타이드는 제한 부위 XhoI 및 SpeI/XbaI 축퇴성 부위에 상응한다. "CNNC" 모티프는 1차 miRNA(pri-miRNA)의 효율적인 절단을 위해 필요한 세린/아르기닌 농후 스플라이싱 인자 3(SRSF3) 부위에 상응한다. N개의 뉴클레오타이드는 모든 뉴클레오타이드를 나타낸다. U6.mir-675는 5개의 CNNC 모티프를 갖는다. U6.mir-675NF; H1.mir-675; U6.mir-675F; U6.mir-675F2, U6.mir-675-2.1; U6.mir-675-2.2 및 U6.mir-675-2.1.1에 대해 5' 말단에서의 뉴클레오타이드는 H1 프로모터가 사용될 때 "C"이고 U6 프로모터가 사용될 때 "G"이다. U6.mir-675 및 U6.mir-675H는 가능한 드로샤(Drosha) 인식 부위로서 "UA"(박스에 있음) 디뉴클레오타이드를 갖는다. 그러나, U6.mir-675-2.3; H1.mir-675-2.4; U6.mir-675-2.3.1 및 U6.mir-675-2.5는 pri-miRNA의 기본 줄기에서 보통 발견된 드로샤 인식 부위로서 "UG"(박스에 있음)를 갖는다. 도 2b. 모든 14개의 mir-675 작제물을 사용한 웨스턴 및 노던 블롯. 3개 내지 8개의 독립 웨스턴 블롯 반복실험(N=3-8)의 2개의 대표적인 웨스턴 블롯 및 정량화 결과가 본원에 도시되어 있다. 형질주입 및 단백질 추출은 도 1a-b와 유사하였다. U6/H1.mir-675 대 CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 발현 플라스미드의 몰 비는 모든 형질주입에서 1 대 3였다. 그래프는 오른쪽에서 mir-675 형질주입 후 평균 DUX4 단백질 수준을 보여준다. 모든 13개의 mir-675 작제물은 U6.mir-675보다 더 우수한 억제 효율을 가졌다(43 ± 4%, N=6)(표 2). U6.mir-675-2.1.1 및 U6.mir-675H는 각각 83 ± 3(N=3 독립 반복실험) 및 89 ± 6(N=3 독립 반복실험)의 억제 효율을 가졌다. U6.mir-675-2.1.1 및 U6.mir-675H는 모든 다른 mir-675 작제물과 비교할 때 통계학적으로 유의미한 DUX4 단백질 수준의 가장 높은 억제 효율을 가졌다(P<0.05, ANOVA, N=3-8 독립 반복실험). CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 발현 플라스미드에서, 전장 DUX4를 COOH-말단 V5 에피토프에 융합한다. 따라서, 도 1a-b에서처럼 항-V5 1차 항체를 사용하여 DUX4를 검출하였다. DUX4를 발현하는 동일한 플라스미드로부터 공동발현된 eGFP를 검출하도록 항체를 또한 사용하고 정규화군으로서 사용하였다. 모든 값을 CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 및 U6-milacZ에 의해 공동형질주입된 세포로부터의 DUX4 단백질 수준으로 정규화하였다. 퍼센트 DUX4 단백질 수준을 정량화하기 위한 각각의 mir-675 작제물에 상응하는 칼럼의 상부에, 각각의 작제물에 대한 완전 RNA 프로파일을 나타내는 노던 블롯 결과가 도시되어 있다. 항-mir-675-5p 이중 비오티닐화된 프로브를 사용하였다. 21합체-25합체 성숙 서열은 겔 블롯의 오른쪽에 표시된다. 결과는 3개 내지 8개 독립 반복실험의 평균 퍼센트 DUX4 단백질 수준 ± SEM으로서 보고되어 있다.
도 3a-b는 U6.mi405F가 원래의 U6.mi405 작제물과 비교할 때 DUX4 발현의 더 높은 억제 효율을 나타냈다는 것을 보여준다. 도 3a는 왼쪽에서 줄기-루프 구조의 5' 말단 및 3' 말단에서의 상이한 플랭킹 서열을 갖는 3개의 U6.mi405 작제물의 2차 구조가 나타난다는 것을 보여준다. U6.mi405는 각각 5' 말단 및 3' 말단에서 34합체 및 41합체 긴 플랭킹 서열을 보유한다. 이 작제물에서, 3' 말단 플랭킹 서열은 SRSF3 스플라이싱 인자에 의해 인식될 수 있는 5개의 "CNNC" 모티프를 갖는다. U6.mi405F는 5' 말단에서 1개의 뉴클레오타이드를 보유하고 3' 말단에서 16합체 긴 3' 플랭킹 서열을 보유한다. 후자는 단일 "CNNC" 모티프를 갖는다. U6.mi405NF는 5' 말단에서 오직 1개의 뉴클레오타이드를 보유하고, 3' 말단에서 "CNNC" 모티프를 보유하지 않는다. 밑줄 표시된 서열은 mi405 가이드 가닥에 상응한다. 오른쪽에서, 이 작제물에 대한 발현 플라스미드뿐만 아니라 RenLuc-DUX4 ORF 이중 루시퍼라제 작제물의 발현 플라스미드가 도시되어 있다. 이중 루시퍼라제 검정 및 웨스턴 블롯은 3개의 mi405 작제물의 억제 효율을 평가하도록 사용되었다. 이중 루시퍼라제 검정에서, U6.mi405는 RenLuc-DUX4 ORF 작제물에 대해 시험될 때 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 85 ± 1% 감소시키고(P<0.0001, ANOVA, N=3), U6.mi405F는 89 ± 1% 감소시키고(P<0.0001, ANOVA, N=3), U6.mi405NF를 66 ± 1% 감소시켰다(P<0.0001, ANOVA, N=3). 모든 판독을 miGFP 음성 대조군으로 정규화하였다. U6.mi405F는 1:4의 DUX4:mi405 몰 비에서 시험될 때 U6.mi405보다 통계학적으로 유의미하게 더 높은 억제 효율을 가졌다(P<0.04 ANOVA, N=3 독립 반복실험). HEK293 세포에서 DUX4 단백질 수준을 감소시키도록 mi405 작제물의 효율을 시험하도록 웨스턴 블롯을 또한 사용하였다. 동일한 1:4의 DUX4:mi405 몰 비를 사용하였다. 형질주입 후 24시간에, U6.mi405, U6.mi405F 및 U6.mi405NF는 DUX4 단백질 수준을 각각 79 ± 1%(P<0.0001, ANOVA, N=2), 99 ± 1%(P<0.0001, ANOVA, N=2) 및 70 ± 13%(P<0.0036, ANOVA, N=2) 감소시켰다. U6.mi405F는 U6.mi405와 비교할 때 평균 20%의 이의 억제 효율 증가를 가졌다(P<0.0079, ANOVA, N=2 독립 반복실험). 모든 정량화를 miGFP 음성 대조군으로 정규화하였다. 결과는 2 독립 반복실험의 평균 퍼센트 DUX4 단백질 수준 ± SEM으로서 보고되어 있다. 도 3b. mi405F 플랭킹 서열을 사용하여 [Wallace 등 Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Mar 16; 8: 121-130]에 의해 이전에 식별된 10개의 miDUX4 후보의 억제 효율을 시험하기 위한 이중 루시퍼라제 검정. 후자의 사용은 시험된 임의의 10개의 miDUX4 miRNA의 억제 효율을 향상시키지 않았다. 그에 반해, mi185F, mi186F, mi318F, mi599F, mi1156F 및 mi1311F는 각각 상대 레닐라 루시퍼라제 활성의 160 ± 8%(P<0.0001, ANOVA, N=3), 27 ± 9%(P<0.026, ANOVA, N=3), 44 ± 15%(P<0.018, ANOVA, N=3), 24 ± 9%(P<0.039, ANOVA, N=3), 34 ± 8%(P<0.0071, ANOVA, N=3) 및 27 ± 9%(P<0.021, ANOVA, N=3)의 증가에 의해 나타난 것처럼 이의 원래의 대응물보다 더 낮은 억제 효율을 가졌다. 모든 판독을 miGFP 음성 대조군으로 정규화하였다. 결과는 3개의 독립 반복실험의 평균 상대 레닐라 루시퍼라제 활성 ± SEM으로서 보고되어 있다.
도 4a-b는 DUX4 대 miDUX4 몰 비의 감소가 다른 10개의 U6.miDUX4F 작제물이 아니라 U6.mi405F의 억제 효율을 증가시켰다는 것을 보여준다. 도 4a는 1:1, 1:2, 1:3 및 1:4의 DUX4 대 miDUX4 몰 비를 사용한 10개의 miDUX4 miRNA 및 이의 동족 miDUX4F 작제물의 억제 효율을 시험하기 위해 사용된 이중 루시퍼라제 검정으로부터의 결과를 억제 효율. U6.mi405F는 U6.mi405와 비교할 때 모든 비에서 향상된 억제 효율을 보여주었다(상대 레닐라 루시퍼라제 활성은 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 1:4 비에서 33 ± 2%; 32 ± 2%; 34 ± 1% 및 32 ± 1% 감소됨)(P<0.0001, ANOVA, N=3 독립 반복실험). 도 4b는 형질주입 후 24시간에 HEK293 세포에서 이중 루시퍼라제 검정을 사용한 mi405, mi405NF 및 mi405F의 용량 단계적 축소 연구의 결과를 보여준다. DUX4:mi405 몰 비는 1:4 내지 40:1의 범위였다. U6.mi405 및 U6.mi405F의 침묵화 효율은 용량 의존적이었다. 그러나, U6.mi405F의 억제 효율은 모든 몰 비에서 U6.mi405의 것보다 항상 더 양호하였다(P<0.0001, ANOVA, N=3). U6.mi405F는 U6.mi405와 비교할 때 48 ± 6%의 상대 레닐라 루시퍼라제 활성의 감소에 의해 8:1 몰 비에서 가장 효율적이었다(P<0.0001, ANOVA, N=3). 모든 판독을 miGFP 음성 대조군으로 정규화하였다. 결과는 3개의 독립 반복실험의 평균 상대 레닐라 루시퍼라제 활성 ± SEM으로서 보고되어 있다.
도 5a-c는 mi405 줄기-루프 구조를 플랭킹하는 5' 및 3' 말단 서열을 변경하는 것이 miRNA의 침묵화 효율에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 도 5a는 오른쪽에서 줄기-루프 구조의 5' 말단 및 3' 말단에서의 상이한 플랭킹 서열을 갖는 10개의 mi405 작제물의 2차 구조가 나타난다는 것을 보여준다. 도 5a는 왼쪽에서 mi405 작제물에 대한 발현 플라스미드, 이중 루시퍼라제 검정(RenLuc-DUX4-ORF) 및 웨스턴 블롯(CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP)를 보여준다. 주석은 도 1a 및 도 2a에서와 동일하다. 도 5b는 2 대 1 및 12 대 1의 DUX4:mi405 몰 비를 갖는 RenLuc-DUX4 ORF 및 U6.mi405 작제물에 의한 이중 루시퍼라제 검정의 결과를 보여준다. 형질주입 후 24시간에, 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 2 대 1 비의 경우에, 모든 U6.mi405 작제물은 U6.mi405NF 및 U6.mi405B를 제외하고 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 효율적으로 감소시켰고, 이는 레닐라 루시퍼라제 활성을 각각 3.6 ± 1.8%(P>0.80, ANOVA, N=3) 및 25 ± 3%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 감소시켰다. 그러나, U6.mi405, U6.mi405A, U6.mi405C, U6.mi405D, U6.mi405E, U6.mi405F, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 레닐라 루시퍼라제 활성을 각각 62 ± 2%, 72 ± 1%, 64 ± 1%, 71 ± 1%, 73 ± 1%, 77 ± 1%, 81 ± 1% 및 80 ± 1%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 감소시켰다. U6.mi405F와 비교할 때, 다른 U6.mi405 작제물 중 어느 것도 통계학적으로 유의미한 향상된 억제 효율을 갖지 않았다. 12 대 1의 DUX4:mi405 몰 비를 사용할 때, U6.mi405F, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 레닐라 루시퍼라제 활성을 각각 45 ± 4%, 59 ± 2% 및 58 ± 2%(P<0.0001, ANOVA, N=3 독립 반복실험) 감소시켰다. U6.mi405F와 비교할 때, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 레닐라 루시퍼라제 활성을 각각 추가 26 ± 5%(P<0.033, ANOVA, N=3) 및 25 ± 6%(0.042, ANOVA, N=3) 감소시켰다. 모든 판독을 U6.miGFP 음성 대조군으로 정량화하였다. 결과는 3개의 독립 반복실험의 평균 상대 레닐라 루시퍼라제 활성 ± SEM으로서 보고되어 있다. 도 5c는 12 대 1의 U6.miRNA 대 CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP의 몰 비에서의 U6.miGFP, U6.mi405, U6.mi405F, U6.mi405G 또는 U6.mi405H 및 CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 발현 플라스미드에 의해 일찍 24시간에 공동형질주입된 HEK293 세포로부터 추출된 전체 단백질의 웨스턴 블롯을 보여준다. 그래프는 4개의 독립 실험의 평균 DUX4 단백질 수준을 보여준다. U6.mi405와 비교할 때, U6.mi405F, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 각각 40 ± 5%(P<0.0209, ANOVA, N=4), 71 ± 5%(P<0.0001, ANOVA, N=4) 및 60 ± 8%(P<0.0009, ANOVA, N=4) DUX4 단백질 수준의 유의미한 감소를 유도하였다. U6.mi405F와 비교할 때, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 각각 52 ± 9%(P<0.0009, ANOVA, N=4) 및 33 ± 14%(P<0.0498, ANOVA, N=4) DUX4 단백질 수준의 유의미한 감소를 유도하였다. 결과는 4개의 독립 반복실험의 평균 퍼센트 DUX4 단백질 수준 ± SEM으로서 보고되어 있다.
도 6a-b는 5' 및 3' 말단 플랭킹 서열의 변경 후 성숙 mi405의 차등적 발현이 검출된다는 것을 보여준다. 도 6a는 표준 TaqMan cDNA 합성 반응을 사용하여 모든 U6.mi405 발현 플라스미드로부터의 성숙 mi405 마이크로RNA 서열의 발현을 평가하기 위해 사용된 QPCR을 보여준다. 후자는 줄기-루프 프라미머 기반 소형 RNA 검출 원칙에 따라 성숙 mi405 서열을 검출하는 역방향 프라이머를 사용한다(ThermoFisher)[Jung 등, RNA (2013) 19: 1-10]. 이후, 증폭 단계에 mi405에 특이적인 표준 TaqMan 프로브를 사용하였다. 이 프로브는 mi405 성숙 서열의 3' 말단과 역방향 프라이머 서열의 5' 말단 사이의 연접부에서 염기쌍을 짓는다. HEK293 세포에서 형질주입 후 24시간에 모든 U6.mi405 작제물에서 QPCR 분석을 수행하였다. 모든 값을 U6.mi405로 정규화하였다. U6.mi405F, U6.mi405B 및 U6.mi405C는 이의 성숙 mi405 서열 발현이 각각 85 ± 5%(P<0.0019, ANOVA, N=3 독립 반복실험), 71 ± 9%(P<0.0038, ANOVA, N=4) 및 63 ± 27%(P<0.0133, ANOVA, N=3) 감소되었다. 그러나, U6.mi405A, U6.mi405D, U6.mi405E, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 U6.mi405로부터 발현된 수준과 비교할 때 최소로 증가된(통계학적으로 유의미하지 않은) 수준에서 성숙 mi405 서열을 발현하였다. 유전자 발현을 hsa-RPL13A로 정규화하였다. 결과는 3개 내지 4개의 독립 반복실험의 상대 mi405 발현 ± SEM으로서 보고되어 있다. Q: 켄쳐. F: 형광단. 도 6b는 mi405, mi405F, mi405B, mi405C, mi405G 및 mi405H 발현 수준을 정량화하기 위한 드롭플렛 디지털 PCR을 보여준다. TaqMan 어드밴스드 cDNA 합성 키트(ThermoFisher)(cDNA 결과는 ddPCR 그래프 위에 예시됨) 및 2개의 TaqMan 어드밴스드 커스텀 제조된 mi405 프로브(임베딩된 mi405 프로브 및 중첩된 mi405 프로브)를 사용하여 cDNA를 생성하였다. 임베딩된 프로브는 오직 mi405 서열 내에 염기쌍을 짓는다. 중첩된 프로브는 mi405 3' 말단 서열 및 어댑터 영역의 일부와 염기쌍을 짓는다. 이 검정에서, mi405 수준을 mir-191-5p 내인성 대조군 miRNA 수준으로 정규화하였다. 결과는 3개의 독립 반복실험의 mir-191-5p에 대한 mi405의 카피 ± SEM으로서 보고되어 있다. R: 리포터 염료. NFQ: 비형광 켄쳐 염료. MGB: 소형 홈 결합제.
도 7은 도 1a-b에 보충적인 자르지 않은 웨스턴 블롯 반복실험을 보여준다.
도 8은 도 2a-b에 보충적인 자르지 않은 웨스턴 블롯 반복실험을 보여준다.
도 9a-b는 U6.mir-675에 대한 성숙 mir-675 수준의 정량화를 보여준다. 도 9a는 HEK293 세포에서 14개의 mir-675 작제물의 형질주입 후 23합체 성숙 mir-675-5p 수준을 정량화하기 위해 사용된 RT-qPCR을 보여준다(도 2a-b 참조). 형질주입 후 24시간에, 제조사 프로토콜에 따라 mirVana 전체 RNA 단리 키트를 사용하여 RNA를 추출하였다. 결과는 성숙 mir-675-5p 및 pri-mir-675 발현 수준과 관련하여 mir-675 작제물 사이의 차이를 보여준다. H1.mir-675(232 ± 35%, P<0.0002, ANOVA, N=3 독립 실험), U6.mir-675F2(882 ± 108%, P<0.0001, ANOVA, N=3) 및 U6.mir-675H(774 ± 93%, P<0.0001, ANOVA, N=3)는 U6.mir-675와 비교할 때 mir-675-5p의 가장 높은 수준을 생성하였다. 그러나, H1.mir-675(320 ± 43%, P<0.0001, ANOVA, N=3), U6.mir-675NF(213 ± 28%, P<0.0087, ANOVA, N=3), U6.mir-675-2.3.1(274 ± 49%, P<0.0007, ANOVA, N=3) 및 U6.mir-675H(256 ± 37%, P<0.0008, ANOVA, N=3)는 U6.mir-675와 비교할 때 pri-mir-675의 가장 높은 수준을 생성하였다. mir-675-5p/pri-mir-675의 비를 살펴볼 때, U6.mir-675F2(918 ± 169%, N=3), U6.mir-675-2.1.1(207 ± 38%, N=3) 및 U6.mir-675H(303 ± 57%, N=3)는 U6.mir-675와 비교할 때 가장 높은 비를 가졌다(P<0.0001, ANOVA, N=3). 도 9b는 TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis 방법을 사용하여 모든 성숙 mir-675-5p 서열을 정량화하기 위해 사용된 ddPCR을 보여준다. 모든 작제물을 도 9a에서처럼 HEK293 세포에서 형질주입하였다. 그 결과, U6.mir-675NF(176 ± 60%, N=3), U6.mir-675F(133 ± 38%, N=3), U6.mir-675F2(181 ± 34%, N=3), U6.mir-675-2.1(142 ± 45%, N=3), U6.mir-675-2.1.1(213 ± 51%, N=3), U6.mir-675-2.3(114 ± 8%, N=3), U6.mir-675-2.3.1(187 ± 40%, N=3), U6.mir-675-2.5(153 ± 52%, N=3) 및 U6.mir-675H(201 ± 38%, N=3)는 U6.mir-675와 비교할 때 더 높은 배수 변화 수준을 보여주었다. 오직 U6.mir-675-2.1.1(P<0.014, ANOVA, N=3), U6.mir-675-2.3.1(P<0.024, ANOVA, N=3) 및 U6.mir-675H(P<0.007, ANOVA, N=3)는 통계적으로 유의미한 더 높은 배수 변화를 갖는다.
도 10은 U6.mi405, U6.mi405F 및 U6.mi405NF를 사용한 DUX4 단백질 수준의 웨스턴 블롯을 보여준다. HEK293s 세포를 1 대 3의 몰 비에서의 CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 및 U6.mi405, U6.mi405F 또는 U6.mi405NF 발현 플라스미드에 의해 공동형질주입하였다. 전체 단백질을 형질주입 후 24시간에 추출하였다.
도 11은 웨스턴 블롯을 사용한 U6.mi405F, U6.mi405G 및 U6.mi405H의 억제 효율을 시험하는 데이터를 보여준다. DUX4:mi405를 2 대 1의 몰 비에서 사용하였다. HEK293 세포를 24시간 동안 U6.miGFP, U6.mi405F, U6.mi405G 또는 U6.mi405H 및 CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 발현 플라스미드에 의해 공동형질주입하였다. U6.mi405F, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 음성 대조군(U6.miGFP) 형질주입된 샘플과 비교할 때 DUX4 단백질 수준을 각각 81 ± 9%, 88 ± 2% 및 79 ± 6% 감소시켰다(P<0.0001, ANOVA, N=3 독립 반복실험). 사용된 DUX4:mi405 몰 비에서 3개의 시험된 mi405 작제물 사이에 통계학적으로 유의미한 차이가 측정되지 않았다. 본 발명자들은 결과를 3개의 독립 반복실험의 평균 퍼센트 DUX4 단백질 수준 ± SEM으로서 보고하였다.
도 12는 도 5c에 보충적인 4개의 독립 웨스턴 블롯 반복실험을 보여주고, 이는 U6.mi405F, U6.mi405G 및 U6.mi405H가 U6.mi405에 비해 40 ± 5%(P<0.0209, ANOVA, N=4), 71 ± 5%(P<0.0001, ANOVA, N=4) 및 60 ± 8%(P<0.0009, ANOVA, N=4)의 DUX4 단백질 수준의 유의미한 감소를 유도한다는 것을 나타낸다. 게다가, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 U6.mi405F와 비교할 때 52 ± 9%(P<0.0009, ANOVA, N=4) 및 33 ± 14%(P<0.0498, ANOVA, N=4)의 DUX4 단백질 수준의 유의미한 감소를 유도하였다.
도 13a-d는 mir-675가 고효율로 DUX4 ORF 및 3' UTR에서의 부위를 표적화한다는 것을 보여주는 분자 비콘 결합 검정(MBB 검정)으로부터의 결과를 보여준다. 도 13a는 mir-675-5p에 대한 예측된 표적 부위(TS) 위치를 보여주는 DUX4 서열의 도식을 제공한다. 도 13b(왼쪽)는 DUX4 서열에 대한 mir-675-5p 결합을 결정하기 위해 사용된 형광 기반 분자 비콘 결합 검정을 설명하는 도식을 제공한다. 비결합되어, 분자 비콘(MB)은 줄기 루프 구조로 폴딩하고, 이는 켄쳐(zenBHQ)를 형광단(6FAM)에 가깝게 근접하게 놓아서 6FAM의 형광 방출을 켄칭한다. mir-675-5p의 성숙 서열을 MB 루프 서열에서 혼입하였다. 상보성 TS 서열에 대한 MB의 혼성화는 형광단 및 켄처를 분리하여서 형광 방출을 허용하고, 이후 이것은 결합의 측정치로서 정량화된다. 도 13b(오른쪽)는 도 13a에 도시된 표적 부위에 대한 성숙 mir-675-5p 분자 비콘의 결합을 보여주는 그래프를 제공한다. 각각의 데이터 점은 3개의 별개의 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. mir-675-5p는 전장 DUX4 서열 내의 8개의 표적 부위(TS527, TS649, TS668, TS754, TS780, TS1004, TS1340 및 TS1471)에 결합할 수 있었다. 처음의 6개의 TS는 DUX4 ORF에 있고, 남은 2개의 TS는 3' UTR에서 발견된다. 6개의 예측된 TS는 mir-675-5p에 결합하지 않았다(TS 위치 및 서열에 대해 도 17a-17b 및 도 13d 참조). TS 음성 대조군은 무작위 서열이다. 도 13c는 각각의 표적 부위에 대한 mir-675-5p 분자 비콘의 결합 친화도(Kd)가 상대 형광 단위(RFU)로 표현된 분자 비콘 신호(MBS)로부터의 배경 형광 신호를 공제함으로써 결정되었다는 것을 보여준다. Kd는 최대 형광의 절반에 도달하는 데 필요한 TS 농도(μM)에 상응한다. (RNA 하이브리드 알고리즘에 의해 예측된 것과 같이) mir-675-5p와 이의 TS 사이의 염기쌍 짓기뿐만 아니라 이의 상응하는 Kd 값이 또한 도시되어 있다. RNA "모방체" 염기는 mir-675-5p:TS 쌍에서 생성되었고, "G"가 "T"를 바라볼 때마다 "G" 뉴클레오타이드를 (회색의) "A" 뉴클레오타이드로 대체하였다. 도 13d는 5' 태그(6FAM 염료) 및 3' 태그(Zen 검정 홀 qTencher(ZenBHQ))를 갖는 miRNA-5p에 대한 분자 비콘 및 DUX 4 표적 부위의 각각의 위치, 명칭 및 서열을 보여준다.
도 14는 mir-675 가공을 조사하기 위한 상이한 mir-675 작제물에 대한 노던 블롯을 보여준다. U6.miGFP(gfp mRNA를 표적화하는 음성 대조군 miRNA), U6.mir-675, H1.mir-675, U6.mir-675-3p 및 U6.mir-675-5p 작제물에 의해 형질주입된 HEK293 세포로부터 추출된 RNA에서 노던 블롯을 수행하였다. U6.miGFP 및 U6.mir-675-3p 음성 대조군 작제물은 임의의 밴드를 보여주지 않았다. U6.mir-675 작제물은 21합체와 25합체 사이의 크기를 갖는 성숙 mir-675-5p의 낮은 수준을 생성하였다. H1.mir-675 작제물은 25합체와 가까운 크기를 갖는 성숙 mir-675-5p의 풍부한 수준을 생성하였다. U6.mir-675-5p 작제물은 또한 21합체와 가까운 크기를 갖는 성숙 mir-675-5p의 풍부한 수준을 제공하였다. H1.mir-675 생성된 성숙 mir-675-5p는 각각 형질주입 후 24시간 및 48시간에 U6.mir-675 생성된 성숙 mir-675-5p보다 13배 및 23배 더 풍부하였다. H1.mir-675의 경우에, 형질주입 후 24시간에 비해 48시간에 1.4배 더 성숙한 mir-675-5p가 생성되었다.
도 15a-b는 mir-675가 DUX4 유도 근육 손상으로부터 마우스 골격 전경골근(TA) 근육을 보호할 수 있다는 것을 보여준다. 도 15a는 벡터의 표시된 용량에 의한 근육내(IM) 주사 후 2주에 AAV 주사된 성체 마우스(C57BL/6) TA 근육의 H&E 염색, 중앙 핵 계수치 및 유전자 발현(ddPCR) 분석을 보여준다. 영상은 고출력(20배) 및 저출력(4배)에서 H&E로 염색된 10 μm 저온절편을 보여준다. 저출력 영상에서 잠재적인 병변의 너비를 가시화하는 것을 돕도록, 중앙 핵(CN) 또는 활성 퇴행 및 염증의 부위를 갖는 섬유를 자주색의 디지털 오버레이에 의해 의도적으로 음영처리하였다. DUX4 발현 근육은 염증성 침윤물, 중앙 핵 및 가변 섬유 크기를 갖는 근섬유를 포함하는 퇴행의 조직병리학적 증거를 보여준다(상부 왼쪽). AAV.CMV.DUX4-FL 및 scAAV6.mir-675 벡터의 공동주사(각각 상부 오른쪽)는 조직학적으로 정상이다. 고출력 사진은 scAAV6.mir-675 및 AAV.CMV.DUX4-FL과 공동주사된 n=6 TA, AAV.milacZ 및 AAV.CMV.DUX4-FL과 공동주사된 n=3 TA 및 AAV.milacZ 및 scAAV6.mir-675와 공동주사된 n=3 TA의 표시된 벡터 투여량에서의 대표적인 영상을 보여준다. 후자의 TA 근육은 조직학적으로 정상이고(하부 왼쪽), 이는 scAAV6.mir-675가 근육에 독성이 아니라는 것을 나타낸다. 기준자, 고출력에 대해 100 μm; 저출력 영상에 대해 500 μm. 20x H&E 염색된 TA 근육 연속 절편(10 μm)의 중앙 핵 계수치. scAAV6.mir-675 처리된 근육은 AAV.milacZ 및 AAV.CMV.DUX4-FL과 공동주사된 TA 근육(N=3)과 비교할 때 중앙 핵을 갖는 85 ± 14%(N=6, 2측 비쌍별 t-시험, ****, P<0.0001)의 더 적은 근섬유를 갖는다. scAAV6.mir-675 처리된 및 비처리된 TA 근육에서의 DUX4-FL 발현의 드롭플렛 디지털 PCR(ddPCR). 처리된 TA 근육에서, DUX4-FL 수준은 비처리된 근육과 비교할 때 56 ± 32% 감소되었다(N=6, 2측 비쌍별 t 시험, *, P<0.038). scAAV6.mir-675 처리된 및 비처리된 TA 근육에서의 mir-675 및 DUX4 반응성 마우스 바이오마커(Trim36 및 Wfdc3)의 ddPCR. Trim36 및 Wfdc3 발현은 각각 90 ± 31%(N=6, ANOVA, ***, P<0.0003) 및 54 ± 20%(N=6, ANOVA, *, P<0.039) 감소되었다. 도 15b는 DUX4(V5 에피토프, 적색) 또는 핵(DAPI, 청색)에 대해 면역형광으로 염색된 10 μm 저온절편을 보여주는 영상을 제공한다. 고출력 사진은 scAAV6.mir-675 및 AAV.CMV.DUX4-FL과 공동주사된 N=6 TA, AAV.milacZ 및 AAV.CMV.DUX4-FL과 공동주사된 N=3 TA의 표시된 벡터 투여량에서의 대표적인 영상을 보여준다. mir-675의 부재 하에, DUX4 단백질의 높은 수준이 검출된다. 흰색 화살표는 DUX4 단백질을 발현하는 대표적인 섬유 및 근핵을 나타낸다.
도 16a-c는 mir-675-5p가 DUX4를 표적화하는 성숙 miRNA 가닥이라는 것을 보여준다. 도 16a는 hsa-H19 lncRNA(CMV.H19)에 의해 형질주입된 HEK293 세포에서의 mir-675 발현의 QPCR 분석을 보여준다. miR-675-5p 발현은 miR-675-3p의 것에 대한 것이다. mir-675-5p 및 mir-675-3p의 성숙 서열을 인식하도록 설계된 Taqman 프로브를 사용하여 QPCR을 수행하였다. mir-675-3p 발현은 mir-675-5p의 것에 비해 2.20 ± 0.15배 더 높았다(P<0.0001, ANOVA, N=3). 유전자 발현을 하우스키핑 유전자 RPL13A로 정규화하였다. 결과는 3개의 반복실험의 평균 상대 유전자 발현 ± SEM으로서 보고되었다(N=3). 도 16b는 U6.mir-675-3p, U6.mir-675-5p(그래프의 옆에 mir-675-3p 및 mir-675-5p에 대한 상응하는 줄기 루프 구조를 참조) 및 RenLuc-DUX4-FL 작제물에 의한 이중 루시퍼라제 검정을 보여준다. RenLuc-DUX4-FL의 40배(pmole)에서 miRNA(pmole)를 사용하였다. U6.mir-675-3p 작제물을 시험할 때, U6.mir-675-3p가 음성 대조군 mir-675-5p 수준에 비해 mir-675-3p의 높은 수준을 발현하더라도, 상대 레닐라 루시퍼라제는 이의 활성의 평균 95%(P<0.2, ANOVA)에서 유지되었다. 다른 한편, U6.mir-675-5p는 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 평균 33 ± 3% 감소시킬 수 있었다(P<0.0001, ANOVA, N=3). 모든 판독을 milacZ 음성 대조군으로 정규화하였다. 결과는 3개의 반복실험의 평균 상대 레닐라 루시퍼라제 활성 ± SEM으로서 보고되었다(N=3). 도 16c는 표적 서열(mir-675R)로서 mir-675-5p의 역방향 상보성 서열을 사용한 이중 루시퍼라제 검정을 보여준다. 레닐라 루시퍼라제 유전자의 하류에 3' UTR로서 이 서열을 클로닝하였다. 상응하는 상대 레닐라 루시퍼라제 활성의 억제 효율을 측정함으로써 mir-675 완전 표적 부위(PTS) mir-675R에 대한 표적화 효율에 대해 U6.mir-675 작제물을 시험하였다. U6.mir-675는 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 용량 의존적 방식으로 감소시켜 41 ± 12%의 최대 억제에 도달하고(P<0.01, ANOVA, N=3), CMV.H19는 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 40 ± 6% 감소시켰다(P<0.0048, ANOVA, N=3). 모든 판독을 milacZ 음성 대조군으로 정규화하였다. 결과는 3개의 반복실험의 평균 상대 레닐라 루시퍼라제 활성 ± SEM으로서 보고되었다.
도 17a-b는 DUX4 서열에서의 mir-675 결합 부위를 보여준다. 도 17a는 mir-675, mir-675-5p 및 mir-675-3p의 줄기 루프 구조를 보여준다. 성숙 서열은 적색으로 강조된다. 도 17b는 DUX4 서열(DUX4 ORF + 인트론이 없는 3' UTR)을 보여준다. 검증된 mir-675-5p 결합 부위는 적색으로 강조된다. 오직 mir-675-5p 결합 부위가 여기서 도시되어 있다.
도 18은 U6.mir-675, CMV.mir-675, H1.mir-675, U6.mir-675-5p, CMV.H19 및 mir-675 모방체(성숙 이중 가닥 mir-675 서열)가 DUX4 단백질 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 19는 도 18의 반복실험이고, U6.mir-675, H1.mir-675 및 U6.mir-675-5p가 DUX4 단백질 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 그러나, 도 19는 또한 이 mir-675 작제물이 mir-675 내성 DUX4 작제물에 대해 시험될 때 DUX4 단백질 수준을 감소시킬 수 없었다는 것을 보여준다(CMV.DUX4-mir-675Res: 이 발현 플라스미드는 DUX4 돌연변이체 서열을 암호화한다. 이 서열은 ORF에서 발견된 mir-675 표적 부위 780(TS780)에서 돌연변이되고(도 17b 참조), 이의 3' UTR이 결실되어서, 이 DUX4 돌연변이체의 발현이 mir-675 의존적 억제에 저항적이게 한다).
도 20은 CMV 프로모터 하의 mir-675 작제물이 DUX4 발현의 약 50% 억제를 일으킨다는 것을 보여주고, 이는 CDS mRNA를 발현하도록 대부분 사용된 프로모터로부터의 mir-675의 강력한 발현을 나타낸다. 도 20은 도 18의 반복실험이고, 맹검 웨스턴 블롯에서, U6.mir-675, CMV.mir-675, H1.mir-675, U6.mir-675-5p, CMV.H19 및 mir-675 모방체가 DUX4 단백질 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 20은 또한 이 mir-675 작제물이 mir-675 내성 DUX4 작제물에 대해 시험될 때 DUX4 단백질 수준을 감소시킬 수 없었다는 것을 보여준다. mir-675를 발현하는 다양한 작제물 및 전장 V5 태그화된 DUX4 작제물(DUX4-FL WT: CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 및 DUX4-mir-675Res: CMV.DUX4-mir-675Res)에 의해 공동형질주입된 HEK293 세포로부터의 단백질 추출물에서 3개의 반복된 맹검 웨스턴 블롯을 수행하였다. 후자는 동일한 프라스미드 골격으로부터 eGFP를 공동발현한다. 정량화 목적을 위해 형질주입 대조군 및 기준 유전자로서 eGFP를 사용하였다. DUX4 단백질 수준을 그래프에 도시된 것처럼 milacZ 샘플에 대해 정량화하였다.
도 21은 도 18의 반복실험이고, 맹검 웨스턴 블롯에서, U6.mir-675, CMV.mir-675, H1.mir-675, U6.mir-675-5p 및 CMV.H19가 DUX4 단백질 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 21은 또한 이 mir-675 작제물이 mir-675 내성 DUX4 작제물에 대해 시험될 때 DUX4 단백질 수준을 감소시킬 수 없었다는 것을 보여준다. mir-675를 발현하는 다양한 작제물 및 전장 V5 태그화된 DUX4 작제물(DUX4-FL WT: CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 및 DUX4-mir-675Res: CMV.DUX4-mir-675Res)에 의해 공동형질주입된 HEK293 세포로부터의 단백질 추출물에서 3개의 반복된 맹검 웨스턴 블롯을 수행하였다. 후자는 동일한 프라스미드 골격으로부터 eGFP를 공동발현한다. 정량화 목적을 위해 형질주입 대조군 및 기준 유전자로서 eGFP를 사용하였다. DUX4 단백질 수준을 그래프에 도시된 것처럼 milacZ 샘플에 대해 정량화하였다.
도 22는 도 18의 다른 반복실험을 제공하고(왼쪽 패널 및 오른쪽 패널(블롯) 참조), 맹검 웨스턴 블롯에서, H1.mir-675 및 CMV.H19가 DUX4 단백질 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 게다가, 도 22(오른쪽 패널)는 U6.mir-675, CMV.mir-675, H1.mir-675, U6.mir-675-5p, CMV.H19 및 mir-675 모방체가 DUX4 단백질 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. mir-675를 발현하는 다양한 작제물 및 전장 V5 태그화된 DUX4 작제물(DUX4-FL WT: CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 및 DUX4-mir-675Res: CMV.DUX4-mir-675Res)에 의해 공동형질주입된 HEK293 세포로부터의 단백질 추출물에서 3개의 반복된 맹검 웨스턴 블롯을 수행하였다(도 20-22). 후자는 동일한 프라스미드 골격으로부터 eGFP를 공동발현한다. 정량화 목적을 위해 형질주입 대조군 및 기준 유전자로서 eGFP를 사용하였다. DUX4 단백질 수준을 그래프에 도시된 것처럼 milacZ 샘플에 대해 정량화하였다. 도 20에서, CMV 프로모터 하의 mir-675 작제물은 시험되고 DUX4 발현의 약 50% 억제를 보여주었고, 이는 CDS mRNA를 발현하도록 대부분 사용된 프로모터로부터의 mir-675의 강력한 발현을 나타낸다. mir-675를 발현하는 다양한 작제물 및 전장 V5 태그화된 DUX4 작제물(DUX4-FL WT: CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 및 DUX4-mir-675Res: CMV.DUX4-mir-675Res)에 의해 공동형질주입된 HEK293 세포로부터의 단백질 추출물에서 3개의 반복된 맹검 웨스턴 블롯을 수행하였다. 후자는 동일한 프라스미드 골격으로부터 eGFP를 공동발현한다. 정량화 목적을 위해 형질주입 대조군 및 기준 유전자로서 eGFP를 사용하였다. DUX4 단백질 수준을 그래프에 도시된 것처럼 milacZ 샘플에 대해 정량화하였다.
도 23a-b는 DUX4 mRNA 수준이 CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 발현 플라스미드에 의해 공동형질주입된 HEK293 세포에서 H1.mir-675의 과발현 시 감소된다는 것을 보여준다. 도 23a는 DUX4 발현의 QPCR 측정을 보여준다. H1.mir-675 작제물을 HEK293 세포에서 DUX4 작제물에 의해 3 대 1 비로 형질주입하고, 형질주입 후 24시간 및 48시간에 RNA 추출물을 수집하였다. miRVANA 단리 키트를 사용하여 전체 RNA를 제조하였다. 재료 및 방법에 기재된 것과 같은 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여 DUX4 및 egfp(기준 유전자로서 사용됨) mRNA 수준을 결정하였다. 모든 값은 egfp로 정규화되고, milacZ 처리된 샘플에 대해 보고되었다. 형질주입 후 24시간 및 48시간에, DUX4 수준은 각각 평균 37 ± 2%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 및 51 ± 2%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 감소되었다. 결과는 3개의 반복실험의 평균 상대 DUX4 발현 ± SEM으로서 보고되었다. 도 23b는 QPCR에 의한 HEK293 세포에서의 이의 과발현 후 mir-675-5p 발현의 측정을 보여준다. milacZ 샘플과 비교할 때, mir-675-5p 과발현된 수준은 약 2000배 더 높았다(P<0.0001, ANOVA, N=3). 결과는 3개의 반복실험의 평균 상대 mir-675-5p 발현(2-ΔCq) ± SEM으로서 보고되었다.
도 24는 pri-mir-675 및 mir-675-3p가 인간 대조군(15V) 및 FSHD 이환된(15A 및 17A) 근원세포 및 근관세포에서 발현된다는 것을 보여준다. 3개의 상이한 인간 골격근 유래된 근원세포 세포주 15V, 15A 및 17A에서 pri-mir-675 및 mir-675-3p의 발현을 측정하였다. RNA를 제조하고, pri-mir-675(1차 mir-675 전사체) 및 mir-675-3p의 유전자 발현을 근원세포 및 4일 분화된(4DD) 근관세포에서 측정하였다. 그 결과, pri-mir-675 및 mir-675-3p는 15V, 15A 및 17A 근원세포 및 분화된 근관세포에서 그러나 다양한 수준으로 발현되었다. 특히, pri-mir-675 및 mir-675-3p 수준 둘 다는 모든 시험된 세포주에서 분화 시 증가하였다. 더 정확하게는, pri-mir-675 발현은 15V에 대해 2.3 ± 0.1배(P<0.0001, ANOVA, N=3), 15A에 대해 2.3 ± 0.2배(P<0.0001, ANOVA, N=3) 및 17A에 대해 3.3 ± 0.4배(P<0.0001, ANOVA, N=3) 증가하였다. 다른 한편, mir-675-3p 발현은 15V에 대해 7.7 ± 1.0배(P<0.0001, ANOVA, N=3), 15A에 대해 7.9 ± 0.2배(P<0.0001, ANOVA, N=3) 및 17A에 대해 1.4 ± 0.1배(P<0.0001, ANOVA, N=3) 증가하였다. 결과는 15V 근원세포에서 유전자 발현에 대해 3개의 반복실험(N=3)의 상대 유전자 발현(ΔΔCq) ± SEM으로서 보고되었고, 각각의 QPCR 검정은 3중 반복으로 수행되었다. 기준 유전자로서 하우스키핑 유전자 RPL13A를 사용하여 모든 결과를 정량화하였다.
도 25는 mir-675가 HEK293 세포에서 SMAD1, SMAD5 및 CDC6을 표적화한다는 것을 보여준다. 각각의 조사된 유전자에 특이적인 TaqMan 프로브를 사용하여 HEK293 세포에서 QPCR에 의해 SMAD1, SMAD5 및 CDC6의 발현을 측정하였다. 이것을 하기 위해, U6.milacZ(음성 대조군), H1.mir-675, U6.mir-675-3p 또는 U6.mir-675-5p 발현 작제물을 HEK293 세포로 형질주입하고, 전체 RNA를 형질주입 후 48시간에 추출하였다. 그 결과, U6.mir-675-3p는 SMAD1 수준을 평균 32 ± 6% 감소시키고(P<0.044, ANOVA, N=3), SMAD5 수준을 평균 35 ± 6% 감소시켰다(P<0.0013, ANOVA, N=3). 다른 한편, H1.mir-675 및 U6.mir-675-5p는 CDC6 수준을 각각 평균 38 ± 4%(P<0.0034, ANOVA, N=3) 및 36 ± 7%(P<0.0048, ANOVA, N=3) 억제하였다. 결과는 U6.milacZ에 의해 형질주입된 세포에서 유전자 발현에 대해 3개의 반복실험(N=3)의 상대 유전자 발현(ΔΔCq) ± SEM으로서 보고되었고, 각각의 QPCR 검정은 3중 반복으로 수행되었다. 기준 유전자로서 하우스키핑 유전자 RPL13A를 사용하여 모든 결과를 정량화하였다.
도 26은 15V Ctrl 근관세포에서의 Cdc6 단백질의 검출을 위한 자르지 않은 웨스턴 블롯 겔을 보여준다. Cdc6은 mir-675에 대한 천연 표적이다. 따라서, 이 도면은, 항-mir-675에 의한 15V 대조군(Ctrl) 근관세포의 형질주입이 Cdc6 단백질의 유도 발현으로 이어지므로, 항-mir-675 안타고미르(antagomir)를 사용한 mir-675의 억제가 작용한다는 것을 보여준다.
도 27은 항-mir-675-5p, DUX4-FL(WT) 및 DUX4-mir-675Res 작제물에 의해 공동형질주입된 15A FSHD 근관세포로부터의 단백질 추출물에서 수행된 3개의 자르지 않은 반복된 웨스턴 블롯을 보여준다. 이 도면은 DUX4 발현 플라스미드(DUX4-FL WT)에 의해 형질주입된 15A FSHD 근관세포에서의 항-mir-675-5p(aka 항-mir-675)의 형질주입이 DUX4의 유도 발현으로 이어진다는 것을 보여주고, 이는 내인성으로 발현된 mir-675가 DUX4의 발현을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 근관세포를 분화 후 4일에 수집하였다. 반복실험 1 및 반복실험 2에 대해, 알파-튜불린을 기준 유전자로서 사용하고, 알파-튜불린 토끼 다중클론 항체(5% 밀크 TBST 완충액 중의 1:500, ab15246; Abcam)를 사용하여 검출하였다. 항-V5 항체(5% 밀크 TBST 완충액 중의 1:5,000에서 사용된 HRP 커플링된 마우스 단일클론 항체)를 사용하여 DUX4 단백질을 검출하였다. 반복실험 3에 대해 15A 근원세포를 둘 다 eGFP를 공동발현하는 CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 또는 CMV.DUX4-mir-675Res 플라스미드에 의해 형질주입하였다. 정량화 목적을 위해 형질주입 대조군 및 기준 유전자로서 후자를 사용하였다. 이 복제된 웨스턴 블롯에서, 항-V5 항체를 사용하여 DUX4 단백질을 또한 검출하였다.
도 28은 β-에스트라디올, β-에스트라디올 + 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA) 또는 멜라토닌이 대조군, 즉 100% 에탄올 처리된 DUX4 형질주입된 세포와 비교할 때 mir-675 수준을 유의미하게 증가시켰다는 것을 보여준다. HEK293 세포에서 β-에스트라디올, MPA 및 멜라토닌은 mir-675 발현을 증가시키고, DUX4 및 DUX4 유도 바이오마커 TRIM43의 발현을 감소시켰다. mir-675-5p, DUX4 및 TRIM43 수준을 측정하도록 드롭플렛 디지털 PCR(ddPCR)을 수행하였다. HEK293 세포를 DUX4에 의해 형질주입하고, 형질주입 시 개별적으로 2종의 약물(즉, β-에스트라디올 및 멜라토닌) 또는 10, 20 또는 40 μM에서의 β-에스트라디올 및 MPA의 조합에 의해 처리하였다. 에탄올(비히클) 처리된 세포와의 비교에 의해 이 약물의 효과를 평가하였다. 숫자는 n=3 독립 실험(ANOVA, P<0.0001)에 상응한다. β-에스트라디올, β-에스트라디올 + MPA 또는 멜라토닌으로 처리된 HEK293 세포로부터의 유전자 발현의 정량화(퍼센트 변화)는 드롭플렛 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 측정되고, 본원에 제공된 표 3에서 보고되어 있다.
도 29a-c는 15A(도 29a), 17A(도 29b) 및 18A(도 29c) FSHD 분화된 근육 세포주(근관세포)에서 내인성 mir-675-5p, DUX4 및 TRIM43의 발현에 대한 β-에스트라디올, β-에스트라디올 + MPA 또는 멜라토닌인 3개의 처리 레지멘의 효과를 보여준다. 이 FSHD 세포주는 낮은(15A), 중간(18A) 및 높은(17A) DUX4 발현을 나타내므로 선택되었다[Jones 등, Hum. Mol. Genet. 21: 4419-30 (2012)]. β-에스트라디올, β-에스트라디올 + MPA 및 멜라토닌의 각각은 3개의 FSHD 이환된 근관세포주에서 mir-675 발현을 증가시키고, DUX4 및 DUX4 유도 바이오마커 TRIM43의 발현을 감소시켰다. 모든 처리를 에탄올(비히클) 처리된 대조군 세포와 비교하였다(15A에 대해 n=6 독립 실험 및 17A 및 18A에 대해 N=3. *, P<0.05. **, P<0.01. ***, P<0.001, ANOVA). 5일 분화된 15A, 17A 및 18A 근관세포에서의 유전자 발현(mir-675-5p, DUX4 및 TRIM43)의 정량화는 본원에서 표 4에 보고되어 있다.
도 30은 내인성 mir-675가 대조군 비이환된 분화된 근육 세포주(15V 근육 세포주의 근관세포)에서 CDC6 유전자 발현을 표적화하고, 15A FSHD 이환된 인간 근관세포에서 DUX4 유도 독성을 방지한다는 것을 보여준다. 특이적 항-mir-675 안타고미르를 사용함으로써 그리고 4일 분화된 15V 대조군 근관세포에서 Cdc6 단백질 수준을 측정함으로써 CDC6 유전자 발현의 표적화를 시험하였다. 항-mir-675에 의해 형질주입된 근관세포에서 Cdc6이 오직 검출되었다(또한 자르지 않은 겔에 대해 도 26 참조). 기준품으로서 하우스키핑 단백질 α-튜불린을 사용하였다.
도 31a-c는 mir-675가 고효율로 DUX4 ORF 및 3' UTR에서의 부위를 표적화한다는 것을 보여주는 분자 비콘 결합 검정(MBB 검정)으로부터의 결과를 보여준다(그리고 도 13a-c에 대한 업데이트를 제공한다). 도 31a는 mir-675-5p에 대한 예측된 표적 부위(TS) 위치를 보여주는 DUX4 서열의 도식을 제공한다. 도 31b(왼쪽 패널)는 DUX4 서열에 대한 mir-675-5p 결합을 결정하기 위해 사용된 형광 기반 분자 비콘 결합 검정을 설명하는 도식을 제공한다. 비결합되어, 분자 비콘(MB)은 줄기 루프 구조로 폴딩하고, 이는 켄쳐(zenBHQ)를 형광단(6FAM)에 가깝게 근접하게 놓아서 6FAM의 형광 방출을 켄칭한다. mir-675-5p의 성숙 서열을 MB 루프 서열에서 혼입하였다. 상보성 TS 서열에 대한 MB의 혼성화는 형광단 및 켄처를 분리하여서 형광 방출을 허용하고, 이후 이것은 결합의 측정치로서 정량화되었다. 도 31b(오른쪽 패널)는 도 31a에 도시된 표적 부위에 대한 성숙 mir-675-5p 분자 비콘의 결합을 보여주는 그래프를 제공한다. 각각의 데이터 점은 3개의 별개의 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. mir-675-5p는 전장 DUX4 서열 내의 8개의 표적 부위(TS527, TS649, TS668, TS754, TS780, TS1004, TS1340 및 TS1471)에 결합할 수 있었다. 처음의 6개의 TS는 DUX4 ORF에 있고, 남은 2개의 TS는 3' UTR에서 발견된다. 6개의 예측된 TS는 mir-675-5p에 결합하지 않았고(TS 위치 및 서열에 대해 도 17a-17b 및 도 13d 참조); 도 13d는 5' 태그(6FAM 염료) 및 3' 태그(Zen 검정 홀 qTencher(ZenBHQ))를 갖는 miRNA-5p에 대한 분자 비콘 및 DUX 4 표적 부위의 각각의 위치, 명칭 및 서열을 보여준다. TS 음성 대조군은 무작위 서열이다. 도 31c는 각각의 표적 부위에 대한 mir-675-5p 분자 비콘의 결합 친화도(Kd)가 상대 형광 단위(RFU)로 표현된 분자 비콘 신호(MBS)로부터의 배경 형광 신호를 공제함으로써 결정되었다는 것을 보여준다. Kd는 최대 형광의 절반에 도달하는 데 필요한 TS 농도(μM)에 상응한다. (RNA 하이브리드 알고리즘에 의해 예측된 것과 같이) mir-675-5p와 이의 TS 사이의 염기쌍 짓기뿐만 아니라 이의 상응하는 Kd 값이 또한 도시되어 있다. RNA "모방체" 염기는 mir-675-5p:TS 쌍에서 생성되었고, "G"가 "T"를 바라볼 때마다 "G" 뉴클레오타이드를 (회색의) "A" 뉴클레오타이드로 대체하였다.
도 32a-b는 mir-675가 DUX4 유도 근육 손상으로부터 마우스 골격 전경골근(TA) 근육을 보호할 수 있다는 것을 보여준다(그리고 도 15a-b에 대한 업데이트를 제공한다). 도 32a는 벡터의 표시된 용량에 의한 근육내(IM) 주사 후 2주에 AAV 주사된 성체 마우스(C57BL/6) TA 근육의 H&E 염색, 중앙 핵 계수치 및 유전자 발현(ddPCR) 분석을 보여준다. 영상은 고출력(20배) 및 저출력(4배)에서 H&E로 염색된 10 μm 저온절편을 보여준다. 저출력 영상에서 잠재적인 병변의 너비를 가시화하는 것을 돕도록, 중앙 핵(CN) 또는 활성 퇴행 및 염증의 부위를 갖는 섬유를 자주색의 디지털 오버레이에 의해 의도적으로 음영처리하였다. DUX4 발현 근육은 염증성 침윤물, 중앙 핵 및 가변 섬유 크기를 갖는 근섬유를 포함하는 퇴행의 조직병리학적 증거를 보여준다(상부 왼쪽). AAV.CMV.DUX4-FL 및 scAAV6.mir-675 벡터(각각 상부 오른쪽)의 공동주사 후, 근육은 조직학적으로 정상이었다. 고출력 사진은 scAAV6.mir-675 및 AAV.CMV.DUX4-FL과 공동주사된 n=8 TA, 음성 대조군 AAV(AAV.milacZ 또는 AAV.eGFP) 및 AAV.CMV.DUX4-FL과 공동주사된 n=5 TA 및 AAV.milacZ 및 scAAV6.mir-675와 공동주사된 n=3 TA의 표시된 벡터 투여량에서의 대표적인 영상을 보여준다. 후자의 TA 근육은 조직학적으로 정상이고(하부 왼쪽), 이는 scAAV6.mir-675가 근육에 독성이 아니라는 것을 나타낸다. 기준자, 고출력에 대해 100 μm; 저출력 영상에 대해 500 μm. 20x H&E 염색된 TA 근육 연속 절편(10 μm)의 중앙 핵 계수치. scAAV6.mir-675 처리된 근육은 음성 대조군 AAV 및 AAV.CMV.DUX4-FL과 공동주사된 TA 근육(N=5)과 비교할 때 중앙 핵을 갖는 81 ± 6%(N=8, 2측 비쌍별 t-시험, ***, P=0.0004)의 더 적은 근섬유를 보여주었다. scAAV6.mir-675 처리된 및 비처리된 TA 근육에서의 DUX4-FL 발현의 드롭플렛 디지털 PCR(ddPCR). 처리된 TA 근육에서, DUX4-FL 수준은 비처리된 근육과 비교할 때 56 ± 12% 감소되었다(N=8, 2측 비쌍별 t 시험, *, P=0.01). scAAV6.mir-675 처리된 및 비처리된 TA 근육에서의 mir-675 및 DUX4 반응성 마우스 바이오마커(Trim36 및 Wfdc3)의 ddPCR. Trim36 및 Wfdc3 발현은 각각 88 ± 4%(N=8, ANOVA, ***, P=0.0004) 및 57 ± 13%(N=8, ANOVA, *, P<0.011) 감소되었다. 도 32a, 중앙 오른쪽, 음성 대조군 AAV 및 AAV.CMV.DUX4-FL 또는 AAV.CMV.DUX4-FL 및 scAAV6.mir-675와 공동주사된 TA 근육으로부터 수집된 단백질에 대한 웨스턴 블롯. V5 태그화된 DUX4를 검출하도록 항-V5 에피토프 항체를 사용하였다. 로딩 대조군으로서 알파-튜불린(α-튜불린)을 사용하였다. 도 32b는 DUX4(V5 에피토프, 적색) 또는 핵(DAPI, 청색)에 대해 면역형광으로 염색된 10 μm 저온절편을 보여주는 영상을 제공한다. 고출력 사진은 scAAV6.mir-675 및 AAV.CMV.DUX4-FL과 공동주사된 n=8 TA, 음성 대조군 AAV 및 AAV.CMV.DUX4-FL과 공동주사된 N=5 TA의 표시된 벡터 투여량에서의 대표적인 영상을 보여준다. mir-675의 부재 하에, DUX4 단백질의 높은 수준이 검출되었다. 흰색 화살표는 DUX4 단백질을 발현하는 대표적인 섬유 및 근핵을 나타낸다. 이 데이터는 mir-675에 의한 표적 관여가 AAV.mir-675 및 AAV.DUX4와 공동주사된 TA 골격근에서 DUX4 단백질 수준을 감소시켰다는 것을 보여준다.
도 33은 항-mir-675-5p, DUX4-FL(WT) 및 DUX4-mir-675Res 작제물에 의해 공동형질주입된 15A FSHD 근관세포로부터의 단백질 추출물에서 수행된 3개의 자르지 않은 반복된 웨스턴 블롯을 보여준다(그리고 도 27에 대한 업데이트를 제공한다). 형질주입 후 24시간 및 48시간에 근원세포를 수집하였다. 이후, 분화 후 4일(형질주입 후 5일)에 근관세포를 수집하였다. 반복실험 1 및 반복실험 2에 대한 기준 유전자로서 알파-튜불린을 사용하였다. 항-V5 항체(5% 밀크 TBST 완충액 중의 1:5,000에서 사용된 HRP 커플링된 마우스 단일클론 항체)를 사용하여 DUX4 단백질을 검출하였다. 반복실험 3에 대해 15A 근원세포를 CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 또는 CMV.DUX4-miR-675Res 플라스미드(둘 다 동일한 플라스미드로부터 eGFP를 공동발현)에 의해 형질주입하였다. 정량화를 위해, 형질주입 대조군 및 기준 유전자로서 eGFP를 사용하였다. 이 복제된 웨스턴 블롯에서, 항-V5 항체를 사용하여 DUX4 단백질을 또한 검출하였다. 내인성으로 발현된 단백질 기준품으로서 β-액틴을 사용하였다. 항-마우스 단일클론 항체(5% 밀크 TBST 완충액 중의 1:1000, SIGMA)를 사용하여 β-액틴을 검출하였다. 그래프는 모든 시험된 조건에서의 DUX4 단백질 수준의 정량화를 보여준다. 소스 데이터는 Source 데이터 파일로서 제공된다. 이 도면은 DUX4 발현 플라스미드(DUX4-FL WT)에 의해 형질주입된 15A FSHD 근관세포에서의 항-mir-675-5p(aka 항-mir-675)의 형질주입이 DUX4의 유도 발현으로 이어진다는 것을 보여주고, 이는 내인성으로 발현된 mir-675가 DUX4의 발현을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 34는 8주 동안 AAV.CMV.DUX4-FL 또는 AAV.U6.mi405 또는 AAV.U6.mi405F 또는 AAV.U6.mi405G 또는 AAV.U6.mi405H의 5 X 109 DRP에 의해 주사된 C57BL/6 TA 근육으로부터 수집된 10 μm 근육 절편의 H&E 염색을 보여준다. 이 도면은 또한 AAV.CMV.DUX4-FL의 5 X 109 DRP 및 4개의 mi405 작제물(즉, AAV.U6.mi405 또는 AAV.U6.mi405F 또는 AAV.U6.mi405G 또는 AAV.U6.mi405H)의 각각의 5 X 109 DRP에 의해 8주 동안 공동주사된 TA 근육으로부터의 근육 절편을 보여준다. 이 데이터는 저용량에서 mi405G 및 mi405H가 단핵 세포 침윤 및 중앙 핵을 갖는 근섬유를 특징으로 하는 DUX4 유도 근육 독성을 제거하는 데 있어서 mi405보다 더 효율적이라는 것을 보여준다.
도 35는 분화의 제4일에 피라진아미드 또는 소라페닙의 증가하는 농도로 처리된 18A FSHD 이환된 근관세포로부터의 DUX4, TRIM43 및 ZSCAN4에 대한 ddPCR 유전자 발현 데이터를 보여준다. 유전자 발현은 RPL13A인 기준 유전자의 카피에 대한 각각의 유전자의 카피로서 도시되어 있다. 이 데이터는 피라진아미드 또는 소라페닙의 증가하는 농도에 의해 DUX4 및 DUX4 반응성 바이오마커, 예를 들면 TRIM43 및 ZSCAN4가 18A FSHD 이환된 근관세포에서 감소되었다는 것을 보여준다.
본 개시내용은 근육에서의 DUX4의 발현이 암 및 비제한적인 예로서 안면견갑상완 근 위축증(FSHD)을 포함하는 근 위축증을 야기하는 것으로 알려져 있으므로 DUX4 단백질 생성을 억제하거나 저해함으로써 전사후 이중 호메오박스 단백질 4(DUX4) 유전자 발현을 달성하기 위한 신규의 전략을 제공한다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 기재된 생성물 및 방법은 암 및 비제한적인 예로서 육종 및 FSHD를 포함하는 근 위축증을 치료하고/하거나 개선하고/하거나 이의 진행을 지연시키고/시키거나 이를 예방하는 데 사용된다.
DUX4 유전자는 대략 45 kDA 단백질을 암호화하고; UniProtKB - Q9UBX2(DUX4_HUMAN)를 참조한다. DUX4 유전자의 탈억제는 FSHD의 질환 발병에 관여된다. 탈억제는 D4Z4 반복 수축 또는 염색질 변경자 유전자 SMCHD1 또는 DNMT3B에서의 돌연변이인 2가지의 알려진 기전을 통해 발생할 수 있다. 전자에 대해, 비이환된 대상체에서, D4Z4 어레이는 11개 내지 100개의 반복부로 이루어지는 한편, FSHD1 환자에서, 그 어레이는 1개 내지 10개의 반복부로 감소된다(Mostacciuolo 등, Clin. Genet. Jun;75(6):550-5 (2009); PubMed:19320656). 어느 하나의 병태는 염색체 4q35에서 DNA 저메틸화를 야기하여서 DUX4 발현에 허용 가능한 염색체 환경을 생성할 수 있다.
DUX4는 체조직에서 후성적으로 억제된 D4Z4 미세부수체에 위치한다. FSHD1에서의 D4Z4 염색질 이완은 골격근 핵의 하위집단에서 DUX4의 비효율적인 후성적 억제 및 DUX4 단백질 발현의 다양한 패턴을 생성시킨다. 골격근에서의 DUX4의 이소성 발현은 줄기 세포 및 생식선 유전자의 발현을 활성화하고, 체세포에서 과발현될 때, DUX4는 궁극적으로는 세포사로 이어질 수 있다.
각각의 D4Z4 반복 단위는 2개의 호메오박스를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(DUX4로 명명됨)을 갖고; 반복-어레이 및 ORF는 다른 포유류에서 보존된다. 암호화된 단백질은 ZSCAN4, PRAMEF12, TRIM43 및 MBD3L2를 포함하는 FSHD 질환 바이오마커인 것으로 여겨지는 일부를 포함하여 많은 유전자의 전사 활성자로서 기능하는 것으로 보고되었다(Yao 등, Hum Mol Genet. 2014 Oct15;23(20):5342-52; PMID: 24861551). 미세부수체 반복부의 수축은 상염색체 우성 FSHD를 야기한다. 대안적인 스플라이싱은 다수의 전사체 변이체를 생성시킨다.
일부 양태에서, 인간 DUX4를 암호화하는 핵산은 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 제시되어 있다. 일부 양태에서, 인간 DUX4의 아미노산 서열은 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열에 제시되어 있다. 다양한 양태에서, 본 개시내용의 방법은 또한 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 아이소폼 및 변이체를 표적화한다. 일부 양태에서, 변이체는 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71% 및 70%의 동일성을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 방법은 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 아이소폼 및 변이체를 표적화한다. 일부 양태에서, 변이체는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71% 및 70%의 동일성을 포함한다.
현재 FSHD에 대한 치료가 없고, 근 위축증 중에서 이의 상대적인 풍부도에도 불구하고, 매우 적은 FSHD 표적화된 번역 연구가 공개되었다. 몇몇 FSHD 후보 유전자가 식별되었지만, 많은 최근의 연구는 FSHD 발병에 대한 주요 기여자가 전사 인자를 암호화하는 아폽토시스촉진 DUX4 유전자라는 것을 뒷받침한다. 따라서, 가장 단순한 용어에서, DUX4 과발현은 주요 병원균성 공격 기저 FSHD이다[Chen 등, (2016) Mol Ther 24: 1405-1411; Ansseau 등, (2017) Genes 8(3): 93; Lek 등, (2020) Sci Transl Med 12(536); Himeda 등, (2016) Mol Ther 24: 527-535; DeSimone 등, (2019) Sci Adv 5:12; Lim 등, (2020) Proc Natl Acad Sci USA 117: 16509-16515; 상기 Wallace 등, (2018) 문헌; Rojas 등, (2020) J Pharmacol Exp Ther. 374(3): 489-498]
본 개시내용은 마이크로RNA(miRNA) 표적화 DUX4를 암호화하고 DUX4의 발현을 억제하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 마이크로RNA(miRNA) 표적화 DUX4를 암호화하고 프로모터 서열을 추가로 포함하는 DUX4의 발현을 억제하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 miRNA에 의해 표적화된 RNA 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 miRNA 서열이 표적화하도록 설계된 DUX4 서열을 제공한다. 본 개시내용은 본원에 기재된 다양한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어지거나 이것으로 이루어진 다양한 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산은 뉴클레오타이드 서열로 본질적으로 이루어진다. 일부 양태에서, 핵산은 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.
본원에 기재된 DUX4의 miRNA 표적화에 사용된 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 하기 표 1에서 식별된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
예시적인 뉴클레오타이드 서열은 상기 표 1에 제시되어 있다. 다양한 서열은 상이한 프로모터 및/또는 상이한 플랭킹 서열을 갖는다. 일부 경우에, miRNA는 DUX4에서 하나의 결합 자리를 갖는다. 다른 경우에, miRNA는 DUX4에서 다수의 결합 자리를 갖는다. 예를 들면, 마이크로RNA 675(miR-675)는 결합 부위, 즉 DUX4 표적 서열과 100% 상보성을 갖지 않으므로 이의 표적 유전자에서의 다수의 결합 자리에 결합하는 천연 마이크로RNA이다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 핵산은 서열 번호 1 내지 124 중 어느 하나에 제시된 서열과 동일한 적어도 또는 약 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 핵산은 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 DUX4 발현을 하향조절하거나 억제하는 RNA 간섭의 용도를 포함한다. RNA 간섭(RNAi)은 다양한 질환의 치료에 고려되는 진핵 세포에서의 유전자 조절의 기전이다. RNAi는 miRNA에 의해 매개된 유전자 발현의 전사후 제어를 지칭한다. miRNA는 서열 상동성을 공유하고 동족 메신저 RNA(mRNA)의 서열 표적 부위와 염기쌍을 짓는 작은(약 21개 내지 25개의 뉴클레오타이드) 비암호화 RNA이다. miRNA와 mRNA 사이의 상호작용은 mRNA 붕괴를 유도하고/하거나 단백질로의 mRNA 번역을 방지하는 세포 유전자 침묵화 기계를 지시한다.
천연 RNAi 경로의 이해가 개발되면서, 조사자들은 질환을 치료하기 위한 표적 유전자의 발현을 조절하는 데 있어서의 용도를 위해 인공 shRNA 및 snRNA를 설계하였다. 소형 RNA의 몇몇 종류는 포유류 세포에서 벡터 발현된 트리거의 유사한 종류를 구성하는 짧은(또는 작은) 간섭 RNA(siRNA) 및 짧은(또는 작은) 헤어핀 RNA(shRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)를 포함하는 RNAi 과정을 촉발하는 것으로 알려져 있다[Davidson 등, Nat. Rev. Genet. 12:329-40, 2011; Harper, Arch. Neurol. 66:933-8, 2009]. shRNA 및 miRNA는 생체내 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반 벡터로부터 발현되고, 따라서 벡터가 표적 세포 핵 내에 존재하고 유발 프로모터가 활성인 한 단일 투여에 의해 장기간 유전자 침묵화를 달성할 수 있다(Davidson 등, Methods Enzymol. 392:145-73, 2005). 중요하게는, 이 벡터 발현된 접근법은 근육 유전자 치료 분야에서 이미 이루어진 10년에 걸리는 진전을 이용하지만, 단백질 암호화 유전자를 발현하는 것 대신에 RNAi 치료 전략에서의 벡터 카고는 관심 있는 질환 유전자를 표적화하는 인공 shRNA 또는 miRNA 카세트이다. 이 전략은 천연 miRNA를 발현하도록 사용된다. 마이크로RNA 675는 그 자체의 구조를 갖는다. 본원에 기재된 각각의 다른 miRNA는 hsa-miR-30a 서열 및 구조에 기초한다. 천연 mir-30a 성숙 서열은 표적 유전자로부터 유래된 고유한 센스 서열 및 안티센스 서열에 의해 대체된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 생성물 및 방법은 마이크로RNA(miRNA)를 포함한다. 마이크로RNA(miRNA)는 RNA 침묵화 및 유전자 발현의 조절에서 중요한 역할을 하는 비암호화 RNA의 종류이다. 대부분의 miRNA는 DNA 서열로부터 1차 miRNA로 전사되고, 전구체 miRNA로 가공되고 마침내 성숙 miRNA로 가공된다. 대부분의 경우에, miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역된 영역(3' UTR)과 상호작용하여 mRNA 분해 및 번역 억제를 유도한다. 그러나, miRNA와 5' UTR, 암호화 서열 및 유전자 프로모터를 포함하는 다른 영역의 상호작용이 또한 보고되었다. 소정의 조건 하에, miRNA는 또한 번역을 활성화하거나 전사를 조절할 수 있다. miRNA와 이의 표적 유전자의 상호작용은 동적이고, miRNA의 세포이하 위치, miRNA 및 표적 mRNA의 풍부도 및 miRNA-mRNA 상호작용의 친화도와 같은 많은 인자에 따라 달라진다.
현재까지 대부분의 연구는 miRNA가 이의 표적 mRNA의 3' UTR에서의 특정 서열에 결합하여 전사 억제 및 mRNA 탈아데닐화 및 탈캡핑을 유도한다는 것을 보여주었다. miRNA 결합 부위는 또한 5' UTR 및 암호화 서열을 포함하는 다른 mRNA 영역에서뿐만 아니라 프로모터 영역 내에서 검출되었다. miRNA의 5' UTR 및 암호화 영역에 대한 결합은 유전자 발현에 대한 침묵화 효과를 갖지만, 프로모터 영역과의 miRNA 상호작용은 전사를 유도하는 것으로 보고되었다.
다양한 양태에서, 중합효소 II 프로모터 및 중합효소 III 프로모터, 예컨대 U6 및 H1이 사용된다. 일부 양태에서, U6 miRNA가 사용된다. 일부 양태에서, H1 miRNA가 사용된다. 따라서, 일부 양태에서, U6 miRNA 또는 H1 miRNA는 DUX4 유전자 발현을 추가로 억제하거나 넉다운하거나 방해하도록 사용된다. 전통적인 작은/짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 서열은 보통 Pol III 프로모터, 예컨대 U6을 함유하는 벡터로부터 세포 핵 내에서 전사된다. 내인성 U6 프로모터는 보통 스플라이싱에 관여된 작은 핵RNA(snRNA)인 U6 RNA의 발현을 제어하고, 잘 규명되었다[Kunkel 등, Nature. 322(6074):73-7 (1986); Kunkel 등, Genes Dev. 2(2):196-204 (1988); Paule 등, Nucleic Acids Res. 28(6):1283-98 (2000)]. 일부 양태에서, U6 또는 H1 프로모터는, (1) 프로모터가 RNA 중합효소 III(폴리 III)에 의해 인식되고 shRNA의 높은 수준 구성적 발현을 제어하고; (2) Pol III 프로모터가 고수율의 shRNA를 합성하기 위해 RNA 중합효소 II보다 높은 역량을 보유하고[Boden 등, Nucleic Acids Res. 32:1154-8 (2004); Xia 등, Neurodegenerative Dis. 2:220-31 (2005)]; (3) Pol III 프로모터가 콤팩트한 서열 및 취급하기 쉬운 단순한 종결자의 구성성분이고[상기 Medina 등 (1999) 문헌]; (2) 프로모터가 대부분의 포유류 세포 유형에서 활성이므로, 포유류 세포에서 shRNA 분자의 벡터 기반 발현을 제어하도록 사용된다[Paddison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(3):1443-8 (2002); Paul 등, Nat. Biotechnol. 20(5):505-8 (2002); Medina 등, Curr. Opin. Mol. Ther. 1:580-94 (1999))]. 일부 양태에서, 프로모터는 shRNA의 발현을 제어하기 위해 필요한 모든 요소가 전사 시작 부위의 상류에 위치한다는 점에서 III형 Pol III 프로모터이다[Paule 등, Nucleic Acids Res. 28(6):1283-98 (2000)]. 본 개시내용은 쥣과 및 인간 U6 프로모터 둘 다를 포함한다. 루프에 의해 연결된 표적 유전자로부터 센스 서열 및 안티센스 서열을 함유하는 shRNA는 핵으로부터 세포질로 수송되고, 여기서 Dicer는 이것을 작은/짧은 간섭 RNA(siRNA)로 가공한다.
본 개시내용은 희석제, 부형제 또는 완충액과 조합된 본원에 기재된 임의의 핵산을 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 실시형태는 본원에 개시된 핵산을 전달하기 위해 벡터(예를 들면, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노 연관 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 말 연관된 바이러스, 알파바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 단순 포진 바이러스, 폴리오 바이러스, 신드비스 바이러스, 백시니아 바이러스 또는 합성 바이러스, 예를 들면 키메라 바이러스, 모자이크 바이러스 또는 위형화된 바이러스 및/또는 외래 단백질, 합성 중합체, 나노입자 또는 소분자를 함유하는 바이러스)를 이용한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 AAV 벡터이다. 일부 양태에서, 벡터는 단일 가닥 AAV 벡터이다. 일부 양태에서 AAV는 재조합 AAV(rAAV)이다. 일부 양태에서, rAAV는 rep 및 cap 유전자가 결여된다. 일부 양태에서, rAAV는 자가 상보성(sc) AAV이다.
따라서, 일부 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노 연관 바이러스(AAV), 예컨대 AAV1(즉, AAV1 도립된 말단 반복부(ITR) 및 AAV1 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV2(즉, AAV2 ITR 및 AAV2 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV3(즉, AAV3 ITR 및 AAV3 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV4(즉, AAV4 ITR 및 AAV4 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV5(즉, AAV5 ITR 및 AAV5 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV6(즉, AAV6 ITR 및 AAV6 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV7(즉, AAV7 ITR 및 AAV7 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV8(즉, AAV8 ITR 및 AAV8 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV9(즉, AAV9 ITR 및 AAV9 캡시드 단백질), AAVrh74(즉, AAVrh74 ITR 및 AAVrh74 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAVrh.8(즉, AAVrh.8 ITR 및 AAVrh.8 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAVrh.10(즉, AAVrh.10 ITR 및 AAVrh.10 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV11(즉, AAV11 ITR 및 AAV11 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV12(즉, AAV12 ITR 및 AAV12 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV13(즉, AAV13 ITR 및 AAV13 캡시드 단백질을 함유하는 AAV), AAV-anc80, AAV rh.74, AAV rh.8, AAVrh.10 또는 AAV-B1이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 miRNA를 암호화하는 핵산을 전달하도록 아데노 연관 바이러스(AAV)를 이용한다. AAV는 145개의 뉴클레오타이드 도립된 말단 반복부(ITR)를 포함하는 약 4.7 kb 길이인 단일 가닥 DNA 게놈인 복제 결핍 파르보바이러스이다. AAV의 다수의 혈청형이 있다. AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열이 알려져 있다. 예를 들면, AAV1의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_002077에서 제공되고; AAV2의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001401 및 Srivastava 등, J. Virol., 45: 555-564 {1983)에서 제공되고; AAV3의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_1829에서 제공되고; AAV4의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_001829에서 제공되고; AAV5 게놈은 GenBank 수탁 번호 AF085716에서 제공되고; AAV6의 완전한 게놈은 GenBank 수탁 번호 NC_00 1862에서 제공되고; AAV7 및 AAV8 게놈의 적어도 일부는 각각 GenBank 수탁 번호 AX753246 및 AX753249에서 제공되고(또한 AAV8과 관련하여 미국 특허 제7,282,199호 및 제7,790,449호 참조); AAV9 게놈은 Gao 등, J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)에서 제공되고; AAV10 게놈은 Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)에서 제공되고; AAV11 게놈은 Virology, 330(2): 375-383 (2004)에서 제공되고; AAV12 게놈은 J. Virol. 2008 Feb; 82(3): 1399-406에서 제공되고; AAV13 게놈은 J. Virol. 2008; 82: 8911에서 제공된다. 바이러스 DNA 복제(rep), 캡시드화/패키징 및 숙주 세포 염색체 통합을 지시하는 시스 작용 서열은 AAV ITR 내에 함유된다. 3개의 AAV 프로모터(이들의 상대 맵 위치에 대해 p5, p19 및 p40으로 명명됨)는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 2개의 AAV 내부 오픈 리딩 프레임의 발현을 유발한다. (뉴클레오타이드 2107 및 2227에서) 단일 AAV 인트론의 차등적 스플라이싱과 커플링된 2개의 rep 프로모터(p5 및 p19)는 rep 유전자로부터 4개의 rep 단백질(rep 78, rep 68, rep 52 및 rep 40)을 생성시킨다. rep 단백질은 궁극적으로 바이러스 게놈을 복제하는 것을 담당하는 다수의 효소 특성을 보유한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 발현되고, 이것은 3개의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 암호화한다. 대안적인 스플라이싱 및 비공통 번역 시작 부위는 3개의 관련된 캡시드 단백질의 생성을 담당한다. 단일 공통 폴리아데닐화 부위는 AAV 게놈의 95번 맵 위치에서 위치한다. AAV의 생활 주기 및 유전학은 Muzyczka(Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992))에서 검토된다.
AAV는 예를 들면 유전자 치료에서 외래 DNA를 세포로 전달하기 위한 벡터로서 이것이 매력적이게 하는 고유한 특징을 보유한다. 배양물에서의 세포의 AAV 감염은 비세포변성이고, 인간 및 다른 동물의 천연 감염은 침묵이고 무증상이다. 더욱이, AAV는 많은 포유류 세포를 감염시켜서 많은 상이한 조직을 생체내 표적화하는 가능성을 허용한다. 더욱이, AAV는 서서히 분열하는 세포 및 비분열하는 세포를 형질도입하고, 전사적으로 활성인 핵 에피솜(염색체외 요소)으로서 이 세포의 수명에 대해 본질적으로 지속할 수 있다. AAV 프로바이러스 게놈은, 재조합 게놈의 작제가 실행 가능하게 하는, 플라스미드에서 클로닝된 DNA로서 감염성이다. 더욱이, AAV 복제, 게놈 캡시드화 및 통합을 지시하는 신호가 AAV 게놈의 ITR 내에 함유되므로, 게놈(복제 및 구조적 캡시드 단백질, rep-cap를 암호화)의 내부 대략 4.3 kb의 전부 또는 일부를 외래 DNA로 대체될 수 있다. 일부 양태에서, rep 및 cap 단백질은 트랜스로 제공된다. AAV의 또 다른 중요한 특징은 이것이 극도로 안정하고 왕성한 바이러스라는 것이다. 이것은 아데노바이러스를 불활성화하도록 사용된 조건(몇 시간 동안 56℃ 내지 65℃)을 쉽게 견뎌서, AAV의 차가운 보존이 덜 중요하게 한다. AAV는 동결건조될 수 있고, AAV 감염된 세포는 중복감염에 저항적이지 않다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 rAAV 게놈을 포함하는 본 개시내용의 DNA 플라스미드가 제공된다. DNA 플라스미드를 감염성 바이러스 입자로의 rAAV 게놈의 어셈블리를 위해 AAV(예를 들면, 아데노바이러스, E1 결실된 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)의 헬퍼 바이러스에 의한 감염에 허용 가능한 세포로 옮긴다. 패키징되는 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 입자를 제조하는 기법은 당해 분야에서 표준이다. rAAV의 생성은 rAAV 게놈, rAAV 게놈과 별개의(즉, 이것에 없는) AAV rep 및 cap 유전자 및 헬퍼 바이러스 기능인 성분이 단일 세포(본원에서 패키징 세포로 표시됨) 내에 존재할 것을 요한다. AAV rep 유전자는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형 유래일 수 있고, 비제한적인 예로서 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-anc80, AAV rh.74, AAV rh.8, AAVrh.10 및 AAV-B1을 포함하는 rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형 유래일 수 있다. 일부 양태에서, rAAV 게놈에서의 AAV DNA는 비제한적인 예로서 AAV 혈청형 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-anc80, AAV rh.74, AAV rh.8, AAVrh.10 및 AAV-B1을 포함하는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형 유래이다. rAAV 변이체의 다른 유형, 예를 들면 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV는 본 개시내용에 또한 포함된다. 예를 들면, Marsic 등, Molecular Therapy 22(11): 1900-1909 (2014)를 참조한다. 상기 기술된 것처럼, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 알려져 있다. 동족 성분의 사용이 구체적으로 고려된다. 위형화된 rAAV의 생성은 본원에 그 전체가 참고로 포함된 예를 들면 WO 01/83692호에 개시되어 있다.
본 개시내용의 재조합 AAV 게놈은 적어도 하나의 DUX4 표적화된 폴리뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열을 플랭킹하는 하나 이상의 AAV ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 miRNA 또는 miRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 양태에서, miRNA는 DUX4를 표적화하는 다른 폴리뉴클레오타이드 작제물과 투여된다. 다양한 양태에서, miRNA는 비제한적인 예로서 U6 프로모터, U7 프로모터, T7 프로모터, tRNA 프로모터, H1 프로모터, EF1-알파 프로모터, 최소 EF1-알파 프로모터, unc45b 프로모터, CK1 프로모터, CK6 프로모터, CK7 프로모터, CK8 프로모터, miniCMV 프로모터, CMV 프로모터, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, 알파-미오신 중쇄 인핸서-/MCK 인핸서-프로모터(MHCK7), tMCK 프로모터, 최소 MCK 프로모터 또는 데스민 프로모터와 같은 이러한 프로모터를 포함하는 다양한 프로모터 하에 발현된다. rAAV 게놈에서의 AAV DNA는 비제한적인 예로서 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVanc80, AAV rh.74, AAV rh.8, AAVrh.10 및 AAV-B1을 포함하는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형 유래일 수 있다. 본원에서 상기에 제시된 것처럼, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 알려져 있다.
본 개시내용의 DNA 플라스미드는 본 개시내용의 rAAV 게놈을 포함한다. DNA 플라스미드를 감염성 바이러스 입자로의 rAAV 게놈의 어셈블리를 위해 AAV(예를 들면, 아데노바이러스, E1 결실된 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)의 헬퍼 바이러스에 의한 감염에 허용 가능한 세포로 옮긴다. 패키징되는 AAV 게놈, rep 및 cap 유전자 및 헬퍼 바이러스 기능이 세포에 제공되는 rAAV 입자를 제조하는 기법은 당해 분야에서 표준이다. rAAV의 생성은 rAAV 게놈, rAAV 게놈과 별개의(즉, 이것에 없는) AAV rep 및 cap 유전자 및 헬퍼 바이러스 기능인 성분이 단일 세포(본원에서 패키징 세포로 표시됨) 내에 존재할 것을 요한다. AAV rep 유전자는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형 유래일 수 있고, 비제한적인 예로서 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVanc80, AAVrh.74, AAVrh.8, AAVrh.10 또는 AAV-B1을 포함하는 rAAV 게놈 ITR과 상이한 AAV 혈청형 유래일 수 있다. 일부 양태에서, rAAV 게놈에서의 AAV DNA는 비제한적인 예로서 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVanc80, AAVrh.74, AAVrh.8, AAVrh.10 또는 AAV-B1을 포함하는 재조합 바이러스가 유래될 수 있는 임의의 AAV 혈청형 유래이다. rAAV 변이체의 다른 유형, 예를 들면 캡시드 돌연변이를 갖는 rAAV는 본 개시내용에 또한 포함된다. 예를 들면, Marsic 등, Molecular Therapy 22(11): 1900-1909 (2014)를 참조한다. 상기 기술된 것처럼, 다양한 AAV 혈청형의 게놈의 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 알려져 있다. 동족 성분의 사용이 구체적으로 고려된다. 위형화된 rAAV의 생성은 본원에 그 전체가 참고로 포함된 예를 들면 WO 01/83692호에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 패키징 세포가 제공된다. 패키징 세포는 AAV 입자 제조를 위한 모든 필요한 성분을 안정하게 발현하는 세포주를 갖도록 생성된다. 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 gag, pol 및 env 유전자의 제거에 의해 생성된다. 이것은 치료학적 유전자에 의해 대체된다. 벡터 입자를 제조하기 위해, 패키징 세포가 본질적이다. 패키징 세포주는 캡시드 제조 및 벡터의 비리온 성숙에 필요한 모든 바이러스 단백질을 제공한다. 따라서, 패키징 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 함유하도록 제조된다. 레트로바이러스 DNA 벡터로의 원하는 유전자의 삽입 및 적절한 패키징 세포주의 유지 후에, 이것은 이제 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위한 단순한 문제이다.
예를 들면, AAV rep 및 cap 유전자가 결여된 rAAV 게놈, rAAV 게놈과 별개인 AAV rep 및 cap 유전자 및 선택 가능한 마커, 예컨대 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 플라스미드(또는 다수의 플라스미드)는 세포의 게놈으로 통합된다. AAV 게놈은 GC 테일링과 같은 절차[Samulski 등, 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081], 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 첨가[Laughlin 등, 1983, Gene, 23:65-73] 또는 직접적인 무딘 말단 결찰[Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666]에 의해 박테리아 플라스미드로 도입되었다. 이후, 패키징 세포주는 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스에 의해 감염된다. 이 방법의 이점은 세포가 선택 가능하고, rAAV의 대규모 제조에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포로 도입하기 위해 플라스미드보다는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스를 이용한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 희석제, 부형제 또는 완충액과 조합된 본원에 기재된 임의의 핵산 또는 임의의 벡터를 포함하는 조성물을 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, AAV 입자 생성을 위한 모든 필요한 성분을 안정하게 발현하는 세포주를 생성하도록 패키징 세포를 생성하는 방법이 제공된다. 예를 들면, AAV rep 및 cap 유전자가 결여된 rAAV 게놈, rAAV 게놈과 별개인 AAV rep 및 cap 유전자 및 선택 가능한 마커, 예컨대 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 플라스미드(또는 다수의 플라스미드)는 세포의 게놈으로 통합된다. AAV 게놈은 GC 테일링과 같은 절차[Samulski 등, 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081], 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 합성 링커의 첨가(Laughlin 등, 1983, Gene, 23:65-73) 또는 직접적인 무딘 말단 결찰(Senapathy 등, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661-4666)에 의해 박테리아 플라스미드로 도입되었다. 이후, 패키징 세포주는 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스에 의해 감염된다. 이 방법의 이점은 세포가 선택 가능하고, rAAV의 대규모 제조에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 패키징 세포로 도입하기 위해 플라스미드보다는 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스를 이용한다.
rAAV 생성의 일반 원칙은 예를 들면 Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; 및 Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129)에 검토되어 있다. 다양한 접근법은 Ratschin 등, Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonat 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin 등, Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin 등, J. Virol., 62:1963 (1988); 및 Lebkowski 등, 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski 등, J. Virol., 63:3822-3828 (1989); 미국 특허 제5,173,414호; WO 95/13365호 및 상응하는 미국 특허 출원 제5,658.776호; WO 95/13392호; WO 96/17947호; PCT/US98/18600호; WO 97/09441호(PCT/US96/14423호); WO 97/08298호(PCT/US96/13872호); WO 97/21825호(PCT/US96/20777호); WO 97/06243호(PCT/FR96/01064호); WO 99/11764호; Perrin 등, Vaccine, 13:1244-1250 (1995); Paul 등, Human Gene Therapy, 4:609-615 (1993); Clark 등, Gene Therapy, 3:1124-1132 (1996); 미국 특허 출원 제5,786,211호; 미국 특허 출원 제5,871,982호; 미국 특허 제6,258,595호; 및 McCarty, Mol. Ther., 16(10): 1648-1656 (2008)에 기재되어 있다. 상기 문헌은 본원에 의해 그 전문이 본원에 참고로 포함되고, rAAV 생성에 관한 문헌의 부문에 특별히 강조된다. rAAV의 다양한 유형의 생성 및 사용은 구체적으로 고려되고 예시화된다. 재조합 AAV(즉, 감염성 캡시드화 rAAV 입자)가 이로써 본원에서 제공된다. 일부 양태에서, rAAV의 게놈은 AAV rep 및 cap 유전자가 결여되고; 즉 rAAV의 게놈의 ITR 사이에 AAV rep 또는 cap DNA가 없다. 일부 실시형태에서, AAV는 재조합 선형 AAV(rAAV), 단일 가닥 AAV(ssAAV) 또는 재조합 자가 상보성 AAV(scAAV)이다.
본 개시내용은 따라서 일부 실시형태에서 감염성 rAAV를 생성하는 패키징 세포를 제공한다. 일 실시형태에서, 패키징 세포는 안정하게 형질전환된 암 세포, 예컨대 HeLa 세포, 293 세포 및 PerC.6 세포(동족 293 계통)이다. 또 다른 실시형태에서, 패키징 세포는 형질전환되지 않은 암 세포인 세포, 예컨대 낮은 계대배양 293 세포(아데노바이러스의 E1에 의해 형질전환된 인간 태아 신장 세포), MRC-5 세포(인간 태아 섬유아세포), WI-38 세포(인간 태아 섬유아세포), Vero 세포(원숭이 신장 세포) 및 FRhL-2 세포(레서스 태아 폐 세포)이다.
rAAV는 일부 양태에서 당해 분야에서 표준인 방법, 예컨대 칼럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배에 의해 정제된다. 헬퍼 바이러스로부터 rAAV 벡터를 정제하는 방법은 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들면 Clark 등, Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schenpp and Clark, Methods Mol. Med., 69 427-443 (2002); 미국 특허 제6,566,118호 및 WO 98/09657호에 개시된 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 핵산 또는 예를 들면 본원에 기재된 것과 같은 바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함하는 조성물 또는 조성물들을 제공한다. 따라서, 본원에 기재된 전달 비히클(예컨대, rAAV)을 포함하는 조성물이 제공된다. 다양한 양태에서, 이러한 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 일반적으로, 본원에 사용된 것과 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 약학 투여, 특히 비경구 투여와 적합한 모든 수성 및 비수성 용액, 멸균 용액, 용매, 완충액, 예를 들면 인산염 완충 식염수(PBS) 용액, 물, 현탁액, 에멀션, 예컨대 오일/물 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 리포솜, 분산 매질 및 코팅을 의미한다. 약학 조성물에서의 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 종래의 방법에 의해 제형화될 수 있다.
본 개시내용은 또한 근 위축증 또는 DUX4의 발현 또는 과발현과 연관된 암의 치료에서의 DUX4를 하향조절하기 위한 다양한 소분자 화합물 및 이러한 소분자 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 이전의 연구는 mir-675가 단독의 또는 프로게스테론과 조합된 멜라토닌 및 에스트로겐의 치료에 의해 유도된다는 것을 보여주었다[Cai 등, Journal Pineal Research 61: 82-95 (2016); Gaube 등, BMC Pharmacology 7:11 (2007); Hanifi-Moghaddam 등, Journal Molecular Medicine 85: 471-480 (2007)]. FSHD에서의 에스트로겐의 역할이 한정적이 아니지만, 에스트로겐 또는 이의 유도체 β-에스트라디올은 FSHD 발병에 이전에 연관되었다. 일부 이전의 보고서는 여성이 남성보다 덜 심각하게 이환되는 것으로 보고되고 출산 및 폐경 후 지속적인 증상 악화를 가질 수 있으므로 에스트로겐이 FSHD 질환에서 보호성일 것이라는 것을 제안하였다[Awater 등, European J. Obstetrics, Gynecology, and Reprod. Biol. 162: 153-9 (2012); Sacconi 등, Biochim. Biophys. Acta. 1852: 607-14 (2015); Zatz 등, Amer. J. Med. Genetics 77:155-61 (1998)]. 하나의 연구는 에스트로겐에 의해 활성화될 때 세포의 세포질에서 DUX4 단백질을 봉쇄하고 핵에서 이의 독성 효과를 방지하는 에스트로겐 수용체(ERβ)에 의해 에스트로겐의 유리한 효과가 매개된다는 것을 제안하였다[Teveroni 등, J. Clin. Investigation 127: 1531-45 (2017)]. 에스트로겐의 보호 효과를 제안하는 이 보고서와 반대로, FLExDUX4 마우스의 최근의 연구는 암컷이 일부 결과 측정치에서 수컷보다 더 나쁘게 수행한다는 것을 보고하였다[Jones 등, Skelet. Muscle 10: 8 (2020). 그러나, 이 동물을 생성하도록 사용된 ERT2 시스템은 DUX4 발현의 높은 수준을 유도하여서 이 동물에서 표현형에 대해 에스트로겐의 영향의 해석을 복잡하게 하는 항-에스트로겐 약물 타목시펜을 이용한다. 게다가, 85명의 여성 FSHD 환자의 최근의 임상 연구는 에스트로겐 노출의 차이와 질환 중증도 사이의 상당한 상관관계를 발현하지 못했다[Mul 등, Neuromuscul Disord 28, 508-11 (2018)]. 흥미롭게도 이의 임상 접근법은 프로게스테론을 포함하는 다른 생식 호르몬과의 상호작용에 의해 야기된 보호 효과는 배제되지 않을 수 있도록 생식 수명에서 높은 프로게스테론 수준을 갖는 기간을 공제하는 것으로 이루어졌다. 본 개시내용의 본원에서 제공된 데이터는 에스트로겐 및/또는 에스트로겐과 프로게스테론이 mir-675 상향조절을 통해 DUX4 발현에 대응함으로써 FSHD 질환으로부터 세포를 적어도 부분적으로 보호할 수 있는 새로운 기전을 제안한다. 멜라토닌은 이의 소염 특성 및 항산화제 특성으로 인해 신경근 질환에 대한 유망한 약물 치료로서 이전에 식별되었다. 이 목적을 위해, 이것은 mdx5Cv 뒤시엔느 근 위축증(DMD) 마우스 모델에서 시험되었고, 여기서 이것은 근육 기능을 개선하고 근육의 레독스 상태를 향상시켰다[Hibaoui 등, J. Pineal Res. 51: 163-71 (2011)]. 또 다른 연구에서, 멜라토닌은 심장 질환에서 발생하는 심장 전구 세포의 조기 노화를 방지하였다[Cai 등, J. Pineal Res. 61: 82-95 (2016)].
본 개시내용은 β-에스트라디올, β-에스트라디올과 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA) 및 멜라토닌이 모두 mir-675 상향조절을 통해 DUX4 발현을 하향조절할 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 본 개시내용은 본원에 기재된 것과 같은 근 위축증 또는 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 암을 치료하는 방법에서 다양한 화합물 및 화합물의 조합, 예컨대 β-에스트라디올 + 멜라토닌; 멜라토닌 + MPA; 블레오마이신; 피라진아미드; 소라페닙; 블레오마이신 + 피라진아미드; 블레오마이신 + 소라페닙; 및 피라진아미드 + 소라페닙을 포함한다.
유전자 발현 연구는 블레오마이신[Liu 등, J. Immunol. 187: 450-61 (2011)], 피라진아미드[Manca 등, PloS One. 8:e74082 (2013); ] 및 소라페닙(https_colon_forward slash_forward slash_maayanlab.cloud/Harmonizome/gene_set/sorafenib_homo+sapiens_gpl6244_gse35907/GEO+Signatures+of+Differentially+Expressed+Genes+for+Small+Molecules)[Man 등, Blood. 119: 5133-43 (2012)]이 mir-675 발현을 상향조절한다는 것을 보여주었다. 본 개시내용은 따라서 일부 양태에서 본원에 기재된 것과 같은 FSHD를 치료하는 다양한 방법에서 상승 효과에 대해 블레오마이신, 피라진아미드 및 소라페닙 또는 이의 유도체 및/또는 이의 조합을 포함한다.
본 개시내용은 따라서 블레오마이신 또는 이의 유도체, 피라진아미드 또는 이의 유도체, 소라페닙(4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-메틸피리딘-2-카복사미드) 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 유도체는 블레오마이신 유도체이다. 이러한 블레오마이신 유도체는 블레오마이신 A2, 데글리코-블레오마이신 A2, 블레오마이신 A5, 블레오마이신 A6, 블레오마이신 B2를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 또한 블레오마이신의 동의어인 약물, 예를 들면 블레오신(Bleocin), 블레오미신(Bleomicin), 블레오미시나(Bleomicina)(스페인어), 블레오마이신(Bleomycine)(프랑스어) 및 블레오마이시늄(Bleomycinum)(라틴어)을 포함한다.
일부 양태에서, 유도체는 피라지나미드 유도체이다. 이러한 피라지나미드 유도체는 피라진-2-카복실산 클로라이드, N-(1-브로민 메틸)피라진 포름아미드, N-(브로모메틸)피라진-2-카복사미드, N-(2-브로모에틸)피라진-2-카복사미드, N-(3-브로모프로필)피라진-2-카복사미드, N-(피페리딘-1-일메틸)피라진-2-카복사미드, N-(피페리딘-1-일메틸)피라진-2-카복사미드, N-(티오모르폴리노메틸)피라진-2-카복사미드, N-(2-(피페리딘-1-일)에틸)피라진-2-카복사미드, N-(2-(피페리딘-1-일)에틸)피라진-2-카복사미드, N-(2-모르폴리노에틸)피라진-2-카복사미드, N-(2-티오모르폴리노에틸)피라진-2-카복사미드, N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)피라진-2-카복사미드, N-(3-(피페리딘-1-일)프로필)피라진-2-카복사미드, N-(3-모르폴리노프로필)피라진-2-카복사미드, N-(3-티오모르폴리노프로필)피라진-2-카복사미드, 3-클로로피라진-2-카복사미드, 3-[(4-메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, N-벤질피라진-2-카복사미드, 피라진-1,2,3-트리아졸, N-알킬 치환된 3-아미노피라진-2-카복사미드, 피라지노산 n-옥틸 에스테르, 피라진 티오카복사미드, N-하이드록시메틸 피라진, 티오카복사미드, 피라지노산 피발로일옥시메틸 에스테르, 3-(벤질아미노)피라진-2-카복사미드, 3-[(3-클로로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(3,4-디클로로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(3-트리플루오로메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(4-클로로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(2-메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(4-메톡시벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(4-메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(4-아미노벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(2-클로로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(2-플루오로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(4-트리플루오로메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(2-트리플루오로메틸벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(2,4-디메톡시벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-[(3-니트로벤질)아미노]피라진-2-카복사미드, 3-(벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(4-메틸벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(4-메톡시벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(4-아미노벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(3-클로로벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(4-클로로벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(3,4-디클로로벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(3-니트로벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(3-트리플루오로메틸벤질아미노)-5-시아노피라진-2-카복사미드, 3-(벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(4-메틸벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(4-메톡시벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(4-아미노벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(3-클로로벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(4-클로로벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(3,4-디클로로벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(3-니트로벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(3-트리플루오로메틸벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴, 3-(2-메틸벤질아미노)피라진-2,5-디카보니트릴을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 또한 피라지나미드의 동의어인 약물, 예컨대 2-카바밀피라진, 2-피라진카복사미드, 알딘아미드(Aldinamide), 피라진 카복사미드(Pyrazine carboxamide), 피라진-2-카복사미드, 피라진아미드(Pyrazineamide), 피라진카복사미드(Pyrazinecarboxamide), 피라지노산 아미드(Pyrazinoic acid amide), 피리진아미드(Pyrizinamide), 피라지나미다(Pirazinamida) 또는 피라지나미다(Pyrazinamida)(스페인어), 피라지나미드(Pyrazinamid)(독일어) 및 피라지나미듐(Pyrazinamidum)(라틴어)을 포함한다.
일부 양태에서, 유도체는 소라페닙 유도체이다. 이러한 소라페닙 유도체는 4-클로로피리딘-2-카보닐 클로라이드 하이드로클로라이드, 4-클로로-N-사이클로펜틸피리딘-2-카복사미드, 4-클로로-N-사이클로헥실피리딘-2-카복사미드, 4-클로로-N-사이클로헥실메틸피리딘-2-카복사미드, 4-클로로-N-벤질피리딘-2-카복사미드, 4-클로로-N-페닐에틸피리딘-2-카복사미드, 4-(4-아미노페녹시)-N-사이클로펜틸피리딘-2-카복사미드, 4-(4-아미노페녹시)-N-사이클로헥실피리딘-2-카복사미드, 4-(4-아미노페녹시)-N-사이클로헥실메틸피리딘-2-카복사미드, 4-(4-아미노페녹시)-N-벤질피리딘-2-카복사미드, 4-(4-아미노페녹시)-N-페닐에틸피리딘-2-카복사미드, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-사이클로펜틸-피리딘-2-카복사미드, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-사이클로헥실-피리딘-2-카복사미드, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-사이클로헥실메틸-피리딘-2-카복사미드, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-벤질-피리딘-2-카복사미드, 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카바모일아미노]페녹시]-N-페닐에틸-피리딘-2-카복사미드, 페닐시아노 기를 함유하는 소라페닙 유도체, 질소 헤테로사이클릭을 함유하는 소라페닙 유도체, 퀴녹살린디온 구조를 갖는 소라페닙 유도체, 칼콘 모이어티를 함유하는 소라페닙 유도체, 티오에테르 및 니코틴아미드를 함유하는 소라페닙 유도체, 소라페닙의 디아릴 티오우레아 유도체의 종류, 디티오카바메이트 모이어티를 함유하는 오라페닙 유도체, 피라졸 스캐폴드를 보유하는 오라페닙 유도체, 사이클로헥실 모이어티를 함유하는 소라페닙 유도체, 퀴놀린 핵을 함유하는 소라페닙 유도체, 이합체 기반 구조를 함유하는 소라페닙 유도체, 소라페닙의 a,b-불포화 케톤 유도체, 1,2,3-트리아졸 프레임워크를 함유하는 오라페닙 유도체, 1,3,4-트리아릴피라졸 프레임워크를 함유하는 오라페닙 유도체, 소라페닙의 이미다조 [2,1-b] 티아졸 유도체, 4-(4-(5-(2,4-디클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(5-(3-브로모페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(5-(3,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)피콜린아미드, 4-(4-(5-(4-시아노페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(5-(2-클로로-4-플루오로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(5-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(5-(3-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)피콜린아미드, 4-(4-(5-(4-메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(5-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)피콜린아미드, 4-(4-(5-(3,4-디클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(5-(4-플루오로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(5-(4-브로모페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(5-(2,3,4-트리메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)피콜린아미드, 4-(4-(5-(2,3-디클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, N-메틸-4-(4-(3-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-5-일)페녹시)피콜린아미드, 4-(4-(3-(4-브로모페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-5-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(3-(4-클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-5-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-5-(3-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-5-(4-플루오로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-5-(4-클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-5-(2,3-디클로로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-5-(4-시아노페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-3-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, 4-(4-(1-카바모티오일-3-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-5-일)페녹시)-N-메틸피콜린아미드, HLC-080, 피롤리딘 측쇄를 보유하는 벤지미다졸 유도체, N-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-2-(2-옥소인돌린-3-일리덴)하이드라진-1-카복사미드, N-(3,4-디플루오로페닐)-2-(2-옥소인돌린-3-일리덴)하이드라진-1-카복사미드, N-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-2-(5-메틸-2-옥소인돌린-3-일리덴)하이드라진-1-카복사미드, 2-((1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3-브로모페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3,4-디플루오로페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(p-톨릴)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3,4-디플루오로페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3-클로로페닐)하이드라진-1-카복사미드, N-(3-브로모페닐)-2-((2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-메톡시페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-플루오로페닐)하이드라진-1-카복사미드, N-(3-브로모페닐)-2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(2-플루오로페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3-플루오로페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(4-메톡시페닐)하이드라진-1-카복사미드, 2-((2-클로로-1-에틸-1H-인돌-3-일)메틸렌)-N-(3-클로로페닐)하이드라진-1-카복사미드, N-(3-브로모페닐)-2-((2-클로로-1-프로필-1H-인돌-3-일)메틸렌)하이드라진-1-카복사미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-4-페닐피콜린아미드, 4-(4-플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 4-(2,4-디플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 4-(4-클로로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 4-(4-메톡시페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-4-p-톨릴피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-4-m-톨릴피콜린아미드, 4-(3-플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-4-(4-(트리플루오로메틸)페닐)피콜린아미드, 4-(4-에틸페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 4-(2,4-디메틸페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-5-페닐피콜린아미드, 5-(4-플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 5-(2,4-디플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 5-(4-클로로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 5-(4-메톡시페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-5-p-톨릴피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-5-m-톨릴피콜린아미드, 5-(3-플루오로페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)-5-(4-(트리플루오로메틸)페닐)피콜린아미드, 5-(4-에틸페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드, 5-(2,4-디메틸페닐)-N-(4-(2-(메틸카바모일)피리딘-4-일옥시)페닐)피콜린아미드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 소라페닙의 동의어인 약물, 예컨대 소라페닙()(프랑스어) 및 소라페니븀(라틴어)을 또한 포함한다.
따라서, 본 개시내용은 세포를 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 마이크로RNA-675의 발현을 상향조절하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 세포를 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 DUX4 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하고/하거나 방해하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 추가로 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 근 위축증 또는 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 근 위축증은 안면견갑상완 근 위축증(FSHD)이다. 일부 양태에서, 암은 육종, B 세포 림프종, 또는 부신, 담관, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 두부/경부, 간, 뇌, 폐, 중피, 신경능, 난소, 췌장, 전립선, 신장, 피부, 연조직, 위, 고환 또는 흉선의 DUX4 발현 암이다.
일부 양태에서, 에스트로겐 또는 합성 에스트로겐은 에스트론, 에스트라디올, 에스트리올, 에스테트롤, 27-하이드록시콜레스테롤, 데하이드로에피안드로스테론(DHEA), 7-옥소-DHEA, 7α-하이드록시-DHEA, 16α-하이드록시-DHEA, 7β-하이드록시에피안드로스테론, 안드로스텐디온(A4), 안드로스텐디올(A5), 3α-안드로스탄디올 및 3β-안드로스탄디올, 2-하이드록시에스트라디올, 2-하이드록시에스트론, 4-하이드록시에스트라디올, 4-하이드록시에스트론, 16α-하이드록시에스트론, 에티닐 에스트라디올, 에스트라디올 발러레이트, 에스트로피페이트, 공액 에스테르화 에스트로겐 및 퀴네스트롤이다.
일부 양태에서, 프로게스테론 또는 프로게스틴은 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA), 17α-하이드록시프로게스테론, 클로르마디논 아세테이트, 시프로테론 아세테이트, 게스토덴 또는 에토노게스트렐이다.
일부 양태에서, 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합은 근육내 주사, 경구 투여, 피하, 피내 또는 피부경유 수송, 혈류로의 주사를 위해 또는 에어로졸 투여를 위해 제형화된다. 일부 양태에서, 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합은 조성물에서 제형화된다.
다양한 양태에서, 본 개시내용의 임의의 조성물은 또한 다른 성분, 예컨대 희석제, 부형제 및/또는 아쥬반트를 포함한다. 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 및 아쥬반트는 수혜자에게 비독성이고, 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이고, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 또는 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산; 저분자량 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청, 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 Tween, 플루로닉 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
일부 양태에서, 핵산은 전달을 위해 벡터로 도입된다. 일부 양태에서, 전달을 위한 벡터는 AAV 또는 rAAV이다. 따라서, 본 개시내용의 실시형태는 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 rAAV 게놈을 포함한다.
일부 다른 양태에서, 핵산은 비벡터화된 전달을 통해 세포로 도입된다. 따라서, 실시형태에서, 본 개시내용은 DUX4 표적화 miRNA를 암호화하는 핵산의 비벡터화된 전달을 포함한다. 일부 양태에서, 이 맥락에서, 핵산과 복합체를 형성하고 세포외 뉴클레아제 및 세포내 뉴클레아제로부터 이를 보호할 수 있는 합성 담체는 바이러스 벡터에 대한 대안이다. 일부 양태에서, 이러한 비벡터화된 전달은 본 개시내용의 핵산을 포함하는 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀의 사용을 포함한다. 본 개시내용은 또한 단독의 또는 조합된 본원에 기재된 임의의 작제물을 포함하는 조성물을 포함한다.
멸균 주사용 용액은 적절한 용매 중의 필요한 양의 rAAV를 필요한 대로 상기에 열거된 다양한 다른 성분과 혼입한 후, 멸균 여과하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 상기에 열거된 것으로부터 염기성 분산 매질 및 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클로 멸균된 활성 성분을 혼입하여 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조 기법이다.
본 개시내용의 방법에서 투여되는 rAAV의 역가는 예를 들면 특정한 rAAV, 투여 방식, 치료 목표, 표적화되는 개체 및 세포 유형(들)에 따라 달라질 것이고, 당해 분야에서 표준인 방법에 의해 결정될 수 있다. rAAV의 역가는 1 ml당 약 1x106개, 약 1x107개, 약 1x108개, 약 1x109개, 약 1x1010개, 약 1x1011개, 약 1x1012개, 약 1x1013개 내지 약 1x1014개 또는 초과의 DNase 내성 입자(DRP)의 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈(vg)의 단위(예를 들면, 각각 1x107 vg, 1x108 vg, 1x109 vg, 1x1010 vg, 1x1011 vg, 1x1012 vg, 1x1013 vg 및 1x1014 vg)로 표현될 수 있다.
따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 하나 이상의 핵산을 세포 또는 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 하나 이상의 핵산을 포함하는 AAV를 세포 또는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
더 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포 또는 대상체에서 DUX4 유전자의 발현을 감소시키거나 기능적 DUX4의 발현을 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포 또는 대상체를 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열; 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 하나 이상의 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 AAV 벡터에서 핵산을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 비벡터화된 전달에서 세포에 핵산을 전달하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, DUX4의 발현 또는 기능적 DUX4의 발현은 본원에 제공된 방법에 의해 세포 또는 대상체에서 적어도 또는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 감소된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 것과 같은 DUX4 miRNA를 암호화하는 핵산의 전달을 위해 AAV 형질도입 세포를 제공한다. 생체내 또는 시험관내 표적 세포를 rAAV에 의해 형질도입하는 방법은 본 개시내용에 포함된다. 상기 방법은 이를 필요로 하는 동물(예컨대, 인간)을 포함하는 대상체에 대한 본 개시내용의 rAAV를 포함하는 조성물의 유효량 또는 유효 다중 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 용량이 근 위축증의 발생 전에 투여되면, 투여는 예방학적이다. 용량이 근 위축증의 발생 후에 투여되면, 투여는 치료학적이다. 본 개시내용의 실시형태에서, 유효 용량은 치료되는 근 위축증과 연관된 적어도 하나의 증상을 완화(제거 또는 감소)하고/하거나, 근 위축증의 진행을 느리게 하거나 예방하고/하거나, 근 위축증의 진행을 느리게 하거나 예방하고/하거나, 질환의 정도를 감소시키고/시키거나, 근 위축증의 관해(부분 또는 완전)를 생성시키고/시키거나, 생존기간을 연장시키는 용량이다. 일부 양태에서, 근 위축증은 FSHD이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 것과 같은 DUX4 miRNA를 암호화하는 핵산의 비벡터화된 전달을 제공하였다. 일부 양태에서, 핵산 또는 핵산을 포함하는 조성물은 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀에서 전달된다.
조합 치료제는 본 개시내용에 의해 또한 고려된다. 본원에 사용된 것과 같은 조합은 동시 치료 또는 순차 치료를 포함한다. 표준 의학 치료(예를 들면, 코티코스테로이드 및/또는 면역억제 약물) 또는 다른 억제 RNA 작제물에 의한 본 개시내용의 방법의 조합은 다른 치료제, 예컨대 본원에 그 전문이 참고로 포함된 국제 공보 WO 2013/016352호에 개시된 것과의 조합이면서 구체적으로 고려된다.
본 개시내용의 조성물 및 핵산을 포함하는 AAV, 나노입자, 세포외 베시클 및 엑소좀을 포함하는 조성물의 유효 용량의 투여는 비제한적인 예로서 근육내, 비경구, 혈관내, 정맥내, 경구, 협측, 비강, 폐, 두개내, 뇌실내, 척추강내, 골내, 눈내, 직장 또는 질을 포함하는 당해 분야에서 표준인 경로에 의할 수 있다. 본 개시내용의 rAAV(특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로(들) 및 AAV 성분의 혈청형(들)은 치료되는 질환 상태 및 표적 세포/조직(들), 예컨대 DUX4를 발현하는 세포를 고려하여 당업자에 의해 선택되고/되거나 일치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물 또는 약제는 근육내 주사, 경구 투여, 피하, 피내 또는 피부경유 수송, 혈류로의 주사를 위해 또는 에어로졸 투여를 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 투여 경로는 근육내이다. 일부 실시형태에서, 투여 경로는 정맥내이다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 rAAV의 실제 투여는 동물의 표적 조직으로 rAAV 재조합 벡터를 수송하는 임의의 물리적 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 본 개시내용에 따른 투여는 근육, 혈류, 중추 신경계로의 주사 및/또는 직접적으로 뇌 또는 다른 장기로의 주사를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 인산염 완충 식염수 중에 rAAV를 간단히 재현탁하는 것은 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기에 충분한 것으로 나타났고, (DNA를 분해하는 조성물이 rAAV에 의해 일반 방식으로 회피되어야 하지만) rAAV와 공동투여될 수 있는 담체 또는 다른 성분에 대한 알려진 제한은 없다. rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 관심 있는 특정한 표적 조직, 예컨대 근육으로 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 개시내용이 본원에 참고로 포함된 WO 02/053703호를 참조한다. 약학 조성물은 경구 투여를 위해, 주사형 제형으로서, 또는 피하, 피내 및/또는 피부경유 수송에 의해 근육으로 전달되는 국소 제형으로서 제조될 수 있다. 근육내 주사 및 피부경유 수송 둘 다를 위한 많은 제형은 이전에 개발되었고, 본 개시내용의 실행에서 사용될 수 있다. rAAV는 투여 및 취급의 용이를 위해 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체와 사용될 수 있다.
근육내 주사의 목적을 위해, 아쥬반트, 예컨대 참깨유 또는 땅콩유, 또는 수성 프로필렌 글리콜 중의 용액뿐만 아니라 멸균 수성 용액이 사용될 수 있다. 이러한 수성 용액은 원하면 완충될 수 있고, 액체 희석제는 처음에 식염수 또는 글루코스와 등장성이 되었다. 유리 산(DNA는 산성 포스페이트 기를 함유함) 또는 약리학적으로 허용 가능한 염으로서의 rAAV의 용액은 계면활성제, 예컨대 하이드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에 제조될 수 있다. rAAV의 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일 중에 제조될 수 있다. 이 조제물은 보통의 저장 및 사용 조건 하에 미생물의 성장을 막는 보존제를 함유한다. 이 연결에서, 사용된 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 잘 알려진 표준 기법에 의해 용이하게 얻어질 수 있다.
주사용 사용에 적합한 약학 형태는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 그 형태는 멸균이어야 하고 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이것은 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 기타), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 양태에서, 적절한 유동성은 예를 들면 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지된다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 및 기타에 의해 일어날 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들면 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 일어날 수 있다.
일부 양태에서, 제형은 안정화제를 포함한다. 용어 "안정화제"는 불리한 조건으로부터 제형을 보호하는 물질 또는 부형제, 예컨대 가열 또는 냉동 동안 발생하고/하거나 안정한 상태에서 제형의 안정성 또는 반감기를 연장하는 것을 지칭한다. 안정화제의 예는 당, 예컨대 수크로스, 락토스 및 만노스; 당 알코올, 예컨대 만니톨; 아미노산, 예컨대 글리신 또는 글루탐산; 및 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 젤라틴을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 양태에서, 제형은 항균성 보존제를 포함한다. 용어 "항균성 보존제"는 사용된 바이알 또는 용기의 반복 천공 시 도입될 수 있는 미생물의 성장을 억제하는 조성물에 첨가되는 임의의 물질을 지칭한다. 항균성 보존제의 예는 티메로살, 2-페녹시에탄올, 벤제토늄 클로라이드 및 페놀과 같은 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
용어 "형질도입"은, 수혜자 세포에 의해 DUX4의 발현을 감소시키는, 본 개시내용의 복제 결핍 rAAV를 통한 생체내 또는 시험관내 수혜자 세포에 대한 하나 이상의 DUX4 표적화 작제물, 예를 들면 본원에 기재된 DUX4 miRNA 또는 DUX miRNA를 암호화하는 핵산의 투여/전달을 지칭하도록 사용된다.
일 양태에서, rAAV에 의한 형질도입은 시험관내 수행된다. 일 실시형태에서, 원하는 표적 세포는 대상체로부터 제거되고, rAAV에 의해 형질도입되고, 대상체로 재도입된다. 대안적으로, 동계 세포 또는 이종 세포가 사용될 수 있는데, 여기서 이 세포는 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않을 것이다.
대상체로의 형질도입된 세포의 형질도입 및 재도입을 위한 적합한 방법은 당해 분야에 알려져 있다. 일 실시형태에서, 예를 들면 적절한 배지에서 rAAV를 세포와 조합하고, 사우던 블롯 및/또는 PCR과 같은 종래의 기법을 사용하여 또는 선택 가능한 마커를 사용하여 관심 있는 DNA를 보유하는 이 세포를 스크리닝함으로써 세포는 시험관내 형질도입된다. 이후, 형질도입된 세포는 약학 조성물로 제형화될 수 있고, 상기 조성물은 대상체로 다양한 기법, 예컨대 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사 또는 예를 들면 카테터를 사용한 평활근 및 심장근으로의 주사에 의해 도입될 수 있다.
본 개시내용은 세포 또는 이를 필요로 하는 대상체에게 DUX4의 발현을 하향조절하거나 억제하도록 설계된 마이크로 RNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 rAAV의 유효 용량(또는 본질적으로 동시에 투여된 용량 또는 간격으로 주어진 용량)을 투여하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 유효 용량은 따라서 치료학적 유효 용량이다.
일부 실시형태에서, 투여된 rAAV의 용량 또는 유효 용량은 약 1.0x1010 vg/kg 내지 약 1.0x1016 vg/kg이다. 일부 양태에서, 1.0x1010 vg/kg는 또한 1.0 E10 vg/kg로 지정되고, 이것은 단순히 과학적 표기법을 나타내는 대안적인 방식이다. 마찬가지로, 1011은 E11과 동등하고, 기타 등등이다. 일부 양태에서, 투여된 rAAV의 용량은 약 1.0x1011 vg/kg 내지 약 1.0x1015 vg/kg이다. 일부 양태에서, rAAV의 용량은 약 1.0x1010 vg/kg, 약 2.0x1010 vg/kg, 약 3.0x1010 vg/kg, 약 4.0x1010 vg/kg, 약 5.0x1010 vg/kg, 약 6.0x1010 vg/kg, 약 7.0x1010 vg/kg, 약 8.0x1010 vg/kg, 약 9.0x1010 약 1.0x1011 vg/kg, 약 2.0x1011 vg/kg, 약 3.0x1011 vg/kg, 약 4.0x1011 vg/kg, 약 5.0x1011 vg/kg, 약 6.0x1011 vg/kg, 약 7.0x1011 vg/kg, 약 8.0x1011 vg/kg, 약 9.0x1011 vg/kg, 약 1.0x1012 vg/kg, 약 2.0x1012 vg/kg, 약 3.0x1012 vg/kg, 약 4.0x1012 vg/kg, 약 5.0x1012 vg/kg, 약 6.0x1012 vg/kg, 약 7.0x1012 vg/kg, 약 8.0x1012 vg/kg, 약 9.0x1012 vg/kg, 약 1.0x1013 vg/kg, 약 2.0x1013 vg/kg, 약 3.0x1013 vg/kg, 약 4.0x1013 vg/kg, 약 5.0x1013 vg/kg, 약 6.0x1013 vg/kg, 약 7.0x1013 vg/kg, 약 8.0x1013 vg/kg, 약 9.0x1013 vg/kg, 약 1.0x1014 vg/kg, 약 2.0x1014 vg/kg, 약 3.0x1014 vg/kg, 약 4.0x1014 vg/kg, 약 5.0x1014 vg/kg, 약 6.0x1014 vg/kg, 약 7.0x1014 vg/kg, 약 8.0x1014 vg/kg, 약 9.0x1014 vg/kg, 약 1.0x1015 vg/kg, 약 2.0x1015 vg/kg, 약 3.0x1015 vg/kg, 약 4.0x1015 vg/kg, 약 5.0x1015 vg/kg, 약 6.0x1015 vg/kg, 약 7.0x1015 vg/kg, 약 8.0x1015 vg/kg, 약 9.0x1015 vg/kg 또는 약 1.0x1016 vg/kg이다.
일부 양태에서, 용량은 약 1.0x1011 vg/kg 내지 약 1.0x1015 vg/kg이다. 일부 양태에서, 용량은 약 1.0x1013 vg/kg 내지 약 5.0x1013 vg/kg이다. 일부 양태에서, 용량은 약 2.0x1013 vg/kg 내지 약 4.0x1013 vg/kg이다. 일부 양태에서, 용량은 약 3.0x1013 vg/kg이다.
일부 양태에서, 초기 용량에 제2의 더 큰 용량이 뒤따른다. 일부 양태에서, 초기 용량에 제2의 동일한 용량이 뒤따른다. 일부 양태에서, 초기 용량에 하나 이상의 더 적은 용량이 뒤따른다. 일부 양태에서, 초기 용량에 동일하거나 더 큰 용량인 다수의 용량이 뒤따른다.
표적 세포를 생체내 또는 시험관내 전달 비히클(예컨대, rAAV)로 형질도입하는 방법이 고려된다. 본 개시내용의 rAAV에 의한 세포의 형질도입은 DUX4 miRNA 서열의 발현을 지속시킨다. 본 개시내용은 따라서 rAAV 및 대상체에서 시험관내 또는 생체내 세포(들)에서 DUX4 miRNA 서열을 발현하는 rAAV를 투여/전달하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 대상체는 포유류이다. 일부 양태에서, 포유류는 인간이다. 이 방법은 본원에 기재된 하나 이상의 rAAV에 의해 세포 및 조직(비제한적인 예로서 조직 예컨대 근육을 포함)을 형질도입하는 단계를 포함한다. 형질도입은 세포 특이적 제어 요소를 포함하는 유전자 카세트에 의해 수행될 수 있다. 용어 "형질도입"은, 예를 들면 표적 세포에 의한 DUX4의 감소된 발현 또는 발현의 억제를 생성시키는, 본원에 기재된 복제 결핍 rAAV를 통한 생체내 또는 시험관내 표적 세포로의 DUX4 miRNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 예를 들면 DUX4 miRNA의 투여/전달을 지칭하도록 사용된다.
생체내 방법은 이를 필요로 하는 대상체(인간 대상체를 포함)에게 전달 비히클(예컨대, rAAV)을 포함하는 조성물의 유효 용량 또는 유효 다중 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 따라서, 이를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 rAAV의 유효 용량(또는 본질적으로 동시에 투여된 용량 또는 간격으로 주어진 용량)을 투여하는 방법이 제공된다. 용량 또는 용량들이 장애/질환의 발생 전에 투여되면, 투여는 예방학적이다. 용량 또는 용량들이 장애/질환의 발생 후에 투여되면, 투여는 치료학적이다. 유효 용량은 치료되는 장애/질환 상태와 연관된 적어도 하나의 증상을 완화(제거 또는 감소)하고/하거나, 장애/질환 상태로의 진행을 느리게 하거나 예방하고/하거나, 장애/질환 상태의 진행을 느리게 하거나 예방하고/하거나, 질환의 정도를 감소시키고/시키거나, 질환의 관해(부분 또는 전체)를 발생시키고/시키거나, 생존기간을 연장시키는 용량이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 근 위축증(MD)과 같은 질환을 치료하거나 개선하거나 예방하는 데 사용된다. 다양한 양태에서, 이러한 MD는 FSHD이다. FSHD는 870,000명의 개체만큼 많이 영향을 미치는 것으로 추정되는 가장 흔히 유전되는 근 위축증 중에 있다. FSHD 제시의 전통적인 설명은 얼굴, 견갑대 및 팔뚝에서의 진행성 근육 약화를 포함하지만, 질환은 몸통 및 하지의 근육을 포함하여 더 광범위하게 표출될 수 있다. 가변성은 또한 비대칭적 약화가 흔하면서 개체 내에 흔히 보인다. 발병 연령은 초기 사춘기에서 성인의 범위일 수 있고, 보통 질환 중증도와 관련되고, 여기서 조기 발병은 대개 더 심각한 근육 약화와 연관된다. FSHD를 갖는 대부분의 환자가 정상 수명 기간을 가지지만, 호흡기 부전이 발생할 수 있고, 이환된 개체의 대략 25%가 더 심각한 질환 형태에서 50대에 그리고 심지어는 그보다 일찍 휠체어에 의존하게 되고, 나머지는 평생 보행을 유지시킬 수 있으므로, 그 질환은 쇠약해질 수 있다.
FSHD는 골격근에 독성인 전사 인자를 생성하는 이중 호메오박스 4 유전자(DUX4)의 비정상 발현에 의해 야기된다. DUX4는 보통 인간 발생의 2 세포 단계 동안 기능적이지만, 이후 아마도 시험을 제외하고 본질적으로 모든 다른 조직에서 억제되었다. FSHD를 갖는 사람의 골격근에서, 특정 유전적 인자 및 후성적 인자는 DUX4 탈억제를 허용하도록 모의하고, 여기서 이것을 이후 분화 비정상, 산화 스트레스, 염증성 침윤, 세포사 및 근육 위축증에 관여된 것을 포함하는 몇몇 비정상 유전자 발현 캐스케이드를 개시시킨다.
병리학적 FSHD를 보균하는 것으로 알려진 가족에서, 본 개시내용의 방법은 다양한 양태에서 질환을 예방하는 방법이고, 이것은 질환의 발병 전에 수행된다. 다른 다양한 양태에서, 본 개시내용의 방법은 진단 후 수행되고, 따라서 질환을 치료하거나 개선하는 방법이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 암과 같은 질환을 치료하거나 개선하거나 예방하는 데 사용된다. DUX4는 일부 암 유형에서 활성화되는 것으로 나타났고, 여기서 이것은 면역계로부터 종양 세포를 마스킹하도록 기능한다[Chew 등, Dev. Cell 50(5):658-71 (2019)]. 예를 들면, DUX4 단백질 융합은 횡문근육종 및 유잉 육종과 같은 암을 야기하는 것으로 알려져 있다. CIC-DUX4 유전자 융합은 육종을 유도하고 육종 전이를 유발한다[Yoshimoto 등, Cancer Res. 2017 Jun 1; 77(11): 2927-2937; Okimoto 등, J Clin Invest. 2019; 129(8):3401-3406)]. 다른 암 조직, 예컨대 부신, B 세포 림프종, 담관, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 두부/경부, 간, 뇌(예를 들면, 저등급 신경종), 폐, 중피, 신경능, 난소, 췌장, 전립선, 신장, 피부, 연조직, 위, 고환 및 흉선으로부터의 조직은 또한 DUX4를 발현하는 것으로 나타났다[Chew 등, Dev. Cell 50(5):658-71 (2019)]. 따라서, 본원에 기재된 핵산, rAAV 및 조성물은 암의 치료, 개선 또는 예방에서 DUX4 발현을 억제하는 데 사용된다.
분자, 생화학적, 조직학적 및 기능적 결과 측정치는 DUX4 유전자 및 단백질의 발현을 감소시키고 근 위축증, 예컨대 FSHD를 치료하기 위한 본원에 개시된 생성물 및 방법의 치료 효능을 입증한다. 결과 측정치는 예를 들면 Dyck and Thomas, Peripheral Neuropathy, Elsevier Saunders, Philadelphia, PA, 4th Edition, Volume 1 (2005)의 32장, 35장 및 43장 및 Burgess 등, Methods Mol. Biol., 602: 347-393 (2010)에 기재되어 있다. 결과 측정치는 이환된 조직에서의 DUX4 mRNA 또는 단백질의 감소 또는 제거를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 세포에서 DUX4의 발현의 결여 및/또는 DUX4의 발현의 하향조절은 개선을 결정하기 위해 rAAV의 투여 전 및 후 생검된 근육에서 비제한적인 예로서 RT-PCR, QRT-PCR, RNAcope, 웨스턴 블롯, 면역형광 또는 면역조직화학을 포함하는 당해 분야에 알려진 방법에 의해 DUX4 단백질의 수준을 측정함으로써 검출된다.
일부 실시형태에서, 대상체의 세포에서의 DUX4 유전자 발현 또는 단백질 발현의 수준은 DUX4 miRNA를 암호화하는 핵산 또는 벡터, 예를 들면 rAAV의 투여 전의 DUX4 유전자 발현 또는 단백질 발현의 수준과 비교하여 DUX4 miRNA를 암호화하는 핵산 또는 DUX4 miRNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 예를 들면 rAAV의 투여 후 감소된다. 일부 양태에서, DUX4의 발현은 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 퍼센트 또는 적어도 약 100% 초과 감소된다. 다양한 양태에서, 개선된 근육 강도, 개선된 근육 기능 및/또는 개선된 이동성 및 정력은 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 100% 퍼센트 또는 적어도 약 100% 초과의 개선을 보여준다.
다른 결과 측정치는 치료 전 및 후의 대상체에서의 혈청 크레아티닌 키나제(CK)의 수준을 측정하는 것을 포함한다. 증가된 CK 수준은 근육 손상의 특징이다. 근 위축증 환자에서, CK 수준은 정상 범위 초과로(출생 이후에 정상 수준의 10배 내지 100배) 유의미하게 증가된다. 상승된 CK 수준이 혈액 샘플에서 발견될 때, 이것은 보통 근육이 근 위축증 또는 염증과 같은 일부 비정상 과정에 의해 붕괴된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 개시내용의 방법에 의한 치료에 대한 긍정적인 치료 결과는 rAAV의 투여 전의 혈청 크레아티닌 키나제의 수준과 비교하여 rAAV의 투여 후의 혈청 크레아티닌 키나제의 수준의 감소이다.
다른 결과 측정치는 치료 후의 대상체에서의 개선된 근육 강도, 개선된 근육 기능, 개선된 이동성, 개선된 정력 또는 이들의 2개 이상의 조합이 있는지를 결정하기 위한 측정을 포함한다. 이러한 결과 측정치는 대상체에서의 근 위축증 진행을 결정하는 데 중요하고, 당해 분야에 알려진 다양한 시험에 의해 측정된다. 이 시험 중 일부는 6분 걷기 시험, 일어나기 시간 시험, 4 걸음 올라가기 시험, 4 걸음 올라가기 및 내려가기 시험, 노스 스타 보행 평가(North Star Ambulatory Assessment: NSAA) 시험, 10미터 시간 시험, 100미터 시간 시험, 휴대용 동력측정법(HHD: hand held dynamometry) 시험, 일어서서 걷기 시험, 대동작 하위검사 척도(Gross Motor Subtest Scaled) (Bayley-III) 점수, 최대 등척성 수의 수축 시험(MVICT: maximum isometric voluntary contraction test) 또는 이들의 2개 이상의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
조합 치료제는 본 개시내용에 의해 또한 고려된다. 본원에 사용된 것과 같은 조합은 동시 치료 및 순차적 치료 둘 다를 포함한다. 본원에 기재된 방법과 표준 의학 치료 및 지지 요법과의 조합은 글루코코르티코이드와 같은 치료제의 조합이 있으면서 구체적으로 고려된다. 글루코코르티코이드의 모든 유형은 본원에 개시된 조합 치료제에서 사용을 위해 포함된다. 이러한 글루코코르티코이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 덱사메타손, 데플라자코트, 베클로메타손, 베타메타손, 부데소나이드, 코티손, 하이드로코티손, 메틸프레드니솔론 및 트리암시놀론을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 개시내용에 포함된 다른 조합 치료제는 다른 miRNA와 조합된 또는 U7-snRNA 기반 유전자 치료제, DUX4 발현의 소분자 억제제, RNAi 또는 RNAse H 또는 엑손 스키핑 기전을 통해 DUX4를 억제하는 올리고뉴클레오타이드, U7-snRNA와 이론적 CRISPR 기반 유전자 치료 접근법과 조합된 본원에 기재된 것과 같은 DUX4 miRNA이다.
본 개시내용의 핵산, 바이러스 벡터 또는 조성물의 유효 용량의 투여는 비제한적인 예로서 근육내, 비경구, 혈관내, 정맥내, 경구, 협측, 비강, 폐, 두개내, 뇌실내, 척추강내, 골내, 눈내, 직장 또는 질을 포함하는 당해 분야에서 표준인 경로에 의할 수 있다. 일부 양태에서, 유효 용량은 전신 투여 경로, 즉 전신 투여에 의해 전달된다. 전신 투여는 전신이 영향을 받는 순환계로의 투여의 경로이다. 이러한 전신 투여는 다양한 양태에서 장용 투여(위장관을 통한 약물의 흡수) 또는 비경구 투여(일반적으로 주사, 점적 또는 이식)를 통해 일어난다. 다양한 양태에서, 유효 용량은 경로의 조합에 의해 전달된다. 예를 들면, 다양한 양태에서, 유효 용량은 정맥내 및/또는 근육내, 또는 정맥내 및 뇌실내로 및 기타에 의해 전달된다. 일부 양태에서, 유효 용량은 순서로 또는 순차적으로 전달된다. 일부 양태에서, 유효 용량은 동시에 전달된다. 본 개시내용의 rAAV(특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로(들) 및 AAV 성분의 혈청형(들)은 다양한 양태에서 당업자에 의해 치료되는 질환 또는 장애의 컨디션 또는 상태, 대상체의 컨디션, 상태 또는 연령 및 핵산 또는 단백질을 발현하기 위한 표적 세포/조직(들)을 고려하여 선택되고/되거나 일치된다.
특히, 전달 비히클(예컨대, rAAV)의 실제 투여는 전달 비히클(예컨대, rAAV)을 동물의 표적 세포로 수송하는 임의의 물리적 방법에 의해 달성될 수 있다. 투여는 근육, 혈류에 대한 주사 및/또는 직접적으로 신경계 또는 간에 대한 주사를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 인산염 완충 식염수 중에 rAAV를 간단히 재현탁하는 것은 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기에 충분한 것으로 나타났고, (DNA를 분해하는 조성물이 rAAV에 의해 일반 방식으로 회피되어야 하지만) rAAV와 공동투여될 수 있는 담체 또는 다른 성분에 대한 알려진 제한은 없다. rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 관심 있는 특정한 표적 조직, 예컨대 뉴런으로 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 개시내용이 본원에 참고로 포함된 WO 02/053703호를 참조한다. 약학 조성물은 주사형 제형으로서 제조되거나 피부경유 수송에 의해 근육으로 전달되는 국소 제형으로서 제조될 수 있다. 근육내 주사 및 피부경유 수송 둘 다를 위한 많은 제형은 이전에 개발되었고, 본 개시내용의 실행에서 사용될 수 있다. 전달 비히클(예컨대, rAAV)은 투여 및 취급의 용이를 위해 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체와 사용될 수 있다.
전달 비히클(예컨대, rAAV)의 분산액은 또한 글리세롤, 소르비톨, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일 중에 제조될 수 있다. 이 조제물은 보통의 저장 및 사용 조건 하에 미생물의 성장을 막는 보존제를 함유한다. 이 연결에서, 사용된 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 알려진 표준 기법에 의해 용이하게 얻어질 수 있다.
주사용 사용에 적합한 약학 형태는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 그 형태는 멸균이어야 하고 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이것은 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 소르비톨 및 기타), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 및 기타에 의해 일어날 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들면 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 일어날 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적절한 용매 중의 필요한 양의 rAAV를 필요한 대로 상기에 열거된 다양한 다른 성분과 혼입한 후, 멸균 여과하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 상기에 열거된 것으로부터 염기성 분산 매질 및 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클로 멸균된 활성 성분을 혼입하여 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조 기법이다.
"치료하는"은 비제한적인 예로서 근육 소모, 근육 약화, 근긴장증, 골격근 문제, 망막의 비정상, 엉덩이 약화, 안면 약화, 복근 약화, 관절 및 척추 비정상, 하지 약화, 어깨 약화, 청각 소실, 근육 염증 및 비대칭적 약화를 포함하는 근 위축증의 하나 이상의 증상을 개선하거나 억제하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 핵산, 바이러스 벡터 또는 조성물의 유효 용량의 투여는 비제한적인 예로서 근육내, 비경구, 혈관내, 정맥내, 경구, 협측, 비강, 폐, 두개내, 뇌실내, 척추강내, 골내, 눈내, 직장 또는 질을 포함하는 당해 분야에서 표준인 경로에 의할 수 있다. 일부 양태에서, 유효 용량은 전신 투여 경로, 즉 전신 투여에 의해 전달된다. 전신 투여는 전신이 영향을 받는 순환계로의 투여의 경로이다. 이러한 전신 투여는 다양한 양태에서 장용 투여(위장관을 통한 약물의 흡수) 또는 비경구 투여(일반적으로 주사, 점적 또는 이식)를 통해 일어난다. 다양한 양태에서, 유효 용량은 경로의 조합에 의해 전달된다. 예를 들면, 다양한 양태에서, 유효 용량은 정맥내 및/또는 근육내, 또는 정맥내 및 뇌실내로 및 기타에 의해 전달된다. 일부 양태에서, 유효 용량은 순서로 또는 순차적으로 전달된다. 일부 양태에서, 유효 용량은 동시에 전달된다. 본 개시내용의 rAAV(특히, AAV ITR 및 캡시드 단백질)의 투여 경로(들) 및 AAV 성분의 혈청형(들)은 다양한 양태에서 당업자에 의해 치료되는 질환 또는 장애의 컨디션 또는 상태, 대상체의 컨디션, 상태 또는 연령 및 핵산 또는 단백질을 발현하기 위한 표적 세포/조직(들)을 고려하여 선택되고/되거나 일치된다.
특히, 전달 비히클(예컨대, rAAV)의 실제 투여는 전달 비히클(예컨대, rAAV)을 동물의 표적 세포로 수송하는 임의의 물리적 방법에 의해 달성될 수 있다. 투여는 근육, 혈류에 대한 주사 및/또는 직접적으로 신경계 또는 간에 대한 주사를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 인산염 완충 식염수 중에 rAAV를 간단히 재현탁하는 것은 근육 조직 발현에 유용한 비히클을 제공하기에 충분한 것으로 나타났고, (DNA를 분해하는 조성물이 rAAV에 의해 일반 방식으로 회피되어야 하지만) rAAV와 공동투여될 수 있는 담체 또는 다른 성분에 대한 알려진 제한은 없다. rAAV의 캡시드 단백질은 rAAV가 관심 있는 특정한 표적 조직, 예컨대 뉴런으로 표적화되도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 개시내용이 본원에 참고로 포함된 WO 02/053703호를 참조한다. 약학 조성물은 주사형 제형으로서 제조되거나 피부경유 수송에 의해 근육으로 전달되는 국소 제형으로서 제조될 수 있다. 근육내 주사 및 피부경유 수송 둘 다를 위한 많은 제형은 이전에 개발되었고, 본 개시내용의 실행에서 사용될 수 있다. 전달 비히클(예컨대, rAAV)은 투여 및 취급의 용이를 위해 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체와 사용될 수 있다.
전달 비히클(예컨대, rAAV)의 분산액은 또한 글리세롤, 소르비톨, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일 중에 제조될 수 있다. 이 조제물은 보통의 저장 및 사용 조건 하에 미생물의 성장을 막는 보존제를 함유한다. 이 연결에서, 사용된 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 알려진 표준 기법에 의해 용이하게 얻어질 수 있다.
주사용 사용에 적합한 약학 형태는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 그 형태는 멸균이어야 하고 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이것은 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 소르비톨 및 기타), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 및 기타에 의해 일어날 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들면 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 일어날 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적절한 용매 중의 필요한 양의 rAAV를 필요한 대로 상기에 열거된 다양한 다른 성분과 혼입한 후, 멸균 여과하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 상기에 열거된 것으로부터 염기성 분산 매질 및 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클로 멸균된 활성 성분을 혼입하여 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조 기법이다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 핵산, 벡터 또는 조성물을 포함하거나 본 개시내용의 공정에 따라 제조된 키트를 제공한다. 본 개시내용의 맥락에서, 용어 "키트"는 하나는 본 개시내용의 핵산, 벡터 또는 조성물에 상응하고 다른 것은 컨테이너, 수용체(recipient), 지시 또는 그 외에 상응하는 2개 이상의 성분을 의미한다. 키트는 따라서 다양한 양태에서 단일 단위로서 판매될 수 있는 소정의 목적을 달성하기에 충분한 생성물의 세트이다.
키트는 투여에 대한 적절한 투여량(상기 참조)의 본 개시내용의 핵산, 벡터 또는 조성물을 함유하는 임의의 적절한 형상, 크기 및 재료의 하나 이상의 수용체(예컨대, 바이알, 앰플, 컨테이너, 주사기, 병, 백)를 포함한다. 키트는 추가적으로 (예를 들면, 리플릿 또는 지시 설명서 형태의) 사용을 위한 명령 또는 지시, 핵산, 벡터 또는 조성물을 투여하기 위한 수단, 예컨대 주사기, 펌프, 점적장치 또는 기타, 핵산, 벡터 또는 조성물을 재구성하기 위한 수단 및/또는 핵산, 벡터 또는 조성물을 희석하기 위한 수단을 함유할 수 있다.
일부 양태에서, 키트는 키트에 제공된 시약의 사용을 기술하는 라벨 및/또는 지시를 포함한다. 키트는 또한 선택적으로 본원에 기재된 방법에서 사용된 조성물의 하나 이상의 전달을 위한 카테터, 주사기 또는 다른 전달 장치를 포함한다.
본 개시내용은 또한 투여 단위의 단일 용량 또는 다중 용량을 위한 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 단일 챔버 및 다중 챔버 프리필드 주사기를 함유하는 키트를 제공한다.
본 전체 문헌은 통합된 개시내용으로서 관련되도록 의도되고, 특징의 조합이 본 문헌의 동일한 문장 또는 문단 또는 부문에서 함께 발견되지 않더라도 본원에 기재된 특징의 모든 조합이 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용은 또한 임의의 방식으로 상기에 구체적으로 언급된 변형보다 범위가 더 좁은 개시내용의 모든 실시형태를 포함한다. 속으로서 기재된 개시내용의 양태와 관련하여, 모든 개별 종은 본 개시내용의 별개의 양태인 것으로 여겨진다. "일" 또는 "하나"에 의해 기재되거나 청구된 개시내용의 양태와 관련하여, 문맥이 모호하게 더 제한된 의미를 요하지 않는 한 이 용어가 "하나 이상"을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
달리 표시되지 않는 한, 요소의 시리즈의 앞에 있는 용어 "적어도"는 시리즈에서의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 일상적 실험을 이용하여 본원에 기재된 개시내용의 구체적인 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 개시내용에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
용어 "및/또는"은 본원에서 사용될 때마다 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소의 모든 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 내, 바람직하게는 10% 내 및 보다 바람직하게는 5% 내를 의미한다. 그러나, 이것은 또한 명수를 포함하고, 예를 들면 약 10은 10을 포함한다.
하기의 본 명세서 및 청구항에 걸쳐, 문맥이 달리 요하지 않는 한, "포함한다"의 단어 및 "포함한" 및 "포함하는"과 같은 변형어는 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제가 아니라 기술된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용될 때 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "수반하는" 또는 때때로 본원에서 사용될 때 용어 "갖는"으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용될 때 "이루어진"은 청구항 요소에 기재되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용될 때 "본질적으로 이루어진"은 청구항의 기본적인 특징 및 신규의 특징에 중요하게 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다.
본원에서 각각의 경우에 임의의 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"은 다른 2개의 용어 중 어느 것으로 대체될 수 있다.
본 개시내용이 본원에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 재료, 시약 및 물질 등으로 제한되지 않고, 그러므로 변할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 전문용어는 오직 특정한 실시형태를 기재할 목적을 위한 것이고, 오로지 청구항에 의해 제한된 본 개시내용의 대상의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
본 명세서(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 사양, 설명서 등을 포함)의 본문에 걸쳐 인용된 모든 공보 및 특허는 상기이든 또는 하기이든 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 자료가 본 명세서에 상충하거나 불일치하는 정도로, 본 명세서는 임의의 이러한 자료를 대체할 것이다.
본 개시내용 및 이의 이점의 더 좋은 이해는 오직 예시 목적을 위해 제공된 하기 실시예로부터 얻어질 것이다. 실시예는 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 기재된 실시예 및 실시형태가 오직 예시 목적을 위한 것이고, 이의 견지에서 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제시되고 본 출원의 사상 및 영역 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다.
실시예
본 개시내용의 추가 양태 및 상세내용은 하기 실시예로부터 자명할 것이고, 이 실시예는 제한보다는 예시인 것으로 의도된다.
실시예 1
재료 및 방법
연구 설계. 연구의 목적은 근 위축증, 예컨대 FSHD 또는 DUX4의 발현 또는 과발현으로부터 생긴 암의 치료를 위한 새로운 전략을 탐구하는 것이었다. FSHD는 근육에 독성인 DUX4 유전자의 탈억제에 의해 야기된다. FSHD 치료는 따라서 이 연구의 주요 목표인 DUX4의 억제에 집중되었다. 이 연구에서, DUX4에 대해 RNAi를 지시하기 위해 신규의 전략이 개발되었다. 구체적으로는, DUX4에 대해 RNAi를 천연적으로 지시하는 내인성 인간 마이크로RNA를 상향조절하기 위한 약물이 이 접근법이 RNAi에 의해 DUX4 유전자를 억제하기 위한 신규의 전략을 제공할 것이라는 이론에 의해 시험되었다. 이 연구에서, mir-675가 DUX4를 효율적으로 억제하고 인간 HEK293 세포주 및 FSHD 근육 세포주에서 DUX4 연관된 표현형을 감소시키는 것으로 나타났다. mir-675가 이전에 개발되고 공개된 AAV.DUX4 마우스 모델에서 생체내 DUX4 연관된 병리학을 억제하기 위해 유전자 치료 벡터 내에 기능하는 것으로 또한 나타났다[Wallace 등, Ann. Neurol. 69: 540-552 (2011)]. 시험관내 연구에 대해, n=3 내지 n=6 사이의 독립 실험이 검정에 따라 수행되었다. DUX4 발현의 mir-675 특이적 억제를 시험할 때 6개의 독립 맹검 웨스턴 블롯을 수행하였다. 소분자 처리 검정에서, 3개의 상이한 FSHD 세포주, 즉 15A, 17A 및 18A를 사용하였다. 15A FSHD 세포주에 대해, 6개의 독립 실험을 수행하였다. 17A 및 18A FSHD 세포주에 대해, 3개의 독립 실험을 수행하였다. 생체내 연구에 대해, 샘플 크기를 이전에 공개된 연구에 기초하여 선택하였다[Wallace 등, Mol. Ther. 20: 1417-23 (2012); Wallace 등, Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 8: 121-130 (2018)].
서열 생성 및 클로닝. 이 연구에 사용된 모든 miRNA를 [Wallace 등, Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 8:121-130 (2018)]에 이전에 보고된 것처럼 설계하였다. 모든 miDUX4를 이전에 기재된 것처럼[Wallace 등, Mol. Ther. 20:1417-23 (2012)] mir-30 기반/U6 작제물로 클로닝하였다. 마이크로RNA-675 서열을 miRBase 데이터베이스(www.mirbase.org)로부터 얻고, 이 연구에 사용된 모든 mir-675 작제물을 프로모터(U6 또는 H1 프로모터)의 RNA 중합효소 III 종류의 하류에 발현 플라스미드로 클로닝하였다. mir-675, mir-675-5p 및 mir-675-3p 작제물의 줄기 루프 구조의 서열은 도 17a-17b에 도시되어 있다. CMV.H19 작제물을 OriGene으로부터 구매하였다. psi2-DUX4Fl을 주형으로서의 AAV.CMV.DUX4ΔV5 작제물 및 하기 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 정방향 프라이머: CCGGCTCGAGATGGCCCTCCCGACAC(서열 번호 127) 및 역방향 프라이머: ACGACTAGTGGGAGGGGGCATTTTAATATATCTC(서열 번호 128). 이후, PCR 산물을 XhoI/SpeI 제한 부위 및 psi2.SD5 돌연변이체-DUX4 3' UTR 플라스미드 골격을 사용하여 이전에 설계된 psicheck2(psi2) SD5 돌연변이체(레닐라 루시퍼라제는 SD5 돌연변이체를 가짐) 플라스미드[Ansseau 등, Plos One 10: e0118813 (2015)]로 클로닝하였다. DUX4 ORF 및 3' UTR뿐만 아니라 이의 3' 말단에서 V5 태그를 포함하는 전장 DUX4(DUX4-FL)를 발현하는 AAV.CMV.DUX4-FL 작제물을 PCR 증폭하고, 이전에 기재된 것과 같이[Wallace 등, Ann. Neurol. 69: 540-52 (2011)] AAV6.CMV 프로-바이러스 골격 플라스미드로 클로닝하였다. 원래의 V5 펩타이드 태그를 이전에 기재된 것과 같이[Ansseau 등, Plos One 10: e0118813 (2015)] 재조합 PCR을 통해 V5 및 DUX4 중지 코돈의 미스스플라이싱을 방지하도록 돌연변이(V5.2)하였다. 게다가, 이 플라스미드는 DUX4 오픈 리딩 프레임(DUX4 ORF), DUX4 3' UTR 서열(pLAM 서열)을 포함하는 사이토메갈로바이러스 프로모터(CMVp) 유발 DUX4 전장 서열을 함유한다. 후자는 엑손 1(Ex1), 엑손 2(Ex2) 및 엑손 3(Ex3) 및 내인성 DUX4 비관습적 polyA 서열(ATTAAAA(서열 번호 129))(epA)로 형성된다. CMV.eGFP를 AAV.CMV.DUX4-FL 플라스미드로 클로닝하기 위해, CMV.eGFP를 주형으로서의 AAV.CMV.eGFP 및 하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다: 정방향 프라이머: TTACTAGTATTAATAGTAATCAATTACGG(서열 번호 130) 및 역방향 프라이머: CAATGAATTCGTTAATGATTAACCCGCCAT(서열 번호 131). 이후, PCR 산물을 플라스미드 골격에서 SpeI/EcoRI 제한 부위를 사용하여 클로닝하였다. mir-675 억제에 저항성인 DUX4 ORF 돌연변이체를 발현하는 CMV.DUX4 mir-675Res 작제물을 주형으로서의 야생형 DUX4 및 하기 프라이머를 사용하여 EcoRI/KpnI 제한 부위를 사용하여 재조합 PCR에 의해 클로닝하였다: 정방향: 5' CCGAGAATTCCTCGACTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCA 3'(서열 번호 132), 정방향 중간: 5' ACCCAAGATCTGGGGCAAGGTGGGCAAAAGCCGGGAGGA 3'(서열 번호 133), 역방향 중간: 5' CACCTTGCCCCAGATCTTGGGTGCCTGAGGGTGGGAGAG 3'(서열 번호 134), 역방향: 5' CGGGTACCCTACGTAGAATCGAGCCCGAGGAG 3'(서열 번호 135). CMV.DUX4-mir-675Res는 고친화도로 점 돌연변이를 갖는 CMVp 유발 DUX4 ORF, ORF 배치된 mir-675 결합 부위(TS780WT에 대한 TS780M 서열 정렬 참조)를 함유하고, DUX4 3' UTR을 갖지 않는다. 후자의 부재는 DUX4 전사체에서 다른 mir-675 표적 부위를 제거하였다. 이 작제물은 또한 돌연변이된 V5 에피토프 서열(V5.2) 및 SV40 폴리아데닐화 신호(SV40 pA)를 함유한다. CMV.eGFP를 CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP 및 CMV.DUX4 mir-675Res 플라스미드로 클로닝하기 위해, CMV.eGFP를 주형으로서의 CMV.eGFP 및 하기 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다: 정방향: TTACTAGTATTAATAGTAATCAATTACGG(서열 번호 136), 역방향: CAATGA ATTCGTTAATGATTAACCCGCCAT(서열 번호 137). 이후, PCR 산물을 플라스미드 골격에서 SpeI/EcoRI 제한 부위를 사용하여 클로닝하였다. RenLuc-PTS(모든 성숙 miRNA 서열의 역방향 보체)를 제조하기 위해, 모든 miRBase 예측된 miRNA의 표적 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 상업적으로 제조하고 이 연구에 사용하였고, 재조합 PCR을 사용하여 이것을 psiCheck2(RenLuc) 이중 루시퍼라제 플라스미드(Promega)에서 레닐라 루시퍼라제의 3' UTR로서 융합하였다. RenLuc-mir-675R에서 레닐라 루시퍼라제의 3' UTR에서의 mir-675에 대한 완전한 표적 부위를 클로닝하기 위해 유사한 전략을 사용하였다. DUX4 ORF, DUX4 3' UTR 또는 전장 DUX4(DUX4-FL)가 레닐라 루시퍼라제 3' UTR(RenLuc-DUX4 ORF, RenLuc-DUX4 3' UTR 및 DUX4-FL)로서 삽입된 이중 루시퍼라제 플라스미드를 제조하기 위해, 주형으로서의 CMV.DUX4-FLΔV5 플라스미드를 사용하여 서열을 PCR에 의해 증폭하고 RenLuc로 클로닝하였다. RenLuc-DUX4-FL 발현 플라스미드(도 1a)를 제조하기 위해, DUX4-FL(V5 태그 + 3' UTR이 없는 DUX4 ORF)을 하기 프라미머에 의해 주형으로서의 CMV.DUX4-FLΔV5를 사용하여 PCR 증폭시켰다: 정방향: 5' CCGGCTCGAGATGGCCCTCCCGACAC 3'(서열 번호 138), 역방향: 5' ACGACTAGTGGGAGGGGGCATTTTAATATATCTC 3'(서열 번호 139). 이후, XhoI/SpeI 제한 부위 및 RenLuc.SD5 돌연변이체-DUX4 3' UTR 플라스미드 골격을 사용하여 이전에 설계된 RenLuc SD5 돌연변이체 플라스미드로 PCR 산물을 클로닝하였다. 레닐라 루시퍼라제 유전자는 DUX4-FL mRNA의 대안적인 스플라이싱을 방지하는 스플라이싱 공여자 돌연변이(*SD5)를 갖는다[Ansseau 등, Plos One 10: e0118813 (2015)]. RenLuc-DUX4 ORF-mir-675Res 발현 플라스미드를 제조하기 위해, DUX4 ORF에서 가장 강한 mir-675 표적 부위(TS780) 중 하나를 결실시키도록 재조합 PCR을 수행하고, 하기 프라이머를 사용하여 DUX4 3' UTR을 제거하였다: 정방향: 5' CCGGCTCGAGATGGCCCTCCCGACAC 3'(서열 번호 140), 정방향 중간: 5' CGGGCAAAAGCCGGGAGGA 3'(서열 번호 141), 역방향 중간: 5' TCCTCCCGGCTTTTGCCCGGCCTGAGGGTGGGAGA 3'(서열 번호 142) 및 역방향: 5' AGCGGCCGCAAGCTCCTCCAGCAGAGC 3'(서열 번호 143). 이후, 이 작제물을 XhoI/NotI 제한 부위를 사용하여 RenLuc 골격으로 클로닝하였다.
세포 배양.
HEK293 세포 배양. HEK293 세포를 20% FBS(Corning), 1% L-글루타민(Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 DMEM(Gibco) 배지를 사용하여 성장시켰다. 형질주입된 세포를 페니실린-스트렙토마이신이 결여됨을 제외하고는 동일한 DMEM 배지에서 성장시켰다.
1차 세포 배양. 15A, 17A 및 18A FSHD 인간 근원세포 및 15V 대조군 인간 근원세포는 FSHD에 대해 UMMS Wellstone Center에 의해 제공되고, 이전에 규명되었다[Jones 등, Hum. Mol. Genet. 21: 4419-4430 (2012)]. 이전에 불활화된 15A 세포주는 단일 4qA 허용 가능한 대립유전자를 갖는다. 면역세포화학(ICC)을 사용하여, Jones(상기)는 15A 세포주가 1:104의 DUX4+ 핵을 갖는다는 것을 보여주었고, 이것은 다른 FSHD 이환된 세포주(즉, 17A 및 18A)와 비교할 때 낮다. 15V 세포주는 2개의 4qB 비허용 가능한 대립유전자를 갖는다. 세포를 2일마다 새로운 LHCN 배지[15% 규명된 FBS(Corning), 0.02 M HEPES(Thermo Fisher), 0.03 μg/mL의 ZnSO4(Honeywell Fluka), 1.4 μg/mL의 비타민 B12(Sigma-Aldrich), 0.055 μg/mL의 덱사메타손(Sigma-Aldrich), 1% 항생제/항진균제(Gibco), 2.5 ng/mL의 간세포 성장 인자(Millipore) 및 10 ng/mL의 기본 섬유아세포 성장 인자(Millipore)가 보충된 4:1 DMEM:Medium 199(Gibco)]로 영양공급함으로써 이것을 전파시켰다. 근원세포를 분화를 위해 세포가 90% 초과의 포화상태일 때 분화 배지[15% KnockOut Serum Replacement(ThermoFisher Scientific), 2 mM L-글루타민(Gibco), 1% 항생제/항진균제(Gibco), 1 mM 피루브산나트륨(Gibco) 및 20 mM HEPES(ThermoFisher Scientific)가 보충된 4:1 DMEM: Medium 199(Gibco)]로 전환하였다. 분화 배지를 첨가하기 전에, 세포를 PBS(Gibco)로 세척하였다. 세포를 7일 이하 동안 3일마다 새로운 분화 배지로 시딩하였다. 세포를 탈착하기 위해, TrypLE™ Express, 페놀 레드(ThermoFisher Scientific)를 사용하였다.
이중 루시퍼라제 검정. (또한 도 1a, 도 3a-b, 도 4a-b, 도 5b 및 도 16b-c 참조.) 이 검정을 Wallace 외(Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 8: 121-30 (2018))에 의해 기재된 것처럼 그리고 약간의 변경에 의해 이중 루시퍼라제 리포터 검정 시스템(Promega) 프로토콜에 따라 수행하였다. 모든 플라스미드 작제물은 별개의 레닐라 및 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 함유하는 골격으로서 psiCheck2 이중 루시퍼라제 리포터 플라스미드(Promega)를 가졌고, 여기서 전자는 본 개시내용의 실험에 사용된 다양한 표적 서열을 함유하고, 후자는 형질주입 정규화군(대조군)으로서 작용한다. 모든 DUX4 및 대조군 서열을 레닐라 루시퍼라제 중지 코돈의 하류에서 클로닝하여 3' UTR로서 작용한다. HEK293 세포를 형질주입 전에 24시간에 예비플레이팅하였다. 이후, 세포를 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 증가하는 루시퍼라제 DUX4 리포터:miRNA 몰 비로 루시퍼라제 DUX4 리포터 및 개별 마이크로RNA 발현 플라스미드에 의해 공동형질주입하였다. 루시퍼라제 활성을 형질주입 후 24시간 또는 48시간에 측정하였다. DUX4 유전자 침묵화를 이전에 기재된 것처럼[Wallace 등, Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 8: 121-30 (2018)] 결정하였다. 3중 반복 데이터를 실험마다 평균하였고, 개별 시험을 3회 수행하였다. 결과는 모든 조합된 실험에 대해 레닐라 대 반딧불이 루시퍼라제 활성의 평균 비 ± SEM으로서 보고되었다.
RNA 추출. HEK293 세포로부터의 RNA를 노던 블롯 검정 및 QPCR을 위해 추출하였다. miRVANA miRNA 단리 키트(ThermoFisher Scientific)를 소형 RNA, 예컨대 miRNA를 포함하는 전체 RNA를 추출하기 위해 제조사의 지시에 따라 사용하였다. C57BL/6 골격근으로부터 RNA를 추출하기 위해, 저온보존된 근육을 액체 질소를 사용하여 그리고 모르타르 및 막자를 사용하여 준최적 온도 하에 분쇄하였다. 이후, 분쇄된 근육을 600 μL의 miRVANA miRNA 단리 키트 용해 완충액, TissueLyser 및 1.0 mm 지르코니아 비드(Biospec)를 사용하여 용해하였다. 근육을 30 Hz에서 10초 휴식으로 30초 동안 균질화하였다. 이를 3회 반복하였다.
정량적 RT-PCR 검정. (또한 도 6a-b, 도 9a-a, 도 15a, 도 16a-b, 도 23a-b, 도 24 및 도 25 참조.)
TaqMan 유전자 발현 검정. TaqMan 프로브(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 pri-mir-675, mir-675-5p 및 mi405의 발현을 정량화하기 위해 QRT-PCR을 수행하였다. RNA 조제물로부터 게놈 DNA를 제거함으로써 실험을 시작하고, 이후 제조사의 지시에 따라 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA를 생성하였다. 동일한 cDNA 반응 내에, 1x RT 랜덤 6합체 프라이머를 사용하여 기준 유전자로서 사용된 RPL13A에 대한 그리고 pri-mir-675에 대한 cDNA를 생성하였다. mir-675에 대한 cDNA를 생성하기 위해, ThermoFisher Scientific에 의해 제공된 RT mir-675 역방향 프라이머를 사용하였다. mi405에 대해, mi405 qPCR 프로토콜을 이전에 기재된 것처럼[Wallace 등, Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 8: 121-30 (2018)] 수행하였다. mir-675 및 mi405 수준을 정량화하기 위해, HEK293 세포로부터의 mirVana miRNA Isolation Kit(Ambion)에 대해 전체 RNA 프로토콜을 사용하여 RNA를 추출하였다. 랜덤 6합체 프라이머 및 pri-mir-675 및 mir-675-5p에 대한 특이적 역방향 프라이머의 믹스를 사용하여 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA를 생성하였다. mi405에 대해, RT 단계에 200 nM의 줄기-루프 형성 프라이머(5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTCCAG-3')(서열 번호 144)를 또한 사용하였다. 이후, CFX Connect Real Time 시스템 장치(Bio-Rad)를 사용하여 1.5 μM의 정방향 프라이머(5'-CGGCCCAAACCAGATCTGAATC-3')(서열 번호 145), 0.7 μM의 역방향 프라이머(5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3')(서열 번호 146) 및 0.2 μM의 mi405 프로브(5'-6FAM- ATACGACGTCCAGGAT-3')(서열 번호 147)를 포함하는 커스텀 TaqMan 검정(Applied Biosystems)을 실행하였다. RPL13A(Mm02526700_g1; Applied Biosystems)는 기준 유전자로서 작용하였다. TaqMan 유전자 발현 검정은 TaqMan Gene Expression Master 믹스 및 ThermoFisher Scientific으로부터 구입된 TaqMan 프로브로 이루어졌다. 1x의 프로브를 1x의 TaqMan Gene Expression Master 믹스(ThermoFisher Scientific) 및 20 ng의 cDNA와 혼합하였다. 오직 mir-675-5p 및 mi405 성숙 서열(TaqMan Gene Expression Master 믹스 프로토콜 참조)을 정량화하기 위해 mir-675- 및 mi405 특이적 프라이머 및 프로브를 설계하였다.
디지털 드롭플렛 PCR(ddPCR). mir-675 및 mi405 작제물에 대해, 상기 QPCR에 기재된 것처럼 RNA 추출을 수행하였다. cDNA 합성을 위해, TaqMan 어드밴스드 cDNA 합성 키트(ThermoFisher)를 사용하고, 제조사의 지시에 의해 cDNA를 제조하였다. 프로브에 대한 1X ddPCR Supermix(dUTP 무)(Bio-Rad), 1X 상업적으로 구입 가능한 mir-675 어드밴스드 TaqMan 프로브 또는 커스텀 제조된 mi405 어드밴스드 TaqMan 프로브(ThermoFisher) 및 50 ng의 cDNA를 사용하여 ddPCR을 수행하였다. DUX4 cDNA 합성을 위해, 제조사의 지시에 따라 High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)를 사용하였다. 동일한 cDNA 반응 내에, 1x RT 랜덤 6합체 프라이머 및 25 pmole의 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 DUX4 및 DUX4 반응성 바이오마커에 대한 그리고 기준 유전자로서 사용된 마우스 Rpl13A에 대한 cDNA를 생성하였다. DUX4를 정량화하기 위해, ddPCR 반응 혼합물(20 μL)은 1X ddPCR Evagreen Supermix(Bio-Rad), 1 μM의 정방향 및 역방향 DUX4 프라이머(Sharma 등, J Genet Syndr Gene Ther 2016 Aug;7(4):303. doi: 10.4172/2157-7412.1000303. Epub 2016 Aug 8) 및 50 ng의 cDNA를 함유하였다. Rpl13A 및 DUX4 반응성 바이오마커(Trim36 및 Wfdc3)를 정량화하기 위해, 각각의 유전자에 대해 프로브를 위한 1X ddPCR Supermix(dUTP 무) 및 TaqMan 특이적 프로브를 사용하였다. Automatic Droplet 생성장치 QX200 AutoDG(Bio-Rad)를 사용하여 드롭플렛을 생성하고, 96-Deep Well Reaction Module을 갖는 C1000 Touch™ Thermal Cycler(Bio-Rad)에서 반응을 증폭시켰다. QX200 ddPCR Evagreen Supermix 프로토콜에 따라 사이클링 조건을 설정하였다. 모든 검정은 58℃의 어닐링 온도와 적합하다. 이후, QX200 드롭플렛 판독장치(Bio-Rad)를 사용하여 드롭플렛을 판독하였다. 마지막으로, QuantaSoft 분석 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 정량화를 위해, 20 μL의 각각의 반응은 적어도 10,000개의 허용 가능한 드롭플렛을 생성하는 것으로 추정되었다.
소형-전사체 노던 블롯. (또한 도 2b 및 도 14 참조.) 이 블롯팅을 약간의 변경으로 [McBride 등, Proc Natl Acad Sci USA (2008) 105(15):5868-73]에 이전에 기재된 것처럼 수행하였다. miR-675 및 H19 전사체를 과발현하도록 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포를 사용하였다. 후자의 발현 플라스미드를 Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 HEK293으로 형질주입하였다. 세포를 형질주입 후 48시간에 수확하고, 사용을 위해 제조사의 지시에 따라 miRVANA miRNA 단리 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 용해하였다. miRNA에 대한 농후화를 수행하지 않았다. 20 μg을 8 M 우레아(48%, wt/vol) 및 1x Tris-보레이트-EDTA(TBE) RNAe 유리 용액(Invitrogen)을 함유하는 15% 아크릴아미드-비스아크릴아미드(19:1) 겔에 로딩하였다. New England BioLabs(NEB)로부터의 miRNA Marker를 miRNA 래더로서 사용하고, 1:10 희석하고, 1.5 μL를 크기 기준품으로서 겔에 로딩하였다. miR-675 가이드 가닥(miR-675-5p)에 특이적인 DNA 올리고뉴클레오타이드 프로브를 5' 말단 및 3' 말단에서 2개의 비오틴 태그에 의해 이중 표지하고, 0.3 pmol에서 사용하였다(miR-675-5p 프로브: 5' 비오틴-CACTGTGGGCCCTCTCCGCACCA-3' 비오틴; (서열 번호 148)). 이후, 블롯은 사용을 위해 제조사의 지시에 따라 Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit(Thermo Fisher)를 사용하여 드러났고, 화학발광을 위해 최적화된 Hyblot CL Autoradiography 필름에 노출되었다.
웨스턴 블롯. (또한 도 1b, 도 2b, 도 3a, 도 5c, 도 7, 도 8, 도 10-12, 도 18-22, 도 26, 도 27 및 도 33 참조.) mir-675 및 miDUX4.405에 의한 DUX4 단백질 발현의 억제를 평가하기 위해, HEK293 세포를 다양한 몰 비의 AAV.CMV.DUX4-FL 및 mir-675 발현 플라스미드에 의해 Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 공동형질주입하였다. 50 mM Tris(pH 7.5-8.0), 150 mM NaCl, 0.1%(v/v) SDS, 0.5%(v/v) 데옥시콜레이트, 1%(v/v) triton X-100(Fisher Scientific) 및 10 mL의 완충액당 1개의 정제의 프로테아제 억제제(ThermoFisher Scientific)를 함유하는 RIPA 완충액을 사용하여 형질주입 후 48시간에 전체 단백질을 추출하였다. DC 단백질 검정(Bio-Rad)을 사용하여 전체 단백질 추출물을 정량화하였다. 20 마이크로그램의 샘플을 12% SDS-PAGE에서 분리하고, 습식 이동 시스템을 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 4℃에서 밤새 V5에 대한 마우스 단일클론 항체(겨자무 과산화효소[HRP] 접합된)[5% 밀크 TBST 완충액(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.4 및 0.1% Tween 20(Fisher Scientific)) 중의 1:5,000, R961-25; Invitrogen); 토끼 다중클론 eGFP 항체(3% BSA PBS 중의 1:50,000, ab290; Abcam); 마우스 단일클론 β-액틴 항체(1:60,000; Sigma, 미주리주 세인트 루이스)인 상기 항체와 항온처리하였다. eGFP 항체를 사용할 때, 막을 블롯팅 전에 3% BSA PBS에 의해 30분 차단하였다. eGFP 프로빙된 블롯을 각각 TBST 완충액 중의 0.5% Tween 20(Fisher Scientific)에 의해 5분 5회 세척하고, 이후 실온에서 2시간 동안 HRP 커플링된 염소 항-토끼 2차 항체(3% BSA PBS 중의 1:250,000, 115-035-144; Jackson ImmunoResearch)와 항온처리하였다. V5 프로빙된 블롯을 각각 TBST 완충액 중의 0.1% Tween 20에 의해 5분 5회 세척하였다. 세척 후, 블롯을 Immobilon Western HRP 기질(Millipore)을 사용하여 전개시키고 필름에 노출시켰다. ImageJ를 사용하여 DUX4.V5 및 eGFP 정량화를 평가하였다.
Cdc6 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블롯 (또한 도 26 참조.) mir-675 및 H19에 의한 Cdc6 단백질 발현의 억제를 평가하기 위해, 본 발명자들은 15A FSHD 근원세포를 mir-675 또는 H19 발현 플라스미드 중 어느 하나에 의해 형질주입하고, 근원세포를 7일 동안 분화시켰다. 5% BSA TBST 완충액 중의 1:500 희석으로 Cdc6 토끼 단일클론 항체(C42F7; Cell Signaling Technology)를 사용하여 Cdc6을 검출하였다. Cdc6 프로빙된 블롯을 각각 0.1% Tween 20(ThermoFisher Scientific)이 보충된 TBST 완충액에 의해 10분 3회 세척하고, 이후 실온에서 2시간 동안 HRP 커플링된 염소 항-토끼 2차 항체(5% BSA TBST 완충액 중의 1:100,000)와 항온처리하였다. ImageJ를 사용하여 단백질 수준을 정량화하였다.
알파-튜불린(α-튜불린) 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블롯. (또한 도 27 및 도 33 참조.) α-튜불린 토끼 다중클론 항체(5% 밀크 TBST 완충액 중의 1:500, ab15246; Abcam)를 사용하여 알파-튜불린(α-튜불린) 단백질을 검출하였다. 알파-튜불린 프로빙된 블롯을 각각 0`.1% Tween 20(ThermoFisher Scientific)이 보충된 TBST 완충액에 의해 5분 5회 세척하고, 이후 실온에서 2시간 동안 HRP 커플링된 염소 항-토끼 2차 항체(5% 밀크 TBST 완충액 중의 1:100,000)와 항온처리하였다. 모든 블롯을 Immobilon Western HRP 기질(Millipore)에 의한 처리 후 X선에 노출시킴으로써 이것을 전개시켰다. ImageJ를 사용하여 단백질 수준을 정량화하였다.
β-액틴 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블롯. (또한 도 27 및 도 33 참조.) 마우스(5% 밀크 TBST 완충액 중의 1:1000, SIGMA)에서 제조된 단일클론 항체를 사용하여 β-액틴 단백질을 검출하였다. ImageJ를 사용하여 단백질 수준을 정량화하였다.
아폽토시스 검정.
HEK293 세포에서의 아폽토시스. HEK293 세포에서 Caspase 3/7 활성을 측정하기 위해, Lipofectamine 2000을 사용하여 세포를 mir-675 또는 H19 발현 플라스미드 및 CMV.DUX4-FL WT 발현 플라스미드(CMV.eGFP를 포함하지 않음)에 의해 공동형질주입하였다. 형질주입 후 48시간에, 세포를 제조사의 지시에 따라 Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay(Promega)에 의해 처리하였다. 형광 마이크로플레이트 판독장치를 사용하여 Caspase 3/7 활성(RFU)을 측정하였다.
인간 근원세포에서의 아폽토시스. 인간 근원세포에서 Caspase 3/7 활성을 측정하기 위해, mir-675, H19 발현 플라스미드 또는 mir-675 안타고미르(항-mir-675, ThermoFisher Scientific)를 고효율 전기천공 프로토콜을 사용하여 이 세포로 전기천공하고, 분화 배지가 보충된 KOSR(DUX4 발현(79)을 유도)을 사용하여 분화를 시작하기 전에 이의 성장 배지(LHCN 배지)에서 24시간 동안 회수되도록 정치시켰다. 이후, 세포를 7일 동안 분화되게 한 후, Caspase 3/7 활성을 판독하였다.
알칼리 Comet 검정. HEK293 세포를 본원에서 상기에 기재된 아폽토시스 검정에서처럼 공동형질주입하고, 형질주입 후 24시간 또는 48시간에 수집하였다. 포름아미도피리미딘 DNA-글리코실라제(FPG) 효소 처리 없이 Wang 등 (Cell Reports 9:90-103 (2014)) 및 Dmitriev 등 (Free Radic. Biol. Med. 99: 244-258 (2016))에 이전에 기재된 것처럼 알칼리 comet 검정을 수행하였다. DNA 손상의 정량화를 위해, 본 발명자들은 무작위로 선택된 비중첩하는 세포의 10개의 영상을 분석하도록 Tritek CometScore 소프트웨어를 사용하였다. DNA 손상의 정도를 평가하기 위해, comet 꼬리 모멘트(꼬리 강도에 의해 곱한 꼬리 길이의 측정치)는 각각의 핵에 대해 측정되고, 30개 내지 60개 핵의 평균 comet 꼬리 모멘트로서 값을 나타냈다.
유세포분석법. 생존능력에 대해, 세포를 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR 염색의 1:100 희석액을 함유하는 PBS에 현탁시켰다. 세포를 실온에서 30분 동안 항온처리하고, 실온에서 10분 동안 1% 포름알데하이드로 고정하였다. 이후, 세포를 1회 세척하고, 유세포분석법 분석 전에 FACS 완충액(PBS 중의 0.1% 아지드화나트륨을 갖는 2% FBS)에 재현탁하였다. 생존가능 세포를 633 nm 여기 파장에서 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR 염색에 의해 염색함으로써 게이팅하였다. 488 nm 여기 파장을 사용하여 GFP 형광 신호를 발현하는 생존가능 세포를 게이팅하였다. Behemoth BD LSR II Flow Cytometer(BD Biosciences)를 사용하여 모든 샘플을 분석하였다. GFP 양성 세포의 퍼센트를 유세포분석기 소프트웨어 FlowJo를 사용하여 전체 생 세포의 수에 기초하여 계산하였다.
마우스에 대한 AAV 벡터 전달. (또한 도 15a-b 및 도 32a-b 참조.) 생물활성을 결정하기 위해, 6주령 내지 9주령 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스는 TA로 직접적인 35 μL의 IM 주사를 받았다. 마우스는 1 X 1010 DRP에서의 scAAV6.CMV.eGFP와 공동주사된 5 X 109 DNase-저항 입자(DRP)에서의 아데노 연관 바이러스 scAAV6.CMV.DUX4-FL 및 1 X 109 DRP 또는 5 X 109 DRP에서의 scAAV6.CMV.DUX4-FL 및 5 X 1010 DRP에서의 scAAV6.U6.mir-675의 대측성 주사를 받았다. mir-675의 독성을 시험하기 위해, 전경골근(TA)은 5 X 1010 DRP 및 1 X 1011 DRP에서의 scAAV6.U6.mir-675의 증가하는 용량이 근육내 주사되고 식염수에 의해 대측성 TA 주사되었다. mi405 독성을 시험하기 위해, TA는 scAAV6.U6.mi405F, scAAV6.U6.mi405G 또는 scAAV6.U6.mi405H의 5 X 108 DRP, 5 X 109 DRP 및 5 X 1010 DRP가 근육내 주사되고 식염수에 의해 대측성 TA 주사되었다. mi405 억제 효율을 시험하기 위해, TA는 5 X 109 DRP에서의 scAAV6.CMV.DUX4-FL 및 5 X 108 DRP, 5 X 109 DRP 또는 5 X 1010 DRP에서의 scAAV6.U6.mi405F, G 또는 H가 공동주사되었다. 이를 위해, 5 X 109 DRP에서의 scAAV6.U6.mi405F, G 또는 H 또는 scAAV6.CMV.DUX4-FL 중 어느 하나의 대측성 주사를 수행하였다. mi405에 대해, 모든 주사를 scAAV6.U6.mi405와 비교하였다. 주사 후 2주, 4주 또는 8주에 근육을 수확하였다. NIH 실험 동물 관리 및 사용 가이드(NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 모든 동물 연구를 수행하였다.
조직학. (또한 도 15a-b 및 도 32a-b 참조.) 절개된 TA 근육을 O.C.T. 화합물(Tissue-Tek)에 두고, 액체 질소 냉각된 이소펜탄에서 동결시켰다. 저온절편을 10 μm에서 절단하고, 이후 표준 프로토콜에 따라 H&E에 의해 염색하였다[Harper 등, Nat Med (2002) 8(3):253-61].
인시츄 면역형광. (또한 도 15a-b 및 도 32a-b 참조.) [Giesige 등, JCI Insight (2018) 3(22):e123538]에 이전에 기재된 것처럼 V5 면역형광을 사용하여 DUX4 단백질의 유전자 발현 및 세포이하 국재화를 가시화하였다.
실시예 2
U6 mir-675 작제물(U6.mir-675)은 DUX4를 표적화하고 감소된 효율로 DUX4 발현을 억제한다
mir-675는 이중 루시퍼라제 검정 및 웨스턴 블롯을 사용하여 도시된 것처럼 DUX4를 표적화하고 이의 발현을 억제하는 능력을 갖는다(도 1a-b, 도 2a-b, 도 7, 도 8, 도 15a-b, 도 16a-c, 도 18-23a 및 도 27). 검정 둘 다에 대해, 잠재적으로 보유된 인트론(RenLuc-DUX4-FL, 여기서 FL = 전장)을 포함하는 모든 DUX4 pre-mRNA 서열(ORF 및 3' UTR)을 함유하는 DUX4 작제물을 사용하였다. 이후, 공동형질주입된 HEK293 세포에서 DUX4를 침묵화하는 mir-675의 능력을 시험하였다. U6 프로모터 유발 mir-675 발현 플라스미드(U6.mir-675)를 사용하여 mir-675를 세포로 전달하였다(도 1a). 이 작제물을 인공적으로 설계된 miDUX4 miRNA를 클로닝하기 위해 이전에 사용된 것처럼[Wallace 등, Mol Ther. 2012 Jul; 20(7): 1417-1423] 동일한 U6 기반 발현 카세트를 사용하여 클로닝하였다. 따라서, 이것은 이의 5' 말단 플랭킹 서열에서 40개의 뉴클레오타이드를 갖고 3' 말단 플랭킹 서열에서 47개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 도 1a에 도시된 것처럼, 이 서열은 염기쌍을 짓고 줄기-루프 구조를 형성할 수 있다. 형질주입 후 48시간에, 레닐라 및 반딧불이 루시퍼라제 활성 둘 다를 측정하였다. 처음에, U6.mir-675는 비표적화 RenLuc 대조군 골격 플라스미드(RenLuc)로부터 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 감소시킬 수 없었다. 그러나, RenLuc-DUX4-FL에 의해 공동형질주입될 때, U6.mir-675는 용량 의존적 방식으로 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 감소시킬 수 있었다. 그 결과, mir-675는 각각 10 대 1, 20 대 1 및 40 대 1의 U6.mir-675:RenLuc-DUX4-FL의 몰농도 비(n:n)로 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 24 ± 3%(P<0.0001, ANOVA, N=3), 28 ± 2%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 및 33 ± 3%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 감소시켰다(도 1a). 루시퍼라제 검정 후, DUX4 발현의 mir-675 매개된 침묵화는 mir-675 또는 H19(mir-675 전구체) 및 DUX4-FL 야생형 mRNA 서열 및 DUX4 단백질을 과발현하는 공동형질주입된 HEK293 세포로부터 추출된 전체 단백질에 대해 웨스턴 블롯을 사용하여 확인되었다(도 2a-b, 도 7, 도 8, 도 15a-b 및 도 18-22). 그 결과, DUX4 ORF(DUX4 단백질 COOH-말단에 융합됨) 및 DUX4 3' UTR 서열의 하류에서 클로닝된 변형된 V5 에피토프 서열[Ansseau 등, Plos One, 2016년 1월 27일 공개; https-colon-slash-slash-doi.org/10.1371/journal.pone.0146893]을 포함하는 U6.mir-675 또는 CMV.H19 및 AAV.CMV.DUX4-FL 발현 플라스미드에 의한 공동형질주입 후 24시간에, U6.mir-675 및 CMV.H19는 DUX4 단백질 수준을 각각 46 ± 11%(P<0.02, ANOVA, N=3) 및 48 ± 12%(P<0.02, ANOVA. N=3) 감소시켰다(도 1b 및 도 7). 약 20% 내지 60% 사이의 억제 효율이 보통 천연 miRNA에 의해 달성되므로 이 결과는 천연 miRNA에 대해 상당하였는데, 이것은 보통 이의 표적 부위와 약한 염기쌍 짓기를 갖는다[Miyamoto-Mikami 등, Int. J. Sports Med. 37: 411-417 (2020); Dusl 등, Hum. Mol. Genet. 24: 3418-26 (2015); Saetrom 등, Cancer Res. 69: 7459-65 (2009); Clop 등, Nat. Genet. 38:813-8 (2006); Mencia 등, Nat. Genet. 41: 609-13 (2009)]. 분자 비콘 결합 검정(MBB 검정)은 mir-675가 높은 효율로 DUX4 ORF 및 3' UTR에서의 부위를 표적화한다는 것을 보여주었고(도 13a-c 및 도 31a-c), 이는 DUX4 발현의 비교적 예상외로 높은 억제 효율을 설명할 것이다. 그러나, 50% 억제 효율에 의해서도, FSHD에 대한 치료로 mir-675를 번역하는 능력은 최소일 수 있다. 따라서, U6.mir-675 발현 플라스미드가 mir-675-5p 및 mir-675-3p 성숙 서열 둘 다를 효율적으로 발현하고 이의 최적 가공을 허용하도록 이성적으로 설계되지 않을 수 있다는 것이 추론되었다. 따라서, DUX4 발현의 더 높은 억제 효율에 도달하려는 목표로 mir-675를 더 효율적으로 발현하고 이의 더 양호한 가공을 허용하는 상업적으로 구입 가능한 mir-675 발현 플라스미드가 추구되었다. 따라서, H1.mir-675(SBI Biosciences)가 식별되고 시험되었고; 이것은 DUX4 발현의 더 높은 억제 효율을 보여주었고 노던 블롯을 사용하여 나타난 것처럼 더 양호하게 가공되었다(도 14). 그러나, C57BL/6 전경골근(TA) 근육의 근육내 주사를 사용하여 생체내 시험될 때, scAAV6.mir-675 발현 H1.mir-675 작제물은 근육 독성을 보여주었다(데이터 비도시). 따라서, FSHD에 대한 생존가능 miRNA 기반 유전자 치료제로서 mir-675를 번역할 목적을 위해, 추가 mir-675 발현 카세트는 더 양호한 가공을 위해 그리고 DUX4 발현을 억제하고 DUX4 유도 독성을 감소시키는 데 있어서 mir-675 효력을 증가시키기 위해 5' 및 3' 말단 플랭킹 서열을 변경함으로써 설계되고 시험되었다.
실시예 3
시험관내 DUX4 단백질 수준의 억제
많은 이전의 공보는 양호한 miRNA 가공 및 발현과 관련된 구조 및 모티프를 식별하고 검증하였다(예를 들면, Treiber 등, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 20:5-20 (2019) 참조). 중요한 구조 및 모티프의 일부는 miRNA의 줄기-루프 구조로부터 분지하는 5' 및 3' 말단 플랭킹 서열에 있다. 예로서, "UG" 디뉴클레오타이드 모티프는 5' miRNA 가닥에서의 드로샤 절단 부위로부터의 약 11개의 염기쌍인 기본 줄기에서 보통 발견된다. 3' 말단에서, 마이크로프로세서에 의해 절단을 촉진하기 위해 필요한 것으로 생각된 단일 "CNNC" SRSF3 모티프가 있다. 이 구조 및 모티프가 고도로 보존되더라도, 이 구조 및 모티프의 일부의 부재 하에 miRNA 가공 및 발현을 허용하는 많은 예외가 존재한다. 예를 들면, mir-675는 "UG" 모티프와 같은 이 모티프의 부재 하에 기능적 miRNA로서 가공되고 발현될 수 있었다. 게다가, mir-675 구조는 이의 루프의 3' 말단에서 "UGGUG"(서열 번호 150)가 되는 축퇴된 "UGUG"(서열 번호 149) DGCR8 결합 모티프를 포함하고, 이상적인 35개의 뉴클레오타이드 대신에 33개를 갖는 더 작은 줄기에 의해 형성된다. mir-675는 또한 미스매칭된 "GHG" 모티프가 결여되고, 발현되었고, 다수의 "CNNC"(서열 번호 151) SRSF3 모티프의 임의의 부재 하에 또는 존재 하에 DUX4 발현의 억제를 할 수 있다(도 2a). 따라서, mir-675 구조에 이 모티프의 일부를 첨가함으로써, mir-675 가공, 발현 및 억제 효력이 향상될 것이라고 가정되었다.
따라서, 줄기-루프 구조의 5' 말단 및 3' 말단에서 9개의 상이한 플랭킹 서열을 포함하는 14개의 mir-675 작제물(도 2a)이 설계되었다. U6.mir-675를 제외하고 모든 작제물은 mir-675 기본 줄기의 3' 말단의 하류에 단일 "CNNC" 모티프, 3개(U6.mir-675-2.1, H1.mir-675-2.2, U6.mir-675-2.3, H1.mir-675-2.4, U6.mir-675-2.5 및 U6.mir-675-2.6) 또는 4개(U6.mir-675-2.1.1, U6.mir-675-2.3.1, H1.mir-675, U6.mir-675F, U6.mir-675F2 및 U6.mir-675H)의 뉴클레오타이드를 포함하였다. H1.mir-675, U6.mir-675F 및 U6.mir-675F2는 유사한 플랭킹 서열을 갖지만, 중합효소 III 프로모터 또는 프로모터의 상류에서의 추가 구조, 즉 표적-세포 감염 동안 HIV 렌티바이러스 게놈의 핵 이동을 허용하는 "DNA 플랩"을 생성하는 중앙 폴리퓨린 트랙/중앙 말단 서열(cPPT/CTS)을 포함하는 H1.mir-675 및 U6.mir-675F2의 존재가 다르다. U6.mir-675-2.1 및 H1.mir-675-2.2는 또한 유사한 플랭킹 서열을 갖지만, 2개의 상이한 프로모터(U6 또는 H1)로부터 발현된다. U6.mir-675-2.3 및 H1.mir-675-2.4에 의해 유사한 경우가 보인다. U6.mir-675NF는 플랭킹 서열을 갖지 않는다. U6.mir-675-2.1, H1.mir-675-2.2, U6.mir-675-2.5 및 U6.mir-675-2.3.1은 이의 줄기-루프 구조의 기본에서 "UG" 드로샤 인식 모티프를 갖는다. U6.mir-675 및 U6.mir-675H에 대한 것처럼, "UA"(박스에 있음) 디뉴클레오타이드는 축퇴성 드로샤 인식 부위를 나타낼 것이다. 모든 작제물에 대해, 플랭킹 서열을 설계할 때, 이렇게 뉴클레오타이드 서열을 조정함으로써 서열 사이의 임의의 염기쌍 짓기 구조를 생성하지 않는 것이 보장되었다.
이 작제물의 억제 효율을 평가하기 위해, H1/U6.mir-675 및 CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP(전장 DUX4(ORF + 3' UTR) 및 eGFP를 공동발현함) 발현 플라스미드에 의해 공동형질주입된 HEK293 세포로부터 추출된 전체 단백질을 사용한 웨스턴 블롯을 수행하였다. 모든 13개의 mir-675 작제물은 U6.mir-675보다 더 양호한 억제 효율을 입증하였다(43 ± 4%, N=6)(도 2b, 표 2 및 도 8).
일반적으로, U6 제어된 mir-675는 H1 제어된 mir-675 작제물보다 더 양호한 억제 효율을 보여주었다. U6.mir-675-2.1.1 및 U6.mir-675H는 각각 83 ± 3(N=3 독립 반복실험) 및 89 ± 6(N=3 독립 반복실험)의 억제 효율을 가졌고, DUX4 단백질 수준의 가장 높은 억제 효율을 가졌다(P<0.05, ANOVA, N=3-8 독립 반복실험). 노던 블롯 결과는 오직 U6.mir-675F, U6.mir-675NF, U6.mir-675-2.1, U6.mir-675-2.2, U6.mir-675F2 및 U6.mir-675-2.1.1이 21합체와 25합체 사이의 크기의 범위의 검출 가능한 mir-675 성숙 서열을 갖는다는 것을 보여주었다. 이들 6개의 작제물 중 4개는 전형적인 miRNA 가공 프로파일을 보여주었다[Nguyen 등, Cell 161:1374-87 (2015)]. 오직 U6.mir-675NF 및 U6.mir-675F2는 추가 가공된 밴드를 보여주었고: 1개의 밴드는 21합체보다 작은 크기를 갖고, 1개의 추가 밴드는 25합체와 가까운 크기를 갖는다. 게다가, U6.mir-675NF, U6.mir-675F2 및 U6.mir-675-2.1.1은 mir-675-5p 성숙 서열의 23합체의 예상된 크기에 상응하는 21합체와 25합체 사이의 크기를 갖는 밴드를 보여주었다(도 2b).
이 mir-675 성숙 서열(UGGUGCGGAGAGGGCCCACAGUG; (서열 번호 152))의 발현을 정량화하기 위해, QRT-PCR을 수행하고, 핵산 수준을 HEK293 세포로의 H1/U6.mir-675 작제물의 형질주입 후 1차 mir-675 서열(pri-mir-675)의 수준과 비교하였다. H1.mir-675, U6.mir-675F2, U6.mir-675-2.1.1, U6.mir-675-2.3.1 및 U6.mir-675H는 각각 U6.mir-675로부터 발현된 수준보다 232 ± 35%(P<0.0002, ANOVA, N=3 독립 실험), 882 ± 108%(P<0.0001, ANOVA, N=3), 282 ± 34%(P<0.0001, ANOVA, N=3), 241 ± 29%(P<0.0003, ANOVA, N=3) 및 774 ± 93% 배수 더 높은(P<0.0001, ANOVA, N=3) mir-675-5p 수준을 발현하였다. mir-675-5p/pri-mir-675의 비를 비교할 때, U6.mir-675F2, U6.mir-675-2.1.1 및 U6.mir-675H는 각각 918 ± 169%, 207 ± 38% 및 303 ± 57%(P<0.0001, ANOVA, N=3)의 배수 변화로 가장 높은 상대 mir-675-5p 발현을 보여주었고, 이는 이 작제물이 mir-675-5p 성숙 서열로의 pri-mir-675의 더 많은 가공을 허용한다는 것을 나타낸다(도 9a-b). 그러나, miRbase 데이타베이스(http-colon-forward slash-forward slash-www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_entry.pl?acc=MI0005416)에서 발견된 심부 시퀀싱 판독은 16합체와 23합체 사이의 크기의 범위의 다수의 가공된 성숙 mir-675-5p 서열의 존재를 보여주었다.
모든 이 성숙 서열의 수준을 정량화하기 위해, TaqMan 어드밴스드 miRNA 프로브를 사용하여 정량화될 수 있는 cDNA 주형을 합성하기 위해 보편적 역방향 전사(RT) 화학을 사용하는 TaqMan 어드밴스드 miRNA cDNA 합성 방법을 사용하였다. 이 방법에서, 대부분의 가공된 성숙 miRNA 서열을 정량화하였다. 그 결과, U6.mir-675-2.1.1, U6.mir-675-2.3.1 및 U6.mir-675H는 각각 213 ± 51%(P<0.014, ANOVA, N=3), 187 ± 40%(P<0.024, ANOVA, N=3) 및 201 ± 38%(P<0.0074, ANOVA, N=3)의 배수 변화로 U6.mir-675와 비교할 때 가장 높은 수준을 보여주었다(도 9a-b). 14개의 mir-675 작제물 중 2개(U6.mir-675-2.1.1 및 U6.mir-675H)는 시험관내 DUX4 단백질 수준의 가장 높은 억제 효율을 보여주었다(도 2a-b 및 도 8).
실시예 4
다른 miDUX4가 아닌 mi405의 억제 효율은 5' 및 3' 말단 플랭킹 서열을 변경함으로써 증가되었다
발현 카세트의 5' 및 3' 말단 플랭킹 서열의 변경을 통해 mir-675의 억제 효율을 증가시키는 것에서의 성공 이후에, FSHD에 대한 miRNA 기반 유전자 치료제로서 개발된 인공으로 설계된 miDUX4(mi405) miRNA에 동일한 전략을 적용하였다[Wallace 등 Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Mar 16; 8: 121-130]. 이 miRNA(U6.mi405)는 U6.mir-675 발현 플라스미드에서 발견된 동일한 플랭킹 서열을 갖는다.
따라서, 2개의 새로운 mi405 작제물, 즉 mi405F 및 mi405NF를 설계하였다. mi405F인 제1 작제물은 줄기-루프 구조의 5' 말단(U6 전사 시작 부위에 대해 오직 하나의 "G" 뉴클레오타이드)에서 플랭킹 서열이 결여되고, H1.mir-675, U6.mir-675F 및 U6.mir-675F2의 것과 유사한 단일 "CNNC"(서열 번호 151) 모티프를 갖는 16합체 긴 3' 말단 플랭킹 서열을 보유한다. mi405NF인 제2 작제물은 5' 말단에서 오직 하나의 "G" 뉴클레오타이드를 보유하고 3' 말단에서 플랭킹 서열을 보유하지 않는다(도 3a). 3개의 mi405 작제물의 억제 효율을 평가하기 위해, mir-675에 기재된 것과 유사한 이중 루시퍼라제 검정 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 이중 루시퍼라제 검정에서, U6.mi405, U6.mi405F 또는 U6.mi405NF를 RenLuc-DUX4 ORF(레닐라 루시퍼라제의 3' UTR 서열로서 DUX4의 오픈 리딩 프레임을 발현하는 작제물)와 함께 HEK293 세포로 공동형질주입하였다. 형질주입 후 24시간에, U6.mi405, U6.mi405F 및 U6.mi405NF는 RenLuc-DUX4 ORF 작제물에 대해 시험될 때 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 각각 85 ± 1%, 89 ± 1% 및 66 ± 1%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 감소시켰다. 게다가, U6.mi405F는 1:4의 DUX4:mi405 몰 비에서 시험될 때 U6.mi405보다 유의미하게 더 높은 억제 효율을 입증하였다(P<0.04 ANOVA, N=3 독립 실험). 웨스턴 블롯 분석은 유사한 형질주입 조건 하에 U6.mi405, U6.mi405F 및 U6.mi405NF가 DUX4 단백질 수준을 각각 79 ± 1%(P<0.0001, ANOVA, N=2 독립 실험), 99 ± 1%(P<0.0001, ANOVA, N=2) 및 70 ± 13%(P<0.0036, ANOVA, N=2) 감소시키다는 것을 보여주었다. 유사하게, U6.mi405F는 가장 효율적이고 U6.mi405와 비교할 때 평균 20%의 억제 효율 증가를 보여주었다(P<0.0079, ANOVA, N=2)(도 3a 및 도 10).
U6.mi405F에 의한 성공 이후에, DUX4 발현을 억제하는 데 있어서 mi405보다 덜 효율적인 다른 인공적으로 설계된 miDUX4의 억제 효율에 대해 새로운 플랭킹 서열의 효과를 시험되었다[Wallace 등, Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2018 Mar 16; 8: 121-130]. 이의 억제 효율의 향상을 얻을 기대로, U6.mi405F에 사용된 동일한 플랭킹 서열을 사용하여 10개의 miDUX4를 클로닝하였다. 이중 루시퍼라제 검정을 사용하여 이의 억제 효율을 시험하였다(도 4a-b). 놀랍게도, 10개의 miDUX4F 작제물 중 어느 것도 이의 억제 효율이 향상되지 않았다. 그에 반해, mi185F, mi186F, mi318F, mi599F, mi1156F 및 mi1311F의 억제 효율은 각각 상대 레닐라 루시퍼라제 활성의 160 ± 8%(P<0.0001, ANOVA, N=3), 27 ± 9%(P<0.026, ANOVA, N=3), 44 ± 15%(P<0.018, ANOVA, N=3), 24 ± 9%(P<0.039, ANOVA, N=3), 34 ± 8%(P<0.0071, ANOVA, N=3) 및 27 ± 9%(P<0.021, ANOVA, N=3)의 증가에 의해 나타난 것처럼 이의 원래의 대응물과 비교할 때 감소하였다(도 9b).
공동형질주입된 HEK293 세포에서의 miDUX4 수준의 증가는 mi70F, mi318, mi318F, mi333, mi599, mi599F, mi1155 및 mi1155F를 제외하고 대부분의 시험된 miDUX4 miRNA의 억제 효율의 용량 의존적 증가를 보여주었다(도 4a). 게다가, 1:4 초과의 DUX4 대 miDUX4의 몰 비에서, miDUX4F miRNA의 어느 것도 모든 비에서 향상된 억제 효율을 보여준 mi405F를 제외하고 이의 동족 miDUX4보다 더 양호하게 수행되지 않았다. 후자는 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 1:4의 비로 33 ± 2%; 32 ± 2%; 34 ± 1% 및 32 ± 1%(P<0.0001, ANOVA, N=3 독립 반복실험)의 상대 레닐라 루시퍼라제 활성의 감소에 의해 나타났다.
다음에, HEK293 세포에서 이중 루시퍼라제 검정을 사용하여 mi405F에 대해 용량 단계적 감소 연구를 수행하였다(도 4b). 1:4로부터 40:1로의 DUX4:mi405 몰 비의 증가는 3개의 miDUX4 miRNA 작제물, 즉 U6.mi405, U6.mi405NF 및 U6.mi405F가 시험될 때 상대 레닐라 루시퍼라제 활성의 용량 의존적 증가로 이어졌다. U6.mi405NF는 73 ± 7%(P<0.0094, ANOVA, N=3)의 상대 레닐라 루시퍼라제 활성의 유의미한 증가를 보여주었는데, 1:2 대 1:1의 DUX4:miDUX4의 몰 비로부터 전환될 때 88 ± 3%에 도달한다. 흥미롭게도, U6.mi405F는 40:1 DUX4:miDUX4의 몰 비에서도 여전히 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 감소시킬 수 있었고, 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 감소시키는 데 있어서 U6.mi405보다 13 ± 2%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 더 효율적이었다. U6.mi405와 U6.mi405F 사이의 가장 큰 차이가 8:1의 DUX4:miDUX4 몰 비에서 관찰되었고, 여기서 U6.mi405F는 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 감소시키는 데 있어서 48 ± 6%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 더 효율적이었는데 38 ± 2%에 도달한다(도 4b).
실시예 5
mi405 줄기-루프 구조를 플랭킹하는 5' 및 3' 말단 서열의 변경은 miRNA의 침묵화 효율 및 발현에 영향을 미쳤다.
mi405F의 억제 효율과 mi70F, mi185F, mi186F, mi318F, mi333F, mi599F, mi1155F, mi1156F, mi1230F 및 mi1311F의 억제 효율 사이의 불일치는 miRNA의 억제 효율의 향상이 이의 5' 및 3' 말단 플랭킹 서열과 관련될 뿐만 아니라 miRNA 서열에 따라 달라진다는 것을 제시하였다(도 3a-b). mi405를 제외하고, mi405F의 5' 및 3' 말단 플랭크에 의해 다른 miDUX4의 것을 대체하는 것이 이의 억제 효율을 향상시키지 않았으므로, 다른 플랭킹 서열을 사용하는 것이 실제 결과를 변경하지 않을 것이라는 것을 제시할 이유가 없다. 따라서, 주요 miRNA mi405는 이의 억제 효율을 향상시키는 것을 담당하는 서열을 식별하기 위해 집중되었다. U6.mi405, U6.mi405NF 및 U6.mi405F 이외에, 7개의 추가 작제물, 즉 U6.mi405A, U6.mi405B, U6.mi405C, U6.mi405D, U6.mi405E, U6.mi405G 및 U6.mi405H(도 5a)가 설계되었다.
줄기-루프 구조로부터 분지하는 플랭킹 서열에서, "UA" 모티프는 5' 말단 플랭킹 서열에서 발견된 가능한 드로샤 인식 부위이면서 집중되고, 3' 말단 플랭킹 서열에서 발견된 "CNNC"(서열 번호 151) SRSF3에서 집중되었다. U6.mi405, U6.mi405A, U6.mi405B, U6.mi405G 및 U6.mi405H와 같은 작제물은 "UA" 모티프를 보유한다. U6.mi405, U6.mi405A, U6.mi405C, U6.mi405D, U6.mi405E, U6.mi405F, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 1개 또는 다수의 "CNNC"(서열 번호 151) 모티프를 보유한다(도 5a). 추가적으로, U6.mi405NF와 같은 일부 작제물은 플랭킹 서열이 결여된다. 모든 이 작제물을 U6 발현 플라스미드에서 클로닝하고, 이중 루시퍼라제 검정을 사용하여 이의 억제 효율에 대해 시험하였다.
따라서, U6.mi405 및 RenLuc-DUX4 ORF 발현 플라스미드를 2 대 1의 DUX4:mi405 몰 비로 HEK293 세포로 공동형질주입하고, 형질주입 후 24시간에 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 사용하여 측정하였다. 모든 U6.mi405 작제물은 U6.mi405NF 및 U6.mi405B를 제외하고 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 효율적으로 감소시켰고, 이는 레닐라 루시퍼라제 활성을 각각 4 ± 2%(P>0.80, ANOVA, N=3) 및 25 ± 3%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 감소시켰다. 그러나, U6.mi405, U6.mi405A, U6.mi405C, U6.mi405D, U6.mi405E, U6.mi405F, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 레닐라 루시퍼라제 활성을 각각 62 ± 2%, 72 ± 1%, 64 ± 1%, 71 ± 1%, 73 ± 1%, 77 ± 1%, 81 ± 1%, 80 ± 1%(P<0.0001, ANOVA, N=3) 감소시켰다. 흥미롭게도, 2 대 1의 DUX4:mi405 몰 비에서, 다른 U6.mi405 작제물의 어느 것도 상대 레닐라 루시퍼라제 활성을 억제하는 데 있어서 U6.mi405F보다 유의미하게 더 강력하였다(도 5b). 오직 U6.mi405G 및 U6.mi405H는 U6.mi405F와 비교할 때 이의 억제 효율의 최소 향상을 보여주었다. 따라서, HEK293 세포에서 24시간 동안 공동형질주입된 동일한 DUX4:mi405 몰 비를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 이의 활성을 추가로 시험하는 것이 결정되었다. 발현 플라스미드로서, miRNA 음성 대조군 U6.miGFP를 사용하였다. U6.mi405F, U6.mi405G 또는 U6.mi405H는 또한 mi405를 발현하도록 사용되었다. CMV.DUX4-FL/CMV.eGFP는 DUX4-FL 및 eGFP를 발현하도록 사용되었다.
U6.mi405F, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 U6.miGFP와 비교할 때 DUX4 단백질 수준을 각각 81 ± 9%, 88 ± 2% 및 79 ± 6% 감소시켰다(P<0.0001, ANOVA, N=3 독립 반복실험)(도 11). 그러나, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 U6.mi405F보다 유의미하게 더 효율적이지 않았다. 따라서, DUX4:mi405 몰 비는 12 대 1로 증가하였고, 이중 루시퍼라제 검정 및 웨스턴 블롯을 사용하여 3개의 mi405 작제물에 의해 재시험되었다(도 5b-5c). 본원에서 상기에 기재된 것처럼 이중 루시퍼라제 검정을 수행하였다. 그 결과, U6.mi405F와 비교할 때, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 레닐라 루시퍼라제 활성을 각각 추가 26 ± 5%(P<0.033, ANOVA, N=3) 및 25 ± 6%(P<0.042, ANOVA, N=3) 감소시켰다(도 11). 이 결과와 함께, 웨스턴 블롯은 U6.mi405F, U6.mi405G 및 U6.mi405H가 U6.mi405에 대해 40 ± 5%(P<0.0209, ANOVA, N=4), 71 ± 5%(P<0.0001, ANOVA, N=4) 및 60 ± 8%(P<0.0009, ANOVA, N=4)의 DUX4 단백질 수준의 유의미한 감소를 유도한다는 것을 보여주었다. 게다가, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 U6.mi405F와 비교할 때 52 ± 9%(P<0.0009, ANOVA, N=4) 및 33 ± 14%(P<0.0498, ANOVA, N=4)의 DUX4 단백질 수준의 유의미한 감소를 유도하였다(도 5c 및 도 12).
mi405의 억제 효율에 대한 효과와 별도로, miRNA의 발현에 대한 플랭킹 서열의 효과를 또한 시험하였다. 따라서, 가공된 성숙 mi405 서열의 발현을 표준 및 어드밴스드 TaqMan cDNA 합성 반응을 사용하여 정량화하였다. 전자의 반응에서, 역방향 프라이머는 줄기-루프 프라미머 기반 소형 RNA 검출 원칙(ThermoFisher Scientific)에 따라 성숙 mi405 서열을 검출한다(Jung 등, RNA (2013) 19: 1-10). 이후, mi405 성숙 서열과 역방향 프라이머 서열 사이의 연접부에서 염기쌍을 짓는 mi405에 특이적인 표준 TaqMan 프로브를 사용하여 증폭 및 정량화 단계를 수행하였다(도 6a). 그 결과, 표준 TaqMan cDNA 합성 반응을 사용하여 생성된 모든 U6.mi405 작제물로부터 cDNA에서 수행된 QPCR 분석은 U6.mi405F, U6.mi405B 및 U6.mi405C가 각각 U6.mi405와 비교하여 이의 성숙 mi405 서열보다 85 ± 5%(P<0.0019, ANOVA, N=3 독립 반복실험), 71 ± 9%(P<0.0038, ANOVA, N=4) 및 63 ± 27%(P<0.0133, ANOVA, N=3) 덜 하거나 더 적은 발현을 갖는다는 것을 보여주었다. 그러나, U6.mi405와 비교할 때 U6.mi405A, U6.mi405D, U6.mi405E, U6.mi405G 및 U6.mi405H로부터 기원하는 성숙 mi405 서열의 수준은 통계학적으로 유의미하지 않은 차이로 더 크거나 더 높았다(P>0.05, ANOVA, N=3-4 독립 실험)(도 6a). TaqMan 어드밴스드 cDNA 합성 반응에서, 성숙 서열은 5' 말단에서 어댑터 서열의 결찰을 통해 그리고 성숙 mi405 서열의 3' 말단에서 polyA 꼬리의 효소 첨가를 통해 연장된다. 이후, 성숙 miRNA의 3' 말단 및 어댑터 서열의 일부와 보통 염기쌍을 짓는 mi405에 특이적인 TaqMan 어드밴스드 프로브를 사용하여 증폭 및 정량화 단계를 수행하였다. 여기서, mi405의 성숙 서열과 오직 염기쌍을 짓는 추가 TaqMan 어드밴스드 프로브(임베딩된 프로브)(도 6b)를 사용하였다. 그 결과, TaqMan 어드밴스드 cDNA 합성 반응 후에, mi405, mi405F, mi405B, mi405C, mi405G 및 mi405H 발현 수준을 정량화하기 위해 드롭플렛 디지털 PCR(ddPCR)을 수행하였다. 이를 위해, TaqMan 어드밴스드 임베딩된 및 중첩된 mi405 프로브(도 6b)를 사용하였다. 그 결과, U6.mi405C, U6.mi405G 및 U6.mi405H가 통계학적으로 유의미하지 않은 더 높은 수준을 보여주었지만, 모든 시험된 U6.mi405 작제물은 유사한 수준으로 성숙 mi405 서열을 생성하였다.
실시예 6
DUX4 miRNA는 FSHD의 마우스 모델에서 DUX4 활성화된 바이오마커 발현을 감소시킨다
본 개시내용의 DUX4 miRNA 작제물을 포함하는 AAV를 근육내로(IM) 또는 정맥내로(IV) 새로운 FSHD 마우스 모델(TIC-DUX4) 또는 FSHD 마우스의 임의의 다른 마우스 모델로 주사한다. 4주, 8주, 12주, 16주, 20주 및 24주 후, qRT-PCR, RNAcope 또는 ddPCR에 의해 DUX4 바이오마커, 예컨대 Wfdc3 또는 Trim36의 발현 수준을 측정한다.
DUX4 바이오마커 발현의 수준의 감소가 비처리된 마우스의 근육에서의 수준과 비교하여 DUX4 miRNA로 처리된 마우스의 근육에서 관찰된다.
실시예 7
DUX4 miRNA는 FSHD의 마우스 모델에서 근육에서 내인성 DUX4 발현을 감소시킨다
본 개시내용의 DUX4 miRNA 작제물을 포함하는 AAV를 근육내로(IM) 또는 정맥내로(IV) 새로운 FSHD 마우스 모델(TIC-DUX4) 또는 FSHD 마우스의 임의의 다른 마우스 모델로 주사한다. 4주, 8주, 12주, 16주, 20주 및 24주 후, qRT-PCR, RNAcope 또는 ddPCR에 의해 DUX4 mRNA의 발현 수준을 측정한다.
DUX4 mRNA의 수준의 감소가 비처리된 마우스의 근육에서의 수준과 비교하여 DUX4 miRNA로 처리된 마우스의 근육에서 관찰된다.
실시예 8
DUX4 miRNA는 근육에서 내인성 DUX4 발현을 감소시킨다
본 개시내용의 DUX4 miRNA 작제물을 포함하는 AAV를 근육내로(IM) 또는 정맥내로(IV) FSHD를 겪는 환자로 주사한다. 처리 전 및 4주, 8주, 12주, 16주, 20주, 24주, 28주, 32주, 36주 40주, 44주, 48주 및 52주 후, qRT-PCR, RNAcope 또는 ddPCR에 의해 생검된 근육에서 환자의 근육에서의 DUX4 mRNA의 발현 수준을 측정한다.
DUX4 mRNA의 수준의 감소가 처리 전의 동일한 환자의 근육에서의 DUX4 mRNA의 수준과 비교하여 본 개시내용의 DUX4 miRNA 작제물을 포함하는 AAV로 처리된 환자의 근육에서 관찰된다. FSHD 질환 증상의 개선이 또한 관찰된다.
실시예 9
mir-675의 소분자 상향조절은 FSHD 환자 근관세포에서 DUX4 및 DUX4 반응성 바이오마커를 감소시킨다
DUX4를 조절하는 마이크로RNA인 Mir-675는 모든 알려진 인간 miRNA의 0.05%를 나타낸다. mir-675가 DUX4 조절자로서 식별되었지만, DUX4의 발현 또는 과발현과 연관된 질환, 예컨대 근 위축증, FSHD 및 암을 치료하는 데 있어서 약물 기반 치료학적 접근법에 대한 이 발견을 이용하도록 실험 작업을 수행하였다. 이러한 약물 기반 치료제는 뜻밖의 사건이 발생하면 조율 가능하고 잠재적으로 중단된다. mir-675가 DUX4의 강한 내인성 조절자로서 식별되었지만, mir-675 발현을 증가시키는 것으로 나타난 소분자 약물 또는 이의 H19 전구체에 대한 이전에 공개된 유전자 발현 데이터를 검토하도록 조사가 수행되었다.
3개의 소분자 후보(β-에스트라디올, β-에스트라디올 + 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA)의 조합 및 멜라토닌)는 HEK293 세포 및 인간 근관세포에서 mir-675-5p를 상향조절하는 이의 능력에 대해 시험되었다. HEK293 세포는 보통 최소량의 mir-675를 발현한다. HEK293 세포를 (1) 20 μM의 β-에스트라디올 단독; (2) 10 μM 또는 20 μM의 β-에스트라디올 + MPA; 또는 (3) 20 μM 또는 40 μM의 멜라토닌으로 처리하였다. 처리 후 24시간에, Droplet Digital PCR(ddPCR)에 의해 mir-675-5p 발현을 측정하였다.
3개의 처리 레지멘, 예를 들면 β-에스트라디올, β-에스트라디올 + MPA 또는 멜라토닌의 각각은 대조군, 즉 100% 에탄올 처리된 DUX4 형질주입된 세포와 비교할 때 mir-675 수준을 유의미하게 증가시켰다(도 28 및 표 3). 도 28에서, β-에스트라디올, 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA) 및 멜라토닌은 mir-675 발현을 증가시키고, HEK293 세포에서 DUX4 및 DUX4 유도 바이오마커 TRIM43의 발현을 감소시켰다. mir-675-5p, DUX4 및 TRIM43 수준을 측정하도록 드롭플렛 디지털 PCR(ddPCR)을 수행하였다. HEK293 세포를 DUX4에 의해 형질주입하고, 형질주입 시 개별적으로 2종의 약물(즉, β-에스트라디올 및 멜라토닌) 또는 10, 20 또는 40 μM에서의 β-에스트라디올 및 MPA의 조합에 의해 처리하였다. 에탄올(비히클) 처리된 세포와의 비교에 의해 이 약물의 효과를 평가하였다. 숫자는 n=3 독립 실험(ANOVA, P<0.0001)에 상응한다. β-에스트라디올, β-에스트라디올 + MPA 또는 멜라토닌으로 처리된 HEK293 세포로부터의 유전자 발현의 정량화(퍼센트 변화)는 드롭플렛 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 측정되고, 하기에 제시된 표 3에서 보고되어 있다. 항-mir-675는 mir-675-5p의 성숙 서열을 표적화하는 안타고미르인데, DUX4 유전자 발현의 억제제로서 이의 기능을 억제한다. CMV.DUX4-mir-675Res는 DUX4 돌연변이체 서열을 암호화하는 발현 플라스미드이다. 이 서열은 ORF에서 발견된 mir-675 표적 부위 780(TS780)에서 돌연변이되고(도 17b 참조), 이의 3' UTR이 결실되어서, 이 DUX4 돌연변이체의 발현이 mir-675 의존적 억제에 저항적이게 한다.
처리 그룹의 각각의 세포에서 DUX4 수준을 측정하였다. DUX4에 의해 형질주입된 대조군 처리된 세포는 하우스키핑 유전자 RPL13A에 대해 평균 339 ± 2 카피/μL를 가졌다. 20 μM에서의 β-에스트라디올; 각각 20 μM에서의 β-에스트라디올 + MPA; 및 20 μM 및 40 μM에서의 멜라토닌의 각각의 첨가는 DUX4 및 DUX4 반응성 바이오마커 TRIM43의 수준의 유의미한 감소로 이어졌다(도 28 및 표 3).
HEK293 세포가 10 μM의 조합 β-에스트라디올 + MPA 및 20 μM의 멜라토닌으로 처리될 때 항-mir-675 안타고미르에 의한 공동형질주입은 TRIM43 수준을 증가시켰고, 이는 사용된 약물이 mir-675의 발현을 직접적으로 유도함으로써 DUX4 및 TRIM43에 대한 이의 효과를 발휘한다는 것을 나타낸다.
mir-675-저항 DUX4 발현 플라스미드(CMV.DUX4-mir-675Res)에 의해 형질주입된 HEK293 세포의 40 μM의 멜라토닌에 의한 처리는 TRIM43 발현의 감소로 이어지지 않아서, 멜라토닌의 mir-675 의존적 효과를 확인시켜 준다(도 28 및 표 3).
다음에, 15A, 17A 및 18A FSHD 분화된 근육 세포주(근관세포)에서 내인성 mir-675-5p, DUX4 및 TRIM43의 발현에 대해 3개의 처리 레지멘의 효과를 시험하였다(도 29 및 표 4). 이 FSHD 세포주는 낮은(15A), 중간(18A) 및 높은(17A) DUX4 발현을 나타내므로 선택되었다[Jones 등, Hum. Mol. Genet. 21: 4419-30 (2012)]. 도 29에서, β-에스트라디올, 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA) 및 멜라토닌은 mir-675 발현을 증가시켰고, 3개의 FSHD 이환된 근관세포주에서 DUX4 및 DUX4 유도 바이오마커 TRIM43의 발현을 감소시켰다. 분화 후 5일에 15A(A), 17A(B) 및 18A(C) FSHD 이환된 근관세포에서 mir-675-5p, DUX4 및 TRIM43 수준을 측정하기 위해 드롭플렛 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하였다. 분화의 제4일에 2종의 약물(즉, β-에스트라디올 및 멜라토닌)을 20 μM에서 개별적으로 또는 조합(β-에스트라디올 + MPA)으로서 첨가하였다. 모든 처리를 에탄올(비히클) 처리된 대조군 세포와 비교하였다(15A에 대해 n=6 독립 실험 및 17A 및 18A에 대해 N=3. *, P<0.05. **, P<0.01. ***, P<0.001, ANOVA). β-에스트라디올, β-에스트라디올+MPA 또는 멜라토닌으로 처리된 5일 분화된 15A, 17A 및 18A 근관세포에서의 유전자 발현(mir-675-5p, DUX4 및 TRIM43)의 정량화는 하기 표 4 및 도 29에 보고되어 있다.
분화의 제4일에 3개의 처리 레지멘을 근관세포에 첨가하였다. 세포를 나중에 24시간에 수확하였다. DUX4 발현에서의 부스트가 분화 단계에서 발생하므로 FSHD 세포를 분화 단계에서 처리하였다[Balog 등, Epigenetics 10: 1133-42 (2015)].
15A 근관세포에서, 모든 3개의 처리 레지멘은 mir-675 발현의 증가를 촉발하였다(도 29a 및 표 4). 동시에, 15A 근관세포가 β-에스트라디올 + MPA 또는 멜라토닌으로 처리될 때 DUX4 및 TRIM43 발현은 유의미하게 감소하였다. 그러나, β-에스트라디올 단독에 의한 처리는 TRIM43 발현의 유의미한 감소를 촉발하지 않았다(도 29a 및 표 4). 17A 및 18A 근관세포에서, β-에스트라디올, β-에스트라디올 + MPA 또는 멜라토닌은 DUX4 및 TRIM43 발현의 유의미한 감소와 연관된 mir-675 발현의 유의미한 증가를 촉발하였다(도 29b-c 및 표 4).
본원에 개시된 치료학적 전략은 (1) 내인성 마이크로RNA 유전자 발현이 소분자 처리에 반응하여 변할 수 있고; 그리고 (2) 천연 DUX4 표적화된 마이크로RNA가 RNAi 경로를 통해 DUX4 발현을 감소시키도록 상향조절될 수 있다는 것을 보여준다. 이 2가지 원칙을 조합함으로써, 세포 내에 분해를 위해 DUX4를 표적화하는 천연 마이크로RNA의 발현을 증가시키도록 소분자를 사용할 수 있어서, 근 위축증 또는 DUX4 발현 또는 DUX4의 과발현과 연관된 암에 대한 새로운 치료제를 생성시킨다.
중요하게는, mir-675를 항-mir-675 안타고미르에 의해 억제하는 것 또는 mir-675-저항 DUX4 작제물(CMV.DUX4 mir-675Res)에 대한 이의 결합을 방지하는 것은 3개의 처리 레지멘, 즉 β-에스트라디올, β-에스트라디올 + MPA의 조합, 및 멜라토닌이 mir-675 작용을 통해 이의 DUX4 억제 효과를 발휘한다는 것을 지지하였다(도 28 및 표 3).
이 연구는 에스트로겐, 에스트로겐 및 프로게스테론, 및 멜라토닌이 DUX4 발현을 억제할 수 있고, DUX4의 발현 및/또는 과발현과 연관된 질환, 예컨대 FSHD 또는 암의 치료에 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 10
mir-675는 골격근 재생 및 분화를 향상시킨다
손상된 마우스 골격근의 재생 및 분화에 대한 mir-675의 유리한 효과를 보여주는 이전의 연구에 덧붙여[Dey 등, Genes Dev. 28: 491-501 (2014)], 이 연구는 mir-675가 인간 골격근 및 비근육 세포주에서 골 형태형성 단백질(BMP) 경로 및 DNA 복제 개시 인자 Cdc6에 중요한 항-분화 Smad 전사 인자(Smad 1 및 5)를 표적화하고 하향조절할 수 있는 것으로 입증되었으므로(도 25, 26 및 30), mir-675가 인간 골격근 재생 및 분화를 향상시키는 것으로 보인다는 것을 보여준다. 도 25는 HEK293 세포에서 SMAD1, SMAD5 및 CDC6의 mir-675 표적화를 보여준다. 각각의 조사된 유전자에 특이적인 TaqMan 프로브를 사용하여 HEK293 세포에서 SMAD1, SMAD5 및 CDC6의 발현을 측정하도록 QPCR을 이용하였다. 이것을 하기 위해, U6.milacZ(음성 대조군), H1.mir-675, U6.mir-675-3p 또는 U6.mir-675-5p 발현 작제물을 HEK293 세포로 형질주입하고, 전체 RNA를 형질주입 후 48시간에 추출하였다. U6.mir-675-3p는 SMAD1 수준을 평균 32 ± 6% 감소시키고(P<0.044, ANOVA, N=3), SMAD5 수준을 평균 35 ± 6% 감소시켰다(P<0.0013, ANOVA, N=3). 다른 한편, H1.mir-675 및 U6.mir-675-5p는 CDC6 수준을 각각 평균 38 ± 4%(P<0.0034, ANOVA, N=3) 및 36 ± 7%(P<0.0048, ANOVA, N=3) 억제하였다. 결과는 U6.milacZ에 의해 형질주입된 세포에서 유전자 발현에 대해 3개의 반복실험(N=3)의 상대 유전자 발현(ΔΔCq) ± SEM으로서 보고되었고, 각각의 QPCR 검정은 3중 반복으로 수행되었다. 기준 유전자로서 하우스키핑 유전자 RPL13A를 사용하여 모든 결과를 정량화하였다. 도 26은 도 30의 자르지 않은 웨스턴 블롯을 보여준다. 도 30에서, 내인성 mir-675는 대조군 비이환된 분화된 근육 세포주(15V 근육 세포주의 근관세포)에서 CDC6 유전자 발현을 표적화하고, 15A FSHD 이환된 인간 근관세포에서 DUX4 유도 독성을 방지한다. CDC6 유전자 발현의 표적화는 특이적 항-mir-675 안타고미르를 사용함으로써 그리고 4일 분화된 15V 대조군 근관세포에서 Cdc6 단백질 수준을 측정함으로써 시험되었다. Cdc6은 항-mir-675에 의해 형질주입된 근관세포에서 오직 검출되었다(자르지 않은 겔에 대해 도 26 참조). 기준품으로서 하우스키핑 단백질 α-튜불린을 사용하였다.
DUX4 발현의 침묵화에 덧붙여, 재생에서의 mir-675의 관여는 이것이 DUX4 발현이 이후에 감소되는 새로운 근육 섬유를 재생하는 것을 도우면서 FSHD 이환된 골격근에 유리한 것으로 예상된다.
요약하면, 본원에 제공된 mir-675 및 mir-675 유사체는 FSHD 및 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 다른 질환을 치료하기 위한 치료학적 적용을 갖는 DUX4 억제제로서 유용하다.
실시예 11
mi405G 및 H는 낮은 AAV 용량에서 생체내 DUX4 독성을 감소시키는 데 있어서 mi405보다 더 효율적이다
U6.mi405, U6.mi405F, U6.mi405G 및 U6.mi405H는 C57BL/6 마우스의 TA에서 동등한 용량(5e09 DNase 내성 입자(DRP))에서의 AAV.CMV.DUX4-FL과 scAAV6을 사용하여 공동주사되었다. AAV.CMV.DUX4-FL의 용량과 동등한 용량에서 생체내 DUX4 유도 근육 독성을 제거하기 위해 4개의 mi405 작제물의 효율을 조사하도록 이 실험을 수행하였다. 이전에, Wallace 등 [Wallace 등, Ann. Neurol. 69: 540-552 (2011); Wallace 등 Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Mar 16; 8: 121-130]는 AAV.U6.mi405가 AAV.DUX4의 용량보다 1 log 높은 용량에서 DUX4 유도 독성에 대응하는 데 고도로 효율적이었다는 것을 보여주었지만, 더 낮은 용량에서 AAV.U6.mi405를 결코 시험하지 않았다. 도 34에서의 데이터는 더 낮은 용량에서 mi405F가 아니라 mi405G 및 mi405H가 단핵 세포 침윤 및 중앙 핵을 갖는 근섬유를 특징으로 하는 DUX4 유도 근육 독성을 제거하는 데 있어서 mi405보다 더 효율적이라는 것을 보여준다. 이 데이터는 mi405와 비교할 때 생체내 향상된 억제 효율을 나타내지 않은 mi405F를 제외하고(도 34) 시험관내 데이터(도 5c 및 도 12)와 일치한다.
실시예 12
피라진아미드 및 소라페닙은 FSHD 이환된 근육 세포에서 DUX4 및 DUX4 반응성 바이오마커(TRIM43 및 ZSCAN4)의 발현을 감소시켰다
18A FSHD 이환된 근육 세포주를 근관세포로의 분화의 제4일에 피라진아미드 또는 소라페닙의 증가하는 농도로 처리하였다. 세포를 분화의 제5일에 수집하였다. RNA를 추출하고, DUX4, TRIM43 및 ZSCAN4에 대한 ddPCR 유전자 발현 분석을 수행하였다. 그 결과, 40 μM의 피라진아미드는 TRIM43 및 ZSCAN4 발현을 각각 35 ± 7%(ANOVA, P=0.0378, N=3 독립 실험) 및 42 ± 6%(ANOVA, P=0.0043, N=3 독립 실험) 감소시켰다(도 35). 소라페닙은 용량 의존적 방식으로 DUX4, TRIM43 및 ZSCAN4 발현을 감소시켰고, 여기서 이것은 40 μM의 농도에서 사용될 때 최대 억제에 도달하였다. 후자에서, 소라페닙은 DUX4, TRIM43 및 ZSCAN4 발현을 각각 40 ± 10%(ANOVA, P=0.0486, N=3 독립 실험), 70 ± 4%(ANOVA, P=0.0003, N=3 독립 실험) 및 68 ± 3%(ANOVA, P=0.0001, N=3 독립 실험) 감소시켰다(도 35).
본 발명의 범위 내의 변형이 당업자에게 자명할 수 있으면서 상기 설명은 오직 이해의 명확함을 위해 주어지고, 불필요한 제한이 이로부터 이해되지 않아야 한다.
하기하는 본 명세서 및 청구항에 걸쳐, 문맥이 달리 요하지 않는 한, "포함한다"의 단어 및 "포함한" 및 "포함하는"과 같은 변형어는 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제가 아니라 기술된 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 걸쳐, 조성물이 성분 또는 재료를 포함하는 것으로 기재되는 경우, 그 조성물이 또한 달리 기재되지 않는 한 열거된 성분 또는 재료의 임의의 조합으로 본질적으로 이루어지거나 이루어질 수 있는 것으로 고려된다. 마찬가지로, 방법이 특정한 단계를 포함하는 것으로 기재되는 경우, 그 방법은 또한 달리 기재되지 않는 한 열거된 단계의 임의의 조합으로 본질적으로 이루어지거나 이루어질 수 있는 것으로 고려된다. 본원에 예시적으로 개시된 발명은 적합하게는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 단계의 부재 하에 실행될 수 있다.
본원에 개시된 방법 및 이의 개별 단계의 실행은 수동으로 및/또는 전자 설비의 도움으로 또는 이에 의해 제공된 자동화로 수행될 수 있다. 공정이 특정한 실시형태와 관련하여 기재되어 있지만, 당업자는 그 방법과 연관된 행동을 수행하는 다른 방식이 사용될 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들면, 다양한 단계의 순서는 달리 기재되지 않는 한 그 방법의 범위 또는 정신으로부터 벗어나지 않으면서 변할 수 있다. 게다가, 개별 단계의 일부는 조합되거나 생략되거나 추가 단계로 추가로 하위분할될 수 있다.
본원에 인용된 모든 특허, 공보 및 참고문헌은 본원에 완전히 참고로 포함된다. 본 개시내용과 포함된 특허, 공보 및 참고문헌 사이의 상충의 경우에, 본 개시내용이 지배해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Research Institute at Nationwide Children's Hospital <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING DISEASE ASSOCIATED WITH DUX4 OVEREXPRESSION <130> 28335/53445/PC <150> US 63/145,255 <151> 2021-02-03 <160> 152 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2059 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 atggccctcc cgacaccctc ggacagcacc ctccccgcgg aagcccgggg acgaggacgg 60 cgacggagac tcgtttggac cccgagccaa agcgaggccc tgcgagcctg ctttgagcgg 120 aacccgtacc cgggcatcgc caccagagaa cggctggccc aggccatcgg cattccggag 180 cccagggtcc agatttggtt tcagaatgag aggtcacgcc agctgaggca gcaccggcgg 240 gaatctcggc cctggcccgg gagacgcggc ccgccagaag gccggcgaaa gcggaccgcc 300 gtcaccggat cccagaccgc cctgctcctc cgagcctttg agaaggatcg ctttccaggc 360 atcgccgccc gggaggagct ggccagagag acgggcctcc cggagtccag gattcagatc 420 tggtttcaga atcgaagggc caggcacccg ggacagggtg gcagggcgcc cgcgcaggca 480 ggcggcctgt gcagcgcggc ccccggcggg ggtcaccctg ctccctcgtg ggtcgccttc 540 gcccacaccg gcgcgtgggg 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atgataggct 180 tggatttcta taagagatac aaatactaaa ttattatttt aaaaaacagc acaaaaggaa 240 actcacccta actgtaaagt aattgtgtgt tttgagacta taaatatccc ttggagaaaa 300 gccttgtttg ctcgagtgag cgccccctca gcgaggaaga atacctgtaa agccacagat 360 ggggtattct tcctcgctga ggggttgcct actagtaatt cttcgattct gcttttttc 419 <210> 91 <211> 477 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 91 gacgccgcca tctctaggcc cgcgccggcc ccctcgcaca gacttgtggg agaagctcgg 60 ctactcccct gccccggtta atttgcatat aatatttcct agtaactata gaggcttaat 120 gtgcgataaa agacagataa tctgttcttt ttaatactag ctacatttta catgataggc 180 ttggatttct ataagagata caaatactaa attattattt taaaaaacag cacaaaagga 240 aactcaccct aactgtaaag taattgtgtg ttttgagact ataaatatcc cttggagaaa 300 agccttgttt gcgtttagtg aaccgtcaga tggtaccgtt taaactcgag tgagcgagcg 360 gagaactgcc attctttcct gtaaagccac agatggggaa agaatggcag ttctccgcgt 420 gcctactaga gcggccgcca cagcggggag atccagacat gataagatac atttttt 477 <210> 92 <211> 418 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 92 acgccgccat ctctaggccc gcgccggccc cctcgcacag acttgtggga gaagctcggc 60 tactcccctg ccccggttaa tttgcatata atatttccta gtaactatag aggcttaatg 120 tgcgataaaa gacagataat ctgttctttt taatactagc tacattttac atgataggct 180 tggatttcta taagagatac aaatactaaa ttattatttt aaaaaacagc acaaaaggaa 240 actcacccta actgtaaagt aattgtgtgt tttgagacta taaatatccc ttggagaaaa 300 gccttgtttg ctcgagtgag cgagcggaga actgccattc tttcctgtaa agccacagat 360 ggggaaagaa tggcagttct ccgcgtgcct actagtaatt cttcgattct gctttttt 418 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 93 auuaaagcga guggcaacau gg 22 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 94 aaaccagauc ugaauccugg ac 22 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 95 uggugcggag agggcccaca gug 23 <210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 96 uuuggcucgg gguccaaacg ag 22 <210> 97 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 97 uucugaaacc aaaucuggac cc 22 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 98 auucugaaac caaaucugga cc 22 <210> 99 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 99 aaaggctcgg aggagcaggg cg 22 <210> 100 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 100 aaagcgaucc uucucaaagg cu 22 <210> 101 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 101 aaagcccccu gugggagagc cc 22 <210> 102 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 102 uucuaggaga gguugcgccu gc 22 <210> 103 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 103 uuucuaggag agguugcgcc ug 22 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 104 guauucuucc ucgcugaggg gu 22 <210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 105 gaaagaaugg caguucuccg cg 22 <210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 106 guccaggauu cagaucuggu uu 22 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 107 ccagggucca gauuugguuu 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 108 cgugggucgc cuucgcccac 20 <210> 109 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 109 gcgcugcagc ccagccaggc cgcgccgg 28 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 110 ugcagcccag ccaggccgcg ccg 23 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 111 uccucgcugg ccuccgcacc 20 <210> 112 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 112 cuccaccucc ccagcccgcg cc 22 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 113 ccggugagag acuccacacc g 21 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 114 ccggugagag acuccacacc g 21 <210> 115 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 115 cguuuggacc ccgagccaaa cu 22 <210> 116 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 116 guccagauuu gguuucagaa cu 22 <210> 117 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 117 uccagauuug guuucagaau cu 22 <210> 118 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 118 cccugcuccu ccgagccuuu cu 22 <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 119 ccuuugagaa ggaucgcuuu cu 22 <210> 120 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 120 gcucucccac agggggcuuu cu 22 <210> 121 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 121 aggcgcaacc ucuccuagaa cu 22 <210> 122 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 122 ggcgcaaccu cuccuagaaa cu 22 <210> 123 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 123 cccucagcga ggaagaauac cu 22 <210> 124 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 124 cggagaacug ccauucuuuc cu 22 <210> 125 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 125 ccggctcgag atggccctcc cgacac 26 <210> 126 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 126 acgactagtg ggagggggca ttttaatata tctc 34 <210> 127 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 127 ccggctcgag atggccctcc cgacac 26 <210> 128 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 128 acgactagtg ggagggggca ttttaatata tctc 34 <210> 129 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 129 attaaaa 7 <210> 130 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 130 ttactagtat taatagtaat caattacgg 29 <210> 131 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 131 caatgaattc gttaatgatt aacccgccat 30 <210> 132 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 132 ccgagaattc ctcgacttat taatagtaat caattacggg gtca 44 <210> 133 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 133 acccaagatc tggggcaagg tgggcaaaag ccgggagga 39 <210> 134 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 134 caccttgccc cagatcttgg gtgcctgagg gtgggagag 39 <210> 135 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 135 cgggtaccct acgtagaatc gagcccgagg ag 32 <210> 136 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 136 ttactagtat taatagtaat caattacgg 29 <210> 137 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 137 attcgttaat gattaacccg ccat 24 <210> 138 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 138 ccggctcgag atggccctcc cgacac 26 <210> 139 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 139 acgactagtg ggagggggca ttttaatata tctc 34 <210> 140 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 140 ccggctcgag atggccctcc cgacac 26 <210> 141 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 141 cgggcaaaag ccgggagga 19 <210> 142 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 142 tcctcccggc ttttgcccgg cctgagggtg ggaga 35 <210> 143 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 143 agcggccgca agctcctcca gcagagc 27 <210> 144 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 144 gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgtccag 50 <210> 145 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 145 cggcccaaac cagatctgaa tc 22 <210> 146 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 146 gtgcagggtc cgaggt 16 <210> 147 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 147 atacgacgtc caggat 16 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 148 cactgtgggc cctctccgca cca 23 <210> 149 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 149 ugug 4 <210> 150 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 150 uggug 5 <210> 151 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> n is a, c, g, t or u <400> 151 cnnc 4 <210> 152 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 152 uggugcggag agggcccaca gug 23

Claims (38)

  1. 이중 호메오박스 4(DUX4: double homeobox 4) 표적화 마이크로RNA(miRNA)를 암호화하는 핵산으로서,
    (a) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열;
    (b) 서열 번호 5 내지 47 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열;
    (c) 서열 번호 95 내지 105 중 어느 하나에 제시된 RNA 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
    (d) 서열 번호 106 내지 124 중 어느 하나에 제시된 DUX4 서열에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 프로모터 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 프로모터는 U6, U7, tRNA, H1, 최소 CMV, T7, EF1-알파, 최소 EF1-알파 또는 근육 특이적 프로모터 중 어느 것인, 핵산.
  4. 제3항 또는 제4항에 있어서, 프로모터는 U6 또는 H1인, 핵산.
  5. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 서열과 적어도 90%의 동일성을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 또는
    (b) 서열 번호 50 내지 92 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  6. 제3항에 있어서, 근육 특이적 프로모터는 unc45b, tMCK, 최소 MCK, CK6, CK7, CK8, MHCK7 또는 CK1인, 핵산.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 아데노 연관 바이러스.
  8. 제7항에 있어서, 바이러스는 rep 및 cap 유전자가 결여된, 아데노 연관 바이러스.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 바이러스는 재조합 AAV(rAAV) 또는 자가 상보성 재조합 AAV(scAAV)인, 아데노 연관 바이러스.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAVanc80, AAVrh.74, AAVrh.8, AAVrh.10 또는 AAV-B1인, 아데노 연관 바이러스.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 AAV9인, 아데노 연관 바이러스.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀.
  13. 조성물로서,
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 아데노 연관 바이러스; 또는
    (c) 제12항의 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀; 및
    약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 조성물.
  14. 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하고/하거나 방해하는 방법으로서, 세포를
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 아데노 연관 바이러스;
    (c) 제12항의 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀; 및/또는
    (d) 제13항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 근 위축증 또는 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 하기의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 아데노 연관 바이러스;
    (c) 제12항의 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀; 및/또는
    (d) 제13항의 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 근 위축증은 안면견갑상완 근 위축증(FSHD)인, 방법.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 암은 육종, B 세포 림프종, 또는 부신, 담관, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 두부/경부, 간, 뇌, 폐, 중피, 신경능, 난소, 췌장, 전립선, 신장, 피부, 연조직, 위, 고환 또는 흉선의 DUX4 발현 암인, 방법.
  18. 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하기 위한 약제의 제조를 위한,
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 아데노 연관 바이러스;
    (c) 제12항의 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀; 및/또는
    (d) 제13항의 조성물
    의 용도.
  19. 근 위축증 또는 암을 치료하거나 개선하기 위한,
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 아데노 연관 바이러스;
    (c) 제12항의 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀; 및/또는
    (d) 제13항의 조성물
    의 용도.
  20. 근 위축증 또는 암을 치료하거나 개선하기 위한 약제의 제조를 위한,
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 아데노 연관 바이러스;
    (c) 제12항의 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀; 및/또는
    (d) 제13항의 조성물
    의 용도.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 근 위축증은 안면견갑상완 근 위축증인, 용도.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 육종, B 세포 림프종, 또는 부신, 담관, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 두부/경부, 간, 뇌, 폐, 중피, 신경능, 난소, 췌장, 전립선, 신장, 피부, 연조직, 위, 고환 또는 흉선의 DUX4 발현 암인, 용도.
  23. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산;
    (b) 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 아데노 연관 바이러스(AAV);
    (c) 제12항의 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀;
    (d) 제13항의 조성물;
    (e) 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법; 또는
    (f) 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항의 용도로서,
    핵산, AAV, 나노입자, 세포외 베시클, 엑소좀, 또는 조성물, 또는 약제는 근육내 주사, 경구 투여, 피하, 피내 또는 피부경유 수송, 혈류로의 주사를 위해 또는 에어로졸 투여를 위해 제형화된, 핵산, AAV, 나노입자, 세포외 베시클 또는 엑소좀, 조성물, 방법 또는 용도.
  24. 세포에서 마이크로RNA-675의 발현을 상향조절하는 방법으로서, 세포를 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하고/하거나 방해하는 방법으로서, 세포를 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 근 위축증 또는 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 근 위축증은 안면견갑상완 근 위축증(FSHD)인, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 암은 육종, B 세포 림프종, 또는 부신, 담관, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 두부/경부, 간, 뇌, 폐, 중피, 신경능, 난소, 췌장, 전립선, 신장, 피부, 연조직, 위, 고환 또는 흉선의 DUX4 발현 암인, 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 에스트로겐 또는 합성 에스트로겐은 에스트론, 에스트라디올, 에스트리올, 에스테트롤, 27-하이드록시콜레스테롤, 데하이드로에피안드로스테론(DHEA), 7-옥소-DHEA, 7α-하이드록시-DHEA, 16α-하이드록시-DHEA, 7β-하이드록시에피안드로스테론, 안드로스텐디온(A4), 안드로스텐디올(A5), 3α-안드로스탄디올 및 3β-안드로스탄디올, 2-하이드록시에스트라디올, 2-하이드록시에스트론, 4-하이드록시에스트라디올, 4-하이드록시에스트론, 16α-하이드록시에스트론, 에티닐 에스트라디올, 에스트라디올 발러레이트, 에스트로피페이트, 공액 에스테르화 에스트로겐 및 퀴네스트롤인, 방법.
  30. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 프로게스테론 또는 프로게스틴은 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA), 17α-하이드록시프로게스테론, 클로르마디논 아세테이트, 시프로테론 아세테이트, 게스토덴 또는 에토노게스트렐인, 방법.
  31. 세포에서 마이크로RNA-675의 발현을 상향조절하기 위한, 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 용도.
  32. 세포에서 이중 호메오박스 4(DUX4) 유전자의 발현을 억제하고/하거나 방해하기 위한, 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 용도.
  33. 근 위축증 또는 DUX4 발현 또는 과발현과 연관된 암을 갖는 대상체를 치료하기 위한, 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합의 용도.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 근 위축증은 안면견갑상완 근 위축증인, 용도.
  35. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 육종, B 세포 림프종, 또는 부신, 담관, 방광, 유방, 자궁경부, 결장, 자궁내막, 식도, 두부/경부, 간, 뇌, 폐, 중피, 신경능, 난소, 췌장, 전립선, 신장, 피부, 연조직, 위, 고환 또는 흉선의 DUX4 발현 암인, 용도.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 에스트로겐 또는 합성 에스트로겐은 에스트론, 에스트라디올, 에스트리올, 에스테트롤, 27-하이드록시콜레스테롤, 데하이드로에피안드로스테론(DHEA), 7-옥소-DHEA, 7α-하이드록시-DHEA, 16α-하이드록시-DHEA, 7β-하이드록시에피안드로스테론, 안드로스텐디온(A4), 안드로스텐디올(A5), 3α-안드로스탄디올 및 3β-안드로스탄디올, 2-하이드록시에스트라디올, 2-하이드록시에스트론, 4-하이드록시에스트라디올, 4-하이드록시에스트론, 16α-하이드록시에스트론, 에티닐 에스트라디올, 에스트라디올 발러레이트, 에스트로피페이트, 공액 에스테르화 에스트로겐 및 퀴네스트롤인, 용도.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 프로게스테론 또는 프로게스틴은 메드록시프로게스테론 아세테이트(MPA), 17α-하이드록시프로게스테론, 클로르마디논 아세테이트, 시프로테론 아세테이트, 게스토덴 또는 에토노게스트렐인, 용도.
  38. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항의 방법 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항의 용도로서, 에스트로겐, 합성 에스트로겐, 프로게스테론, 프로게스틴, 멜라토닌, 블레오마이신, 피라진아미드, 소라페닙 또는 이의 유도체, 또는 임의의 이들의 조합은 근육내 주사, 경구 투여, 피하, 피내 또는 피부경유 수송, 혈류로의 주사를 위해 또는 에어로졸 투여를 위해 제형화된, 방법 또는 용도.
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