DE69735636T2

DE69735636T2 - Verfahren zur bestimmung des malignen zellezustands und verfahren zur behandlung

Info

Publication number: DE69735636T2
Application number: DE69735636T
Authority: DE
Inventors: Fabien Calvo
Original assignee: Cerenis SA
Current assignee: Abionyx Pharma SA
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2017-11-01
Also published as: DE69735636D1; EP0941364B1; FR2755148B1; EP0941364A1; WO1998018960A1; ATE322553T1; FR2755148A1; JP2001503261A; US6277575B1; CA2269865A1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein den Nachweis einer Reorganisation des Kerns während der Tumorsuppression und die Konsequenzen, die sich daraus in Hinblick auf Diagnostik wie Therapie, insbesondere die Antikrebstherapie ergeben.
Mehr und mehr Hinweise legen nahe, dass die Regulation der Expression der Gene, unabhängig davon, ob es sich um deren Aktivierung oder um deren Stilllegung handelt, in zwei Schritten abläuft, bei welchen man zuallererst eine Kompartimentierung der Chromosomen im Kern vor der Transkription beobachtet.
Die Erfindung hat die Tatsache nachgewiesen, dass in Krebsgeweben diese Kompartimentierung verglichen mit einer normalen Zelle unterschiedlich abläuft, was ein Element für eine Diagnose darstellen könnte.
Diese Beobachtung konnte insbesondere gemacht werden, indem der Mechanismus des Gens p21WAF1 und sein Verhalten während der Aktivierung, welche zu der Suppression des Tumorentstehungsprozesses beiträgt, untersucht wurden.
Dieses Phänomen konnte insbesondere dank einer Perfektionierung des DNase I-Verfahrens, welches erlaubt hat, diesen Prozess zu verfolgen, nachgewiesen werden.
Das DNase I-Verfahren beruht auf der Beobachtung, dass das auf der Ebene der Transkription aktive Chromatin gegenüber der Wirkung von Nukleasen ganz besonders empfindlich ist. Es enthält insbesondere Stellen, die gegenüber DNase I hyperempfindlich sind (es handelt sich um relativ kurze DNR-Abschnitte, die gegenüber einer großen Anzahl von Spaltungs mitteln sehr empfindlich sind). Diese von Nukleosomen freien DNA-Abschnitte sind mit verschiedenen Funktionen der Genexpression assoziiert. Solche „offenen Chromatin-Regionen„ können die Bindung von spezifischen Faktoren erlauben und weisen bedeutende Regulationsfunktionen auf; man spricht dann davon, dass die markierte DNA die exponierte DNA ist.
Es konnten folglich dank dieses Verfahrens die möglichen Beziehungen zwischen der Transkription der Gene und deren Hyperempfindlichkeit gegenüber der DNase I in situ untersucht werden, insbesondere als Marker, welcher die Analyse der Organisation des Gesamtgenoms bei Krebsphänomenen, erlaubt.
Das generelle Verfahren, welches nachfolgend als „DNase-Verfahren„ bezeichnet werden wird, wird insbesondere in dem veröffentlichten amerikanischen Patent US-5-264-343 beschrieben; dieses Dokument wird hier als ausdrückliche Referenz zitiert und die Informationen, die es enthält, werden hier nicht mehr im Detail wiederholt. Man könnte gleichfalls auf die Veröffentlichung von Puck et al. (Puck, T.T., Bartholdi, M., Krystosek, A., Johnson, R. & M. Haag. Somatic Cell and Molec. Genetics 17, 489-503, 1991) verweisen.
Das Dokument WO 95/09928 bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Krebs durch Nachweis von Chromosomendeletionen.
Gleichwohl erlaubt das in dem fraglichen Patent beschriebene Verfahren nicht die Analyse von Geweben, die durch die Formol-Paraffin-Methode fixiert worden sind, d.h. von Geweben, die durch die Methode, die in den meisten Anatomie-Pathologie-Laboratorien ausgeführt wird, erhalten werden. Tatsächlich betrifft das in dem amerikanischen Patent beschriebene Verfahren im Wesentlichen die Analyse von Systemen in Zellkultur.
Es ist folglich einer der Gegenstände der Erfindung, ein neues DNase-Verfahren vorzuschlagen, welches erlaubt, Diagnostiken an fixierten Geweben auszuführen.
Die Erfindung hat aber außerdem allgemein Verfahren zum Gegenstand, die dazu bestimmt sind, den Status einer malignen Zelle nachzuweisen, in welchen man die genaue Konformation von wenigstens einem Gen innerhalb des Kerns der Zelle durch Markierung des Gens in situ und Auswertung der Abweichung dieser Konformation verglichen mit einer normalen Zelle als Index für deren Malignität nachweist.
Wenn der Nachweis der Position der exponierten DNA durch die DNase-Methode tatsächlich eine globale Analyse des Malignitätsstatus eines Gewebes erlaubt, erlaubt im Gegenzug die Untersuchung der genauen Konformation von wenigstens einem Gen innerhalb eines Chromosoms und die Messung von deren Abweichung vom Normalzustand nicht nur eine Klassifizierung der unterschiedlichen Arten von malignen Zellen, sondern gleichfalls eine Auswertung von deren Malignitätsindex und selbstverständlich gerade dadurch die Weiterbeobachtung einer therapeutischen Behandlung.
Es empfiehlt sich, zu wiederholen, dass man im Folgenden gegebenenfalls die Terminologie von „maligne„ oder „Malignitätsindex„ gleichfalls verwenden wird, um über Phänomene zu berichten, die nicht direkt mit Onkogenese in Verbindung stehen, die aber gleichfalls durch eine Desorganisation der Chromosome innerhalb des Kerns gekennzeichnet sind, beispielsweise die zystische Fibrose.
Dieses zweite Verfahren beruht auch hier wieder auf dem Nachweis der Tatsache, dass man, indem man die Konformation, d.h. zugleich die Position, aber gleichfalls, sofern erforderlich, die Struktur von einem oder mehreren Genen durch eine jegliche geeignete Technik, insbesondere durch Fluoreszenz-in si tu-Hybridisierung (FISH), auswertet, feststellt, dass je nach dem Malignitätsstatus der Zelle bestimmte Gene, die an der Tumorsuppression und/oder -aktivierung beteiligt sind, sich von dem Zentrum des Kerns in Richtung nach Außen verlagern und dass deren Abweichung vom Normalzustand einen guten Index für den Status der Zelle, welcher nachfolgend als „Malignitätsindex„ bezeichnet wird, darstellt, wobei dieser Index durch eine jegliche geeignete Methode zwischen einer normalen Zelle und einer Zelle, deren Malignität als irreversibel angesehen werden wird, ausgewertet werden kann.
Dieses Verfahren erlaubt eine Klassifizierung der Tumore abhängig von der Position der verschiedenen Gene im Kern und ebenso der dreidimensionalen Struktur dieser speziellen Gene im Kern.
Es wird erstmals möglich sein, die Position der Gene im Kern einfach zu untersuchen, indem die Position der Centromere von Chromosomen, die diese tragen, untersucht wird, Dieses Verfahren kann ausgeführt werden mit Hybridisierungssonden vom Centromer-Typ; in diesem Falle entspricht der Normalzustand einer peripheren Lokalisierung der Chromosome, welche die Centromersonden tragen, und insbesondere, wie nachfolgend erläutert werden wird, können diese Centromersonden den Chromosomen 13q und 16q entsprechen, welche Träger der Gene HUMSIAH und Rbr-2, welche auf dem Chromosom 16q colokalisiert sind, und des Gens Rb, welches auf dem Chromosom 13q lokalisiert ist, sind, wobei diese Gene an dem Phänomen der Krebssuppression beteiligt sind. Es versteht sich, dass die Centromersonden, die in den erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar sind, einem jeglichen anderen zellulären Chromosom entsprechen können, auf die gleiche Weise wie die Gen-Markierung gemäß den Verfahren der Erfindung einem oder mehreren Genen, die sich auf einem oder mehreren Chromosomen, die aus der Gesamtheit der Chromosome der Zelle ausgewählt werden, befinden, entsprechen kann.
Wie bereits angegeben, betrifft die Erfindung aber gleichfalls ein Verfahren, welches dazu bestimmt ist, den globalen Malignitätsstatus der Zellen eines Gewebes nach Fixierung nachzuweisen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man die exponierte nukleäre DNA markiert und man die Gesamtheit der DNA mit einem DNA-spezifischen Marker markiert, wobei diese beiden Marker in der Lage sind, nicht-verunreinigte spezifische Signale auszusenden.
Unter „nicht-verunreinigte spezifische Signale„ wird verstanden, dass es möglich ist, die den beiden Markern entsprechenden beiden Signale separat ohne bemerkenswerte Verunreinigung sichtbar zu machen.
Allgemein wird die exponierte nukleäre DNA durch die DNase I-Methode markiert, wie dies zuvor beschrieben worden ist, und die DNA wird durch den spezifischen Marker Chromomycin A-3 (CA-3) markiert.
Unter den Markern für die exponierte nukleäre DNA kann man insbesondere Tetramethylrhodamin, welches in Kombination mit Peroxidase eingesetzt wird, aufführen. Die Markierung mit Peroxidase kann durch eine jegliche geeignete Methode erfolgen, insbesondere Bindungspartner-Kombinationen vom Typ Avidin oder Streptavidin/Biotin oder DIG/antiDIG (DIG für Digoxigenin).
Tatsächlich erlaubt des Substrat der Peroxidase, welches als Tyramid-TRITC bezeichnet wird, das erhaltene Signal um einen Faktor 15 zu amplifizieren und erlaubt so, eine Feinverteilung des Signals im Inneren des Kerns zu analysieren.
Der Vorteil, einen DNA-spezifischen Marker zu verwenden, besteht darin, dass er erlaubt, den Zellzyklus auf halbautomatische Weise zu analysieren, folglich eine Korrelation zwischen der Exposition des Genoms, welche dank der DNase I-Methode ermittelt wird, und den Phasen des Zellzyklus vorzunehmen.
So betrifft die Erfindung gleichfalls ein erfindungsgemäßes Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Position der exponierten nukleären DNA bezogen auf die Phase des Zellzyklus, nachgewiesen durch den DNA-spezifischen Marker, als Index für den Malignitätsstatus der Gewebezellen auswertet.
Außerdem haben die beiden so eingesetzten Fluorochrome eine Emission in dem gleichen Bereich des sichtbaren Spektrums, d.h. 600 nm, aber ihre spezifische Anregung ist sehr unterschiedlich, 467 nm für CA-3 und 514 nm für TRITC, ebenso wie die Extinktionskoeffizienten, was erlaubt, ohne irgendeine Verunreinigung zwischen den beiden Markern spezifische Signale zu erhalten. Außerdem kann dank dieser Marker die Analyse mit einem einzigen Argon-Laser, der der im Bereich der Mikroskopie am weitesten verbreitete Laser ist, erfolgen.
Dieses erfindungsgemäße Verfahren erlaubt, gemäß Routinemethoden in Formol fixierte Gewebe einzusetzen und erlaubt so eine Analyse von Geweben, die beispielsweise aus einer Gewebesammlung stammen.
Allgemein erlauben die so beschriebenen Verfahren, den Bösartigkeitsstatus ausgehend von Geweben und/oder von Zellkulturen zu diagnostizieren, und erlauben dank der ermittelten Klassifizierung einen Prognosefaktor im Rahmen der diagnostischen Pathologie.
Sie erlauben insbesondere, beispielsweise zwischen einfachen Hyperplasien (Brust, Prostata), die gutartige Pathologien sind, atypischen Hyperplasien (Brust, Prostata) mit schwierig zu ermittelnder variabler Entwicklung, und die als „Borderline„ bekannte Pathologien bilden, die man aber im vorliegenden Falle dank der unterschiedlichen Markierungselemente, die erwähnt worden sind, leichter klassifizieren könnte, und dem Karzinom in situ zu unterscheiden.
Diese Verfahren erlauben gleichfalls die schnelle Bereitstellung von Modellen, welche erlauben, Antikrebs-Erzeugnisse zu testen, und insbesondere indem deren Wirkung auf die Reorganisation von bestimmten spezifischen Chromosomen untersucht wird, eine feinere Klassifizierung der Aktivität der verschiedenen fraglichen Mittel.
Um die Antikrebs-Erzeugnisse oder verwandten Erzeugnisse zu testen, führt man bevorzugt die zuvor beschriebenen Verfahren, in welchen man den Status einer malignen Zelle nachweist, aus, dann behandelt man die Zelle mit einem Antikrebs-Erzeugnis oder verwandten Erzeugnis und man wertet die Aktivität der Verbindung aus, indem man die Variation des Malignitätsindexes misst.
Die Erfindung umfasst die Antikrebs-Erzeugnisse oder verwandten Erzeugnisse, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie durch ein erfindungsgemäßes Verfahren ausgewählt worden sind.
Mit verwandten Erzeugnissen sollen die Produkte bezeichnet werden, welche bei Pathologien wirksam sind, die nicht direkt mit Onkogenese in Verbindung stehen, und solche, wie zuvor definiert.
Selbstverständlich erlauben diese Verfahren eben deshalb im Behandlungsfalle eine therapeutische Weiterbeobachtung.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Zellen, welche eine Desorganisation auf der Ebene des Kerns aufweisen, und die Anwendung dieses Verfahrens bei der Behandlung von bestimmten Pathologien, insbesondere tumorartigen Pathologien.
Die Erfindung beruht tatsächlich auf dem Nachweis der Reorganisationseigenschaften des Kerns verbunden mit dem Gen p21WAF1.
Die Assoziation von p21WAF1 mit dem p53-Signal, seine Rolle als Inhibitor der Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) und bei der Kontrolle der Chromosomen-Endoreplikation weisen darauf hin, dass dieses Gen eine Hauptrolle bei der Kontrolle der Zellvermehrung spielt.
Es ist jetzt nachgewiesen worden, dass die erneute Expression von p21WAF1 in einem Modell zu einer Suppression des Tumors führte.
Aus diesem Grunde betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Zellen, welche eine Desorganisation des Kerns aufweisen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Expression des Produkts des Gens p21WAF1 oder eines äquivalenten Produkts hervorruft oder man ebensogut das Produkt des Gens oder das äquivalente Produkt einführt.
Das Gen p21WAF1 ist bekannt und ist bereits wiederholt beschrieben worden; für seine Charakterisierung, seine Isolierung oder bestimmte von seinen Eigenschaften kann man sich auf die nachfolgenden Dokumente und auf deren Referenzen beziehen:

• Weinberg R. A. Science 254, 1138-1146 (1992)
• Telerman A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8702-8706 (1993)
• Amson R.B. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3953-3957 (1996)
• Nemani M. et al. Proc. Natl. Acad, Sci. USA 93, 9039-9042 (1996)
• El-Deiry W. S. et al. Cell 75, 817-825 (1993)
• Harper J. W., Adami G. R., Wei N., Keyomarsi K. & Elledge S J. Cell 75, 805-816 (1993).
• Waga S., Hannon G. J., Beach D. & Stillman B. Nature 369, 574-578 (1994)
• Yang Z. Y., Perkins N. D., Ohno T., Nabel E. G. & Nabel G. J Nature Medicine I, 1052-1056 (1995).
• Xiong Y. et al., Nature 366, 701-704 (1993)
• Waldman T., Lengauer C., K. W., K. & Vogelstein B. Nature 381, 713-716 (1996).

Wie nachfolgend erläutert werden wird, kann die Desorganisation des Kerns auf einen Tumor zurückzuführen sein, aber es kann sich um Desorganisationen anderer Art handeln. Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung von Zellen, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass die Desorganisation des Kerns auf ein Tumor-Phänomen oder ein Nicht-Tumor-Phänomen zurückzuführen ist, bilden gleichfalls einen Teil der Erfindung.
Unter „Desorganisation des Kerns„ versteht man einen Kern, in welchem das genetische Material, insbesondere die Chromosomen, einen Platz einnimmt, welcher verschieden ist von jenem, den es im normalen Zustand im Kern der Zelle einnimmt; eine Desorganisation, die insbesondere durch die zuvor beschriebenen Verfahren nachgewiesen werden kann.
Obgleich das Phänomen einer Desorganisation des Kerns insbesondere bei Tumor-Phänomenen nachgewiesen worden ist, kann diese Desorganisation gleichfalls bei anderen nicht-tumorartigen Phänomenen, wie der zystischen Fibrose (CFTR), auftreten.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt so entweder durch erneute Induktion der Expression des p21WAF1 entsprechenden Gens oder durch Verwendung von einem Produkt des Gens oder eines äquivalenten Produkts, d.h. mit der gleichen Reorganisationsaktivität wie das Produkt des Gens p21WAF1, das genetische Material des Kerns zu reorganisieren.
Selbstverständlich kann die Induktion der Expression des Gens durch eine Blockierung der Repression eben dieses Gens oder eines Expressionsprodukts ersetzt werden.
Die Expression des Gens p21WAF1 oder eines äquivalenten Produkts kann durch ein jegliches bekanntes Verfahren bewirkt werden; in den Beispielen wird insbesondere ein Expressionsvektor viralen Ursprungs eingesetzt, in welchen das entsprechende Gen unter der Kontrolle eines Promotors, der in den Zellen exprimiert wird, eingeführt worden ist; diese Einführung, unabhängig davon, ob der Vektor nicht-chromosomal bleibt oder ob er sich in die Chromosomen integriert, führt zu der Expression des Produkts von p21WAF1 und zu der Verringerung der Malignität der Zellen. Unter den viralen Vektoren kann man insbesondere die adenoviralen Vektoren, retroviralen Vektoren, Herpes-Virus-Vektoren oder ebenso Systeme vom synthetischen Typ oder ebenso nackte DNAs aufführen.
Obgleich man das Gen p21WAF1 in seiner Gänze exprimieren könnte, können bestimmte verkürzte, Deletionen aufweisende oder mutierte Versionen äquivalente Eigenschaften aufweisen und gehören folglich gleichfalls zu dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Selbstverständlich kann man die Produkte des Gens p21WAF1 einsetzen, die beispielsweise durch Zellkultur erhalten werden, ebenso wie Kulturen, die, wie zuvor gesagt wurde, äquivalente Produkte produzieren.
Es ist gleichfalls möglich, eine in situ erfolgende Reaktivierung des natürlichen Promotors von p21WAF1 oder ebenso die Blockierung der Repressionssysteme von dessen Expression in situ ins Auge zu fassen.
Allgemein betrifft die Erfindung die Verwendung des Expressionsprodukts des Gens p21WAF1 oder eines äquivalenten Produkts oder ebenso einer Verbindung, welche die Expression des Produkts sicherstellt, für die Herstellung eines Arzneimittels, welches dazu bestimmt ist, die Reorganisation des Zellkerns der Zellen bei Krebsprozessen oder nicht-krebsartigen Prozessen mit einer Desorganisation des Kerns sicherzustellen, wie auch eine therapeutische Zusammensetzung, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie als Wirkstoff das Expressionsprodukt des Gens p21WAF1 oder ein äquivalentes Produkt oder ebenso eine Verbindung, welche die Expression des Produkts sicherstellt, umfasst.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden beim Lesen der nachfolgenden Beispiele, die unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren, deren Legenden nachfolgend beschrieben werden, beschrieben werden, ersichtlich werden:
1:
Die 1 stellt die unterschiedliche Expression von mRNAs in den transfizierten U937-Vergleichszellen (pRSV) und transfizierten U937-Zellen, die p21WAF1 exprimieren (pRSV-p21), dar. Die Northern-Blot-Analyse zeigt die Aktivierung von p21WAF1, HUMSIAH, Rb und Rbr-2 in den durch pRSV-p21 transfizierten Zellen verglichen mit den durch den Vektor allein transfizierten pRSV-Vergleichszellen. GAPDH wird als Kontrollsonde eingesetzt.
2: Tumorigenität der mit dem Vektor allein transfizierten pRSV-U937-Vergleichszellen verglichen mit den transfizierten pRSV-p21-Zellen.
Die Tumorigenität wird nach subkutaner Injektion von 10⁷ Zellen in scid/scid-Mäuse ausgewertet.
3: Repositionierung des Chromosoms 16 in den transfizierten p21WAF1-U937-Zellen.

und b) Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung einer alphoiden Centromersonde von Chromosom 16: die zwei oder drei Punkte (normalerweise in rot), welche im Inneren des Kerns (normalerweise in blau) auftreten, repräsentieren die Fluoreszenzsignale, welche der markierten Centromersonde entsprechen. a) entspricht den Kernen von transfizierten U937-Vergleichszellen (pRSV) und b) entspricht den Kernen von transfizierten p21WAF1-U937-Zellen (p21-WAF1). Der Kern der transfizierten U937-Vergleichszellen und die transfizierten p21-WAF1-Zellen sind mit DAPI (blau) markiert. Das FISH-Signal wird durch Tyramid-TRITC (rot) sichtbar gemacht. Unter Berücksichtigung einer Trisomie 16 der Probe sind hier drei Flecken sichtbar.
c) Vergrößerung einer transfizierten p21WAF1-U937-Zelle (p21-WAF1) mit dem Bild des Codeabstands des Kerns.
d) Darstellung der aufeinanderfolgenden Schichten mit der Größe eines Pixels, klassifiziert durch deren Abstand zu dem Rand des Kerns.
e): Rekonstruktion eines Kernvolumens ausgehend von einem zweidimensionalen Bild. Die Kugel (R: Radius) wurde in einen Satz von Zylindern (Radius: r_i, Höhe: h_i, Dicke: ΔR) zerschnitten.
f): die periphere Verteilung wurde durch stochastische (zufällige) Verteilung in einem Ring mit einer Dicke von 2/10 R modellartig nachempfunden.
g): Die modellartige Nachbildung der Verteilung eines Signals in Ringen von unterschiedlichen Dicken je nach dem Abstand zu dem Kernrand.

4: Histogramm der Verteilung der Signale, wie ausgehend von dem äußersten Rand des Kerns gemessen.
Vergleich zwischen den transfizierten pRSV-U937-Vergleichszellen (:) und den transfizierten pRSV-p21-U937-Zellen (?).
a: Verteilung von zufälligen Punkten in einer Kugel.
b-f: Verteilung von FISH-Signalen, wie ausgehend von dem Rand des Kerns für das Chromosom 16 (b), die Chromosomen 13/21 (c), das Chromosom 17 (d), das Gen p53 (e) bzw. das Gen Rb (f) gemessen.
BEISPIEL 1:
Transfektion
Die vollständige cDNA, welche das humane p21WAF1-Gen kodiert, wurde in die EcoRI-Stelle des Phagemids pBK-RSV (Stratagene) kloniert. Es wurde eine Transfektion mit den Konstrukten unter Verwendung des Reagens Lipofectin (Gibco-BRL) ausgeführt. 3,5 × 10⁶ Zellen werden 8 Stunden mit einem Lipofectin (30 μg)-DNA (20 μg)-Komplex inkubiert.
Analyse durch Northern-Blot
Die Extraktion von mRNA und die Northern-Blot-Analysen erfolgten unter Verwendung der Standardprozedur, die Sonde p21WAF1 entspricht einer cDNA von 2,1 kb. Für HUMSIAH wird ein cDNA-Fragment von 1,4 kb eingesetzt, die Sonde Rb1 ist HP126 (Medgene) und die Sonde Rbr-2 ist ein PCR-Fragment von 393 bp, erhalten mittels der folgenden Primer:
5'-TGGGACAGCTACCGCAGGATGAGCGA-3'
und 5'-CACAGTACAGGGCTGTCGCCGCTGTT-3'.
Analyse der Tumorigenität
Die Injektion in die scid/scid-Mäuse erfolgte, wie zuvor beschrieben (Telerman et al., 1993). Pro Stelle werden 10⁷-Zellen injiziert. Die Tiere werden drei Monate lang verfolgt. Der Mann-Whitney-Test wurde für die statistische Analyse eingesetzt.
Exposition des Genoms gegenüber DNase I.
Der Test der Exposition des Genoms gegenüber DNase I wurde bezogen auf jenen, der von Puck beschrieben worden ist (Puck et al., 1991), modifiziert. Die Zellen werden in 4% Paraformaldehyd/PBS fixiert (PBS: Phosphat-Kochsalz-Puffer), dehydratisiert und bei –80°C aufbewahrt. Die Nick-Translation in situ (NT) wurde ausgeführt unter Verwendung von 30 E (Einheiten; U) DNase I (Boehringer Mannheim, Deutschland) in einem NT-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM MgCl₂, 10 mM β-Mercaptoethanol, 50 ng/ml BSA (Rinderserumalbumin)) bei Umgebungstemperatur und 40 E DNA-Polymerase I (Boehringer Mannheim, Deutschland), 100 mM markierter dNTP-Digoxigenin-Mischung (Boehringer Mannheim, Deutschland). Die in situ reparierte DNA wurde sichtbar gemacht unter Verwendung von mit Peroxidase konjugierten anti-Digoxigenin-Antikörpern (Boehringer Mannheim, Deutschland) und Tyramid-TRITC (Du Pont NEN, Vereinigte Staaten) als Substrat. Die Schnitte wurden mit Chromomycin A3 (Sigma, Vereinigte Staaten) markiert. Die Analyse erfolgte durch Lasermikroskopie mit konfokaler Abtastung (MRC 600 Bio-Rad, Großbritannien) im Fluoreszenz-Modus.
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH)
Die FISH wurde ausgeführt, wie zuvor von Linares-Cruz et al. (Linares-Cruz et al., 1995, Histochemical Journal, 27, 15-23) beschrieben. Es wurden die folgenden Sonden eingesetzt (ONCOR, Vereinigte Staaten): eine alphoide Centromersonde, welche dem Chromosom 16 entspricht (D16Z2), eine alphoide Centromersonde, welche dem Chromosom 17 entspricht (D17Z1) und alphoide Centromersonden, welche den Chromosomen 13/21 (D13Z1/D21Z1), den Genen p53 und Rb entsprechen. Die Analyse wurde durch Epifluoreszenzmikroskopie (mit einer gekühlten 3CCD-Kamera, ausgerüstet mit einer dreifachen Übertragungsbandbreite, Lhesa Frankreich) unter Verwendung von Linsen mit geringer numerischer Apertur (N. A.) (40x, N. A. 0,75), digitalisiert in einer Matrix von 768 × 512 Pixeln, ausgeführt. Jeder Pixel entspricht 55 × 55 nm des Objekts.
Die Bildanalyse.
Die Abstandsmessungen erfolgten unter Verwendung eines Bildanalysesystems SAMBA IPS (UNILOG, Frankreich). Die Marker wurden durch „top hat„-Transformation extrahiert und die Kerne wurden nach dem Schwellenwert ausgehend von dem DAPI-Fluoreszenzbild fraktioniert. Es wurden für die Marker bzw. für die Kerne zwei binäre Bilder erhalten. Die sukzessive Erosion wurde eingesetzt, um den Abstand zwischen den Markern und dem Rand des Kerns zu messen. Die Positionen der Marker wurden durch die Überschneidung von deren Bild mit dem Abstand bestimmt. Diese Methode erlaubt, die Gesamtheit der Kerne unabhängig von ihrer Form zu analysieren. Um die Kerngrößenunterschiede zu kompensieren, wurden die Abstände systematisch normalisiert, indem jeder Abstandswert durch den Radius des entsprechenden Kerns dividiert wurde.
Modell der Verteilung der Abstände
Die Modellkurven, die für den Vergleich der experimentell erhaltenen Abstände eingesetzt wurden, wurden durch stereologische Simulation erstellt. Die dreidimensionale Darstellung der Kerne wird an ein kugelförmiges Modell, welches aus einem Satz von Zylindern gebildet wird, angepasst. Das Volumen eines elementaren Zylinders (v_i) ist mit der Wahrscheinlichkeit (P_i) des Vorhandenseins der Marker korreliert durch: P_i = v_i/ Σ v_i. Wenn R der Radius des Kerns, r_i der Radius des Zylinders, ΔR die Dicke des Zylinders und h_i seine Höhe ist: v_i = Π Δ R (2 r_i – ΔR) h_i.
Diese Gleichung erlaubt, die Zufallsverteilung in einer Kugel und die periphere Verteilung in den Ringen von unterschiedlicher Dicke aufzuzeichnen. Bei diesem Modell ist die erhaltene Funktion unabhängig von der elliptischen Form des Kerns. Es werden die FISH-Signale, angepasst an eine Brennpunktregelung (äquatoriale Ebene), analysiert. Pro Fall wurden mehr als 100 Kerne ausgewertet.
Statistische Analyse.
Der Radius des Kerns wird in acht Klassen unterteilt. Jeder zwischen dem Kernrand und den FISH-Signalen gemessene Abstand wurde in eine dieser acht Klassen eingestuft. Der X²-Test wurde eingesetzt, um beide Hypothesen zu bestätigen. Erstens, dass die in den p21WAF1-U937-Zellen gemessenen Abstände auf ähnliche Weise wie jene, die in den mit allein dem Vektor transfizierten U937-Zellen gemessen worden sind, verteilt sind. Zweitens, dass die in den beiden Zelllinien gemessenen Abstände auf ähnliche Weise verteilt sind wie zufällige Punkte in einer Kugel. Es wird angenommen, dass P < 0, 001 einen signifikanten Unterschied angibt.
Erneute Expression von p21WAF1 in einem Modellsystem
Die transformierten Zellen sind die Zellen einer Tumorzelllinie U937, einer zugleich in vitro wie in vivo tumorigenen Linie, die sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Proteinebene praktisch kein p21WAF1 exprimiert (Telerman et al., 1993, und Nemani et al. 1996).
Es wurde beobachtet, dass die von der Tumorzelllinie U937 abgeleiteten US3-US4-Tochterzellen, welche mittels des Parvovirus H-1 selektioniert wurden, eine Suppression des tumoralen Phänotyps aufweisen. Es ist beispielsweise gezeigt worden, dass die U937-Zellen Tumore im Bereich von 80% der Injektionsstellen in scid/scid-Mäusen bilden, wohingegen die US3-Zellen keinerlei Tumor bilden, und dass die U54-Zellen einen Tumor pro 20 Injektionsstellen bilden. Diese US3- und US4-Zellen exprimieren im Gegenzug konstitutiv sehr hohe Niveaus von p21WAF1 unabhängig vom p53-Weg.
Aus diesem Grunde haben diese Beobachtungen dazu geführt, die Wirkung von p21WAF1 auf die spezifische Genexpression und die Tumorsuppression von U937-Zellen, die stabil durch p21WAF1 transfiziert sind, zu untersuchen.
Induktion der spezifischen Genexpression durch p21WAF1 und Suppression der Tumorigenität
Nach Transfektion der U937-Zellen mit den vorangegangenen Vektoren stellt man nach Northern-Blot-Analyse fest (siehe 1), dass die U937-Zellen, die durch p21WAF1 transfiziert sind (pRSV-p21), einen sehr hohen mRNA-Spiegel, welcher der Expression des Gens p21WAF1 des humanen Homologs des Drosophila-Gens „seven in absentia„ (HUMSIAH) entspricht, aufweisen. Dieses Gen (welches ferner als TSAP 3, „Tumor Suppressor Activated Pathway 3„ (Tumorsuppressor-aktivierter Weg 3), bezeichnet wird) wird durch das p53-Wildtyp-Protein in einem sehr frühen Stadium der Apoptose und der Tumorsuppression aktiviert (Nemani et al., 1996, und Amson et al., 1996). Außerdem sind das Retinoblastom-Suszeptibilitätsgen Rb (Weinberg et al., 1992) und das p130 in Verbindung mit Rb kodierende Gen (Rbr-2) (Hannon et al., 1993, Genes and Development, 7, 2378-2391) gleichfalls bei den p21-Transfektanten der U937-Zellen sehr stark aktiviert (siehe 1). Die Expression des Gens p53 bleibt auf mRNA- und Proteinebene zugleich im Vergleichssystem wie in den transfizierten Zellen nicht nachweisbar (Ergebnisse nicht gezeigt). Die Expression des Rb-Gens entfaltet seine Tumorsuppressoreigenschaften ebenso wie für das Gen Rbr-2 aufgrund seiner Beteiligung am Zellzyklus und der chromosomalen Lokalisation von HUMSIAH. Indessen hat die Analyse des Zellzyklus durch FACS (Analyse durch Durchflusszytometrie) in drei unabhängigen Experimenten (unter Verwendung von Propidiumiodid) keinen signifikanten Unterschied zwischen den transfizierten U937-Vergleichszellen und den U937-p21-WAF1-Zellen enthüllt (Beispiel der erhaltenen Ergebnisse: i) transfizierte U937-Vergleichszellen: in G₁ 65%/S 29%/G₂ 6%; ii) U937-p21-WAF1-Zellen: G₁ 64%/S 30% /G₂ 6%).
Die Verdopplungszeit ist bei den beiden Linien ebenfalls ähnlich, 33 h für die transfizierten U937-Vergleichszellen bzw. 36 h für die U937-p21-WAF1-Zellen.
Die Injektion in Scid/Scid-Mäuse erfolgt, wie dies zuvor beschrieben worden ist. Der Vergleich erfolgt mit Zellen, die durch den Vektor allein (pRSV) transfiziert worden sind. GAPDH wird als Kontrolle eingesetzt. Nach Transfektion der U937-Zellen mit den vorangegangenen Vektoren stellt man fest, dass die stabil durch p21WAFl (pRSV-p21) transfizierten U937-Zellen ein signifikantes Verschwinden des bösartigen Phänotyps zeigen (siehe 2). Nach 24 Tagen weisen die scid/scid-Mäuse, denen U937-Zellen, welche den Vektor allein enthalten, injiziert worden sind, Tumore im Bereich von allen Stellen und mit einem solchen Volumen, dass sie getötet werden mussten, auf. Im Gegensatz dazu haben nur 9 Stellen von 20 Injektionsstellen von transfizierten p21WAF1-U937-Zellen Tumore gebildet, die offensichtlich retardiert waren, und mit einem viel geringeren Volumen. Nach 6 weiteren Wochen Beobachtung ist kein weiterer Tumor aufgetreten. So ist die spezifische Induktion der Expression des Gens p21-WAF1 ohne bedeutende Variation des Zellzyklus teilweise verantwortlich für die Aktivierung des molekularen Prozesses der Tumorsuppression.
BEISPIEL 2
DNase I-Methode – Einfluss von p21WAF1 auf die Reorganisation des Kerns
Dieses Beispiel hat zum Gegenstand, die Rolle von p21WAF1 bei einer möglichen Reorganisation des Kerns zu untersuchen.
Das Verfahren, welches für diesen Nachweis der Tatsache, dass die Position der Chromosome im Kern einen Einfluss auf den zellulären Phänotyp haben könnte, eingesetzt wurde, ist das sogenannte DNase I-Verfahren, welches erlaubt, die exponierte DNA sichtbar zu machen, d.h. Chromosomenabschnitte, die unter bestimmten Bedingungen empfindlicher gegenüber der DNase I sind, was erlaubt, diese zu markieren.
Dafür wurde auf die DNase I-Methode, wie sie in dem Patent US 5,264,343 beschrieben worden ist, zurückgegriffen, aber derart, dass man sie auf Gewebe anwenden kann.
Die Gewebe werden in einer Mischung von 4% Paraformaldehyd in PBS 10 min fixiert, dehydratisiert und bei –80°C aufbewahrt.
Die Markierung durch „Nick-Translation„ erfolgt unter Verwendung eines „Nick-Translations„-Puffers (NTB) und einer 10x Lösung (100 ml).
NTB umfasst 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, mMgCl₂, 10 mM β-Mercaptoethanol und 50 ng/ml BSA. Die 10x Lösung (100 ml) enthält 50 ml Tris-HCl, pH 8 (1 M), 3,3 ml MgCl₂ (1,5 M), 700 ml β-Mercaptoethanol (14,2 M) und 1,66 μl BSA (3%-ig).
Man behandelt die Gewebe mit 100 μl NTB, enthaltend 30 E DNase I, für jeden Schnitt. Man inkubiert 3 min bei Umgebungstemperatur, man blockiert mit 20 mM EDTA, pH 8, während 3 min, dann wäscht man dreimal mit NTB.
Man setzt dann 100 μl NTB mit 40 E DNA-Polymerase I und 100 μM dNTP-Digoxigenin (10% der 10x Lösung für jeden Schnitt) ein. Man inkubiert 6 min bei Umgebungstemperatur und man blockiert mit EDTA wie zuvor, man wäscht dreimal mit NTB.
Die Markierung erfolgt nach Sättigung mit 3% BSA, Sichtbarmachung mit anti-DIG-Antikörpern, die mit Peroxidase markiert sind, nach dreimaligem dreiminütigem Waschen mit PBS; man setzt als Substrat Thyramid-TRITC ein, dann wäscht man dreimal während 3 min mit PBS.
Die Platten werden dann mit Chromomycin 3-A gegengefärbt.
Die Analyse erfolgt durch konfokale Lasermikroskopie (MRC 600 Bio-Rad) im Fluoreszenz-Modus (die Ergebnisse sind auf Farbphotographien, die in die vorliegende Beschreibung nicht aufgenommen worden sind, dargestellt).
Die U937-Ausgangskrebszellen oder die gleichen Zellen, die mit dem Kontrollvektor transfiziert worden sind, weisen ein diffuses Erscheinungsbild, wie es bei Biopsien von Mammakarzinomen beobachtet wird, auf. Die mit p21WAF1 transfizierten U937-Zellen zeigen bei der Exposition des Genoms gegenüber der DNase I eine radikale Veränderung, indem sie ein ähnliches Erscheinungsbild wie jenes der US3-US4-Zellen, die eine Suppression des Tumor-Phänotyps aufweisen, zeigen, ebenso wie sie ein Erscheinungsbild zeigen, welches jenem von Epithelzellen, die auf Biopsien von normalen Brüsten beobachtet worden sind, entspricht, d.h. eine Markierung entlang eines Rings an der Peripherie des Kerns.
Diese Reorganisation des Kerns kann mit der Aktivierung von Genen bei der Suppression der Tumorigenität assoziiert werden. Diese Reorganisation des Kerns, die durch p21-WAF1 induziert wird, könnte entweder eine direkte Auswirkung dieser Induktion sein oder mit dessen Funktion als Inhibitor der cdk („Cyclin dependent kinase„)-Aktivität verbunden sein. Die Gruppe von nukleären Laminen (Foisnier et al., 1993, Cell, 73, 1267-1279) ist eines der Ziele, die hinsichtlich der mitotischen cdk-Aktivität charakterisiert worden sind. Die nukleären Modifikationen können aus einer Veränderung des Phosphorylierungszustands dieser nukleären Lamine resultieren. Diese bedeutende Veränderung der Verteilung der gegenüber DNase I empfindlichen Stellen könnte folglich als Ursprung die Auslösung der Bewegungen von Chromosomen im Inneren des Kerns, welche durch p21-WAF1 induziert werden, haben.
BEISPIEL 3
In situ-Markierung
Man führt eine in situ-Hybridisierung der DNA mit einer alphoiden Centromersonde 16 aus, wie dies zuvor beschrieben worden ist (Klinger, K., et al., Am. J. Hum. Genet. 51, 55-65 (1992)).
Da HUMSIAH und Rbr-2 auf dem Chromosom 16q colokalisiert sind, wohingegen Rb auf dem Chromosom 13q lokalisiert ist, setzt man entsprechende Sonden ein. Unter Verwendung der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), kombiniert mit digitaler optischer Mikroskopie, mit diesen alphoiden Centromersonden, welche dem Chromosom 16 entsprechen, kann man auf den erhaltenen Farbphotographien (in der vorliegenden Beschreibung in Schwarz-Weiß) (siehe 3, a) – d)) beobachten, dass die U937-Zellen ein Hybridisierungssignal nahe des Zentrums des Kerns zeigen. Im Gegenzug zeigen die durch p21WAF1 transfizierten U937-Zellen oder die US3-US4-Zellen, die eine Tumorsuppression aufweisen, ein Signal, welches in der peripheren Region des Kerns detektiert wird. Der Kern der transfizierten U937-Vergleichszellen und die transfizierten p21-WAF1-Zellen werden mit DAPI markiert (blau). Das FISH-Signal wird durch Tyramid-TRITC (rot) sichtbar gemacht. Aus physiologischer Sicht bestätigen diese Beobachtungen die Gewissheit einer territorialen Chromosomenorganisation in der Interphase. Die genaue topologische Konformation des Gens im Kern weist eine evidente funktionelle Rückwirkung auf. Insbesondere könnte diese Reorganisation des Kerns für die Aktivierung der an der Suppression von Tumoren beteiligten Gene, welche bei Tumorprozessen still sind, verantwortlich sein.
Für jede eingesetzte Sonde wurde der Abstand ausgehend von dem Rand des Kerns gemessen und in ein Modell integriert (siehe 3, e) – g)).
Es ist festgestellt worden, dass die transfizierten p21-WAF1-U937-Zellen eine globale Umverteilung der Signale mit einer deutlichen Verlagerung in Richtung der peripheren Region des Kerns aufweisen (siehe 4). Die Verteilung dieser FISH-Signale, welche den Centromersonden entsprechen, ist zwischen den Tumorzellen und jenen, die eine Tumorsuppression aufweisen, statistisch unterschiedlich. Der X²-Test ist sehr signifikant (p < 0,001). Unter Verwendung der für die Gene Rb und p53 spezifischen Sonden haben wir keinen statistischen signifikanten Unterschied bei der Verteilung zwischen den FISH-Signalen, welche den mit dem Vektor pRSV allein und mit p21-WAF1 transfizierten Zellen entsprechen, beobachtet (unter Verwendung des X²-Tests) (siehe 4). Aus physiologischer Sicht ergänzen diese Beobachtungen Beobachtungen, die stark die territoriale chromosomale Organisation in der Interphase nahe legen (Manuelidis et al., 1990, Science, 250, 1533-1540; Cremer et al., 1993, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, LVIII, 777-792, und Puck et al., 1991)). Spezielle Domänen des Chromatins nehmen deutlich und nicht zufällig räumliche Positionen, wie zuvor beschrieben (Hulspas et al., 1994, Chromosoma, 103, 286-292; Nagele et al., 1995, Science, 270, 1831-1835), ein. Es ist nicht sicher, ob eine Korrelation zwischen der Expression des Gens und der Repositionierung des Chromosoms existiert; dies bleibt zu ermitteln in dem Maße, wie bestimmte Ergebnisse zugleich aktive und in aktive Gene, die präferentiell in den peripheren Gebieten der Chromosomen lokalisiert sind, anzeigen. Unsere Untersuchung zeigt, dass in dem Falle einer Suppression der Tumorigenität, welche durch p21-WAF1 induziert wird, die Centromerregionen, welche kein kodierendes genetisches Material enthalten, repositioniert sind. Diese Repositionierung der Centromerregionen von Chromosomen, die oben analysiert worden ist, kann die Ursache für einen Mechanismus, durch welchen die Architektur des chromosomalen Territoriums modifiziert wird, sein. Solche territorialen Modifikationen können die räumliche Umgebung eines spezifischen Gens beeinflussen und deren Expression modulieren. Evident müsste die genaue topologische Konformation der Gene im Inneren des Kerns funktionelle Rückwirkungen haben. Tatsächlich haben neuere Arbeiten, welche die Diversität der Positionseffekte bei Drosophila beschreiben, klar die funktionale Bedeutung der spezifischen nukleären Architektur bei der Expression von Genen nachgewiesen (Csink et al., 1996, Nature, 381, 529-531; Dernburg et al., 1996, 85, 745-749).
Als Schlussfolgerung zeigen die nachfolgend aufgeführten Ergebnisse unter gleichzeitiger Verwendung der Modellsysteme für eine Analyse der Suppression der Tumorigenität und die stabile Transfektion,, dass p21-WAF1q die Repositionierung des genetischen Materials im Kern, verbunden mit potentiell bedeutenden Funktionen, um eine Tumorsuppression zu erzielen, induziert. Diese Ergebnisse zeigen die zentrale Rolle, die durch p21WAF1 bei der Organisation des Kerns, bei der Positionierung der Chromosomen und bei der Aktivierung des Prozesses der Suppression der Tumorigenität gespielt wird.

Claims

Verfahren, welches dazu bestimmt ist, den Status einer malignen Zelle nachzuweisen, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) die Position von einem oder mehreren Genen in dem Kern auszuwerten, indem die Position der Centromeren von Chromosomen, die diese tragen, durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung unter Verwendung von Centromersonden ausgewertet wird b) die Abweichung von dieser Position bezogen auf eine normale Zelle als Index für deren Malignität auszuwerten, bei welcher eine periphere Lokalisierung der Chromosomen, die diese Centromersonden tragen, der Normalität entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Chromosom das Chromosom 13q und/oder 16q ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Status einer malignen Zelle nachweist, man die Zelle dann mit einem Antikrebs-Erzeugnis oder verwandten Erzeugnis behandelt und man die Aktivität der Verbindungen auswertet, indem die Variation des Malignitätsindexes gemessen wird.