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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Zytogenetik
und im besonderen auf das Gebiet der molekularen Zytogenetik. Die
Erfindung betrifft Verfahren zum Färben von chromosomaler Ziel-DNA, um
eine chromosomale Amplifikation oder Deletion nachzuweisen, und
Kits dafür.
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Obwohl
hier die meisten Beispiele menschliche Chromosomen betreffen und
ein Großteil
der Terminologie auf humane Bezüge
gerichtet ist, ist das Konzept der Verwendung von Nukleinsäuresonden
zum Färben
oder Anfärben
von Chromosomen auf Chromosomen jeder Herkunft, was sowohl Pflanzen
als auch Tiere einschließt,
anwendbar.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Chromosomenanomalien
sind mit genetischen Störungen,
degenerativen Erkrankungen und der Einwirkung von Mitteln, von denen
bekannt ist, dass sie degenerative Erkrankungen, insbesondere Krebs,
bewirken, assoziiert; German, "Studying
Human Chromosomes Today",
American Scientist, Bd. 58, S. 182-201 (1970); Yunis, "The Chromosomal Basis
of Human Neoplasia",
Science, Bd. 221, S.227-236 (1983); und German, "Clinical Implication of Chromosome Breakage", in Genetic Damage
in Man Caused by Environmental Agents, Berg, Hrsg., S. 65-86 (Academic
Press, New York, 1979). Chromosomenanomalien können unterschiedlichen Typs
sein und beinhalten unter anderem: zusätzliche oder fehlende einzelne
Chromosomen, zusätzliche
oder fehlende Teile eines Chromosoms (segmentale Duplikationen oder
Deletionen), Brüche,
Ringe und Chromosomenumordnungen. Chromosomale oder genetische Umordnungen
beinhalten Translokationen (Übertragung
eines Stücks
von einem Chromosom auf ein anderes Chromosom), dizentrische Chromosomen (Chromosome
mit zwei Zentromeren), Inversionen (Umkehrung der Polarität eines
Chromosomensegments), Insertionen, Amplifikationen und Deletionen.
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Nachweisbare
Chromosomenanomalien treten mit einer Häufigkeit von eins zu 250 menschlichen
Geburten auf. Anomalien, welche Deletionen oder Additionen von Chromosomenmaterial
beinhalten, verändern das
Gengleichgewicht eines Organismus und führen allgemein zum Tod des
Fetus oder zu schweren geistigen und körperlichen Defekten. Das Down-Syndrom
kann durch das Vorliegen von drei Kopien des Chromosoms 21 anstelle
der normalen zwei hervorgerufen werden. Dieses Syndrom ist ein Beispiel
für einen
Zustand, der durch eine anomale Chromosomenzahl oder Aneuploidie
hervorgerufen wird. Das Down-Syndrom kann auch durch eine segmentale
Duplikation einer Subregion auf Chromosom 21 (wie z.B. 21q22), welche
auf Chromosom 21 oder auf einem anderen Chromosom vorliegen kann,
hervorgerufen werden. Das Edward-Syndrom (18+), das Patau-Syndrom
(13+), das Turner-Syndrom
(XO) und das Kleinfelter-Syndrom (XXY) zählen zu den häufigsten
zahlenmäßigen Aberrationen.
[Epstein, The Consequences of Chromosome Imbalance: Principles, Mechanisms
and Models (Cambridge Univ. Press 1986); Jacobs, Am. J. Epidemiol,
105:180 (1977); und Lubs et al., Science, 169:495 (1970).]
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Retinoblastom
(del 13q14), Prader-Willi-Syndrom (del 15qII-q13), Wilms-Tumor (del
11p13) und Cri-du-chat-Syndrom (del 5p) sind Beispiele für wichtige,
mit Erkrankungen verbundene strukturelle Aberrationen. [Nora and
Fraser, Medical Genetics: Principles and Practice, (Lea and Febiger
1989).]
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Messungen
der Häufigkeit
von Chromosomen mit strukturellen Aberrationen, beispielsweise von
dizentrischen Chromosomen, welche durch erbsubstanzverändernde
Mittel, wie z.B. ionisierende Strahlung oder chemische Mutagene,
hervorgerufen sind, werden breit als quantitative Indikatoren der
durch solche Mittel verursachten genetischen Schädigung eingesetzt; Biochemical
Indicators of Radiation Injury in Man (International Atomic Energy
Agency, Vienna, 1971); und Berg, Hrsg. Genetic Damage in Man Caused
by Environmental Agents (Academic Press, New York, 1979). Eine große Zahl
potentiell karzinogener und teratogener Chemikalien ist aufgrund
industrieller und landwirtschaftlicher Tätigkeit in der Umwelt weit
verbreitet. Diese Chemikalien schließen Pestizide und eine Palette
industrieller Abfälle
und Nebenprodukte ein, wie z.B. halogenierte Kohlenwasserstoffe,
Vinylchlorid, Benzol, Ar sen und dergleichen; Kraybill et al., Hrsg.,
Environmental Cancer (Hemisphere Publishing Corporation, New York,
1977). Empfindliche Messungen von Chromosomenbrüchen und anderen Anomalien
könnten
die Grundlage für
verbesserte Methodologien der Dosimetrie und Risikoabschätzung zur
Evaluierung der Folgen der Einwirkung solcher berufs- und umweltbedingter
Mittel bilden.
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Die
gegenwärtigen
Verfahren für
genetisches Screening und biologische Dosimetrie beinhalten die Analyse
von Karyotypen. Ein Karyotyp ist der spezielle Chromosomenbestand
eines Individuums oder einer verwandten Gruppe von Individuen, definiert
durch die Zahl und Morphologie der Chromosomen, üblicherweise in der mitotischen
Metaphase. Er beinhaltet Dinge wie z.B. die Gesamtzahl der Chromosomen,
die Kopienzahl der einzelnen Chromosomentypen (z.B. die Zahl von
Kopien des Chromosoms X) und die chromosomale Morphologie, z.B.
gemessen als Länge,
Zentromerindex, Verbundensein oder dergleichen. Chromosomenanomalien
können
durch Untersuchung der Karyotypen nachgewiesen werden. Karyotypen
werden in konventioneller Weise durch Anfärben von Metaphasechromosomen
oder in anderer Weise (beispielsweise durch vorzeitige Chromosomenkondensation)
kondensierter Chromosomen eines Organismus bestimmt. Kondensierte Chromosomen
werden verwendet, da es bis vor kurzem nicht möglich war, Interphasechromosomen
sichtbar zu machen, was auf ihren dispersen Zustand und das Fehlen
sichtbarer Grenzen zwischen ihnen im Zellkern zurückzuführen ist.
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Mehrere,
auf chemischen Färbungen
beruhende zytologische Techniken sind entwickelt worden, welche
ein Längsmuster
auf kondensierten Chromosomen erzeugen, das allgemein als Banden
bezeichnet wird. Das Bandenmuster jedes Chromosoms in einem Organismus
erlaubt üblicherweise
die eindeutige Identifizierung jedes Chromosomentyps; Latt, "Optical Studies of
Metaphase Chromosome Organization", Annual Review of Biophysics and Bioengineering,
Bd. 5, S. 1-37 (1976). Der genaue Nachweis einiger wichtiger Chromosomenanomalien,
wie z.B. Translokationen und Inversionen, hat solche Bandenanalysen
erfordert.
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Unglücklicherweise
erfordert eine solche Bandenanalyse das Kultivieren von Zellen und
die Präparation
von Metaphasespreitungen hoher Qualität, was zeit- und arbeitsaufwendig
und häufig
schwierig oder undurchführbar
ist. Beispielsweise sind Zellen vieler Tumorarten schwierig zu kultivieren,
und es ist nicht klar, dass die kultivierten Zellen die ursprüngliche
Tumorzellpopulation repräsentieren.
Fetale Zellen, die kultiviert werden können, müssen mit invasiven Mitteln
gewonnen und über
mehrere Wochen kultiviert werden, um genügend Metaphasezellen für die Analyse
zu erhalten. In vielen Fällen
erlauben die Bandenmuster auf den anomalen Chromosomen keine eindeutige
Identifizierung der Teile der normalen Chromosomen, aus welchen
sie gebildet sind. Eine solche Identifizierung kann wichtig sein,
um die Lage wichtiger, von der Anomalie betroffener Gene anzuzeigen.
Außerdem
sind die Empfindlichkeit und Auflösungskraft der gegenwärtigen Verfahren zur
Karyotyp-Bestimmung
dadurch begrenzt, dass multiple Chromosomen oder Chromosomenregionen
sehr ähnliche
Färbungscharakteristiken
aufweisen und dass Anomalien (wie z.B. Deletionen), welche nur den Bruchteil
einer Bande betreffen, nicht nachweisbar sind. Daher sind solche
Verfahren im wesentlichen auf die Diagnose und detaillierte Analyse
von benachbarte Gene betreffenden Syndromen (engl.: "contiguous gene syndromes"), wie z.B. partielle
Trisomie, Prader-Willi-Syndrom [Emanuel, Am. J. Hum. Genet., 43:575
(1988); Schmickel, J. Pediatr., 109:231 (1986)] und Retinoblastom
[Sparkes, Biochem. Biophys. Acta., 780:95 (1985)] beschränkt.
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Die
konventionelle Bandenanalyse weist somit mehrere wichtige Limitationen
auf, welche die folgenden beinhalten. 1) Sie ist arbeitsaufwendig,
zeitaufwendig und erfordert einen hochgeübten Analytiker. 2) Sie kann
nur auf kondensierte Chromosomen angewendet werden. 3) Sie erlaubt
nicht den Nachweis struktureller Aberrationen, welche weniger als
3-15 Megabasen (MB), abhängig
von der Art der Aberration und der Auflösung der Bandendarstellungstechnik,
betreffen [Landegren et al., Science, 242:229 (1988)]. Diese Erfindung liefert
Sondenzusammensetzungen und Verfahren, um solche Limitationen konventioneller
Bandenanalysen zu überwinden.
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Die
chemischen Färbemethoden
des Stands der Technik liefern aus Gründen, welche nicht gut verstanden
sind, Genommuster, die nicht nach Bedarf für den Einsatz bei verschiedenen
Anwendungen modifiziert werden können.
Solche chemischen Färbungsmuster
wurden zum Kartieren der Bindungsstelle von Sonden eingesetzt. Eine
In situ-Hybridisierung wurde jedoch nur gelegentlich und unter großem Aufwand
eingesetzt, um eine gewisse Information über die Position einer Läsion, beispielsweise
einer Bruchstelle bezogen auf eine spezielle DNA-Sequenz, zu gewinnen.
Die vorliegende Erfindung überwindet
die Inflexibilität
der chemischen Färbung,
indem sie ein Genom mit einem Muster färbt, das auf der Nukleinsäuresequenz
basiert; das Muster kann daher durch Ändern der Nukleinsäuresequenz
der Sonde je nach Bedarf verändert
werden. Die mittels Sonde erzeugten erfindungsgemäßen Färbungsmuster
liefern verlässliche
Markierungen, welche für die
zytogenetische Analyse nützlich
sind.
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Der
automatisierte Nachweis struktureller Anomalien von Chromosomen
mit einer Bildanalyse chemisch gefärbter Banden würde die
Entwicklung eines Systems erfordern, das die auf Metaphasechromosomen durch
konventionelle Techniken erzeugten Bandenmuster nachweisen und auswerten
kann. Es hat sich als sehr schwierig erwiesen, normale Chromosomen,
die chemisch gefärbt
worden waren, mit automatisierten Mitteln verlässlich zu identifizieren; es
ist noch viel schwieriger, anomale Chromosomen mit Strukturanomalien, wie
z.B. Translokationen, zu differenzieren. Ein wirkungsvoller automatisierter
Nachweis von Translokationen bei konventionell mit Banden versehenen
Chromosomen ist nach über
einer Dekade intensiver Arbeit nicht zustande gebracht worden. Die
mittels Sonden erzeugten erfindungsgemäßen Bandenmuster sind für einen
solchen automatisierten Nachweis und eine solche automatisierte
Analyse geeignet.
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In
den letzten Jahren haben sich rasche Fortschritte bei der Untersuchung
der Chromosomenstruktur und ihrer Beziehung zum genetischen Gehalt
und zur DNA-Zusammensetzung
ergeben. Zum Teil kam der Fortschritt in Form verbesserter Verfahren
der Genkartierung, basierend auf der Verfügbarkeit großer Mengen reiner,
durch gentechnologische Verfahren produzierter DNA- und RNA-Fragmente
als Sonden, z.B. Kao, "Somatic
Cell Genetics and Gene Mapping",
International Review of Cytology, Bd. 85, S. 109-146 (1983) und D'Eustachio et al., "Somatic Cell Genetics
in Gene Families",
Science, Bd. 220, S. 9, 19-924 (1983). Die Sonden zur Genkartierung
umfassen markierte Fragmente einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA
oder RNA, welche an komplementäre
Stellen der chromosomalen DNA hybridisiert werden. Im Zusammenhang
mit solchen Sonden ist es höchst
wichtig, reine oder homogene Sonden zu erzeugen, um die Hybridisierungen
an andere Orte als die interessierende Stelle möglichst gering zu halten; Henderson, "Cytological Hybridization
to Mammalian Chromosomes",
International Review of Cytology, Bd. 76, S. 1-46 (1982).
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Das
Hybridisierungsverfahren beinhaltet das Auftrennen oder Aufschmelzen
der doppelsträngigen Sonden-Nukleinsäuren und
Ziel-Nukleinsäuren
durch Erhitzen oder andere Mittel (außer die Sonden-Nukleinsäure und
Ziel-Nukleinsäure
sind einzelsträngige
Nukleinsäuren).
Dieser Schritt wird manchmal als Denaturieren der Nukleinsäure bezeichnet.
Wenn das Gemisch aus Sonde und Ziel-Nukleinsäuren abkühlt, rekombinieren oder reassoziieren
("Annealing") die Stränge, welche
komplementäre
Basen aufweisen. Wenn eine Sonde mit einer Ziel-Nukleinsäure reassoziiert,
kann die Lage der Sonde auf der Ziel-Nukleinsäure durch eine von der Sonde
getragene Markierung oder durch gewisse intrinsische Eigenschaften
der Sonde oder des Sonde-Ziel-Doppelstranges nachgewiesen werden.
Wenn die Ziel-Nukleinsäure in ihrer
natürlichen
biologischen Umgebung verbleibt, z.B. DNA in Chromosomen, mRNA in
Cytoplasma, Teilen von Chromosomen oder Zellkernen (wenn diese auch
durch Präparationstechniken
fixiert oder verändert
sind), wird das Hybridisierungsverfahren als In situ-Hybridisierung
bezeichnet.
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Sonden
für In
situ-Hybridisierung waren anfänglich
darauf beschränkt,
die Lage von Genen oder anderen gut definierten Nukleinsäuresequenzen
auf Chromosomen oder in Zellen zu identifizieren. Vergleiche der
Kartierung von Einzelkopie-Sonden an normalen und anomalen Chromosomen
wurden verwendet, um Chromosomenanomalien zu untersuchen. Cannizzaro
et al., Cytogenetics and Cell Genetics, 39:173-178 (1985). Die Verteilung der multiplen
Bindungsstellen repetitiver Sonden konnten ebenfalls bestimmt werden.
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Die
Hybridisierung mit Sonden, welche eine Zielstelle in einem haploiden
Genom aufweisen, Einzelkopie- oder Einmalsequenz-Sonden, sind verwendet
worden, um die Lage spezieller Gene im Genom zu kartieren [Harper
und Saunders, "Localization
of the Human Insulin Gene to the Distal End of the Short Arm of Chromosome
11", Proc. Natl.
Acad. Sci., Bd. 78, S. 4458-4460 (1981); Kao et al., "Assignment of the
Structural Gene Coding for Albumin to Chromosome 4", Human Genetics,
Bd. 62, S. 337-341 (1982)]; solche Hybridisierungen sind jedoch
nicht verlässlich,
wenn die Größe der Zielstelle
klein ist. Da die Menge an Zielsequenz für Einzelkopie-Sonden niedriger
Komplexität
gering ist bildet nur ein Teil der potentiellen Zielstellen in einer
Zellpopulation Hybride mit der Sonde. Die Kartierung der Lage der
spezifischen Bindungsstelle der Sonde ist daher durch Hintergrundsignale
kompliziert worden, welche durch nicht-spezifisches Binden der Sonde
und auch durch Rauschen im Nachweissystem (beispielsweise Autoradiographie
oder Immunchemie) erzeugt werden. Die Unverlässlichkeit der Signale für solche
Einzelkopie-Sonden des Stands der Technik hat eine statistische Analyse
der Positionen der scheinbaren Hybridisierungssignale in multiplen
Zellen erforderlich gemacht, um die spezifische Bindungsstelle der
Sonde zu kartieren.
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Unterschiedliche
repetitive Sequenzen können
unterschiedliche Verteilungen auf Chromosomen aufweisen. Sie können, wie
in der eben zitierten Referenz, über
alle Chromosome verteilt sein, oder sie können in kompakten Regionen
des Genoms, wie z.B. auf den Zentromeren der Chromosomen, konzentriert
sein, oder sie können
andere Verteilungen aufweisen. In manchen Fällen ist eine solche repetitive
Sequenz vorwiegend auf einem einzigen Chromosom lokalisiert, und
ist daher eine chromosomenspezifische repetitive Sequenz. [Willard
et al., "Isolation
and Characterization of a Major Tandem Repeat Family from the Human
X Chromosome", Nucleic
Acids Research, Bd. 11, S. 2017-2033 (1983).]
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Eine
Sonde für
repetitive Sequenzen, welche allen Chromosomen gemeinsam ist, kann
verwendet werden, um zwischen Chromosomen verschiedener Species
zu unterscheiden, wenn die Sequenz spezifisch für eine der Species ist. Die
gesamte genomische DNA aus einer Species, welche reich an solchen
repetitiven Sequenzen ist, kann in dieser Weise verwendet werden.
[Pinkel et al. (III), PNAS USA, 83:2934 (1986); Manuelidis, Hum.
Genet., 71:288 (1985) und Durnam et al., Somatic Cell Molec. Genet.,
11:571 (1985)].
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In
jüngster
Zeit gibt es eine größere Verfügbarkeit
von Sonden für
wiederholte Sequenzen (repetitive Sonden), welche stark und spezifisch
an ausgewählte
Chromosomen hybridisieren. [Trask et al., Hum. Genet., 78:251 (1988)
und dort zitierte Referenzdokumente]. Solche Sonden sind nun für mehr als
die Hälfte
der menschlichen Chromosomen verfügbar. Im allgemeinen binden
sie an wiederholte Sequenzen auf kompakten Regionen des Ziel-Chromosoms
nahe dem Zentromer. Von einer Sonde wurde jedoch berichtet, dass
sie an das menschliche Chromosom 1p36 hybridisiert, und es gibt
mehrere Sonden, die an das menschliche Chromosom Yq hybridisieren.
Die Hybridisierung mit solchen Sonden erlaubt die rasche Identifizierung
von Chromosomen in Metaphasespreitungen, die Bestimmung der Kopienzahl
ausgewählter
Chromosomen in Interphasezellkernen [Pinkel et al. (I), PNAS USA,
83:2934 (1986); Pinkel et al. (II), Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol., 51:151 (1986) und Cremer et al., Hum. Genet., 74:346 (1986)]
und die Bestimmung der relativen Positionen von Chromosomen in Interphasezellkernen
[Trask et al., siehe oben; Pinkel et al. (I), siehe oben; Pinkel
et al. (II), siehe oben; Manuelidis, PNAS USA, 81:3123 (1984); Rappold
et al., Hum. Genet., 67:317 (1984); Schardin et al., Hum. Genet.,
71:282 (1985); und Manuelidis, Hum. Genet., 71:288 (1985)].
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Viele
Anwendungen sind jedoch immer noch durch das Fehlen geeigneter Sonden
beschränkt.
Beispielsweise waren, bis die hier beschriebenen Verfahren erfunden
wurden, Sonden mit einer für
die pränatale Diagnostik
ausreichenden Spezifität
für Chromosom
13 oder 21 nicht verfügbar.
Außerdem
sind repetitive Sonden für
den Nachweis struktureller Aberrationen nicht sehr brauchbar, da
die Wahrscheinlichkeit, dass die Aberrationen die Region betreffen,
an welche die Sonde hybridisiert, gering ist.
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Diese
Erfindung überwindet
die Limitationen des Stands der Technik hinsichtlich des Einsatzes
der Sonden und erhöht
die Anwendung der In situ-Hybridisierung für die zytogenetische Analyse
dramatisch. Wie oben dargestellt, sind Sonden des Stands der Technik
für eine
tief greifende zytogenetische Analyse nicht brauchbar. Einzelkopie-Sonden
niedriger Komplexität
erzeugen beim derzeitigen Stand der Hybridisierungstechnologie keine
verlässlichen
Signale. Obwohl repetitive Sonden verlässliche Signale liefern, können solche Signale
wegen der fixierten Verteilung der repetitiven Sequenzen in einem
Genom nicht auf unterschiedliche Anwendungen zugeschnitten werden.
Die hierin beschriebenen Sonden kombinieren die Hybridisierungsverläßlichkeit
repetitiver Sonden mit der Flexibilität, dass das Bindungsmuster
der Sonde auf jede gewünschte
Anwendung zugeschnitten werden kann.
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Die
verbesserten Fähigkeiten
dieser Sonden beruhen auf ihrer höheren Komplexität. Das Erhöhen der Komplexität einer
Sonde erhöht
die Wahrscheinlichkeit und daher die Intensität der Hybridisierung an die
Zielregion, erhöht
jedoch auch die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Hybridisierungen,
welche zu Hintergrundsignalen führen.
Im erfindungsgemäßen Konzept
wurde jedoch berücksichtigt,
dass solche Hintergrundsignale ungefähr zufällig über das Genom verteilt sein
würden.
Als Nettoergebnis ergibt sich daher, dass die Zielregion mit erhöhtem Kontrast
gegen solche Hintergrundsignale visualisiert werden könnte.
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Hierin
sind beispielhaft Sonden mit einem ungefähren Komplexitätsbereich
von etwa 50.000 Basen (50 kB) bis zu hunderten Millionen Basen dargestellt.
Solche repräsentativen
Sonden eignen sich für
kompakte Loci und ganze menschliche Chromosome. Vor dieser Erfindung
wiesen die für
In situ-Hybridisierungstechniken eingesetzten Sonden Komplexitäten unter
40 kB und noch typischer in der Größenordnung von wenigen kB auf.
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Das
Färben
von Chromosomenmaterial mit diesen Sonden unterscheidet sich signifikant
vom chemischen Färben
nach dem Stand der Technik. Die Spezifität der von den Sonden erzeugten
erfindungsgemäßen Färbung resultiert
aus einer völlig
neuen Quelle – der
Nukleinsäuresequenz
in einem Genom. Die erfindungsgemäßen Färbungsmuster können daher
so konzipiert werden, dass sie grundlegende genetische Informationen,
die wichtig für
spezielle Anwendungen sind, hervorheben.
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Die
hierin beschriebenen Methoden zur Konstruktion von Sonden jeder
gewünschten
Spezifität
liefern signifikante Fortschritte für ein breites Spektrum zytogenetischer
Studien. Die Analyse kann an Interphasezellkernen durchgeführt werden.
Die hierin beschriebenen Techniken können besonders vorteilhaft
für Applikationen
sein, wo eine Bandendarstellung hoher Qualität mittels konventioneller Methoden
schwierig ist oder wo vermutet wird, dass diese eine fehlerhafte
Information liefert, z.B. in der Tumorzytogenetik. Reagenzien, welche
auf Stellen von Läsionen
zielen, die als diagnostisch oder prognostisch wichtig bekannt sind,
wie z.B. für Tumorarten
spezifische Translokationen, erlauben eine rasche Erkennung solcher
Anomalien. Wo die Analysengeschwindigkeit im Vordergrund der Überlegungen
steht, beispielsweise beim Nachweis von durch toxische Umwelteinflüsse hervorgerufenen
Chromosomenaberrationen geringer Häufigkeit, erlauben die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
eine dramatische Erhöhung
der Nachweiseffizienz im Vergleich zu früheren, auf konventioneller
Chromosomen-Bandendarstellung basierenden Techniken.
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Des
Weiteren wird das pränatale
Screening auf mit Krankheiten verbundene Chromosomenaberrationen
(Beispielsweise Trisomie 21) durch den raschen Nachweis solcher
Aberrationen mit den hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen
verbessert. Die hierin beschriebene Interphasen-Aneuploidie-Analyse
ist für
die pränatale
Diagnostik dadurch besonders bedeutsam, dass sie raschere Ergebnisse
liefert als sie durch Zellkulturverfahren zur Verfügung stehen.
Ferner können
fetale, vom mütterlichen
Blut abgetrennte Zellen, welche nicht mittels Routinemethoden kultiviert
und daher nicht mit konventionellen Techniken zur Bestimmung des
Karyotyps analysiert werden können,
durch die erfindungsgemäßen Verfahren
und Zusammensetzungen untersucht werden. Außerdem verbessern Intensität, Kontrast
und Farbkombinationen der Färbungsmuster
in Verbindung mit der Fähigkeit
des Zuschneidens der Muster auf spezielle Anwendungen die Möglichkeiten
für eine
automatisierte zytogenetische Analyse, beispielsweise mittels Durchflußzytometrie
oder computergestützter
Mikroskopie und Bildanalyse.
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Diese
Anmeldung beschreibt spezifisch Verfahren für den Nachweis chromosomaler
Amplifikationen und Deletionen. Eine repräsentative derart nachgewiesene
Amplifika tion, ist die eines Fusionsgens-BCR-ABL-, das diagnostisch
für chronischmyeloische
Leukämie
(CML) ist.
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Chronisch-myeloische
Leukämie
(CML) ist eine neoplastische Proliferation von Knochenmarkzellen, die
auf genetischer Ebene durch die Fusion des BCR-Gens und des ABL-Gens
auf den Chromosomen 9 und 22 charakterisiert ist. Diese Fusion beinhaltet üblicherweise
eine reziproke Translokation t(9;22)(q34;q11), welche das zytogenetisch
charakteristische Philadelphia-Chromosom (Ph1)
erzeugt. Jedoch können
auch komplexere Umordnungen eine BCR-ABL-Fusion bewirken. Auf der
molekularen Ebene kann die Fusion durch Southern-Analyse oder durch
In vitro-Amplifikation der mRNA des Fusionsgens unter Verwendung
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachgewiesen werden. Diese Techniken
sind empfindlich, können
aber nicht auf Einzelzellen angewendet werden.
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Ein
empfindliches Verfahren zum Nachweis von Chromosomenanomalien und – noch spezifischer – genetischer
Umordnungen, wie beispielsweise der mit CML assoziierten, tumorspezifischen
Umordnungen, wäre
ein höchst
nützliches
Werkzeug für
genetisches Screening. Diese Erfindung stellt ein solches Werkzeug zur
Verfügung.
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Die
folgenden Zitate werden im nachfolgenden Text mit den angegebenen
Nummern angeführt:
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Die
Fusion des Proto-Onkogens c-ABL aus dem langen Arm des Chromosoms
9 mit dem BCR-Gen von Chromosom 22 ist ein konsistenter Befund bei
CML (1-3). Diese genetische Veränderung
führt zur
Bildung eines BCR-ABL-Transkripts, das translatiert wird, wobei
ein Protein mit 210 kd gebildet wird, das bei praktisch allen Fällen von
CML vorhanden ist (4-6). In 90% der Fälle resultiert das Fusionsgen
aus einer reziproken Translokation unter Beteiligung der Chromosomen
9 und 22, welche ein zytogenetisch unterscheidbares kleines akrozentrisches
Chromosom erzeugt, das als Philadelphia-Chromosom (Ph1)
bezeichnet wird (7-12); 8. Die Standard-Zytogenetik weist
jedoch nicht die Auflösung
auf, um nahe zusammenliegende Bruchstellen, wie z.B. die für CML und
akute lymphatische Leukämie
(ALL) charakteristischen, zu unterscheiden und versagt bei Fusionen,
die durch komplexere Umordnungen erzeugt werden. Die Kartierung
und das Klonieren von Bruchstellenregionen in beiden Genen hat zu
molekularen Techniken geführt,
welche eine BCR-ABL-Fusion
bei CML-Fällen
zeigen, bei denen das Ph1-Chromosom zytogenetisch
nicht nachgewiesen werden konnte (13-16). Die Southern-Analyse hinsichtlich
BCR-Umordnungen
ist zum Standard für
die Diagnose von CML geworden. Kürzlich
wurde die Fusion durch In vitro-Amplifikation eines cDNA-Transkripts,
das unter Verwendung von reverser Transkriptase von CML-mRNA kopiert
worden war, nachgewiesen (17-23). Diese Technik erlaubt den Nachweis
eines BCR-ABL-Transkripts aus CML-Zellen, die in geringer Häufigkeit
vorliegen. Beide dieser Techniken verwenden Nukleinsäure, die
aus Zellpopulationen erhalten wird, so dass eine Korrelation zwischen Genotyp
und Phänotyp
für einzelne
Zellen nicht möglich
ist.
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Hierin
werden chromosomenspezifische Reagenzien und Verfahren zum Nachweis
genetischer Umordnungen, wie z.B. die hier beispielhaft für die BCR-ABL-Fusion
dargestellten, beschrieben, welche Informationen liefern, die mit
existierenden Techniken nicht verfügbar sind.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft Verfahren zum Färben von chromosomalem Material
wie in Anspruch 1 definiert. Die Verfahren erzeugen Färbungsmuster,
die auf spezifische zytogenetische Analysen zugeschnitten werden
können.
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Eine
weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es Kits herzustellen, welche
für eine
cytogenetische Analyse nützliche
Nukleinsäuresonden
umfassen, die das chromosomale Material mit zuverlässigen Signalen
färben. Solche
Sonden sind für
eine In situ- Hybridisierung
geeignet. Bevorzugte Nukleinsäuresonden
für bestimmte erfindungsgemäße Anwendungen
sind jene, welche eine ausreichende Komplexität aufweisen, um jede von zwei
oder mehr Zielstellen zuverlässig
zu färben.
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Die
erfindungsgemäßen Kits
dieser Erfindung umfassen Sondenzusammensetzungen, welche beim gegenwärtigen Stand
der Hybridisierungstechniken typischerweise eine hohe Komplexität aufweisen, üblicherweise
eine Komplexität
von größer als
etwa 50 kB, wobei die Komplexität
von der Anwendung abhängt,
für welche
die Sonde vorgesehen ist. Insbesondere werden chromosomenspezifische
Färbereagenzien
bereitgestellt, welche heterogene Gemische von Nukleinsäurefragmenten
umfassen, wobei bei jedem Fragment ein wesentlicher Teil seiner
Sequenzen zu einem Teil der Nukleinsäure, die spezifisch angefärbt werden
soll, – die Ziel-Nukleinsäure, vorzugsweise
das chromosomale Ziel-Material – im
wesentlichen komplementär
ist. Im allgemeinen werden die Nukleinsäurefragmente mit Mitteln, wie
sie hier beispielhaft dargestellt und nachstehend angeführt sind,
markiert. Die Nukleinsäurefragmente
müssen
jedoch direkt markiert werden, damit die Bindung der Sondenfragmente
an das Ziel nachgewiesen werden kann; eine solche Nukleinsäurebindung
kann beispielsweise durch anti-RNA/DNA-Duplex-Antikörper und
Antikörper
gegen Thymidin-Dimere
nachgewiesen werden. Die Nukleinsäurefragmente der heterogenen
Gemische beinhalten doppelsträngige
oder einzelsträngige
RNA oder DNA.
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Diese
Erfindung ist einzig durch die anhängenden Ansprüche definiert
und betrifft chromosomenspezifische Reagenzien und Verfahren zum
Färben
von chromosomalem Material, das sich in der Nähe einer vermuteten genetischen
Umordnung befindet, nämlich
einer chromosomalen Amplifikation oder Deletion. Wenn eine solche
genetische Umordnung mit einer Krankheit assoziiert ist, werden
solche chromosomenspezifischen Reagenzien als krankheitsspezifische
Reagenzien oder Sonden bezeichnet. Wenn eine solche genetische Umordnung
mit Krebs assoziiert ist, werden solche Reagenzien als tumorspezifische
Reagenzien oder Sonden bezeichnet.
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Im
Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "genetische Umordnung" auf chromosomale
Amplifikation oder Deletion.
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Für den Nachweis
genetischer Umordnungen brauchbare Nukleinsäuresonden weisen typischerweise eine
hohe Komplexität
auf.
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Diese
Erfindung stellt ferner Verfahren und Reagenzien zur Unterscheidung
zwischen zytogenetisch ähnlichen,
aber genetisch unterschiedlichen chromosomalen Umordnungen, wie
vorstehend erwähnt,
zur Verfügung.
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Hierin
sind spezifisch chromosomenspezifische Reagenzien und Verfahren
zum Nachweis genetischer Umordnungen offenbart, z.B. Translokationen,
Deletionen, Amplifikationen und Insertionen, welche die BCR-ABL-Fusion
erzeugen, die diagnostisch für
chronisch-myeloische Leukämie
(CML) ist. Es ist jedoch ersichtlich, dass die Erfindung den Nachweis
von chromosomalen Amplifikationen und Deletionen betrifft. Chromosomenspezifische
Reagenzien für
die Diagnose von CML enthalten Nukleinsäuresequenzen, die im wesentlichen
homolog sind zu chromosomalen Sequenzen in der Nähe der Translokationsbruchstellenregionen der
chromosomalen Regionen 9q34 und 22q11, die mit CML assoziiert sind.
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Diese
Reagenzien erzeugen ein Färbungsmuster,
welches sich eindeutig ändert,
wenn die für
CML charakteristische BCR-ABL-Fusion auftritt. 11 zeigt
graphisch eine Vielzahl von Färbungsmustern,
welche – gemeinsam
mit anderen potentiellen Färbungsmustern – bei Vorliegen
einer genetischen Umordnung, wie z.B. der BCR-ABL Fusion, einer Änderung
unterliegen.
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Das
Vorliegen einer genetischen Umordnung kann bestimmt werden, indem
die erfindungsgemäßen Reagenzien
gemäß den hier
beschriebenen Verfahren angewendet und die Nachbarschaft und/oder
andere Charakteristiken der Signale des erzeugten Färbungsmusters
beobachtet werden.
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Vorzugsweise
umfassen die zum Nachweis von CML verwendeten erfindungsgemäßen Reagenzien Nukleinsäuresequenzen,
die eine Komplexität
von etwa 50 Kilobasen (kB) bis etwa 1 Megabase (MB), mehr bevorzugt
von etwa 50 kB bis etwa 750 kB und am meisten bevorzugt von etwa
200 kB bis etwa 400 kB aufweisen.
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Diese
Erfindung liefert ferner Verfahren zur Unterscheidung zwischen vermuteten
genetischen Umordnungen, welche in relativ naher Nachbarschaft in
einem Genom auftreten, wobei die chromosomenspezifischen Reagenzien
Nukleinsäuresequenzen
umfassen, die im wesentlichen homolog zu Nukleinsäuresequenzen
in der Nähe
der vermuteten genetischen Umordnungen sind. Ein Beispiel für eine solche
Differenzierung zwischen zwei potentiellen genetischen Umordnungen
ist die Differentialdiagnose von CML gegenüber akuter lymphatischer Leukämie (ALL).
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Diese
Erfindung liefert darüber
hinaus Verfahren und Reagenzien zum Erzeugen von Färbungsmustern
bei einem Patienten, der von einer krankheitsassoziierten genetischen
Umordnung betroffen ist, wie z.B. der mit der BCR-ABL-Fusion bei
CML assoziierten, wobei die Färbungsmuster
die Reaktion eines Patienten gegenüber verschiedenen Therapiemaßnahmen,
wie z.B. Chemotherapie, Bestrahlung, Chirurgie und Transplantation,
beispielsweise Knochenmarktransplantation, voraussagen und/oder
anzeigen. Solche Färbungsmuster
können
für die Überwachung
des Status eines solchen Patienten, vorzugsweise auf einer Zelle-für-Zelle-Basis,
nützlich
sein und können
einen Krankheitsrückfall
bei einem Patienten, der sich in Remission befindet, voraussagen.
Eine computergestützte
mikroskopische Analyse kann die Interpretation der erfindungsgemäßen Färbungsmuster
unterstützen,
und die Erfindung liefert Verfahren, bei denen eine computergestützte mikroskopische
Analyse zum Testen von Patientenzellen auf einer Zelle-für-Zelle-Basis
eingesetzt wird, um beispielsweise nach einer Restkrankheit bei
einem Patienten zu suchen.
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Außerdem liefert
diese Erfindung Verfahren zur Bestimmung der molekularen Grundlage
einer genetischen Erkrankung und zum Nachweis spezifischer genetisch
bedingter Erkrankungen.
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Des
Weiteren werden hierin Verfahren und Reagenzien zum Nachweis von
benachbarte Gene betreffenden Syndromen beschrieben, umfassend die
In situ-Hybridisierung
von Nukleinsäuresonden,
welche Sequenzen umfassen, die im wesentlich homolog zu den für eine oder
mehrere Komponenten eines benachbarte Gene betreffenden Syndroms
charakteristischen Nukleinsäuresequenzen
sind. Ein typisches Beispiel für
ein solches benachbarte Gene betreffendes Syndrom ist das Down-Syndrom.
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Es
werden auch Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis genetischer Umordnungen
multipler Loci in einem Genom bereitgestellt, umfassend die In situ-Hybridisierung
von Nukleinsäuresonden
hoher Komplexität, welche
Nukleinsäuresequenzen
umfassen, die im wesentlichen homolog zu Nukleinsäuresequenzen
an multiplen Loci in einem Genom sind.
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Des
Weiteren werden Verfahren zum Suchen nach genetischen Umordnungen
in einem Genom bereitgestellt. Beispielsweise kann eine konventionelle
Bandenanalyse eine Anomalie in einer Chromosomenregion eines zu
untersuchenden Genoms anzeigen. Die erfindungsgemäßen Verfahren
können
die Anwendung von Nukleinsäuresonden,
die aus dem benachbarten Bereich jener Chromosomenregion eines normalen
Genoms hergestellt sind, durch In situ-Hybridisierung an Zellen,
welche die Anomalie enthalten, beinhalten, um durch Beobachten des
auf diese Weise erzeugten Färbungsmusters
die exakte Lage und Art der genetischen Umordnung der Anomalie im
Detail festzustellen.
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Die
Erfindung liefert darüber
hinaus Nukleinsäuresonden
hoher Komplexität,
welche für
einen raschen, wirkungsvollen und automatisierten Nachweis genetischer
Umordnungen optimiert sind.
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Ein
Weg zum Erzeugen einer Sonde hoher Komplexität besteht darin, mehrere oder
viele Klone zu poolen, beispielsweise unter anderem Phagen-, Plasmid-,
Cosmid- und/oder
YAC-Klone, wobei jeder Klon eine Einfügungssequenz enthält, die
an einen gewissen Teil des Ziels in einem Genom hybridisieren kann.
Ein anderer Weg zur Erzeugung einer solchen Sonde besteht in der
Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
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Bezogen
auf das Gemisch markierter Nukleinsäurefragmente bedeutet heterogen,
dass die Färbereagenzien
jeweils viele Kopien von Fragmenten mit unterschiedlichen Sequenzen
und/oder Größen (z.B.
von den unterschiedlichen DNA-Klonen, die zur Herstellung der Sonde
gepoolt wurden) umfassen. Als Vorbereitung für die Verwendung können diese
Fragmente zufallsmäßig oder
spezifisch geschnitten werden, um die Größenverteilung der an der Hybridisierungsreaktion
teilnehmenden Nukleinsäurestücke einzustellen.
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Wie
nachstehend ausführlicher
diskutiert, sind die heterogenen Sondengemische vorzugsweise im wesentlichen
frei von Nukleinsäuresequenzen
mit der Fähigkeit
zur Hybridisierung an Nichtziel-Nukleinsäuren. Die meisten solcher Sequenzen
binden an repetitive Sequenzen, die den Ziel- und Nichtziel-Nukleinsäuren gemeinsam
sind, das heißt
gemeinsame repetitive Sequenzen.
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Verfahren
zum Entfernen unerwünschter
Nukleinsäuresequenzen
und/oder zur Ausschaltung des Hybridisierungsvermögens solcher
Sequenzen werden nachstehend ausführlicher diskutiert. [Siehe
Abschnitt II]. Solche Verfahren schließen, ohne darauf beschränkt zu sein,
ein: die selektive Entfernung oder das Screening gemeinsamer repetitiver
Sequenzen aus der Sonde; die sorgfältige Auswahl von Nukleinsäuresequenzen
für die
Aufnahme in die Sonde; das Blockieren gemeinsamer repetitiver Sequenzen
durch die Zugabe unmarkierter genomischer DNA oder das sorgfältigere
Auswählen
von Nukleinsäuresequenzen
für die
Aufnahme in das Blockierungsgemisch; das Inkubieren des Sondengemisches über eine
ausreichende Zeit zur Reassoziation von repetitiven Sequenzen hoher
Kopienzahl oder dergleichen.
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Die
erfindungsgemäßen Färbereagenzien
werden vorzugsweise auf chromosomale DNA aus der Interphase mittels
In situ-Hybridisierung appliziert, und die Chromosomen werden identifiziert
oder klassifiziert, d.h. der Karyotyp bestimmt, indem das Vorhandensein
der Markierung, beispielsweise Biotin oder 3H,
auf den Nukleinsäurefragmenten,
welche das Färbereagenz
umfassen, nachgewiesen wird.
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Die
Erfindung beinhaltet Chromosomen-Färbereagenzien für den gesamten
Genomsatz von Chromosomen, Färbereagenzien
spezifisch für
einzelne Chromosomen, Färbereagenzien
spezifisch für
Chromosomen-Untergruppen und Färbereagenzien spezifische
für Subregionen
innerhalb einzelner oder multipler Chromosomen. Der Begriff "chromosomenspezifisch" ist so zu verstehen,
dass er alle diese Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Färbereagenzien
umfasst. Der Begriff ist auch so zu verstehen, dass er Färbereagenzien, die
sowohl aus normalen und anomalen Chromosomentypen hergestellt und
gegen diese gerichtet sind, umfasst.
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Ein
bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen chromosomenspezifischen
Färbereagenzien
schließt
ein: 1) Isolieren der chromosomalen DNA aus einem speziellen Chromosomentyp
oder Zielregion oder -regionen im Genom, 2) Amplifizieren der isolierten
DNA, um ein heterogenes Gemisch von Nukleinsäurefragmenten zu bilden, 3)
Ausschaltung des Hybridisierungsvermögens der Nukleinsäurefragmente
oder Entfernen darin befindlicher, gemeinsamer wiederholter Sequenzen
und 4) Markieren der Nukleinsäurefragmente
zur Bildung eines heterogenen Gemisches markierter Nukleinsäurefragmente.
Wie nachstehend ausführlicher
beschrieben wird, kann die Reihenfolge der Schritte für spezielle
Ausführungsformen
entsprechend den speziellen Mitteln variieren, welche zur Ausführung der
Schritte verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung beschäftigt
sich mit Problemen, die mit der Bestimmung von Chromosomen-Karyotypen
zusammenhängen,
besonders für
diagnostische und dosimetrische Anwendungen. Insbesondere überwindet
die Erfindung Probleme, welche durch das Fehlen von Färbemitteln,
die ausreichend chromosomenspezifisch sind, auftreten, indem sie
Reagenzien liefert, die heterogene Gemische von Nukleinsäurefragmenten
umfassen, welche an die Ziel-DNA und/oder -RNA hybridisiert werden
können,
beispielsweise an die Ziel-Chromosomen, an Ziel-Untergruppen von
Chromosomen oder an Zielregionen der spezifischen Chromosomen. Die
erfindungsgemäße Färbetechnik
eröffnet
die Möglichkeit
des raschen und empfindlichen Nachweises genetischer Umordnungen
in Interphasezellen unter Verwendung von Klinik- und Labor-Standardausrüstung und
einer verbesserten Analyse mit Einsatz automatisierter Techniken.
Sie besitzt direkte Anwendbarkeit für das genetische Screening,
in der Krebsdiagnostik und bei der biologischen Dosimetrie.
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Diese
Erfindung liefert außerdem
spezifisch Verfahren und Nukleinsäuresonden zum Färben von
fetalem chromosomalem Material in der Interphase. Darüber hinaus
liefert die Erfindung ein für
den Embryo nicht-invasives Verfahren zur Bestimmung des Karyotyps
des chromosomalen Materials von fetalen Zellen, bei dem die fetalen
Zellen vom mütterlichen
Blut abgetrennt worden sind. Solche fetalen Zellen sind vorzugsweise Leukozyten
und/oder Zytotrophoblasten. Exemplarische Nukleinsäuresonden
sind Sonden mit hoher Komplexität,
die für
die Chromosomentypen 13, 18 und/oder 21 chromosomenspezifisch sind.
Repräsentative
Sonden umfassen chromosomenspezifische Bluescribe Plasmidbibliotheken,
aus denen vor und/oder während
der Hybridisierung mit den fetalen Ziel-Chromosomen eine ausreichende
Zahl gemeinsamer repetitiver Sequenzen entfernt oder deren Hybridisierungsvermögen ausgeschaltet
worden ist.
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Diese
Erfindung offenbart Testkits, wie in Anspruch 18 definiert, welche
geeignete Nukleinsäuresonden
für die
Verwendung in der Tumor-Zytogenetik, zum Nachweis von krankheitsbezogenen
Loci, zur Analyse von strukturellen Anomalien, z.B. Translokationen,
unter anderen genetischen Umordnungen, und zur biologischen Dosimetrie
umfassen.
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Diese
Anmeldung offenbart außerdem
Kits für
das pränatale
Screening, die geeignete Nukleinsäuresonden umfassen, einschließlich Testkits,
die Sonden hoher Komplexität
für den
Nachweis genetischer Umordnungen und spezifisch jener, welche die
für CML
charakteristische BCR-ABL-Fusion erzeugen, umfassen.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
und Zusammensetzungen erlauben das Färben von chromosomalem Material
mit für
eine gewünschte
Anwendung zweckmäßigen Mustern.
Das Muster kann sich über
einige Regionen eines oder mehrerer Chromosomen oder über einige
oder alle Chromosomen eines Genoms und multiple Abschnitte, die
durch multiple Farben unterscheidbar sind, erstrecken. Alternativ
dazu kann das Muster auf einen speziellen Teil oder Teile eines
Genoms fokussiert sein, wie z.B. einen Teil oder Teile, welche potentiell
eine Bruchstelle enthalten, die dia gnostisch oder prognostisch für einen
oder mehrere Tumoren wichtig ist, oder auf jene Teile von Chromosomen,
die für
die pränatale
Diagnostik von Bedeutung sind.
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Das
Färbungsmuster
kann je nach eingesetztem Analysenverfahren, sei es beispielsweise
ein menschlicher Beobachter oder eine automatisierte Ausrüstung, wie
z.B. ein Durchfluss-Zytometer oder computergestützte Mikroskopie, angepasst
werden. Die Muster können
so gewählt
werden, dass sie für
die Analyse kondensierter Chromosomen oder von dispersem chromosomalem
Material geeignet sind.
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Die
Erfindung sieht ferner automatisierte Mittel für den Nachweis und die Analyse
chromosomaler Anomalien, insbesondere genetischer Umordnungen, wie
sie durch die erfindungsgemäß erzeugten
Färbungsmuster
angezeigt werden, vor.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein alternatives
Verfahren zu den gegenwärtig
verfügbaren
Techniken für
die Herstellung und Anwendung nicht-selbstkomplementärer einzelsträngiger DNA-Hybridisierungssonden
zur Verfügung
zu stellen.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, das bei einer In situ-Hybridisierung
erzielbare Signal-Rauschverhältnis
durch Reduzieren des unspezifischen und fehlgepaarten Bindens der
Sonde zu verbessern.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Denaturierung
doppelsträngiger Ziel-DNA
für die
Anwendung der Hybridisierungssonde bereitzustellen, welches die
für eine
Hybridisierung verfügbaren
einzelsträngigen
Regionen, die zu den Sondensequenzen nicht komplementär sind,
auf ein Minimum beschränkt.
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DNA-Fragmente,
aus denen Sonden durch Behandlung mit einer Restriktionsendonuklease,
die eine Sammlung von Restriktionsfragmenten mit "klebrigen" Enden oder abgestuften
Schnitten, charakteristisch für die
verwendete Endonuklease, erzeugt, konstruiert werden können. Das
heißt,
die zwei durch einen Schnitt eingeführten Fragmentenden bestehen
jeweils aus einem überhängenden
und einem zurückge setzten
Strang. Die Restriktionsfragmente werden in Vektoren eingefügt, welche
so konstruiert sind, dass sie diesen Restriktionsfragment-Typ akzeptieren;
und die Vektoren werden durch Transfektion in Wirtsorganismen eingeschleust, welche
angezüchtet
werden, um die Zahl der Restriktionsfragmente zu erhöhen. Danach
werden die Vektoren von den Wirtsorganismen abgetrennt, und die
Restriktionsfragmente werden herausgeschnitten und von den Vektoren
abgetrennt. An jedem Ende der Restriktionsfragmente werden die zurückgesetzten
Stränge
durch eine geeignete Exonuklease verdaut. Es wird nicht zugelassen,
dass die Verdauung vollständig
abläuft.
Die mit Exonuklease behandelten Restriktionsfragmente werden dann
als Vorlage/Primer für
DNA-Polymerase verwendet, welche den verdauten Strang in Gegenwart
einer markierten Vorläufersubstanz
ersetzt. Beispiele für
Enzyme, die für
dieses Verfahren geeignet sind, sind Exonuklease III, gefolgt von
Behandlung mit dem großen
Fragment der DNA-Polymerase I; oder T4-DNA-Polymerase, welche durch Änderungen
in den Reaktionsbedingungen beide Funktionen ausführen kann.
Nach Abschluss der Synthese werden die Restriktionsfragmente zu
kleineren Fragmenten zerbrochen, so dass die markierten Teile des
ursprünglichen
Restriktionsfragments im wesentlichen intakt bleiben. Die kleineren
Fragmente werden denaturiert, und die markierten Stränge werden
von den unmarkierten Strängen
abgetrennt, um die Hybridisierungssonden zu bilden.
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Bei
diesem Verfahren der Verwendung einzelsträngiger Sonden wird die Ziel-DNA
vor Applikation der Hybridisierungssonde auf die Ziel-DNA zuerst
mit der gleichen Restriktionsendonuklease behandelt, die zum Ausschneiden
der Sonden-DNA aus dem Klonierungsvektor verwendet wurde. Diese
Behandlung zerbricht die Ziel-DNA in eine Sammlung von Restriktionsfragmenten,
welche an jedem Ende für
die Restriktionsendonuklease charakteristische Schwänze aufweisen.
Dann wird die Ziel-DNA
mit einer Exonuklease behandelt, welche den zurückgesetzten Strang entfernt,
so dass einzelsträngige
DNA in der Nähe
des durch die Restriktionsendonuklease eingeführten Schnitts freigelegt wird.
Schließlich
wird die Hybridisierungssonde auf die Ziel-DNA appliziert, beispielsweise
unter Verwendung von Standardprotokollen für die In situ-Hybridisierung, wie
sie nachstehend ausführlicher
beschrieben sind.
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Ein
wichtiges Merkmal des Verfahrens mit einzelsträngigen Sonden besteht darin,
dass die klonierte Sonden-DNA und die Ziel-DNA mit der gleichen
Restriktionsendonuklease behandelt werden. Dies stellt sicher, dass
die einzelsträngige
DNA des Ziels komplementär
zum markierten Strang der Sonde ist. Natürlich werden zusätzlich zu
den korrekten Bindungsstellen viele Segmente des Ziels in Einzelstränge überführt werden,
da viele Restriktionsschnitte vorhanden sind, aber es wird insgesamt
viel weniger einzelsträngiges
Ziel vorliegen, als durch wahllose Denaturierung erzeugt würde. Außerdem kann
die auf diese Weise in einen Einzelstrang überführte Ziel-DNA nicht mit sich
selbst reassoziieren und so den Zugang für die Sonde blockieren.
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Ein
weiteres wichtiges (aber nicht kritisches) Merkmal eines solchen
Verfahrens besteht in der Wahl einer Markierung, welche die Abtrennung
markierter Stränge
von unmarkierten Strängen
erlaubt. Die Vorläufersubstanzen
werden vorzugsweise durch Biotinylierung markiert, und die markierten
Stränge
werden von den unmarkierten Strängen
durch Affinitätschromatographie
abgetrennt.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die 1A, B und C und die 2A und 2B veranschaulichen
die Hybridisierung einer für
Chromosom 21 spezifischen Bibliothek an eine menschliche Metaphasespreitung,
wobei die Einfügungssequenzen im
Lambda-Phagen Charon 21A kloniert waren. Das Hybridisierungsvermögen der
repetitiven Sequenzen mit hoher Kopienzahl in der Bibliothek wurde
durch die Zugabe unmarkierter genomischer DNA zum Hybridisierungsgemisch
reduziert. Die Sonde wurde mit Biotin markiert, das mit grünem FITC-Avidin
(Fluoresceinisothiocyanat-Avidin) nachgewiesen wurde. Die gesamte
DNA in den Chromosomen wurde mit dem blauen Fluoreszenzfarbstoff
DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol) gefärbt.
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1A ist ein Binärbild
der DAPI-Färbung
in der menschlichen Metaphasespreitung, die durch Verwendung einer
an einem Fluoreszenzmikroskop befestigten TV-Kamera erhalten wurde. Es wurden für eine DAPI-Visualisierung
geeignete Filter verwendet. Die Computerverarbeitung des Bildes
zeigt alle Teile oberhalb einer gewählten Intensitätsschwelle
als weiß und
den Rest als schwarz.
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1B ist ein Binärbild
der FITC-Färbung
derselben menschlichen Metaphasespreitung wie in 1A. Das Bild wurde wie in 1A hergestellt,
der Filter im Mikroskop wurde jedoch gewechselt, so dass das an
die Sonde gebundene FITC statt des DAPI sichtbar ist.
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1C ist ein Binärbild
der Chromosomen des Typs 21 allein, wobei am Binärbild der 1B unspezifisch gefärbte Objekte (die kleiner sind)
durch Standard-Bildbearbeitungstechniken
entfernt wurden.
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2A ist eine Farbphotographie der DAPI-Färbung in
einer menschlichen Metaphasespreitung, der gleichzeitig mit dem
in den computergenerierten Binärbildern
der 1A, B und C gezeigten Spreitung
hergestellt und hybridisiert wurde.
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2B ist eine Farbphotographie des an die DNA-Sonde
gebundenen Fluorescein in derselben menschlichen Metaphasespreitung
wie der in 2A. Sie wurde durch Wechseln
der Filter im Fluoreszenzmikroskop zur Anregung von Fluorescein
anstelle von DAPI erhalten. Die Photographie ist mit dem Binärbild von 1B vergleichbar.
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3 ist
eine Photographie einer menschlichen Metaphasespreitung, die gleichzeitig
mit den in den 1A, B und C und 2A und
B gezeigten Spreitungen hergestellt und hybridisiert wurde. Die
verwendeten Methoden waren dieselben, außer dass PI (Propidiumiodid)
anstelle von DAPI zum Färben
der gesamten Chromosomen verwendet wurde. Sowohl PI- als auch Fluorescein-Färbungen
können
mit den gleichen Mikroskopfiltern betrachtet werden. Es wurde Farbfilm
verwendet, so dass auf dem Farbfilm die Propidiumiodid-Gegenfärbung rot
und das Fluorescein der Sonde gelb erscheint.
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4A zeigt die Hybridisierung der Chromosom 4-spezifischen
Bibliothek in Bluescribe-Plasmiden (die Bibliothek pBS-4) an eine
menschliche Metaphasesprei tung, wobei keine unmarkierte menschliche
genomische DNA verwendet und das Hybridisierungsgemisch unmittelbar
nach Denaturierung appliziert wurde. Beide Kopien von Chromosom
4 sind als ein wenig heller als die anderen Chromosomen zu erkennen.
Die kleinen Pfeile bezeichnen Regionen, die nicht mit der Sonde
gefärbt
sind. Wie bei 3 und wie beim Rest der unten
angeführten
Figuren ist PI die Gegenfärbung,
und Fluorescein wird verwendet, um die Sonde zu markieren.
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4B zeigt die Hybridisierung von pBS-4 an eine
menschliche Metaphasespreitung, wobei unmarkierte menschliche genomische
DNA während
der Hybridisierung eingesetzt wurde (Q = 2 von genomischer DNA;
die Bedeutung von Q ist unten erklärt). Eine qualitative Bildanalyse
zeigt, dass die Intensität
pro Längeneinheit
der Chromosomen des Typs 4 etwa das 20-fache der anderen Chromosomen
beträgt.
Die Chromosomen des Typs 4 sind gelb; die anderen Chromosomen sind
aufgrund der Propidiumiodid-Gegenfärbung rot. Zwei Schichten von
Avidin-Fluoresceinisothiocyanat
wurden verwendet, um die Ziel-Chromosomen für eine genaue Messung ausreichend
aufzuhellen. Die Chromosomen des Typs 4 können jedoch nach Aufbringen
einer einzigen Schicht leicht erkannt werden.
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4C zeigt dieselbe Spreitung wie in 4B, aber durch ein Filter, das nur die Fluoreszenz
des Fluoresceinisothiocyanats passieren lässt.
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4D zeigt den Nachweis einer die Chromosomen des
Typs 4 betreffenden strahlungsinduzierten Translokation (Pfeile)
in einer menschlichen Metaphasespreitung, wobei pBS-4-spezifische
Bibliotheken verwendet werden. Das Kontrastverhältnis ist etwa 5X.
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4E zeigt, dass normale und zwei Derivat-Chromosomen,
die aus einer Translokation zwischen Chromosom 4 und 11 (in Ziellinie
RS4;11) resultieren, durch die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren
in Interphasezellkernen nachgewiesen werden können. Sie zeigen sich als drei
getrennte Domänen.
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4F zeigt die Hybridisierung der Chromosom 21-spezifischen
Bibliothek in Bluescribe-Plasmiden (die Bibliothek pBS-21) an eine
Metaphasespreitung einer Trisomie-21-Zellinie. Ein geringes Ausmaß an Hybridisierung
ist nahe den Zentromeren der anderen akrozentrischen Chromosomen
sichtbar.
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4G zeigt die gleiche Hybridisierung wie in 4F, jedoch mit Interphasezellkernen. Die drei
Chromosom 21-Domänen
sind deutlich gezeigt.
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4H zeigt die Hybridisierung mit einem Pool von
120 Einzelkopie-Sonden aus Chromosom 4 an eine menschliche Metaphasespreitung.
Die Chromosomen des Typs 4 sind mit Pfeilen bezeichnet.
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5 zeigt
die Hybridisierung eines Klons eines künstlichen Hefe-Chromosoms (YAC),
der eine 580-kB-Einfügungssequenz
menschlicher DNA enthält,
an eine menschliche Metaphasespreitung. Eine gelbe Fluoresceinbande
auf jedem der Chromosomen des Typs 12 (bei 12g21.1) ist gegen die
Propidiumiodid-Gegenfärbung sichtbar.
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6 zeigt
die Hybridisierung von DNA aus einer Mensch/Hamster-Hybridzelle,
die eine Kopie des menschlichen Chromosoms 19 enthält, an eine
menschliche Metaphasespreitung. Ein wenig rechts von der Mitte der
Photographie befinden sich die zwei Chromosomen des Typs 19, die
heller als die anderen Chromosomen in der Spreitung sind.
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7 veranschaulicht
ein repräsentatives
Verfahren zur Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für die Herstellung
erfindungsgemäßer Sonden,
die eine verminderte Zahl repetitiver Sequenzen aufweisen.
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8 veranschaulicht
die Lage von Sonden zur CML-Bruchstelle und die korrespondierenden
Färbungsmuster
in normalen und CML-Metaphase- und Interphasezellkernen.
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Die
linke Seite zeigt schematische Darstellungen des BCR-Gens auf Chromosom
22, des ABL-Gens auf Chromosom 9 und des BCR-ABL-Fusionsgens auf
dem Philadelphia-Chromosom. Auch die Lage der CML-Bruchstellen und
ihre Relation zu den Sonden sind gezeigt (32). Die rechte Seite
zeigt Hybridisierungsmuster, wie sie für die c-hu-ABL- und PEM12-Sonden
bei Hybridisierung an normale und CML-Metaphasespreitungen und -Interphasezellkerne
zu erwarten sind.
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9 zeigt eine Fluoreszenz-In situ-Hybridisierung
(FISH) an Metaphasespreitungen und Interphasezellkerne. Die Tafeln
A und B zeigen die Hybridisierung von ABL und BCR an normale Metaphasespreitungen. Das
ABL-Signal (A) ist auf dem telomeren Teil von 9q lokalisiert, und
das BCR-Signal (B) ist nahe dem Zentromer von 22q lokalisiert. Tafel
C zeigt, dass die abl-Färbung
bei einem CML-Fall mit 46XY, t(9:22) (q34;q11) auf der telomeren
Region des Philadelphia-Chromosoms lokalisiert ist. Tafel D zeigt,
dass die abl-Färbung
bei einem CML-Fall mit 46XY ins (22:9)(q11;q34) interstitiell auf
dem Derivat-Chromosom 22, das aus einem Insertionsereignis entsteht,
liegt. Tafel E veranschaulicht, dass die K562-Zellinie multiple
Signale aufweist, die auf einer Region des Interphasezellkerns lokalisiert
sind. Ein identisches Färbungsmuster
wurde mit einer BCR-Sonde beobachtet, was eine Amplifizierung des
BCR-ABL-Fusionsgens anzeigt. Tafel F stellt eine Metaphasespreitung
aus der K562-Zellinie dar, der eine auf einem einzigen Chromosom
lokalisierte Fusionsgen-Amplifizierung
zeigt.
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10 veranschaulicht eine Fluoreszenz-In situ-Hybridisierung
bei CML-Interphasezellkernen
mit ABL(rot)- und BCR(grün)-Sonden,
die gleichzeitig durch ein Doppelbandfilter visualisiert werden.
Die Zellen aus einem CML-Patienten zeigen die rot-grünen (gelben)
Signale, die aus der Hybridisierung an das BCR-ABL-Fusionsgen resultieren,
und einzelne rote und grüne
Hybridisierungssignale für
die Hybridisierung an die normalen BCR- und ABL-Gene auf den Chromosomen
22 und 9.
-
11 veranschaulicht einige typische Sondenstrategien
für den
Nachweis struktureller Aberrationen. Das Design der Bindungsmuster,
Farben etc. der Sonden kann für
den Nachweis genetischer Anomalien in Metaphase- und/oder Interphasezellen optimiert
werden. Unterschiedliche Muster können für spezielle Anwendungen von
Vorteil sein. Die Zeichnungen in 11 veranschaulichen
einige der für
den Nachweis einiger Anomalien brauchbaren Muster. Die Beispiele
sind repräsentativ
und nicht als erschöpfend
anzusehen; verschiedene Muster können
kombiniert werden, um den Nachweis multipler Anomalien in derselben
Zelle zu ermöglichen.
-
In
den Zeichnungen der 11, sind die Metaphasechromosomen
mit an beide Chromatiden gebundenen Sonden dargestellt. Die Interphasezellkerne
sind in einem Stadium des Zellzyklus vor Replikation des Teils des
Chromosoms, an den die Sonde bindet; abgebildet; es liegt daher
nur ein Chromatid von jedem Interphasechromosom vor. Wenn die Sondenbindung
nur auf einen Teil eines Chromosoms beschränkt ist, ist das Signal entweder
als schwarzer oder weißer
Kreis angezeigt. Eine solche Darstellung wird verwendet, um verschiedene
Farben oder auf andere Weise unterscheidbare Charakteristiken der
Färbung
anzuzeigen. Muster, die mehr als zwei unterscheidbare Charakteristiken
(drei Farben, verschiedene Farbverhältnisse etc.) enthalten, erlauben
komplexere Färbungsmuster
als die in der Figur dargestellten. Die chromosomale Lage der Bruchstellen
in der DNA wird durch waagrechte Linien neben den anomalen Chromosomen
angezeigt.
- a. Abschnitt a) stellt die Verwendung
einer Sonde dar, die ein ganzes Chromosom färbt. Eine solche Sonde kann
verwendet werden, um eine Translokation, die irgendwo entlang eines
Chromosoms auftritt, nachzuweisen. Die Farbphotographie der 12 zeigt die Verwendung eines solchen Färbemittels
für Chromosom
22 zum Nachweis einer Translokation, in diesem Fall jener, die bei
CML auftritt. Eine solche Vorgangsweise hinsichtlich der Färbung ist
bei Interphasezellkernen nicht sehr nützlich, da die Region des Zellkerns, welche
gefärbt
wird, relativ groß ist; Überlappungen
der gefärbten
Regionen können
bei vielen Zellkernen die Interpretation schwierig gestalten.
- b. Abschnitt b) stellt die Reduktion der gefärbten Region des in a) gezeigten
Chromosoms auf die Region in der Nähe einer Bruchstelle dar, so
dass eine auf Ereignisse in dieser Region fokussierte Information
geliefert wird. Das Färbungsmuster
kann kontinuierlich oder diskontinuierlich über die Bruchstelle verlaufen, gerade
so, dass eine gewisse Bindung auf beiden Seiten der Bruchstelle
gegeben ist. Ein solches Färbungsmuster
erfordert lediglich eine "Farbe", gibt aber keine
Information darüber,
welche andere Genomregion in den Austausch involviert sein kann.
- c. Abschnitt c) stellt die Verwendung einer Sonde dar, die an
Sequenzen bindet, welche als Ergebnis der Umordnung zusammenkommen,
und den Nachweis in Metaphase- und Interphasezellen erlaubt. In
diesem Fall werden die verschiedenen Sequenzen mit verschiedenen "Farben" gefärbt. Ein
solches Färbungsmuster
ist jenes, das in den Beispielen des Abschnitts VIII dieser Anmeldung
verwendet wird.
- d. Abschnitt d) stellt eine Ausweitung von c) dar, indem er
das Färben
beider Seiten der beiden Bruchstellen, die an der Umordnung beteiligt
sind, beinhaltet. Verschiedene "Farben" werden wie angezeigt
verwendet. Die durch das komplexere Färbungsmuster gelieferte zusätzliche
Information kann die Interpretation der Zellkerne unterstützen. Sie
könnte
auch, wie hierin diskutiert, die Erkennung eines scheinbaren Insertionsereignisses
erlauben.
- e. Abschnitt e) stellt den Nachweis einer Inversion in einem
Homolog eines Chromosoms dar.
- f. Abschnitt f) stellt ein Färbungsmuster
dar, das für
den Nachweis einer Deletion nützlich
ist. Eine Deletion könnte
auch mit einer Sonde nachgewiesen werden, die nur die deletierte
Region färbt;
das Fehlen einer Sondenbindung kann jedoch auf andere Gründe als
die Deletion der Zielsequenz zurückzuführen sein.
Die mit einer unterschiedlichen "Farbe" gefärbten flankierenden
Regionen dienen als Kontrolle für
die Hybridisierung.
-
12 veranschaulicht ein Färbungsmuster zum Nachweis einer
Umordnung mittels Anfärbung
eines ganzen Chromosoms, in diesem Fall eine mit CML assoziierte
Umordnung von Chromosom 22. Die Metaphasespreitung dieser Figur
stammt aus einer CML-Zelle, die mit einer Sonde gefärbt wurde,
welche entlang des gesamten Chromosoms 22 bindet. Die von der Sonde
gefärbten
Regionen erscheinen gelb. Die restliche DNA wurde mit dem rot-fluoreszierenden
chemischen Färbemittel
Propidiumiodid gefärbt.
Das völlig
gelbe Chromosom ist eine normale Kopie von Chromosom 22. Genau unter
dem normalen Chromosom 22 befindet sich das Philadelphia-Chromosom, ein zum
kleinen Teil gelbes und zum Teil rotes Chromosom. Unterhalb und
rechts vom Philadelphia-Chromosom befindet sich das anomale Chromosom
9 (rot) mit dem angefügten
distalen Teil von Chromosom 22 (gelb). Die Photographie dieser Figur
veranschaulicht das in Teil a) der vorhergehenden Figur dargestellte
Färbungsmuster.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Diese
Erfindung betrifft die Verwendung von Nukleinsäuresonden zum Färben von
chromosomalem Ziel-Material in Mustern, die sich über eines
oder mehrere Chromosomen und/oder entlang einer oder mehrerer Regionen
auf einem oder mehreren Chromosomen erstrecken können, einschließlich Mustern,
die sich über
ein gesamtes Genom erstrecken. Die erfindungsgemäßen Färbereagenzien erleichtern die
mikroskopische und/oder durchflußzytometrische Identifizierung
normaler und aberranter Chromosomen und ermöglichen die Charakterisierung
der genetischen Natur spezieller Anomalien, wie z.B. genetischer
Umordnungen. Der Begriff "chromosomenspezifisch" ist hierin so definiert,
dass er die Begriffe "zielspezifisch" und "regionsspezifisch" umfasst, das heißt, wenn
die Färbezusammensetzung
auf ein Chromosom gerichtet ist, dann ist sie chromosomenspezifisch,
aber sie ist auch chromosomenspezifisch, wenn sie beispielsweise
auf multiple Regionen auf multiplen Chromosomen oder auf eine Region
nur eines Chromosoms oder auf Regionen im Bereich des gesamtem Genoms
gerichtet ist. Der Begriff "chromosomenspezifisch" hat seinen Ursprung
in der Verwendung rekombinanter DNA-Bibliotheken, die durch Klonieren
von DNA aus einem einzelnen normalen Chromosomentyp hergestellt
wurden, als das Ausgangsmaterial für die anfänglichen erfindungsgemäßen Sonden.
Bibliotheken, die aus DNA von Regionen eines oder mehrerer Chromosomen
hergestellt sind, sind DNA-Ausgangsmaterial für Sonden für diese Region oder diese Regionen
des Genoms. Die aus einem solchen Ausgangsmaterial hergestellten
Sonden sind regionsspezifische Sonden, jedoch auch von dem weitergefassten
Ausdruck "chromosomenspezifische" Sonden umfasst.
Der Begriff "zielspezifisch" wird hierin austauschbar
mit dem Begriff "chromosomenspezifisch" verwendet.
-
Das
Wort "spezifisch", wie es im Fachgebiet üblicherweise
gebraucht wird, besitzt zwei etwas unterschiedliche Bedeutungen.
Dieser Praxis wird auch hierin gefolgt. "Spezifisch" kann sich auf die Herkunft einer Nukleinsäuresequenz
oder auf das Muster, mit dem sie als Teil eines Färbereagenz
an ein Genom hybridisieren wird, beziehen. Beispielsweise führt das
Isolieren und Klonieren von DNA aus einem spezifizierten Chromosom
zu einer "chromosomenspezifischen
Bibliothek". [Z.B.,
Van Dills et al., "Human
Chromosome-Specific DNA Libraries: Construction and Availability", Biotechnologe,
4:537 (1986).] Eine solche Bibliothek enthält jedoch Sequenzen, die sie
mit anderen Chromosomen gemeinsam hat. Solche gemeinsamen Sequenzen
sind hinsichtlich ihrer Hybridisierungseigenschaften nicht chromosomenspezifisch
für das
Chromosom, von dem sie abgeleitet sind, da sie an mehr Chromosomen
als das Ursprungschromosom binden werden. Eine Sequenz ist "chromosomenspezifisch", wenn sie nur an
den gewünschten
Teil eines Genoms bindet. Solche Sequenzen umfassen im Ziel enthaltene
Einzelkopie-Sequenzen oder repetitive Sequenzen, bei denen die Kopien
vorwiegend im Ziel enthalten sind.
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"Chromosomenspezifisch" als nähere Bestimmung
von "Färbereagenz" bezieht sich auf
das gesamte Hybridisierungsmuster der Nukleinsäuresequenzen, die das Reagenz
umfasst. Ein Färbereagenz
ist chromosomenspezifisch, wenn ein brauchbarer Kontrast zwischen
dem chromosomalen Ziel- und Nichtziel-Material erzielt wird (das
heißt,
dass das Ziel ausreichend visualisiert werden kann).
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Eine
Sonde ist hierin definiert als eine Sammlung von Nukleinsäurefragmenten,
deren Hybridisierung an das Ziel nachgewiesen werden kann. Die Sonde
wird wie unten beschrieben markiert, so dass ihre Bindung an das
Ziel visualisiert werden kann. Die Sonde wird aus einer Nukleinsäurequelle,
beispielsweise einer Sammlung von Klonen oder einer Sammlung von
Produkten einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), hergestellt. Die
Ausgangsnukleinsäure
kann dann in mancher Weise weiter verarbeitet werden, beispielsweise
durch Entfernen repetitiver Sequenzen oder deren Blockierung mit
einer unmarkierten Nukleinsäure
mit komplementärer
Sequenz, so dass die Hybridisierung mit der resultierenden Sonde
eine Färbung
mit ausreichendem Kontrast auf dem Ziel erzeugt. Das Wort Sonde
kann hierin somit nicht nur in Bezug auf die nachweisbare Nukleinsäure, sondern
auch in Bezug auf die nachweisbare Nukleinsäure in der Form, in welcher
sie auf das Ziel appliziert wird, beispielsweise mit der blockierenden
Nukleinsäure
etc., verwendet sein. Die blockierende Nukleinsäure kann auch getrennt genannt
werden. Worauf sich "Sonde" spezifisch bezieht,
sollte aus dem Zusammenhang, in dem das Wort gebraucht wird, klar
sein.
-
Wenn
zwei oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuresonden
zusammengemischt werden, ergeben sie eine neue Sonde, die bei Hybridisierung
an ein Ziel nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Färbungsmuster
erzeugen, das eine Kombination der von deren Komponenten-Sonden
einzeln produzierten Färbungsmuster
darstellt. Daher können
die Begriffe "Sonde" und "Sonden" (das heißt, die
Einzahl- und Mehrzahlform)
im Zusammenhang mit einem erzeugten Färbungsmuster austauschbar verwendet
werden. Wenn beispielsweise eine erfindungsgemäße Sonde einen Punkt auf Chromosom
9 erzeugt, und eine andere Sonde erzeugt eine Bande auf Chromosom
11, dann bilden die zwei Sonden zusammen eine Sonde, die ein Punkt/Bande-Färbungsmuster
erzeugt.
-
Der
Begriff "markiert" wird hierin verwendet,
um darauf hinzuweisen, dass ein Verfahren zur Visualisierung der
gebundenen Sonde existiert, unabhängig davon ob die Sonde direkt
einen modifizierten Bestandteil trägt oder nicht. Der nachstehende
Abschnitt III beschreibt verschiedene Mittel zum direkten Markieren
der Sonde und andere Markierungsmittel, mit welchen die gebundene
Sonde nachgewiesen werden kann.
-
Die
Begriffe "Färben" bzw. "Färbung" oder "Anfärben" bedeuten hierin
definitionsgemäß das Hybridisieren
einer erfindungsgemäßen Sonde
an ein Genom oder ein Segment davon, so dass die Sonde zuverlässig an
das darin befindliche chromoso male Ziel-Material bindet und die
gebundene Sonde visualisiert werden kann. Die Begriffe "Färben" oder "Anfärben" werden austauschbar
verwendet. Die durch das "Färben" oder "Anfärben" erhaltenen Muster
sind nützlich
für zytogenetische
Analysen, insbesondere für
molekulare zytogenetische Analysen. Die Färbungsmuster erleichtern die
mikroskopische und/oder durchflusszytometrische Identifizierung
normaler und anomaler Chromosomen und die Charakterisierung der
genetischen Natur spezieller Anomalien. Der nachstehende Abschnitt
III beschreibt Verfahren zum Sichtbarmachen der Sonde. Da vielfältige kompatible
Verfahren der Sondenvisualisierung verfügbar sind, können die
Bindungsmuster verschiedener Komponenten der Sonde unterschieden
werden, beispielsweise durch Farbe. Diese Erfindung kann daher jedes
gewünschte
Färbungsmuster,
das mittels einer oder mehrerer Farben (ein Vielfarben-Färbungsmuster)
und/oder anderer Indikatorverfahren visualisiert wird, auf den Chromosomen
erzeugen. Der Begriff "Färben", wie er hierin definiert
ist, beinhaltet nicht das Konzept des Färbens von Chromosomen mit Chemikalien
wie bei konventionellen Verfahren zur Karyotyp-Bestimmung, obwohl
solche konventionellen Färbemittel
in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Sonden verwendet werden
können,
um die Visualisierung jener Teile des Genoms zu ermöglichen,
an welche die Sonde nicht bindet. Die Verwendung von DAPI und Propidiumiodid
für einen
solchen Zweck ist in den Figuren dargestellt.
-
Der
Ausdruck "hohe Komplexität" bedeutet hierin
definitionsgemäß, dass
die dadurch näher
bestimmte Sonde in der Größenordnung
von 50.000 (50 kB) oder mehr, bis zu vielen Millionen oder mehreren
Milliarden Basen von Nukleinsäuresequenzen,
die in der Sonde nicht wiederholt sind, enthält. Beispielsweise können typische
erfindungsgemäße Nukleinsäuresonden
hoher Komplexität
eine Komplexität
von größer als
50 kB, größer als
100.000 Basen (100 kB), größer als
200.000 (200 kB), größer als
500.000 Basen (500 kB), größer als eine
Million Basen (1 MB), größer als
2 MB, größer als
10 MB, größer als
100 MB, größer als
500 MB, größer als
1 Milliarde Basen und weiters größer als
mehrere Milliarden Basen aufweisen.
-
Der
Begriff "Komplexität" ist hierin gemäß dem Standard
für die
Nukleinsäure-Komplexität definiert, wie
er von Britten et al., Methods of Enzymol., 29:363 (1974) aufgestellt
wurde. Siehe auch Cantor und Schimmel, Biophysical Chemistry: Part
III: The Behavior of Biological Macromolecules, S. 1228-1230 (Freeman
and Co. 1980) zur weiteren Erklärung
und beispielhaften Darstellung der Nukleinsäure-Komplexität.
-
Die
für eine
erfindungsgemäße Sondenzusammensetzung
bevorzugte Komplexität
hängt von
der Anwendung ab, für
die sie bestimmt ist. Im allgemeinen ist die Sonde umso komplexer,
je größer der
Zielbereich ist. Es ist vorauszusehen, dass die zum Erzeugen eines
gewünschten
Musters von Markierungspunkten auf einem Chromosom notwendige Komplexität einer
Sonde mit zunehmender Hybridisierungsempfindlichkeit entsprechend
den Fortschritten in der Hybridisierungstechnologie abnehmen wird.
Mit zunehmender Empfindlichkeit wird die Zuverlässigkeit des Signals von kleineren
Zielstellen zunehmen. Während
daher gegenwärtig
eine Zielsequenz mit etwa 40 kB bis etwa 100 kB zur Lieferung eines
zuverlässigen,
leicht nachweisbaren Signals notwendig sein kann, sollten zukünftig kleinere
Zielsequenzen zuverlässige
Signale liefern. Daher sollte mit zunehmender Hybridisierungsempfindlichkeit
eine Sonde mit einer bestimmten Komplexität, beispielsweise 100 kB, den
Anwender in die Lage versetzen, beträchtlich mehr Loci in einem
Genom nachzuweisen als derzeit zuverlässig nachgewiesen werden; somit
wird mit einer Sonde derselben Komplexität mehr Information erhalten
werden. Der Begriff "Komplexität" bezieht sich daher
auf die Komplexität
der gesamten Sonde, unabhängig davon,
wie viele visuell unterscheidbare Loci nachgewiesen werden sollen,
das heißt,
unabhängig
von der Verteilung der Zielstellen über das Genom.
-
Wie
oben angedeutet, ist es mit den gegenwärtigen Hybridisierungstechniken
möglich,
ein zuverlässiges,
leicht nachweisbares Signal mit einer Sonde mit etwa 40 kB bis etwa
100 kB (z.B. die Sonden-Insertionskapazität eines oder einiger weniger
Cosmide), die auf einen kompakten Punkt im Genom zielt, zu erhalten. Somit
erlaubt derzeit beispielsweise eine Komplexität im Bereich von ungefähr 100 kB
eine Hybridisierung an beide Seiten einer tumorspezifischen Translokation.
Der auf die eine Seite der Bruchstelle zielende Teil der Sonde kann
verschieden von jenem Teil der Sonde markiert werden, der auf die
andere Seite der Bruchstelle zielt, so dass die zwei Seiten beispielsweise
durch verschiedene Farben differenziert werden können.
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Das
proportionale Erhöhen
der Komplexität
der Sonde erlaubt die gleichzeitige Analyse multipler kompakter
Regionen des Genoms. Die konventionellen, mit chemischen Färbemitteln
erzeugten Bandenmuster können
erfindungsgemäß durch
eine Serie auf Sonden basierender, (beispielsweise) farbcodierter
Referenzpunkte entlang jedes Chromosoms oder signifikanter Regionen
davon ersetzt werden.
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Das
gleichmäßige Färben einer
ausgedehnten, zusammenhängenden
Region eines Genoms, beispielsweise eines ganzen Chromosoms, erfordert
eine Sondenkomplexität,
die der Komplexität
der Zielregion proportional, jedoch wesentlich nedriger als diese
ist. Die benötigte
Komplexität
ist lediglich jene, die für
die Bereitstellung eines zuverlässigen,
im wesentlichen gleichmäßigen Signals
auf dem Ziel notwendig ist. Abschnitt V.B, weiter unten zeigt, dass
für die
Fluoreszenzfärbung
des menschlichen Chromosoms 21, das etwa 50 Megabasen (MB) DNA enthält, eine
Sondenkomplexität
von etwa 1 MB ausreichend ist. 4H veranschaulicht
die Hybridisierung von etwa 400 kB einer Sonde an das menschliche
Chromosom 4, das etwa 200 MB DNA enthält. In diesem Fall sind Lücken zwischen
der Hybridisierung der einzelnen Elemente der Sonde sichtbar. Die 4B und 4F zeigen
die Ergebnisse, welche mit Sonden erzielt wurden, die aus vollständigen Bibliotheken
für die
Chromosomen 4 bzw. 21 bestanden. Wie in den 4B und 4F gezeigt
ist, sind die Chromosomen viel dichter gefärbt als mit der Einzelkopie-Sequenzen
umfassenden Sonde niedrigerer Komplexität, die zur Erzeugung des Musters
von 4H verwendet wurde.
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Eine
Erhöhung
der Komplexität über das
für eine
ausreichende Färbung
benötigte
Minimum hinaus ist nicht nachteilig, solange die Nukleinsäure-Gesamtkonzentration
in der Sonde unter dem Punkt bleibt, wo die Hybridisierung beeinträchtigt wird.
Eine geringere Konzentration eines Teils einer Sequenz in der Sonde
wird durch die Erhöhung
der Zahl der Zielstellen kompensiert. Wenn doppelsträngige Sonden
verwendet werden, ist es tatsächlich
bevorzugt, eine relativ niedrige Konzentration jedes Teils der Sequenz
aufrechtzuerhalten, um die Reassoziation zu inhibieren, bevor der
Teil der Sequenz auf dem Ziel eine Bindungsstelle finden kann.
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Die
erfindungsgemäßen Färbungsmuster
umfassen eine oder mehrere "Banden". Der Begriff "Bande" ist hier definiert
als ein Referenzpunkt in einem Genom, der eine Ziel-Nukleinsäuresequenz,
die an eine Sondenkomponente gebunden ist, umfasst, welcher Doppelstrang
durch bestimmte Indikatormittel nachweisbar ist und in seiner kleinsten
Abmessung unter den angewendeten Bedingungen und Protokollen für die Hybridisierung
und der Instrumentierung, neben anderen Variablen, ein zuverlässiges Signal
liefert. Eine Bande kann sich von der kleinsten Abmessung einer
Sequenz, die ein zuverlässiges
Signal liefert, über
ein ganzes Chromosom bis zu multiplen Regionen auf einer Zahl von
Chromosomen erstrecken.
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Die
erfindungsgemäßen, durch
Sonden erzeugten Banden müssen
von den Banden unterschieden werden, die durch chemische Färbung erzeugt
werden, wie oben im Kapitel Hintergrund dargestellt. Die erfindungsgemäßen, durch
Sonden erzeugten Banden basieren auf Nukleinsäuresequenzen, während die
durch chemische Färbung
erzeugten Banden von natürlichen
Eigenschaften der Chromosomen, jedoch nicht von der tatsächlichen
Nukleinsäuresequenz
abhängen.
Die durch chemische Färbung
erzeugten Bandenmuster sind außerdem
nur für
Metaphasechromosomen interpretierbar, während die erfindungsgemäßen, durch
Sonden erzeugten Banden sowohl für
Metaphase- als auch Interphasechromosomen brauchbar sind.
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Für Vergleichszwecke
wird die Färbung
von Metaphasechromosomen nachstehend diskutiert und dargestellt.
Es ist jedoch ersichtlich, dass die Erfindung das Färben von
Interphase-DNA betrifft.
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Ein
Verfahren zur Bildung der erfindungsgemäßen Sonden besteht darin, viele
verschiedene Sonden niedriger Komplexität zu poolen. Eine solche Sonde
würde dann
ein "heterogenes
Gemisch" einzelner
klonierter Sequenzen umfassen. Die Zahl der erforderlichen Klone
hängt von
der Ausdehnung des Zielbereichs und der Kapazität des Klonierungsvektors ab.
Wenn das Ziel aus mehreren diskreten, kompakten Loci besteht, das heißt, einzelnen
Spots an der Grenze der mikroskopischen Auflösung, dann liefern mit den
gegenwärtigen Techniken
etwa 40 kB, mehr bevorzugt 100 kB, für jeden Spot ein zuverlässiges Signal.
Der Sondenteil für
jeden Spot kann bei spielsweise aus einer einzelnen Einfügungssequenz
aus einem künstlichen
Hefe-Chromosom (YAC),
aus mehreren Cosmiden, von denen jedes 35-40 kB Sondensequenz enthält, oder
aus etwa 25 Plasmiden mit jeweils 4kB Sequenz bestehen.
-
Typische
heterogene Gemische von Klonen, die hierin beispielhaft dargestellt
sind, schließen
Phagen (1, 2 und 3)
und Plasmide (4) ein. Künstliche
Hefe-Chromosomen
(YACS) (5) und ein einzelnes menschliches
Chromosom in einer Interspecies-Hybridzelle (6) sind
Beispiele für
Sonden hoher Komplexität
für einzelne
Loci und ein ganzes Chromosom, welche als Einzelklon vermehrt werden
können.
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Eine
Basensequenz an irgendeinem Punkt des Genoms kann entweder als "Einzelkopie" oder als "repetitiv" klassifiziert werden.
Zu Praxiszwecken muss die Sequenz lang genug sein, so dass unter
den angewendeten Hybridisierungsbedingungen eine komplementäre Sondensequenz
mit der Zielsequenz ein stabiles Hybrid bilden kann. Eine solche
Länge liegt
typischerweise im Bereich von mehreren zehn bis hunderten Nukleotiden.
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Eine "Einzelkopie-Sequenz" liegt vor, wenn
nur eine Kopie der Ziel-Nukleinsäuresequenz
im haploiden Genom vorhanden ist. "Einzelkopie-Sequenzen" sind in der Literatur
auch als "einmalige
Sequenzen" bekannt. Eine "repetitive Sequenz" liegt vor, wenn
mehr als eine Kopie der gleichen Ziel-Nukleinsäuresequenz im Genom vorhanden
ist. Jede Kopie einer repetitiven Sequenz muss nicht identisch mit
allen anderen sein. Das wesentliche Merkmal besteht darin, dass
die Sequenz den anderen Mitgliedern der Familie repetitiver Sequenzen ausreichend ähnlich ist,
so dass unter den angewendeten Hybridisierungsbedingungen dasselbe
Fragment der Sondennukleinsäure
stabile Hybride mit jeder Kopie bilden kann. Eine "gemeinsame repetitive
Sequenz" ist eine
Sequenz mit einigen Kopien in der Zielregion des Genoms und einigen
an anderer Stelle.
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Wenn
die Adjektive "Einzelkopie-", "repetitiv", "gemeinsam repetitiv" – unter anderen solchen näher bestimmenden
Begriffen – verwendet
werden, um Sequenzen in der Sonde zu beschreiben, beziehen sie sich auf
die Art der Sequenz im Zielbereich, an welche die Sondensequenz
binden wird. "Eine
repetitive Sonde" ist daher
eine, die an eine repetitive Sequenz im Zielbereich bindet; und "eine Einzelkopie-Sonde" bindet an eine Einzelkopie-Zielsequenz.
-
Repetitive
Sequenzen treten im haploiden Genom in multiplen Kopien auf. Die
Kopienzahl kann von zwei bis hunderttausenden reichen, wobei die
Alu-Familie repetitiver DNA für
die letztgenannte vielzahlige Art beispielhaft ist. Die Kopien der
Wiederholungssequenzen können
gehäuft
oder über
das Genom gestreut sein. Die Wiederholungssequenzen können an
einer oder mehreren Stellen des Genoms gehäuft sein, beispielsweise repetitive
Sequenzen, die nahe den Zentromeren jedes Chromosoms auftreten,
und Tandem-Wiederholungssequenzen variabler Zahl (VNTRs) [Nakamura
et al., Science, 235:1616 (1987)]; oder die Wiederholungssequenzen
können über ein
einzelnes Chromosom verteilt sein [beispielsweise nur auf dem X-Chromosom vorhandene
Wiederholungssequenzen, wie von Bardoni et al., Cytogenet. Cell
Genet., 46:575 (1987) beschrieben]; oder die Wiederholungssequenzen
sind über
alle Chromosomen verteilt, beispielsweise die Alu-Familie repetitiver
Sequenzen.
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Die
Begriffe repetitive Sequenzen, wiederholte Sequenzen und Wiederholungssequenzen
werden hierin austauschbar verwendet.
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Gemeinsame
repetitive Sequenzen können
gehäuft
oder gestreut sein. Gehäufte
repetitive Sequenzen schließen
Tandem-Wiederholungssequenzen ein, die so genannt werden, weil sie
am DNA-Molekül,
welches das Rückgrat
eines Chromosoms bildet, benachbart sind. Gehäufte Wiederholungssequenzen
sind mit wohldefinierten Regionen eines oder mehrerer Chromosomen
assoziiert, z.B. der Zentromerregion. Wenn eine oder mehrere gehäufte Wiederholungssequenzen
einen beträchtlichen
Anteil eines Chromosoms ausmachen und auch in einer oder mehreren
Nichtziel-Region(en)
des Genoms vorhanden sind und daher aus dem erfindungsgemäß angewendeten
heterogenen Gemisch von Fragmenten entfernt wurden oder deren Hybridisierungsvermögen ausgeschaltet
wurde, kann es sein, dass eine vollkomme ne Gleichmäßigkeit
der Färbung
der Zielregion nicht möglich
ist. Diese Situation wird durch die Verwendung des Begriffes "im wesentlichen gleichmäßig", bezogen auf die
Bindung des heterogenen Gemisches markierter Nukleinsäurefragmente
an das Ziel, ausgedrückt.
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Die
chromosomenspezifische Färbung
der vorliegenden Erfindung wird durch Verwendung von Nukleinsäurefragmenten
erzielt, welche an Sequenzen binden, die spezifisch für das Ziel
sind. Diese Sequenzen können
entweder Einzelkopie- oder repetitive Sequenzen sein, wobei die
Kopien der Wiederholungssequenz überwiegend
im Zielbereich auftreten. 4H und
die Ergebnisse der unten in Abschnitt V näher beschriebenen Arbeit zeigen,
dass Sonden aus Einzelkopie-Sequenzen bestehen können. Bei solchen Sonden wie
jener von 4B können jedoch chromosomenspezifische
Wiederholungssequenzen niedriger Kopienzahl [Nakamura et al. und
Bardoni et al., siehe oben] ebenfalls zur Hybridisierung beitragen.
-
Wenn
Nukleinsäurefragmente,
die zu Nichtziel-Regionen des Genoms komplementär sind, in der Sonde vorhanden
sind, beispielsweise gemeinsame repetitive Sequenzen oder unspezifische
Sequenzen, muss deren Hybridisierungsvermögen ausreichend ausgeschaltet
oder ihre Häufigkeit
ausreichend reduziert werden, damit ein adäquater Färbungskontrast erzielt werden
kann. Abschnitt V und 4H zeigen Hybridisierungsbeispiele
mit Sonden, die Klon-Pools enthalten, bei denen jeder Klon individuell
ausgewählt
wurde, so dass er an Einzelkopie-Sequenzen oder repetitive Sequenzen
sehr niedriger Kopienzahl hybridisiert. Die restlichen Figuren veranschaulichen
die Verwendung von Sonden, die Fragmente enthalten, welche an repetitive Sequenzen
hoher Kopienzahl hybridisieren hätten
können,
bei denen jedoch das Hybridisierungsvermögen solcher Sequenzen ausgeschaltet
worden war.
-
Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden
müssen
nicht absolut spezifisch für
den Zielbereich des Genoms sein. Sie sollen einen "Färbungskontrast" erzeugen. Der "Kontrast" wird durch das Verhältnis der
Färbungsintensität der Zielregion
des Genoms zu jener der anderen Teile des Genoms quantifiziert.
Beispielsweise kann eine durch Klonieren eines speziellen Chromosoms
hergestellte DNA-Bibliothek, wie z.B. die in Tabelle I angeführten Bibliotheken,
als Sonde zum Färben
des ganzen Chromosoms verwendet werden. Die Bibliothek enthält Sequenzen,
die nur auf diesem Chromosom vorhanden sind, und mit anderen Chromosomen gemeinsame
Sequenzen. In einem vereinfachten (ungefähr lebensechten) Modell des
menschlichen Genoms fällt
etwa die Hälfte
der chromosomalen DNA in jede dieser Klassen. Wenn die Hybridisierung
mit der gesamten Bibliothek alle Bindungsstellen absättigen könnte, würde das
Ziel-Chromosom zweimal so hell (Kontrastverhältnis 2) wie die anderen sein,
da es Signale von den spezifischen und den gemeinsamen Sequenzen
der Sonde enthalten würde,
während
das andere Chromosom nur das Signal von den gemeinsamen Sequenzen aufweisen
würde.
Eine mäßige Verringerung
der Hybridisierung der gemeinsamen Sequenzen in der Sonde würde daher
den Kontrast wesentlich erhöhen.
Kontaminierende Sequenzen, die nur an Nichtziel-Sequenzen hybridisieren,
beispielsweise Verunreinigungen in einer Bibliothek, können in
der Sonde bis zu dem Grad toleriert werden, dass diese Sequenzen
nicht den Färbungskontrast
unter ein brauchbares Niveau reduzieren.
-
In
Wirklichkeit kann es sein, dass nicht alle Zielstellen während der
Hybridisierung abgesättigt
werden, und viele andere Mechanismen tragen zur Erzeugung von Färbungskontrast
bei, aber dieses Modell veranschaulicht eine allgemeine Überlegung
bei der Verwendung von Sonden, die auf einen großen Teil eines Genoms zielen.
-
Der
benötigte
Kontrast hängt
von der Anwendung ab, für
welche die Sonde bestimmt ist. Bei mikroskopischer Visualisierung
von Chromosomen und Zellkernen etc. ist ein Kontrastverhältnis von
zwei oder größer zur
Identifizierung ganzer Chromosomen oft ausreichend. In den 4D-F beträgt das Kontrastverhältnis 3-5. Je
kleiner die einzelnen Segmente der Zielregion sind, desto größer muss
der Kontrast sein, um eine zuverlässige Erkennung des Ziels in
Relation zu den Schwankungen der Färbung der Nichtziel-Regionen
zu erlauben. Wenn die in einem Zellkern vorhandene Größe der Zielregion
durch Messungen der Fluoreszenzintensität unter Anwendung von Durchflußzytometrie
oder quantitativer Mikroskopie quantifiziert werden soll, liegt
das benötigte
Kontrastverhältnis
in der Größenordnung
von durchschnittlich 1/T oder größer für das Genom,
wobei T der in der Zielregion enthaltene Anteil des Genoms ist.
Wenn das Kontrastverhältnis
gleich 1/T ist, kommt eine Hälfte
der gesamten Fluoreszenzintensität
von der Zielregion und eine Hälfte
vom restlichen Genom. Wenn beispielsweise eine Sonde hoher Komplexität für Chromosom
1, das etwa 10% des Genoms umfasst, verwendet wird, liegt das benötigte Kontrastverhältnis in
der Größenordnung
von 10, damit die Chromosom 1-Fluoreszenzintensität jener
des restlichen Genoms gleich ist.
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Es
kann sein, dass die Hintergrundfärbung
durch die Sonde, das heißt
auf den Nichtziel-Regionen des Genoms, nicht gleichmäßig ist. 4F zeigt, dass eine für Chromosom 21 spezifische
Sonde Sondenfragmente enthält,
die an kompakte Regionen nahe den Zentromeren anderer akrozentrischer
menschlicher Chromosomen schwach hybridisieren. Dieser Grad an Unspezifität verhindert
nicht ihre Verwendung für
die dargestellten Anwendungen. Für
andere Anwendungen kann die Entfernung oder ein weitergehendes Ausschalten
des Hybridisierungsvermögens
der Sondenfragmente, die an diese Sequenzen binden, notwendig sein.
-
Für andere
Anwendungen können
repetitive Sequenzen, die an Zentromere binden, beispielsweise α-Satellitensequenzen,
und/oder Telomere Teil der chromosomenspezifischen Färbereagenzien
sein, wobei das Ziel einige oder alle Zentromere und/oder Telomere
in einem Genom gemeinsam mit vielleicht anderen chromosomalen Regionen
einschließt.
Dafür typisch
würde eine
solche Anwendung sein, bei der das Färbereagenz so ausgelegt ist,
dass es durch erbsubstanzverändernde
Mittel bewirkte, zufällige
strukturelle Aberrationen, die zu dizentrischen Chromosomen und
anderen strukturellen Anomalien, wie z.B. Translokationen, führen, nachweist.
Die Zugabe von Sequenzen, die an alle Zentromere eines Genoms binden,
beispielsweise zur Sonde, die zur Erzeugung des Färbungsmusters
von 4D verwendet wurde, würde eine
zuverlässigere Unterscheidung
zwischen dizentrischen Chromosomen und Translokationen erlauben.
-
Die
Anwendung der erfindungsgemäßen Färbereagenzien
auf ein Genom führt
zu einer im wesentlichen gleichförmigen
Verteilung der an die Zielregionen eines Genoms hybridisierten Sonde.
Die Verteilung der gebundenen Sonde wird als "im we sentlichen gleichmäßig" angesehen, wenn
die Zielregionen des Genoms mit einem brauchbaren Kontrast visualisiert
werden können.
Beispielsweise ist ein Ziel in dem Fall, wo es eine Serie visuell
getrennter Loci darstellt, im wesentlichen gleichmäßig gefärbt, wenn
der Großteil
der Loci im Großteil
der Zellen sichtbar ist.
-
"Wesentliche Anteile" bedeutet bezogen
auf die Basensequenzen der Nukleinsäurefragmente, die zur chromosomalen
DNA komplementär
sind, dass die Komplementarität
extensiv genug ist, dass die Fragmente unter den angewendeten Hybridisierungsbedingungen
stabile Hybride mit der chromosomalen DNA bilden. Insbesondere umfasst
der Begriff die Situation, wo die Nukleinsäurefragmente des heterogenen
Gemisches einige Sequenzregionen besitzen, die zum chromosomalen
Ziel-Material nicht vollkommen komplementär sind. Die Stringenz kann
eingestellt werden, um die für
die Hybridisierung benötigte
Komplementaritätsgenauigkeit
zu steuern.
-
Der
Ausdruck "Metaphasechromosomen" bedeutet hier definitionsgemäß nicht
nur im Metaphase-Stadium der Mitose kondensierte Chromosomen, sondern
schließt
alle kondensierten Chromosomen ein, beispielsweise jene, die durch
vorzeitige Chromosomenkondensation kondensiert sind.
-
Das
Ausschalten des Hybridisierungsvermögens einer Nukleinsäurensequenz
wird hier manchmal als "Ausschalten
der Nukleinsäuresequenz" abgekürzt.
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
und Reagenzien finden eine besonders zweckmäßige Anwendung auf dem Gebiet
der diagnostischen Zytogenetik, insbesondere auf dem Gebiet der
diagnostischen Interphase-Zytogenetik. Der Nachweis genetischer
Umordnungen, die mit einer Krankheit wie z.B. Krebs assoziiert sind,
stellt eine spezifische Anwendung der erfindungsgemäßen chromosomenspezifischen
Reagenzien und Färbeverfahren
dar.
-
Benachbarte
Gene betreffende Syndrome sind ein Beispiel für die genetischen Umordnungen,
welche die erfindungsgemäßen Sonden
und Verfahren identifizieren können.
Benachbarte Gene betreffende Syndrome sind durch das Vorhandensein mehrerer
eng beisammenliegender Gene charakterisiert, die in multipler und/oder
reduzierter Kopienzahl vorliegen können. Das Down-Syndrom ist
ein Beispiel für
ein benachbarte Gene betreffendes Syndrom, bei dem eine zusätzliche
Kopie einer mehrere Gene enthaltenden Chromosomenregion vorhanden
ist.
-
Insbesondere
ist hierin die Anwendung von chromosomenspezifischen Reagenzien
und Verfahren zum Nachweis genetischer Umordnungen, welche die mit
CML assoziierte BCR-ABL-Fusion erzeugen, beschrieben. Solche Reagenzien
sind beispielhaft für
krankheitsspezifische, in diesem Fall tumorspezifische Sonden, die
direkt und/oder indirekt markiert werden können, so dass sie sichtbar
gemacht werden können, wenn
sie an das chromosomale Ziel-Material, das im Falle von CML der
Nachbarbereich der Translokationsbruchstellen-Regionen der bekanntermaßen mit
CML assoziierten Chromosomenregionen 9q34 und 22q11 ist, gebunden
sind. Bei den in Abschnitt VIII dieser Anmeldung zur Verfügung gestellten
Beispielen werden die Sonden so markiert, dass im Färbungsmuster
dieser Sonden nach In situ-Hybridisierung
[Fluoreszenz-In situ-Hybridisierung (FISH)] eine Zweifarben-Fluoreszenz erzeugt
wird; die Färbungsmuster
können
jedoch in vielen Farben erzeugt werden und andere Arten von Signalen
und alle Visualisierungsmittel, welche die an ihr Ziel gebundene
Sonde anzeigen, können
bei den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden.
-
Abschnitt
VIII beschreibt hierin repräsentative
erfindungsgemäße Verfahren
und Reagenzien zum Nachweis genetischer Umordnungen. Die Beispiele
von Abschnitt VIII betreffen genetische Umordnungen, welche die
für CML
charakteristische BCR-ABL-Fusion
erzeugen. Die Vorgangsweise bei solchen Beispielen basiert auf FISH
mit Sonden aus den Chromosomen 9 und 22, welche die fusionierten
BCR- und ABL-Sequenzen
praktisch bei allen CML-Fällen
flankieren (8). Wenn die Sonden an das
chromosomale Material sowohl normaler als auch anomaler Zellen hybridisiert
werden, erzeugen sie unterschiedliche Färbungsmuster, wie dies in den 8-12 dargestellt
ist. Die durch solche typischen Sonden erzeugten Färbungsmuster unterscheiden
sich in normalen und anomalen Zellen; das Färbungsmuster, das vorliegt,
wenn die genetische Umordnung auftritt, ist gegenüber dem
Färbungsmuster,
das sich durch Hybridisieren der Sonden an chromosomales Material,
welches die genetische Umordnung nicht enthält, zeigt, eindeutig verändert. Außerdem sind Färbungsmuster
für eine
Art von genetischer Umordnung gegenüber einer anderen Art eindeutig
verschieden. Beispielsweise sind die Färbungsmuster, welche nach Hybridisieren
von erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonden
an chromosomales Material, das eine mit ALL assoziierte genetische
Umordnung enthält,
erzeugt werden, eindeutig verschieden von jenen, die nach Hybridisierung
solcher Sonden an chromosomales Material erzeugt werden, das die
für CML
charakteristische BCR-ABL-Fusion enthält. Die erfindungsgemäßen Verfahren und
Reagenzien ermöglichen
daher die Differentialdiagnose verwandter Erkrankungen.
-
Die
Beispiele von Abschnitt VIII ermöglichen
die Diagnose von CML, basierend auf der Nähe der Fluoreszenzsignale in
den Färbungsmustern,
und stützen
sich auf einen Grenzwert von 1 Mikron zur Bestimmung des Vorliegens
einer Fusion. Der Nahabstand der Signale ist nur ein Kennzeichen
der Signale unter vielen anderen, das zum Nachweis des Vorliegens
einer genetischen Umordnung verwendet werden kann. Der Nahabstand
ist außerdem
von den angewendeten speziellen Zellpräparationstechniken und der
Größe der darin
befindlichen Zellkerne abhängig
und ist für
eine spezielle Zellpräparation
relativ, abhängig
vom Abstand zwischen den Signalen in normalen und anomalen Zellen.
-
Die
in den Beispielen von Abschnitt VIII beispielhaft dargestellten
Färbungsmuster
sind für
eine Art der Sondenstrategie repräsentativ. Viele andere Sondenstrategien
können
angewendet werden. 11 veranschaulicht
einige andere beispielhaften Sondenstrategien zum Nachweis genetischer
Umordnungen, deren Muster modifiziert und optimiert und in anderer
Weise variiert werden können,
um spezielle genetische Umordnungen nachzuweisen.
-
Die
Verwendung anderer erfindungsgemäßer krankheitsspezifischer
Reagenzien würde
den in Abschnitt VIII für
CML näher
beschriebenen Verfahren analog sein. Beispielsweise kann die Diagnose
und Untersuchung von akuter lymphatischer Leukämie (ALL) durch Ersetzen der
BCR-Sonde (PEM12) von Abschnitt VIII durch eine Sonde vom 5'-Ende des BCR-Gens
erreicht werden. ALL ist von besonderem Interesse, da das Ph1-Chromosom die häufigste Anomalie bei dieser
Erkrankung ist, und das Vorhandensein eines solchen Chromosoms auf
ein sehr aggressives Neoplasma hinweist.
-
Die
hier insbesondere in Abschnitt VIII beispielhaft dargestellten Verfahren
und Reagenzien stellen die Mittel zu Verfügung, zwischen zytogenetisch ähnlichen,
aber genetisch verschiedenen Erkrankungen zu unterscheiden. "Zytogenetisch" bezieht sich in
diesem speziellen Zusammenhang auf eine Ähnlichkeit, die durch eine
konventionelle Bandenanalyse bestimmt wird. CML und ALL sind in
diesem Zusammenhang dadurch zytogenetisch ähnlich, dass eine konventionelle
Banden-Analyse nicht zwischen ihnen unterscheiden kann, weil die
zugehörigen
Bruchstellen im menschlichen Genom so nahe beisammenliegen.
-
Diese
Erfindung stellt des Weiteren Verfahren und Reagenzien zur Verfügung, die
in der zytogenetischen Forschung als Arbeitsweise zur Untersuchung
der molekularen Grundlagen genetischer Erkrankung verwendet werden
können.
Wenn beispielsweise im Karyotyp einer Person mittels konventioneller
Banden-Analyse eine Anomalie beobachtet wird, können die erfindungsgemäßen Sonden
und Reagenzien verwendet werden, um irgendwelche genetischen Umordnungen
in der Nähe
der Anomalie nachzuweisen. Die der Anomalie zugrunde liegende molekulare
Basis kann durch die erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien
bestimmt werden, und die resultierenden Unterschiede auf der genetischen
Ebene können
Hinweise auf verschiedene Behandlungspläne geben und prognostisch wichtig
sein. Es kann sich zeigen, dass die zugrunde liegenden genetischen
Umordnungen regelmäßig mit
einem Satz phänotypischer
Charakteristiken in einer Population assoziiert sind.
-
Die
folgenden Abschnitte geben Beispiele für die Herstellung und Verwendung
der erfindungsgemäßen Färbezusammensetzungen
und dienen lediglich Veranschaulichungszwecken und sollen die Erfindung
in keiner Weise beschränken.
In der folgenden Beschreibung sind auch Beispiele für das Screening
von Metaphasespreitungen eingeschlossen. Obwohl solche Beispiele
nicht im Bereich der vorliegenden Ansprüche eingeschlossen sind, werden
sie als nützlich
für das
Verständnis
und die Anwendung der vorliegenden Erfindung, welche den Nachweis
von Translokationen in Interphasezellen betrifft, angesehen. Wie
vorstehend aufgezeigt, veranschaulichen die Beispiele Färbeverfahren
für Metaphasechromosomen
und Nachweisverfahren für
genetische Umordnungen, welche von chromosomalen Amplifikationen
und Deletionen verschieden sind. Solche Verfahren werden hierin
jedoch nicht beansprucht.
-
Die
folgenden Abkürzungen
werden verwendet.
-
Abkürzungen
-
- BN
- – Bicarbonat-Puffer mit NP-40
- DAPI
- – 4,6-Diamidino-2-phenylindol
- DCS
- – wie in Fluorescein-Avidin
DCS (eine kommerziell erhältliche
sortierte Qualität
von Fluorescein-Avidin D)
- AAF
- – N-Acetoxy-N-2-acetylaminofluoren
- EDTA
- – Ethylendiamintetraacetat
- FACS
- – Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung
- FITC
- – Fluoresceinisothiocyanat
- IB
- – Isolierungspuffer
- NP-40
- – nichtionisches Detergens,
kommerziell erhältlich
von Sigma als Nonidet P-40 (St. Louis, MO)
- PBS
- – Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
- PI
- – Propidiumiodid
- PMSF
- – Phenylmethylsulfonylfluorid
- PN-Puffer
- – Gemisch von 0,1 M NaH2PO4 und 0,1 M Na2HPO4, pH 8; 0,1%
NP-40
- PNM-Puffer
- – Pn-Puffer plus 5% fettfreie
Trockenmilch (zentrifugiert); 0,02% Na-Azid
- SDS
- – Natriumdodecylsulfat
- SSC
- – 0,15 M NaCl/0,015 M Na-Citrat,
pH 7
- VNTR
- – Tandem-Wiederholungssequenz
variabler Zahl
-
I. Verfahren zur Herstellung chromosomenspezifischer
Färbereagenzien
-
I.A. Isolierung chromosomenspezifischer
DNA und Bildung von DNA-Fragment-Bibliotheken
-
Der
erste Schritt bei einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung der
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
besteht in der Isolierung chromosomenspezifischer DNA (welcher Begriff
wie oben erwähnt zielspezifische
und/oder regionsspezifische DNA beinhaltet, wobei spezifisch sich
auf die Herkunft der DNA bezieht). Dieser Schritt beinhaltet als
erstes das Isolieren einer ausreichenden Menge des speziellen Chromosomentyps
oder der chromosomalen Subregion, auf welche die Färbezusammensetzung
gerichtet ist, dann das Extrahieren der DNA aus dem (den) isolierten
Chromosom(en) oder der (den) chromosomalen Subregion(en). "Ausreichende Menge" bedeutet hier ausreichend,
um die nachfolgenden Schritte des Verfahrens durchzuführen. Die
extrahierte DNA wird vorzugsweise verwendet, um unter Verwendung
gentechnologischer Standardtechniken durch Klonieren eine Bibliothek
von DNA-Einfügungssequenzen
zu erstellen.
-
Bevorzugte
Klonierungsvektoren schließen
künstliche
Hefe-Chromosomen (YACS), Plasmide, Bakteriophagen und Cosmide ein,
sind aber nicht darauf beschränkt.
Bevorzugte Plasmide sind Bluescribe-Plasmide; bevorzugte Bakteriophagen
sind Lambda-Insertionsvektoren, insbesondere Charon 4A, Charon 21A,
Charon 35, Charon 40 und GEM11; und bevorzugte Cosmide schließen Lawrist
4, Lawrist 5 und sCos1 ein.
-
Wie
vorstehend erwähnt,
kann die DNA aus jedem Ausgangsmaterial isoliert sein. Chromosomenspezifische
Färbereagenzien
können
gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
sowohl aus pflanzlicher als auch tierischer DNA hergestellt sein.
Wichtige Quellen für
tierische DNA sind Säuger,
insbesondere Primaten oder Nagetiere, wobei Primatenquellen insbesondere
Mensch und Affe sind und Nagetierquellen insbesondere Ratten oder
Mäuse und
besonders bevorzugt Mäuse
sind.
-
1. Isolieren der DNA von einem ganzen
Chromosom.
-
Ein
bevorzugtes Mittel zur Isolierung bestimmter ganzer Chromosomen
(spezifischer Chromosomentypen) besteht in der direkten Durchflusssortierung
[Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)] von Metaphasechromosomen
mit oder ohne Verwendung interspezifischer Hybridzellsysteme. Bei
einigen Species kann jedes Chromosom durch die gegenwärtig verfügbaren Sortiertechniken
isoliert werden. Die meisten, wenn auch nicht alle menschlichen
Chromosomen sind derzeit mittels Durchflußsortierung aus menschlichen Zellen
isolierbar, Carrano et al., "Measurement
and Purification of Human Chromosomes by Flow Cytometry and Sorting", Proc.Natl. Acad.
Sci., Bd. 76, S. 1382-1384 (1979). Für die Isolierung einiger menschlicher
Chromosomen kann daher die Verwendung des Mensch/Nagetier-Hybridzellsystems
notwendig sein, siehe Kao, "Somatic
Cell Genetics and Gene Mapping," International
Review of Cytology., Bd. 85, S. 109-146 (1983) für eine Übersicht, und Gusella et al., "Isolation and Localization
of DNA Segments from Specific Human Chromosomes," Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 77, S.
2829-2833 (1980). Die Chromosomensortierung kann mit kommerziell
erhältlichen
Fluoreszenz-aktivierten Sortiermaschinen, z.B. Becton Dickinson
FACS-II, Coulter Epics V Sortierer oder für Chromosomensortierung optimierte
Sortierer für
Spezialzwecke oder dergleichen Geräte durchgeführt werden.
-
DNA
wird aus den isolierten Chromosomen mittels Standardtechniken isoliert,
z.B. Marmur, "A
Procedure for the Isolation of Deoxyribonucleic Acid from Micro-Organisms," J. Mol. Biol., Bd.
3, S. 208-218 (1961); oder Maniatis et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laborstory, 1982) S. 280-281.
Diese Referenzdokumente werden bezüglich ihrer Beschreibungen
von DNA-Isolierungstechniken durch
Zitat aufgenommen.
-
Die
Herstellung von Einfügungssequenz-Bibliotheken
aus der isolierten chromosomenspezifischen DNA wird unter Verwendung
gentechnologischer Standardtechniken durchgeführt, z.B. Davies et al., "Cloning of a Representative
Genomic Library of the Human X Chromosome After Sorting by Flow
Cytometry", Nature, Bd.
293, S. 374-376 (1981); Krumlauf et al., "Construction and Characterization of
Genomic Libraries from Specific Human Chromosomes", Proc. Natl. Acad.
Sci., Bd. 79, S. 2971-2975 (1982); Lawn et al., "The Isolation and Characterization of
Linked Delta-and-Beta-Globin
Genes from a Cloned Library of Human DNA." Cell, Bd. 15, S. 1157-1174 (1978);
und Maniatis et al., "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual",
(Cold Springs Harbor Laborstory, 1982), S. 256-308; Van Dills et
al., id.; Fuscoe, Gene, 52:291 (1987); und Fuscoe et al., Cytogenet.
Cell Genet., 43:79 (1986). Diese Referenzdokumente werden hierin
durch Zitat aufgenommen.
-
Bibliotheken
von rekombinanter DNA für
jedes der menschlichen Chromosome sind durch das National Laborstory
Gene Library Project konstruiert worden und sind von der American
Type Culture Collection verfügbar.
[van Dills et al., Biotechnology, 4:537 (1986).] Kleine, Einfügungssequenzen
enthaltende Bibliotheken wurden durch vollständige Verdauung durchflußsortierter
menschlicher genomischer Chromosomen-DNA mit HindIII oder EcoRI
und Klonieren in den Lambda-Insertionsvektor Charon 21A konstruiert.
Der Vektor kann menschliche Einfügungssequenzen
von bis zu 9,1 'kB
Größe aufnehmen.
HindIII-(oder EcoRI-)Restriktionsfragmente größer als 9,1 'kB werden somit aus
diesen Bibliotheken nicht gewonnen werden. Die in diesen Bibliotheken
beobachtete durchschnittliche Größe der Einfügungssequenzen
beträgt
ungefähr
4 kB. Eine repräsentative
Aufstellung der chromosomenspezifischen HindIII-Bibliotheken mit
ihren ATCC-Eingangsnummern ist in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE
1 MENSCHLICHE
CHROMOSOMENSPEZIFISCHE GENOMISCHE BIBLIOTHEKEN IN CHARON 21A VEKTOR
CHROMOSOM | ATCC
NR. | BIBLIOTHEK |
1 | 57753 | LL01NS01 |
1 | 57754 | LL01NS02 |
2 | 57744 | LL02NS01 |
3 | 57751 | LL03NS01 |
4 | 57700 | LL04NS01 |
4 | 57745 | LL04NS02 |
5 | 57746 | LL05NS01 |
6 | 57701 | LL06NS01 |
7 | 57755 | LL07NS01 |
8 | 57702 | LL08NS02 |
9 | 57703 | LL09NS01 |
10 | 57736 | LL10NS01 |
11 | 57704 | LL11NS01 |
12 | 57756 | LL12NS01 |
13 | 57705 | LL13NS01 |
13 | 57757 | LL13NS02 |
14 | 57706 | LL14NS01 |
14/15 | 57707 | LL99NS01 |
15 | 57737 | LL15NS01 |
16 | 57758 | LL16NS03 |
17 | 57759 | LL17NS02 |
18 | 57710 | LL18NS01 |
19 | 57711 | LL19NS01 |
20 | 57712 | LL20NS01 |
21 | 57713 | LL21NS02 |
22 | 57714 | LL22NS01 |
X | 57747 | LL0XNS01 |
Y | 57715 | LL0YNS01 |
-
Alternativ
dazu kann anstatt des Klonierens der extrahierten DNA in einem Vektor
oder Anzüchten
in einer Ziellinie die aus einem sortierten Chromosomentyp extrahierte
DNA mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden.
Bei der Vorbereitung für
die PCR werden an die extrahierte DNA geeignete Schwänze angefügt. Literaturzitate
für solche
PCR-Methoden sind nachstehend in Abschnitt I.B angeführt.
-
Andere
mögliche
Verfahren zur Isolierung der gewünschten
Sequenzen aus Hybridzellen schließen jene von Schmeckpeper et
al., "Partial Purification
and Characterization of DNA from Human X Chromosome", Proc. Natl. Acad.
Sci., Bd. 76, S. 6525-6528
(1979) oder Olsen et al., siehe oben (im Kapitel Hintergrund) ein. Entsprechend
sind diese Referenzdokumente hierin durch Zitat aufgenommen.
-
2. Isolierung von DNA aus einem Teil eines
Chromosoms.
-
Zu
den Verfahren, die zur Isolierung regionsspezifischer chromosomaler
DNA verwendet werden können,
zählen:
die Selektion einer geeigneten chromosomalen Region aus DNA, die
vorher kartiert worden ist, beispielsweise aus einer Bibliothek
kartierter Cosmide; das Sortieren von Derivat-Chromosomen, beispielsweise
durch FACS; die Mikrodissektion von selektiertem chromosomalem Material;
subtraktive Hybridisierung; Identifizierung einer geeigneten Hybridzelle,
die ein gewünschtes
Chromosomenfragment enthält,
Extrahieren und Amplifizieren der DNA und Selektieren der gewünschten
amplifizierten DNA; und die Selektion geeigneten chromosomalen Materials
aus Strahlungshybriden. Die vorstehend im Unterabschnitt I.A.1 skizzierten
gentechnologischen Standardtechniken werden bei solchen, dem Fachmann
wohlbekannten Methoden verwendet. Die Amplifizierung der regionsspezifischen
DNA kann durch Klonieren in einem geeigneten Vektor, Vermehrung
in einer geeigneten Ziellinie und/oder durch die Verwendung von
PCR (siehe I.B unten) durchgeführt werden.
-
Ein
bevorzugtes Verfahren zur Isolierung chromosomaler regionsspezifischer
DNA besteht in der Verwendung kartierter kurzer DNA-Sequenzen, um
eine Bibliothek längerer
DNA-Sequenzen zu sondieren, wobei die letztgenannte Bibliothek üblicherweise
in einem unterschiedlichen Vektor kloniert worden ist. Beispielsweise
kann eine in einem Plasmid klonierte Sonde dazu verwendet werden,
eine Cosmid- oder Künstliche-Hefechromosom-(YAC)-Bibliothek
zu sondieren. Durch Verwendung einer initialen Startsonde können überlappende
Klone in der Bibliothek mit den größeren Einfügungssequenzen gefunden werden
(ein "Walking" genanntes Verfahren),
und eine Sonde mit höherer
Komplexität
für die
zuverlässige
Färbung
der die Startsonde umgebenden chromosomalen Region kann hergestellt
werden. Wenn letztendlich ein gesamtes Genom für eine Species kartiert worden
ist (beispielsweise das Human Genom Project für die menschliche Species),
werden geordnete Klone für
das gesamte Genom der Species verfügbar sein. Man kann dann leicht
die geeigneten Klone auswählen,
um eine Sonde mit der gewünschten
Spezifität
zu bilden.
-
Ein
anderes Verfahren zur Isolierung von DNA aus einer chromosomalen
Region oder chromosomalen Regionen (oder auch einem ganzen Chromosom)
besteht darin, eine solche chromosomale Region oder solche chromosomalen
Regionen in einer geeigneten Ziellinie (beispielsweise einer Hybridzelllinie,
wie z.B. einer Mensch/Hamster-Hybridzellinie) zu vermehren, die
DNA aus der Ziellinie zu extrahieren und sie in einem geeigneten
Vektor zu klonieren und menschliche DNA enthaltende Klone zu selektieren,
um eine Bibliothek zu bilden. Wenn eine Hybridzelle verwendet wird,
können
die Chromosomen in der Hybridzelle, welche das menschliche chromosomale
Material enthalten, mittels Durchflusssortierung (FACS) vor dem
Klonieren abgetrennt werden, um die Häufigkeit menschlicher Klone
in der Bibliothek zu erhöhen.
Ferner kann die gesamte DNA ohne weiteres Klonieren aus der Hybridzelle
isoliert und markiert und als Sonde verwendet werden, wie dies in 6 beispielhaft
dargestellt ist.
-
3. Einzelsträngige Sonden.
-
In
manchen Fällen
ist es bevorzugt, dass die Nukleinsäurefragmente des heterogenen
Gemisches aus einzelsträngiger
RNA oder DNA bestehen. Es ist festgestellt worden, dass unter manchen
Bedingungen die Bindungseffizienz von einzelsträngigen Nukleinsäuresonden
während
In situ-Hybridisierung höher
ist, z.B. Cox et al., "Detection
of mRNAs in Sea Urchin Embryos by In Situ Hybridization Using Asymmetric
RNA Probes", Developmental
Biologe, Bd. 101, S. 485-502 (1984).
-
Zur
Herstellung von RNA-Fragmenten von isolierten DNA-Fragmenten werden
Standardverfahren verwendet. Beispielsweise ist ein von Green et
al. entwickeltes, in Cell, Bd. 32, S. 681-694 (1983) beschriebenes Verfahren
unter dem Warenzeichen "Riboprobe" von Promega Biotec
(Madison, WI) kommerziell erhältlich. Andere
zur Verwendung für
die vorliegende Erfindung geeignete Transkriptionskits sind von
der United States Biochemical Corporation (Cleveland, OH) unter
dem Warenzeichen "Genescribe" erhältlich.
Einzelsträngige DNA-Sonden
können
mit dem einzelsträngigen
Bakteriophagen M13, der auch in Form eines Kits, z.B. von Bethesda
Research Laboratories (Gathersburg, MD) erhältlich ist, hergestellt werden.
Die in 4 dargestellten Hybridisierungen
wurden mit den in den Bluescribe-Plasmidvektor (Stratagene, La Jolla,
CA) subklonierten Bibliotheken von Tabelle 1 durchgeführt. Das
Bluescribe-Plasmid enthält
RNA-Promotoren, welche die Herstellung einzelsträngiger Sonden erlauben.
-
Der
nachstehende Abschnitt IX stellt Verfahren zur Herstellung und Anwendung
von nicht-selbstkomplementären
einzelsträngigen
Nukleinsäuresonden
zur Verfügung,
welche das bei In situ-Hybridisierung erreichbare Signal-Rauschverhältnis durch
Reduzieren der unspezifischen und fehlgepaarten Bindung der Sonde
verbessern. Dieser Abschnitt stellt weiters Verfahren zur Denaturierung
doppelsträngiger
Ziel-Nukleinsäure zur
Verfügung,
welche einzelsträngige,
für die
Hybridisierung verfügbare
Regionen, die nichtkomplementär
zu Sondensequenzen sind, auf ein Minimum reduzieren. Kurz gesagt,
wird die Sonde konstruiert, indem die DNA mit einem Restriktionsenzym
und einer Exonuklease behandelt wird, um Vorlagen/Primer für eine DNA-Polymerase
zu bilden. Der verdaute Strang wird in Gegenwart von markiertem
Nukleosidtriphosphat-Vorläufer
neu synthetisiert, und die markierten einzelsträngigen Fragmente werden von
den neu synthetisierten Fragmenten abgetrennt, um die Sonde zu bilden.
Die Ziel-Nukleinsäure
wird mit demselben Restriktionsenzym, das zur Konstruktion der Sonde
benutzt wird, behandelt und wird vor Applikation der Sonde mit einer
Exonuklease behandelt.
-
I.B. PCR
-
Ein
weiteres Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Sonden beinhaltet die Verwendung
der Polymerase-Kettenreaktion [PCR]. [Für eine Erklärung des Mechanismus der PCR,
siehe Saiki et al., Science, 230:1350 (1985) und
US-Patente Nr. 4,683,195 ,
4,683,202 (beide erteilt
am 28. Juli 1987) und
4,800,159 (erteilt
am 24. Jänner
1989)]. Zielspezifische Nukleinsäuresequenzen,
die wie oben dargestellt iso liert wurden, können mit PCR amplifiziert werden,
um zielspezifische Sequenzen herzustellen, die vermindert an oder
frei von repetitiven Sequenzen sind. Die für eine solche Methode verwendeten
PCR-Primer sind auf die Enden der repetitiven Sequenzen gerichtet,
wodurch eine Amplifikation von Sequenzen erfolgt, welche von den
Wiederholungssequenzen flankiert sind.
-
7 veranschaulicht
ein solches Verfahren unter Verwendung der PCR, wobei die repräsentative
repetitive Sequenz Alu ist. Wenn nur kurze Segmente amplifiziert
werden, ist es wahrscheinlich, dass solche Sequenzen frei von anderen
Wiederholungssequenzen sind, so dass eine an repetitiven Sequenzen
verminderte DNA zur Verfügung
gestellt wird.
-
Man
kann die Erzeugung repetitiver Sequenzen bei einer solchen PCR-Methode
weiter unterdrücken, indem
zuerst komplementäre
Sequenzen an die repetitive Sequenz anhybridisiert werden, wobei
die komplementären
Sequenzen erweiterte nichtkomplementäre flankierende Enden aufweisen
oder terminale Nukleotide besitzen, die keine Verlängerung
durch die Polymerase zulassen. Die nichtkomplementären Enden
der Blockierungssequenzen hindern die Blockierungssequenzen daran,
während
des PCR-Verfahrens als PCR-Primer zu fungieren.
-
II. Entfernung repetitiver Sequenzen und/oder
Ausschalten des Hybridisierungsvermögens repetitiver Sequenzen
-
Eine
erfindungsgemäße Sonde
wird typischerweise in einer Reihe von Schritten hergestellt, welche einschließen: Gewinnen
der Ausgangsnukleinsäuresequenzen,
die zur Zielregion des Genoms komplementär sind, Markieren und anderweitiges
Bearbeiten dieser, so dass sie effizient an das Ziel hybridisieren
werden und nach deren Binden nachgewiesen werden können und
Behandlung dieser, um entweder die Hybridisierungskapazität auszuschalten
oder einen ausreichenden Teil der gemeinsamen repetitiven Sequenzen
zu entfernen oder solche Sequenzen sowohl auszu schalten als auch
zu entfernen. Die Reihenfolge dieser Schritte ist von den spezifischen
angewendeten Methoden abhängig.
-
Die
folgenden Verfahren können
verwendet werden, um gemeinsame repetitive Sequenzen zu entfernen
und/oder das Hybridisierungsvermögen
solcher gemeinsamer repetitiver Sequenzen auszuschalten. Solche
Verfahren sind repräsentativ
und werden schematisch in Form von dem Fachmann wohlbekannten Methoden
dargestellt und können
gemäß dem Fachmann
wohlbekannten Parametern und Methoden modifiziert und erweitert
werden.
-
1. Einzelkopie-Sonden.
-
Eine
Einzelkopie-Sonde besteht aus Nukleinsäurefragmenten, die komplementär zu Einzelkopie-Sequenzen
sind, welche in der Zielregion des Genoms enthalten sind. Ein Verfahren
zur Konstruktion einer solchen Sonde besteht darin, mit einer DNA-Bibliothek, die durch
Klonieren der Zielregion hergestellt wurde, zu beginnen. Einige
der Klone der Bibliothek werden DNA enthalten, deren gesamte Sequenz
eine Einzelkopie darstellt; andere werden repetitive Sequenzen enthalten;
und wieder andere werden Teile mit Einzelkopie-Sequenzen und repetitiven
Sequenzen aufweisen. Eine Selektion auf Klon-für-Klon-Basis und das Poolen
jener Klone, die nur Einzelkopie-Sequenzen
enthalten, wird zu einer Sonde führen,
die spezifisch an die Zielregion hybridisiert. Die Einzelkopie-Natur
eines Klons kann schließlich
durch Southern-Hybridisierung
unter Verwendung von Standardtechniken bewiesen werden. 4H zeigt eine Hybridisierung mit 120 Klonen, die
auf diese Weise aus einer Chromosom 4-Bibliothek selektiert wurden.
-
Eine
Southern-Analyse ist sehr zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Daher
sind weniger vollkommene, aber effizientere Screening-Verfahren
zur Gewinnung von Kandidaten von Einzelkopie-Klonen nützlich.
In Abschnitt V.B werden Beispiele für verbesserte Verfahren zum
Screening individueller Phagen- und Plasmid-Klone auf das Vorhandensein
repetitiver DNA unter Verwendung von Hybridisierung mit genomischer
DNA gegeben. Das Screening der Plasmid-Klone ist effizienter, und
ungefähr
80% der selektierten Klone enthalten lediglich Einzelkopie-Sequenzen;
der Rest ent hält
Wiederholungssequenzen niedriger Kopienzahl. Die so produzierten
Sonden können
jedoch einen adäquaten
Färbungskontrast
erzeugen, was darauf hinweist, dass die repetitiven Sequenzen niedriger
Kopienzahl in der Sonde toleriert werden können (siehe Unterabschnitt
3 diese Abschnitts).
-
Ein
Nachteil der Klon-für-Klon-Methoden
besteht darin, dass ein Klon auch verworfen wird, wenn nur ein Teil
der darin enthaltenen Sequenz repetitiv ist. Je größer die
Länge der
klonierten Nukleinsäure
ist, desto größer ist
die Chance, dass sie eine repetitive Sequenz enthalten wird. Wenn
daher Nukleinsäure
in einem Vektor, der große
Einfügungssequenzen
aufweist, wie z.B. ein Cosmid, YAC oder in einer Ziellinie, wie
z.B. Hybridzellen, vermehrt wird, kann es vorteilhaft sein, sie
in kleineren Stücken
subzuklonieren, bevor die Einzelkopie-Selektion durchgeführt wird.
Die oben gerade skizzierten Selektionsmethoden unterscheiden nicht zwischen
gemeinsamen und spezifischen repetitiven Sequenzen; Klone mit nachweisbaren
repetitiven Sequenzen jedes Typs werden in der Sonde nicht verwendet.
-
2. Individuelles Testen der Hybridisierungseigenschaften.
-
Die
Hybridisierungsspezifität
eines Stücks
Nukleinsäure,
beispielsweise eines Klons, kann durch In situ-Hybridisierung getestet
werden. Wenn es unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an Einzelkopie- oder
repetitive Sequenzen bindet, die spezifisch für die gewünschte Zielregion sind, kann
es in die Sonde aufgenommen werden. Viele Sequenzen mit spezifischen
Hybridisierungseigenschaften sind bereits bekannt, wie z.B. chromosomenspezifische
repetitive Sequenzen [Trask et al., siehe oben, (1988) und die dort
zitierten Literaturstellen], VNTRs, zahlreiche kartierte Einzelkopie-Sequenzen.
Weitere werden kontinuierlich kartiert. Solche Sequenzen können in
einer erfindungsgemäßen Sonde
enthalten sein.
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3. Bulk-Methoden.
-
In
vielen Genomen, wie z.B. dem menschlichen Genom, ist ein Großteil der
gemeinsamen repetitiven DNA in wenigen Familien von hochwiederholten
Sequenzen, wie z.B. Alu, enthalten. Eine Sonde, die im wesentlichen
frei von solchen repetitiven Sequenzen hoher Kopienzahl ist, erzeugt
bei vielen Anwendungen einen brauchbaren Färbungskontrast. Eine solche
Sonde kann aus einer Nukleinsäuresequenz-Quelle,
beispielsweise den Bibliotheken von Tabelle I, mit relativ einfachen
Bulk-Methoden hergestellt werden. Solche Bulk-Methoden sind daher
die bevorzugten Verfahren für
solche Anwendungen.
-
Diese
Verfahren nützen
hauptsächlich
die Tatsache, dass die Hybridisierungsgeschwindigkeit von komplementären Nukleinsäuresträngen bei
Zunahme ihrer Konzentration zunimmt. Wenn somit ein heterogenes
Gemisch der Nukleinsäurefragmente
denaturiert und unter Bedingungen, die eine Hybridisierung zulassen,
inkubiert wird, werden die in hoher Konzentration vorhanden Sequenzen
rascher Doppelstränge
bilden als die anderen. Die doppelsträngige Nukleinsäure kann
dann entfernt werden, und der Rest kann als Sonde verwendet werden.
Alternativ dazu kann das partiell hybridisierte Gemisch als Sonde
verwendet werden, wobei die doppelsträngigen Sequenzen nicht an das
Ziel binden können.
Die folgenden Verfahren sind repräsentativ für Bulk-Methoden, die zur Erzeugung
der erfindungsgemäßen zielspezifischen
Färbung
brauchbar sind.
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3a. Selbst-Reassoziation der Sonde.
-
Die
doppelsträngige
Sonden-Nukleinsäure
im Hybridisierungsgemisch wird denaturiert und dann unter Hybridisierungsbedingungen
für eine
Zeit inkubiert, die ausreicht, dass die Sequenzen hoher Kopienzahl
in der Sonde im wesentlichen Doppelstränge ausbilden. Dann wird das
Hybridisierungsgemisch auf die Probe appliziert. Die restlichen
markierten einzelsträngigen
Kopien der hochwiederholten Sequenzen binden über die gesamte Probe verteilt,
wobei ein schwaches, breit gestreutes Signal erzeugt wird. Die Bindung
der vielfach vorhandenen, für
die Zielregion des Genoms spezifischen Sequenzen niedriger Kopienzahl
erzeugt ein leicht unterscheidbares spezifisches Signal.
-
Ein
solches Verfahren ist in Abschnitt VI.B (unten) mit chromosomenspezifischen
Bibliotheken für
die Chromosomen 4 und 21 (pBS4 und pBS21) als Sonden für diese
Chromosomen beispielhaft dargestellt. [Pinkel et al., PNAS (USA),
85:9138-9142 (Dezember 1988)]. Das Hybridisierungsgemisch, welches
eine Sonden- Konzentration
im Bereich von 1-10 ng/ul enthielt, wurde vor Applikation auf die
Probe zur Denaturierung der Sonde erhitzt und 24 Stunden bei 37°C inkubiert.
-
3b. Verwendung von blockierender Nukleinsäure.
-
Unmarkierte
Nukleinsäuresequenzen,
die zu jenen Sequenzen in der Sonde komplementär sind, deren Hybridisierungsvermögen inhibiert
werden soll, werden dem Hybridisierungsgemisch hinzugefügt. Die Sonde
und die blockierende Nukleinsäure
werden -falls notwendig – denaturiert
und unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen inkubiert. Die zu
blockierenden Sequenzen bilden rascher Doppelstränge aus als die anderen und
können
daher nicht an das Ziel binden, wenn das Hybridisierungsgemisch
auf das Ziel appliziert wird. In manchen Fällen tritt die Blockierreaktion
so rasch ein, dass der Inkubationszeitraum sehr kurz sein kann,
und adäquate
Ergebnisse können
erhalten werden, wenn das Hybridisierungsgemisch unmittelbar nach der
Denaturierung auf das Ziel appliziert wird. Ein Blockierverfahren
wird von Sealy et al., "Removal
of Repeat Sequences from Hybridization Probes", Nucleic Acid Research, 13:1905 (1985)
allgemein beschrieben. Beispiele für blockierende Nukleinsäuren sind
genomische DNA, eine Fraktion genomischer DNA mit hoher Kopienzahl
und spezielle Sequenzen, wie sie nachstehend angeführt sind
(i-iii).
-
3b.i. Genomische DNA.
-
Genomische
DNA enthält
alle Nukleinsäuresequenzen
des Organismus im Verhältnis
ihrer Kopienzahl im Genom. Das Hinzufügen genomischer DNA zum Hybridisierungsgemisch
erhöht
daher die Konzentration der Wiederholungssequenzen hoher Kopienzahl
stärker
als jene von Sequenzen niedriger Kopienzahl und ist daher für das Blockieren
der erstgenannten wirksamer. Die genomische DNA enthält jedoch
Kopien der Sequenzen, die für
das Ziel spezifisch sind, und wird daher auch die gewünschte chromosomenspezifische
Bindung verringern, falls zu viel davon hinzugefügt wird. Richtlinien zur Bestimmung,
wie viel genomische DNA zugesetzt werden soll (siehe nachstehend
3.e. Das Q-Konzept) und Beispiele für die Verwendung genomischer
blockierender DNA werden nachstehend gegeben. Die blockierende Wirksamkeit
genomischer DNA kann unter manchen Bedingungen durch Einstellung
des Zeitpunkts ihrer Zugabe zum Hybridisierungsgemisch erhöht werden;
Beispiele für solche
Zeitpunkt-Einstellungen werden mit den Protokoll I- und Protokoll II-Hybridisierungen
gegeben, die nachstehend in den 4B bis
E (Protokoll I) und in 4F (Protokoll
II) dargestellt und in Abschnitt VI detailliert beschrieben sind.
-
3b.ii. Fraktion genomischer DNA mit hoher
Kopienzahl.
-
Die
Schwierigkeit bei der Verwendung genomischer DNA besteht darin,
dass sie auch die Hybridisierung der Sequenzen niedriger Kopienzahl
blockiert, welche überwiegend
jene Sequenzen sind, die die gewünschte
Ziel-Färbung
liefern. Eine Fraktionierung der genomischen DNA, um nur die Sequenzen
hoher Kopienzahl zu erhalten, und deren Verwendung für die Blockierung überwindet
daher diese Schwierigkeit. Eine solche Fraktionierung kann beispielsweise,
wie nachstehend beschrieben (3c.i) mit Hydroxyapatit durchgeführt werden.
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3b.iii. Spezifizierte Sequenzen.
-
Das
Blockieren einer speziellen Sequenz in der Sonde kann durch Zugabe
vieler unmarkierter Kopien dieser Sequenz erreicht werden. Beispielsweise
können
Alu-Sequenzen in
der Sonde durch Zugabe kionierter Alu-DNA blockiert werden. Blockierende
DNA, die aus einem Gemisch weniger Klone besteht, welche die Sequenzen
mit der höchsten
Kopienzahl im menschlichen Genom enthalten, kann wirkungsvoll mit
chromosomenspezifischen Bibliotheken, beispielsweise jenen von Tabelle
I verwendet werden. Alternativ dazu könnten unmarkierte Nukleinsäuresequenzen
aus einer oder mehreren chromosomenspezifischen Bibliotheken verwendet
werden, um eine Sonde zu blockieren, welche markierte Sequenzen
aus einer oder mehreren anderen chromosomenspezifischen Bibliotheken
enthält.
Die gemeinsamen Sequenzen würden
blockiert werden, während
die nur auf dem Ziel-Chromosom vorhandenen Sequenzen unbeeinflusst
bleiben würden. 4F zeigt, dass genomische DNA die Hybridisierung
einer Sequenz oder von Sequenzen, die dem menschlichen Chromosom
21 und den Zentromer-Regionen der anderen menschlichen akrozentrischen
Chromosomen gemeinsam sind, nicht vollständig blockierte. Wenn ein Klon
oder Klone, welche(r) eine solche Sequenz oder Sequenzen enthält (enthalten),
schließlich
isoliert wird (werden), könnte
daraus hergestellte unmarkierte DNA der genomischen blockierenden
DNA zugegeben werden, um die Spezifität der Färbung zu erhöhen.
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3c. Entfernung von Sequenzen.
-
3c.i. Hydroxyapatit.
-
Einzel-
und doppelsträngige
Nukleinsäuren
weisen gegenüber
Hydroxyapatit unterschiedliche Bindungseigenschaften auf. Solche
Eigenschaften liefern eine Grundlage, die üblicherweise für die Fraktionierung von
Nukleinsäuren
genutzt wird. Hydroxyapatit ist kommerziell erhältlich (z.B. Bio-Rad Laborstories,
Richmond, CA). Die Fraktion genomischer DNA, welche Sequenzen mit
einem speziellen Repetitionsgrad – von der höchsten Kopienzahl bis zur Einzelkopie – enthält, kann
durch Denaturieren genomischer DNA, Reassoziieren lassen unter geeigneten
Bedingungen bis zu einem bestimmten Wert von C0t,
gefolgt von der Abtrennung unter Verwendung von Hydroxyapatit gewonnen
werden. Die einzel- und doppelsträngige Nukleinsäure kann
auch durch Verwendung von S1-Nuklease getrennt werden. Solche Techniken
und das C0t-Konzept sind in Britten et al., "Analysis of Repeating
DNA Sequences by Reassociation",
in Methods in Enzymology, Bd. 29, S. 363-418 (1974) beschrieben.
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Die
oben gemäß 3a. oder
3b. hergestellte einzelsträngige
Nukleinsäurefraktion
kann mit Hydroxyapatit getrennt und als Sonde verwendet werden.
Die Sequenzen, welche blockiert worden sind (welche einen Doppelstrang
bilden), werden so physisch entfernt. Die Sonde kann dann bis zu
ihrer Verwendung gelagert werden. Die Sonde kann dann ohne weitere
blockierende Nukleinsäure
verwendet werden, oder es kann deren Färbungskontrast eventuell durch
zusätzliches
Blockieren verbessert werden.
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3c.ii. Reaktion mit immobilisierter Nukleinsäure.
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Die
Entfernung bestimmter Sequenzen kann auch durch Anheften von einzelsträngigen "absorbierenden" Nukleinsäuresequenzen
auf einem festen Träger
erreicht werden. Einzelsträngige
Ausgangsnukleinsäure wird
an die immobilisierte Nukleinsäure
hybridisiert. Nach der Hybridisierung werden die nicht gebundenen
Sequenzen gesammelt und als Sonde verwendet. Beispielsweise kann
menschliche genomische DNA verwendet werden, um repetitive Sequenzen
aus menschlichen Sonden zu ab sorbieren. Ein solches Verfahren ist
von Brison et al., "General
Method for Cloning Amplified DNA by Differential Screening with
Genomic Probes",
Molecular and Cellular Biologe, Bd. 2, S. 578-587 (1982) beschrieben.
Kurz gesagt, wird die einer minimalen Scherwirkung ausgesetzt gewesene
menschliche genomische DNA an Diazonium-Cellulose oder einen gleichartigen
Träger
gebunden. Die zweckmäßig zu Fragmenten
zerschnittene Ausgangs-DNA wird an die immobilisierte DNA bei C0t-Werten
im Bereich von etwa 1 bis 100 hybridisiert. Die bevorzugte Stringenz
der Hybridisierungsbedingungen kann in Abhängigkeit von der Basenzusammensetzung
der DNA variieren. Eine solche Methode könnte repetitive Sequenzen aus
chromosomenspezifischen Bibliotheken, beispielsweise jenen von Tabelle
I entfernen, um eine Sonde herzustellen, die ein ganzes menschliches
Chromosom färben
kann.
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3d. Blockieren von Nichtziel-Sequenzen
im Ziel-Genom.
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Das
Blockieren von Nichtziel-Bindungsstellen im Ziel-Genom durch Hybridisierung
mit unmarkierten komplementären
Sequenzen wird das Binden von markierten Sequenzen in der Sonde,
welche das Potential zur Bindung an diese Stellen besitzen, verhindern.
Beispielsweise wird eine Hybridisierung mit unmarkierter genomischer
DNA die repetitiven Sequenzen hoher Kopienzahl im Ziel-Genom in
Doppelstränge überführen. Wenn
die Sonde anschließend
appliziert wird, werden markierte Kopien solcher Sequenzen in der
Sonde nicht binden können.
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In
der Praxis ist für
die Erzeugung des Färbungskontrastes
eine Kombination mehrerer Mechanismen verantwortlich. Wenn beispielsweise – wie vorstehend
in 3b – der
Sonde blockierende DNA zugesetzt wird, kann jene, die noch einzelsträngig ist,
wenn die Sonde auf das Ziel appliziert wird, an die Zielsequenzen
binden und diese blockieren. Wenn die Inkubation der Sonde mit der
blockierenden DNA minimal ist, dann blockiert die genomische DNA
die Sonde und konkurriert gleichzeitig mit der Sonde um Bindungsstellen
auf dem Ziel.
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3e. Das Q-Konzept.
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Wie
vorstehend in Abschnitt 3b.i erwähnt,
ist es notwendig, die richtige Menge an genomischer DNA zuzusetzen,
um den besten Kompromiss zwischen der Inhibierung des Hybridisierungsvermögens von
Wiederholungssequenzen hoher Kopienzahl in der Sonde und der Verminderung
der Intensität
des gewünschten Signals
durch die Inhibierung der Bindung der zielspezifischen Sequenzen
zu erzielen. Die folgende Diskussion betrifft die Verwendung genomischer
blockierender DNA mit Sonden, welche durch Klonierung oder andere Replikation
von DNA-Bereichen aus der Zielregion des Genoms hergestellt sind.
Die Sonde enthält
daher eine repräsentative
Auswahl der im Ziel vorhandenen Einzelkopie-Sequenzen, chromosomenspezifischen
repetitiven Sequenzen und gemeinsamen repetitiven Sequenzen. Die
Komplexität
einer solchen Sonde könnte
im Bereich von 100 kB Sequenz, abgeleitet von einer kleinen Region
des Genoms, beispielsweise mehreren eng benachbarten Cosmid-Klonen,
bis zu vielen Millionen Basen, beispielsweise einer Kombination
multipler Bibliotheken von Tabelle 1 reichen. Die nachstehend geführte Diskussion
dient der Erläuterung
und kann auf andere Situationen ausgedehnt werden, wo unterschiedliche
blockierende Nukleinsäuren
verwendet werden. Die folgende Diskussion über Q ist lediglich darauf
hin ausgelegt, allgemeine Richtlinien zur Vorgangsweise zu geben.
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Die
Zugabe einer unmarkierten genomischen DNA zu einem Hybridisierungsgemisch,
das markierte Sondensequenzen enthält, erhöht die Konzentration der gesamten
Sequenzen, erhöht
jedoch die Konzentration der gemeinsamen Sequenzen um einen größeren Faktor
als die Konzentration der zielspezifischen Sequenzen, da die gemeinsamen
Sequenzen im Gegensatz zu den zielspezifischen Sequenzen auch an
anderen Stellen im Genom vorhanden sind. Die Reassoziation der gemeinsamen
Sequenzen wird somit in bevorzugter Weise erhöht, so dass die Hybridisierung
der markierten Kopien der gemeinsamen Sequenzen an das Ziel in bevorzugter
Weise inhibiert wird.
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Um
dieses Konzept zu quantifizieren, betrachten wir als als erstes
eine der Sequenzen, sei es eine Einzelkopie-Sequenz oder eine Wiederholungssequenz,
die spezifisch an das i-te Chromosom bindet, in einem Hybridisierungsgemisch,
das eine Masse mp von Sonden-DNA aus der
i-ten-Chromosomen-Bibliothek von Tabelle 1 (als Beispiel) und eine
Masse mb von unmarkierter genomischer DNA
enthält.
Die Zahl markierter Kopien der Sequenz ist proportional zu mp. Die Zahl unmarkierter Kopien ist jedoch
proportional zu fimb,
worin fi die auf dem i-ten Chromosom enthaltene
Fraktion genomischer DNA bedeutet. Das Verhältnis von unmarkierten zu markierten
Kopien jeder der für
das Ziel-Chromosom spezifischen Sequenzen ist daher fimb/mp, welches hier
als Q definiert ist. Für
normale menschliche Chromosomen gilt: 0,016 ≤ fi ≤ 0,08 [Mendelsohn
et al., Science, 179:1126 (1973)]. Für repräsentative, in Abschnitt VI.B
(unten) beschriebene Beispiele: f4 = 0,066
und f21 = 0,016. Für eine Sonde, die auf eine
Region mit L Basenpaaren zielt: fi = L/G,
worin G die Zahl der Basenpaare in einem Genom (ungefähr 3 × 109 Basen bei Menschen und anderen Säugern) bedeutet.
Somit gilt: Q = (L/G) (mb/mp).
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Nun
betrachten wir eine gemeinsame Sequenz, die mehr oder weniger gleichmäßig über das
Genom verteilt ist, beispielsweise Alu. Die Zahl markierter Kopien
ist proportional zu mp, während die
Zahl unmarkierter Kopien proportional zu mb ist.
Das Verhältnis
von unmarkierten zu markierten Kopien ist daher mb/mp = Q/fi. Dies gilt
für alle
gleichmäßig verteilten
Sequenzen unabhängig
von der Kopienzahl. Die Zugabe genomischer DNA erhöht daher
die Konzentration jeder spezifischen Sequenz um den Faktor 1 + Q,
während
jede gleichförmig
verteilte Sequenz um den größeren Faktor
1 + Q/fi erhöht wird. Die Reassoziationsgeschwindigkeiten der
gemeinsamen Sequenzen werden daher durch die Zugabe der genomischen
DNA um einen größeren Faktor
erhöht
als jene der spezifischen Sequenzen.
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Es
kann gezeigt werden, dass etwa die Hälfte des günstigen Effekts der genomischen
DNA auf die relativen Reassoziationsgeschwindigkeiten erzielt wird,
wenn Q = 1, und dass bei Q = 5 im wesentlichen kein weiterer Nutzen
durch weitere Erhöhungen
gewonnen werden kann. Die Protokoll 1-Hybridisierungen von Abschnitt
VI.B unten halten Q ≤ 5.
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Um
die Verwendung genomischer blockierender DNA zu veranschaulichen,
ist es zweckmäßig, ein Modell
eines Genoms zu betrachten, bei dem 50% der DNA aus spezifischen
Sequenzen (sowohl repetitive als auch Einzelkopien) und die anderen
50% der DNA aus gemeinsamen repetitiven Sequenzen, die gleichmäßig über das Genom
verteilt sind, bestehen. Wenn das Ziel L Basen sind (das heißt, die
Sonde enthält
Fragmente, die L Basen des Zielbereichs oder der Zielbereiche des
Genoms repräsentieren),
werden daher gemäß dem Modell
Sequenzen, die L/2 Basen enthalten, spezifisch für das Ziel sein, und L/2 werden
mit dem gesamten Genom gemeinsam sein.
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III. Markieren der Nukleinsäurefragmente
des heterogenen Gemisches.
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Für das Markieren
einzel- und doppelsträngiger
Nukleinsäurefragmente
des heterogenen Gemisches stehen mehrere Techniken zur Verfügung. Dazu
zählen:
der Einbau radioaktiver Markierungen, z.B. Harper et al., Chromosoma,
Bd. 83, S. 431-439 (1984); direktes Anheften von Fluorochromen oder
Enzymen, z.B. Smith et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, S. 2399-2412
(1985) und Connolly et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, S. 4485-4502
(1985); und verschiedene chemische Modifikationen der Nukleinsäurefragmente,
welche sie immunchemisch oder durch andere Affinitätsreaktionen
nachweisbar machen, z.B. Tchen et al., "Chemically Modified Nucleic Acids as
Immunodetectable Probes in Hybridization Experiments", Proc. Natl. Acad.
Sci., Bd. 81, S. 3466-3470 (1984); Richardson et al., "Biotin and Fluorescent
Labeling of RNA Using T4 RNA Ligase", Nucleic Acids Research, Bd. 11, S.
6167-6184 (1983); Langer et al., "Enzymatic Synthesis of Biotin-Labeled Polynucleotides:
Novel Nucleic Acid Affinity Probes," Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 78, S.
6633-6637 (1981); Brigati et al., "Detection of Viral Genomes in Cultured
Cells and Paraffin-Embedded Tissue Sections Using Biotin-Labeled
Hybridization Probes",
Virology, Bd. 126, S. 32-50 (1983); Broker et al., "Electron Microscopic
Visualization of tRNA Genes with Ferritin-Avidin: Biotin Labels", Nucleic Acids Research,
Bd. 5, S. 363-384 (1978); Bayer et al., "The Use of the Avidin Biotin Complex
as a Tool in Molecular Biology",
Methods of Biochemical Analysis, Bd. 26, S1-45 (1980) Kuhlmann,
Immunoenzyme Techniques in Cytochemistry (Weinheim, Basel, 1984).
Langer-Safer et al., PNAS USA, 79,:4381 (1982): Landegent et al.,
Exp. Cell Res., 153:61 (1984); und Hopman et al., Exp. Cell Res.,
169:357 (1987).
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Zu
den typischen Markierungsmitteln zählen solche, bei denen die
Sondenfragmente biotinyliert, mit N-Acetoxy-N-2-acetylaminofluoren
modifiziert, mit Fluoresceinisothiocyanat modifiziert, mit Quecksilber/TNP-Liganden
modifiziert, sulfoniert oder mit Digoxigenin markiert werden oder
T-T-Dimere enthalten.
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Das
Hauptmerkmal der "Sondenmarkierung" besteht darin, dass
die an das Ziel gebundene Sonde nachweisbar wird. In manchen Fällen kann
statt eines hinzugefügten
Merkmals ein intrinsisches Merkmal der Sonden-Nukleinsäure für diesen
Zweck genützt
werden. Beispielsweise ist gezeigt worden, dass Antikörper, die
spezifisch RNA/DNA-Doppelstränge
erkennen, die Fähigkeit
besitzen, aus RNA bestehende und an DNA-Ziele gebundene Sonden zu
erkennen [Rudkin and Stollar, Nature, 265:472-473 (1977)]. Die für solche Sonden
verwendete RNA ist nicht modifiziert. Sonden-Nukleinsäurefragmente
können
durch Anhängen
von "Schwänzen" aus modifizierten
Nukleotiden oder bestimmten normalen Nukleotiden verlängert werden.
Wenn ein Schwanz aus normalen Nukleotiden verwendet wird, erlaubt
eine zweite Hybridisierung mit zum Schwanz komplementärer Nukleinsäure, die
als Markierungsmittel beispielsweise Fluorochrome, Enzyme, Radioaktivität und/oder
modifizierte Basen enthält,
den Nachweis der gebundenen Sonde. Ein solches System ist von Enzo
Biochem (Biobridge Labeling System; Enzo Biochem Inc., New York,
N.Y.) kommerziell erhältlich.
-
Ein
weiteres Beispiel für
ein Mittel zur Visualisierung der gebundenen Sonde, bei dem die
Nukleinsäuresequenzen
in der Sonde keinen direkten modifizierten Bestandteil tragen, ist
die Verwendung von Antikörpern
gegen Thymidin-Dimere. Nakane et al., 20(2):229 (1987) veranschaulichen
ein solches Verfahren, bei dem mit Thymin-Thymin-Dimeren versehene
DNA (T-T-DNA) als Marker für
eine In situ-Hybridisierung
verwendet wurde. Die hybridisierte T-T-DNA wurde unter Verwendung
von Kaninchen-anti-T-T-DNA-Antikörper immunhistochemisch
nachgewiesen.
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Alle
in den oben angeführten
Referenzdokumenten offenbarten Markierungstechniken können unter bestimmten
Umständen
bevorzugt sein. Demgemäß werden
die oben zitierten Referenzdokumente durch Zitat aufgenommen. Des
Weiteren würden alle
dem Fachmann bekannten Markierungstechniken brauchbar sein, um die
erfindungsgemäßen Färbezusammensetzungen
zu markieren. Mehrere Faktoren beeinflussen die Wahl des Markierungsmittels,
wozu die Wirkung der Markierung auf die Geschwindigkeit der Hybridisierung und
Bindung der Nukleinsäurefragmente
an die chromosomale DNA, die Zugänglichkeit
der gebundenen Sonde für
Markierungskomponenten, die nach der initialen Hybridisierung appliziert
werden, die gegenseitige Kompatibilität der Markierungskomponenten,
die Art und Intensität
des durch die Markierung erzeugten Signals, der Aufwand und die
Leichtigkeit, mit der die Markierung appliziert wird und dergleichen
zählen.
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Mehrere
unterschiedliche Sonden hoher Komplexität, von denen jede mit einem
unterschiedlichen Verfahren markiert ist, können gleichzeitig verwendet
werden. Die Bindung von unterschiedlichen Sonden kann damit beispielsweise
durch verschiedene Farben unterschieden werden.
-
IV. In situ-Hybridisierung.
-
Die
Applikation des erfindungsgemäßen heterogenen
Gemisches auf Chromosomen wird durch Standardtechniken der In situ-Hybridisierung
vorgenommen. Mehrere hervorragende Anleitungen für die Technik sind verfügbar, z.B.
Gall und Pardue, "Nucleic
Acid Hybridization in Cytological Preparations", Methods in Enzymology, Bd. 21, S.
470-480 (1981); Henderson, "Cytological
Hybridization to Mammalian Chromosomes", International Review of Cytology,
Bd. 76, S. 1-46 (1982) und Angerer et al., "In Situ Hybridization to Cellular RNAs", in Genetic Engineering:
Principles and Methods, Setlow und Hollaender, Hrsg., Bd. 7, S.
43-65 (Plenum Press, New York, 1985).
-
Drei
Faktoren beeinflussen die Färbungsintensität der Hybridisierungssonden:
(1) die Effizienz der Hybridisierung (Anteil der Ziel-DNA, die durch
die Sonde hybridisiert werden kann), (2) die Nachweiseffizienz (d.h. das
Ausmaß an
sichtbarem Signal, das von einer gegebenen Menge der Hybridisierungssonde
erzielt werden kann) und (3) der Rauschpegel, der durch das unspezifische
Binden der Sonde oder von Komponenten des Nachweissystems erzeugt
wird.
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Allgemein
umfasst die In situ-Hybridisierung die folgenden Hauptschritte:
(1) Fixierung des Gewebes oder der biologischen Struktur, die untersucht
werden sollen, (2) Vorhybridisierungsbehandlung der biologischen
Struktur, um die Zugänglichkeit
der Ziel-DNA zu erhöhen
und unspezifisches Binden zu reduzieren, (3) Hybridisierung des
heterogenen Gemisches der Sonde an die DNA in der biologischen Struktur
oder im Gewebe; (4) Wäschen
nach der Hybridisierung zur Entfernung von Sonde, die nicht in spezifischen
Hybriden gebunden ist und (5) Nachweis der hybridisierten Sonden
des heterogenen Gemisches. Die bei jedem dieser Schritte verwendeten
Reagenzien und ihre Anwendungsbedingungen unterscheiden sich in
Abhängigkeit
von der speziellen Situation.
-
Die
folgenden Kommentare sollen als eine Richtlinie für die Anwendung
der oben angeführten
allgemeinen Schritte dienen. Ein gewisses Maß an Versuchen kann notwendig
sein, um optimale Färbebedingungen
für spezielle
Anwendungen festzulegen.
-
Zur
Vorbereitung der Hybridisierung kann die Sonde – unabhängig von ihrem Herstellungsverfahren – zu Fragmenten
mit einer Größe, die
geeignet ist, die beste Intensität
und Spezifität
der Hybridisierung zu liefern, zerbrochen werden. Als eine allgemeine
Richtlinie hinsichtlich der Größe der Fragmente
muss man anerkennen, dass wenn die Fragmente zu lang sind, sie nicht
zum Binden in das Ziel eindringen können und statt dessen Aggregate
bilden, die ein Hintergrundrauschen für die Hybridisierung beitragen;
wenn jedoch die Fragmente zu kurz sind, ist die Signal-Intensität vermindert.
-
Unter
den in Abschnitt VI.B beispielhaft dargestellten Hybridisierungsbedingungen,
worin eine menschliche genomische DNA als Mittel zur Blockierung
des Hybridisierungsvermögens
der gemeinsamen repetitiven Sequenzen hoher Kopienzahl verwendet
wird, ist der bevorzugte Größenbereich
der Sondenfragmente etwa 200 Ba sen bis etwa 2000 Basen, mehr bevorzugt
nahe 1 kB. Wenn die Größe des Sondenfragments
im Bereich von etwa 800 bis etwa 1000 Basen liegt, ist die bevorzugte
Hybridisierungstemperatur etwa 30°C
bis etwa 45°C,
mehr bevorzugt etwa 35°C
bis 40°C
und noch mehr bevorzugt etwa 37°C;
der bevorzugte Waschtemperaturbereich ist etwa 40°C bis etwa
50°C, mehr
bevorzugt etwa 45°C.
-
Die
Größe der Sondenfragmente
wird vor Hybridisierung an das Ziel überprüft; vorzugsweise wird die Größe der Fragmente
durch Elektrophorese, mehr bevorzugt durch denaturierende Agarose-Gelelektrophorese überwacht.
-
Fixierungsmittel
schließen
Säure-Alkohol-Lösungen,
Säure-Aceton-Lösungen,
Petrunkewitsch-Reagenz und verschiedene Aldehyde, wie z.B. Formaldehyd,
Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder dergleichen ein. Vorzugsweise
werden Ethanol-Essigsäure- oder
Methanol-Essigsäure-Lösungen in
Verhältnissen
von etwa 3:1 verwendet, um die Chromosomen in Metaphasespreitungen
zu fixieren. Für
Zellen oder Chromosomen in Suspension ist eine von Trask et al.
in Science, Bd. 230, S. 1401-1402
(1985) geoffenbarte Fixierungsmethode brauchbar. Demgemäß wird Trask
et al. durch Zitat aufgenommen. Kurz gesagt, werden K2CO3 und Dimethylsuberimidat (DMS) (aus einer
5-fach konzentrierten Stammlösung,
die unmittelbar vor Verwendung gemischt wird) einer Suspension zugesetzt,
die etwa 5 × 106 Zellkerne/ml enthält. Die Endkonzentrationen
an K2CO3 und DMS
betragen 20 mM bzw. 3 mM. Nach 15 Minuten bei 25°C wird der pH durch die Zugabe
von 50 Mikroliter 100 mM Zitronensäure pro Milliliter Suspension
von 10,0 auf 8,0 eingestellt. Die Zellkerne werden einmal durch
Zentrifugation gewaschen (300g, 10 Minuten, 4°C in 50 mM KCl, 5 mM Hepes-Puffer
mit pH 9,0 und 10mM MgSO4).
-
Eine
bevorzugte Fixierungsmethode für
in Suspension befindliche Zellen oder Zellkerne wird von Trask et
al., Hum. Genet., 78:251-259 (1988) offenbart. Kurz gesagt, werden
die Zellkerne für
etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur in 1% Paraformaldehyd in PBS,
50 mM MgSO4, pH 7,6 fixiert und zweimal
gewaschen. Die Zellkerne werden in Isolierungspuffer (IB) (50 mM
KCl, 5 mM HEPES, 10 mM MgSO4, 3 mM Dithioerythritol, 0,15
mg/ml RNase, pH 8.0)/0,05% Triton X-100 mit 108/ml
resuspendiert.
-
Vor
der In situ-Hybridisierung werden Chromosomen oft mit Mitteln zur
Proteinentfernung behandelt. Solche Mittel schließen Enzyme
oder milde Säuren
ein. Pronase, Pepsin oder Proteinase K sind häufig verwendete Enzyme. Eine
typische Säurebehandlung
ist 0,02-0,2 N HCl, gefolgt von Waschen bei hoher Temperatur (z.B.
70°C). Die
Optimierung der Deproteinisierung erfordert eine Kombination von
Protease-Konzentration
und Verdauungszeit, welche die Hybridisierung maximiert, aber keinen
unannehmbaren Verlust an morphologischem Detail bewirkt. Die optimalen
Bedingungen variieren je nach Gewebearten und Fixierungsverfahren.
Eine zusätzliche
Fixierung nach der Protease-Behandlung kann nützlich sein. Für spezielle
Anwendungen kann daher ein gewisse Maß an Versuchen notwendig sein,
um die Protease-Behandlung zu optimieren.
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In
manchen Fällen
kann eine Vorbehandlung mit RNase wünschenswert sein, um restliche
RNA vom Ziel zu entfernen. Eine solche Entfernung kann durch Inkubation
der fixierten Chromosomen in 50-100 Mikrogramm/Milliliter RNase
in 2X SSC (wobei SSC eine Lösung
von 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat ist) für einen Zeitraum von 1-2 Stunden
bei Raumtemperatur erreicht werden.
-
Der
Schritt der Hybridisierung der Sonden des heterogenen Sondengemisches
an die chromosomale DNA beinhaltet (1) Denaturieren der Ziel-DNA,
so dass die Sonde Zugang zu komplementären einzelsträngigen Regionen
erhalten kann und (2) das Aufbringen des heterogenen Gemisches unter
Bedingungen, die es den Sonden erlauben, an komplementäre Stellen
im Zielbereich zu reassoziieren. Verfahren zur Denaturierung schließen die
Inkubation in Gegenwart von hohem pH, niedrigem pH, hoher Temperatur
oder organischen Lösungsmitteln,
wie z.B. Formamid, Tetraalkylammoniumhalogenide oder dergleichen,
bei verschiedenen Kombinationen von Konzentration und Temperatur
ein. Einzelsträngige
DNA im Zielbereich kann auch mit Enzymen, wie z.B. Exonuklease III
[van Dekken et al., Chromosoma (Berl) 97:1-5 (1988)] erzeugt werden.
Das bevorzugte Denaturierungsverfahren besteht in einer Inkubation
für etwa
1-10 Minuten in Formamid bei einer Konzentration zwischen etwa 35-95
Prozent in 2X SSC und bei einer Temperatur zwischen etwa 25-70°C. Die Bestimmung
der optimalen Inkubationszeit, Konzentration und Temperatur innerhalb
dieser Bereiche hängt von
mehreren Variablen ab, einschließlich des Fixierungsverfahrens
und der Art der Sonden-Nukleinsäure (beispielsweise
DNA oder RNA).
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Nach
Denaturierung der chromosomalen DNA werden die Denaturierungsmittel
typischerweise vor Applikation des heterogenen Probengemisches entfernt.
Wenn Formamid und Wärme
die primären
Denaturierungsmittel sind, wird die Entfernung zweckmäßig durch
mehrere Wäschen
mit einem Lösungsmittel,
das häufig
gekühlt
ist, wie z.B. Serien von 70%igem, 85%igem und 100%igem kaltem Ethanol,
bewerkstelligt. Alternativ dazu kann die Zusammensetzung des Denaturierungsmittels
durch Zusatz anderer Bestandteile oder Wäschen mit geeigneten Lösungen je
nach Zweckmäßigkeit
für die
In situ-Hybridisierung eingestellt werden. Die Sonde und die Ziel-Nukleinsäure können gleichzeitig
denaturiert werden, indem das Hybridisierungsgemisch appliziert
und dann auf die geeignete Temperatur erwärmt wird.
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Die
physiochemischen Umgebungsbedingungen von chromosomaler DNA und
Sonde während
der Zeit, in der das heterogene Gemisch appliziert wird, werden
hierin als Hybridisierungsbedingungen oder Reassoziationsbedingungen
bezeichnet. Optimale Hybridisierungsbedingungen für bestimmte
Anwendungen können
durch Steuern mehrerer Faktoren eingestellt werden, welche die Konzentration
der Bestandteile, die Inkubationszeit der Chromosomen im heterogenen
Gemisch und die Konzentrationen, Komplexitäten und Längen der Nukleinsäurefragmente,
aus denen das heterogene Gemisch besteht, einschließen. Die
Hybridisierungsbedingungen müssen
etwa ausreichend nahe an der Schmelztemperatur liegen, um unspezifisches
Binden zu minimieren. Andererseits können die Bedingungen nicht
so stringent sein, dass sie korrekte Hybridisierungen von komplementären Sequenzen
unter nachweisbare Niveaus vermindern oder übertrieben lange Inkubationszeiten
erfordern.
-
Die
Nukleinsäure-Konzentration
im Hybridisierungsgemisch ist eine wichtige Variable. Die Konzentrationen
müssen
hoch genug sein, so dass eine ausreichende Hybri disierung der entsprechenden
chromosomalen Bindungsstellen in einer vernünftigen Zeit erfolgt (z.B.
innerhalb von Stunden oder mehrerer Tage). Höhere Konzentrationen als die
zur Erzielung adäquater
Signale notwendigen sollten vermieden werden, damit unspezifisches
Binden minimiert wird. Eine wichtige praktische Beschränkung für die Sondennukleinsäure-Konzentration
im heterogenen Gemisch stellt die Löslichkeit dar. Es existieren
Obergrenzen hinsichtlich der Fragmentkonzentration, d.h. Längeneinheiten
an Nukleinsäure
pro Einheiten Volumen, die in Lösung
gehalten werden kann und wirkungsvoll hybridisieren kann.
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Bei
den in Abschnitt VI.B (unten) beschriebenen, repräsentativen
Beispielen wies die gesamte DNA-Konzentration im Hybridisierungsgemisch
eine obere Grenze in der Größenordnung
von 1 ug/ul auf. Sondenkonzentrationen im Bereich von 1-20 ng/ul
wurden für
solche Färbungen
ganzer Chromosomen verwendet. Die Menge an genomischer blockierender
DNA wurde so eingestellt, dass Q kleiner als 5 war. Am unteren Ende
der Sondenkonzentration wurden adäquate Signale mit einer einstündigen Inkubation,
das heißt,
einem Zeitraum, in dem die Sonde und die blockierende DNA vor Applikation
auf das Ziel-Material gemeinsam gehalten werden, um die Sequenzen
hoher Kopienzahl zu blockieren, und einer 16-ständigen Hybridisierung erzielt. Signale
waren nach zweistündiger
Hybridisierung sichtbar. Die besten Ergebnisse (helle Signale mit
höchstem Kontrast)
ergaben sich nach 100-ständiger
Hybridisierung, die den zielspezifischen Sequenzen niedriger Kopienzahl
mehr Gelegenheit zum Auffinden von Bindungsstellen gab. Am oberen
Ende der Sondenkonzentration werden helle Signale nach Hybridisierungen
für 16
Stunden oder weniger erhalten; der Kontrast war vermindert, da mehr
markierte repetitive Sequenzen in der Sonde enthalten waren.
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Das
fixierte Zielobjekt kann auf mehrere Arten entweder während oder
nach dem Hybridisierungsschritt behandelt werden, um das unspezifische
Binden von Sonden-DNA
zu vermindern. Solche Behandlungen beinhalten das Zugeben von Nichtsonden-
oder "Träger"-DNA zum heterogenen
Gemisch, das Verwenden von Beschichtungslösungen, wie z.B. Denhardt-Lösung (Biochem.
Biophys. Res. Commun., Bd. 23, S. 641-645 (1966)) mit dem heterogenen
Gemisch, das Inkubieren in denaturie renden Lösungsmitteln bei einer Temperatur
von 5-10°C über der
Hybridisierungstemperatur für
mehrere Minuten, z.B. 5-20, und im Falle von RNA-Sonden die schonende
Behandlung mit Einzelstrang-RNase (z.B 5-10 Mikrogramm pro Milliliter
RNase) in 2X SSC bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
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V. Chromosomenspezifische Färbereagenzien,
die ausgewählte
Einzelkopie-Sequenzen
umfassen
-
V.A. Herstellung und Verwendung eines
für das
menschliche Chromosom 21 spezifischen Färbereagenz
-
V.A.1. Isolierung von Chromosom 21 und
Konstruktion einer für
Chromosom 21 spezifischen Bibliothek
-
DNA-Fragmente
aus menschlichen chromosomenspezifischen Bibliotheken sind vom National
Laborstory Gene Library Project durch die American Type Culture
Collection (ATCC), Rockville, MD erhältlich. DNA-Fragmente aus Chromosom
21 wurden durch die von Fuscoe et al. in "Construction of Fifteen Human Chromosome-Specific
DNA Libraries from Flow-Purified Chromosomes", Cytogenet. Cell Genet., Bd. 43, S. 79-86 (1986) beschriebene
Methode gewonnen. Kurz gesagt, wurde eine menschliche diploide Fibroblastenkultur
aus Vorhautgewebe von Neugeborenen hergestellt. Die Chromosomen
der Zellen wurden durch das MgSO4-Verfahren
von van den Engh et al., Cytometry; Bd. 5, S. 108-123 (1984) isoliert
und mit den Fluoreszenz-Farbstoffen Hoechst 33258 und Chromomycin
A3 gefärbt.
Chromosom 21 wurde auf dem von Peters et al., Cytometry; Bd. 6,
S. 290-301 (1985) beschriebenen Hochgeschwindigkeitssortierer des
Lawrence Livermore National Laborstory gereinigt.
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Nach
dem Sortieren betrugen die Chromosomenkonzentrationen ungefähr 4 × 105/ml. Daher wurden die Chromosomen (0,2-1,0 × 106) vor der DNA-Extraktion durch Zentrifugation
bei 40.000 × g
für 30
Minuten bei 4°C
konzentriert. Das Pellet wurde dann in 100 Mikrolitern DNA-Isolierungspuffer
(15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 8,0), der 0,5% SDS und
100 Mikrogramm/ml Proteinase K enthielt, resuspendiert. Nach Inkubation über Nacht
bei 37°C
wurden die Proteine zweimal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1)
und einmal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Wegen
der kleinen DNA-Mengen wurde jede organische Phase neuerlich mit
einer kleinen Menge 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA (TE) extrahiert.
Die wässrigen
Phasen wurden vereinigt und auf eine Mini-Kollodiummembran von Schleicher und
Schuell (Nr. UHO20/25) übertragen
und bei Raumtemperatur für
6-8 Stunden gegen TE dialysiert. Die gereinigte DNA-Lösung wurde
dann mit 50 Einheiten von HindIII (Bethesda Research Laborstories,
Inc.) in 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2,
1 mM Dithiotreitol verdaut. Nach 4 Stunden bei 37°C wurde die
Reaktion durch Extraktionen mit Phenol und Chloroform wie vorstehend
beschrieben gestoppt. Die wässrige
Phase wurde über
Nacht bei 4°C
in einem Mini-Kollodiumsack gegen Wasser dialysiert und dann wurden
2 Mikrogramm Charon-21A-Arme, die mit HindIII gespalten und mit
alkalischer Phosphatase vom Kalb (Boehringer Mannheim) behandelt
worden waren, hinzugefügt.
Diese Lösung
wurde unter Vakuum auf ein Volumen von 50-100 Mikroliter konzentriert
und in ein 0,5 ml Mikrofugen-Röhrchen überführt, wo
die DNA mit einem Zehntel Volumen 3M Natriumacetat, pH 5,0 und 2
Volumina Ethanol ausgefällt
wurde. Der Niederschlag wurde mittels Zentrifugation gesammelt,
mit kaltem 70%igem Ethanol gewaschen und in 10 Mikroliter TE gelöst.
-
Nach
mehrstündigem
Auflösenlassen
der DNA wurden 1 Mikroliter 10X Ligase-Puffer (0,5M Tris-HCl pH
7,4, 0,1 M MgCl2, 0,1 M Dithiotreitol, 10
mM ATP, 1 mg/ml Rinderserumalbumin) und 1 Einheit T4-Ligase (Bethesda
Research Laborstories, Inc.) hinzugegeben. Das Ligations-Reaktionsgemisch
wurde 16-20 Stunden bei 10°C
inkubiert und Teilmengen zu je 3 Mikroliter wurden in Phagenpartikel
verpackt, wobei aus den E. coli-Stämmen BHB 2688 und BHB 2690
hergestellte In vitro-Extrakte, beschrieben von Hohn in Methods
of Enzymology, Bd. 68, S. 299-309 (1979) Molecular Cloning: A Laborstory
Manual, (Cold Spring Harbor Laborstory, New York, 1982), verwendet
wurden. Kurz gesagt, wurden beide Extrakte durch Beschallung hergestellt und
zum Zeitpunkt der In vivo-Verpackung vereinigt. Diese Extrakte verpackten
Wildtyp-Lambda-DNA mit einer Effizienz von 1-5 × 108 Plaquebildenden
Einheiten (pfu) pro Mikrogramm. Die resultierenden Phagen wurden
auf E. coli LE392 in einer Dichte von ungefähr 104 pfu/150
mm Platte 8 Stunden amplifiziert, um die Plaques am Zusammenwachsen
zu hindern und Unterschiede in den Wachstumsgeschwindigkeiten unterschiedlicher
Rekombinanten zu minimieren. Die Phagen wurden aus dem Agar in 10
ml SM-Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgSO4,
100 mM NaCl, 0,01% Gelatine) pro Platte durch sanftes Schütteln bei
4°C über 12 Stunden
eluiert. Die Platten wurden dann mit weiteren 4 ml SM gespült. Nach
dem Abscheiden der Zelldebris wurde die Phagensuspension über Chloroform
bei 4°C
aufbewahrt.
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V.A.2. Konstruktion und Verwendung des
für Chromosom
21 spezifischen Färbemittels
zum Färben
von Chromosom 21 von menschlichen Lymphozyten
-
Klone
mit einmaligen Einfügungssequenzen
werden durch das Verfahren von Benton and Davis, Science, Bd. 196,
S. 180-182 (1977) isoliert. Kurz gesagt, werden etwa 1000 rekombinante
Phagen zufallsmäßig aus
der für
Chromosom 21 spezifischen Bibliothek isoliert. Diese werden auf
Nitrocellulose überführt und
mit Nicktranslatierter gesamter genomischer menschlicher DNA sondiert.
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Von
den Klonen, welche keine starke Hybridisierung zeigen, werden ungefähr 300 ausgewählt, die DNA
mit offenbar einmaliger Sequenz enthalten. Nach Amplifikation der
selektierten Klone, wird die Chromosom 21-Einfügungssequenz in jedem Klon
mit 32p markiert und an Southern-Blots von
menschlicher genomischer DNA hybridisiert, welche mit demselben
Enzym verdaut ist, das zur Konstruktion der für Chromosom 21 spezifischen
Bibliothek verwendet wurde, d.h. HindIII. Einmalige Sequenzen enthaltende
Klone werden als jene erkannt, die bei der Southern-Analyse eine
einzige Bande erzeugen. Etwa 100 solcher Klone werden für das heterogene
Gemisch selektiert. Die Klone mit einmaliger Sequenz werden amplifiziert,
die Einfügungssequenzen
werden durch HindIII-Verdauung herausgeschnitten, und die Einfügungssequenzen
werden von den Phagenarmen durch Gelelektrophorese abgetrennt. Die
Sonden-DNA-Fragmente (d.h. die einmaligen Einfügungssequenzen) werden aus
dem Gel entfernt und mittels Nick-Translation biotinyliert (z.B.
mittels eines von Bethesda Research Laborstories erhältlichen
Kits). Markierte DNA-Fragmente werden aus dem Reaktionsgemisch der
Nick-Translation unter Verwendung kleiner Spin- Säulen,
die in mit Sephadex® G-50 (Medium), das in
50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,1% SDS bei pH 7,5 gequollen ist, befüllten 0,5
ml Eppendorph-Röhrchen
hergestellt sind, abgetrennt. Menschliche Lymphozyten-Chromosomen
werden gemäß Harper
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 78, S. 4458-4460 (1981) präpariert.
Metaphase- und Interphasezellen wurden dreimal in phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
gewaschen, in Methanol-Essigsäure
(3:1) fixiert und auf gereinigte Objektträger aufgetragen. Die Objektträger werden
in einer Stickstoffatmosphäre
bei –20°C aufbewahrt.
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Objektträger, die
Interphasezellen und/oder Metaphasespreitungen tragen, werden aus
dem Stickstoff entnommen, in Luft 4 Stunden auf 65°C erhitzt,
mit RNase (100 Mikrogramm/ml für
1 Stunde bei 37°C)
behandelt und mit einer Ethanolserie dehydratisiert. Dann werden
sie mit Proteinase K (60 ng/ml bei 37°C für 7,5 Minuten) behandelt und
dehydratisiert. Die Proteinase K-Konzentration wird abhängig von
der Zellart und der Enzym-Charge eingestellt, so dass fast kein
phasenmikroskopisches Bild der Chromosomen auf dem trockenen Objektträger zurückbleibt.
Das Hybridisierungsgemisch besteht aus (Endkonzentrationen) 50 Prozent Formamid,
2X SSC, 10 Prozent Dextransulfat, 500 Mikrogramm/ml Träger-DNA
(beschallte Heringsperma-DNA)
und 2,0 Mikrogramm/ml Biotin-markierter, für Chromosom 21 spezifischer
DNA. Das Gemisch wird auf die Objektträger in einer Dichte von 3 Mikroliter/cm2 unter ein Deckglas aufgetragen und mit
Kautschukkitt verschlossen. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht
werden die Objektträger
bei 45°C
gewaschen (50% Formamid-2XSSC
pH 7,3, 3 mal 3 Minuten; gefolgt von 2XSSC pH 7, 5 mal 2 Minuten)
und in BN-Puffer (0,1 M Na-Bicarbonat, 0,05 Prozent NP-40, pH 8)
eingetaucht. Die Objektträger
werden nach diesem Zeitpunkt nie mehr austrocknen gelassen.
-
Die
Objektträger
werden aus dem BN-Puffer entnommen und 5 Minuten bei Raumtemperatur
mit BN-Puffer (5 Mikroliter/cm2 unter Kunststoffdeckstreifen),
der 5% fettfreie Trockenmilch (Carnation) und 0,02% Na-Azid enthält, blockiert.
Die Deckstreifen werden entfernt und überschüssige Flüssigkeit kurz abgesaugt, und
Fluorescein-Avidin
DCS (3 Mikrogramm/ml in BN-Puffer mit 5% Milch und 0,02% Na-Azid)
wird aufgetragen (5 Mikroliter/cm2). Dieselben
Deckstreifen werden wieder aufgebracht, und die Objektträger werden
20 Minuten bei 37°C
inkubiert. Die Objektträger
werden dann 3 mal jeweils 2 Minuten mit BN-Puffer bei 45°C gewaschen.
Die Intensität
der Biotin-gekoppelten Fluoreszenz wird durch Auftragen einer Schicht
von biotinyliertem Ziegen-Antiavidin-Antikörper (5 Mikrogramm/ml in BN-Puffer
mit 5% Ziegenserum und 0,02% Na-Azid) verstärkt, gefolgt – nach Waschen
wie oben – von
einer weiteren Schicht Fluorescein-Avidin DCS. Fluorescein-Avidin
DCS, Ziegen-Antiavidin und Ziegenserum sind alle kommerziell erhältlich,
z.B. Vector Laborstories (Burlingame, CA). Nach Waschen mit BN,
wird vor Betrachtung eine das Verblassen der Fluoreszenz hemmende
Lösung,
p-Phenylendiamin (1,5 Mikroliter/cm2 Deckstreifen)
zugegeben. Für
eine optimale mikroskopische Abbildung ist es wichtig, diese Schicht
dünn zu
halten. Diese verblassungshemmende Lösung verminderte das Verblassen
des Fluoresceins signifikant und erlaubt eine kontinuierliche mikroskopische
Beobachtung für
bis zu 5 Minuten. Die DNA-Gegenfärbemittel
(DAPI oder Propidiumiodid) sind in der verblassungshemmenden Lösung zu
0,25-0,5 Mikrogramm/ml enthalten.
-
Der
rot-fluoreszierende DNA-spezifische Farbstoff Propidiumiodid (PI)
wird verwendet, um die gleichzeitige Beobachtung von hybridisierter
Sonde und gesamter DNA zu erlauben. Das Fluorescein und PI werden bei
450-490 nm (Zeiss-Filterkombination
487709) angeregt. Die Erhöhung
der Anregungswellenlänge
auf 546 nm (Zeiss-Filterkombination 487715) erlaubt die Beobachtung
des PI allein. DAPI, ein blau-fluoreszierendes DNA-spezifisches
Färbemittel,
das im Ultravioletten (Zeiss-Filterkombination 487701) angeregt
wird, wird als Gegenfärbemittel
verwendet, wenn Biotin-markierte und gesamte DNA getrennt beobachtet
werden. Metaphasechromosomen des Typs 21 werden durch zufällig angeordnete
gelbe Tupfen, die über
den Chromosomenkörper
verteilt sind, nachgewiesen.
-
V.B. Verbessertes Verfahren zum effizienten
Selektieren von Einzelkopie-Sequenzen
von Chromosom 21
-
Fuscoe
et al., Genomics, 5:100-109 (1989) stellen effizientere Verfahren
als das soeben beschriebene (V.A.2) zum Selektieren großer Zahlen
von Klonen mit Einzelkopie-Sequenzen oder Klonen mit Wiederholungssequenzen
sehr niedriger Kopienzahl aus Bibliotheken rekombinanter Phagen
zur Verfügung
und zeigen deren Verwen dung zum Färben von Chromosom 21. Die
genannte Veröffentlichung
wird hiermit durch Zitat aufgenommen. Kurz gesagt, wurden Klone
aus der Charon-21A-Bibliothek
LL21NS02 (hergestellt aus DNA vom menschlichen Chromosom 21) unter
Verwendung zweier grundlegender Methoden selektiert. Bei der ersten
wurde die Phagenbibliothek in zwei Schritten durchmustert, wobei
Verfahren verwendet wurden, die auf eine höhere Empfindlichkeit gegenüber dem
Vorhandensein repetitiver Sequenzen in den Klonen ausgerichtet waren
als das Verfahren von Abschnitt V.A.2. Die selektierten Klone wurden
dann in Plasmide subkloniert. Die so selektierten 450 Einfügungssequenzen
bilden die Bibliothek pBS-U21. Die zweite Methode bestand in einem
Mehrstufen-Verfahren, bei dem 1) Einfügungssequenzen aus LL21NS02
in Bluescribe-Plasmide subkloniert wurden, 2) Plasmide in hoher
Dichte in Bakterienkulturen auf Nitrocellulose-Filtern vermehrt
wurden und 3) radioaktive menschliche genomische DNA an die Plasmid-DNA
auf den Nitrocellulose-Filtern bei niedriger Stringenz in zwei Schritten
anhybridisiert wurde und 4) Plasmide mit Einfügungssequenzen, die nicht hybridisierten,
als potentielle Träger
von Einzelkopie-Sequenzen selektiert wurden. Fünfzehnhundertdreißig Kolonien wurden
auf diese Weise ausgewählt,
um die Bibliothek pBS-U21/1530 zu bilden.
-
Die
Southern-Analyse zeigte, dass die zweite Methode wirksamer im Erkennen
repetitiver Sequenzen war als die erste. Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung
mit DNA aus pBS-U21/1530 erlaubte die spezifische, intensive Färbung von
Chromosomen des Typs 21 in aus menschlichen Lymphozyten gewonnenen
Metaphasespreitungen. Die Hybridisierung mit pBS-U21 ergibt eine
weniger spezifische Färbung
von Chromosom 21. Details bezüglich
des Verfahrens von Fuscoe et al. zum Selektieren von Sonden mit
Einzelkopie-Sequenzen oder von Sonden mit Wiederholungssequenzen
sehr niedriger Kopienzahl aus rekombinanten Bibliotheken sind in Fuscoe
et al., id., zu finden.
-
V.C. Hybridisierung mit einer Sammlung
von Chromosom 4-Einzelkopie-Sequenzen
-
Pinkel
et al., PNAS (USA), 85:9138-9142 (Dezember 1988) beschreiben die
Methoden zur Herstellung von Chromosom 4-Einzelkopie-Sequenzen und
dann ein Protokoll [Modifizierung der in Pinkel et al., PNAS (USA),
83:2934-2938 (1986) beschriebenen Methode] zum Hybridisieren der
Einzelkopie-Sonden an eine menschliche Metaphasespreitung. 4H zeigt die Hybridisierung mit einem Pool von
120 Einzelkopie-Sonden aus Chromosom 4 an eine menschliche Metaphasespreitung.
-
VI. Ausschalten gemeinsamer repetitiver
Sequenzen
-
VI.A. Chromosom 21-spezifische Färbung unter
Verwendung blockierender DNA
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Hohe
Konzentrationen von unmarkierter menschlicher genomischer DNA und
Lambda-Phagen-DNA wurden verwendet, um die Bindung von repetitiven
und Vektor-DNA-Sequenzen
an die Ziel-Chromosomen zu inhibieren. Ausgedehnte Verdauung durch
Proteinase und anschließende
Fixierung des Ziels verbesserten den Zugang der Sonden zur Ziel-DNA.
-
Menschliche
Metaphasespreitungen wurden auf Objektträgern mit Standardtechniken
hergestellt und sofort in einer Stickstoff-Atmosphäre bei –20°C aufbewahrt.
-
Die
Objektträger
wurden aus dem Tiefkühler
entnommen und in einer Stickstoffatmosphäre auf Raumtemperatur anwärmen gelassen,
bevor mit dem Färbevorgang
begonnen wurde. Die aufgewärmten
Objektträger
wurden zuerst 7,5 Minuten mit 0,6 Mikrogramm/ml Proteinase K in
P-Puffer (20 mM Tris, 2 mM CaCl2 mit pH
7,5) behandelt und einmal mit P-Puffer gewaschen. Die verwendete
Menge Proteinase K muß für die verschiedenen
Chargen von Objektträgern
eingestellt werden. Nach dem Denaturieren wurden die Objektträger in 2XSSC
aufbewahrt. Ein Hybridisierungsgemisch wurde hergestellt, das aus
50% Formamid, 10% Dextransulfat, 1% Tween 20, 2XSSC, 0,5 mg/ml menschliche
genomische DNA, 0,03 mg/ml Lambda-DNA und 3 Mikrogramm/ml Biotin-markierte
Sonden-DNA bestand. Die Sonden-DNA bestand aus der Phagen-Fraktion
mit der höchsten
Dichte (bestimmt mit einem Cäsiumchlorid-Gradienten)
aus der Chromosom 21-HindIII-Fragment-Bibliothek (ATCC-Eingangsnummer 57713).
(Sowohl Einfügungssequenz-
als auch Phagen-DNA der Sonde wurden mittels Nick-Translation markiert.)
Die durchschnittliche, mittels Gelelektrophorese bestimmte Größe der Einfügungssequenz
(Menge an Chromosom 21-DNA)
betrug etwa 5 Kilobasen. Es wurde kein Versuch unternommen, repetitive
Sequenzen aus den Einfügungssequenzen
zu entfernen oder die Einfügungssequenzen
aus dem Lambda-Phagenvektor zu isolieren. Das Hybridisierungsgemisch
wurde durch Erhitzen auf 70°C
für 5 Minuten
denaturiert, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 1 Stunde. Die Inkubation
ermöglicht
es der menschlichen genomischen DNA und der unmarkierten Lambda-DNA
im Hybridisierungsgemisch, die menschlichen repetitiven Sequenzen
und Vektorsequenzen in der Sonde zu blockieren.
-
Der
die menschliche Metaphasespreitung enthaltende Objektträger wurde
aus dem 2XSSC entnommen und mit einem Linsenpapier trockengetupft.
Das Hybridisierungsgemisch wurde sofort auf den Objektträger aufgebracht,
ein Deckglas wurde auf dem Objektträger mit Kautschukkitt befestigt,
und der Objektträger wurde über Nacht
bei 37°C
inkubiert. Danach erfolgte die Präparierung der Objektträger wie
im Abschnitt V.B. beschrieben (wo Chromosom 21-DNA mit Fluorescein
gefärbt
und die gesamte chromosomale DNA mit DAPI gegengefärbt wurde).
Die 1A-C veranschaulichen die Ergebnisse. 1A ist ein DAPI-Bild der menschlichen Metaphasespreitung,
das mit einem computerisierten Bildanalysesystem erhalten wurde.
Es ist ein Binärbild,
das alles oberhalb der Nachweisschwelle in Weiß und den Rest in Schwarz zeigt.
Die Primärdaten
wurden als ein Graustufenbild mit 256 Intensitätsstufen aufgezeichnet. (Kleine
Pfeile weisen auf die Lage der Chromosomen des Typs 21 hin.) 1B ist eine Fluorescein-Abbildung derselben Spreitung
wie in 1A, wieder in Binärform. (Wiederum
weisen kleine Pfeile auf die Lage der Chromosomen des Typs 21 hin.) 10 veranschaulicht die Positionen der Chromosomen
des Typs 21, nachdem andere, weniger dicht gefärbte Objekte mittels Standardtechniken
der Bildverarbeitung entfernt worden waren.
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VI.B. Nachweis von Trisomie 21 und Translokationen
von Chromosom 4 unter Verwendung von Bluescribe-Plasmidbibliotheken
-
Wie
in Abschnitt VI.A. veranschaulicht, kann eine menschliche chromosomenspezifische
Bibliothek, einschließlich
ihrer gemeinsamen repetitiven Sequenzen, verwendet werden, um dieses
Chromosom zu färben,
wenn das Hybridisierungsvermögen
der gemeinsamen repetitiven Sequenzen durch Inkubation mit unmarkierter
menschlicher genomischer DNA vermindert wird. In Abschnitt VI.A.
wurden die Nukleinsäuresequenzen
des heterogenen Gemisches im Phagenvektor Charon 21A kloniert, bei
welchem das Verhältnis
von Einfügungssequenz-
zu Vektor-DNA etwa 0,1 (4 kB durchschnittliche Einfügungssequenz
zu 40 kB des Vektors) beträgt.
In diesem Abschnitt zeigen wir, dass das Übertragen derselben Einfügungssequenzen
in einen kleineren Kloniervektor, das etwa 3 kB große Bluescribe-Plasmid,
was das Verhältnis
von Einfügungssequenz- zu
Vektor-DNA auf 0,5 erhöht,
die Spezifität
und Intensität
der Färbung
verbesserte.
-
Wie
vorstehend diskutiert, kann die Inkubation der Sonde mit der Sonde
allein, mit der mit unmarkierter genomischer DNA vermischten Sonde
und mit einer Sonde, die mit unmarkierter DNA, die hinsichtlich
aller oder bestimmter gemeinsamer repetitiver Sequenzen angereichert
ist, vermischt ist, durchgeführt
werden. Wenn unmarkierte genomische DNA zugesetzt wird, dann ist
es wichtig, genug zuzusetzen, um die gemeinsamen repetitiven Sequenzen
in der Sonde ausreichend auszuschalten. Die genomische DNA enthält jedoch auch
unmarkierte Kopien der Sequenzen, deren Hybridisierung erwünscht ist.
Wie oben erklärt,
ist Q hier als das Verhältnis
von unmarkierten zu markierten Kopien der chromosomenspezifischen
Sequenzen im Hybridisierungsgemisch definiert.
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Pinkel
et al., PNAS (USA), 85:9138-9142 (Dezember 1988) beschreiben die
Verwendung unmarkierter genomischer DNA zur kompetitiven Hemmung
der Hybridisierung jener Sequenzen in einer chromosomenspezifischen
Bibliothek, die auch auf anderen Chromosomen vorhanden sind. Diese
Veröffentlichung
beschreibt Materialien und Verfahren zur Fluoreszenz-In situ-Hybridisierung
mit menschlichen chromoso menspezifischen Bibliotheken [Chromosom-4-Bibliothek
LL04NS02, subkloniert in Bluescribe-Plasmide (pBS-4); Chromosom-21-Bibliothek
LL21NS02, subkloniert in Bluescribe-Plasmide (pBS-21)]. Die Ergebnisse
dieser Hybridisierungen sind in 4A-C
und 4F und G gezeigt.
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VI.C. Hybridisierung von künstlichen
Hefechromosomen (YACS) an eine menschliche Metaphasespreitung
-
YACS.
Sieben Hefeklone HY1, HY19, HY29, HYA1.A2, HYA3.A2, HYA3.A9 und
HYA9.E6 wurden von D. Burke (Washington University, St. Louis, MO)
erhalten. Die Längen
der menschlichen DNA in den Klonen reichten von etwa 100 kB bis
etwa 600 kB. Eine Gelelektrophorese wurde durchgeführt, um
die Größe dieser Einfügungssequenzen
zu verifizieren. Jeder dieser Klone wurde angezüchtet, und die gesamte DNA
wurde isoliert. Die isolierte DNA wurde mittels Nick-Translation
biotinyliert, so dass 10-30% des Thymidins durch Biotin-11-dUTP
ersetzt wurden. Die Konzentration an gesamter markierter DNA nach
Nick-Translation liegt im Bereich von 10-20 ng/ul.
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Blockierende
DNA. Menschliche plazentäre
DNA (Sigma) wurde mit Proteinase K behandelt und mit Phenol extrahiert
und bis zum Vorliegen eines Größenbereichs
von 200-600 bp beschallt. Aus Hefe isolierte gesamte DNA, die kein
künstliches
Chromosom enthielt, wurde bis zum Vorliegen eines ähnlichen
Größenbereichs
beschallt. Beide DNAs wurden bei einer Konzentration von 1-10 ug/ul
gehalten.
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Fluoreszenz-In
situ-Hybridisierung (FISH). Die Hybridisierung folgte mit leichten
Modifikationen den Methoden von Pinkel et al. (1988), siehe oben.
Metaphasespreitungen wurden aus Methotrexat-synchronisierten Kulturen
gemäß den Methoden
von Harper et al. PNAS (USA) 78:4458-4460, (1981) hergestellt. Die
Zellen wurden mit Methanol/Essigsäure fixiert, fixiert (3:1),
auf Objektträger
aufgebracht, luftgetrocknet und unter Stickstoffgas bei –20°C bis zur
Verwendung gelagert. Die Objektträger wurden dann zwei Minuten
in 70% Formamid/2xSSC eingetaucht, um die Sequenzen der Ziel-DNA
zu denaturieren, mit einer 70-85-100% Ethanol-Serie dehydratisiert
und luftgetrocknet. (SSC ist 0,15 M NaCl/0,015 M Na-Citrat, pH 7).
Zehn – 100
ng biotiny lierte Hefe-DNA und jeweils ungefähr 1 ug unmarkierte Hefe-DNA
und menschliche genomische DNA wurden dann dem Hybridisierungsgemisch
hinzugefügt
(Endvolumen 10 ul, Endzusammensetzung 50% Formamid/2xSSC/10% Dextransulfat),
5 Minuten auf 70°C
erhitzt und dann 1 Stunde bei 37°C
inkubiert, um die komplementären
Stränge
der wiederholten Sequenzen mit höherer
Kopienzahl reassoziieren zu lassen.
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Das
Hybridisierungsgemisch wurde dann auf den Objektträger (eine
Fläche
von ungefähr
4 cm2) aufgebracht und mit Kautschukkitt
unter einem Deckglas verschlossen. Nach Inkubation über Nacht
bei 37°C
wurde das Deckglas entfernt und der Objektträger 3 mal jeweils 3 Minuten
mit 50% Formamid/2xSSC bei 42-45°C und
einmal mit PN-Puffer [Gemisch von 0,1 M NaH2PO4 und 0,1 M Na2HPO4, so dass pH 8 erhalten wird; 0,1% Nonidet
P-40 (Sigma)] gewaschen. Die gebundene Sonde wurde dann mit alternierenden
20-minütigen
Inkubationen (Raumtemperatur) mit Avidin-FITC und Ziegen-Antiavidin-Antikörper, beide
zu 5 ug/ml in PNM-Puffer (PN-Puffer plus 5% fettfreie Trockenmilch,
zur Entfernung von Feststoffen zentrifugiert; 0,02% Na-Azid) nachgewiesen.
Avidin- und Antiavidin-Inkubation wurden durch 3 Waschungen von
jeweils 3 Minuten mit PN-Puffer getrennt. Zwei oder drei Schichten
Avidin wurden aufgetragen (Avidin von DCS-Qualität und biotinyliertes Ziegen-Antiavidin
wurden von Vector Laborstories Inc., Burlingame. CA) erhalten.
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5 zeigt
die Hybridisierung von HYA3.A2 (580 kB menschlicher DNA) an 12q21.1.
Der Ort der Hybridisierung wurde durch Verwendung einer konventionellen
Fluoreszenz-Bandendarstellungstechnik unter Einsatz der DAPI/Actinomycin
D-Methode festgestellt:
Schweizer, "Reverse
fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI", Chromosoms, 58:307-324
(1976). Das Hybridisierungssignal bildet eine Bande über die
Breite jedes Chromosoms des Typs 12, was auf die Morphologie der
Packung der DNA in dieser Chromosomenregion hinweist.
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Die
Positionen der YAC-Klone sind wie unten in Tabelle 2 gezeigt zugeordnet. TABELLE
2 YAC-Kompetitionshybridisierung
YAC-Klon | Größe der Einfügungssequenz | Lokalisation |
HY1 | 120 | Xq23 |
HY19 | 450 | 8q23.3 |
| | 21q21.1 |
HY29 | 500 | 14q12 |
HYA1.A2 | 250 | 6q16 |
HYA3.A2 | 580 | 12q21.1 |
HYA3.A9 | 600 | 14q21 |
HYA9.E6 | 280 | 1p36.2 |
| | 3q22 |
-
VI.D. Hybridisierung mit Mensch/Hamster-Hybridzellen
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In
diesem Beispiel wurden im wesentlichen dieselben Hybridisierungs-
und Färbebedingungen
verwendet, wie sie bei der Methode von Pinkel et al. (1988), siehe
oben, detailliert beschrieben und in den Abschnitten V.C. und VI.B.,
siehe oben, beispielhaft dargestellt wurden. Bei diesem Beispiel
wurden 400 ng Biotin-markierter DNA aus einer Hamster-Mensch-Hybridzelle,
die eine Kopie des menschlichen Chromosoms 19 enthält, mit
1,9 ug unmarkierter menschlicher genomischer DNA in 10 ul Hybridisierungsgemisch
gemischt. Die Hybridisierung wurde über ungefähr 60 Stunden bei 37°C durchgeführt. Das
Fluoreszenzfärben
der gebundenen Sonde und das Gegenfärben der Chromosomen erfolgte
wie bei den anderen oben dargestellten Beispielen. 6 zeigt
die Ergebnisse der Hybridisierung.
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VII. Spezifische Anwendungen
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Die
vorliegende Erfindung erlaubt den mikroskopischen und in manchen
Fällen
durchflusszytometrischen Nachweis genetischer Anomalien auf einer
Zelle-für-Zelle-Basis. Die Mikrosokopie
kann vollständig durch
menschliche Beobachter vorgenommen werden oder verschiedene Grade
zusätzlicher
Instrumentierung und Computerunterstützung bis zur vollständigen Automatisierung
einschließen.
Der Einsatz von Instrumentierung und Automatisierung für solche
Analysen bietet viele Vorteile. Dazu zählen die Verwendung von Fluoreszenz-Farbstoffen,
die für
menschliche Beobachter unsichtbar sind (beispielsweise Infrarotfarbstoffe) und
die Möglichkeit
zur Interpretation von Ergebnissen, die mit Mehrfachmarkierungsverfahren
gewonnen wurden, welche nicht gleichzeitig sichtbar sein könnten (beispielsweise
Kombinationen von fluoreszierenden und absorbierenden Färbemitteln,
Autoradiographie etc.). Quantitative Messungen können verwendet werden, um Färbungsunterschiede
nachzuweisen, die durch menschliche Beobachter nicht nachweisbar
sind. Wie weiter unten beschrieben ist, kann eine automatisierte
Analyse auch die Geschwindigkeit erhöhen, mit der Zellen und Chromosomen
analysiert werden können.
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Die
mit den Sonden dieser Erfindung nachweisbaren cytogenen Anomalien
schließen
ein: Duplikation des gesamten oder eines Teils eines Chromosomentyps
kann nachgewiesen werden als ein Anstieg in der Zahl oder der Größe verschiedener
Hybridisierungsdomänen
in Interphase-Kernen nach Hybridisierung mit einer Sonde für den Chromosomentyp
oder den Bereich, oder durch Anstieg in der Menge gebundener Sonde. Wenn
die Sonde durch Fluoreszenz nachgewiesen wird, kann die Menge gebundener
Sonde entweder durchflusscytometrisch oder mittels quantitativer
Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden. Deletion eines gesamten
Chromosoms oder eines Chromosomenbereichs kann nachgewiesen werden
als eine Abnahme in der Zahl oder der Größe verschiedener Hybridisierungsdomänen in Interphase-Kernen
nach Hybridisierung mit einer Sonde für den Chromosomentyp oder den
Bereich, oder durch Abnahme Menge gebundener Sonde. Wenn die Sonde
durch Fluoreszenz nachgewiesen wird, kann die Menge gebundener Sonde
entwe der durchflusscytometrisch oder mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie
bestimmt werden.
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VII.A Bandenanalyse
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Wesentliche
Anstrengungen wurden während
der vergangenen dreißig
Jahre der Entwicklung automatisierter Systeme (besonders computergesteuerter
Mikroskope) für
die automatische Klassifikation und den Nachweis von Aberrationen
von Chromosomen durch Analyse von Metaphasespreitungen gewidmet.
In den letzten Jahren waren die Anstrengungen vor allem auf die
automatische Klassifizierung von Chromosomen gerichtet, die zur
Erzeugung eindeutiger Bandenmuster auf den verschiedenen Chromosomentypen
chemisch gefärbt
wurden. Diese Anstrengungen waren wegen der feinen Unterschiede
im Bandenmuster zwischen Chromosomentypen mit ungefähr gleicher
Größe, und
weil die unterschiedliche Kontraktion der Chromosomen in verschiedenen
Metaphasespreitungen eine Änderung
der Zahl und Breite der auf den Chromosomen jedes Typs sichtbaren
Banden bewirkt, nur teilweise erfolgreich. Die vorliegende Erfindung überwindet
dieses Problem, indem sie die Konstruktion von Reagenzien erlaubt,
welche ein Färbungsmuster
erzeugen, dessen Abstand, Breiten und Markierungsunterschiede (beispielsweise
unterschiedliche Farben) dahingehend optimiert sind, dass sie die
automatisierte Klassifizierung und den automatisierten Nachweis
von Aberrationen von Chromosomen erleichtern. Dies ist möglich, weil
die Hybridisierungssonden ganz nach Wunsch entlang den Längen der
Chromosomen gewählt
werden können.
Die Größe einer
von einem solchen Reagenz erzeugten Bande kann von einem einzelnen
kleinen Punkt bis zu einer im wesentlichen gleichmäßigen Deckfärbung eines
oder mehrerer ganzer Chromosomen reichen. Die vorliegende Erfindung
erlaubt somit die Konstruktion einer Hybridisierungssonde und die
Verwendung von Markierungsmitteln, vorzugsweise Fluoreszenz, in
einer Weise, dass benachbarte Hybridisierungsdomänen unterschieden werden können, beispielsweise
durch Farbe, so dass Banden, die für eine räumliche Auflösung zu
nahe aneinanderliegen, spektral nachgewiesen werden können (d.h.,
wenn rote und grüne
fluoreszierende Banden verschmelzen, kann das Vorhanden sein der zwei
Banden durch die resultierende gelbe Fluoreszenz nachgewiesen werden).
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Die
vorliegende Erfindung erlaubt auch die Konstruktion von Bandenmustern,
die auf spezielle Anwendungen zugeschnitten sind. Sie können daher
signifikant unterschiedlich hinsichtlich Abstand und Farbmischung
sein, beispielsweise auf Chromosomen, die bezüglich allgemeiner Gestalt und
Größe ähnlich sind
und die bei Anwendung konventioneller Techniken ähnliche Bandenmuster aufweisen.
Die Größe, Gestalt
und Markierung (z.B. Farbe) der durch die erfindungsgemäßen Sonden
erzeugten Hybridisierungsbanden kann optimiert werden, um Irrtümer beim
maschinellen Erfassen zu eliminieren, so dass ein genauer automatisierter Nachweis
von Aberrationen möglich
wird. Dieses optimierte Bandenmuster verbessert auch in hohem Maß die visuelle
Klassifizierung und den visuellen Nachweis von Aberrationen von
Chromosomen.
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Die
Leichtigkeit der Erkennung spezifischer Translokationsbruchstellen
kann durch Verwendung eines Reagenz, das auf die Nähe der Bruchregion
zielt, verbessert werden. Beispielsweise kann eine erfindungsgemäße Sonde
hoher Komplexität
verwendet werden, die Sequenzen umfasst, welche an beide Seiten
des Bruchs auf einem Chromosom hybridisieren. Der Anteil der Sonde,
welcher an eine Seite des Bruchs bindet, kann auf unterschiedliche
Weise nachgewiesen werden als der Anteil, welcher an die andere
Seite bindet, beispielsweise mit unterschiedlichen Farben. Bei einem
solchen Muster würde
ein normales Chromosom die verschiedenen gefärbten Hybridisierungsregionen
nebeneinander vorliegend aufweisen, und solche Banden würden nahe
beieinander erscheinen. Ein Bruch würde die Sonden auf unterschiedliche
Chromosomen separieren oder zu chromosomalen Fragmenten führen, und
diese könnten
als im Durchschnitt viel weiter entfernt visualisiert werden.
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VII.B Biologische Dosimetrie
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Ein
Weg der biologischen Dosimetrie besteht darin, die Häufigkeiten
von strukturell aberranten Chromosomen als Hinweis für die genetische
Schädigung
von Personen, die potentiell toxischen Mitteln ausgesetzt waren,
zu messen. Zahlreiche Studien haben die Zunahme der Häufigkeit
struktureller Aberrationen mit zunehmender Exposition gegenüber ionisierender
Strahlung und anderen Mitteln, die als Clastogene bezeichnet werden,
gezeigt. Dizentrische Chromosomen werden am häufigsten erfaßt, da ihre
charakteristische Art es ermöglicht,
sie rasch ohne Bandenanalyse zu erfassen. Eine rasche Analyse ist
wichtig wegen der geringen Häufigkeit
solcher Aberrationen bei Personen, die gegenüber an Arbeitsplätzen gefundenen
Konzentrationen exponiert waren (~2 × 10–3/Zelle).
Unglücklicherweise
bleiben dizentrische Chromosomen nicht stabil erhalten, so dass
die gemessene Häufigkeit
dizentrischer Chromosomen mit der Zeit nach Exposition abnimmt.
Eine längerdauernde
Exposition auf niedrigem Niveau führt daher wegen der ständigen Beseitigung
dieser Aberrationen nicht zu einer erhöhten Häufigkeit dizentrischer Chromosomen.
Translokationen sind geeignetere Aberrationen zur Erfassung bei
solchen dosimetrischen Studien, da sie mehr oder weniger unbegrenzt
erhalten bleiben. Die Feststellung eines genetischen Schadens kann
so lange Zeit nach Exposition erfolgen. Translokationen werden für Zwecke
der biologischen Dosimetrie nicht routinemäßig erfasst, da die Schwierigkeit
ihrer Erkennung das Erfassen ausreichender Zellen für die Dosimetrie
logistisch unmöglich
macht.
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Die
vorliegende Erfindung beseitigt diese Schwierigkeit. Im einzelnen
erlaubt die Hybridisierung mit einer Sonde, die mehrere Chromosomen
(z.B. Chromosomen 1, 2, 3 und 4) im wesentlichen gleichförmig färbt, die
sofortige mikroskopische Identifizierung von diese Chromosomen betreffenden
strukturellen Aberrationen in Metaphasespreitungen. Normale Chromosomen
erscheinen als durch die Sonde vollständig gefärbt oder ungefärbt. Derivat-Chromosomen,
die durch Translokationen zwischen Ziel- und Nichtziel-Chromosomen
entstanden sind, werden als nur teilweise gefärbt erkannt (4D). Solche partiell hybridisierten Chromosomen können unmittelbar
entweder visuell im Mikroskop oder auf automatisierte Weise unter
Verwendung computergestützter
Mikroskopie erkannt werden. Die Unterscheidung zwischen Translokationen
und dizentrischen Chromosomen wird erleichtert, indem der Sonde
in allen Chromosomen-Zentromeren vorhandene Sequenzen zugesetzt
werden. Der Nachweis der zentromeren Komponenten der Sonde mit einem
Markierungsmittel, beispielsweise Farbe, die sich von der zum Nachweis
der übrigen
Sondenelemente verwendeten unterscheidet, erlaubt die leichte Identifizierung
der Chromosomenzentromere, was wiederum die Unterscheidung zwischen dizentrischen
Chromosomen und Translokationen erleichtert. Diese Technologie vermindert
den bei früheren Techniken
erforderlichen Erfassungsaufwand dramatisch, so dass es möglich wird,
zehntausende Metaphasespreitungen zu untersuchen, wie dies für biologische
Dosimetrie im niedrigen Konzentrationsbereich erforderlich ist.
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VII.C. Pränatale Diagnostik
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Die
häufigsten
pränatal
vorhandenen Aberrationen sind Trisomien, welche die Chromosomen
21 (Down-Syndrom), 18 (Edward-Syndrom) und 13 (Patau-Syndrom) betreffen
und XO (Turner Syndrom)-, XXY(Kleinfelter-Syndrom)- und XYY-Krankheit.
Strukturelle Aberrationen treten auch auf. Sie sind aber selten, und
ihre klinische Bedeutung ist oft unsicher. Die Bedeutung des Nachweises
dieser Aberrationen ist daher fraglich. Die gegenwärtigen Techniken
zur Gewinnung fetaler Zellen für
eine konventionelle Karyotyp-Bestimmung, wie z.B. Amniozentese und
Chorionbiopsie, liefern hunderte bis tausende Zellen für die Analyse.
Diese werden üblicherweise
in einer Kultur über
2 bis 5 Wochen angezüchtet,
um eine ausreichende Zahl mitotischer Zellen für die zytogenetische Analyse
zu produzieren. Nach Präparation
der Metaphasespreitungen werden diese mittels konventioneller Bandenanalyse
analysiert. Ein solches Verfahren kann nur von hochgeübten Analytikern
durchgeführt
werden und ist zeitaufwendig, so dass die Zahl an Analysen, welche
selbst von den größten zytogenetischen
Laboratorien verlässlich
durchgeführt
werden kann, nur wenige tausend pro Jahr beträgt. Als Folge davon sind pränatale zytogenetische
Analysen üblicherweise
auf Frauen beschränkt,
deren Kinder ein hohes Risiko für
eine genetische Erkrankung aufweisen (z.B. über 35 Jahre alte Frauen).
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Die
vorliegende Erfindung überwindet
diese Schwierigkeiten, indem sie die einfache, rasche Identifizierung
häufiger
numerischer Chromosomenaberrationen in Interphasezellen ohne oder
mit minimaler Zellkuitivierung erlaubt. Im einzelnen kann eine anomale
Anzahl der Chromosomen 21, 18, 13, X und Y in Interphasezellkernen durch
Zählen
der Zahl der Hybridisierungsdomänen
nach Hybridisierung mit für
diese Chromosomen (oder für
wichtige Regionen darauf, wie z.B. 21q22 bei Down-Syndrom) spezifischen
Sonden nachgewiesen werden. Eine Hybridisierungsdomäne ist eine
kompakte, deutlich erkennbare Region, auf der eine hohe Hybridisierungsintensität besteht.
Eine erhöhte
Häufigkeit
von Zellen (mehr als 10%), die drei Domänen für die Chromosomen 21, 18 und
13 zeigen, weist auf das Vorliegen von Down-, Edward- bzw. Patau-Syndrom hin.
Eine Erhöhung
der Zahl von Zellen, welche nach Hybridisierung mit X-spezifischen
und Y-spezifischen Sonden eine einzige X-spezifische Domäne und keine Y-spezifische
Domäne
zeigen, weist auf das Vorliegen von Turner-Syndrom hin. Eine Erhöhung der
Häufigkeit
von Zellen, welche zwei X-spezifische Domänen und eine Y-spezifische
Domäne
zeigen, weist auf Kleinfelter-Syndrom
hin, und eine Erhöhung
der Häufigkeit
von Zellen, welche eine X-spezifische
Domäne
und zwei Y-spezifische Domänen
zeigen, weist auf einen XYY-Fetus
hin. Das Zählen
von Domänen
in Interphasezellkernen kann durch Messung der Hybridisierungsintensität, beispielsweise
unter Verwendung von quantitativer Fluoreszenz-Mikroskopie oder
Durchflußzytometrie
ergänzt
(oder in manchen Fällen
ersetzt) werden, da die Hybridisierungsintensität der Zahl der Ziel-Chromosomen,
für welche
die Sonde spezifisch ist, ungefähr
proportional ist. Numerische Aberrationen, die mehrere Chromosomen
betreffen, können
durch den Nachweis der Hybridisierung der verschiedenen Chromosomen mit
verschiedenen Markierungsmitteln, beispielsweise verschiedenen Farben,
gleichzeitig gezählt
werden. Diese Nachweismethoden für
Aberrationen überwinden
die Notwendigkeit ausgedehnter Zellkultivierung bei konventionellen
Methoden, da alle Zellen in der Population ausgewertet werden können. Sie
beseitigen wegen der einfachen, eindeutigen Art der Hybridisierungssignale
für numerische
Aberrationen den Bedarf an hochgeübten Analytikern. Sie sind
außerdem
für eine
automatisierte Aberrationsanalyse gut geeignet.
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Die
Tatsache, dass numerische Aberrationen in Interphasezellkernen nachgewiesen
werden können, erlaubt
auch die zytogenetische Analyse von Zellen, die normalerweise nicht
zur Mitose stimuliert werden können.
Im einzelnen erlauben sie die Analyse von im mütterlichen Blut vorhandenen
fetalen Zellen. Ein solches Merkmal ist vorteilhaft, da es die Notwendigkeit
invasiver Probenahmen fetaler Zellen, wie z.B. Amniozentese oder
Chorionbiopsie, eliminiert.
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Wie
bereits im Kapitel Hintergrund angedeutet, besteht der Grund, dass
solche Embryo-invasiven Verfahren notwendig sind, darin, dass die
konventionelle Karyotyp-Bestimmung
und Bandenanalyse Metaphasechromosomen benötigt. Gegenwärtig gibt
es keine anerkannten Methoden zur Kultivierung von aus mütterlichem
Blut abgetrennten fetalen Zellen, um eine Zellpopulation mit Metaphasechromosomen
zu erhalten. Dadurch dass die erfindungsgemäßen Färbereagenzien mit Interphasezellkernen
verwendet werden können, wird
durch diese Erfindung ein für
den Embryo nicht-invasives Verfahren zur Karyotyp-Bestimmung fetaler Chromosomen
zur Verfügung
gestellt.
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Der
erste Schritt bei einem solchen Verfahren besteht in der Abtrennung
fetaler Zellen, welche die Plazenta passiert haben oder von der
Plazenta in das mütterliche
Blut ausgeschieden worden sind. Die Inzidenz fetaler Zellen im mütterlichen
Blutstrom ist sehr niedrig, in der Größenordnung von 10–4 bis
10–6 Zellen/ml
und variiert ziemlich in Abhängigkeit
von der Schwangerschaftsphase; in geeigneter Weise markierte fetale
Zellen können
jedoch von den mütterlichen
Zellen unterschieden und konzentriert werden, beispielsweise durch Hochgeschwindigkeits-Zellsortierung.
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Das
Vorhandensein von Zellen eines männlichen
Fetus kann durch eine Markierung, beispielsweise einen Fluoreszenzmarker,
auf einem chromosomenspezifischen Färbereagenz für das Y-Chromosom
identifiziert werden. Es wurde gezeigt, dass Zellen, die offenbar
entweder Lymphozyten- oder Erythrozyten-Vorläufer waren, welche aus mütterlichen
Blut abgetrennt worden waren, Y-Chromatin-positiv sind. [Zillacus
et al., Scan. J. Haematol, 15:333 (1975); Parks und Herzenberg,
Methods in Cell Biology, Bd. 10, S. 277-295 (Academic Press, N.Y.,
1982) und Siebers et al., Humangenetik, 28:273 (1975)].
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Ein
bevorzugtes Verfahren zur Abtrennung fetaler Zellen aus mütterlichem
Blut besteht in der Verwendung monoklonaler Antikörper, welche
in bevorzugter Weise eine Affinität für einen nicht auf den mütterlichen Blutzellen
vorhandenen Bestandteil aufweisen. Die fetalen Zellen können durch
väterliche
HLA(Humanes Leukozyten-Antigen)-Marker
oder durch ein Antigen auf der Oberfläche der fetalen Zellen nachgewiesen
werden. Bevorzugte immunchemische Methoden zur Unterscheidung fetaler
und mütterlicher
Leukozyten auf Grundlage des unterschiedlichen HLA-Typs nutzen Unterschiede
bei den HLA-A2-, -A3- und -B7-Loci und besonders bevorzugt beim-A2-Locus.
Ferner können
fetale Trophoblasten des ersten und zweiten Trimesters mit Antikörper gegen
den inneren Zellbestandteil Cytokeratin, der in mütterlichen
Leukozyten nicht vorhanden ist, markiert werden. Beispielhafte monoklonale
Antikörper
sind in den folgenden zitierten Dokumenten beschrieben.
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Herzenberg
et al., PNAS, 76:1453 (1979) berichtet über die Isolierung fetaler
Zellen, offenbar lymphatischer Herkunft, aus mütterlichem Blut durch Fluoreszenz-aktivierte
Zellsortierung (FACS), wobei die Abtrennung auf dem Nachweis markierter
Antikörpersonden,
die an HLA-A2-negative Zellen in mütterlichem Blut binden, basierte.
Die auf diese Weise abgetrennten männlichen fetalen Zellen wurden
darüber
hinaus durch Chinacrin-Färbung
des Y-Chromatins identifiziert.
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Covone
et al., Lancet, Okt. 13, 1984:841 berichteten über die Gewinnung fetaler Trophoblasten
aus mütterlichem
Blut mittels Durchflußzytometrie
unter Verwendung eines Antikörpers
mit der Bezeichnung H315. Dieser monoklonale Antikörper identifiziert
gemäß dem Bericht
ein Glykoprotein, das auf der Oberfläche des menschlichen Syncytiotrophoblasten
sowie anderer Trophoblasten-Zellpopulationen exprimiert wird und
in anderen peripheren Blutzellen nicht vorhanden ist.
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Kawata
et al., J. Exp. Med., 160:653 (1984) offenbaren ein Verfahren zur
Isolierung plazentärer
Zellpopulationen aus Suspensionen menschlicher Plazenta. Das Verfahren
verwendet koordinierte Zwei-Farben- und Lichtstreuungs-FACS-Analyse
und – Sortierung.
Fünf verschiedene
Zellpopulationen wurden auf Basis von Größen- und quantitativen Unterschieden
hinsichtlich der koordinierten Expression von Oberflächenantigenen,
die durch monoklonale Antikörper
gegen eine HLA-A-, B-, C- monomorphe
Determinante (MB40.5) und gegen menschliche Trophoblasten (anti-Trop-1 und anti-Trop-2)
nachgewiesen worden waren, isoliert.
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Loke
und Butterworth, J. Cell Sci., 76:189 (1985) beschreiben zwei monoklonale
Antikörper,
18B/A5 und 18A/C4, die mit Zytotrophoblasten des ersten Trimesters
und anderen fetalen Epithelgeweben, einschließlich Syncytiotrophoblasten
reagieren.
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Ein
bevorzugter monoklonaler Antikörper
zur Abtrennung fetaler Zellen aus mütterlichem Blut für die erfindungsgemäße Färbung ist
der Anti-Cytokeratin-Antikörper
Cam 5.2, der von Becton-Dickinson (Franklin Lakes, N.J., USA) kommerziell
erhältlich
ist.
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Andere
bevorzugte monoklonale Antikörper
zum Abtrennen fetaler Zellen aus mütterlichem Blut sind in der
ebenfalls anhängigen,
gemeinsam gehörenden
US-Patentanmeldung
USSN 389,224 , eingereicht am 3. August 1989 unter dem Titel "Method for Isolating
Fetal Cytotrophoblast Cells" geoffenbart.
[Siehe auch in Fisher et al., J. Cell. Biol., 109 (2):891-902 (1989)].
Die dort offenbarten monoklonalen Antikörper reagieren spezifisch mit
Antigen auf Zytotrophoblasten-Zellen des ersten Trimesters, welche
fetalen Zellen die höchste Wahrscheinlichkeit
für das
Erreichen des mütterlichen
Blutkreislaufs besitzen. Die genannte Anmeldung und der genannte
Artikel werden hierin spezifisch durch Zitat aufgenommen. Kurz gesagt,
wurden die monoklonalen Antikörper
durch Injizieren von Zytotrophoblasten-Zellen, die aus Schnitten
des durch Uterusaspiration isolierten Plazentabetts gewonnen wurden,
in Versuchstiere produziert. Die produzierten Antikörper wurden
mehreren zytologischen Siebvorgängen
unterworfen, um jene Antikörper
zu selektieren, die mit der Zytotrophoblasten-Stammzellschicht der
Chorionzotten des ersten Trimesters reagieren.
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Bevorzugte,
von Fisher et al. offenbarte monoklonale Antikörper gegen solche Zytotrophoblasten-Zellen
des ersten Trimesters sind beispielsweise monoklonale Antikörper, die
von den folgenden, gemäß dem Budapester
Vertrag bei der American Type Culture Collection (ATCC; Rockville,
MD, USA) hinterlegten Hybridomen produziert werden:
Hybridom | ATCC-Eingangsnr. |
J1D8 | HB10096 |
P1B5 | HB10097 |
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Beide
Hybridom-Kulturen wurden von der ATCC am 4. April 1989 in Empfang
genommen, und deren Lebensfähigkeit
wurde von dieser am 14. April 1989 berichtet.
-
Fisher
et al. geben an, dass die unter Verwendung dieser monoklonalen Antiköper aus
mütterlichem Blut
isolierten fetalen Zellen zur In vitro-Replikation befähigt sind.
Daher können
die gemäß dem Verfahren
von Fisher et al. isolierten fetalen Zellen, das heißt, fetale
Zytotrophoblasten des ersten Trimesters, fetales chromosomales Material
liefern, das sich sowohl in der Metaphase als auch in der Interphase
befindet.
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Nachdem
die fetalen Zellen, vorzugsweise Leukozyten und Zytotrophoblasten,
besonders bevorzugt Zytotrophoblasten, mit einem geeigneten Antikörper markiert
worden sind, werden sie dann von den mütterlichen Zellen entweder
direkt oder vorzugsweise durch Abtrennen und Konzentrieren der fetalen
Zellen durch Zell-Sortierung
oder Panning abgetrennt. Beispielsweise kann FACS verwendet werden,
um fluoreszenzmarkierte fetale Zellen abzutrennen, oder es kann
die Durchflusszytometrie verwendet werden.
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Nachdem
die fetalen Zellen vom mütterlichen
Blut abgetrennt worden sind, können
sie gemäß den Verfahren
dieser Erfindung mit geeigneten erfindungsgemäßen chromosomenspezifischen
Färbereagenzien, vorzugsweise
jenen mit spezieller Bedeutung für
die pränatale
Diagnostik, gefärbt
werden. Bevorzugte Färbereagenzien
sind jene, welche so beschaffen sind, dass sie eine Aneuploidie,
beispielsweise die Trisomie eines jeden von mehreren Chromosomen,
einschließlich
der Chromosomentypen 21, 18, 13, X und Y und von Subregionen auf
solchen Chromosomen, wie z.B. Subregion 21q22 auf Chromosom 21,
nachweisen können.
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Vorzugsweise
umfasst eine fetale Probe für
eine erfindungsgemäße Färbeanalyse
mindestens 10 Zellen oder Zellkerne und mehr bevorzugt etwa 100
Zellen oder Zellkerne.
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VII.D Tumor-Zytogenetik
-
In
den letzten Jahren haben zahlreiche Studien das Vorliegen struktureller
und numerischer Chromosomen-Aberrationen aufgezeigt, die für spezielle
Krankheitsphänotypen
diagnostisch sind und Hinweise auf die genetische Natur der Krankheit
selbst liefern. Zu den prominenten Beispielen zählen die enge Assoziation zwischen
chronisch-myeloischer Leukämie
und einer die Chromosomen 9 und 22 betreffenden Translokation, die
Assoziation einer Deletion eines Teils von 13q14 mit Retinoblastom
und die Assoziation einer die Chromosomen 8 und 14 betreffenden
Translokation mit Burkitt-Lymphom. Der derzeitige Fortschritt bei
der Aufklärung neuer
tumorspezifischer Anomalien wird durch die Schwierigkeit beschränkt, repräsentative
Metaphasespreitungen mit Banden hoher Qualität für die zytogenetische Analyse
zu produzieren. Diese Probleme ergeben sich aus der Tatsache, dass
viele menschliche Tumoren schwer oder gar nicht in Kultur gezüchtet werden
können.
Die Gewinnung mitotischer Zellen ist daher üblicherweise schwierig. Auch
wenn die Zellen in Kultur gezüchtet
werden können,
besteht ein signifikantes Risiko, dass die Zellen, die tatsächlich wachsen,
nicht repräsentativ
für die
tumorauslösende
Population sein könnten.
Diese Schwierigkeit verhindert auch die Anwendung des vorhandenen
genetischen Wissens für
die klinische Diagnostik und Prognose.
-
Die
vorliegende Erfindung überwindet
die Beschränkungen,
indem sie den Nachweis spezifischer struktureller und numerischer
Aberrationen in Interphasezellkernen ermöglicht. Diese Aberrationen
werden wie oben beschrieben nachgewiesen. Die Hybridisierung mit
Ganzchromosomen-Sonden wird die Identifizierung von bisher unbekannten
Aberrationen erleichtern und dadurch die rasche Entwicklung neuer
Zusammenhänge zwischen
Aberrationen und Krankheitsphänotypen
erlauben. Mit der Zunahme des Wissens über die genetische Natur spezifischer
maligner Erkrankungen können
die Interphase-Untersuchungen zunehmend spezifisch durchgeführt werden,
indem Hybridisierungssonden selektiert werden, die auf die genetische
Läsion
zielen. Translokationen an spezifischen Stellen auf ausgewählten Chromosomen
können
durch Verwendung von Hybridisierungssonden, welche die Bruchstellen
in deren Nähe
flankieren, nachgewiesen werden. Die Verwendung dieser Sonden erlaubt
die Diagnose dieser spezifischen Krankheitsphänotypen. Translokationen können in
der Interphase nachgewiesen werden, weil sie Hybridisierungsdomänen zusammenbringen,
die normalerweise voneinander getrennt sind, oder weil sie eine
Hybridisierungsdomäne
in zwei, deutlich getrennte Domänen
auftrennen. Außerdem
können
sie verwendet werden, um die Verringerung und das Wiederauftreten
von malignen Zellen während
des Therapieverlaufs zu verfolgen. Die Interphasen-Analyse ist bei einer
solchen Anwendung besonders wichtig, da es sein kann, dass nur eine
kleine Zahl von Zellen vorhanden ist und diese schwer oder gar nicht
zur Mitose stimuliert werden können.
-
Duplikationen
und Deletionen, an der Gen-Amplifikation beteiligte Prozesse und
der Verlust der Heterozygotie können
ebenfalls unter Verwendung der erfindungsgemäßen Techniken in Metaphasespreitungen und
Interphasezellkernen nachgewiesen werden. Solche Prozesse werden
mit einer zunehmenden Anzahl verschiedener Tumoren in Verbindung
gebracht.
-
VIII. Nachweis der BCR-ABL-Fusion bei
chronisch-myeloischer Leukämie
(CML)
-
Sonden.
Dieser Abschnitt beschreibt im Detail einen CML-Test, der auf FISH
mit Sonden aus den Chromosomen 9 und 22 basiert, welche die fusionierten
BCR- und ABL-Sequenzen bei im wesentlichen allen Fällen von
CML flankieren (8). Die für die Beispiele dieses Abschnitts
verwendeten BCR- und ABL-Sonden wurden freundlicherweise von Carol
A. Westbrook vom Department of Medicine, Section of Hematology/Oncology
am University of Chicago Medical Center in Chicago, Illinois (USA)
zur Verfügung
gestellt.
-
Die
ABL-Sonde für
Chromosom 9, c-hu-ABL, ist ein 35-kB-Cosmid(pCV105)-Klon, der daraufhin
selektiert ist, dass er zur 200-kB-Region von ABL zwischen den Exons IB
und II, worin die Brüche
auftreten, telomer ist (24). Die BCR-Sonde für Chromosom 22, PEM12, ist
ein 18-kB-Phagenklon (in EMBL3), der einen Teil der 5,8-kB-Bruchstellencluster-Region
des BCR-Gens, worin beinahe alle CML-Bruchstellen auftreten, enthält und sich
zentromer zu dieser erstreckt. Die FISH wurde unter Verwendung einer
Biotin-markierten ABL-Sonde, nachgewiesen mit dem Fluorochrom Texasrot,
und einer Digoxigenin-markierten BCR-Sonde, nachgewiesen mit dem
grünen
Fluorochrom FITC, durchgeführt.
Die Hybridisierung beider Sonden konnte unter Verwendung eines mit
einem Doppelbandfiltersatz (Omega Optical) ausgestatteten Mikroskops
gleichzeitig beobachtet werden.
-
8 ist
eine schematische Darstellung des BCR-Gens auf Chromosom 22, des
ABL-Gens von Chromosom 9 und des BCR-ABL-Fusionsgens auf dem Philadelphia-Chromosom und zeigt
die Lage der CML-Bruchstellen und deren Beziehung zu den Sonden.
Exons des BCR-Gens sind als schraffierte Rechtecke dargestellt.
Die römische
Ziffer I bezieht sich auf das erste Exon des BCR-Gens; die arabischen
Ziffern 1-5 beziehen
sich auf Exons innerhalb der Bruchstellencluster-Region, hier durch
eine strichlierte Linie angedeutet. Die ungefähre Lage der 18-kB-Phage-PEM12-Sonde
(die BCR-Sonde) ist durch den leeren, horizontalen Balken angedeutet.
Da die Mehrzahl der Bruchstellen bei CML zwischen den Exons 2 und
4 auftritt, werden 15 kB oder mehr des Ziels für PEM12 auf dem Philadelphia-Chromosom
verbleiben. Bei der klassischen reziproken Translokation werden
wenige kB des Ziels für
PEM12 (nicht nachweisbares Fluoreszenzsignal) auf dem Derivat-Chromosom
zu finden sein. Die Karte und die Nummerierung der Exons (nicht
maßstabsgetreu) wurden
nach Heisterkamp et al. (Zitat 34, siehe oben) adaptiert.
-
Exons
des ABL-Gens sind als leere vertikale Balken dargestellt (nicht
maßstabsgetreu).
Die römischen
Ziffern Ia und Ib beziehen sich auf die alternativen ersten Exons
und II auf das zweite Exon. Exon II ist ungefähr 25 kB stromaufwärts vom
Ende des 28-kB-Cosmids c-hu-abl (der ABL-Sonde). Alle CML-Bruchstellen
treten stromaufwärts
von Exon II auf, üblicherweise
zwischen den Exons Ib und Ia innerhalb einer Region, deren Länge ungefähr 200 kB
beträgt.
C-hu-abl wird daher immer 25 bis 200 kB von der Verbindungsstelle
der Fusion entfernt sein. Die Karte (nicht maßstabsge treu) wurde nach Heisterkamp
et al. (Zitat 35, siehe oben) adaptiert. Das BCR-ABL-Fusionsgen ist dargestellt.
Bei CML wird PEM12 immer an der Verbindungsstelle liegen, und c-hu-abl
wird von PEM12 durch 25 bis 225 kB getrennt sein.
-
Probenvorbereitung:
CML-4: Peripheres Blut wurde 5 Minuten zentrifugiert. Zehn Tropfen
der Phasengrenzfläche
wurden mit PBS verdünnt,
zentrifugiert, mit Methanol/Essigsäure (3:1) fixiert und auf Objektträger aufgetropft.
CML-2, 3, 7: Fünf
bis 10 Tropfen Mark, das zur Verhinderung der Koagulation mit PBS
verdünnt worden
war, wurden mit Methanol/Essigsäure
fixiert und auf Objektträger
aufgetropft. CML-1, 4, 5, 6: Peripheres Blut und/oder Knochenmark
wurden in RPMI 1640, das mit 10% fetalem Kalbsserum, einer antibiotischen Mischung
(Gentamycin 500 mg/ml) und 1% L-Glutamin
supplementiert war, 24 h kultiviert. Die Kulturen wurden gemäß J.J. Yunis
und M.E. Chandler Prog. in Clin. Path., 7:267 (1977) synchronisiert,
und die Präparation
der Chromosomen folgte Gibis und Jackson, Karyogram, 11:91 (1985).
-
Hybridisierungs-
und Nachweisprotokoll. Die Hybridisierung folgte mit Modifikationen
den von D. Pinkel et al. (27), Trask et al. (25) und J.B. Lawrence
et al. (30) beschriebenen Methoden. Die BCR-Sonde wurde mittels
Nick-Translation (Bethesda Research Laborstories Nick-Translation
System) mit Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer Mannheim Biochemicals)
mit einem durchschnittlichen Einbau von 25% markiert. Die ABL-Sonde wurde
in ähnlicher
Weise mittels Nick-Translation mit Biotin-11-dUTP (Enzo Diagnostics)
markiert.
- 1. Hybridisierung. Denaturieren der
Ziel-Interphasezellen und/oder -Metaphasespreitungen auf Glas-Objektträgern bei
72°C in
70% Formamid/2xSSC mit pH 7 für
2 Minuten. Dehydratisieren mit einer Ethanolserie (70%, 85% und
100% jeweils für
2 Minuten). Lufttrocknen und bei 37°C halten (2xSSC ist 0,3 M NaCl/30 mM
Natriumcitrat). Erhitzen von 10 ml des Hybridisierungsgemisches,
enthaltend 2 ng/ml jeder Sonde, 50% Formamid/2xSSC, 10% Dextransulfat
und 1 mg/ml menschliche genomische DNA (beschallt auf 200-600 bp),
auf 70°C
für 5 Minuten
zur Denaturierung der DNA. Inkubieren bei 37°30 Minuten. Auf die erwärmten C
für Objektträger auftragen,
mit einem 20 mm × 20
mm großen
Deckglas bedecken, mit Kautschukkitt ver siegeln und über Nacht
in einer Feuchtkammer bei 37°C
inkubieren. Die Deckgläser
entfernen und dreimal jeweils 20 Minuten mit 50% Formamid/2xSSC,
pH 7 bei 42°C,
zweimal jeweils 20 Minuten mit 2xSSC bei 42°C waschen und schließlich bei
Raumtemperatur mit 4xSSC spülen.
- 2. Nachweis der gebundenen Sonden: Alle Inkubationsschritte
werden mit ungefähr
100 ml Lösung
bei Raumtemperatur unter Deckgläsern
durchgeführt.
Die biotinylierte ABL-Sonde wurde zuerst nachgewiesen, dann die
Digoxigenin-markierte BCR-Sonde.
a.
Biotinylierte ABL-Sonde: Vorblockieren mit 4xSSC/1% Rinderserumalbumin
(BSA) für
5 Minuten. Aufbringen von Texasrot-Avidin (Vector Laborstories Inc.,
2 mg/ml in 4xSSC/1% BSA) für
45 Minuten. Einmal waschen mit 4xSSC, mit 4xSSC/1% Triton-X 100
(Sigma) und dann wieder mit 4xSSC, jeweils 5 Minuten. Vorblockieren
mit PNM (PN enthaltend 5% fettfreie Trockenmilch und 0,02% Natriumazid
und zur Entfernung von Feststoffen zentrifugiert. PN ist 0,1 M NaH2PO4/0,1 M Na2HPO4, 0,05% NP40,
pH 8) für
5 Minuten. Aufbringen von biotinyliertem Ziegen-Antiavidin (Vector
Laborstories Inc., 5 mg/ml in PNM) für 45 Minuten. Zweimal waschen
mit PN für
5 Minuten. Aufbringen einer zweiten Schicht von Texasrot-Avidin
(2mg/ml in PNM) für
45 Minuten. Zweimal waschen mit PN für jeweils 5 Minuten.
b.
Digoxigenin-markierte BCR-Sonde: Vorblockieren mit PNM für 5 Minuten.
Aufbringen von Schaf-Antidigoxigenin-Antikörper (erhalten von D. Pepper,
Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN; 15,4 mg/ml in
PNM) für
45 Minuten. Zweimal waschen mit PN für jeweils 5 Minuten. Vorblockieren
mit PNM für 5
Minuten. Aufbringen von mit FITC konjugiertem Kaninchen-Antischaf-Antikörper (Organon
Teknika-Cappel, 1:50 in PNM) für
45 Minuten. Zweimal waschen mit PN für jeweils 5 Minuten. Falls
erforderlich wird das Signal durch Vorblockieren für 5 Minuten
mit PNM und Aufbringen von mit FITC konjugiertem Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper (Organon
Teknika-Cappel, 1:50 in PNM) für
45 Minuten verstärkt.
Spülen
mit PN.
- 3. Visualierung: Auf die Objektträger wird eine das Verblassen
der Fluoreszenz hemmende Lösung
[G. D. Johnson und J. G. Nogueria, J. Immunol. Methods, 43:349 (1981)
(Zitat 31, siehe oben)], enthaltend 1 mg/ml 4',6-Amidino-2-Phenylindol (DAPI) als
Gegenfärbemittel,
aufgebracht und diese werden unter Verwendung eines FITC/Texasrot-Doppelbandfiltersatzes
(Omega Optical) auf einem Zeiss Axioskop untersucht.
-
Das
hier für
den PCR-Test auf BCR-ABL verwendete Verfahren war für CML-3,
4 und 7 das von Hegewisch-Becker et al. beschriebene (Zitat 32,
siehe oben) und für
CML-5 und 6 das von Kohler et al. beschriebene (Zitat 33, siehe
oben).
-
Ergebnisse.
ABL- und BCR-Hybridisierungsstellen waren auf beiden Chromatiden
der Chromosomen in den meisten Metaphasespreitungen sichtbar. Die
ABL-Sonde band an Metaphasespreitungen von normalen Personen (9A) nahe des Telomers auf 9q, während die
BCR-Sonde bei 22q11 band (9B).
Hybridisierung mit der ABL- oder BCR-Sonde an normale Interphasezellkerne
führte
typischerweise zu zwei winzigen Fluoreszenzpunkten entsprechend
der Zielsequenz auf beiden Chromosomen-Homomologen. Die Punkte waren
auf den zweidimensionalen Kernbildern offenbar zufällig verteilt
und üblicherweise
gut getrennt. Einige wenige Zellen zeigten zwei Dublett-Hybridisierungssignale,
wahrscheinlich ein Ergebnis der Hybridisierung an beide Schwesterchromatiden
beider Homologe in Zellen, welche diese DNA-Region repliziert hatten (d.h. die in
der S- oder G2-Phase des Zellzyklus). Zweifarben-FISH der ABL(rot)-
und BCR(grün)-Sonden
an normale G1-Zellkerne lieferte zwei rote (ABL) und zwei grüne (BCR)
Hybridisierungssignale, die zufällig über den
Zellkern verteilt waren.
-
Die
genetische Umordnung bei CML bringt die zu den Sonden homologen
DNA-Sequenzen auf
einem anomalen Chromosom, üblicherweise
dem Ph1, zusammen und im Interphasezellkern
zusammen, wie in 8 dargestellt. Der genomische
Abstand zwischen den Sonden-Bindungsstellen im Fusionsgen variiert
zwischen den CML-Fällen
im Bereich von 25 kB bis 225 kB, bleibt aber in allen Zellen eines
einzelnen Leukämie-Klons
gleich. Zweifarben-Hybridisierung mit ABL- und BCR-Sonden an Interphase-CML-Zellen
führte
zu einem roten und einem grünen
Hybridisierungssignal, deren Lokalisation im Zellkern zufällig war,
und einem rot-grünen
Dublett-Signal,
bei dem der Abstand zwischen den beiden Farben weniger als 1 Mikron
betrug (oder ein gelbes Hybridisierungssignal für eine Hybridisierung in sehr
enger Nachbarschaft, siehe 10).
Die zufallsmäßig lokalisierten
roten und grünen
Signale werden der Hybridisierung an die ABL- und BCR-Gene auf den
normalen Chromosomen zugeschrieben, und das rot-grüne Dublett-Signal
der Hybridisierung an das BCR-ABL-Fusionsgen. Interphase-Kartierungsstudien
lassen vermuten, dass DNA-Sequenzen, die durch weniger als 250 kB
getrennt sind, in Interphasezellkernen durch weniger als 1 Mikron
getrennt sein sollten (25). Daraus folgt, dass Zellen, die rote
und grüne
Hybridisierungssignale zeigten, welche durch mehr als 1 Mikron getrennt
waren, als normal gewertet wurden, da dies mit dem Vorliegen der
Hybridisierungsstellen auf verschiedenen Chromosomen übereinstimmt.
Aufgrund statistischer Betrachtungen werden einige normale Zellen
jedoch rote und grüne
Farbpunkte aufweisen, die einander nahe genug sind, um als anomal
gewertet zu werden. Bei diesen zweidimensionalen Kernanalysen wiesen
9 von 750 normalen Zellkernen rote und grüne Hybridisierungssignale weniger
als 1 Mikron vom jeweils anderen auf. Somit wurden ungefähr 1% der
normalen Zellen als anomal klassifiziert.
-
Tabelle
3 zeigt die Hybridisierungsergebnisse für 7 Proben von 6 CML-Fällen zusammen
mit konventionellen Karyotypen und anderen diagnostischen Ergebnissen
(PCR- und Southern-Blot-Daten). Alle sechs Fälle, einschließlich 3,
die mit Bandenanalyse (CML –5, –6 und –7) als
Ph
1-negativ bestimmt wurden, zeigten bei
mehr als 50% der untersuchten Zellkerne rot-grüne Hybridisierungssignale,
die durch weniger als 1 Mikron getrennt waren. Bei den meisten war
das Fusionsereignis in fast jeder Zelle sichtbar. Ein Fall (CML-7)
zeigte Fusionssignale in fast jeder Zelle, obwohl die PCR-Analyse
das Vorhandensein eines Fusionsgens nicht nachweisen konnte und
die Bandenanalyse kein Philadelphia-Chromosom offenbarte.
-
Eine
Hybridisierung an Metaphasespreitungen wurde in drei Fällen durchgeführt (CML –1, –5 und –6). Alle
zeigten rote und grüne
Hybridisierungssignale eng benachbart auf einem einzigen akrozentrischen
Chromosom. Bei zwei Fällen,
die mittels Bandenanalyse als t(9:22)(q34;q11) erfasst wurden, befand
sich das rot-grüne
Paar in enger Nachbarschaft zum Telomer des langen Arms eines kleinen
akrozentrischen Chromosoms, wie es für das Ph1 zu
erwarten war (9C). Bei einem Fall (CML-6)
wurde aufgrund klassischer zytogenetischer Untersuchungen vermutet,
dass eine Insertion von chromosomalem Material bei 22q11 vorliegt. Zweifarben-Hybridisierungen
an Metaphasespreitungen von diesem Fall zeigten, dass das rotgrüne Paar
zentral auf einem kleinen Chromosom lokalisiert war (9D). Dieses Ergebnis stimmt mit der Bildung des BCR-ABL-Fusionsgens
durch eine Insertion überein.
Bei einem Fall (CML-1) wurden bei 3 von 150 (2%) Interphasezellkernen
zwei Paare rot-grüner
Dublett-Signale gesehen. Dies kann auf ein doppeltes Ph1 (oder
ein doppeltes Fusionsgen) in diesen Zellen hinweisen. Ein solches
Ereignis war mittels der Standard-Zytogenetik, die auf die Analyse
von 25 Metaphasespreitungen beschränkt war, nicht nachgewiesen
worden. Der Erwerb eines zusätzlichen
Ph1 ist das häufigste Begleitereignis einer
Blastentransformation, und sein zytogenetischer Nachweis kann eine
Krankheitsprogression ankündigen.
-
Die
gleichzeitige Hybridisierung mit ABL- und BCR-Sonden an Metaphasespreitungen
der von CML abgeleiteten Ziellinie K-562 zeigte multiple rot-grüne Hybridisierungsstellen
entlang beider Arme eines einzigen akrozentrischen Chromosoms. Die
Hybridisierung an Interphasezellkerne zeigte, dass die roten und
grünen
Signale auf dieselbe Region des Zellkerns beschränkt waren. Dies stimmt mit
ihrer Lokalisation auf einem einzigen Chromosom überein. Zwölf bis fünfzehn Hybridisierungspaare
wurden in jedem Zellkern gesehen, was auf eine entsprechende Amplifikation
des BCR-ABL-Fusionsgens hinweist (siehe 9E und 9F). Diese
Ergebnisse stimmen mit früheren
Southern-Blot-Daten überein,
die eine Amplifikation des Fusionsgens in dieser Ziellinie zeigen
(26).
-
Zusammenfassend
legt die Analyse von Interphasezellen bei sieben CML- und vier normalen
Zell-Proben unter Verwendung von Zweifarben-FISH mit ABL- und BCR- Sonden die Brauchbarkeit
dieser Vorgangsweise für
die Routinediagnose von CML und das klinische Monitoring der Krankheit
nahe. Zu ihren sehr wichtigen Vorteilen zählen die Möglichkeit, genetische Informationen
aus einzelnen Interphase- oder Metaphasezellen in weniger als 24
Stunden zu gewinnen. Sie kann somit auf alle Zellen einer Population
und nicht nur auf jene, die sich zufällig oder durch Kultivierung
gerade in der Metaphase befinden, angewendet werden. Außerdem kann
die Analyse des Genotyps mit dem auf Basis der Morphologie oder
anderer Merkmale beurteilten Zell-Phänotyp in Zusammenhang gebracht
werden, wodurch die Untersuchung der Abstammungsspezifität von Zellen
mit dem CML-Genotyp sowie die Feststellung der Häufigkeit von Zellen mit dieser
Anomalie ermöglicht
wird.
-
Das
zufällige
Nebeneinanderliegen roter und grüner
Signale in zweidimensionalen Abbildungen normaler Zellen, das bei
etwa 0,01 von normalen Zellen auftritt, setzt die Grenze für den Nachweis
geringer Häufigkeiten.
Diese Nachweisgrenze kann durch eine vollständigere quantitative Messung
der Trennung und Intensität
der Hybridisierungssignale in jedem Zellkern unter Verwendung computerisierter
Bildanalyse gesenkt werden. Eine solche Analyse wird besonders bei
der Untersuchung von Patientenpopulationen wichtig sein, bei denen
die Zellen, welche die BCR-ABL-Fusion
tragen, in geringer Häufigkeit
vorliegen (z.B. während
einer Remission, nach Knochenmarktransplantation, während eines
Relapse oder bei Modellsystemen).
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Dieser
Test sollte auch für
den Nachweis von CML-Zellen während
einer Therapie vorteilhaft sein, wenn die Zahl der für eine Analyse
verfügbaren
Zellen niedrig ist, da nur wenige Zellen benötigt werden. Schließlich ermöglicht das
einfache Zählen
von Hybridisierungsspots den Nachweis und die quantitative Analyse
der Amplifikation des BCR-ABL-Fusionsgens, wie dies für die K562-Zellinie
dargestellt ist (9E). Die quantitative Messung
der Fluoreszenzintensität
kann eine solche Analyse unterstützen.
-
IX. Verfahren zur Herstellung und Anwendung
einzelsträngiger
Nukleinsäure-Sonden auf doppelsträngige Ziel-DNAs
-
Allgemein
beinhaltet das Verfahren zur Herstellung und Anwendung einzelsträngiger DNA-Hybridisierungssonden
auf doppelsträngige
Ziel-DNA das Behandeln sowohl der Ziel-DNA als auch der Sonden-DNA mit
derselben Restriktionsendonuklease, gefolgt von der Verdauung der
den Restriktionsschnittstellen benachbarten Einzelstränge. Die
Sonden werden durch Neusynthese der verdauten Einzelstränge mit
markierten Nukleotiden konstruiert. Die markierten Stränge sind
im wesentlichen komplementär
zu den unverdauten Einzelsträngen
der Ziel-DNAs. Die die markierten Einzelstränge enthaltenden doppelsträngigen DNA-Fragmente werden
zu kleineren Stücken
zerbrochen und denaturiert. Die Hybridisierungssonden werden durch
Abtrennen der markierten einzelsträngigen Fragmente von den unmarkierten
Fragmenten gewonnen.
-
DNA,
die für
die Sonden verwendet werden soll, wird mit einer Restriktionsendonuklease
so geschnitten, dass Restriktionsfragmente mit "klebrigen" Enden gebildet werden. Das heißt, es ist
wichtig, dass die Restriktionsendonuklease einen abgestuften Schnitt
durch die doppelsträngige
DNA ausführt.
Geeignete Restriktionsendonukleasen schließen, ohne darauf beschränkt zu sein,
ein: HindIII, Bam H1, Eco R1 oder dergleichen, welche alle kommerziell
erhältlich
sind, z.B. Promega Biotec (Madison, WI) oder Boehringer Mannheim (Indianapolis,
IN). Bei der Auswahl einer Restriktionsendonuklease ist es bevorzugt,
dass die resultierenden Restriktionsfragmente innerhalb eines Größenbereichs
liegen, der ihre direkte Insertion in verfügbare Klonierungsvektoren erlaubt.
Zu den geeigneten Klonierungsvektoren zählen Plasmide, wie z.B. pBR322,
und Phagen, wie z.B. Lambda-Phage, wobei verschiedene Abkömmlinge
dieser beiden kommerziell erhältlich
sind, z.B. Promega Biotec (Madison, WI) und Boehringer Mannheim
(Indianapolis, IN). Amplifizierte Kopien der Restriktionsfragmente
werden unter Verwendung von Standardtechniken isoliert, z.B. Maniatis
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laborstory, 1982). Alternativ dazu können für manche Anwendungen Restriktionsfragmente
aus existierenden Bibliotheken erhalten werden. Beispielsweise hält die American Type
Culture Collection, Rockville, MD, Sammlungen menschlicher chromosomenspezifischer
Bibliotheken von Restriktionsfragmenten, welche der Öffentlichkeit
zur Verfügung
stehen.
-
Bei
der Behandlung der Restriktionsfragmente mit Exonuklease werden
Standardmethoden verwendet, ebenso bei der enzymatischen Neusynthese
der verdauten Stränge
in Gegenwart von markierten Vorläufersubstanzen.
Insbesondere wird der von James und Leffak, Anal. Biochem., Bd.
141, S. 33-37 (1984) offenbarten Technik gefolgt. Kurz gesagt, werden
zu den Restriktionsfragmenten etwa 3 Einheiten Exonuklease III pro
Mikrogramm DNA in einer Lösung,
bestehend aus 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2 und 1 mM Dithiothreitol, bei 37°C hinzugefügt. Die
Verdauung wird durch Erhitzen der Probe auf 60°C für 5-10 Minuten beendet. James
und Laffak berichten, dass diese Bedingungen zu einer Verdauung
von etwa 80-200 Nukleotiden pro Minute führen. Die tatsächliche
Verdauungsgeschwindigkeit wird abhängig vom Ausgangsmaterial und
der Charge der Exonuklease III sowie dem Ausgangsmaterial des DNA-Substrates
variieren, z.B. Guo et al., Nucl. Acids Res., Bd. 10, S. 2065. Ein
gewisses Maß an
Versuchen kann notwendig sein, um markierte Stränge der gewünschten Länge zu erhalten. Exonuklease
III ist kommerziell erhältlich,
z.B. Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) oder Promega Biotec
(Madison, WI). T4-Polymerase (BRL, Bethesda, MD) kann ebenfalls
sowohl für
den Exonuklease- als auch den Neusynthese-Schritt verwendet werden.
-
Die
mit Exonuklease behandelten Restriktionsfragmente dienen als Primer/Vorlage
für eine
DNA-Polymerase, welche die verdauten Stränge in Gegenwart markierter
Vorläufersubstanzen
neu synthetisiert. Die bevorzugte markierte Vorläufersubstanz ist biotinyliertes
Uracil als ein Ersatz für
Thymidin. Die Neusynthese wird unter Verwendung von DNA-Polymerase
I oder T4-DNA-Polymerase ausgeführt,
wobei nach der Methode von Langer et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., Bd.
78, S. 6633-6637 (1981) vorgegangen wird, die wiederum eine Adaptierung
der von Rigby et al., J. Mol. Biol., Bd. 113, S. 237 (1977) geoffenbarten
grundlegenden Technik der Nick-Translation ist, z.B. 1 Einheit E.
Coli-Polymerase I pro Mikrogramm DNA wird bei 37°C in einer Lösung, bestehend aus 100 mM
NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2,
1 mM Dithiothreitol und 50 mM KCl, inkubiert. In der Lösung sind
auch geeignete Mengen an Triphosphat-Vorläufern (wovon einer oder mehrere
markiert sind), z.B. 50-100
mikromolar von jedem für
20-50 Mikrogramm pro Milliliter Restriktionsfragmente. Unter diesen
Bedingungen ist die Neusynthese in etwa 40-60 Minuten beendet.
-
Die
markierten Restriktionsfragmente werden zu kleineren Fragmenten
zerbrochen, um sicherzustellen, dass die markierten Regionen auf
jeder Seite der markierten Restriktionsfragmente getrennt werden.
(Ansonsten würde
das markierte Fragment auf einer Seite Teil eines größeren Stücks einzelsträngiger DNA
sein, das zum markierten Fragment am anderen Ende komplementäre Regionen
enthielte). Ein solches Zerbrechen zu kleineren Fragmenten wird
durch eine beliebige Zahl von Standardtechniken erreicht, z.B. Beschallung,
enzymatische Behandlung oder dergleichen, Maniatis et al., Molecular
Cloning: A Laborstory Manual (Cold Spring Harbor Laborstory, 1982).
-
Nachdem
die markierten Restriktionsfragmente in geeigneter Weise zu kleineren
Stücken
zerbrochen worden sind, werden sie denaturiert und einzelsträngige markierte
Fragmente werden von den unmarkierten Fragmenten getrennt. Die Trennung
kann auf mehreren Wegen erreicht werden. Wenn die bevorzugte Markierung,
Biotin, verwendet wird, ist das bevorzugte Trennmittel eine Standard-Avidin-Affinitätssäule, z.B.
Bayer und Wilchek, "The
Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology", Methods of Biochemical Analysis,
Bd. 26, S. 1-45 (1980) und Manning et al., Biochemistry, Bd. 16,
S. 1364-1370 (1977). Avidin kann an eine Anzahl verschiedener Substrate,
wie z.B. Glas, Sepharose, Agarose und dergleichen, mit Standardtechniken,
wie sie in den obigen Referenzdokumenten beschrieben sind, kovalent
gekoppelt werden. Demgemäß werden
Manning et al. und Bayer und Wilchek, S. 9-16 durch Zitat aufgenommen. Avidin-Affinitätssäulen sind
auch kommerziell erhältlich,
z.B. Zymed Laborstories, Inc. (South San Francisco, CA). Die biotinylierten Sonden
werden von den Avidinsäulen
nach der Methode von Chollet und Kawashima, Nucleic Acids Resources,
Bd. 5, S. 1529-1541 (1985) entfernt.
-
Alternativen
zur oben geschilderten Markierungsmethode sind verfügbar. Beispielsweise
werden nach Behandlung der DNA, die für die Sonden verwendet werden
soll, mit einer Restriktionsendonuklease die erhaltenen Restriktionsfragmente
in zwei Teile getrennt. Der erste Teil wird wie oben beschrieben
behandelt. Das heißt,
er wird mit Exonuklease behandelt, um eine Vorlage bzw. Primer für die Neusynthese
eines markierten DNA-Stranges zu bilden. Die erhaltenen neusynthetisierten
Restriktionsfragmente werden dann wie oben beschrieben zu kleineren
Stücken
zerbrochen. Die Markierung muss in diesem Fall nicht Biotin sein.
Beispielsweise kann eine radioaktive Markierung verwendet werden.
Der zweite Teil wird auch mit einer Exonuklease, vorzugsweise Exonuklease
III, behandelt. Die Reaktion wird jedoch vollständig ablaufen gelassen, so
dass jedes Restriktionsfragment in zwei nichtkomplementäre, einzelsträngige Stücke mit
ungefähr
der halben Länge des
Ausgangsstrangs umgewandelt wird. Diese resultierenden Einzelstränge werden
dann unter Verwendung von Standardtechniken kovalent an DBM-Papier
gebunden, z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) S. 335-339 und Alwine
et al. Methods in Enzymology, Bd. 68, S. 220-242 (Academic Press,
New York, 1979). Demgemäß werden
die zitierten Seiten dieser Referenzdokumente durch Zitat aufgenommen.
Die Fragmente des ersten Teils werden denaturiert und mit dem DBM-Papier,
das die kovalent gebundenen Fragmente des zweiten Teils enthält, zusammengebracht.
Die Bedingungen werden so eingestellt, dass sie eine Hybridisierung
der markierten Stränge
an die komplementären, kovalent
an das DBM-Papier gebundenen Stränge
erlauben. Die unmarkierten Stränge
des ersten Teils werden vom Papier abgewaschen (es gibt keine komplementären Stränge, an
die sie hybridisieren könnten).
Nach dem Waschen werden die markierten Stränge beispielsweise durch Erhitzen
abgelöst
und sind verwendungsbereit.
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Vor
Applikation der Sonde auf die Ziel-DNA wird die Ziel-DNA mit der
gleichen Restriktionsendonuklease behandelt, die zur Konstruktion
der Sonde verwendet wurde. Nach Behandlung mit der Restriktionsendonuklease
wird die Ziel-DNA mit einer Exonuklease, vorzugsweise Exonuklease
III oder T4-Polymerase, behandelt. Vorzugsweise werden die Bedingungen
für die
Behandlung mit Exonuklease so einge stellt, dass die Längen der
erzeugten einzelsträngigen
Regionen im wesentlichen gleich den Längen der Sonden-DNA sind.
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Die
Hybridisierung der Sonde an die Ziel-DNA wird unter Verwendung von
Standardmethoden durchgeführt,
z.B. Gall und Pardue, Methods in Enzymology, Bd. 21, S. 270-480
(1981); Henderson, International Review of Cytology, Bd. 76, S.
1-46 (1982) und Angerer et al., in Genetic Engineering: Principles
and Methods, Setlow und Hollaender, Hrsg., Bd. 7, S. 43-65 (Plenum
Press, New York, 1985). Demgemäß werden
diese Referenzdokumente als Anleitung für die Verwendung der Erfindung
bei der In situ-Hybridisierung aufgenommen. Kurz gesagt, wird die
erfindungsgemäß hergestellte
Sonde mit mehreren anderen Mitteln zur Verringerung der unspezifischen
Bindung, zur Erhaltung der Integrität der zu sondierenden biologischen
Struktur und dergleichen kombiniert. Das resultierende Gemisch wird
hierin als Hybridisierungsgemisch bezeichnet. Das Verfahren wird
unten für
die chromosomenspezifische Färbung
von menschlichem Chromosom 21 angewendet.
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HindIII-Restriktionsfragmente
vom menschlichen Chromosom 21 sind vom National Laborstory Gene Library
Project durch die American Type Culture Collection, Rockville, MD,
Van Dills et al., "Human
Chromosome-Specific DNA Libraries: Construction and Availability", Biotechnologe,
Bd. 4, S. 537-552 (1986) erhältlich.
Alternativ dazu können
solche Fragmente gemäß den Offenbarungen
im oben zitierten Van Dills et al. oder in Fuscoe et al., "Construction of Fifteen
Human Chromosome-Specific DNA Libraries from Flow-Purified Chromosomes", Cytogenet Cell
Genet., 43:79-86 (1986) hergestellt werden.
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Klone
aus der Bibliothek mit einmaligen Einfügungssequenzen werden mit dem
Verfahren von Benton und Davis, Science, Bd. 196, S. 180-182 (1977)
isoliert. Kurz gesagt, werden etwa 1000 rekombinante Phagen zufallsmäßig aus
der Chromosom 21-spezifischen
Bibliothek isoliert. Diese werden auf Nitrocellulose übertragen
und mit gesamter genomischer DNA, die einer Nick-Translation unterworfen
wurde, sondiert.
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Von
den Klonen, die keine starke Hybridisierung zeigen, werden ungefähr 300 ausgewählt, die
offenbar DNA mit einmaliger Sequenz enthalten. Nach Amplifikation
der selektierten Klone wird die Chromosom 21-Einfügungssequenz
in jedem Klon mit 32P markiert und an Southern-Blots
von menschlicher genomischer DNA hybridisiert, die mit demselben
Enzym, d.h. HindIII, verdaut ist, das zur Konstruktion der Chromosom 21-Bibliothek
verwendet wurde. Einmalige Sequenzen enthaltende Klone werden als
jene identifiziert, die bei der Southern-Analyse eine einzige Bande
erzeugen. Etwa 100 solcher Klone werden für das heterogene Gemisch der
Sonden-DNA selektiert. Die Klone mit einmaliger Sequenz werden amplifiziert,
die Einfügungssequenzen
werden durch HindIII-Verdauung herausgeschnitten, und die Einfügungssequenzen
werden von den Phagenarmen durch Gelelektrophorese abgetrennt. Die
Sonden-DNA-Fragmente
(d.h. die einmaligen Einfügungssequenzen)
werden aus dem Gel entfernt und wie oben beschrieben mit Exonuklease
III behandelt, gefolgt von Neusynthese in Gegenwart von biotinyliertem
UTP-Vorläufer.
Die erhaltenen doppelsträngigen
Fragmente werden beschallt, so dass im Durchschnitt jedes Fragment
etwa 1,5-2,0 Brüche
erhält.
Die erhaltenen Stücke
werden denaturiert, und die biotinylierten Fragmente werden wie
oben beschrieben mit Avidin-Affinitätschromatographie isoliert.
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Menschliche
Lymphozyten-Chromosomen werden gemäß Harper et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., Bd.
78, S. 4458-4460 (1981) präpariert.
Metaphase- und Interphasezellen werden dreimal mit phosphatgepuffertem Kochsalz
gewaschen, mit Methanol-Essigsäure (3:1)
fixiert und auf gereinigte Objektträger aufgetragen. Die Objektträger werden
in einer Stickstoffatmosphäre
bei –20°C aufbewahrt.
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Objektträger, die
Interphasezellen und/oder Metaphasespreitungen tragen, werden aus
dem Stickstoff entnommen, mit RNase (100 Mikrogramm/ml für 1 Stunde
bei 37°C)
behandelt, für
etwa 1-16 Stunden mit HindIII bei 37°C (10 Einheiten M 10 mM Tris-HCl,
50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 und 14 mM Dithioenythritol
mit pH 7,6) behandelt, mit Exonuklease III wie oben beschrieben
behandelt und mit einer Ethanolserie dehydratisiert. Dann werden
sie mit Proteinase K (60 ng/ml bei 37°C für 7,5 Minuten) behandelt und
dehydratisiert. Die Proteinase-K-Konzentration wird abhängig von
der Zellart und der Enzym-Charge eingestellt, so dass fast kein phasenmikroskopisches
Bild der Chromosomen auf dem trockenen Objektträger zurückbleibt. Das Hybridisierungsgemisch
besteht aus (Endkonzentrationen) 2X SSC (0,15 M NaCl und 0,015 M
Natriumnitrat), 10 Prozent Dextransulfat, 500 Mikrogramm/ml Träger-DNA
(beschallte Heringsperma-DNA) und 2,0 Mikrogramm/ml Biotin-markierter
Sonden-DNA. Dieses Gemisch wird auf die Objektträger in einer Dichte von 3 Mikroliter/cm2 unter ein Deckglas aufgetragen und mit
Kautschukkitt verschlossen. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht,
werden die Objektträger
bei 45°C
gewaschen (50% Formamid-2XSS, pH 7, 3 mal 3 Minuten; gefolgt von
2XSSC, pH 7, 5 mal 2 Minuten) und in BN-Puffer (0,1 M Na-Bicarbonat,
0,05 Prozent NP-40, pH 8) eingetaucht. Die Objektträger werden
nach diesem Zeitpunkt nie mehr austrocknen gelassen.
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Die
Objektträger
werden aus dem BN-Puffer entnommen und 5 Minuten bei Raumtemperatur
mit BN-Puffer (5 Mikroliter/cm2 unter Kunststoffdeckstreifen),
der 5% fettfreie Trockenmilch (Carnation) und 0,92% Na-Azid enthält, blockiert.
Die Deckstreifen werden entfernt und überschüssige Flüssigkeit kurz abgesaugt, und
Fluorescein-Avidin
DCS (3 Mikrogramm/ml in BN-Puffer mit 5% Milch und 0,02% Na-Azid)
wird aufgetragen (5 Mikroliter/cm2). Dieselben
Deckstreifen werden wieder aufgebracht, und die Objektträger werden
20 Minuten bei 37°C
inkubiert. Die Objektträger
werden dann 3 mal jeweils 2 Minuten mit BN-Puffer bei 45°C gewaschen.
Die Intensität
der Biotin-gekoppelten Fluoreszenz wird durch Auftragen einer Schicht
von biotinyliertem Ziegen-Antiavidin-Antikörper (5 Mikrogramm/ml in BN-Puffer
mit 5% Ziegenserum und 0,02% Na-Azid) verstärkt, gefolgt – nach Waschen
wie oben – von
einer weiteren Schicht Fluorescein-Avidin DCS. Fluorescein-Avidin
DCS, Ziegen-Antiavidin und Ziegenserum sind alle kommerziell erhältlich,
z.B. Vector Laborstories (Burlingame, CA). Nach Waschen mit BN,
wird vor Betrachtung eine das Verblassen der Fluoreszenz hemmende
Lösung,
p-Phenylendiamin (1,5 Mikroliter/cm2 Deckstreifen)
zugegeben. Für
eine optimale mikroskopische Abbildung ist es wichtig, diese Schicht
dünn zu
halten. Diese verblassungshemmende Lösung verminderte das Verblassen
des Fluoresceins signifikant und erlaubt eine kontinuierliche mikroskopische
Beobachtung für
bis zu 5 Minuten. Die DNA-Gegenfärbemittel
(DAPI oder Propidiumiodid) sind in der verblassungshemmenden Lösung zu
0,25-0,5 Mikrogramm/ml enthalten.
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Der
rot-fluoreszierende DNA-spezifische Farbstoff Propidiumiodid (PI)
wird verwendet, um die gleichzeitige Beobachtung von hybridisierter
Sonde und gesamter DNA zu erlauben. Das Fluorescein und PI werden bei
450-490 nm (Zeiss-Filterkombination
487709) angeregt. Die Erhöhung
der Anregungswellenlänge
auf 546 nm (Zeiss-Filterkombination 487715) erlaubt die Beobachtung
des PI allein. DAPI, ein blau-fluoreszierendes DNA-spezifisches
Färbemittel,
das im Ultravioletten (Zeiss-Filterkombination 487701) angeregt
wird, wird als Gegenfärbemittel
verwendet, wenn Biotin-markierte und gesamte DNA getrennt beobachtet
werden. Metaphasechromosomen des Typs 21 werden durch zufallsmäßig angeordnete
gelbe Tupfen, die über
die Chromosomenkörper
verteilt sind, nachgewiesen.
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Die
Beschreibungen der vorhergehenden Ausführungsformen der Erfindung
werden zum Zwecke der Veranschaulichung und Beschreibung präsentiert.
Sie sind nicht als vollständig
anzusehen und sollen die Erfindung nicht auf die präzise offenbarte
Form beschränken,
und offensichtlich sind im Lichte der obigen Lehren viele Modifikationen
und Variationen möglich.
Die Ausführungsformen
wurden gewählt
und beschrieben, um die Prinzipien der Erfindung und ihrer praktischen
Anwendung bestmöglich
zu erklären,
um so andere Fachleute in die Lage zu versetzen, die Erfindung bestmöglich für verschiedene
Ausführungsformen
und mit verschiedenen Modifikationen, wie sie für den speziellen beabsichtigten
Gebrauch passend sind, zu nutzen.