JP2001503261A

JP2001503261A - 悪性細胞の状態の検証法および治療法

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Publication number: JP2001503261A
Application number: JP52014598A
Authority: JP
Inventors: ファビアン、カルボ
Original assignee: ファビアン、カルボ
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2001-03-13
Also published as: WO1998018960A1; FR2755148A1; US6277575B1; EP0941364B1; ATE322553T1; CA2269865A1; FR2755148B1; DE69735636D1; EP0941364A1; DE69735636T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、特に、in situにおいて遺伝子を標識すること並びに悪性度の点で試験細胞を通常細胞と比較して遺伝子構造の誤差を評価して細胞核の中に存在する少なくとも１個の遺伝子の正確な構造を明らかにすることを特徴とする悪性細胞の状態を検証する方法に関する。再組織化遺伝子は抗癌方法において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】悪性細胞の状態の検証法および治療法本発明は、一般的に診断レベルおよび治療レベルで、特に抗癌治療レベルで、癌抑止中の細胞核の再組織化およびそのもたらす結果を検証することである。遺伝子の活性化であれ沈黙化であれ、その発現の調節が２段階で展開し、これらの段階中においてまず核中の染色体の転写前の画分化が観察される事をますます多数の指数が示している。本発明は、癌組織中において、この画分化が正常細胞と異なるように生じ、この事が診断要素を成す事実を明らかにした。特に遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１のメカニズムと、腫瘍発生プロセスの抑制に役立つ活性化に際してのその挙動メカニズムとを研究する際に、このような観察が実施された。このような現象は、特にこのプロセスを追跡する事のできるＤＮａｓｅＩ（デオキシリボヌクレアーゼＩ）法の完成によって明かにする事ができた。ＤＮａｓｅＩ法は、転写レベルにおける活性クロマチンが特にヌクレアーゼの作用に対して敏感である事の観察に基づいている。クロマチンは特にＤＮａｓｅＩに対する超感度部位を含む（この場合、多数の裂開剤に対して非常に敏感な比較的短いＤＮＡセグメントが問題となる）。ヌクレオソーム以外のこれらのＤＮＡセグメントは種々の遺伝子発現機能と結合されている。このような「開放クロマチン区域」は特定因子を固定する事ができ、重要な調節機能を有し、従ってマーキングされたＤＮＡは露出されたＤＮＡであると言われる。従ってこの方法によって、特に癌現象中のゲノム全体の組織化の解析を可能とするマーカーとして、遺伝子の転写とインサイチュ（in situ）ＤＮａｓｅＩに対するその超感度との間にありうる関係が研究された。下記において「ＤＮａｓｅＩ法」と呼ばれる一般的方法は公開米国特許第５，２６４，３４３号に記載され、この文献を引例としてここに加えるが、この文献に記載の情報については詳細に繰り返さない。またＰｕｃｋほかの文献を引用する(Puck T.T.,Bartholdi M.，Krystosek A.，Johnson R．& M.Haag，Somatic Ce ll and Molec.Genetics 17,489-503,1991)。しかし、前記の特許に記載の方法は、フォルモル／パラフィン法によって固定された組織、すなわち大部分の病理解剖研究室において実施される方法によって得られる組織の解析を実施する事ができない。実際に前記の米国特許に記載の方法は、本質的に細胞培養システムの解析に関するものである。従って本発明の目的の１つは、固定された組織の診断を実施する事のできる新規なＤＮａｓｅＩ法を提供することである。しかしさらに本発明の目的は、細胞核中の少なくとも１つの遺伝子の詳細な立体配座を遺伝子のインサイチュマーキングによって明かにし、正常細胞に対するこの立体配座の差異をその悪性度指数として評価するようにした悪性細胞の検証法にある。実際に、ＤＮａｓｅＩ法によって露出されたＤＮＡの位置の検証が組織の悪性状態の全体的解析を可能とするならば、これに対して染色体中の少なくとも１つの遺伝子の詳細な立体配座の研究と正常細胞に対するその偏差の測定は、悪性細胞の種々の型の分類を可能にするのみならず、その悪性度指数を評価し、またもちろん、これによって治療法の追跡調査を実施する事を可能にする。下記において、腫瘍形成と直接に結びついていないが核内部の染色体の脱組織化、例えば嚢状線維症を特徴とする現象の説明のために、場合によって用語「悪性」または「悪性度指数」を使用する事を注意しなければならない。この第二の方法も、立体配座、すなわち１つまたは複数の遺伝子の位置のみならず必要ならばその構造を任意適当な手段によって、特に例えば蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）によって評価する際に、細胞の悪性状態に従って、腫瘍の抑制および／または活性化に関連する一部の遺伝子が核の中心から外部にむかって移動し、またこれらの遺伝子の正常造伝子に対する偏差が細胞の良好な指数を成し、これを下記において「悪性度指数」と呼び、またこの指数は正常細胞と不可逆的悪性とみなされた細胞との間において適当な任意方法によって評価する事ができる。この方法は細胞核中の相異なる遺伝子の位置および核中のこれらの特異的遺伝子の三次元構造の関数として腫瘍を分類する事ができる。まず第一に、核中の遺伝子の位置を単にこれらの遺伝子を担持する染色体動原体の位置の測定によって研究する事が可能になる。この方法は動原体プローブ型のハイブリダイゼーションプローブによって実施する事ができ、この場合、正常度は動原体プローブを担持する染色体の外周部域決定に対応し、さらに詳しくは下記に説明するように、これらの動原体プローブは染色体１３ｑおよび１６ｑに対応する事ができ、これらの染色体は、染色体１６ｑ上に共局在する遺伝子ＨＵＭＳＩＡＨおよびＲｂｒ−２、並びに染色体１３ｑ上に局在する遺伝子Ｒｂの担体であり、これらの遺伝子が癌抑制現象の中に含まれる。もちろん、本発明の方法において使用される動原体プローブは他の任意の細胞染色体に対応する事ができ、同様に本発明の方法による遺伝子マーキングは細胞の染色体全体のうちから選択された１つまたは複数の染色体上に担持された１つまたは複数の遺伝子に対応する事ができる。しかし、前述のように、本発明はまた固定後の組織の細胞の全体的悪性状態を検証する方法において、露出された核ＤＮＡおよびＤＮＡ全体をＤＮＡ特異マーカーによってマーキングし、これらの２つのマーカーが汚染されていない特異信号を発生する事ができる事を特徴とする方法に関するものである。「汚染されていない特異信号」とは、２つのマーカーに対応する２つの信号を顕著な汚染なしで別々に可視化できる事を意味する。一般的に、核ＤＮＡは前述のようにＤＮａｓｅＩ法によってマーキングされ、またＤＮＡはクロモマイシンＡ−３特異マーカー（ＣＡ−３）によってマーキングされる。露出された核ＤＮＡマーカーのうち、特にペルオキシダーゼと共に使用されるテトラメチルロダミンを挙げなければならない。ペルオキシダーゼによるマーキングは任意適当な方法によって実施する事ができ、特にアビジン型、またはストレプトビジン／ビオチン型またはＤＩＧ／アンチＤＩＧ型（ジゴキシゲニンに対してＤＩＧ）のカップリングを使用する事ができる。実際に、チラミド−ＴＲＩＴＣと呼ばれるペルオキシダーゼ基質は得られた信号を１５倍増幅する事ができ、このようにして核中の信号の微細分布を解析する事を可能にする。ＤＮＡの特異的マーカーを使用する利点は細胞環を半自動的に解析する事を可能にし、従ってＤＮａｓｅＩ法によって得られたゲノムの露出と細胞環の相とを相関させうる事にある。このようにして、本発明はまた組織細胞の悪性状態の指数としてのＤＮＡの特異的マーカーによって検証された細胞環の相に対して露出核ＤＮＡの位置を評価する事を特徴とする方法に関するものである。さらに、使用される２種類のフルオロクロムは光スペクトルの同一区域、すなわち６００ｎｍにおいて放射するが、その特異的励起は非常に相異なり、すなわちＣＡ−３の場合は４６７ｎｍ、ＴＲＩＴＣの場合は５１４ｎｍであり、また消滅係数を有するので、２つのマーカーの間においてまったく汚染を伴なわずに、特異的信号をえる事ができる。さらにこれらのマーカーの故に、顕微鏡検査において最も普及したアルゴン・レーザ１台のみで解析を実施する事ができる。この本発明による方法は通常法によってフォルモルの中に固定された組織を使用する事ができ、従って例えば組織コレクションから得られた組織を解析する事ができる。一般的に、前記の方法は組織および／または細胞培養から悪性状態を診断する事を可能にし、また作成された分類によって診断病理学における予後因子を立てる事ができる。さらに詳しくは、前記の方法は例えば良性病理としての単純過形成（胸部、前立腺）と、確証する事が困難で「ボーダライン」として公知の病理を成すが本発明の場合には前述の種々のマーキング要素によって容易に分類する事のできる可変的展開を示す異型的過形成（胸部、前立腺）と、インサイチュ癌腫とを区別する事を可能にする。またこれらの方法は、抗癌剤を試験するための複数のモデルを迅速に確立し、特に二、三の特異的染色体の再組織作用に対する抗癌剤の作用を研究して、種々の抗癌剤のさらに詳細な分類を可能とする。好ましくは、抗癌剤または関連物を試験するため、前記の手順を実施し、この場合まず悪性細胞の状態を検証し、次に前記細胞を抗癌剤または関連物によって処置し、次に悪性度指数の変動を測定する事によって前記化合物の活性を評価する。本発明は、本発明の方法によって選択された事を特徴とする抗癌剤または関連物を含む。関連物とは、腫瘍形成に直接に結びつけられていないが前述の定義のような病理に作用する生成物を言うものとする。もちろん、これによってこれらの生成物は処置に際して治療の追跡調査を可能とする。最後に本発明は核のレベルにおいて脱組織化を示す細胞の治療法、およびこの方法の二、三の病理、特に腫瘍の治療に対する応用に関するものである。本発明は、遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１と関連した細胞核再組織特性の検証に基づいている。遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１と信号ｐ５３との関連、サイクリンに依存するキナーゼの抑止剤（ＣＤＫｓ）としての役割および染色体内部複製の制御におけるのその役割は、この遺伝子が細胞成長の制御に大きな役割を果たす事を示している。モデル中の遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１の再発現が腫瘍の抑止を導く事を明らかにした。この故に本発明は、核の脱組織化を示す細胞の治療法において、遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１の生成物または均等生成物の発現を生じまたは前記の遺伝子生成物または均等物を導入する事を特徴とする方法を提供するにある。遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１は公知であり、すでに繰り返し記載されており、その特徴、その分離、またはその一部の特性に関しては、下記の文献およびその引用文献を参照されたい。下記に説明するように核の脱組織化は腫瘍の原因でありうるが、他の型の脱組織化もありうる。本発明による細胞治療法は、核の脱組織化が腫瘍現象によるものであれ非腫瘍現象によるものであれ、均等に本発明の一部を成す。「核の脱組織化」とは、遺伝物質、特に染色体が正常状態において細胞核の中に占める位置と異なる位置を占める事を意味し、このような脱組織化は特に前記の方法によって検証される。核の脱組織化現象は特に腫瘍現象において検証されたが、この脱組織化は非腫瘍型の他の現象、例えば嚢状線維症（ＣＦＴＲ）においても介入する事ができる。従って本発明による方法は、ｐ２１ＷＡＦ１に対応する遺伝子の発現の再誘導によるにせよ、この遺伝子または均等生成物、すなわち遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１の生成物と同様の再組織活性を有する生成物、を利用するにせよ、細胞核の遺伝物質を再組織する事ができる。もちろん遺伝子の発現の誘導の代わりに、この遺伝子またはその発現生成物の抑制の阻止を使用する事ができる。遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１または均等生成物の発現は任意公知の方法によって実施する事ができ、その例としては特に細胞中において発現されるプロモータの制御のもとに対応の遺伝子を導入されたウイルス起源の発現ベクターを使用し、この導入は、ベクターが非染色体のままであるか、またはベクターが染色体の中に合体されているかに関わらず、ｐ２１ＷＡＦ１の生成物の発現および細胞の悪性の減少に導く。ウイルスベクターとしては、特にアデノウイルス・ベクター、レトロウイルス・ベクター、ヘルペスウイルス・ベクターまたは合成型システムまたは裸ＤＮＡも挙げる事ができる。ｐ２１ＷＡＦ１遺伝子はその全体を発現させることもできるが、ある種の切断型、欠失型または変異型の変形は、均等な性質を呈することができ、それゆえ、本発明の方法の一部をなす。たとえば細胞培養によって得られた遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１の産物ならびに先に述べたような均等な産物を産生する培養物を使用できる。天然のｐ２１ＷＡＦ１のプロモーターのインサイチュでの再活性化またはそれのインサイチュでの発現を抑制する系の阻害を図ることも可能である。一般に、本発明は、遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１の発現産物または均等な産物あるいは該産物の発現を確保・保証する化合物を、癌性過程にある細胞または核の異常編成を伴う非癌性タイプの細胞の細胞核の再編成を確保・保証するための医薬の製造に用いることならびに遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１の発現産物または均等な産物あるいは該産物の発現を確保・保証する化合物を活性成分として含有することを特徴とする治療用組成物に関するものである。本発明のその他の特徴および利点は、以下に記載する、添付の図面を参照しての実施例から明らかになるであろう。図面の説明は以下の通りである：図１：図１は、対照（ｐＲＳＶ）およびｐ２１ＷＡＦ１を発現する（ｐＲＳＶ−ｐ２１）形質転換（トランスフェクション）Ｕ９３７細胞におけるｍＲＮＡの差異のある発現を示している。ノーザンブロットによる分析は、ベクターのみでトランスフェクトした対照ｐＲＳＶ細胞と比較して、ｐＲＳＶ−ｐ２１形質転換細胞におけるｐ２１ＷＡＦ１、ＨＵＭＳＩＡＨ、ＲｂおよびＲｂｒ−２の活性化を示している。ＧＡＰＤＨを対照プローブとして用いている。図２：トランスフェクトしたｐＲＳＶ−ｐ２１細胞と比較したときのベクター単独でトランスフェクトした対照Ｕ９３７ｐＲＳＶ細胞の腫痘形成腫瘍形成は、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに１０⁷個の細胞を皮下注射したのちに評価している。図３：トランスフェクトした細胞Ｕ９３７ｐ２１ＷＡＦ１における１６番染色体の再配置。ｂ）１６番染色体のアルフォイド動原体プローブを用いた蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)、２つまたは３つの点（通常は赤色）が核（通常は青色）の内部に現れ、標識動原体プローブに対応する蛍光信号を示す。ａ）は対照形質転換（ｐＲＳＶ）Ｕ９３７細胞の核に相当し、ｂ）はｐ２１ＷＡＦ１形質転換Ｕ９３７細胞（ｐ２１−ＷＡＦ１）の核に相当する。対照形質転換Ｕ９３７細胞および形質転換細胞ｐ２１−ＷＡＦ１の核はＤＡＰＩで標識されている( 青)。ＦＩＳＨの信号は、チラミド−ＴＲＩＴＣにより明らかにされている(赤) 。ここでは、試料の１６番の三染色体性から考えて３つの点をみることができる。ｃ）トランスフェクトした細胞Ｕ９３７ｐ２１ＷＡＦ１（ｐ２１−ＷＡＦ１）の拡大図、核の距離コード像付き。ｄ）核の極限的境界に対する距離により分類したときの画素（ピクセル）サイズの順次の層の表示。ｅ）二次元像からの核体積の復元。球（Ｒ：半径）は一組の円柱（半径：ｒｉ、高さ：ｈｉ、厚み：ΔＲ）に切り分けられている。ｆ）周辺分布を、厚み２／１０Ｒの環状体中のランダム分布によりモデル化したもの。ｇ）核の極限的境界との距離に応じて種々の厚みの環状体における信号の分布のモデル化。図４：核の極限的境界から測定した信号の分布のヒストグラム。対照形質変換細胞Ｕ９３７ｐＲＳＶ（■）と形質変換細胞Ｕ９３７ｐＲＳＶ− ｐ２１（□）との比較。ａ：球内のランダムな点の分布。ｂ−ｆ：１６番染色体(ｂ)、１３／２１番染色体(ｃ)、１７番染色体(ｄ)、遺伝子ｐ５３（ｅ）および遺伝子Ｒｂ（ｆ）のそれぞれについて核の極限的境界から測定したときのＦＩＳＨ信号の分布。実施例１トランスフェクションヒトｐ２１ＷＡＦ１遺伝子をコードする全ｃＤＮＡを、ファージミドｐＢＫ− ＲＳＶ（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。構築物を、試剤リポフェクチン（ギブコ−ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。３．５ｘ１０⁶個の細胞を、リポフェクチン（３０μｇ）−ＤＮＡ（２０μｇ）の複合体とともに８時間インキュベートする。ノーザンブロットによる分析ｍＲＮＡの抽出およびノーザンブロットを、標準的操作法を用いて行う。ｐ２ＩＷＡＦ１プローブは２．１ｋｂのｃＤＮＡに相当する。ＨＵＭＳＩＡＨについては、１．４ｋｂのｃＤＮＡ断片を使用する。Ｒｂ１プローブはＨＰ１２６（メドジーン）であり、Ｒｂｒ−２プローブは、つぎのプライマーを用いて得た３９３ｂｐのＰＣＲ断片である：５’−ＴＧＧＧＡＣＡＧＣＴＡＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＧＡ−３’および５’−ＣＡＣＡＧＴＡＣＡＧＧＧＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＴＧＴＴ−３’ 腫瘍原性の分析ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスへの注射を先に記載されている（Ｔｅｌｅｒｍａｎら、１９９３年）通りにして実施した。１部位当り１０⁷個の細胞を注射した。動物らを３か月間追跡した。統計解析には、マン−ホイットニー検定を用いた。デオキシリボヌクレアーゼＩへのゲノムの暴露デオキシリボヌクレアーゼＩへのゲノムの暴露試験は、パック（Ｐｕｃｋら、１９９１年）が記載しているものに比して修飾したものであった。細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ＰＢＳ：燐酸緩衝食塩液）中で固定し、脱水し、 −８０℃で保存する。外界温度のＮＴ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、５０ｎｇ／ｍ・ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)）中で３０ＵのデオキシリボヌクレアーゼＩ（ベーリンガーマンハイム、ドイツ）および４０ＵのＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガーマンハイム、ドイツ）、１００ｍＭのｄＮＴＰ−ジゴキシゲニン標識化混合物（ベーリンガーマンハイム、ドイツ）を用いて、インサイチュでのニックトランスレーション（ＮＴ）を実施した。インサイチュで修復されたＤＮＡを、ペルオキシダーゼに結合させた抗ジゴキシゲニン抗体（ベーリンガーマンハイム、ドイツ）および基質としてのチラミド−ＴＲＩＴＣ（デュポン、アメリカ合衆国）を用いて、現像した。切片をクロモマイシンＡ３（シグマ、アメリカ合衆国）により標識化した。分析は、蛍光モードでの共焦点走査レーザー顕微分光測光法（ＭＲＣ６００、バイオラド、イギリス）により実施した。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）ＦＩＳＨは、先にリナレス−クルスら（Ｌｉｎａｒｅｓ−Ｃｒｕｚら、１９９５年、ＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，２７，１５−２３）に記載されている通りに実施した。つぎのプローブ（オンコル(ＯＮＣＯＲ)、アメリカ合衆国）を使用した：１６番染色体に対応するアルフォイド動原体プローブ( Ｄ１６Ｚ２)、１７番染色体に対応するアルフォイド動原体プローブ（Ｄ１７Ｚ１）ならびに１３／２１番染色体に対応する（Ｄ１３Ｚ１／Ｄ２１Ｚ１）および遺伝子ｐ５３およびＲｂに対応するアルフォイド動原体プローブ。分析は、エピ（副次）蛍光顕微分光測光法（三重の通過バンドを備えた冷却３ＣＣＤカメラ（フランスのレーザ（Ｌｈｅｓａ）社製）を使用）により、７６８ｘ５１２画素のマトリックスにディジタル化された開口数（ＮＡ）の小さい（４０ｘ：０．７５ＮＡ）レンズを用いて、実施した。各画素は対象物の５５ｘ５５ｎｍに相当する。画像分析距離の測定は、画像分析システムＳＡＭＢＡＩＰＳ（ユニログ(ＵＮＩＬＯＧ)、スランス）を用いて行った。「トップハット」トランスフォーメーションによってマーカー（標識）を抽出し、ＤＡＰＩによる蛍光画像からの閾値によって核を分別した。マーカーおよび核についてそれぞれ２つの二値画像を得た。逐次エロージョンを行って、マーカーと核の縁との間の距離を測定した。マーカーの位置は、それらの画像と前記距離との交わりによって求めた。この方法によって、核の全体をそれらの形態に無関係に分析することができる。核の寸法の差を補償するために、各距離値を相当する核の半径で除して、それらの距離を系統的に正規化した。距離の分布モデル実験で得られた距離の比較のために用いたモデル曲線は、立体解析学的シミュレーションによって作成した。核の三次元表示は、ワンセットの円柱の形の球形モデルと同等とみなした。基本円柱の体積（ｖｉ）は次式によってマーカーの存在確率（Ｐｉ）と相関関係にある：Ｐｉ＝Ｖｉ／Σｖｉ。Ｒを核の半径、ηを円柱の半径、ΔＲを円柱の厚み、ｈｉをその高さとすれば：ｖｉ＝ΠΔＲ（２η− ΔＲ）ｈｉとなる。この方程式によって、球内のランダム分布および異なる厚みの環状（ドーナツ状）体中の周辺分布を追跡できる。このモデルでは、得られた関数は核の楕円形状とは無関係である。焦点調整（赤道面）で整合させたＦＩＳＨスポットを分析する。各ケースについて１００個以上の核を評価した。統計解析核の半径を８クラスに分ける。核の縁とＦＩＳＨ信号との間の各測定距離をこれら８つのクラスの１つに登録する。２つの仮説を検定するために、χ²検定を用いた。第一に、Ｕ９３７ｐ２１ＷＡＦ１細胞で測定された距離が、ベクターのみでトランスフェクトされたＵ９３７細胞で測定された距離と同様に分布するという仮説である。第二に、２つの細胞系で測定された距離は球内のランダムな点と同様に分布するという仮説である。Ｐ＜０．００１をもって有意差を示すものであると考える。モデル系におけるｐ２１ＷＡＦ１の再発現形質転換した細胞は、インビトロおよびインビボで同時に腫瘍を形成する系統であって、ｍＲＮＡレベルでも蛋白質レベルでもｐ２１ＷＡＦ１をほとんど発現しない（Ｔｅｌｅｒｍａｎら、１９９３年およびＮｅｍａｎｉら、１９９６年）腫瘍細胞系Ｕ９３７の細胞である。腫瘍細胞系Ｕ９３７から誘導し、パルボウイルスＨ−１を用いて選択した娘細胞ＵＳ３−ＵＳ４は腫瘍性表現型の抑制を示すことが認められた。たとえば、Ｕ９３７細胞は、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスへの注射部位の８０％で腫瘍を形成するが、ＵＳ３細胞は腫瘍を形成せず、ＵＳ４細胞は２０の注射部位で腫瘍を形成することが示された。その代わりに、これらの細胞ＵＳ３およびＵＳ４は、ｐ５３ルートとは無関係に、きわめて高いレベルのｐ２１ＷＡＦ１を構成的に発現する。このため、これらの観察に基づいて、特異的遺伝子発現に及ぼすｐ２１ＷＡＦ１の影響およびｐ２１ＷＡＦ１により安定にトランスフェクトされたＵ９３７細胞の腫瘍の抑制を研究することとした。ｐ２１ＷＡＦ１による特異的遺伝子発現の誘発および腫瘍原性の抑制前記のベクターによるＵ９３７細胞のトランスフェクションののち、ノーザンブロット分析（図１参照）のあとで、ｐ２１ＷＡＦ１によりトランスフェクトされたＵ９３７細胞（ｐＲＳＶ−ｐ２１）は、ショウジョウバエ”ｓｅｖｅｎｉｎａｂｓｅｎｔｉａ”の遺伝子のヒト相同染色体（ＨＵＭＳＩＡＨ）のｐ２１ＷＡＦ１遺伝子の発現に相当するきわめて高いｍＲＮＡ含量を示すことが認められる。この遺伝子（経路３で活性な癌抑制遺伝子ＴＳＡＰ３とも呼ばれる）は、アポトーシスおよび癌抑制のきわめて早期の段階で野性ｐ５３蛋白質によって活性化される(Ｎｅｍａｎｉら、１９９６年およびＡｍｓｏｎら、１９９６年)。その上、網膜芽細胞腫感受性遺伝子Ｒｂ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、１９９２年）およびＲｂに関連するｐ１３０をコードする遺伝子(Ｒｂｒ−２)（Ｈａｎｎｏｎら、１９９３年ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７，２３７８−２３９１）も、Ｕ９３７細胞の形質転換体ｐ２１においてきわめて強度に活性化される(図１参照)。ｍＲＮＡおよび蛋白質レベルでのｐ５３遺伝子の発現は、対照においてもトランスフェクトした細胞においても検出できない(結果は示さない)。Ｒｂ遺伝子の発現はそれの腫瘍抑制性を確証するものであり、Ｒｂｒ−２遺伝子の場合の細胞周期およびＨＵＭＳＩＡＨの染色体局在におけるそれの関与についても同様である。しかしながら、３つの独立した実験（沃化ポピジウムを用いての）でのＦＡＣＳ（フローサイトメトリーによる分析）による細胞周期の解析は、対照でトランスフェクトしたＵ９３７細胞とＵ９３７ｐ２１−ＷＡＦ１細胞との間で有意差を明らかにしなかった（得られた結果の例：ｉ）対照でトランスフェクトしたＵ９３７細胞：Ｇ１６５％／Ｓ２９％／Ｇ₂６％；ｉｉ）Ｕ９３７ｐ２１−ＷＡＦ１細胞：Ｇ１６４％／Ｓ３９％／Ｇ₂６％)。倍加時間も両細胞系で類似しており、それぞれ、対照でトランスフェクトしたＵ９３７細胞で３３時間、Ｕ９３７ｐ２１ＷＡＦ１細胞で３６時間である。Ｓｃｉｄ／Ｓｃｉｄマウスへの注射を先に記載したのと同様にして実施する。ベクター単独でトランスフェクトした細胞（ｐＲＳＶ）と比較する。対照としてＧＡＰＤＨを用いる。前記ベクター類によるＵ９３７細胞のトランスフェクションののち、ｐ２１ＷＡＦ１で安定的にトランスフェクトされたＵ９３７細胞（ｐＲＳＶ−ｐ２１）は悪性表現型の顕著な消失を示すのが認められる(図２参照)。２４日後、ベクターのみを含有するＵ９３７細胞を注射したｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスは、すべての部位で、屠殺しなければならないほどの体積の腫瘍を呈する。これに対し、トランスフェクトＵ９３７ｐ２１ＷＡＦ１細胞の２０の注射部位のうち９部位のみが、体積のずっと小さい、遅延型と思われる腫瘍を形成した。さらに６週間の観察ののちにも、他の腫瘍は現れなかった。このように、細胞周期の重大な変化なしでのｐ２１−ＷＡＦ１遺伝子の特異的誘発は、腫瘍抑制の分子過程の活性化の部分的な原因となっている。実施例２デオキシリボヌクレアーゼＩ法 − 核の再組織化に及ぼすｐ２１ＷＡＦ１の影響この実施例は、ありうべき核の再編成におけるｐ２１ＷＡＦ１の役割を調べることを目的としている。核中の染色体の位置が細胞の表現型を持ちうることを明らかにするのに用いた方法は、暴露されたＤＮＡ（すなわちある条件下でデオキシリボヌクレアーゼＩに対してより感受性であり、そのためそれらの部分を標識化するのと可能ならしめる染色体の部分）を可視化することを可能ならしめるデオキシリボヌクレアーゼＩ法である。これを行うために、ＵＳ特許５２６４３４３に記載されているごときデオキシリボヌクレアーゼＩ法を、ただし組織に適用できるようにして、実施した。組織を、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド混合物中で１０分間固定し、脱水し、−８０℃で保存する。「ニックトランスレーション」による標識化を、「ニックトランスレーション」緩衝液（ＮＴＢ）および溶液１０ｘ（１００ｍｌ）を用いて行う。ＮＴＢは、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭβ −メルカプトエタノールおよび５０ｎｇ／ｍｌのＢＳＡを含有している。前記の溶液１０ｘ（１００ｍｌ）は、トリスＨＣｌｐＨ８（１Ｍ）５０ｍｌ、ＭｇＣｌ₂（１．５Ｍ）３．３ｍｌ、β−メルカプトエタノール（１４．２Ｍ）７００ｍｌおよびＢＳＡ（３％）１．６６μｌを含有している。各切片当たりデオキシリボヌクレアーゼＩを３０単位含有するＮＴＢ１００μ ｌで組織を処理する。外界温度で３分間インキュベートし、ＥＤＴＡ２０ｍＭ、ｐＨ８で３分間ブロックし、つぎにＮＴＢで３回洗う。つぎに、１００μｌのＮＴＢを４０ＵのＤＮＡポリメラーゼおよび１００μＭのｄＮＴＰジゴキシゲニンと共に用いる(各切片当たり１０％の溶液１０ｘ)。外界温度で６分間インキュベートし、上記と同様にＥＤＴＡでブロックし、ＮＴＢで３回洗う。標識化は、３％のＢＳＡによる飽和ののちに行い、可視化は、ペルオキシダーゼ標識抗ＤＩＧ抗体を用いて行い、ＰＢＳで３回洗浄後、基質としてチラミド− ＴＲＩＴＣを用い、つぎにＰＢＳで３分間洗う。つぎに、プラークをクロモマイシン３−Ａを用いて対比発色させる。分析は、共焦点レーザー顕微鏡（ＭＲＣ６００バイオラド）を用いて蛍光モードで行う(結果は、本明細書には含まれていないが、カラー写真によって表わされる)。癌性親細胞Ｕ９３７または対照ベクターでトランスフェクトした同細胞は、哺乳動物の癌腫の生検で観察されるような散在性の外観を呈する。ｐ２１ＷＡＦ１でトランスフェクトしたＵ９３７細胞は、ゲノムのデオキシリボヌクレアーゼＩへの露出によって本質的な変化を示し、腫瘍性表現型の抑制されたＵＳ３−ＵＳ４細胞に似た外観を呈し、また、正常乳房の生検で観察される上皮細胞に相当する外観を呈し、すなわち核周辺の環状部に標識化を示す。この核再編成は、腫瘍原性の抑制における遺伝子の活性化と関連している可能性がある。ｐ２１−ＷＡＦ１により誘発されるこの核再組織化は、この誘発の直接的効果であるかもしくはｃｄｋ（「サイクリン依存性キナーゼ」）活性阻害剤としての機能に関係している可能性がある。核ラミナのグループ（Ｆｏｉｓｎｉｅｒら、１９９３年、Ｃｅｌｌ，７３，１２６７−１２７９）はｃｄｋ−有糸分裂活性に特徴的な標的の一つである。核修飾は、これらの核ラミナの燐酸化状態の変化の結果でありうる。それゆえ、デオキシリボヌクレアーゼＩに対して感受性の部位の分布におけるこの重要な変化は、ｐ２１−ＷＡＦ１により誘発される核内部への染色体の移動開始の原点となりうるのかもしれない。実施例３ｉｎｓｉｔｕ標識化１６番アルフォイド動原体プローブによるＤＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションを以前に記載されている（ＫｌｉｎｇｅｒＫ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５１，５５−６５(１９９２)）通りに実施する。ＨＵＭＳＩＡＨおよびＲｂｒ−２は染色体１６ｑに共局在し、Ｒｂは染色体１３ｑに局在化するので、相当するプローブを使用する。インサイｓチュハイブリダイゼーションによる蛍光（ＦＩＳＨ）をディジタル光学顕微鏡観察と組合せ、１６番染色体に対応するこれらのアルフォイド動原体を用いると、得られたカラー写真（本明細書では白黒）(図３、ａ）−ｄ）参照)で、Ｕ９３７細胞が核の中心近くにハイブリダイゼーションの信号を示すことを観察できる。これに対して、ｐ２１ＷＡＦ１でトランスフェクトしたＵ９３７細胞および腫瘍を抑制されたＵＳ３−ＵＳ４細胞は、核の周辺領域に検出される信号を示す。対照形質転換Ｕ９３７細胞の核および形質転換細胞ｐ２１−ＷＡＦ１をＤＡＰＩ（青）で標識化する。ＦＩＳＨ信号をチラミド−ＴＲＩＴＣ（赤）により現像する。生理学的観点からは、これらの観察は、間期の染色体の領域編成の証拠を確固たるものにする。核内の遺伝子の精密なトポロジーコンフォメーションは、明白な機能上の影響を示す。とくに、この核再編成は、腫瘍形成過程において沈黙している腫瘍の抑制に関与する遺伝子の活性化によるものである可能性がある。使用した各プローブについて、核の縁からの距離を測定し、モデルに組み込んだ(図３、ｅ）−ｇ）参照)。トランスフェクトした細胞Ｕ９３７ｐ２１−ＷＡＦ１は、核の周辺領域への明確な転位を示す全体的な信号分布を示す(図４参照)。動原体プローブに対応するこれらのＦＩＳＨ信号の分布は、腫瘍細胞と腫瘍抑制を示す細胞との間で統計的に差がある。χ²検定はきわめて有意である(ｐ＜０．００１)。遺伝子Ｒｂおよびｐ５３に特異的なプローブを用いるとき、ｐＲＳＶベクター単独でトランスフェクトした細胞およびｐ２１−ＷＡＦ１でトランスフェクトした細胞に対応するＦＩＳＨスポット間には分布において統計的有意差（χ²検定を用いたとき）は認められない(図４参照)。生理学的観点からは、これらの観察は、間期の染色体の領域編成を強度に示唆する観察（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，１５３３−１５４０；Ｃｒｅｍｅｒら、１９９３年、量的生物学に関するコールド・スプリング・ハーバーシンポジウム、ＬＶＩＩＩ，７７２−７９２およびＰｕｃｋら、１９９１年）を補足するものである。クロマチンの特異的領域は、はっきりと、非無作為的に、先に記載されているごとき空間内位置を占める(Ｈｕｌｓｐａｓら、１９９４年、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，１０３，２８６−２９２；Ｎａｇｅｌｅら、１９９５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，１８３１−１８３５)。遺伝子発現と染色体の再配置との間に相関関係があるというのは不確かであり、いくつかの結果が染色体の周辺領域に優先的に局在している活性および不活性遺伝子を同時に示していることから、その点はなお研究すべきところである。我々の研究は、ｐ２１−ＷＡＦ１により誘発された腫瘍原性抑制の場合、コードする遺伝物質を含まない動原体領域が再配置されることを示している。上で分析した染色体の動原体領域の再配置は、染色体領域の構成が修飾されるメカニズムの原点である可能性がある。かかる領域修飾は、特定の遺伝子の空間環境に影響し、それの発現を変化させる可能性がある。核内部の遺伝子の精確なトポロジーコンフォメーションが機能上の影響をもつであろうことは明らかである。実際、ショウジョウバエにおける位置の影響の多様性を記述している最近のいくつかの研究は、遺伝子発現における特定の核構成の機能上の重要性をはっきりと明らかにしている(Ｃｓｉｎｋら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ，３８１，５２９−５３１；Ｄｅｒｎｂｕｒｇら、１９９６年、８５，７４５−７４９)。結論として、腫瘍原性の抑制を分析するためのモデル系および安定なトランスフェクションを同時に利用することにより、上に示した結果は、ｐ２１−ＷＡＦ１が、腫瘍発生抑制の達成に潜在的に重要な機能と関連した核内遺伝物質再配置を誘発することを証明している。これらの結果は、核の組織化、染色体の配置および腫瘍原性抑制過程の活性化においてｐ２１−ＷＡＦ１が果たす中心的役割を明らかにしている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年１月１８日（１９９９．１．１８）【補正内容】請求の範囲１．インサイチュ（in situ）において遺伝子を標識すること並びに悪性度の点で試験細胞を通常細胞と比較して遺伝子構造の誤差を評価して細胞核の中に存在する少なくとも１個の遺伝子の正確な構造を明らかにすることを特徴とする悪性細胞の状態を検証する方法。２．前記遺伝子の構造が蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより評価されることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．ハイブリダイゼーションプローブが動原体プローブであることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．状態が前記遺伝子を有する染色体の周辺の存在に対応することを特徴とする請求項３に記載の方法。５．前記染色体が１３ｑおよび／または１６ｑであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。６．定着後に組織細胞の悪性状態を検証する方法であって、露出した核ＤＮＡを標識し且つＤＮＡの特別なマーカーと共にＤＮＡ全体を標識し、これら２つのマーカーが汚染されていない所定の信号を発することができるものであることを特徴とする方法。７．露出した核ＤＮＡがＤＮ酵素Ｉ法によって標識されると共に、ＤＮＡはクロモミシンＡ−３法によって標識されることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．露出した核ＤＮＡが露出したヌクレオチドを明かにするためテトラメチルローダミンによって標識されることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．ＤＮａｓｅＩ法の表示分子がアビジンまたはストレプトアビジンまたは抗体抗ＤＩＧに結合したペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．組織細胞の悪性度として、ＤＮＡの特別なマーカーにより明らかにされた細胞サイクル相と比較しながら露出した核ＤＮＡの位置を評価することを特徴とする請求項６から９のいずれか１項に記載の方法。１１．前記組織が組織の収集に由来することを特徴とする請求項６から１０のいずれか１項に記載の方法。１２．悪性細胞の状態を明らかにし、次に前記細胞を制癌剤または類似の製剤で処理し、悪性度の変化を測定しながら前記化合物の活性を評価することを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。１３．請求項１２に記載の方法により選択されることを特徴とする制癌剤または類似の製剤。１４．遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１生成物または均等な生成物の発現を生じさせるか、遺伝子生成物または均等な生成物を導入することを特徴とする細胞核の脱組織化を伴う細胞処理方法。１５．細胞核の前記脱組織化が腫瘍性の現象に起因することを特徴とする請求項１４に記載の方法。１６．細胞核の前記脱組織化が非腫瘍性の現象に起因することを特徴とする請求項１４に記載の方法。１７．ｐ２１ＷＡＦ１の発現が遺伝子の発現を導入することにより得られることを特徴とする請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。１８．ｐ２１ＷＡＦ１の発現が、遺伝子または発現物質の発現を阻止することにより得られることを特徴とする請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。１９．ｐ２１ＷＡＦ１の発現が、発現物質の発現または均等な生成物をコードする配列を導入することにより得られることを特徴とする請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。２０．ｐ２１ＷＡＦ１の発現が遺伝子生成物または均等な生成物を導入することにより得られることを特徴とする請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。２１．癌細胞成長過程または癌細胞成長ではないタイプの細胞核の非組織化を保証するための薬剤を生成するための、ｐ２１ＷＡＦ１の発現物質または均等物質または化合物の使用。２２．癌細胞成長過程または癌細胞成長ではないタイプの細胞核の非組織化を保証するための薬剤において、有効成分として遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１の発現生成物または均等物質あるいは前記生成物の発現を保証する化合物からなることを特徴とする治療薬。

Claims

【特許請求の範囲】１．インサイチュ（in situ）において遺伝子を標識すること並びに悪性度の点で試験細胞を通常細胞と比較して遺伝子構造の誤差を評価して細胞核の中に存在する少なくとも１個の遺伝子の正確な構造を明らかにすることを特徴とする悪性細胞の状態を検証する方法。２．前記遺伝子の構造が蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより評価されることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．ハイブリダイゼーションプローブが動原体プローブであることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．状態が前記遺伝子を有する染色体の周辺の存在に対応することを特徴とする請求項３に記載の方法。５．前記染色体が１３ｑおよび／または１６ｑであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。６．定着後に組織細胞の悪性状態を検証する方法であって、露出した核ＤＮＡを標識し且つＤＮＡの特別なマーカーと共にＤＮＡ全体を標識し、これら２つのマーカーが汚染されていない所定の信号を発することができるものであることを特徴とする方法。７．露出した核ＤＮＡがＤＮ酵素Ｉ法によって標識されると共に、ＤＮＡはクロモミシンＡ−３法によって標識されることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．露出した核ＤＮＡが露出したヌクレオチドを明かにするためテトラメチルローダミンによって標識されることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．ＤＮａｓｅＩ法の表示分子がアビジンまたはストレプトアビジンまたは抗体抗ＤＩＧに結合したペルオキシダーゼであることを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．組織細胞の悪性度として、ＤＮＡの特別なマーカーにより明らかにされた細胞サイクル相と比較しながら露出した核ＤＮＡの位置を評価することを特徴とする請求項６から９のいずれか１項に記載の方法。１１．前記組織が組織の収集に由来することを特徴とする請求項６から１０のいずれか１項に記載の方法。１２．悪性細胞の状態を明らかにし、次に前記細胞を制癌剤または類似の製剤で処理し、悪性度の変化を測定しながら前記化合物の活性を評価することを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。１３．請求項１２に記載の方法により選択されることを特徴とする制癌剤または類似の製剤。１４．遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１生成物または均等な生成物の発現を生じさせるか、遺伝子生成物または均等な生成物を導入することを特徴とする細胞核の脱組織化を伴う細胞処理方法。１５．細胞核の前記脱組織化が腫瘍性の現象に起因することを特徴とする請求項１４に記載の方法。１６．細胞核の前記脱組織化が非腫瘍性の現象に起因することを特徴とする請求項１４に記載の方法。１７．ｐ２１ＷＡＦ１の発現が遺伝子の発現を導入することにより得られることを特徴とする請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。１８．ｐ２１ＷＡＦ１の発現が、遺伝子または発現物質の発現を阻止することにより得られることを特徴とする請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。１９．ｐ２１ＷＡＦ１の発現が、発現物質の発現または均等な生成物をコードする配列を導入することにより得られることを特徴とする請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。２０．ｐ２１ＷＡＦ１の発現が遺伝子生成物または均等な生成物を導入することにより得られることを特徴とする請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。２１．癌細胞成長過程または癌細胞成長ではないタイプの細胞核の非組織化を保証するための薬剤を生成するための、ｐ２１ＷＡＦ１の発現物質または均等物質または化合物の使用。２２．有効成分として遺伝子ｐ２１ＷＡＦ１の発現生成物または均等物質あるいは前記生成物の発現を保証する化合物からなることを特徴とする治療薬。