JP2001520877A - 血管平滑筋細胞のインビトロ分化、それに関する方法および試薬 - Google Patents

血管平滑筋細胞のインビトロ分化、それに関する方法および試薬

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、不死化神経堤細胞の血管平滑筋細胞への分化を迅速かつ均一に誘導するためのインビトロシステムに関する。血管平滑筋細胞の過剰な増殖が、閉塞性動脈硬化症疾患の発症のための表現型応答である場合、本発明のインビトロシステムは、平滑筋細胞の発達および分化の分子調節因子を同定するために使用される。平滑筋細胞分化の分子調節因子が同定される場合、本発明はまた、これらの調節因子をコードする遺伝子を単離する方法を包含する。本発明はまた、本発明のインビトロシステムの使用によって同定された分子に関し、ならびに同定された分子を阻害または調節する化合物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 政府の後援 本明細書中に記載される研究は、国立衛生研究所により認可された助成金の下
で行われた。従って、米国政府は、本発明に一定の権利を有するであろう。
【０００２】 発明の分野 本発明は、心臓血管の分野に属し、不死化神経堤細胞を血管平滑筋細胞に分化
させるように迅速かつ均一に誘導するためのインビトロシステムに関する。血管
平滑筋細胞の過剰増殖が、閉塞性動脈硬化症疾患の発症に対する表現型応答であ
る場合、本発明のインビトロシステムは、平滑筋細胞の発達および分化の分子調
節因子を同定するために使用される。平滑筋細胞分化の分子調節因子が同定され
る場合、本発明はまた、これらの調節因子をコードする遺伝子を単離する方法を
包含する。本発明はまた、本発明のインビトロシステムを使用して同定された分
子、および同定された分子を阻害または調節する化合物に関する。
【０００３】 発明の背景 動脈硬化症は、一般に、動脈壁の肥厚および硬化をいう。動脈硬化症ならびに
その合併症（例えば、心臓発作（ｈｅａｒｔ ａｔｔａｃｋ）および発作（ｓｔ
ｒｏｋｅ））は、先進国および発展途上国において、主な死因である。（Ｒｏｓ
ｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８０１−８０９）。
【０００４】 血管平滑筋細胞は、血管壁の主な部分を構成する。分化した血管平滑筋細胞は
、主に血管の調子を制御するために機能する。完全に分化した血管平滑筋細胞は
、非常に低い速度で増殖するが、移動せず、そして細胞外マトリックスを合成し
ない。血管平滑筋細胞はまた、独特の収縮性タンパク質、イオンチャンネル、お
よび収縮性機能に必要なシグナル伝達分子を発現する。骨格筋細胞および心筋細
胞とは対照的に、血管平滑筋細胞は、成体動物において、終末的に分化しない。
【０００５】 高コレステロール血症、高ホモシスチン血症、高血圧症、または外傷などによ
る血管壁の損傷に応答して血管平滑筋細胞は脱分化し、そして増殖、移動性、お
よび合成的表現型を確実にする。血管平滑筋細胞における表現型の変化は、閉塞
性動脈硬化性疾患の顕著な特徴である。（Ｒｏｓｓ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ
３６２，８０１−８０９；Ｏｗｅｎｓ（１９９５）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７
５，４８７−５１７；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、（１９９０）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅ ｖ． ７０，１１７７−１２０９）。それにもかかわらず、血管平滑筋細胞の表現
型の変化の重要性にもかかわらず、この細胞型の分化を調節する分子メカニズム
についてはほとんど知られていない。
【０００６】 平滑筋細胞分化の分子調節因子の同定は、血管疾患の処置のための方策の設計
に必要である。平滑筋細胞分化を制御する分子メカニズムに関する研究は、イン
ビトロ細胞分化システムが無いために妨げられてきた。
【０００７】 発明の要旨 本発明は、不死化神経堤細胞の平滑筋細胞への分化を迅速かつ均一に誘導する
ためのインビトロシステムに関する。この神経堤細胞から平滑筋細胞へのモデル
は、平滑筋の発達および分化の結節性調節因子の同定を容易にする。従って、本
発明はまた、このインビトロシステムを使用して同定される分子に関する。本発
明はさらに、このインビトロシステムから同定された結節性調節因子を、阻害ま
たは調節する化合物に関する。これらの結節性調節因子をコードする遺伝子を単
離する方法もまた、本発明の範囲内にある。従って、平滑筋細胞分化を、平滑筋
細胞脱分化の結節性調節因子を不活化する因子によって維持することが出来る。
【０００８】 本発明はまた、このインビトロシステムを使用して同定された結節性調節因子
を阻害または制御する化合物の投与により、平滑筋細胞分化の活性を阻害または
制御することによって、動脈硬化症を処置または予防する方法に関する。このよ
うな化合物は、臓器移植、血管手術、カテーテルを介する血管療法、血管移植、
または血管シャントもしくは血管内ステントの配置によって引き起こされる血管
外傷の処置において、使用することが出来る。それらはまた、血管の処置、およ
び管腔直径の減少（例えば、冠状心臓疾患、平滑筋新生物、子宮類線維、血管移
植片および移植された臓器および他の血管平滑筋の閉塞性疾患）ならびに内皮細
胞増殖障害によって特徴付けられる心臓血管の指標において、使用することが出
来る。
【０００９】 本発明のインビトロ平滑筋細胞分化システムによって同定された分子調節因子
によって媒介される、平滑筋細胞分化の調節もまた、分子調節因子のアゴニスト
またはアンタゴニストによって達成することが出来る。分子調節因子の機能のア
ゴニストまたはアンタゴニストを同定するための、ペプチドライブラリー、化合
物ライブラリー、および遺伝子バンク内の他のデータベースの、スクリーニング
は、潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストが平滑筋細胞脱分化を阻害する能
力について検出するためのアッセイを用いて達成される。
【００１０】 例えば、高速処理スクリーニングアッセイは、平滑筋細胞の分化活性を調節す
る化合物を同定するために使用することが出来る。これらのスクリーニングアッ
セイは、平滑筋細胞脱分化を阻害する化合物の同定を容易にする。例えば、分子
調節因子活性を中断させる化合物のインビトロスクリーニングは、インビトロ平
滑筋細胞分化システムのマルチウェルプレートを含み、そして分化後の十分な時
間の後、試験されるべき１つ以上の化合物の存在下でシステムはインキュベート
される。相互作用を特異的に中断する分子は、原理では、いずれかの分子調節因
子に結合するか、または分子調節因子レセプターを妨害する。いずれのクラスの
化合物も平滑筋細胞を調節する因子の候補である。
【００１１】 図面の説明 図１は、未分化神経堤Ｍｏｎｃ−１細胞を示す（コントロール）。図２は、平
滑筋細胞分化培地（ＳＭＤＭ）における４日間のインキュベーション後の、Ｍｏ
ｎｃ−１細胞の平滑筋細胞への分化後の形態学的変化を示す。ピクトフォトグラ
フの本来の倍率は、両方とも２００×であった。
【００１２】 図３は、外因的に添加された活性ＴＧＦ−β１が、平滑筋細胞分化に効力を有
することを示す。ＳＭＤＭ（レーン１）、完全培地（レーン２）、および活性化
ＴＧＦ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ）（レーン３）で補充したＳＭＤＭ中で、３３時
間培養したＭｏｎｃ−１細胞から、総ＲＮＡ（１０μｌ）を分析した。ゲルをＳ
Ｍ２２αの３２Ｐ標識化フラグメントでハイブリダイズした。
【００１３】 図４は、Ｍｏｎｃ−１細胞から平滑筋およびニューロン系への分化後の平滑筋
マーカーのｍＲＮＡ分析を示す。総ｍＲＮＡを、ＳＭＤＭ中でのインキュベーシ
ョンの０日後、２日後、５日後、および８日後に回収し、そして示される転写物
についてプローブした。同じブロットもまた、１８Ｓオリゴヌクレオチドプロー
ブでハイブリダイズし、ローディングが等しいことを確認した。平滑筋細胞分化
システムに対するＭｏｎｃ−１細胞において試験した全ての遺伝子の発現は、大
動脈におけるものと類似し、図４に示されるように、平滑筋細胞は高度に分化さ
れる。
【００１４】 図５および６は、分化したＭｏｎｃ−１細胞における、平滑筋ミオシン重鎖ア
イソフォームＳＭ１の発現を示す。図５において、総ＲＮＡを、ＳＭＤＭに移し
た後０日目（未分化）および６日目（分化）に、ストリップマウスの大動脈およ
びＭｏｎｃ−１細胞から回収した。逆転写ＰＣＲを、マウスＳＭ１およびＳＭ２
のｃＤＮＡから設計されたプライマーを使用して行った。逆転写の効率のための
コントロールのために、１アリコートをグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）について分析した。図６において、図５におけるよう
に処理したストリップマウス大動脈（１０μｇ）およびＭｏｎｃ−１細胞（２５
μｇ）から単離された総細胞タンパク質を、抗平滑筋ミオシン重鎖抗体を用いて
ウェスタンブロットにより分析した。＊は、非筋ミオシン重鎖を示す。
【００１５】 図７は、分化後のＳＭ２２αプロモーターの誘導を示す。Ｍｏｎｃ−１細胞を
、トランスフェクション効率をコントロールするために、１２．５μｇの示され
た発現プラスミドおよび２．５μｇのＣＭＶ−βＧＡＬを使用して、エレクトロ
ポレーションによってトランスフェクトした。細胞抽出物を、完全培地（Ｃｔｒ
ｌ）またはＳＭＤＭ（Ｄｉｆｆ）中で、７２時間後にアッセイした（平均±ＳＥ
、ｎ＝６、＊ｐ＜０．０５）。図８は、未分化Ｍｏｎｃ−１細胞（Ｃｏｎｔｒｏ
ｌ）およびＳＭＤＭ中で８日間インキュベートした細胞（分化）からの核抽出物
における、ＳＭ２２αプロモーターのＣＡｒＧエレメントを用いた電気泳動移動
シフト分析を示す。２５０倍過剰の同定（Ｉ）および非同定（ＮＩ）オリゴヌク
レオチドを使用した。スーパーシフト分析を、血清応答性因子（ＳＲＦ）および
ＹＹ１に対する抗体を用いて行った。
【００１６】 図９は、１５３塩基対フラグメントＷ０１１とラットＬＴＢＰ−１との間の核
酸配列相同性を示す。
【００１７】 図１０は、増殖ラット大動脈平滑筋細胞（ＲａＳＭＣ）（レーン１）およびコ
ンフルエントなＲａＳＭＣ（レーン２）から単離されたＲＮＡのノーザンブロッ
トを示す。総ＲＮＡ（１０μｇ）を膜に写し、そして３２Ｐ−標識化Ｗ０１１フ
ラグメントを用いてハイブリダイズした。
【００１８】 図１１は、未分化Ｍｏｎｃ−１細胞（レーン１）、ＳＭＤＭ中で３時間（レー
ン２）、１１時間（レーン３）、２４時間（レーン４）、および１２０時間（レ
ーン５）培養されたＭｏｎｃ−１細胞、およびニューロンの分化培地中で２４時
間（レーン６）および９６時間（レーン７）培養されたＭｏｎｃ−１細胞、から
単離されたＲＮＡのノーザンブロットを示す。総ＲＮＡ（１０μｇ）を膜に写し
、そして３２Ｐ−標識化Ｗ０１１フラグメントを用いてハイブリダイズした。
【００１９】 図１２は、ヒトおよびマウスのＡＣＬＰの推定アミノ酸配列を示す。図１２、
ヒトＡＣＬＰおよびマウスＡＣＬＰの推定オープンリーディングフレーム。ヒト
およびマウスのタンパク質は、それぞれ１１５８および１１２８のアミノ酸を含
む。太い黒丸は、マウスＡＥＢＰ１における開始メチオニンを示す。強調された
モチーフは、シグナルペプチド（太字、下線）、４倍リジンリッチおよびプロリ
ンリッチ反復モチーフ（太字、斜体）、ジスコイジン様ドメイン（太字斜体、下
線）、およびカルボキシペプチダーゼに対して相同性を有する領域（太字）を含
む。
【００２０】 図１３は、ヒトＡＣＬＰの模式図である。Ｎ末端でのシグナルペプチド配列（
Ｓｉｇｎａｌ）、４倍反復モチーフ（Ｒｅｐｅａｔ）、ジスコイジン様ドメイン
（ＤＬＤ）、およびカルボキシペプチダーゼ（ＣＬＤ）に対して相同性を有する
領域に印をつけている。
【００２１】 図１４および１５は、マウスＡＣＬＰのインビトロ転写および翻訳、ならびに
ＡＣＬＰの同定を示す。図１４、ｐＣＲ２．１におけるマウスＡＣＬＰ ｃＤＮ
Ａを転写し、そしてインビトロで［３５Ｓ］メチオニンの存在下で翻訳した。こ
の反応のアリコートを６％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで
分離し次いで乾燥させ、そして室温でフィルムに曝露した。図１５、ＭＡＳＭＣ
から抽出されたタンパク質のウェスタンブロット分析である。総細胞性タンパク
質溶解物を「実験手順」に記載されるように調製した後、５０μｇのアリコート
を６％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで分離した。ゲルをニ
トロセルロース膜に写し、そしてポリクローナル抗ＡＣＬＰ一次抗血清および西
洋ワサビペルオキシダーゼ結合化ヤギ抗ウサギ二次抗体とともにインキュベート
した。ブロットを増強化学発光によって可視化し、そして室温でフィルムに曝露
した。
【００２２】 図１６。マウスＡＣＬＰの細胞性局在化。ＲＡＳＭＣおよびＡ７ｒ５細胞を、
Ｃ末端でｃ−ｍｙｃでタグ化されたＡＣＬＰ発現構築物を用いて、一過性にトラ
ンスフェクトした。融合タンパク質を、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いて検出し（Ａお
よびＣ）、そして核ＤＮＡをＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８を用いて対比染色した
（ＢおよびＤ）。核ＤＮＡ対比染色によって示した場合、ＲＡＳＭＣおよびＡ７
ｒ５細胞は共に、核を除く核周囲に強い染色を示した。初期倍率、×４００。
【００２３】 図１７および１８。マウス組織における、ＡＣＬＰ ｍＲＮＡおよびタンパク
質発現。図１７、総ＲＮＡを、「実験手順」に記載されるようにマウス組織から
単離し、そして１０μｇアリコートをアガロース−ホルムアルデヒドゲルで分離
し、ニトロセルロース膜に写し、そしてマウスＡＣＬＰの３２Ｐ−標識化フラグ
メントにハイブリダイズさせた。１８ＳリボソームＲＮＡに相補的な３２Ｐ−標
識化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって、ローディングが
等しいことを確認した。図１８、総細胞性タンパク質をマウス臓器から抽出し、
そして５０μｇのアリコートを、ポリクローナル抗ＡＣＬＰ抗血清を用いてウェ
スタンブロットに供し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体および増強化
学発光を用いて検出した。
【００２４】 図１９。インサイチュハイブリダイゼーションによる大動脈におけるＡＣＬＰ ｍＲＮＡの検出。ラットを４％パラホルムアルデヒドで灌流し、組織を除去し
、そして「実験手順」に記載されるように切片にした。大動脈（ＡおよびＢ）な
らびに骨格筋（ＣおよびＤ）由来の切片を、［３５Ｓ］ＵＴＰ標識化アンチセン
ス（ＡおよびＣ）またはセンス（ＢおよびＤ）リボプローブを用いてハイブリダ
イズした。倍率、×６００。
【００２５】 図２０および２１。血清飢餓大動脈平滑筋細胞における、ＡＣＬＰ ｍＲＮＡ
およびタンパク質のレベルの増加。図２０、総細胞性ＲＮＡをＭＡＳＭＣおよび
ＲＡＳＭＣから抽出し、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｒｏｗｉｎｇ）または０．４％
ウシ血清（Ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ）中で３日間培養した。ＲＮＡを１．２％アガロ
ースホルムアルデヒドゲルで分画し、ニトロセルロース膜に写し、マウスＡＣＬ
Ｐの３２Ｐ−標識化フラグメントにハイブリダイズさせ、そして１８Ｓ ｒＲＮ
Ａに対して正規化した。図２１、図２０でのように処理したＭＡＳＭＣを総細胞
性タンパク質について回収し、そして図１５の解説で記載されるようにイムノブ
ロットした。
【００２６】 図２２および２３。Ｍｏｎｃ−１細胞が平滑筋細胞に分化する場合のＡＣＬＰ ｍＲＮＡおよびタンパク質の誘導。図２２、ＲＮＡを、分化の誘導の前（０）
、または分化培地での処理の１日後、２日後、４日後、および６日後に、フィブ
ロネクチン上で培養したＭｏｎｃ−１細胞から抽出した。ＲＮＡブロットを、３ ２ Ｐで標識したマウスＡＣＬＰおよび平滑筋−アクチン（Ｓｍ−アクチン）のｃ
ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。１８ＳリボソームＲＮＡに相補的な３ ２ Ｐ−標識化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって、ローデ
ィングが等しいことを確認した。図２３、タンパク質抽出物を、分化前（０）ま
たは平滑筋細胞への分化の６日後に回収したＭｏｎｃ−１細胞から調製した。調
製物を、図１５の解説に記載されるようにＡＣＬＰ発現について調べた。ＭＡＳ
ＭＣをホジティブコントロールとして使用した。
【００２７】 図２４および２５は、特定のディファレンシャルディスプレイした遺伝子の発
現パターンを示すゲルの写真である。
【００２８】 図２６は、ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ−１、およびデコリンの発現パターンを示す
。
【００２９】 発明の詳細な説明 血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）は血管壁の主要成分であり、そこでの主な機能は
脈管の調子を制御することである。ＶＳＭＣは通常分化状態で存在するが、特定
の刺激に応答して脱分化および増殖することが出来る。収縮性かつ静止状態から
増殖性かつ合成状態へのＶＳＭＣの活性化は、動脈硬化症を含むいくつかの疾患
プロセスに起因する。ＶＳＭＣ機能を調節するエフェクターの決定、および所定
のＶＳＭＣ表現型状態を特徴付けるマーカータンパク質の同定は、本発明者らの
ＶＳＭＣ分化を制御するメカニズムの理解に起因する。
【００３０】 （ｉ）発明の概要 本発明の１つの局面は、神経堤細胞の筋細胞（特に、平滑筋細胞）への分化を
促進する培養システムに関する。本発明の培養システムを使用して、インビトロ
およびインビボでの後の使用のために、例えば平滑筋細胞の供給源を提供するこ
とが出来る。さらに、本明細書中に記載されるように、ＳＭＣ培養物は、平滑筋
細胞の分化または移動プログラムの部分として上方制御または下方制御される遺
伝子を同定するために使用することが出来る。これらの同定された遺伝子（これ
らの産物は、本明細書中で互換的に「ＶＳＭＣタンパク質」と呼ばれる）は、診
断マーカーおよび薬物開発の標的として有用である。
【００３１】 本発明の別の局面は、広い範囲の血管損傷の処置において、本発明の「ＶＳＭ
Ｃ治療剤」の使用に関する。本明細書中で使用される場合、「ＶＳＭＣ治療剤」
は、そのような場合、ＶＳＭＣタンパク質の生物学的活性を阻害または増強する
化合物をいう。これらの化合物は、例えば、天然抽出物、小有機分子、核酸、タ
ンパク質、またはペプチドであり得る。
【００３２】 従って、本発明は、哺乳動物における血管損傷形成に関連する細胞の血管細胞
性活性を阻害するための方法を包含し、この方法は、例えば、異常に分割した血
管平滑筋細胞の増殖を阻害するために有効な用量のＶＳＭＣ治療剤を投与する工
程を包含する。このような損傷には、大腿頚動脈および腎動脈における損傷、特
に腎臓透析フィステルから生じる損傷が含まれるが、これらに限定されない。本
発明の方法は、心臓血管形成に関連する血管損傷の処置において特に有用である
。従って、ＶＳＭＣ治療剤は、心筋虚血、アンギナ、心不全、動脈硬化の処置ま
たは予防において使用され、ならびに再狭窄および良性の前立腺肥大の予防のた
めの血管形成における補助物として使用することが出来る。
【００３３】 好ましい実施態様において、本発明のＶＳＭＣ治療剤は、血管平滑筋細胞増殖
、または血管介入もしくは傷害（例えば、血管形成、血管バイパス手術、臓器移
植、または他の血管介入もしくは操作）の後の再狭窄を、阻害または予防するた
めに使用される。より一般的には、本発明は、身体の管腔の再狭窄を低下させる
方法を提供する。
【００３４】 （ｉｉ）定義 便宜のために、本明細書、実施例、および添付の請求の範囲において使用され
る特定の用語を、ここに収集する。
【００３５】 細胞の「成長状態」は、細胞の増殖速度および細胞の分化状態をいう。
【００３６】 「増殖」（すなわち、平滑筋細胞の増殖）とは、すなわち細胞の有糸分裂によ
る、細胞数の増加を意味する。
【００３７】 平滑筋細胞の「移動」とは、例えば、１つの場所から別の場所への細胞の動き
を追跡することによってもまたインビトロで研究することが出来る（例えば、時
間制限映写機またはビデオレコーダーを使用して、および経時的に組織培養にお
ける規定領域の外への平滑筋細胞の移動を手動でカウントして）、インビボでの
これらの細胞の血管の医療層から内膜への移動を意味する。
【００３８】 「平滑筋細胞の増殖または移動の調節」におけるような、用語「調節」とは、
阻害または増強する能力をいう。
【００３９】 句「所望でない増殖」および「異常または病理学的または不適切な増殖」は、
より迅速に生じる、または同じ型の正常に機能する細胞において代表的に生じる
よりも有意に大きい程度までの、細胞の分割、成長、または移動を意味する。
【００４０】 本明細書中でいわれる場合、平滑筋細胞および周皮細胞は、血管の医療層由来
の細胞、および、ＰＴＣＡの間に生じるような傷害の後に初期過形成脈管部位に
おいて増殖する、外膜脈管由来の細胞を含む。
【００４１】 平滑筋細胞の特徴には、仁の存在および筋形質における筋原線維を有する細胞
内の中心に位置する長楕円形の核を有する紡錘形の組織学的形態（光学顕微鏡試
験で）が含まれる。電子顕微鏡試験で、平滑筋細胞は、傍核（ｊｕｘｔａｎｕｃ
ｌｅａｒ）筋形質内の長細いミトコンドリア、粗面小胞体の２、３の管状エレメ
ント、および遊離リボソームの多数のクラスターを有する。小ゴルジ複合体もま
た、核の片方の極の近くに位置する。多数の筋形質は、多くの部分で筋細胞の長
軸に配向することが出来る、薄い平行な筋フィラメントによって占められる。こ
れらのアクチン含有筋原線維は、それらの間に散在するミトコンドリアとともに
、束として配置することが出来る。細胞の収縮性の物質を介する分散（ｓｃａｔ
ｔｅｒｅｄ）もまた長円形の密集領域であり得、細胞質の内部面に沿って間隔的
に分配される類似の密度領域を有する。
【００４２】 周皮細胞の特徴には、不規則な細胞形状によって特徴付けられる形態学的形態
（光学顕微鏡試験で）が含まれる。周皮細胞は、血管内皮細胞を取り巻く基底膜
内に見い出され、α平滑筋アクチン（例えば、抗α−ｓｍｌ、Ｂｉｏｍａｋｏｒ
、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌ）、ＨＭＷ−ＭＡＡ，および周皮細胞ガングリ
オシド抗原（例えば、ＭＡｂ ３Ｇ５（１１））に特異的な抗体を用いるポジテ
ィブ免疫染色；ならびにサイトケラチン（すなわち、上皮マーカーおよび線維芽
細胞マーカー）に対する抗体およびフォン・ビルブラント因子（すなわち、内因
性マーカー）を用いるネガティブ免疫染色によって確かめることが出来る。
【００４３】 本明細書中で使用される場合、「アゴニスト」とは、細胞内で生物学的経路を
誘導する（例えば、レセプターに対するリガンドを模倣することによって）因子
、および、内因性経路に対する細胞の感受性を増強する（例えば、特定のレベル
のレセプター依存性シグナル伝達を誘導するのに必要なリガンドの濃度を低下す
る）因子をいう。
【００４４】 本発明の方法によって処置されるべき「患者」または「被検体」は、ヒトまた
は非ヒト動物のいずれかを意味する。好ましい実施態様において、本発明の方法
は、ヒト患者を用いて実施される。
【００４５】 本発明の方法の処置に関するＶＳＭＣ治療剤の「有効量」は、所望の用量療法
の部分として適用された場合に、細胞増殖速度および／または細胞分化の状態に
変化をもたらし、その結果、処置されるべき障害または美容学的目的のための、
臨床的に需要可能な標準に従って、多量の筋細胞増殖または分化を誘導する、化
合物の量をいう。
【００４６】 用語「平滑筋細胞マーカー」とは、平滑筋において発現される、好ましくは平
滑筋細胞において発現され他の細胞では発現されない（少なくとも神経堤細胞で
は発現されない）、遺伝子産物をいう。
【００４７】 用語「ｍＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ」とは、２つの異なる細胞
または細胞集団の間で比較した場合、発現が上方制御または下方制御される遺伝
子の代表であるｍＲＮＡ（ｏ ｃＤＮＡ）の集団の生成をいう。
【００４８】 本明細書中に記載される場合、用語「ベクター」とは、別の核酸をそれが連結
している核酸に輸送することが出来る核酸分子をいう。１つのベクターの型は、
ゲノム移入ベクター（すなわち、「移入ベクター」）であり、これは、宿主細胞
の染色体ＤＮＡに移入することが出来る。別の型のベクターは、エピソームベク
ター（すなわち、染色体外の複製を行うことができる核酸）である。必要に応じ
て連結される遺伝子の発現を指向することが出来るベクターは、本明細書中で「
発現ベクター」といわれる。本明細書において、「プラスミド」および「ベクタ
ー」は、文脈から他に明らかでない限り、互換的に使用される。
【００４９】 本明細書中で使用される場合、用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）などのポリヌクレオチド、および適切である場合、リボ核酸（ＲＮＡ）をいう
。この用語はまた、記載される実施態様に適する場合、一本鎖ポリヌクレオチド
（例えば、センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むこ
とが理解される。
【００５０】 本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」または「組換え遺伝子」とは、
エキソン配列および（必要に応じて）イントロン配列を含むポリペプチドをコー
ドする、オープンリーディングフレームを含む核酸をいう。「組換え遺伝子」と
は、必要に応じて染色体ＤＮＡ由来のイントロン配列を含み得る、このような調
節性ポリペプチドをコードする核酸をいう。用語「イントロン」とは、タンパク
質に翻訳されず、そして一般にエキソンの間に見られる所定の遺伝子に存在する
ＤＮＡ配列をいう。本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション
」とは、核酸媒介性遺伝子移入による、受容細胞への核酸（例えば、発現ベクタ
ー）の導入を意味する。
【００５１】 本明細書中で使用される場合、用語「形質導入」および「トランスフェクショ
ン」は、認識される技術であり、そして核酸（例えば、発現ベクター）の、核酸
媒介性遺伝子移入による受容細胞への導入を意味する。本明細書中で使用される
場合、「形質転換」とは、細胞の遺伝子型が、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞
の取込みの結果として変化するプロセスをいい、そして例えば、形質転換された
細胞が、ポリペプチドの組換え形態を発現するかまたはアンチセンス発現が移入
された遺伝子から生じる場合、天然に存在する形態のタンパク質の発現は中断さ
れる。
【００５２】 （ｉｉｉ）例示的な実施態様 Ａ．不死化神経堤細胞を平滑筋細胞分化へと迅速かつ均一に誘導する、インビト
ロシステム。
【００５３】 神経堤細胞からの血管平滑筋細胞分化のためのインビトロシステムの成分は、
（１）不死化神経堤細胞前駆体株、および（２）平滑筋細胞分化培地ＳＭＤＭで
ある。平滑筋細胞分化の確認は、平滑筋細胞分化のマーカー：平滑筋α−アクチ
ン、平滑筋ミオシン重鎖、カルポニン、ＳＭ２２α、およびＡＰＥＧ−１、の存
在または非存在についての測定によって達成される。
【００５４】 分化および脱分化は当該分野で使用される用語であるが、この用語は、本発明
の理解を助けるために定義付けられる。「分化」は、構造の進行的な分割および
ある種の細胞への前駆体細胞の機能に関する、変化の複合を意味する。細胞の所
定の株について、分化はしばしば、各々の細胞が取り込み得る転写の型の頻繁に
おける制限を生じる。「脱分化」は、分化の欠失、すなわち特殊化された細胞の
構造の、しばしば主要な変化に対する予備としてより一般化された状態または優
先的な状態への逆戻り、を意味する。従って、上記で説明されるように、傷害へ
の応答において、完全に分化した状態にある血管平滑筋細胞（動脈血管細胞およ
び静脈血管細胞の両方）は脱分化し、そして過剰な増殖、移動、および合成を始
める。本発明の血管平滑筋細胞分化のためのインビトロシステムは、平滑筋細胞
の発達および分化の分子調節因子を同定するために、従って、分子調節因子の活
性を調節する化合物を同定するために使用することが出来る。
【００５５】 不死化神経堤細胞株 多能性神経堤細胞は、ニューロン、グリア、軟骨細胞、メラノサイト、および
平滑筋細胞に分化することが出来る（ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（
１９９２）Ｃｅｌｌ ７１、９７３−９８５；Ｓｈａｈら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８５、３３１−３４３；ならびに、ＫｉｒｂｙおよびＷａｌｄｏ（１９９５） Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ ．７７、２１１−２１５）。種々のメンバーの形質転換成長因
子−βスーパーファミリーが、一次培養神経堤細胞の、ニューロン細胞または平
滑筋細胞への分化を有益に促進することが出来る（Ｓｈａｈら、前出）。しかし
、これらの因子による誘導により、神経堤細胞は、均一には分化しない。言い換
えると、いくつかの細胞は分化するが、他の細胞は分化しない。均一性（すなわ
ち、１００％の分化、または、ほとんど１００％の分化）がなければ、マーカー
および分子調節因子の分析は困難である。本発明によって解決される問題の１つ
は、神経堤細胞の均一な分化（すなわち、１００％の分化、または、ほとんど１
００％の分化）である。
【００５６】 本発明のインビトロ平滑筋細胞分化システムにおいて、不死化神経堤細胞株が
使用される。好ましい実施態様において、不死化神経堤細胞株は、Ｓｏｍｍｅｒ
ら（（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ １５、１２４５−１２５８）、ならびにＲａｏ
およびＡｎｄｒｅｓｏｎ（（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３２、７２２
−７４６）に記載されるように、ｖ−ｍｙｃ遺伝子によってレトロウイルスでト
ランスフェクトされている不死化マウス神経堤細胞株、「Ｍｏｎｃ−１」と呼ば
れる。
【００５７】 しかし、他の不死化神経堤細胞株が生成され、そして本発明のインビトロ平滑
筋細胞分化システムにおいて利用することが出来る。選択された神経堤細胞は、
細胞を不死化することが知られている種々の他の遺伝子でトランスフェクトする
ことが出来る。これらの遺伝子には、ｃ‐ｍｙｃおよびｒａｓ‐癌遺伝子が含ま
れる。神経堤細胞を不死化するための別の好ましい方法は、ｐ５３ノックアウト
マウスから神経堤細胞を得ることである。当該分野における１つの技術は、公知
の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されるもの）を利用して不死化神経堤細胞を作
成するための他の遺伝子を決定および使用することが出来る。
【００５８】 本発明は、不死化神経堤細胞株、Ｍｏｎｃ−１を参照して以下に詳細に記載さ
れる。しかし、他の不死化神経堤細胞株が本発明において使用することが出来る
ことが理解される。
【００５９】 神経堤細胞から平滑筋細胞への分化を促進する、培養条件 フィブロネクチンコートプレート上のＭｏｎｃ−１細胞は、Ｓｔｅｍｐｌｅお
よびＡｎｄｅｒｓｏｎ（後出）およびＳｏｍｍｅｒら（前出）に記載される手順
に従って、未分化状態で維持することが出来る。一般には、この培地（「完全培
地」と呼ばれる）は、ヒヨコ胚抽出物で補充されたＬ−１５ ＣＯ２ベース培地
である。培地が未分化状態で細胞を保持する限り、完全培地に対して微小の変更
または添加をすることが出来る。未分化Ｍｏｎｃ−１細胞は、図１に示される。
【００６０】 神経堤細胞の未分化状態の維持の確認は、未分化神経堤細胞のマーカーである
、低親和性神経成長因子レセプターの発現によって決定される。低親和性の神経
成長因子レセプターのアッセイは、ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（後
出）ならびにＳｏｍｍｅｒら（前出）における手順に記載される。本発明は、完
全培地の培養条件の変更が、神経堤細胞の、平滑筋系への分化を可能にすること
を発見した。この培地は、平滑筋細胞分化培地（ＳＭＤＭ）といわれる。好まし
い実施態様において、ＳＭＤＭは、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で補
充された表１に列挙される培地成分、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）、ス
トレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、および２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７
．４）を含有する。ウシ胎仔血清の２つの異なるロットを研究した。それらのＭ
ｏｎｃ−１細胞分化を誘導する能力に、差異は観察されなかった。ＳＭＤＭは、
これらの成分に限定されることは意図されず、等価物を利用することができ、そ
して培地がＭｏｎｃ−１表現型をもたらす限り、成分の正確な割合が限定される
ことは意図されない。当業者は、神経堤細胞の分化を支持および促進するために
ＳＭＤＭを改変してもよい。
【００６１】
【表１】
【表２】 ＳＭＤＭは、Ｍｏｎｃ−１神経堤細胞において劇的な形態学的変化を誘導する
。ＳＭＤＭ中でのインキュベーションの２４時間以内に、細胞は平たい紡錘状の
外形をおび始め、そして細胞質のサイズが増加する。ＳＭＤＭ中での培養の４日
目までに、ほぼ１００％の細胞が、図２に示されるようにこの形状をおびる。Ｓ
ＭＤＭ中で培養された細胞は、完全培地中で培養されたコントロール細胞よりも
非常に遅く成長する。コンフルエンスでは、分化した細胞は、分化した平滑筋細
胞の特徴である「山と谷」外形を有する。排他的なＭｏｎｃ−１から平滑筋細胞
への分化は、細胞の外形および平滑筋細胞マーカー（平滑筋α−アクチン、平滑
筋ミオシン重鎖、カルポニン、ＳＭ２２α、およびＡＰＥＧ−１）の誘導によっ
て示唆された。
【００６２】 外因性活性化ＴＧＦ−β１は、平滑筋細胞分化を促進する 平滑筋細胞分化におけるＴＧＦ−β１の影響を調べるために、Ｍｏｎｃ−１細
胞をＳＭＤＭ中で、ＴＧＦ−β１の存在下または非存在下で、３３時間培養した
。総ＲＮＡ（１０μｇ）を、３２Ｐ−標識化ＳＭ２２αフラグメント（約４００
塩基対マウスＳＭ２２α ３’領域）を使用して、ノーザンブロットによって分
析した（図３）。等しいローディングのＲＮＡサンプルを、１８Ｓ ｒＲＮＡに
相補的な３２Ｐ−標識化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによっ
て決定した。これらの結果は、ＴＧＦ‐β１が平滑筋細胞分化のプロセスを促進
することを示す。
【００６３】 神経堤細胞分化に応答する平滑筋細胞マーカーの時間依存性誘導 平滑筋細胞分化の確認を、公知の平滑筋細胞マーカーの存在下または非存在下
で決定することによって、達成することが出来る。平滑筋マーカーには、平滑筋
α−アクチン、平滑筋ミオシン重鎖、カルポニン、ＳＭ２２α、およびＡＰＥＧ
−１が含まれる。例えば、ＳＭＤＭ中での培養の４日目に、例えば、細胞培養物
は、平滑筋α−アクチンおよびカルポニン遺伝子の確固たる発現を明白にする。
完全培地中で成長したコントロール細胞は、これらのマーカーを発現しない。
【００６４】 別のコントロールとして、神経堤細胞の、グリア細胞およびニューロン細胞へ
の分化のために使用されるマーカーは、グリア細胞繊維性酸性タンパク質および
ペリフェリンに対する免疫反応性の存在または非存在を決定することによって確
認することが出来る。神経堤細胞から分化した平滑筋細胞は、グリア細胞繊維性
酸性タンパク質またはペリフェリンに染色しないが、グリア細胞およびニューロ
ン細胞に分化した神経堤細胞は、これらのタンパク質について染色する。
【００６５】 平滑筋α−アクチンおよびカルポニン、ならびに他の平滑筋マーカーについて
、ｍＲＮＡの発現の測定は、ＳＭＤＭ中のＭｏｎｃ−１細胞分化の過程にわたっ
てなすることが出来る。図４は、これらの平滑筋マーカー：平滑筋α−アクチン
、カルポニン、ＳＭ２２α、およびＡＰＥＧ−１、の測定を示す。さらに、神経
細胞、アンギオテンシンＩＩレセプター（ＡＴ２）への分化のためのマーカーも
また示す。マーカー１８Ｓは、平滑筋細胞および神経細胞の両方で発現される。
分析は、平滑筋細胞分化の２、５、および８日後に行った。マウス大動脈からの
メッセンジャーＲＮＡを、分化平滑筋細胞についてのポジティブコントロールと
して使用した。ネガティブコントロールとして、並行実験において、Ｍｏｎｃ−
１細胞を、ニューロン経路およびグリア経路への分化のために誘導した。平滑筋
α−アクチンおよびカルポニンｍＲＮＡ発現は、図４に示されるように、ＳＭＤ
Ｍ中でのインキュベーションの、早くて２日後に増加した。いずれのｍＲＮＡも
、ニューロン経路への分化後に検出されなかった。
【００６６】 別の良く研究された平滑筋細胞マーカーは、ＳＭ２２α遺伝子であり、これは
、成体動物において、血管および内臓の平滑筋細胞において排他的に発現される
（Ｋｉｍら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７、２２６６−２２７
８）。平滑筋α−アクチンおよびカルポニンｍＲＮＡでのように、ＳＭ２２α
ｍＲＮＡの発現は、図４に示されるように、ＳＭＤＭ中でのインキュベーション
後に増加した。
【００６７】 分化血管平滑筋細胞中で優先的に発現されるＡＰＥＧ−１（１２．７ｋＤａ核
タンパク質）は、Ｈｓｉｅｈら（（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１
１７３５４−１７３５９）において記載されるように、近年クローン化された
。その発現は、インビボでは動脈平滑筋細胞において高いが、インビトロおよび
インビボの両方で、脱分化動脈平滑筋細胞において迅速かつ完全に下方制御され
るようになる。ＡＰＥＧ−１ ｍＲＮＡの発現はまた、図４において示されるよ
うに、ＳＭＤＭ中でのＭｏｎｃ−１細胞培養の間に増加した。従って、ＡＰＥＧ
−１は、分化血管平滑筋細胞のための敏感なマーカーを示す。ＳＭＤＭ中で分化
Ｍｏｎｃ−１細胞におけるＡＰＥＧ−１の発現は、これらの細胞が、分化血管平
滑筋細胞と特性を共有することを示す。
【００６８】 マーカーＡＴ２は、胚形成の間、血管系および多くの他の組織で発現される（
Ｌｅｎｋｅｉら（１９９６）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３７３、３２２−３
３９；Ｓｈａｎｍｕｇａｍら（１９９５）Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４７、１０９
５−１１００；ならびにＳｈａｎｍｕｇａｍおよびＳａｎｄｂｅｒｇ、（１９９
６）Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．２０、１６９−１７６）。ＡＴ２発現は成体
血管系において下方制御されるが、それは成体ニューロン細胞において継続する
。図４に示されるように、ＡＴ２ ｍＲＮＡは、未分化Ｍｏｎｃ−１細胞中で発
現された（０日目）。ＡＴ２ ｍＲＮＡは、ＳＭＤＭ中でのインキュベーション
の２日後ではまだ見えるが、インキュベーションの５日後および８日後に消失す
る。ＡＴ２ ｍＲＮＡ発現は、ニューロン細胞およびグリア細胞分化が促進され
る場合、増加する。
【００６９】 Ｂ．平滑筋細胞分化の調節因子の同定 平滑筋細胞分化を制御する遺伝子産物は「結節性調節因子」と称され、そして
代表的にタンパク質またはポリペプチド（例えば、「ＶＳＭＣタンパク質」）で
ある。結節性調節因子は多数の平滑筋細胞分化活性に関与する。細胞分化活性の
制御には、転写、ＲＮＡプロセシング、翻訳、ならびに、タンパク質発現に関連
した事象（例えば、分泌物質の発現）および代謝活性のコントロール（例えば、
細胞増殖、有糸分裂、複製、およびアポトーシス）を含む。インビトロ平滑筋細
胞分化システムを、異なる結節性調節因子ならびに他の分子調節因子を同定する
ために使用した。第１に、Ｍｏｎｃ−１細胞分化に応答する平滑筋ミオシン重鎖
発現の誘導を研究した。ＳＭ２２αプロモーター活性が平滑筋細胞分化において
誘導されるか否かもまた決定した。
【００７０】 Ｍｏｎｃ−１細胞分化に応答する平滑筋ミオシン重鎖発現の誘導 平滑筋ミオシン重鎖（分化したＳＭＣの特異的マーカー）がＭｏｎｃ−１細胞
において発現されるか否かを決定するために、逆転写ＰＣＲを使用した。詳細に
は、ＳＭ１およびＳＭ２アイソフォームの３２４塩基対および３６３塩基対のフ
ラグメントをそれぞれ増幅する１対のプライマー。ＳＭ１およびＳＭ２ ＤＮＡ
フラグメントを、共に、逆転写されたマウ大動脈ＲＮＡから増幅した（図５）。
ＳＭ１を、未分化Ｍｏｎｃ−１細胞ＲＮＡではなく、分化Ｍｏｎｃ−１細胞ＲＮ
Ａから増幅した。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ
Ｈ）のためのプライマーを使用して、全てのＲＮＡサンプルから特異的なバンド
を増幅した。ＳＭ１およびＳＭ２の両方を、平滑筋ミオシン重鎖に対する抗体で
、高解像度のウェスタン分析によって、マウス大動脈から調製したサンプルにお
いて検出した（Ｇｒｏｓｃｈｅｌ−Ｓｔｅｗａｒｔら（１９７６）Ｈｉｓｔｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６，２２９−２３６）（図６）。未分化Ｍｏｎｃ−１細胞は
非筋肉ミオシン重鎖のみを発現したが（図６、＊）、分化Ｍｏｎｃ−１細胞はＳ
Ｍ１を発現した。合わせると、これらのデータは、Ｍｏｎｃ−１細胞から分化し
たＳＭＣにおけるＳＭ１の存在を示す。
【００７１】 平滑筋細胞分化に対する、神経堤細胞によるＳＭ２２αプロモーター活性の誘
導 Ｍｏｎｃ−１細胞分化を制御する分子メカニズムへのさらなる洞察を得るため
に、Ｍｏｎｃ−１分化におけるＳＭ２２αプロモーターの効果を研究した。ＳＭ
２２αプロモーターを選択した。なぜなら、ＳＭ２２α遺伝子の発現を制御する
分子メカニズムは非常に良く特徴付けられているからである。２つのＣＡｒＧエ
レメントが存在する、０．４ｋｂ領域のＳＭ２２αプロモーターは、トランスジ
ェニックマウスにおいて血管平滑筋細胞特異的発現媒介することが示されている
。このシス作用性エレメント、ＣａｒＧボックス（ＣＣ Ａ／Ｔ６ＧＧ）は、イ
ンビトロおよびインビボで、血管平滑筋細胞におけるＳＭ２２αの発現に重要で
ある。近位ＣＡｒＧエレメントの変異は、トランスジェニック動物において全て
のＳＭ２２α発現を除去するので、このエレメントは、平滑筋細胞系に制限され
た高レベルの発現を指向するために必要かつ重要であるようである（Ｋｉｍら（
１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７、２２６６‐２２７８；Ｌｉら（
１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３２、８４９‐８５９；およびＭｏｅｓ
ｓｌｅｒら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，２４１５‐２４２５
）。
【００７２】 同じシス作用性エレメントが、平滑筋系に分化したＭｏｎｃ−１において、Ｓ
Ｍ２２αの誘導に重要であるか否かを決定するために、一過性のトランスフェク
ションアッセイをＳＭ２２αを用いて行った。まず、１．４ｋｂのＳＭ２２αプ
ロモーターを含有するルシフェラーゼレポーター構築物（約１．４ｋｂ ＳＭ２
２α）を作製した。次いで、Ｍｏｎｃ−１細胞を、エレクトロポレーションによ
ってＳＭ２２α構築物でトランスフェクトし、そして完全培地またはＳＭＤＭ中
で培養した。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの７２時間後に細胞
溶解物において測定した。約１．４Ｋｂ ＳＭ２２αプロモーターは、図７に示
されるように、未分化Ｍｏｎｃ−１細胞中で最小に活性であった。しかし、Ｍｏ
ｎｃ−１細胞の平滑筋細胞への分化後、ＳＭ２２αプロモーター活性は、２０〜
３０倍に顕著に増加した。
【００７３】 ＣＡｒＧエレメントが、インビトロでのＭｏｎｃ−１細胞から平滑筋細胞への
分化後のＳＭ２２αプロモーター活性の制御に重要であるか否かを調べるために
、２つの他のレセプター構築物を作製した。第１に、ルシフェラーゼレポーター
遺伝子の上流に３つのＳＭ２２α ＣＡｒＧエレメントを含むＣＡｒＧ（３×）
、そして第２に、コア配列が５’ＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧ３’から５’ＣＣＡＣＡ Ｃ ＡＴＧＧ３’に改変されている３つのＳＭ２２α ＣＡｒＧエレメントを含む
、ｍｔＣＡｒＧ（３×）。この変異配列は、平滑筋細胞においてエンハンサーと
して機能し得ない。ネイティブＳＭ２２αプロモーターの活性のように、多重化
（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｅｄ）ＣＡｒＧレポーター構築物の活性は、図７に示さ
れるように、Ｍｏｎｃ−１細胞から平滑筋細胞への分化の後、再び少なくとも２
０倍、劇的に増加した。ＣＡｒＧボックスの変異は、Ｍｏｎｃ−１細胞から平滑
筋細胞への分化の後に、ＳＭ２２αの分化誘導性活性を顕著に減少させた。従っ
て、平滑筋細胞特異的プロモーターＳＭ２２αにおけるこの２０〜３０倍の増加
は、平滑筋細胞分化と同時に起こる。
【００７４】 平滑筋細胞分化に対する神経堤細胞による血清応答性因子ＤＮＡ結合活性の誘
導 インビトロ分化システムを使用して、特異的なトランス作用性因子が、ＣＡｒ
Ｇエレメントに結合するＭｏｎｃ−１分化の後に誘導され、それによってＳＭ２
２α発現を制御するか否かを決定した。ゲル移動シフトアッセイを、プローブと
してＣＡｒＧ（３×）オリゴヌクレオチドを使用することによって、分化した血
管平滑筋細胞およびＭｏｎｃ−１細胞からの核抽出物を用いて行った。図６に示
されるように、５つの特異的なＤＮＡ−タンパク質複合体を明らかにした。これ
らのうち３つは天然（複合体１、２、および４）であり、２つは上方シフトした
（複合体３および５）。複合体１および４は、分化したＭｏｎｃ−１細胞からの
核抽出物中に見い出されたが、未分化細胞からは見い出されなかった。複合体２
は両方の条件下で存在したが、分化後に強いようであった。抗体上方シフト実験
は、複合体４（５にシフトした）は、血清応答性因子と抗原的に同一または関連
するタンパク質を含み、一方、複合体２（３にシフトした）はＹＹ１に関連する
タンパク質を含むことを示した。複合体１は、分化後のＭｏｎｃ−１細胞からの
核抽出物に唯一見られる複合体であった。この新規の複合体を含むタンパク質は
、本発明の分子調節因子である。
【００７５】 従って、ゲル移動シフトアッセイによって、分化したＭｏｎｃ−１細胞から調
製された核抽出物において、新規のＤＮＡ−タンパク質複合体を同定した。新規
の複合体のうちの１つは、血清反応性因子（ＳＲＦ）を含み、そしてＣＡｒＧエ
レメント結合活性を有した。
【００７６】 これらの結果は、ＳＭ２２αプロモーターの活性、および、変異ＣＡｒＧエレ
メントを含有する構築物ではなく近位ＣＡｒＧエレメントを含有する多重化レポ
ーター構築物が、図７に見られるように、平滑筋系への分化後にＭｏｎｃ−１細
胞中で顕著に増加したことを示す。これらのデータは、分化によって誘導された
特的な因子がＣＡｒＧエレメントに結合し、そしてＳＭ２２αプロモーターを活
性化することを示す。実際、３つのＤＮＡ−タンパク質複合体は、図８に示され
るように、ゲル移動シフト分析によって、未分化ではなく分化したＭｏｎｃ−１
細胞からの核抽出物中に見られ、そして第４の複合体の強度は分化したＭｏｎｃ
−１細胞からの抽出物中で増加した。これらの４つの複合体は、ＳＲＦおよびＹ
Ｙ１と同じかまたは抗原的に関連するタンパク質（共同的に、ＳＭ２２αのＣＡ
ｒＧボックスおよび他の遺伝子を活性化することが知られている２つの因子）を
含む。これらを考慮して、ＳＭ２２αプロモーターのこれらの研究は、インビボ
での平滑筋細胞において通常起こる遺伝子プログラムが、インビトロでのＭｏｎ
ｃ−１細胞から平滑筋細胞への分化の間に繰り返されることを示す。
【００７７】 血管平滑筋細胞分化の分子調節因子をコードする遺伝子の単離 従って、新規のインビトロ血管平滑筋細胞分化システムは、他の調節因子を同
定するための方法として使用することが出来る。より詳細には、開示された分化
システムは、血管平滑筋細胞分化の制御に重要な遺伝子を、体系的に単離および
精製およびクローニングするために使用することが出来る。例えば、以前にゲル
移動シフトアッセイによって同定された複合体１に存在する転写因子が、精製お
よびクローン化することが出来る。さらに、２つの強力な分子クローニング方法
を使用し、調節因子を体系的に単離することが出来る：ディファレンシャルディ
スプレイおよび遺伝子スクリーニング技術。
【００７８】 例えば、米国特許第５，８２７，６５８号および第５，８１４，４４５号、な
らびにＬｉａｎｇら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：
３２６９−７５；ＬｉａｎｇおよびＰａｒｄｅｅ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５７：９６７−９７１；ならびにＣｈａｐｍａｎら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅ ｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ，１０８：Ｒ１−Ｒ７に記載されるようなディフ
ァレンシャルディスプレイ技術。
【００７９】 同様に、サプレッションＰＣＲが使用することが出来る。簡潔には、 ｃＤＮ
Ａアダプターを、 ＰＣＲの間に所望でない増幅を妨害するように操作する（１
、２）。サプレッションは、相補配列が一本鎖ｃＤＮＡの各末端に存在する場合
に起こる。各プライマーアニーリング工程の間、ハイブリダイゼーション動力学
は、プライマーアニーリングを妨害するｐａｎ様二次構造の形成を強く好む（よ
り短いプライマーのアニーリングにわたって）。時々プライマーがアニールし、
そして伸長する場合、新しく合成した鎖もまた逆末端反復配列を有し、そして別
のｐａｎ様構造を形成する。従って、ＰＣＲの間、非特異的増幅が効果的に抑制
され、そして特異的な増幅が正常に進行することが出来る。Ｌｕｋｙａｎｏｖら
（１９９４）Ｂｉｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．（Ｒｕｓｓｉａｎ）２０：７０１
−７０４；およびＳｉｅｂｅｒｔら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：１０８７−１０８８。市販のキットとして、ＣＬＯＮＴＥＣＨの
ＭａｒａｔｈｏｎＴＭｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（＃Ｋ１８０２−
１）およびＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）キットが挙げられる。
【００８０】 さらに、血管再生における候補結節性調節因子の重要性は、他の遺伝子アプロ
ーチ（損傷した頚動脈などから単離されたｍＲＡＮを用いたノーザン分析を含む
）によって試験することが出来る。
【００８１】 ヒエログラフシステムによるディファレンシャルディスプレイ ＲＮＡを、平滑筋細胞への分化の前および後（３、６、１２、２４、および７
２時間後）のＭｏｎｃ−１細胞から単離した。このＲＮＡを、ＨＩＥＲＯＧＬＹ
ＰＨＴＭ ｍＲＮＡプロファイルキット（Ｇｅｎｏｍｉｘ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉ
ｔｙ、ＣＡ）を用いるディファレンシャルディスプレイまたは最近開発されたＣ
ＨＩＰ技術のテンプレートとして使用する。ディファレンシャルディスプレイは
、２つの異なる細胞型（すなわち、未分化神経堤細胞および分化平滑筋細胞）の
ＲＡＮの比較を異なる時間で可能にし、その結果、経時的に、これらの細胞のｍ
ＲＮＡのフィンガープリントを得る技術である。Ｍｏｎｃ−１細胞分化の間に出
現または消失する遺伝子から転写されたＲＡＮは、ディファレンシャルディスプ
レイについて好ましい実施態様である。分化Ｍｏｎｃ−１細胞において出現する
遺伝子（分化のための推定分子調節因子）または消失する遺伝子（推定抗分化遺
伝子）は、特に目的である。
【００８２】 ディファレンシャルディスプレイゲルからのこれらのｍＲＮＡからの全長のＤ
ＮＡクローンを、ＲＡＣＥまたはライブラリースクリーニングによって単離した
。ヒエログラフディファレンシャルディスプレイシステムは、より長いｃＤＮＡ
フラグメントを作製するので、従来技術の１つはクローン化遺伝子の部分オープ
ンリーディングフレームを決定することが出来る。ヌクレオチド配列および部分
アミノ酸配列の両方を使用して、ＧｅｎｅＢａｎｋおよびＴＩＧＲデータベース
を検索する。全長ＤＮＡ単離の優先性は、血管平滑筋細胞において優先的に発現
される遺伝子、ならびに、転写因子、シグナル伝達分子、または平滑筋細胞分化
の調節因子であり得るキナーゼ／ホスファターゼに対して相同的な遺伝子につい
てなされる。
【００８３】 例えば、平滑筋細胞分化の間の上方制御または下方制御された発現パターンを
有するいくつかのバンドを同定および単離した。簡潔には、これらのバンドをデ
ィファレンシャルディスプレイゲルから切り出し、そしてＰＣＲによって再増幅
した。これらのＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で分析し、そしてＱＩＡＥ
Ｘ ＩＩ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅ
ｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）によって精製した。次いで、これらのフラグ
メントを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ放射標識化ターミネーターサイク
ル配列決定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）によって配
列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋおよびＴＩＧＲデーターベースによる相同性検
索を、インターネットを使用して行った。配列分析によって、多くのこれらのク
ローンが、既知の遺伝子と相同性を共有することを同定した。従って、本明細書
中に記載されるディファレンシャルディスプレイ法によって同定された平滑筋細
胞分化制御遺伝子は、（１）平滑筋マーカー：平滑筋γ−アクチン、ＲＣＬ−Ａ
ミオシン制御性鎖；（２）成長阻止関連遺伝子：Ｕｆｏ／Ａｘ１／Ａｒｋ、Ｇａ
ｓ３、ｃｃａｌ、２０４／２０２インターフェロン誘導性タンパク質；（３）Ｔ
ＧＦ−β関連遺伝子：ＬＴＢＰ−１、ＴＳＣ−３６、デコリン；（４）転写因子
／核タンパク質：ｃ−ｊｕｎ、ＦＲＡ２、プロチモシン−α；（５）キナーゼ：
インテグリン結合タンパク質キナーゼ、ＬＩＭキナーゼ ２ｂ；（６）その他：
オステオネクチン／ＳＰＡＲＣ、ｒｒｇ／ｌｙｓｙｌオキシダーゼを含み得る。
図２４および２５は、特定のこれらの遺伝子の発現パターンを示す。
【００８４】 クローン化遺伝子の中で、１つのフラグメント（Ｗ０１１と呼ばれる）を、ア
ンカープライマー４（５’ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＧＴ−３’）および任意プライマー８（５’−ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣ
ＡＧＧＡＴＧＧＴＡＡＡＣＣＣ−３’）の組合わせによって増幅し、そして７６
０塩基対長として評価した。Ｗ０１１フラグメントの５’末端の１５３ｂｐを配
列決定し、そしてこれが、ラット潜伏ＴＧＦ−β結合タンパク質１（ＬＴＢＰ−
１）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｍ５５４３１、６
２４４塩基対、相同性９４．４％）およびヒトＬＴＢＰ−１と有意な相同性を共
有することを見い出した。Ｗ０１１の核酸配列とラットＬＴＢＰ−１との比較を
図９に示す。この相同性データーを考慮して、Ｗ０１１が、ＬＴＢＰ−１のマウ
スホモログ（潜伏ＴＧＦ−β１結合タンパク質）であるという可能性が高い。
【００８５】 ＬＴＢＰ−１は、潜伏ＬＴＢＰ−１複合体の３つの異なる成分の１つである。
潜伏ＴＧＦ−β１は高分子量であり、正常細胞によって通常分泌される、生物学
的に不活性形態である。この複合体は、（１）生物学的に活性である成熟ＴＧＦ
−β１；（２）ＴＧＦ−β１潜伏性に十分なＴＧＦ−β１潜伏関連ペプチド（Ｌ
ＡＰ）；および（３）ＬＴＢＰ−１を含む。ＬＴＢＰ−１は、これらのタンパク
質のうちで最も特徴付けられている（Ｋａｎｚａｋｉら（１９９０）Ｃｅｌｌ
６１，１０５１−１０６１；Ｔｓｕｊｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ． ８７，８８３６−８８３９）。糖タンパク質が、ジスルフィド
結合によってＬＡＰと結合している。ＬＴＢＰ−１は、潜伏ＴＧＦ−β１のアッ
センブリー、分泌、および活性化において戦略的な役割を担うと考えられている
。ＴＧＦ−β１の活性が創傷治癒に重要であるが、増加現象は、糸球体腎炎、動
脈硬化症、および肝硬変などの広範な種々の線維症疾患にまで、過剰なＴＧＦ−
β１活性に関連する（Ｔａｍａｋｉら（１９９５）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３
，８１−８９；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９９３）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏ ｌ． １４２，７１−７８；ＢｏｒｄｅｒおよびＲｕｏｓｌａｈｉ（１９９２）Ｊ ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９０，１−７）。ＬＴＢＰ−１が平滑筋細胞におけ
る潜伏ＴＧＦ−β１の活性化を容易になすることが出来ることが示されている（
Ｆｌａｕｍｅｎｈａｆｔら（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２０，９９
５−１００２）が、ＴＧＦ−β１の調節因子としての平滑筋細胞分化におけるそ
の役割は、研究されていない。
【００８６】 ディファレンシャルディスプレイ（または以前のゲル移動シフトアッセイによ
る）によって同定される遺伝子の特徴付けは、種々の方法でさらに研究される。
まず、ｍＲＮＡの発現パターンおよびサイズをノーザンブロットハイブリダイゼ
ーションによって決定する。推定分子調節因子の発現パターンを、マウスならび
にヒトの正常および動脈硬化症の動脈組織培養において、培養した未分化および
分化Ｍｏｎｃ−１細胞において確認する。
【００８７】 例えば、分化平滑筋細胞におけるＬＴＢＰ−１の発現パターンを試験するため
に、ノーザンブロット分析を行った。簡潔には、ＲＮＡを一次培養の増殖中のラ
ット動脈平滑筋細胞から単離し、そしてコンフルエントなラット動脈平滑筋細胞
から単離したＲＮＡと比較した。ＲＮＡを、Ｗ０１１プローブを使用してノーザ
ンブロットによって分析した（図１０）。２つの主要なシグナルを観察し、そし
てラット動脈平滑筋細胞のコンフルエンシーの約１２倍増加されたことを見い出
した。等しいローディングのＲＮＡサンプルを、１８Ｓ ｒＲＮＡに対して相補
的な、３２Ｐ−標識化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって
、決定した。シグナル強度を、ＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒおよびＩｍａｇｅＱ
ｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖ
ａｌｅ、ＣＡ）を使用して定量した。これらの結果は、ＬＴＢＰが、ＴＧＦ−β
１を制御することによって平滑筋細胞分化において重要な役割を果たすることが
出来ることを示す。
【００８８】 さらに、平滑筋細胞分化の間のＬＴＢＰ−１発現パターンの誘導を確認するた
めに、別のノーザンブロット分析を行った。この実験のために、ＲＮＡを未分化
Ｍｏｎｃ−１細胞、ならびにＳＭＤＭ中で３、１１、２４、および１２０時間培
養したＭｏｎｃ−１細胞、ならびにニューロン分化培地中で２４および９６時間
培養したＭｏｎｃ−１細胞から単離した。総ＲＮＡ（１０μｇ）を膜に写し、そ
して３２Ｐ−標識化Ｗ０１１フラグメントでハイブリダイズした（図１１）。ニ
ューロン細胞分化ではなく、平滑筋細胞分化で大量に増加した、２つの主要なバ
ンドを観察した。
【００８９】 第２に、培養したラット大動脈平滑筋細胞およびＭｏｎｃ−１細胞におけるこ
れらの新しいｃＤＮＡの生物学を、本質的なまたは誘導性の様式で候補遺伝子を
発現する、クローンを作製することによって研究した。あるいは、これらの遺伝
子をコードするプラスミドの微量注入は、多くの遺伝子が単離された場合に速い
スクリーニング技術である。これらの遺伝子を有する、本質的／誘導性クローン
または微量注入された細胞を、コントロールクローンと比較して、細胞外マトリ
ックスを増殖、移動、および合成する能力について研究した。分化促進遺伝子は
、細胞外マトリックスの増殖、移動、または合成を阻害する。
【００９０】 選択した遺伝子（例えば、潜在的な成長インヒビター）について、アンチセン
スまたは優勢ネガティブアプローチを行う。これらの遺伝子に対するアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、例えば細胞外マトリックスの増殖、移動、または合成
をブロックするように作製することが出来る。また、候補遺伝子の生物学的効果
を、血管平滑筋細胞経路への分化を増強または阻害するそれらの能力によって評
価してもよい。これらの遺伝子の生物学的効果もまた、Ｍｏｎｃ−１細胞分化に
おいて試験されるが、Ｍｏｎｃ−１細胞をトランスフェクトすることはより困難
であるので、レトロウイルスアプローチが採られる。
【００９１】 第３に、これらの分子調節因子の生物学をインビボで研究する。インビトロで
、血管平滑筋細胞またはＭｏｎｃ−１細胞において分化を潜在的に阻害または増
強する遺伝子を、インビボでさらに研究する。これらの研究を行うために、クロ
ーン化遺伝子を、血管平滑筋細胞特異的プロモーターを用いてアデノウイルスま
たはトランスジェニックアプローチを使用することによって、過剰発現させる。
例えば、分化成長阻害性遺伝子の過剰発現（または分化／成長阻害性遺伝子のア
ンチセンスバージョン）は、血管傷害に応答しての血管平滑筋細胞の増殖および
新内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）の形成を妨害するべきである。このような遺伝子
の過剰発現（またはアンチセンスブロック）は、遺伝子治療方法として適切であ
り得る。これらの候補分子制御性遺伝子の機能は、遺伝子欠損または異なるマウ
スモデルシステムによって研究される。
【００９２】 血管平滑筋細胞分化遺伝子または脱分化遺伝子の遺伝子スクリーニング この方法は分化した表現型を与える遺伝子を単離するための遺伝子スクリーニ
ングを使用する。この戦略は、ＳＭ２２α ５’−フランキングを必要とする。
ＳＭ２２αは、分化したラット大動脈平滑筋細胞またはＭｏｎｃ−１細胞におい
てのみ活性であるが、脱分化したラット大動脈平滑筋細胞または未分化Ｍｏｎｃ
−１細胞において不活性である。一致して、これらの後者の細胞型は、トランス
フェクトされたプラスミドにおけるＳＭ２２α ５’−フランキング配列によっ
て駆動されるハイグロマイシン耐性遺伝子を発現しない。それ故、これらの細胞
において分化した表現型を与えるレトロウイルスｃＤＮＡライブラリーのトラン
スフェクションによる遺伝子の導入は、ＳＭ２２α ５’−フランキング配列を
活性化し、そしてハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を可能にする。これらの細
胞をハイグロマイシンによって選択し、次いで、分化分子調節因子または脱分化
分子調節因子をコードするトランスフェクトしたｃＤＮＡをＰＣＲによって回収
する。
【００９３】 この遺伝子スクリーニング方法を行うために、ハイグロマイシン耐性遺伝子に
対して５’のＳＭ２２αプロモーターを含有するプラスミド（ｐＳＭ２２α−Ｈ
ｙｇｒｏと称される）を作製する。このプラスミドはまた、ＣＭＶプロモーター
によって駆動されるゼオシン選択マーカーを含む。一次分化血管平滑筋細胞を含
む正常ラットまたはヒトの大動脈から調製されたｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブ
ラリーを、レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸを用いて作製する。
【００９４】 血管平滑筋細胞分化遺伝子についてスクリーニングするために、以下の手順を
使用することが出来る。
【００９５】 １．ラット大動脈平滑筋細胞またはＭｏｎｃ−１細胞を、エレクトロポレーシ
ョンによって、（通路２で）ｐＳＭ２２α−Ｈｙｇｒｏを用いてトランスフェク
トする。ｐＳＭ２２α−Ｈｙｇｒｏの導入を、ゼオシンに対する細胞の耐性によ
って決定し、そしてプラスドＤＮＡの導入を、サザンハイブリダイゼーション分
析によって確認する。ハイグロマイシンを全く発現しないか、または非常に低レ
ベルで発現するクローンのみを、続く以下の研究に使用する。
【００９６】 ２．クローンを、レトロウイルスにおけるライブラリーで形質導入する。首尾
良く形質導入されたクローンを、Ｇ‐４１８で選択する。
【００９７】 ３．形質導入したラット大動脈平滑筋細胞クローンを、ハイグロマイシンで選
択する。選択の後、特異的なプライマーでの逆転写ＰＣＲによって、形質導入さ
れたｃＤＮＡを回収する。
【００９８】 ４．全長ｃＤＮＡクローンを得、そしてディファレンシャルディスプレイの節
に記載されるように特徴付ける。
【００９９】 Ｃ．インビトロ平滑筋細胞分化システムから同定される分子調節因子を阻害また
は制御する化合物の同定 本発明の別の曲面は、平滑筋細胞の（例えば、分化および増殖の）成長状態を
調節することが出来る因子の同定に関する。これらの因子には、ＶＳＭＣタンパ
ク質もしくはＶＳＭＣタンパク質を含む複合体の内性酵素活性を、増強するまた
は阻害する化合物、他のタンパク質または核酸でＶＳＭＣタンパク質の相互作用
を妨害する化合物、および優勢な機能喪失または機能譲与活性を提供するために
変化（変異）されたＶＳＭＣタンパク質の形態を含む化合物が含まれるが、これ
らに限定されない。
【０１００】 これに関して、本発明は、本発明のＶＳＭＣタンパク質の、あるいは、平滑筋
細胞の正常もしくは異常な細胞性増殖および／または分化の病理ならびにそれに
関する障害におけるタンパク質の役割の、正常な細胞性機能のアゴニストまたは
アンタゴニストのいずれかである因子を同定するためのアッセイを提供する。１
つの実施態様において、このアッセイは、他のタンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮ
ＡとのＶＳＭＣタンパク質の結合を調節する化合物の能力を評価する。他の実施
態様において、本発明のアッセイは、ＶＳＭＣタンパク質の酵素活性を調節する
化合物を検出する。本発明のアッセイによって同定された化合物は、例えば、増
殖性および／または分化性障害の処置において、およびアポトーシスの調節のた
めに使用することが出来る。
【０１０１】 ＶＳＣＭタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力に
ついて試験されるべき因子は、例えば、細菌、酵母、または他の生物（例えば、
天然産物）、化学的産生物（例えば、ペプチド模倣物を含む小分子）、または組
換え的産生物によって、産生することが出来る。好ましい実施態様において、試
験因子は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する小生物分子である。分子
調節因子に直接結合する因子の高速スクリーニングは、不死化または「タグ化」
コンビナトリアルライブラリー（または、他に容易に脱回旋された（ｄｅｃｏｎ
ｖｏｌｕｔｅｄ）ライブラリー）を使用することが出来る。
【０１０２】 薬物スクリーニングアッセイにおいて活性と同定される因子は、平滑筋細胞分
化活性をブロックする能力について試験されるべき候補体である。以下に記載さ
れるように、これらの因子は、狭窄症、動脈硬化症、または平滑筋細胞分化の活
性を阻害もしくは制御することによって平滑筋細胞の逸脱した成長に関与する他
の障害の処置または予防に有用である。
【０１０３】 種々のアッセイ形式は十分であり、そして本発明の開示を考慮して、本明細書
中に特に記載されていないものは、それにもかかわらず、当業者によって理解さ
れる。例えば、アッセイは多くの異なった形式において作製され、そして細胞を
含まないシステム（例えば、精製タンパク質または細胞溶解物）に基づくアッセ
イ、ならびに細胞に基づくアッセイ（インタクトな細胞を利用する）を含む。単
純な結合アッセイもまた、ＶＳＭＣタンパク質に関与するタンパク質−タンパク
質またはタンパク質−ＤＮＡ相互作用を増強または中断することが出来る化合物
を検出するもののような因子を検出するために使用することが出来る。
【０１０４】 化合物のラブラリーおよび天然の抽出物を試験する多くの薬物スクリーニング
プログラムにおいて、所定の期間で調べられた化合物の数を最大化するために、
高速処理アッセイが所望である。精製もしくは半精製タンパク質とともにまたは
溶解物とともに誘導することが出来るような、細胞を含まないシステムにおいて
行われる本発明のアッセイは、しばしば「一次」スクリーニング（ここで、これ
らは、試験化合物によって媒介される分子の標的における変化の迅速な発達およ
び比較的容易な検出を可能にするように生成することが出来る）といわれる。さ
らに、試験化合物の細胞性毒性および／または生物活性の効果は、インビトロシ
ステムにおいて一般に無視することができ、その代わりに、アッセイは、他のタ
ンパク質との結合親和性の変化、あるいは分子標的の酵素特性の変化を現すこと
が出来るように、分子標的における薬物の効果に主に集中される。
【０１０５】 従って、本発明の例示的なスクリーニングアッセイにおいて、反応混合物を、
ＶＳＭＣタンパク質、試験化合物、および「標的分子」（例えば、ＶＳＭＣタン
パク質と相互作用するかまたはＶＳＭＣタンパク質の酵素活性の基質である、タ
ンパク質または核酸）を含むために生成する。ＶＳＭＣタンパク質の標的分子と
の相互作用または基質変換（適切である場合）の検出および定量は、ＶＳＭＣタ
ンパク質と標的分子との間の相互作用を阻害または増強する化合物の効力を決定
するための手段を提供する。この化合物の効力は、試験化合物の種々の濃度を使
用して得られたデータから用量反応曲線を作成することによって評価することが
出来る。さらに、コントロールアッセイもまた、比較のベースラインを提供する
ために行い得る。コントロールアッセイにおいて、ＶＳＭＣタンパク質と標的分
子との相互作用は、試験化合物の非存在下で定量される。
【０１０６】 ＶＳＭＣタンパク質と標的化合物との間の相互作用は、種々の技術によって検
出することが出来る。複合体の形成の調整は、例えば、検出可能に標識されたタ
ンパク質（例えば、イムノアッセイ、クロマトグラフィー検出、またはアセチラ
ーゼの内性活性の検出によって、放射標識、蛍光標識、または酵素標識された、
ＶＳＭＣタンパク質）を使用して定量することが出来る。
【０１０７】 代表的に、ＶＳＭＣタンパク質または標的分子のいずれかを固定化して、片方
または両方のタンパク質の非複合体化形態からの複合体の分離を容易にすること
、ならびにアッセイの自動化を提供することが所望される。候補因子の存在下お
よび非存在下での標的分子へのＶＳＭＣタンパク質の結合は、反応物を含有する
のに適した任意の容器中で達成することが出来る。例えば、マイクロタイタープ
レート、試験チューブ、および微量遠心分離管が含まれる。１つの実施態様にお
いて、マトリックスへのタンパク質の結合を可能にするドメインを付与する、融
合タンパク質が提供することが出来る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼ／ＶＳＭＣタンパク質（ＧＳＴ／ＶＳＭＣタンパク質）融合タンパク質
を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．
Ｌｏｕｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導性マイクロタイタープレート上に吸着
させ、これを、次いで、細胞溶解物（例えば、３５Ｓ−標識化）および試験化合
物と組合わせ、そして混合物を、複合体形成を行う条件下で（例えば、塩および
ｐＨについて生理学的条件で）（少しだけよりストリンジェントな条件を所望で
きるが）インキュベートする。インキュベーションの後、ビーズを洗浄していか
なる非結合標識も除去し、そして固定化されたマトリックスおよび放射標識を、
直接（例えば、シンチレーションに配置されたビーズ）または複合体が後に解離
した後の上清において、決定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離さ
せ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてビーズ画分において見られる標的
分子のレベルを、標準的な電気泳動技術を使用してゲルから定量することが出来
る。
【０１０８】 マトリックス上に固定化されたタンパク質および他の分子についての他の技術
もまた、本発明のアッセイにおける使用のために利用可能である。例えば、ＶＳ
ＭＣタンパク質または標的分子は、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利
用して固定化することが出来る。例えば、ビオチン化ＶＳＭＣタンパク質分子は
、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から、当該分野におい
て周知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｅｍｉｃａｌｓ
、Ｒｏｃｈｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して調製され、そしてストレプトアビジンで
コートされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル
内に固定される。あるいは、ＶＳＭＣタンパク質と反応性であるが、ＶＳＭＣタ
ンパク質と標的分子との間の相互作用を妨害しない抗体が、プレートのウェルか
ら誘導体化され、そしてＶＳＭＣタンパク質は、抗体結合によってウェル内で捕
獲される。上記のように、標的分子および試験化合物の調製物を、プレートのＶ
ＳＭＣタンパク質が存在するウェル内でインキュベートし、そしてウェル内に捕
獲された複合体の量を定量することが出来る。このような複合体を検出する例示
的な方法には、ＧＳＴ固定化複合体についての上記のものに加えて、標的分子と
反応性であるか、またはＶＳＭＣタンパク質と反応性であって標的分子と競合す
る抗体を使用する、複合体の免疫検出；ならびに、ＶＳＭＣタンパク質または標
的分子と、内因性活性もしくは外因性活性のいずれかで結合する酵素活性の検出
に依存する、酵素連結アッセイが含まれる。後者の場合、酵素を、化学的にＶＳ
ＭＣタンパク質もしくは標的分子と結合することが出来るか、またはＶＳＭＣタ
ンパク質または標的分子との融合タンパク質して提供することが出来る。例証の
ために、標的分子を、西洋ワサビペルオキシダーゼと化学的に架橋させるかまた
は遺伝子的に融合（ポリペプチドである場合）させ、そして複合体に捕獲された
ポリペプチドの量を、酵素の発色基質（例えば、３，３’−ジアミノ−ベンザジ
ンテトラヒドロクロリドまたは４−クロロ−１−ナフトール）を用いて評価する
ことが出来る。同様に、ポリペプチドおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼを含む融合タンパク質が提供され、そして複合体形成は、１−クロロ−２，
４−ジニトロベンゼンを使用してＧＳＴ活性を検出することによって定量される
（Ｈａｂｉｇら（１９７４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４９：７１３０）。
【０１０９】 複合体に捕獲されたタンパク質の定量のための免疫検出に依存するプロセスの
ために、タンパク質に対する抗体（例えば、抗ＶＳＭＣタンパク質抗体）を使用
することが出来る。あるいは、複合体において検出されるべきタンパク質は、Ｖ
ＳＭＣタンパク質配列に加えて第２のポリペプチド（抗体が容易に利用可能であ
るもの（例えば、市販のもの））を含む融合タンパク質の形態で「エピトープタ
グ化」することが出来る。例えば、上記のＧＳＴ融合タンパク質もまた、ＧＳＴ
部分に対する抗体を使用して結合の定量のために使用することが出来る。他の有
用なエピトープタグには、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基配列を含むｍｙｃ−エピト
ープ（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６
：２１１５０−２１１５７）、およびｐＦＬＡＧシステム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、またはｐＥＺＺ−プ
ロテインＡシステム（Ｐｈａｒａｍａｃｉａ，ＮＪ）が含まれる。
【０１１０】 本発明の例示的な薬物スクリーニングアッセイは、（ａ）以下を含む反応混合
物の作製工程：（ｉ）潜在性結合ペプチド（ＬＡＰ）またはＴＧＦβなどの標的
分子、（ｉｉ）潜伏ＴＧＦβ結合タンパク質（ＬＴＢＰ−１）などのＶＳＭＣタ
ンパク質、および（ｉｉｉ）試験化合物；ならびに（ｂ）標的分子とＶＳＭＣタ
ンパク質との相互作用を検出する工程を包含する。試験化合物の非存在下での相
互作用と比較して、試験化合物の存在下でのＶＳＭＣタンパク質の相互作用にお
ける統計学的に有意な変化（増強または阻害）は、試験化合物の潜在的なアゴニ
スト（模倣物または増強因子）またはアンタゴニスト（インヒビター）を示唆す
る。反応混合物は、細胞を含まないタンパク質調製物（例えば、再構成されたタ
ンパク質混合物または細胞溶解物）であり得るか、またはＶＳＭＣタンパク質を
組換え的に発現する異種核酸を誘導する組換え細胞であり得る。
【０１１１】 ＶＳＭＣタンパク質がレセプターである場合、またはＶＳＭＣタンパク質がオ
リゴマーレセプター複合体（例えば、この複合体は他のタンパク質サブユニット
を含む）の部分として関与する場合、細胞を含まないシステムは、例えば、細胞
膜膜調製物、再構成されたタンパク質混合物、またはレセプターを再構成するリ
ポソームであり得る。例えば、ＶＳＭＣタンパク質を含むレセプター複合体のタ
ンパク質サブユニットは、本物の供給源、あるいは人工的な脂質小胞（例えば、
ホスファチジルコリンリポソーム）もしくは細胞膜由来小胞（例えば、Ｂｅａｒ
ら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：８０９−８１８：Ｎｅｗｔｏｎら（１９８３）
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２：６１１０−６１１７；およびＲｅｂｅｒら（
１９８７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：１１３６９−１１３７４を参照の
こと）において再構成することが出来る組換え供給源の両方からの界面活性剤抽
出物から精製することが出来る。得られたリポソームのラメラ構造およびサイズ
は、電子顕微鏡を使用して特徴付けることができる。再構成された膜のレセプタ
ーの外部配向は、例えば、免疫電子顕微鏡によって示すことが出来る。このよう
なＶＳＭＣタンパク質複合体を含むリポソームを有するリガンドまたは試験化合
物とタンパク質を有さないリポソームとの相互作用を、レセプターの潜在的なモ
ジュレーターを同定するために比較することが出来る。
【０１１２】 なお別の実施態様において、薬物スクリーニングアッセイは、ＶＳＭＣタンパ
ク質を発現する全細胞を含むように駆動される。試験因子の、ＶＳＭＣタンパク
質の活性を変化させる能力を、組換え細胞の分析によって検出することが出来る
。例えば、ＶＳＭＣタンパク質生物学的活性のアゴニストおよびアンタゴニスト
は、細胞の成長または分化（表現型）における変化についてスコア付けすること
によって検出することが出来る。検出のための一般的な技術はそれぞれ周知であ
り、そして任意の所定のアッセイにおいて利用される特定の試薬細胞の供給源に
関して変化する。細胞に基づくアッセイのために、組換え細胞は、好ましくは後
生動物細胞（例えば哺乳動物細胞、例えば昆虫細胞、例えばアフリカツメガエル
細胞、例えば卵母細胞）である。好ましい実施態様において、細胞は、筋細胞の
表現型または起源の哺乳動物細胞である。ＶＳＭＣタンパク質がレセプターであ
る他の実施態様において、レセプターは酵母細胞において再構成することが出来
る。
【０１１３】 形態学的研究に加えて、ＶＳＭＣタンパク質に依存する活性に応答性の細胞内
二次メッセンジャーのレベルにおける変化が検出することが出来る。例えば、種
々の実施態様において、アッセイは、リン酸化パターン、アデニル酸シクラーゼ
活性（ｃＡＭＰ産生）、ＧＴＰ加水分解、カルシウム移動、および／またはリン
脂質加水分解（ＩＰ３、ＤＡＧ産生）における変化を引き起こす試験因子の能力
を評価することが出来る。二次メッセンジャーまたは遺伝子発現における変化の
ような細胞内シグナルの変化の検出によって、ＶＳＭＣタンパク質依存性シグナ
ル伝達に対する候補アゴニストおよびアンタゴニストを同定することが出来る。
【０１１４】 ＶＳＭＣタンパク質は、リン酸脂質の活性を制御することが出来る。標準亭な
脂質抽出技術を使用して、イノシトール脂質を抽出および分析することが出来る
。３つのイノシトール脂質（ＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３）の全ての水溶性誘導体も
また、放射標識技術またはＨＰＬＣを使用して定量することが出来る。
【０１１５】 細胞内カルシウムの移動または細胞の外からのカルシウムの流入は、ＶＳＭＣ
タンパク質に依存することが出来る。試薬細胞におけるカルシウム流入を、標準
的な技術を使用して測定することが出来る。適切なカルシウムインディケーター
、蛍光、生物発光体、金属色素、またはＣａ＋＋感受性微小電極の選択は、細胞
型および研究下の事象の大きさおよび時間に依存する（Ｂｏｒｌｅ（１９９０）
Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ ８４：４５−５６）。Ｃａ ＋＋ 検出の例示的な方法として、細胞を、標準的な方法を使用してＣａ＋＋感受
性蛍光色素ｆｕｒａ−２またはｉｎｄｏ−１とともにロードし、そしてＣａ＋＋ における任意の変化をフルオロメーターを使用して測定することが出来る。
【０１１６】 このアッセイの具体的な実施態様において、細胞性リン酸化における変化につ
いてスクリーニングすることが所望であり得る。セリン／スレオニンキナーゼま
たはチロシンキナーゼ活性化を調節する化合物の能力を、リン酸化されたセリン
、スレオニン、またはチロシン残基に対する抗体を使用するコロニーイムノブロ
ットを使用して、スクリーニングすることが出来る（ＬｙｏｎｓおよびＮｅｌｓ
ｏｎ（１９８４）ＰＮＡＳ ８１：７４２６−７４３０）。このようなアッセイ
を行う試薬は市販されており、例えば、これらの残基のリン酸化の増加を測定す
るホルホセリンおよびホスホスレオニン特異的抗体は、市販の販売元から購入す
ることが出来る。
【０１１７】 特定のＶＳＭＣタンパク質は、下流のエフェクターの活性化および阻害に関与
するカスケードを推進することが出来る。これに最も一致するものは、ある場合
において、遺伝子の転写または翻訳における検出可能な変化である。このような
標的遺伝子（例えば、これらの遺伝子の上方制御または下方制御に応答するもの
）から転写制御配列を選択すること、ならびにこのようなプロモーターをレセプ
ター遺伝子に作動可能に連結することによって、本発明は、ＶＳＭＣタンパク質
に依存するシグナル伝達経路に影響を及ぼす特異的な試験化合物の能力に敏感な
、転写に基づくアッセイを提供する。
【０１１８】 例示的な実施態様において、本発明のアッセイは、細胞に基づくアッセイにお
いて、ＶＳＭＣタンパク質によるシグナル伝達を担う転写制御配列によって制御
される遺伝子の発現レベルにおける変化を検出する工程を包含する。本発明のア
ッセイに基づくレポーター遺伝子は、上記のカスケード事象の末端段階（例えば
、転写調節）を測定する。従って、アッセイの１つの実施態様の実施において、
レポーター遺伝子構築物を、ＶＳＭＣタンパク質によるシグナル伝達に依存する
シグナルの検出を生じるために、試薬細胞に挿入する。従って、レポーター遺伝
子の発現は、ＶＳＭＣタンパク質依存性シグナル伝達のアゴニストまたはアンタ
ゴニストとして作用する化合物の開発のための可視化スクリーニング道具を提供
する。
【０１１９】 アッセイの１つの実施態様の実施において、レポーター遺伝子構築物を、ＶＳ
ＭＣタンパク質によって生成される二次メッセンジャーに依存する検出シグナル
を生成するために、試薬細胞に挿入する。代表的には、レポーター遺伝子構築物
は、ＶＳＭＣタンパク質からのシグナル伝達を担う１つ以上の転写制御エレメン
トと作動可能に連結したレポーター遺伝子を、検出シグナルを提供するレポータ
ー遺伝子の発現レベルで含む。レポーター遺伝子からの転写の量は、適切な当業
者に公知の任意の方法を使用して測定することが出来る。例えば、レポーター遺
伝子からのｍＲＮＡ発現は、ＲＮＡｓｅ保護またはＲＮＡに基づくＰＣＲを使用
して検出することができ、あるいはレポーター遺伝子のタンパク質産物は、特徴
的な染色または内因性活性によって同定することが出来る。次いで、レポーター
遺伝子からの発現量を、試験化合物の存在しない同じ細胞のいずれかにおける発
現量と比較するか、または、標的レセプタータンパク質を欠如する実質的に同一
の細胞内の転写量と比較することが出来る。転写量のいかなる統計学的に（また
は他の）有意な差異も、試験化合物が同じ様式でＶＳＭＣタンパク質の誘導性活
性を変化させることを示す。
【０１２０】 さらに詳細に以下に記載されるように、好ましい実施態様において、レポータ
ーの遺伝子産物を、その産物に関連した内因性活性によって検出する。例えば、
レポーター遺伝子は、酵素活性によって、色、蛍光、または発光に基づく検出シ
グナルを生じる遺伝子産物をコードすることが出来る。他の好ましい実施態様に
おいて、レポーターまたはマーカー遺伝子は、選択性成長利点を提供する（例え
ば、レポーター遺伝子は細胞生存性を強めることができ、細胞成分要求性を救済
し得、および／または薬物に対する耐性を提供することが出来る）。多くのレポ
ーター遺伝子が当業者に公知であり、そして他のものは、当業者に公知の方法に
よって同定または合成することが出来る。レポーター遺伝子には、検出可能な遺
伝子産物（これは、ＲＡＮまたはタンパク質であり得る）を発現する任意の遺伝
子が含まれる。
【０１２１】 好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出可能な遺伝子である。レポーター遺
伝子はまた、所望の転写制御配列を含むか、または他の所望の特定を示す遺伝子
との融合遺伝子の形態で、構築物中に含まれ得る。レポーター遺伝子の例には、
ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（Ａｌｔｏｎおよ
びＶａｐｎｅｋ（１９７９），Ｎａｔｕｒｅ ２８２：８６４−８６９）ルシフ
ェラーゼ、および他の酵素検出システム（例えば、βガラクトシダーゼ；ホタル
ルシフェラーゼ（ｄｅＷｅｔら（１９８７），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７
：７２５−７３７）；細菌ルシフェラーゼ（ＥｎｇｅｂｒｅｃｈｔおよびＳｉｌ
ｖｅｒｍａｎ（１９８４），ＰＮＡＳ １：４１５４−４１５８；Ｂａｌｄｗｉ
ｎら（１９８４），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：３６６３−３６６７）；
アルカリホスファターゼ（Ｔｏｈら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１８２：２３１−２３８，Ｈａｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅ
ｎ．２：１０１）、ヒト胎盤分泌型アルカリホスファターゼ（Ｃｕｌｌｅｎおよ
びＭａｌｉｍ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３
６２−３６８）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２２】 薬物スクリーニングのさらに別の実施態様において、２つのハイブリッドアッ
セイは、ＶＳＭＣタンパク質および標的分子を用いて生成することが出来る。相
互作用の薬物依存性阻害または増強がスコア付けすることが出来る。当該分野に
おいて記載される２つのハイブリッドアッセイ形式は、このような薬物スクリー
ニング実施態様に容易に適合することが出来る。例えば、米国特許第５，２８３
，３１７号、第５，５８０，７３６号、および第５，６９５，９４１号；Ｚｅｒ
ｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９
９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅ
ｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；および
Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６を
参照のこと。
【０１２３】 例えば上記の薬物スクリーニングアッセイによって、同定することが出来る小
分子に加えて、平滑筋細胞分化を調節することが出来る他の因子には、ＶＳＭＣ
タンパク質のペプチドドメイン（フラグメント）および分子制御因子の変異体が
含まれ得る。本明細書中で使用される「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸
が、天然に存在するペプチドまたはタンパク質と異なるアミノ酸配列を有するペ
プチドをいう。変異体は、天然に存在するタンパク質と同じ生物学的かつ免疫学
的活性を有することが出来る。しかし、変異体の生物学的または免疫学的活性は
、異なるかまたは欠失することが出来る。例えば、タンパク質変異体は、アゴニ
スト、アンタゴニスト（競合的または非競合的）、または天然に存在するタンパ
ク質の機能の部分的なアゴニストとして作用することが出来る。
【０１２４】 例えば、ＶＳＭＣタンパク質のホモログ（アゴニストおよびアンタゴニストの
両方の形態）は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発などを使用して（Ｒｕ
ｆら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５−１５７２；Ｗａ
ｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂ
ａｌｉｎｔら（１９９３）Ｇｅｎｅ １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒ
ｇら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａ
ｇａｓｈｉｍａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２
８９２；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８
３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４４：１０８１−１０８５）、リンカースキャニング変異誘発によって（Ｇ
ｕｓｔｉｎら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏ
ｗｎら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；
ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６）；飽和変異
誘発によって（Ｍｅｙｅｒｓら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３）
；ＰＣＲ変異誘発によって（Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１１−１９）；またはランダム変異誘発によって（Ｍ
ｉｌｌｅｒら（１９９２）Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒ
ｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇ
ｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２−３４）、生成することが出来る。
特にコンビナトリアルな設定におけるリンカースキャニング変異誘発は、ＶＳＭ
Ｃタンパク質の短縮型（例えば、継続的に活性または優性的にネガティブ）形態
を同定するための魅力的な方法である。
【０１２５】 本発明はまた、本発明のＶＳＭＣタンパク質を還元して、平滑筋細胞の成長状
態において、本物のＶＳＭＣタンパク質の効果を妨害することが出来るかまたは
模倣することが出来る、模倣物（例えば、ペプチドまたは非ペプチド因子）を生
成することを意図する。このようなペプチド模倣物は、平滑筋細胞分化の調節の
ための薬物として作用することが出来る。
【０１２６】 ペプチド模倣物は、薬学的産業において、模倣ペプチドの特性に類似した特性
を有する非ペプチド薬物を含むことが通常理解される。ペプチド模倣物の設計の
原理および実施は当該分野において公知であり、そして例えば、Ｆａｕｃｈｅｒ
ｅ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；およびＥｖａｎｓら
、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）に記載される。治療的に
有用なペプチドに対して構造的類似性を保有するペプチド模倣物を使用して、等
価な治療的効果または予防効果を生じ得る。代表的には、このようなペプチド模
倣物は、インビボでの化学的な破壊に対する耐性のような所望の特性を変化する
ことが出来る結合によって必要に応じて置換された、１つ以上のペプチド結合を
有する。これらの結合には、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２ −、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ ２ ＳＯ−が含まれ得る。ペプチド模倣物は、増強された薬理学的特性（生物学的
半減期、吸着速度など）、異なる特異性、増加した安定性、産生秩序、低下した
抗原性、および特に所望される治療剤としての使用を生じるようなものを示する
ことが出来る。
【０１２７】 上記に記載されるような変異原性技術もまた、例えば、本発明のＬＴＢＰ−１
タンパク質のＴＧＦβへの結合（後出で記載される）に関与するタンパク質−タ
ンパク質相互作用に関与するＶＳＭＣタンパク質の決定子をマッピングするため
に特に有用である。例証のために、他の細胞性タンパク質（または核酸）の分子
認識に関与するＶＳＭＣタンパク質の重要な残基を決定し得、そして少なくとも
結合活性の部分を維持するペプチド模倣物を生成するために使用することが出来
る。例えば、結合に関与するアミノ酸残基をマップするためのスキャニング変異
誘発を使用することによって、キナーゼへの結合における残基を模倣するペプチ
ド模倣物化合物（例えば、ジアゼピンまたはイソキノリン誘導体）が生成するこ
とが出来る。例えば、このような残基の非加水分解性ペプチドアナログを、ベン
ゾジアゼピン（例えば、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯ
Ｍ出版社：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を参照のこと）、
アゼピン（例えば、Ｈｕｆｆｍａｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ出版社：
Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を参照のこと）、置換された
ガマ（ｇａｍａ）ラクタム環（Ｇａｒｖｅｙら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ
出版社：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８）、ケトメチレン偽
ペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９：２９５
；およびＥｗｅｎｓｏｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（第９回アメリカ合衆国ペプチドシンポジウムの会報）Ｐｉｅ
ｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｉｌｌ．，１９８５）、
β−ターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉら（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７；およびＳａｔｏら（１９８６）Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏ ｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、およびβ−アミノアルコール
（Ｇｏｒｄｏｎら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏ ｍｍｕｎ １２６：４１９；およびＤａｎｎら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂ ｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）を使用して作製すること
が出来る。
【０１２８】 本発明による平滑筋細胞分化の調節には、タンパク質あるいはＶＳＭＣタンパ
ク質の３’もしくは５’非コード領域の全てまたは一部に相補的なアンチセンス
ポリヌクレオチドを含むペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列の全て
または一部に相補的な特異的アンチセンスポリヌクレオチドを使用する方法を包
含する。このような相補的アンチセンスポリヌクレオチドには、標的配列への特
異的ハイブリダイゼーションが存続する限り、ヌクレオチドの付加、欠失、置換
、および転移が含まれ得る。
【０１２９】 本明細書中で使用される場合、「アンチセンス」治療は、細胞性条件下で、Ｖ
ＳＭＣタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと特
異的にハイブリダイズ（例えば、結合）するオリゴヌクレオチドプローブもしく
はその誘導体の投与またはインサイチュ生成をいう。ハイブリダイゼーションは
、例えば、転写および／または翻訳阻害によって、そのタンパク質の発現を阻害
するべきである。結合は、従来の塩基対相補性によって、または（例えば、ＤＮ
Ａ二本鎖に結合する場合）二重らせんの主要な溝における特異的な相互作用を介
して、であり得る。一般に、「アンチセンス」治療は、当該分野において一般に
使用される技術の範囲をいい、そして、オリゴヌクレオチド配列に対する特異的
な結合に依存する任意の治療を含む。
【０１３０】 分子制御因子を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡ種に特異的にハイブリダ
イズすることができ、ならびにｍＲＮＡ種の転写および／またはコードしたポリ
ペプチドの翻訳を妨害する、可溶性アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌク
レオチドは、本発明により、相補的なアンチセンスポリヌクレオチドとして考慮
される。
【０１３１】 本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞内で転写された場合、標的細胞
のｍＲＮＡの少なくとも独特な部分に相補的なＲＮＡを産生する発現プラスミド
として、送達することが出来る。あるいは、アンチセンス構築物は、エキソビボ
で生成される、ならびに細胞内に導入された場合に、標的ＶＳＭＣ遺伝子のｍＲ
ＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズすることによって発現の阻害を
引き起こす、オリゴヌクレオチドプローブである。このようなオリゴヌクレオチ
ドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ
および／またはエンドヌクレアーゼ）に耐性であり、従ってインビボで安定であ
る、改変オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての
使用のための、例示的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオ
エート、およびメチルホスホエートアナログである（米国特許第５，１７６，９
９６号；第５，２６４，５６４号；および第５，２５６，７７５号もまた参照の
こと）。さらに、アンチセンス治療に有用なオリゴマーを構築するための一般的
なアプローチが、例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６；およびＳｔｅｉｎら（１９８８）Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２６５９−２６６８によって概説されている。
【０１３２】 本発明の方法における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを構築す
る場合、いくつかの考慮が成されるべきである：（１）オリゴは５０％以上のＧ
Ｃ含量を有するべきである；（２）３以上のＧのストレッチを有する配列を避け
る；ならびに（３）オリゴヌクレオチドは２５〜２６マーより長くないべきであ
る。アンチセンスオリゴヌクレオチドを試験する場合、ミスマッチしたコントロ
ールが構築することが出来る。このコントロールは、同じ塩基比を保存するため
に、アンチセンスオリゴヌクレオチドに対応する配列の順を逆にすることによっ
て作製することが出来る。
【０１３３】 ＶＳＭＣタンパク質のコンピュータ補助分子モデリングを使用して、コンピュ
ータ映像化技術を使用する三次元構造を研究することが出来る。次いで、低分子
量のインヒビターまたはオリゴペプチドの新規の設計を、選択的な阻害について
分析することが出来る。標的化薬物設計の記載は、Ｋｕｎｔｚ，「Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ
ａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：１０７８−１０８２
（１９９２）およびＤｉｘｏｎ，「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｓｉｇｎ：Ｇｅｔｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｂｅｓｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ」Ｔｒｅｎ ｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：３５７−３６３（１９９２）
に見られる。コンピュータモデリングを使用する、標的に対するインヒビターの
結合の特異的な適用は、Ｐｉｐｅｒら「Ｓｔｕｄｉｅｓ Ａｉｄｅｄ ｂｙ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ｏｆ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ
ｏｆ Ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｄｉ
ｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ」Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ３３：４１２（１９９
２）；Ｈｉｂｅｒｔら「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３Ｄ−Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ Ｄｒ
ｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」Ｔｈｅｒａｐｉｅ（Ｐａｒｉｓ），４６：４４５−４５１
（１９９１）（セロトニンレセプター認識部位）に記載されている。三次元分子
モデリングを行うために使用することが出来るコンピュータプログラムは、Ｋｌ
ｏｐｍａｎ，「Ｍｕｌｔｉｃａｓｅ １：Ａ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏ
ｎ Ｐｒｏｇｒａｍ」Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔ ｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ， １１：１７６−１８４（１９９２）
；Ｐａｓｔｏｒら「Ｔｈｅ Ｅｄｉｓｄｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｒａｔｉｏｎ
ａｌ Ｄｒｕｇ Ｓｅｒｉｅｓ Ｄｅｓｉｇｎ」Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓ ｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ， １０：３
５０−３５８（１９９１）；Ｂｏｌｉｓら「Ａ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉ
ｎｇ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ」Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｄｅｓｉｇｎ， ５：６１７−６２８（１９９１）；ならびにＬａｗｒｅｎｃ
ｅおよびＤａｖｉｓ「ＣＬＩＸ：Ａ Ｓｅａｒｃｈ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏ
ｒ Ｆｉｎｄｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｂ
ｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｋｎｏｗｎ Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎ
ｓｉｏｎａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １２：３１−４１（１９９２）に記
載される。
【０１３４】 なお他の実施態様において、分子調節因子に特異的な低分子量インヒビターを
、分子モデリングによって予期することができ、そして標準的な有機化学技術に
よって合成することが出来る。コンピュータモデリングは、平滑筋細胞分化を増
強するかまたはその分化をブロックするオリゴペプチドを同定することが出来る
。同定されたオリゴペプチドを産生するための技術は周知であり、そして遺伝子
操作技術によって、またはＰＣＲに基づく増幅によって、アミノ酸の有機合成に
よって進行することが出来る。Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｔｈｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｃ ｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）。本発明のインヒビター
は、平滑筋細胞分化を選択的に阻害するインヒビターとして同定することが出来
る。
【０１３５】 好ましい実施態様において、薬物スクリーニングアッセイを、例えば他の非筋
細胞組織と比較して、ならびにさらにより好ましくは他の非筋細胞および筋細胞
組織と比較して、平滑筋細胞において選択的に発現されるＶＳＭＣタンパク質を
用いて実施する。例えば、具体的な好ましい実施態様において、薬物開発の候補
物として選択されるＶＳＭＣタンパク質は、他の筋細胞（例えば、骨格筋）にお
いて発現されない、または成長もしくは分化のための細胞において必要とされな
い、タンパク質である。しかし、選択性はまた、本発明のアッセイにおいて同定
される薬物の投与の様式によって提供することが出来ることもまた、当業者に明
らかである。例えば、薬物は、カテーテルによりまたは末梢空間への注射により
送達され、そして例えば、骨格筋または他の組織と比較して、血管平滑筋細胞へ
の選択性を提供する。
【０１３６】 具体的な実施態様において、本発明の治療剤は、血管平滑筋細胞の細胞性活性
（例えば、増殖、移動、細胞容量の増加、細胞外マトリックス合成の増加（例え
ば、コラーゲン、プロテオグリカンなど）、または細胞による細胞外マトリック
ス物質の分泌）を阻害するために選択される。好ましくは、治療剤は、ａ）ＤＮ
Ａの複製阻害（例えば、アドリアマイシン、スタウロスポリン、タモキシフェン
などの薬物）または紡錘糸形成の阻害（例えば、コルチシンなどの薬物）などに
よって細胞増殖における細胞分裂を妨害または遅延するための「細胞成長抑止剤
」として；あるいはｂ）医療壁から内膜への血管平滑筋細胞の移動のインヒビタ
ー（例えば、「抗移動剤」）として；あるいはｃ）細胞容量（すなわち、細胞に
よって占領される組織容量）における細胞内増加のインヒビター（「骨格筋イン
ヒビター」または「代謝性インヒビター」）として；あるいはｄ）細胞のタンパ
ク質合成および／もしくは分泌、または細胞外マトリックスの組織化をブロック
するインヒビター（すなわち、「抗マトリックス剤」）として、のいずれかとし
て作用する。
【０１３７】 ＶＳＭＣ治療は、単独で、または（１）細胞の代謝を変化させる、またはタン
パク質合成、細胞の増殖、もしくは細胞移動のインヒビターである治療剤；（２
）形態学に影響を及ぼすかまたは細胞容量を増加させる、微小管および細糸イン
ヒビター；ならびに／あるいは（３）細胞外マトリックス合成または分泌のイン
ヒビターと組合わせて、投与することが出来る。
【０１３８】 潜伏ＴＧＦβ結合タンパク質 １つの実施態様において、本発明のＶＳＭＣ治療剤は、潜伏ＴＧＦβ結合タン
パク質（ＬＴＢＰ）（好ましくは、ＬＴＢＰ−１）の活性を調節する能力によっ
て同定される。トランスフォームした成長因子β（ＴＧＦβ）は、ＴＧＦβを構
成する、潜伏高分子量複合体、潜伏性結合ペプチド（ＬＡＰ）、および潜伏ＴＧ
Ｆβ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）として分泌される。種々の組織の細胞外マトリ
ックス（ＥＣＭ）の成分であるＬＴＢＰは、ＴＧＦβの分泌に、さらにはＥＣＭ
におけるＴＧＦβの貯蔵に、重要である。ＬＴＢＰの活性の阻害は、平滑筋細胞
の増殖および／または移動を阻害すること（例えば、管腔内膜形成を処置または
阻害すること）が意図される処置の部分として使用することが出来る。
【０１３９】 以前の研究は、ＬＴＢＰ−１が、ＬＴＢＰ−１の８システイン構造モチーフ（
「ＴＧＦ−ｂｐ反復」）とＬＡＰのプロペプチド二量体との間のジスルフィド結
合を介して小潜伏ＴＧＦβ１複合体を結合することを示した。従って、具体的な
実施態様において、本発明は、例えばＬＡＰまたはＬＴＢＰ−１への競合的結合
または非競合的結合によって、ＬＴＢＰ−１と小潜伏ＴＧＦβ１複合体との相互
作用を阻害する、ＶＳＭＣ治療剤の同定を意図する。例示的なＶＳＭＣ治療剤は
、例えば、ＬＴＢＰ−１含有ＴＧＦβ複合体の形成を阻害する小有機分子、なら
びに小潜伏ＴＧＦβ１複合体に競合的に結合しそして天然のＬＴＢＰの結合を阻
害する、ＬＴＢＰ−１のポリペプチド、ペプチドフラグメント、およびペプチド
模倣物であり得る。
【０１４０】 ＬＴＢＰのタンパク質分解性切断は、ＴＧＦ−βの活性化に欠くことが出来な
いと考えられている。従って、別の実施態様において、ＬＴＢＰのタンパク質分
解性を阻害するＶＳＭＣ治療剤（例えば、プロテアーゼインヒビター）が同定す
ることが出来ることが意図される。
【０１４１】 他の実施態様において、ＬＴＢＰ−１の発現を阻害するために、アンチセンス
が使用することが出来る。
【０１４２】 ＬＴＢＰ−１、ＬＡＰ、およびＴＧＦβの組換え形態を生成するための供給源
は、当該分野において公知である。例えば、ヒトＬＴＢＰ−１の配列は、ＳＷＩ
ＳＳ−ＰＲＯＴ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ２２０６４およびＫａｎｚａｋｉら（
１９９０）Ｃｅｌｌ ６１：１０５１−１０６１で提供される。
【０１４３】 インテグリン連結キナーゼ 本明細書中で同定される別の差別的に発現される遺伝子は、インテグリン様キ
ナーゼ（ＩＬＫ）をコードする。従って、別の実施態様において、本発明のＶＳ
ＭＣ治療剤は、ＩＬＫの活性を調節する能力によって同定される。細胞外マトリ
ックスとの細胞の相互作用は、細胞形状、移動性、成長、生存性、分化、および
遺伝子発現を、インテグリン媒介性シグナル伝達を介する部分において制御する
。本明細書中に記載されるアッセイを利用して、平滑筋細胞の発達の間の上方制
御に基づいて、ＩＬＫをクローン化した。ＩＬＫは、β１およびβ３インテグリ
ンサブユニットの細胞質ドメインと直接相互作用（そしてリン酸化）することが
出来るセリン−スレオニンタンパク質キナーゼを含有するアンキリン反復であり
、そのキナーゼ活性は細胞−細胞外マトリックス相互作用によって調節される。
ＩＬＫの過剰発現は上皮細胞構造を破壊し、そしてインテグリン基質への接着を
阻害したが、一方、足場非依存性成長を誘導した。実際、ＩＬＫ過剰発現上皮細
胞は、ヌードマウスにおいて迅速に腫瘍を形成した。本明細書中における本発明
者らの観察に基づいて、本発明者らは、平滑筋細胞成長、細胞生存、および腫瘍
形成におけるこのキナーゼの新しい重要な役割を示す。
【０１４４】 インテグリンは、細胞外、膜内外、および細胞質ドメインを含む、ヘテロ二量
体の完全な血漿膜タンパク質である。インテグリンの細胞質ドメインは、この二
方向性情報の伝達に必要であり、そして最近、ＩＬＫとの直接的な相互作用に関
与することが示されている。本発明は、平滑筋細胞の制御におけるＩＬＫの役割
を拮抗するＶＳＭＣ治療剤が同定することが出来ることを意図する。例えば、Ｉ
ＬＫによってインテグリンおよび他の基質のリン酸化を阻害する化合物が同定す
ることが出来る。例証するために、本発明の薬物スクリーニングアッセイを、Ｉ
ＬＫのキナーゼ活性の機械的または他の競合的インヒビター（例えば、小分子イ
ンヒビター）を同定するために使用することが出来る。同様に、小分子（ＩＬＫ
またはインテグリンのペプチドフラグメントを含む）を、ＩＬＫとその基質との
相互作用を阻害する能力によって同定することが出来る。
【０１４５】 さらに、小腸上皮細胞におけるＩＬＫの過剰発現は、核へのβ−カテニンの転
移、β−カテニンと高移動性基転写因子（ＬＥＦ−１）との間の複合体の形成、
およびこのＬＥＦ−１／β−カテニン複合体による転写活性化を生じる。従って
、平滑筋細胞におけるＩＬＫの阻害もまた、ＬＥＦ−１／β−カテニンシグナル
伝達経路のインヒビターを利用することが出来る。
【０１４６】 上記のように、アンチセンスを使用して、ＩＬＫの発現を阻害することが出来
る。
【０１４７】 逆に、ＩＬＫの本質的な活性形態（例えば、Ｎｏｖａｋら（１９９８）ＰＮＡ Ｓ ９５：４３７４）を発現して、平滑筋細胞におけるＩＬＫの活性を増強する
ことが出来る。
【０１４８】 デコリン 別の差別的に発現した結節性調節因子はデコリンタンパク質である。図２６は
、ＴＧＦβ、ＬＴＢＰ、およびデコリンの選択的な発現パターンを示す。ＴＧＦ
βは、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン、およびルミカンなどのプロ
テオグリカンのデコリンファミリーのメンバーに、特異的に結合する。ＬＴＢＰ
−１が同定されると、代替的な神経堤細胞の運命のプロモーターとしてのＴＧＦ
βの役割、デコリンのＴＧＦβ阻害活性は、平滑筋細胞の成長速度を調節する因
子についての意図された薬物スクリーニング標的である。
【０１４９】 デコリンは、ＰＧ−ＩＩまたはＰＧ−４０としても知られ、小プロテオグリカ
ンである。そのコアタンパク質は、約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
コアは配列決定され、そしてコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸型の一本鎖グ
リコサミノグリカンを保有することが知られている。デコリンのほとんどのコア
タンパク質は、約２４アミノ酸のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）の存在によ
って特徴付けられる。
【０１５０】 デコリンは、ＴＧＦβ誘導性細胞増殖および細胞外マトリックス産生を妨害す
るために使用されている。それ故、デコリンは、ＴＧＦβ制御活性によって引き
起こされる病理を低減または予防するために有用である。ヒト組換えデコリンを
発現および精製する方法は、例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ ９０／００１９４および
米国特許第５，７６３，２７６号に記載されるように、当該分野において公知で
ある。米国特許第５，７０５，６０９号は本発明の処置方法に有用であり得るデ
コリンの阻害性フラグメントを記載する。
【０１５１】 具体的な実施態様において、本発明の薬物スクリーニングアッセイを使用して
、デコリンとＴＧＦβとの相互作用を中断する因子、または代替的に相互作用を
模倣もしくは増強する因子を同定することが出来る。
【０１５２】 カスパーゼ 本発明のＳＭＣ分化アッセイにおいて検出される別の潜在的な薬物標的は、チ
オールタンパク質、カスパーゼ−４である（ＧｅｎＢａｎｋ Ｐ４９６６２；Ｆ
ａｕｃｈｅｕら（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１９１４もまた参照のこと）
。カスパーゼ−４は、いわゆる「死プロテアーゼ」であり、カスパーゼ−８によ
って活性化され（タンパク質分解によって）、そしてカスパーゼ−３を活性化す
る（これもまたタンパク質分解によって）。これらの酵素のプロテアーゼ活性は
、それ故、本発明のスクリーニングアッセイにおける薬物発見のための標的であ
る。
【０１５３】 さらに、活性酵素はヘテロ二量体である。２つのサブユニットは、自己触媒性
メカニズムによってまたはカスパーゼ−８による切断によって、前駆体配列から
誘導される。サブユニットの相互作用は、例えば、本発明の薬物スクリーニング
アッセイにおいて同定される小分子によって阻害することが出来る。
【０１５４】 最終的に、カスパーゼ酵素は、ＣＥＤタンパク質と相互作用することが理解さ
れる。詳細には、カスパーゼ−４は、ＣＥＤ−４、Ａｐａｆ−１の哺乳動物ホモ
ログと相互作用する。この相互作用もまた、薬物発見のための潜在的な標定であ
る。
【０１５５】 トルシン 治療的介入のための別の潜在的な標的は、ＡＴＰ結合タンパク質をコードする
初期オンセットトルシンジストニア遺伝子（ＤＹＴ１）（またはトルシンＡ）の
ヒトホモログの産物である。それは、細胞をストレスおよび外傷、心臓ショック
タンパク質／プロテアーゼから保護するタンパク質のクラスに類似している。Ｏ
ｚｅｌｉｕｓら（１９９７）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １７：４０−４８。トルシン
Ａの活性を阻害または増強する化合物を開発するための技術は、米国特許第５，
７５０，１１９号（これは、関連した心臓ショックタンパク質複合体に基づく薬
物スクリーニングアッセイを記載する）などの当該分野から適合することが出来
る。
【０１５６】 ｃｃｔζ シャペロニン含有ＴＣＰ−１複合体（ＣＣＴ）は、複数の異なるサブユニット
から成るヘテロマー粒子である。本発明者らは、分化の間に選択的に上方制御さ
れるサブユニット、ｃｃｔζを同定した。他の場合では、ＴＣＰ−１の組織特異
的サブユニットが報告されている。例えば、Ｋｕｂｏｔａら（１９９７）ＦＥＢ Ｓ Ｌｅｔｔ ４０２：５３−５６を参照のこと。ｃｃｔζサブユニットは、Ｓ
ＭＣタンパク質の折りたたみにおいて、およびＳＭＣ分子シャペロンとの相互作
用について、特異的な機能を有することが出来る。
【０１５７】 １つの実施態様において、本発明の薬物スクリーニングアッセイは、ｃｃｔζ
とＴＣＰ複合体との相互作用を阻害する化合物を検出するために適合することが
出来る。
【０１５８】 プロチモシンα プロチモシン−αは、細胞成長に必須である、小さな、高酸性の、豊富な、核
の、哺乳動物タンパク質であり、哺乳動物細胞において小細胞質ＲＮＡに共有結
合することが知られている。ヒトプロチモシン−αの変異分析は、二者分担の核
局在性シグナルを明らかにする。そのリン酸化状態は、増殖活性と一致する。１
つの実施態様において、プロチモシン−αのリン酸化状態の制御に関与するキナ
ーゼ（または拮抗的ホスファターゼ）は、ＶＳＭＣ治療剤として有用であるイン
ヒビターの潜在的な標的である。
【０１５９】 プロチモシン−αは、インビトロでヒストンに結合し、そしてヌクレオソーム
アッセンブリーアッセイにおいて活性を示す。この相互作用もまた、ＶＳＭＣ治
療剤として有用なインヒビターの開発のための潜在的な標的である。
【０１６０】 Ｌｉｍ−キナーゼ ＬＩＭ−キナーゼ１（ＬＩＭＫ１）およびＬＩＭ−キナーゼ２（ＬＩＭＫ２）
は、Ｎ末端の２つのＬＩＭドメイン、内部ＰＤＺ様ドメイン、およびＣ末端プロ
テインキナーゼドメインから成る構造的特徴を有する、セリン／スレオニンキナ
ーゼサブファミリーのメンバーである。具体的な実施態様において、本発明のア
ッセイは、ＬＩＭキナーゼ２ｂのキナーゼ活性のインヒビターを見い出すために
生成される。
【０１６１】 ＬＩＭドメイン（種々のタンパク質において見られる約５０アミノ酸を含むＣ
ｙｓリッチモチーフ）は、タンパク質−タンパク質相互作用に指向されることが
提唱されている。従って、アッセイを使用して、ＬＩＭドメインと、例えば、Ｌ
ＩＭドメイン結合タンパク質との、同様にＤＮＡとの、相互作用を阻害する因子
を同定することが出来る。
【０１６２】 他の実施態様において、アッセイは、ＬＩＭ‐キナーゼ２ｂ（例えば、構造的
に活性形態）の活性化因子を同定するために設計される。
【０１６３】 Ｃｃａ （ｃｃａ１（コンフルエント３Ｙ１細胞結合ｌ）と称されるｃＤＮＡフラグメ
ントは、成長しているサブコンフルエントではなく、成長が止まったコンフルエ
ントなラット３Ｙ１細胞において、対応するｍＲＮＡの優先的な蓄積に基づいて
以前に単離された。ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＢ０００２１５。
【０１６４】 インターフェロン活性可能タンパク質 ＳＭＣ培養において差別的に発現される別の遺伝子は、インターフェロン活性
可能タンパク質ｐ２０４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｍ３１４１９
）である。Ｃｈｏｕｂｅｙら（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１
７１８２もまた参照のこと。ｐＲＢおよびｐ１０７のように、ｐ２０４は、感受
性細胞において強力な成長インヒビターである。これはまたリンタンパク質であ
り、従って、薬物スクリーニングアッセイは、ｐ２４のリン酸化状態を阻害また
は増強する因子を検出するために設計することが出来る。
【０１６５】 インターネキシン スクリーニングにおいて同定される別のタンパク質は、細胞骨格エレメントで
あるα−インターネキシン（ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ２７２２０、Ｃｈｉｅｎら（１
９９４）Ｇｅｎｅ １４９：２８９もまた参照のこと）である。α−インターネ
キシンと他の細胞骨格エレメント（例えば、中間フィラメントエレメント）との
相互作用は、薬物開発の標的であり得る。
【０１６６】 デスモイオキン ＡＨＮＡＫ ＳＭＣスクリーニングにおいて同定される別のタンパク質は、デスモイオキン
（またはＡＨＮＡＫ）遺伝子産物である。ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ７４８１８および
Ｘ６５１５７。デスモイオキンは、低カルシウムでの拡散パターンから高カルシ
ウム濃度での細胞境界での局在化への、カルシウム媒介性隔離を受ける。ＴＰＡ
はまた、デスモイオキンタンパク質の転移を誘導する。選択的なＰＫＣインヒビ
ターは、デスモイオキンタンパク質のカルシウム誘導性転移を完全に阻害した。
さらに、デスモイオキンタンパク質は、おそらくＰＫＣによって、カルシウム誘
導性リン酸化を受ける。多数のタンパク質は、例えば分化に応答して、細胞が分
割サイクルから脱した場合に、明らかに増加する。対照的に、リン酸化の量は、
これらの条件下で減少するようである。
【０１６７】 従って、デスモイオキンタンパク質の転移は、薬物スクリーニングの標的であ
る。同様に、タンパク質のリン酸化（または脱リン酸化）の速度は、薬物同定の
標的であり得る。
【０１６８】 ＴＳＣ−３６（ＴＧＦ誘導性タンパク質） 本発明のＳＭＣ分化アッセイにおいて同定されたなお別の標的は、ＴＧＦβ−
誘導性タンパク質、ＴＳＣ−３６である。ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ９１３８０および
Ｓｈｉｂａｎｕｍａら（１９９３）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２１７：１３
を参照のこと。ＴＳＣ−３６タンパク質のアミノ酸配列が、アクチビン結合タン
パク質であるフォリスタチンといくらかの類似性を有し、そしてシステインが豊
富な分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）と限られた類似性をすることを見い出した。
例えば、パラ分泌因子または自己分泌因子のような、ＴＳＣ−３６の生物学的活
性は、薬物開発の標的であり得る。
【０１６９】 Ｔ細胞活性化タンパク質（ＴＡＰ） 本発明のＳＭＣアッセイによって同定されるなお別の標的は、Ｔ細胞活性化タ
ンパク質ＴＡＰ（これは、ホスファチジルイノシトール−アンカー糖タンパク質
である）である。ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０３６３６およびＲｅｉｓｅｒら（１９８
８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８５：２２５５を参
照のこと。ＴＡＰと細胞外成分との相互作用、細胞膜を横切るシグナル伝達、お
よびホスファチジルイノシトールアンカーの付与は、各々、ＳＭＣにおけるＴＡ
Ｐ機能の小分子インヒビターまたはアゴニストを開発するための潜在的な標的で
ある。
【０１７０】 トランスコバラミン 本発明の薬物スクリーニングアッセイのための別の標的は、トランスコバラミ
ン、ＴＣＩＩである。ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０４７５７６およびＡＦ０９０６８
６を参照のこと。トランスコバラミンＩＩ（ＴＣＩＩ）はビタミンＢ１２（コバ
ラミン；Ｃｂｌ）を結合する血漿タンパク質であり、そしてレセプター媒介性エ
ンドサイトーシスによる細胞性取込みを容易にする。
【０１７１】 Ｆｏｓ−関連抗原 Ｆｏｓ−関連抗原−２（ｆｒａ−２）もまた、ＳＭＣアッセイにおいて上方調
節されることが同定された。この遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ１８９１３および
Ｂａｌｅｒら（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：２７３１９を参照
のこと）は、転写因子のＦｏｓファミリーのメンバーである。ｆｒａ−２と他の
転写成分との相互作用（例えば、ＡＰ−１複合体またはＣＲＥＢ複合体を形成す
るための）、ならびにＤＮＡとの相互作用（転写複合体のモノマーまたは一部と
して）は、ＳＭＣにおけるｆｒａ−２活性のインヒビターの開発のための潜在的
な標的である。
【０１７２】 精巣上体の分泌タンパク質Ｅ１前駆体（ＨＥ１） 本発明のＳＭＣ分化アッセイはまた、潜在的な薬物スクリーニング標的として
ＨＥ１を同定した。ＨＥ１は、ヒト精巣上体の主要な分泌タンパク質である。Ｇ
ｅｎＢａｎｋ Ｑ１５６６８およびＫｒｕｌｌら（１９９３）Ｍｏｌ Ｒｅｐｒ ｏｄ Ｄｅｖ ３４：１６、Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆら（１９９６）Ｂｉｏｌ Ｒｅ ｐｒｏｄ ５４：８４７を参照のこと。
【０１７３】 ユビキノンカルボキシル末端加水分解酵素１２（ＵＣＨ−１２） なお別の潜在的な薬物スクリーニング標的は、ユビキチンカルボキシル末端加
水分解酵素１２である。ユビキチンは前駆体として真核生物細胞において発現さ
れ、線状ポリユビキチンアレイにおける他のユビキチン配列または特異的なリボ
ソームタンパク質のいずれかに、そのカルボキシル末端を介して融合される。い
くつかのポリユビキチン融合体において、単一のアミノ酸（例えば、ヒトではバ
リン）がカルボキシル末端に結合する。これらの遺伝子産物は、ユビキチンカル
ボキシル末端加水分解酵素（ＵＣＨ）によって迅速に切断される。従って、ＵＣ
Ｈ−１２のユビキチン依存性タンパク質分解活性は、単独またはポリソームとし
て、ＳＭＣにおける阻害のために標的化することが出来る。
【０１７４】 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン 甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）もまた、分化しているＳＭＣにお
いて上方制御されるとして同定された。ＴＲＨはＧタンパク質結合レセプター（
ＴＲＨ−Ｒ）に結合する。 ＴＲＨとレセプターとの相互作用、および、ＴＲＨ
レセプターによるその後の細胞内シグナル伝達は、各々、平滑筋細胞においてＴ
ＲＨのアゴニストまたはアンタゴニストについての潜在的な標的である。
【０１７５】 本発明の薬物スクリーニングアッセイが、上記のクローンもしくはそのホモロ
グ（例えば、ストリンジェントな条件下で列挙された配列にハイブリダイズする
核酸によってコードされるもの）、またはアゴニストもしくはアンタゴニストが
求められている生物学的活性を保持するそのフラグメント、を使用して実施する
ことが出来ることが、当業者に理解される。好ましい実施態様において、アッセ
イは、標的化タンパク質のヒトホモログを使用して実施される。
【０１７６】 Ｄ．平滑筋細胞分化の活性を阻害または制御することによって動脈効果症を処置
または予防する方法 本発明の別の局面は、ＶＳＭＣタンパク質の活性化を調節する因子と細胞との
接触によって、平滑筋細胞の分化状態、生存性の増強、および／または増殖の阻
害（または代替的に増強）を誘導および／または維持する方法に関する。ＶＳＭ
Ｃタンパク質の活性を調節することに関して阻害性または贈強性の「ＶＳＭＣ治
療剤」は、適した場合、本明細書中に記載される任意の調製物（単離されたＶＳ
ＭＣタンパク質（アゴニスト形態およびアンタゴニスト形態の両方を含む）、遺
伝子治療構築物、アンチセンス分子、ペプチド模倣物、または本明細書中に提供
される薬物アッセイにおいて同定される因子を含む）であり得る。
【０１７７】 不適切な血管平滑筋増殖は、血管疾患のいくつかの臨床的に重要な形態の病態
生理学の完全な成分である。血管平滑筋細胞の増殖および移動は、心臓発作、発
作、または末梢性血管疾患を引き起こす動脈効果プラークの発生の重要なメカニ
ズムである（Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ：３１４：４８８−５００，１９８６）。
経皮経管動脈形成での動脈硬化性血管損傷の処置後の再狭窄は、この手順の共通
の逆の臨床的結果である。再狭窄は、損傷部位での血管平滑筋の増殖応答に関与
する（Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ；６：３６９−３７５，１９８５）
。最終的に、血管平滑筋増殖は、血管傷害の他の形態の発生、または手術のバイ
パス道の閉鎖を含む妨害（Ｊ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２９：４
０５−４０９，１９９２）、血管系への傷害の拡散（Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａ ｒｄｉｏｌ ；１９：１１０６−１１１３，１９９２）、全身性高血圧（Ｊ Ｈｙ ｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ；１２：１６３−１７２，１９９４）、ならびに、新生児
もしくは一次肺高血圧（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ；９６：２７３−２８１，
１９９５およびＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ；４２：１１６３−１１８４，１９７０
）において重要な成分として提唱されている。
【０１７８】 具体的な実施態様において、本発明の薬物スクリーニングアッセイによって同
定されたＶＳＭＣ治療剤の抗増殖性形態を使用して、例えば、インビトロまたは
インビボで、平滑筋細胞の増殖を阻害することが出来る。例えば、多くの病理学
的状態は、本発明の方法によって同定された抗増殖性因子を用いて処置すること
が出来る、平滑筋細胞増殖に関連することが見い出されている。このような状態
には、再狭窄、動脈硬化症、冠状心疾患、血栓症、心筋梗塞、発作、平滑筋新生
物（例えば、腸および子宮の平滑筋腫および平滑筋肉腫、ならびに子宮の類線維
もしくは線維腫）が含まれる。
【０１７９】 例えば、経皮的経管的冠状動脈形成（ＰＴＣＡ）は、冠状動脈疾患を有する多
くの患者において一次処置様式として広範に使用される。ＰＴＣＡは、管腔妨害
の減少および冠状の流れを改善することによって冠状動脈疾患を有する患者の心
筋虚血を除去することが出来る。１年当たり５００，０００を超える数のＰＴＣ
Ａが行われており、この手術の手順の使用は迅速に発達している。ＰＴＣＡに続
く狭窄は、２５％〜３５％の患者が１〜３ヶ月以内に再狭窄を発症し、重要な問
題のままである。再狭窄は、有意な罹患率および死亡率を生じ、しばしばさらな
る介入（例えば、反復血管形成または冠状バイパス手術）を必要とする。
【０１８０】 １つの実施態様において、抗増殖性ＶＳＭＣ治療剤を、例えば、血管手術の間
に成される血管に対する外傷傷害に続く、血管平滑筋細胞の増殖に起因する狭窄
を阻害するために、投与することが出来る。治療剤複合体および本発明の用量形
態は、血管平滑筋細胞の活性を阻害するために（例えば、血管形成後の狭窄の低
減、遅延、または除去ために）有用である。本明細書中で使用される用語「低減
」は、動物モデルまたはヒトにおいて、血管形成後の平滑筋細胞増殖の刺激から
生じる初期の肥厚を減少させることを意味する。「遅延」は、血管形成後の可視
性の内膜過形成（例えば、組織学的な観察または血管形成試験によって）の発症
までの時間の遅延を意味し、そしてまた「低減」した再狭窄によって達成するこ
とが出来る。血管形成後の再狭窄の「除去」は、手術的な介在（すなわち、反復
血管形成、粥状除去術、または環状動脈バイパス手術によって血管を介して適切
な血流を再構築するために）をもはや必要としないところまで、患者の内膜過形
成を完全に「低減」および／または完全に「遅延」することを意味する。狭窄の
低減、遅延、または除去の効果は、当業者にとって日常的な方法（血管造影、超
音波試験、Ｘ線画像、ファイバー眼内視鏡（ｆｉｂｅｒ ｏｐｔｉｃ ｅｎｄｏ
ｓｃｏｐｉｃ）試験、または生検および組織学を含むが、これらに限定されない
）によって決定することが出来る。本発明の治療結合体は、平滑筋細胞および周
皮細胞の細胞膜への特異的な結合によって、これらの有利な効果を達成する。
【０１８１】 別の実施態様において、本発明は、動脈硬化を処置または予防する方法を提供
する。平滑筋細胞脱分化を阻害するまたは平滑筋分化を増強する、有効量の因子
が、動脈硬化症の動物モデル（例えば、ラットにおけるバルーン傷害頚動脈また
はヒト損傷に類似の動脈硬化プラークを発症したａｐｏＥ−／−マウス）に投与
される。有益な効果を示す分子は、患者の処置に使用される。投与は、動脈硬化
の予防または処置に所望な場合、周期的または連続的であり得る。
【０１８２】 本発明のなお別の局面は、血管形成または他の血管外傷の後の拡張した管腔容
量を維持するための治療様式に関する。本発明のこの局面の１つの実施態様は、
血管平滑筋細胞の接触能力を阻害することが出来る治療剤因子を投与する工程を
包含する。本発明のこの局面の実施において有用な例示的な因子は、傷つけられ
た動脈に血管の調子を喪失させ、その結果、正常な血管流体静力学的圧力（すな
わち血圧）が弛緩性の血管を最大の生理学的直径にまで（またはその付近まで）
拡張することが出来るものである。血管の調子の喪失は、収縮性のタンパク質（
例えば、アクチン、ミオシン、トロポミオシン、カルデスモン、カルポニンなど
）の形成または機能を妨害する因子によって引き起こすることが出来る。この妨
害は、血管平滑筋細胞の収縮に関係している、例えば、カルシウム調節、リン酸
化、または他の代謝経路の阻害によって、直接または関節的に生じ得る。
【０１８３】 （ｉｖ）同定された因子の薬学的調製物 特定の試験ＳＬＥを選択的な抗増殖性として同定した後、本発明のアッセイの
実施者は、選択されたＳＬＥの効力および特異性を、インビトロおよびインビボ
の両方で試験することを続ける。続くインビボ試験のために、または是認された
薬物として動物への投与のために、本発明のアッセイにおいて同定された抗増殖
性ペプチドまたはそのペプチド模倣物を、動物（好ましくは、ヒト）へのインビ
ボ投与のための薬学的調製物において処方することが出来る。同様に、アンチセ
ンスＳＬＥは、非加水分解性アナログ（例えば、ヌクレアーゼ分解に対して耐性
）として作製することができ、そして直接投与として処方されるか、または適切
な場合、転写物としてアンチセンス分子を産生する発現ベクターの形態で提供さ
れる（例えば、遺伝子治療のために）。ポリペプチドとして活性であるＳＬＥは
また、例えば、遺伝子治療における使用のために発現ベクターの形態で提供する
ことが出来る。
【０１８４】 本発明のアッセイにおけるペプチド、タンパク質、およびアンチセンス、また
はこのような分子をコードする遺伝子治療ベクターは、従って、生物学的に受容
可能な培地（例えば、水、緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロー
ル、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、またはそれら
の適切な混合物とともに、投与のために処方することが出来る。選択された培地
中の有効成分の最適な濃度は、経験的に、医学的化学者に周知の手順に従って、
決定することが出来る。本明細書中で使用する場合、「生物学的に需要可能な培
地」には、薬学的調製物の所望の投与経路に適することが出来る、任意のおよび
全ての、溶媒および分散培地などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのこの
ような培地の使用は当該分野において公知である。任意の慣習的な培地または因
子が化合物の活性に不適切である場合を除いて、本発明の薬学的調製物における
その使用が意図される。他のタンパク質を含めて、適切なビヒクルおよびその処
方物は、例えば、著書Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，
Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ， ＵＳＡ １９８５）に記載される。これらのビヒクル
には、注入可能な「保管（ｄｅｐｏｓｉｔ）処方物」が含まれる。上記に基づい
て、このような薬学的処方物には、１つ以上の薬学的に受容可能なビヒクルまた
は希釈剤との組合わせにおける、ならびに、適切なｐＨおよび生理学的液体と等
張の緩衝化培地中に含まれた、化合物の溶液または凍結乾燥粉末が含まれるが、
これらに限定されない。好ましい実施態様において、ＳＬＥ化合物は、局所およ
び／または全身投与のための滅菌調製物中に配置することが出来る。凍結乾燥調
製物の場合には、支持性賦形剤（例えば、マンニトールまたはグリシンであるが
、これらに限定されない）を使用することができ、そして適切な所望の容量の緩
衝化溶液が、所望のｐＨの適切な等張化緩衝化溶液を得るように、提供される。
類似の溶液もまた、所望の容量の等張化溶液における化合物の薬学的組成物のた
めに使用することができ、これには、所望のｐＨ（例えば中性のｐＨ）の等張化
薬学的調製物がいつでも得られるような、適切な濃度でのリン酸またはクエン酸
を有する緩衝化生理食塩水溶液の使用が含まれるが、これに限定されない。
【０１８５】 （ｖ）例示 本発明はここで一般的に記載され、具体的な局面および本発明の実施態様の単
に例証の目的で含まれ、そして本発明を制限することが意図されない、以下の実
施例を参照することによって、より容易に理解される。
【０１８６】 本明細書中で使用される技術および科学的用語は、他に規定されない限り、本
発明に関与する当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書中では
、当業者に公知の種々の方法論の参照がなされる。参照がなされるこのような公
知の方法論を示す刊行物および他の資料は、その全体が本明細書中に参考として
援用される。組換えＤＮＡ技術の一般的な原理を示す標準的な参考研究には、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら後出；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇ ｅｎｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ， ＩＬ Ｐｒｅｓ
ｓ， Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）；Ｊｏｎｅｓ，Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２）；ＡｕｓｔｅｎおよびＷｅｓ
ｔｗｏｏｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏ ｎ ，ＩＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１）が含まれる。当業者に公知
の任意の適切な物質および／または方法が、本発明の実施において利用すること
が出来る；しかし、好ましい物質および／または方法が記載される。以下の記載
および実施例において参照がなされる物質および試薬などは、他に示されない限
り、市販の供給源から得ることができる。
【０１８７】 実施例１ 多能性神経堤細胞の平滑筋細胞への分化のためのインビトロシステム＊ 分化した状態から脱分化した状態への血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）における変化
は、閉塞性動脈硬化症疾患を促進する重要な表現型応答である。その重要性にも
かかわらず、平滑筋分化を制御する分子メカニズムに関する研究は、インビトロ
細胞分化システムが無いために妨げられてきた。本実施例は、ＳＭＣへのＭｏｎ
ｃ−１多機能性神経堤細胞の効果的な分化を促進する培養条件を同定する。排他
的なＭｏｎｃ−１からＳＭＣへの分化は、細胞性形態学、ならびに、ＳＭＣの時
間依存性誘導マーカーである、平滑筋−アクチン、平滑筋ミオシン重鎖、カルポ
ニン、ＳＭ２２、およびＡＰＥＧ−１によって示された。ＳＭ２２プロモーター
の活性は、Ｍｏｎｃ−１細胞において低かった。これらの細胞のＳＭＣへの分化
は、野生型ＳＭ２２プロモーターの活性において、および３つのコピーのＣＡｒ
Ｇエレメントを含むハイブリッドプロモーターの活性において、２０〜３０倍の
増加を引き起こした。ゲル移動シフト分析によって、本発明者らは、分化したＭ
ｏｎｃ−１細胞から調製された核抽出物において、新規のＤＮＡ−タンパク質複
合体を同定した。新規の複合体の１つは、血清応答性因子を含んだ。このＭｏｎ
ｃ−１からＳＭＣへのモデルは、平滑筋の発達および分化の結節性調節因子の同
定を容易にするべきである。
【０１８８】 多能性神経堤細胞は、ニューロン、グリア、軟骨細胞、メラノサイト、および
ＳＭＣに分化することが出来る。ヒヨコの上行大動脈および胸大動脈の動脈ＳＭ
Ｃは神経堤起源のものであり、そして種々のメンバーの形質転換成長因子−スー
パーファミリーが、一次培養された神経堤細胞からニューロン細胞またはＳＭＣ
への分化を有益に促進することが出来る。不運なことに、一次培養において神経
堤細胞を用いる本発明者らの研究力は、生化学的および遺伝的分析に十分な量を
得ることが困難なために、限られてきた。この問題は、ｖ−ｍｙｃ遺伝子を有す
るマウス神経堤細胞のレトロウイルストランスフェクションによる不死化神経亭
細胞株Ｍｏｎｃ−１の作製によって、最近解決された。
【０１８９】 本発明者らは、Ｍｏｎｃ−１細胞が、インビトロＳＭＣ分化システムの開発の
ために使用することが出来ることを仮定した。本発明者らは、Ｍｏｎｃ−１細胞
が効率的にＳＭＣに分化することが出来る培養条件を、この報告で記載する。排
他的なＭｏｎｃ−１からＳＭＣへの分化を、ＳＭＣマーカーである、平滑筋−ア
クチン、平滑筋ミオシン重鎖、カルポニン、ＳＭ２２、およびＡＰＥＧ−１の細
胞性出現および誘導によって示した。また、ＳＭＣ−特異的プロモーターＳＭ２
２の活性の２０〜３０倍の増加は、分化の間の新しいＤＮＡ−タンパク質複合体
の形成と一致した。
【０１９０】 実験手順 細胞培養および試薬−−Ｍｏｎｃ−１細胞株は、Ｄａｖｉｄ Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）から、親切にも提供された。Ｍｏｎｃ−１細胞を
、ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓ
ｏｎ（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１，９７３−９８５）によって記載されるように
、ヒヨコ胚抽出物で補充したＬ−１５ ＣＯ２ベースの培地（本明細書中以下完
全培地と呼ばれる）において、フィブロネクチンコートプレート上で、未分化状
態において培養した。ニューロンおよびグリア経路への分化を、Ｓｏｍｍｅｒら
（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ １５，１２４５−１２５８に記載されるように、ポ
リリジン（０．５ｍｇ／ｍｌ）およびフィブロネクチン（０．２５ｍｇ／ｍｌ）
で順にコートしたプレート上で、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇ
ａｎ，ＵＴ）および５ｍＭフォルスコリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）で補充した完全培地において、行った。平滑筋細胞分化を、１０％ウシ胎仔
血清、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ
／ｍｌ）、および２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）で補充した（本明細書中
以下、平滑筋細胞分化培地（ＳＭＤＭ）と呼ばれる）表１に列挙される培地成分
の適用によって、誘導した。
【０１９１】 ＲＮＡ抽出およびノーザン分析−−培養細胞からの総ＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら（後出）に記載される手順に従って、グアニジニウムイソチオシアネート
抽出および塩化セシウムを用いる遠心分離によって、調製した。総ＲＮＡを、１
．３％ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で分画し、そしてニトロセルロース
膜に（これは、適切な、ランダムにプライムされた、３２Ｐ−標識化プローブで
ハイブリダイズされた）写した。ハイブリダイズした膜を、３０ｍＭ塩化ナトリ
ウム、３ｍＭクエン酸ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで、
５５℃にて洗浄した。Ｋｏｄａｋ ＸＡＲフィルムを使用して、８０℃で、オー
トラジオグラフィーを行った。ローディングにおける差異を校正するために、膜
を５０％フォルムアミド溶液で、８０℃にて洗浄し、放射標識化１８Ｓ ｒＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドプローブで再度ハイブリダイズした（Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ
ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，９４６７−９４６９）。膜を
スキャンし、そして放射活性を、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いるＰｈｏｓ
ｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ上で測定した。平滑筋α−アクチンは、Ｊ．Ｌｅｓｓａｒ
ｄ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）によって提供された；ＡＴ２ ｃＤＮＡは、
Ａ．Ｄ．Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）によって提供された
。カルポニンｃＤＮＡを、マウス大動脈ｃＤＮＡライブラリーから単離した。グ
リア繊維酸性タンパク質ｃＤＮＡを、正方向プライマー：５’ＡＧＣＣＡＡＧＧ
ＡＧＣＣＣＡＣＣＡＡＡＣＴ３’、および逆方向プライマー：５’ＴＴＡＣＣＡ
ＣＧＡＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＧＡ３’を使用して、脳ＲＮＡから逆転写ポリメラ
ーゼ連鎖反応によって単離した。ｃＤＮＡの確実性を、ジデオキシ鎖ターミネー
ター法によって確認した。平滑筋ミオシン重鎖アイソフォームのＳＭ１およびＳ
Ｍ２についてのｍＲＮＡを、マウスＳＭ１およびＳＭ２ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａ
ｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ８５９２３およびＤ８５９２４）か
ら設計されたプライマーを使用して、逆転写ＰＣＲによって検出した。正方向プ
ライマーは：５’ＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＧＣＡ３’、および逆
方向プライマー：５’ＧＧＧＡＣＴＧＴＡＣＣＡＣＡＧＧＴＴＡＧ３’を使用し
て、３２４塩基対ＳＭ１フラグメントおよび３６３塩基対（代替的にスプライス
された）ＳＭ２フラグメントを増幅した。逆転写の効率についてのコントロール
のために、テンプレートｃＤＮＡのアリコートを、マウスグリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡ配列から設計された、正方向プライマー（
５’ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣ３’）および逆方
向プライマー（５’ ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ ３
’）を用いて、ＰＣＲによって分析した。
【０１９２】 免疫細胞化学−−Ｍｏｎｃ−１細胞を、適切な培地中で、フィブロネクチン、
または、フィブロネクチンおよびポリリジン、でコートした、ガラススライド上
で増殖させた（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓを参照の
こと）。平滑筋α−アクチン、カルポニン、グリア繊維酸性タンパク質、および
ペリフェリンについての免疫染色を、Ｓｈａｈら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８５、
３３１−３４３およびＹｏｓｈｉｚｕｍｉら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ ｅｓｔ． ９５，２２７５−２２８０中に記載されるように行った。未分化および
分化のＭｏｎｃ−１細胞、ならびにマウス大動脈からのタンパク質を、わずかな
改変を行って、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版 Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐ
ｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）に従って調製した。タンパク質を５％ドデシル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル上で分離し（Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）Ｎ ａｔｕｒｅ ２２７，６８０−６８５）、ニトロセルロース膜に電気泳動によっ
て写し（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｈｅｕｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）、そし
て１：５０００希釈したウサギ抗平滑筋ミオシン重鎖抗体とともにインキュベー
トし（Ｇｒｏｓｃｈｅｌ Ｓｔｅｗａｒｔら（１９７６）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ ４６，２２９−２３６）、次いで、１：４０００希釈した西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体とともにインキュベートした。膜を、増
強された化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）で処理し、そしてフィルムに曝露した。
【０１９３】 トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ−−１．４ｋｂフラグメ
ントのＳＭ２２αプロモーターを、マウスゲノムＤＮＡおよび以下のプライマー
：正方向５’ＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣ３’、および逆方向
５’ＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣ３’、を使用して、ポリメラーゼ連
鎖反応によって得た。プロモーターフラグメントを、平滑末端連結によって、Ｐ
ＧＬ２基礎ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＸｈｏＩ部位
にサブクローニングした。Ｍｏｎｃ−１細胞を、わずかな改変を行って、Ｋｈｏ
ら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３８４５−３８５１に記載さ
れるように、エレクトロポレーションによって一過性にトランスフェクトした。
簡潔には、Ｍｏｎｃ−１細胞をＰＢＳに再懸濁し、そして最終濃度１×１０６細
胞でエレクトロポレーションキュベット（ＢＴＸ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
に配置した。プラスミドＤＮＡを添加し、そして０．２５Ｖ、５００μＦＤでＢ
ｉｏ−Ｒａｄジーンパルサーによってエレクトロポレーションした。次いで細胞
を６０−ｍｍフィブロネクチンコートプレートに適用し、そして完全培地または
ＳＭＤＭ中に配置した。細胞抽出物をトランスフェクションの４８〜７２時間後
に調製し、そしてルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼアッセイを、Ｂｒａ
ｉｓｅｒら（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７，１１１６−１１２２
、およびＬｅｅら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１０４４６−
１０４５０に記載されるように行った。各構築物を少なくとも６回トランスフェ
クトした。各構築物についてのデータを、平均±標準誤差として表す。
【０１９４】 電気泳動移動シフト分析−−核抽出物を、Ｒｉｔｚｅｎｔｈａｌｅｒら（１９
９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０，１５７−１６２の方法に従って調製した。
細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、そして核溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５％ＮＰ−４０）に溶解
した。核を５００ｇで遠心分離し、次いで１ｍｌの核溶解緩衝液で洗浄した。パ
ックした核を、緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、３５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２５
％グリセロール，０．５ｍＭジチオスレイトール、５ｍｇ／ｍｌロイペプチン、
および１ｍｇ／ｍｌアプロンチニン）で、２０分間、４℃で抽出した。サンプル
を１０，０００ｇで２０分間遠心分離し、そして上清を回収した。タンパク質濃
縮物を、標準としてウシ血清アルブミンを使用することによって、製造業者の説
明書に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈ
ｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって決定した。電気泳動移動シフト分析を、Ｋｉｍ
ら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，２２６６−２２７８および
Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，３２６
６−３２７２に記載されるように行った。簡潔には、ＳＭ２２α ＣＡｒＧエレ
メントの配列５’ＴＣＧＡＧＡＣＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＴＡＴ
ＧＧＡＧＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧ３’に従って合成した二本鎖オリゴヌクレ
オチドプローブを、Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅ ｓｔ． ９５，２２７５−２２８０に記載されるように放射標識した。代表的に結
合した反応混合物は、２５ｍｌの最終容量中に、２０，０００ｃｐｍのＤＮＡプ
ローブ、１μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）・ポリ（ｄＩ−ｄＣ）、２５ｍＭ Ｈｅｐ
ｅｓ（ｐＨ７．９）、４０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、１０％グリセロール、および３μｇの核抽
出物を含んだ。反応混合物を室温で２０分間インキュベートし、そして０．２５
×ＴＢＥ緩衝液（２２ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、２２ｍＭホウ酸、および０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ）中で、５％ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分
析した。２５０×過剰の特異的または非特異的オリゴヌクレオチドを、競合的実
験に使用した。スーパーシフト実験のために、１μｌの抗血清応答性因子抗体（
ｓｃ−３３５ｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ
ｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）または抗ＹＹ１抗体（ｓｃ−２８１ｘ，Ｓａｎｔａ Ｃ
ｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を、核抽
出物およびプローブとともにインキュベートした。
【０１９５】 ディファレンシャルディスプレイ−−ディファレンシャルディスプレイ法は、
ヒエログラフィーシステム（Ｇｅｎｏｍｙｘ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）
を、ｇｅｎｏｍｙｘＬＲ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（これは、再現性および
１０００塩基対までのＤＮＡフラグメントを分離する能力を提供する）と組合わ
せて使用する。
【０１９６】 実施例２ 大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質、ジスコイジンおよびカルボキシ
ペプチダーゼ様ドメインを有する新規のタンパク質、は、血管平滑筋細胞分化の
間上方制御される 血管平滑筋細胞の表現型調節は、動脈硬化症の病理において重要な役割を担う
。ヒト大動脈平滑筋細胞において発現されるタンパク質（例えば、実施例１に記
載されるように）のスクリーニングにおいて、本発明者らは、大動脈カルボキシ
ペプチダーゼ様タンパク質（ＡＣＬＰ）と称される新規の遺伝子産物を同定した
。約４キロベースのヒトｃＤＮＡとそのマウスホモログは、それぞれ１１５８と
１１２８のアミノ酸タンパク質をコードし、８５％同一である。ＡＣＬＰは、シ
グナルペプチド、リジン−リッチおよびプロリン−リッチの１１アミノ酸反復モ
チーフ、ジスコイジン様ドメイン、およびＣ末端ドメイン（カルボキシペプチダ
ーゼＥに対して３９％の同一性を有する）を含有する非核タンパク質である。ウ
ェスタンブロット分析およびインサイチュハイブリダイゼーションによって、本
発明者らは、成体大動脈において大量のＡＣＬＰ発現を検出した。ＡＣＬＰは成
体マウス大動脈の平滑筋細胞において優先的に発現されたが、外膜またはいくつ
かの他の組織においては発現されなかった。培養したマウス大動脈平滑筋細胞に
おいて、ＡＣＬＰ ｍＲＮＡおよびタンパク質は、血清飢餓の後２〜３倍上方制
御された。最近開発された神経堤細胞からのインビトロ分化システムを使用して
、本発明者らは、ＡＣＬＰ ｍＲＮＡおよびタンパク質が神経堤細胞において発
現されないが、これらの細胞の分化によって劇的に上方制御されたことを見い出
した。これらの結果は、ＡＣＬＰが、分化した血管平滑筋細胞において役割を担
い得ることを示す。
【０１９７】 胚の発達の間のＡＣＬＰの起源は様々である（参考文献１、３、および４に概
説される）。発達の間、ＶＳＭＣは、多くの細胞型から局所的中胚葉前駆体およ
び神経堤細胞などを駆動する（３、５）。これらが類似のセットの平滑筋細胞マ
ーカー遺伝子を発現する事実にもかかわらず、これらの細胞集団は、形態学的に
異なり、そして形質転換成長因子−１などの因子に対して、系統依存性様式で応
答する（６）。平滑筋細胞分化の複合体調節の理解は、この応答に関与するタン
パク質の同定を必要とする。
【０１９８】 平滑筋細胞成長および分化の潜在的なマーカーおよび調節因子の研究において
、本発明者らは、大動脈カルボキシペプチダーゼ様タンパク質（ＡＣＬＰ）と称
される新規の遺伝子産物を同定した。ＡＣＬＰは、シグナルペプチド、反復モチ
ーフ、ジスコイジン様ドメイン、およびカルボキシペプチダーゼに対する相同性
を有するドメインを含む。ＡＣＬＰは、ノーザンブロット、ウェスタンブロット
、およびインサイチュハイブリダイゼーションによって検出した場合、成体大動
脈平滑筋細胞において高度に発現される。また、ＡＣＬＰの発現は、血清飢餓の
後、培養大動脈平滑筋細胞において増加する。多能性マウス神経堤細胞から平滑
筋細胞への分化を可能にする最近開発されたインビトロシステムを使用して、本
発明者らは、ＡＣＬＰが劇的に上方制御されることを示す。これらの結果は、Ａ
ＣＬＰが、分化した表現型のＶＳＭＣによる必要性において、発生の間に役割を
担い得ることを示す。
【０１９９】 実験手順 細胞株、細胞培養、および試薬−−ラット大動脈平滑筋細胞（ＲＡＳＭＣ）お
よびマウス大動脈平滑筋細胞（ＭＡＳＭＣ）を、Ｇｕｎｔｈｅｒらの方法（７）
によって、成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットおよびＣ５７ＢＩ／６マ
ウスの胸大動脈から単離した。ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）をＣｌｏｎ
ｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入し、そしてラットＡ７ｒ５平
滑筋細胞およびＣ２Ｃ１２マウス筋原細胞をＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍ
Ｄ）から購入した。マウス神経堤細胞株Ｍｏｎｃ−１は、Ｄａｖｉｄ Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）によって提供された。Ｍｏｎｃ−１細胞を
、わずかな改変を行って、記載される（８）ようにフィブロネクチンコートプレ
ート上で培養した（９）。ＲＡＳＭＣ、ＭＡＳＭＣ、およびＡ７ｒ５細胞を、１
０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、４ｍＭ Ｌ−グルタ
ミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００ユニット／ｍｌペニシリン
、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７。４）で補充した、３．７ｇ／リットル
グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を含有する、ダル
ベッコの改変イーグル培地中で培養した。Ｃ２Ｃ１２細胞を、１５％ウシ胎仔血
清、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１
００ユニット／ｍｌペニシリンで補充したダルベッコの改変イーグル培地中で成
長させた。ＨＡＳＭＣを、２０％ウシ胎仔血清、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０
０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１００ユニット／ｍｌペニシリンで補
充したＭ１９９培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中で培
養した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２を含む加湿インキュベーター内で成長させた
。
【０２００】 ヒトおよびマウスのＡＣＬＰのクローニングおよび配列決定−−ハムスターｓ
ｈＰａｎ−１の塩基性ヘリックスループヘリックスドメイン（アミノ酸５０９〜
６４６、Ｒ５５１Ａ、Ｖ５５２Ｌ、およびＲ５５３Ａの変異を有する）および心
筋キナーゼ認識配列およびＦＬＡＧエピトープを含む、組換えＥ４７融合タンパ
ク質（Ｎ３−ＳＨ［ＡＬＡ］）を発現させ、そして記載される（１０、１１）よ
うに精製した。融合タンパク質を［−３２Ｐ］ＡＴＰの存在下で心筋キナーゼに
よってリン酸化し、次いで相互作用クローニング（１０、１１）によって、ヒト
大動脈ｇｔ１１ ｃＤＮＡ発現ライブラリー（１．５×１０６ｐｆｕ；ＣＬＯＮ
ＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をスクリーニングするために使用した。
この相互作用クローニングから得られた１４５０塩基対（ｂｐ）ｃＤＮＡクロー
ンを、ランダムプライミングによって放射標識し、そして同じヒト大動脈ｇｔ１
１ ｃＤＮＡライブラリーから約２．８キロベース（ｋｂ）ｃＤＮＡクローンを
単離するために使用した。ノーザンブロットにより、後者もまた部分ｃＤＮＡク
ローンであることが明らかになったので、本発明者らは、ｃＤＮＡ末端の５’迅
速増幅（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によって、ＨＡＳＭ
Ｃ ＲＮＡからさらなる５’配列を単離した。
【０２０１】 ＧｅｎＢａｎｋＴＭ研究は、本発明者らのヒトＡＣＬＰクローンの３’末端と
マウス肥満細胞エンハンサー結合タンパク質１（ＡＥＢＰ１）との間の有意な相
同性を明らかにした（１２）。対応するマウスＡＣＬＰ ｃＤＮＡを単離するた
めに、本発明者らは、Ｃ２Ｃ１２マウス筋細胞の総ＲＮＡから、マウスＡＥＢＰ
１の５’末端に従って設計されたプライマー５’−ＡＴＣＴＧＧＴＴＧＴＣＣＴ
ＣＡＡＴ−３’を用いる逆転写によって、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ネスティ
ッドプライマー５’−ＴＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＴＡＧ−３’、およびｃＤ
ＮＡ末端の５’迅速増幅のためのキットに含まれるアンカープライマーを使用し
て、本発明者らは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって約１４００ｂｐフ
ラグメントを増幅した。この産物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ
ｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結し、そして下記のように配列決定した。次いで、マ
ウスＡＣＬＰの全オープンリーディングフレームを、逆転写ＰＣＲ（Ｅｘｐａｎ
ｄ Ｌｏｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）によってＣ２Ｃ１２ ＲＮＡから増幅し、そしてｐＣＲ２
．１に連結した。本発明者らは、ヒトおよびマウスのクローンを、Ｓｅｑｕｅｎ
ａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ３３Ｐ ターミネーターサ
イクルシークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ）、および７−デアザ−ＧＴＰを伴うＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ蛍光標識サイクルシークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の組合わせを使用して、Ｌｉｃｏｒ（Ｌｉｎｃｏｌｎ
，ＮＥ）装置において、ジデオキシヌクレオチド鎖末端法によって、配列決定し
た。
【０２０２】 ノーザンブロット分析−−総ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＲＮＡｚｏ
ｌ Ｂ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を使用
することによって、マウス器官から得た。培養細胞からのＲＮＡをグアニジニウ
ムイソチオシアネート抽出および塩化セシウムによる遠心分離によって単離した
（１３）。ＲＮＡを、１．２％アガロース（６％ホルムアルデヒド）ゲル上で分
画し、そしてニトロセルロース膜（ＮｉｔｒｏＰｕｒｅ，Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐ
ａｒａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｓｔｂｏｒｏ，ＭＡ）に移した。フィルターを、ランダ
ムプライムされた３２Ｐ−標識化ｃＤＮＡプローブを用いて、記載される（１３
、１４）ようにハイブリダイズした。ローディングが等しいことを、１８Ｓリボ
ソームＲＮＡに相補的な３２Ｐ−標識化オリゴヌクレオチドにフィルターをハイ
ブリダイズすることによって確認した（１５）。ブロットを、ｘ線フィルムおよ
びリンスクリーンに曝露し、そして放射活性を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウ
ェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を
用いて、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ上で測定し、そして１８Ｓについて正規
化した。
【０２０３】 ＡＣＬＰの細胞性局在化−−ｃ−ｍｙｃタグ化ＡＣＬＰ発現プラスミド（ｐｃ
ＤＮＡ３．１／ＡＣＬＰ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ）を構築するために、本発明者らは、
Ｅｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてマウスＡＣＬＰのオープンリーディ
ングフレームを増幅した。本発明者らは、ＥｃｏＲＩ部位を含む５’プライマー
（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＣＣＧ−３’）およ
びＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む３’プライマー（５’−ＣＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧ
ＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＧ−３’）を使用して、内因性終結コドンを欠
失させた。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、
そしてｐｃＤＮＡ３．１（）／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結した。細胞を、わずかな改変を行っ
たＤＥＡＥ−デキストラン法によって、ｐｃＤＮＡ３．１／ＡＣＬＰ−Ｍｙｃ−
Ｈｉｓを用いて一過性にトランスフェクトした（１６）。トランスフェクション
の２４時間後、細胞をトリプシン処理し、チャンバースライド（Ｎｕｎｃ，Ｎａ
ｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）上に配置し、そしてさらに２４時間成長させた。細胞
を４％のパラホルムアルデヒドのリン酸緩衝化生理食塩水で固定し、そして記載
される（１７）ように、モノクローナル抗ｃ−ｍｙｃ一次抗体（９Ｅ１０ Ａｂ
−１；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ，ＭＡ）およびローダミン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体で免疫染色し
た。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（１μｇ／ｍｌ）で対比染色し、そして蛍
光顕微鏡で可視化した。
【０２０４】 抗体産生およびウェスタンブロット分析−−ポリクローナル抗ＡＣＬＰ抗体を
産生するために、本発明者らは、マウスＡＣＬＰのＢａｍＨＩ〜ＥｃｏＲＩフラ
グメント（アミノ酸６１５〜１１２８をコードする）を、ｐＲＳＥＴ Ｃ細菌性
発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。プラスミドを
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ−コンピテント細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に
形質転換し、そしてタンパク質発現を、１ｍＭイソプロピル−Ｄ−チオガラクト
ピラノシドで３時間誘導した。細菌を、プロテアーゼインヒビターのアプロチニ
ン、ロイペプチン、およびフェニルメチルスルホニルフロリドを含有する溶解緩
衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１００ｍＭ
ＮａＣｌ）中で超音波処理した。溶解物を、１０，０００×ｇでの１５分間の
遠心分離によって清澄にし、そして沈殿物を８Ｍの尿素で補充した溶解緩衝液で
再懸濁した。Ｈｉｓ−タグ化タンパク質をＴａｌｏｎ樹脂（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ
）で精製し、そして８Ｍ尿素および１００ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸を含
む溶解緩衝液で溶出した。タンパク質を、水に対して透析し、そしてＢｉｏ−Ｒ
ａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）タンパク質アッセイ試薬を使用して測定し、そ
して１００μｇを使用してニュージーランドホワイトウサギに免疫した。抗血清
を回収し、組換えタンパク質に対して力価測定し、そして下記のようにイムノブ
ロット分析のために使用した。抗血清の特異性を、プレ免疫血清を使用すること
によって、および組換えタンパク質との競合によって、決定した。
【０２０５】 培養細胞からのタンパク質抽出物を、プロテアーゼインヒビターのアプロチニ
ン、ロイペプチン、およびフェニルメチルスルホニルフロリドを含有する抽出緩
衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオ
キシコール酸ナトリウム、２％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、および０．２％ド
デシル硫酸ナトリウム）においてウェスタンブロットのために調製した。マウス
組織からタンパク質を得るために、本発明者らは、プロテアーゼインヒビター（
ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１０ｍＭエチ
レンジアミンテロラ酢酸における個々の器官をホモジナイズした。タンパク質を
、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。５０
μｇのアリコートを６％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（１
８）で分離した後、タンパク質を、４８ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、３９ｍ
Ｍ グリシン、０．０３７％ドデシル硫酸ナトリウム、および２０％メタノール
転移緩衝液において、電気泳動的にミクロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。ブロットを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
８）、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で平衡化し、そ
して４％脱脂粉乳を含有する同じ溶液中でブロックした。ブロットを、１：１０
００希釈した抗−ＡＣＬＰ血清とともに、次いで１：４０００希釈した西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ血清とともに、インキュベートした。膜を
、増強された化学発光試薬（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ）で処理し、そしてフィルムに曝露した。
【０２０６】 インサイチュハイブリダイゼーション−−成体雄Ｓｐａｒｇｕｅ−Ｄａｗｌｅ
ｙラットを４％パラホルムアルデヒドで灌流し、そして器官を摘出し、切片化し
た（１９）。プローブを調製し、そしてインサイチュハイブリダイゼーションを
、記載される（１９、２０）ように行った。ＡＣＬＰ ｍＲＮＡを、ｐＣＲ２．
１におけるＡＣＬＰ ｃＤＮＡの直線化０．７ｋｂフラグメントから、ＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した［３５Ｓ］ＵＴＰ−標識化アンチセンスリ
ボプローブを使用して、検出した。コントロールとして、センスＲＮＡプローブ
を、ｐＣＲ２．１における直線化ＡＣＬＰ ｃＤＮＡフラグメントから、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成した。
【０２０７】 結果 ヒトおよびマウスＡＣＬＰ ｃＤＮＡの単離および特徴付け−−ＶＳＭＣにお
いてＥ２Ａ遺伝子（Ｅ１２／Ｅ４７）の産物と相互作用するタンパク質を同定す
るために、本発明者らは、３２Ｐ−標識化Ｅ４７融合タンパク質でヒト大動脈発
現ライブラリーをスクリーニングした。このスクリーニングから単離した、１つ
の短縮型クローン（番号１１）は、本明細書中で特徴付けられた全長ＡＣＬＰク
ローンに導いた。インビトロ結合アッセイを使用して、本発明者らは、全長タン
パク質由来ではなく、クローン１１由来のタンパク質が、Ｅ１２およびＥ４７に
結合することを決定した（データは示さず）。３９３５ｂｐの全長ヒトＡＣＬＰ
ｃＤＮＡは、１１５８アミノ酸のオープンリーディングフレーム（図１２）、
および、インフレームストップコドンの前の、翻訳開始のためのＫｏｚａｋコン
センサス配列（ＧＣＣＡＴＧＧ）（２１）を含む。タンパク質は、１３０ＫＤａ
の算出された分子量および評価された４．８のｐＩを有し、そしてそれは、推定
シグナルペプチド配列（２２、２３）、Ｎ末端で４回反復した１１アミノ酸リジ
ン−およびプロリン−リッチモチーフ、粘菌接着タンパク質ジスコイジンＩに対
して３０％のアミノ酸同一性を有するドメイン、およびカルボキシペプチダーゼ
Ｅと３９％の同一性を有するＣ末端ドメインを有する（図１３）。
【０２０８】 ＧｅｎＢａｎｋＴＭ検索により、ヒトＡＣＬＰのＣ末端がマウスＡＥＢＰ１と
高度に相同性であることが明らかになった（１２）。ＡＥＢＰ１は、本来、ノー
ザンブロット分析において約４ｋｂのバンドにハイブリダイズする約２．５ｋｂ
ｃＤＮＡとして同定され、そして７１９アミノ酸、７９ｋＤａタンパク質をコ
ードすると推定された。ＡＣＬＰとＡＥＢＰ１との間の相同性は、２つの可能性
を示唆した：ＡＣＬＰはより長いＡＥＢＰ！遺伝子ファミリーのメンバーである
か、またはＡＥＢＰ１配列はその５’末端で実質的に短縮される。この２つの可
能性を試験するために、本発明者らは、ＡＣＬＰのマウスホモログを、ｃＤＮＡ
末端の５’迅速増幅と逆転写ＰＣＲとの組合わせによってクローン化した、３６
３３ｂｐのマウスＡＣＬＰ ｃＤＮＡフラグメントを配列決定した後、本発明者
らは、それが、本発明者らのヒトクローンのオープンリーディングフレームと類
似したオープンリーディングフレーム（１１２８アミノ酸）をコードすることを
見い出した。これは、それがマウスホモログ（２つは８５％の同一性および９０
％の類似性である）であることを示唆する。ＡＥＢＰ１はマウスＡＣＬＰのＣ末
端と同一であるので、本発明者は、ＡＥＢＰ１ｃＤＮＡはおそらく完全ではない
（ＡＥＢＰ１配列の開始は図１２の太い黒丸で示される）と結論付けた。
【０２０９】 ＡＣＬＰの特徴付け−−マウスＡＣＬＰの推定オープンリーディングフレーム
を確かめるために、本発明者らは、マウスｃＤＮＡをテンプレートとして用いて
インビトロ転写および翻訳反応を行った。翻訳産物を、ドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、そして約１７５ｋＤａの突
出末端を検出した（図１４）。内因性ＡＣＬＰを同定するために、マウスＡＣＬ
ＰのＣ末端フラグメントを細菌中で発現させ、精製し、そしてウサギに抗体を作
らせるために使用した。ウェスタンブロット分析によって、この抗体は、ＭＡＳ
ＭＣ抽出物において約１７５ｋＤａの明らかな移動性を有する単一のバンドを検
出した（図１５）。内因性ＡＣＬＰの類似の移動性およびインビトロで転写およ
び翻訳されたタンパク質は、本発明者らが、全長ｃＤＮＡクローンを単離したこ
とを示す。
【０２１０】 ＡＣＬＰの亜細胞性局在化を評価するために、本発明者らは、Ｃ末端にｃ−ｍ
ｙｃエピトープを有するマウスＡＣＬＰ発現構築物を作製した。ｍｙｃエピトー
プをＣ末端に配置し、それによって、これは、シグナルペプチド−媒介性プロセ
スを妨害しない。この構築物を、ＲＡＳＭＣおよびＡ７ｒ５細胞に一過性にトラ
ンスフェクトし、そして抗ｃ−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を用いて免疫染色を行った。
ＲＡＳＭＣおよびＡ７ｒ５細胞（図１６ＡおよびＣ）は、共に、強い膜結合性染
色または細胞質染色を示した。染色は、核周囲領域で最も強く、そして核では観
察されなかった（図１６ＢおよびＤ）。
【０２１１】 マウスＡＣＬＰの組織発現−−ＡＣＬＰｃＤＮＡを大動脈平滑筋細胞から本来
クローン化したが、本発明者らはまた、他の組織におけるそのｍＲＮＡおよびタ
ンパク質発現を調べたかった。期待されるように、ＡＣＬＰ ｍＲＮＡのレベル
は全大動脈において高かった（外膜を含む）において高かった（図１７）。また
、ＡＣＬＰメッセージは、結腸および腎臓を含む他の組織に存在した（図１７）
。ＡＣＬＰの発現を試験するために、本発明者らは、ウェスタンブロット分析の
ために、マウス組織の抽出を行った。ＡＣＬＰはマウス大動脈（外膜を除く）に
おいて大量に発現されたが、外膜、心臓、肝臓、骨格筋、または腎臓においては
発現されなかった（図１８）。腎臓におけるＡＣＬＰ ｍＲＮＡの存在（図１７
）（しかしタンパク質は存在しない）は、翻訳制御を示することが出来る。成体
においてＡＣＬＰを発現する細胞型を同定するために、本発明者らは、成体ラッ
ト大動脈および骨格筋においてインサイチュハイブリダイゼーションを行った。
アンチセンスリボプローブは大動脈の平滑筋細胞において特異的なＡＣＬＰ発現
を検出し（図１９Ａ）、一方、コントロールのセンスプローブは検出しなかった
（図１９Ｂ）。期待されるように、センスまたはアンチセンスのいずれのプロー
ブも、骨格筋細胞にハイブリダイズしなかった（図１９ＣおよびＤ）。
【０２１２】 培養平滑筋細胞におけるＡＣＬＰ発現−−ＡＣＬＰ発現は大動脈の分化平滑筋
細胞において高い（図１６Ｂ）ので、本発明者らは、ＡＣＬＰ発現におけるＶＳ
ＭＣ増殖および分化の効果を試験した。ＭＡＳＭＣを、静止を誘導する培地を含
有する０．４％ウシ血清において、３日間培養した。次いで、ＲＮＡおよびタン
パク質抽出物を細胞から調製し、そして分析した。ＡＣＬＰ ｍＲＮＡは、成長
しているコントロールよりも、血清飢餓ＭＡＳＭＣにおいてより大量（約２倍）
であった（図２０）。ＲＡＳＭＣにおいて、ＡＣＬＰ ｍＲＮＡは、活性に増殖
している対称物よりも、静止細胞において約３倍多かった（図２０）。ＡＣＬＰ
をまた、静止ＭＡＳＭＣにおいて評価した（図２１）。メッセージおよびタンパ
ク質レベルにおけるこれらの変化はささやかであるが、それらは他のシステムに
おいて観察されたＶＳＭＣ分化特異的マーカーにおける増加と一致する（２４、
２５）。
【０２１３】 平滑筋細胞分化におけるＡＣＬＰ発現−−本発明者らの研究室は、Ｍｏｎｃ−
１細胞、神経堤由来のマウス株、からの平滑筋細胞の分化のためのインビトロシ
ステムを、最近開発した（９）。Ｍｏｎｃ−１細胞は、ヒヨコ胚抽出物で補充し
た培地を分化培地に置き換えた場合、平滑筋細胞に分化する（９）。平滑筋への
未分化Ｍｏｎｃ−１細胞の変換の間のＡＣＬＰ発現を試験するために、本発明者
らは、ＡＣＬＰ発現の時間経過を測定した。ＡＣＬＰ ｍＲＮＡは、未分化Ｍｏ
ｎｃ−１細胞において、ほとんど検出不可能であった（図２２）。しかし、細胞
が分化した場合、ＡＣＬＰ発現は、分化の開始後、４日目および６日目でマーク
されるようになるまで、増加した（図２２）。これらの条件下で、ＡＣＬＰの誘
導は、平滑筋細胞のマーカー、平滑筋−アクチンのものよりも遅れるようであっ
た。同様に処理した細胞におけるＡＣＬＰのレベルを比較するために、本発明者
らは、未分化のＭｏｎｃ−１細胞および６日間分化を許可された細胞からのタン
パク質抽出物を調製した（図２３）。ＡＣＬＰは未分化のＭｏｎｃ−１細胞（０
日目）において検出されなかったが、平滑筋細胞へのＭｏｎｃ−１細胞の分化を
促進する条件下で高度に発現された（６日目）。これらの細胞におけるＡＣＬＰ
の量は、ＭＡＳＭＣにおけるものと同様であった。
【０２１４】 この実施例は、ヒト大動脈平滑筋細胞（ＡＣＬＰと称される）およびそのマウ
スホモログからの新規のｃＮＤＡのクローニングを記載する。タンパク質の顕著
な特徴には、Ｎ末端での推定シグナルペプチド配列、リジン−リッチおよびプロ
リン−リッチの１１−アミノ酸反復、ジスコイジン様ドメイン、および大型Ｃ末
端カルボキシペプチダーゼ様ドメインが含まれる（図１３）。
【０２１５】 ＡＣＬＰの同定に導くスクリーニングを、Ｅ２Ａタンパク質の結合パターンを
同定するために行った。Ｅ２Ａ遺伝子の産物、Ｅ１２およびＥ４７は、いくつか
の細胞型における成長および分化を制御する組織特異的転写因子のためのヘテロ
二量体化パートナーとして作用する。Ｅ２Ａ遺伝子産物は遍在的に発現される（
２６）が、血管平滑筋特異的ヘテロ二量体化パートナーまたは転写因子は同定さ
れていない。本発明者らは、標識化Ｅ４７タンパク質プローブを使用することに
よって、ヒトＡＣＬＰのＣ末端部分（アミノ酸７９３〜１１５８）をクローン化
し、そしてインビトロアッセイによって、Ｅ４７への結合を確認した（データは
示さず）。しかし、全長のＡＣＬＰは、その推定シグナルペプチド配列（図１２
および１３）および非核亜細胞性局在化（図１６）のために、おそらく、インビ
ボにおいて、Ｅ４７のヘテロ二量体化パートナーとして機能しない。
【０２１６】 ＧｅｎＢａｎｋＴＭ研究者は、ヒトＡＣＬＰのＣ末端と、Ｈｅらによって記載
されるマウスＡＥＢＰ１との間の高い相同性を示した（１２）。ＡＣＬＰとＡＥ
ＢＰ１との間の関係を決定するために、本発明者らは、マウスＡＣＬＰ ｃＤＮ
Ａをクローン化した。配列比較によって、ＡＥＢＰ１はＡＣＬＰのメチオニン４
１０で始まり、マウスＡＣＬＰと同一であることが見い出された（図１２）。次
いで、本発明者らは、ＡＣＬＰがマウスにおいて単一コピー遺伝子であることを
決定し、そしてゲノムＤＮＡからＡＥＢＰ１の５’末端に対応する領域をクロー
ン化した。２ ゲノムのクローンの分析により、ＡＥＢＰ１配列が、同定された
ＡＴＧに対して１１塩基５’のＧ残基を欠失していることを確認した。 ＡＣＬ
ＰにおけるこのＧ残基の存在は、Ｈｅら（１２）によって提唱されたインフレー
ムストップコドンを排除し、そしてオープンリーディングフレームを拡張する。
【０２１７】 ２．５ｋｂのＡＥＢＰ１ ｃＤＮＡは、本物のタンパク質をコードするようで
ある。ＡＥＢＰ１、ならびにＡＣＬＰの５’および３’末端由来のプローブは、
単一の約４ｋｂ（これは、ヒトおよびマウスのＡＣＬＰクローン化ｃＤＮＡのサ
イズと一致する）のバンドを、ノーザンブロット分析によって検出した。ＡＥＢ
Ｐ１ ｃＤＮＡは推定ポリアデニル化シグナルおよびポリ（Ａ）テールを含むの
で、ＡＥＢＰ１ ｃＤＮＡとｍＲＮＡとの間の差異は、約１．５ｋｂである。こ
の１．５ｋｂ配列の欠失は、ＡＣＬＰ ｃＤＮＡの５’末端に存在する。また、
これらの研究のために作製された抗ＡＣＬＰ抗体を、ＡＥＢＰ１と同一である、
ＡＣＬＰのＣ末端から作製した。この抗体は、ウェスタンブロットによって、試
験したいくつかの組織において、約１７５ｋＤａ（これは、インビトロで転写お
よび翻訳されたＡＣＬＰ の移動性と一致する（図１４および１５））の単一バ
ンドのみを検出した（図１８）。本発明者らはまた、３Ｔ３−Ｌ１プレ肥満細胞
を含む、培養におけるいくつかの細胞株由来のタンパク質抽出物において、同一
の移動性の単一バンドを検出した。ＡＣＬＰは、３Ｔ３−Ｌ１プレ肥満細胞にお
いて、ＭＡＳＭＣまたは分化Ｍｏｎｃ−１細胞においてよりも実質的に低いレベ
ルで、発現した（データ示さず）。従って、ＡＥＰＢ１は、マウスＡＣＬＰの短
縮型クローンであるようである。ＡＥＢＰ１は、 ＡＣＬＰシグナルペプチド、
反復ドメイン、およびジスコイジンドメインの部分を欠失する。
【０２１８】 ＡＣＬＰは、そのＣ末端に、約５００アミノ酸の突出カルボキシペプチダー
ゼ様ドメインを有する（図１３）。このドメインは、カルボキシペプチダーゼＥ
と３９％同一である。しかし、この高い配列類似性にもかかわらず、本発明者ら
３およびその他（２７）は、このＡＣＬＰのドメインが任意の触媒性カルボキシ
ペプチダーゼ活性を有することを示すことが不可能であった。これらの結果は、
カルボキシペプチダーゼファミリーの配列からのＡＣＬＰにおける特異的残基の
相違を反映することが出来る（２７）。例えば、カルボキシペプチダーゼにおけ
る亜鉛結合に関与するヒスチジンは、ヒトＡＣＬＰにおいてアスパラギン（アミ
ノ酸７６３）に置換される。カルボキシペプチダーゼにおける、触媒的に重要な
チロシンおよびグルタミン酸残基は、ヒトＡＣＬＰにおいて、それぞれ、アスパ
ラギン（アミノ酸８５２）およびチロシン（アミノ酸８７４）に置換される。ま
た、基質のＣ末端カルボキシル基を安定化させるカルボキシペプチダーゼの基質
認識ポケットにおける、正に帯電したアルギニン残基は、ヒトＡＣＬＰにおいて
負に帯電したグルタミン酸残基（アミノ酸残基７００）に置換される。触媒的に
不活性であるが、ＡＣＬＰは、３２Ｐ−標識化タンパク質プローブでスクリーニ
ングした発現ライブラリーからのＡＣＬＰ ｃＤＮＡの本発明者らによる最初の
単離によって証明されるように、このカルボキシペプチダーゼ様ドメインを介し
て、他のタンパク質と相互作用することが出来る。カルボキシペプチダーゼＥは
また、分泌経路における分類性レセプターとして作用し（２８）、このことは、
カルボキシペプチダーゼドメインの触媒性以外の機能を意味する。
【０２１９】 ＡＣＬＰにおける第二の重要なモチーフは、凝血因子である第Ｖ因子および第
ＶＩＩＩ因子（２９〜３１）、乳脂肪小滴膜タンパク質（３２、３３）、ジスコ
イジンドメインチロシンキナーゼレセプター（３４）、内皮細胞タンパク質ｄｅ
ｌ−１（３５）、およびＡ５／ニューロピリンタンパク質（３６〜３８）におい
て同定されている、ジスコイジン様ドメインである（図１３）。ジスコイジンは
、粘菌Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍによって産生される
レクチンであり、そしてフィブロネクチンが脊椎動物において行うような機能に
よって、細胞凝集および移動を用意にすると考えられている（３９）。ＡＣＬＰ
およびジスコイジン様ドメインを含有する他のタンパク質は、ジスコイジンおよ
びフィブロネクチンの両方の機能に重要なＲＧＤモチーフを欠如する（４０）。
ジスコイジン様ドメインは、細胞−細胞認識に重要であり得、そしてそれはホモ
型およびヘテロ型の相互作用によって媒介される細胞移動に関与することが出来
る（３６、３９）。ジスコイジンドメインチロシンキナーゼレセプターは、コラ
ーゲンによって活性化されるが、この相互作用に関与するレセプタードメインは
同定されていない（４１、４２）。ジスコイジン様ドメインはまた、リン脂質に
結合することが出来る（３３、４３）。 ＡＣＬＰが推定膜貫通−スパニングド
メインを欠如する（図１２）ように、ジスコイジン様ドメインは、細胞膜とのＡ
ＣＬＰの相互作用を媒介することが出来る。
【０２２０】 ＡＣＬＰは神経堤細胞において発現されないが、Ｍｏｎｃ−１の平滑筋細胞へ
の分化の間、顕著に誘導される（図２２および２３）。Ｍｏｎｃ−１分化の間の
ＡＣＬＰのこの誘導は、インビボでのＶＳＭＣにおけるＡＣＬＰの優先的な発現
（図１７および１８）に関連して、ＶＳＭＣ系統の発達にＡＣＬＰ発現を関連付
ける。さらに、分化ＡＣＬＰ表現型を与える培養培地によるＡＣＬＰの誘導（図
２２および２１）は、この細胞型の分化におけるＡＣＬＰの役割をさらに示唆す
る。
【０２２１】 使用した略語は：ＶＳＭＣ、血管平滑筋細胞；ＡＣＬＰ、大動脈カルボキシペ
プチダーゼ様タンパク質；ＲＡＳＭＣ、ラット大動脈平滑筋細胞；ＭＡＳＭＣ、
マウス大動脈平滑筋細胞；ＨＡＳＭＣ、ヒト大動脈平滑筋細胞；ｂｐ、塩基対（
単数および複数）；ｋｂ、キロベース；ＡＥＢＰ１、肥満細胞エンハンサー−結
合タンパク質１；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応、である。
【０２２２】
【表３】
【表４】 全ての上記で引用された参考文献および刊行物は、本明細書中に参考として援
用される。
【０２２３】等価物 当業者は、日常的な実験またはそれ以下のもののみを使用して、本明細書中に
記載される具体的な方法および試薬に対する多数の等価物を認識または確かめる
ことができる。このような等価物は、本発明の範囲内にあることが理解され、そ
して請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 未分化神経堤Ｍｏｎｃ−１細胞を示す図
【図２】 平滑筋細胞分化培地（ＳＭＤＭ）における４日間のインキュベーション後の、
Ｍｏｎｃ−１細胞の平滑筋細胞への分化後の形態学的変化を示す図
【図３】 外因的に添加された活性ＴＧＦ−β１が、平滑筋細胞分化に効力を有すること
を示す図
【図４】 Ｍｏｎｃ−１細胞から平滑筋およびニューロン系への分化後の平滑筋マーカー
のｍＲＮＡ分析を示す図
【図５】 分化したＭｏｎｃ−１細胞における、平滑筋ミオシン重鎖アイソフォームＳＭ
１の発現を示す図
【図６】 分化したＭｏｎｃ−１細胞における、平滑筋ミオシン重鎖アイソフォームＳＭ
１の発現を示す図
【図７】 分化後のＳＭ２２αプロモーターの誘導を示す図
【図８】 未分化Ｍｏｎｃ−１細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＳＭＤＭ中で８日間インキ
ュベートした細胞（分化）からの核抽出物における、ＳＭ２２αプロモーターの
ＣＡｒＧエレメントを用いた電気泳動移動シフト分析を示す図
【図９】 １５３塩基対フラグメントＷ０１１とラットＬＴＢＰ−１との間の核酸配列相
同性を示す図
【図１０】 増殖ラット大動脈平滑筋細胞（ＲａＳＭＣ）（レーン１）およびコンフルエン
トなＲａＳＭＣ（レーン２）から単離されたＲＮＡのノーザンブロットを示す図
【図１１】 未分化Ｍｏｎｃ−１細胞（レーン１）、ＳＭＤＭ中で３時間（レーン２）、１
１時間（レーン３）、２４時間（レーン４）、および１２０時間（レーン５）培
養されたＭｏｎｃ−１細胞、およびニューロンの分化培地中で２４時間（レーン
６）および９６時間（レーン７）培養されたＭｏｎｃ−１細胞、から単離された
ＲＮＡのノーザンブロットを示す図
【図１２】 ヒトおよびマウスのＡＣＬＰの推定アミノ酸配列を示す図
【図１３】 ヒトＡＣＬＰの模式図
【図１４】 マウスＡＣＬＰのインビトロ転写および翻訳、ならびにＡＣＬＰの同定を示す
図
【図１５】 マウスＡＣＬＰのインビトロ転写および翻訳、ならびにＡＣＬＰの同定を示す
図
【図１６】 マウスＡＣＬＰの細胞性局在化を示す図
【図１７】 マウス組織における、ＡＣＬＰ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を示す図
【図１８】 マウス組織における、ＡＣＬＰ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を示す図
【図１９】 インサイチュハイブリダイゼーションによる大動脈におけるＡＣＬＰ ｍＲＮ
Ａの検出を示す図
【図２０】 血清飢餓大動脈平滑筋細胞における、ＡＣＬＰ ｍＲＮＡおよびタンパク質の
レベルの増加を示す図
【図２１】 血清飢餓大動脈平滑筋細胞における、ＡＣＬＰ ｍＲＮＡおよびタンパク質の
レベルの増加を示す図
【図２２】 Ｍｏｎｃ−１細胞が平滑筋細胞に分化する場合のＡＣＬＰ ｍＲＮＡおよびタ
ンパク質の誘導を示す図
【図２３】 Ｍｏｎｃ−１細胞が平滑筋細胞に分化する場合のＡＣＬＰ ｍＲＮＡおよびタ
ンパク質の誘導を示す図
【図２４】 特定のディファレンシャルディスプレイした遺伝子の発現パターンを示すゲル
の図
【図２５】 特定のディファレンシャルディスプレイした遺伝子の発現パターンを示すゲル
の図
【図２６】 ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ−１、およびデコリンの発現パターンを示す図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／０９６，６８５ (32)優先日 平成10年８月14日(1998．8．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ジェイン，ムーケッシュ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02165 ウェスト ニュートン グラント ストリート 15 (72)発明者 ワタナベ，マサフミ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02146 ブルックリン ポンド アヴェニ ュー 99

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＳＭ２２α遺伝子発現が誘導される条件下で、神経堤細胞を
    培養する工程を有してなる、血管平滑筋細胞の分化を刺激する方法。
  2. 【請求項２】 前記神経堤細胞が不死化細胞であることを特徴とする請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記神経堤細胞が平滑筋細胞分化培地中で培養されることを
    特徴とする請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記平滑筋細胞分化培地が、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリ
    ン（１００ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、およ
    び２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）で補充された、表１に列挙される培地成
    分を含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記不死化神経堤細胞が、完全培地中で最初に培養されるこ
    とを特徴とする請求項３記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記完全培地が、ヒヨコ胚抽出物で補充されたＬ−１５ Ｃ
    Ｏ２−ベースの培地を含むことを特徴とする請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 （ｉ）神経堤細胞が平滑筋細胞に分化し始めるのに十分な時
    間、ＳＭ２２α遺伝子発現が誘導される培養条件下で、該神経堤細胞を培養する
    工程；および （ｉｉ）該培養条件下で上方制御または下方制御される遺伝子を同定する工程、
    を有してなる、平滑筋細胞の増殖または移動を制御する遺伝子を同定する方法。
  8. 【請求項８】 前記上方制御または下方制御される遺伝子を同定する工程が
    、非平滑筋細胞由来のｍＲＮＡを有する培養細胞からのｍＲＮＡのディファレン
    シャルディスプレイを含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記培養条件下で上方制御または下方制御される１つ以上の
    遺伝子がクローン化されることを特徴とする請求項７記載の方法。
  10. 【請求項１０】 （ａ）ＳＭ２２α遺伝子の発現が、神経堤細胞が平滑筋細
    胞に分化し始めるのに十分な時間誘導される培養条件で、神経堤細胞を培養する
    ことを含む、血管平滑筋細胞の分化を刺激する工程； （ｂ）該細胞を試験因子と接触させる工程；および （ｃ）該試験因子が神経堤細胞の平滑筋細胞への分化を阻害する能力について、
    測定する工程、 を有してなる、平滑筋細胞の増殖または移動を制御する調節因子を同定する方法
    。
  11. 【請求項１１】 前記神経堤細胞の平滑筋細胞への分化を阻害する前記因子
    の能力を、平滑筋細胞マーカーの存在または非存在を検出することによって測定
    することを特徴とする請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 （ｉ）神経堤細胞の平滑筋細胞への分化の間に上方制御ま
    たは下方制御される遺伝子産物を同定する工程；および （ｉｉ）該遺伝子産物の活性を阻害または増強する因子を同定する工程、 を有してなる、平滑筋細胞の増殖または移動を調節する因子を同定する方法。
  13. 【請求項１３】 前記遺伝子産物が、潜伏ＴＧＦβ結合タンパク質、インテ
    グリン−連結キナーゼ、大動脈カルボキシペプチダーゼ、Ｔｏｒｓｉｎ、ｃｃｔ
    ζ、プロチモシン、Ｌｉｍｋ２、Ｃｃａ（コンフルエント３Ｙ１細胞結合型）、
    インターフェロン活性化タンパク質、インターネキシン、カスパーゼ、ＡＨＮＡ
    Ｋ、デスモイオキン、ＴＳＣ−３６（ＴＧＦ誘導性タンパク質）、トランスコバ
    ラミン、ｆｏｓ−関連抗原、精巣上体分泌性タンパク質Ｅ１前駆体（ＨＥ１）、
    ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、
    およびデコリン、からなる群から選択されることを特徴とする請求項１２記載の
    方法。
  14. 【請求項１４】 （ｉ）神経堤細胞の平滑筋細胞への分化の間に上方制御さ
    れる、平滑筋細胞の増殖および／または移動に必要な生物学的活性を有する遺伝
    子産物を同定する工程；および （ｉｉ）該遺伝子産物の該生物学的活性を阻害する因子を同定する工程、 を有してなる、平滑筋細胞の増殖および／または移動を阻害する因子を同定する
    方法。
  15. 【請求項１５】 （ｉ）潜伏ＴＧＦβ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）の生物学
    的活性を変化させる因子を同定する工程、および （ｉｉ）該因子が平滑筋細胞の増殖および／または移動を調節する能力について
    、評価する工程、 を有してなる、平滑筋細胞の増殖および／または移動を調節する因子を同定する
    方法。
  16. 【請求項１６】 前記因子が、ＬＴＢＰのＴＧＦβ複合体との相互作用を阻
    害するものであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記因子が、ＬＴＢＰのタンパク質分解性切断を阻害する
    ものであることを特徴とする請求項１４記載の方法。
  18. 【請求項１８】 （ｉ）インテグリン連結キナーゼのキナーゼ活性を阻害す
    る因子を同定する工程、および （ｉｉ）該因子が平滑筋細胞の増殖および／または移動を調節する能力について
    、評価する工程、 を有してなる、平滑筋細胞の増殖および／または移動を調節する因子を同定する
    方法。
  19. 【請求項１９】 前記因子が、インテグリンサブユニットのリン酸化を阻害
    するものであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
  20. 【請求項２０】 （ｉ）ＬＥＦ−１／β−カテニンシグナル伝達経路の活性
    化を阻害する因子を同定する工程、および （ｉｉ）該因子が平滑筋細胞の増殖および／または移動を調節する能力について
    、評価する工程、 を有してなる、平滑筋細胞の増殖および／または移動を調節する因子を同定する
    方法。
  21. 【請求項２１】 平滑筋細胞の増殖および／または移動を調節することが出
    来るものとして同定された１つ以上の因子を含む、薬学的調節物を処方する工程
    をさらに含むことを特徴とする請求項１０、１２、１４、１５、１８、または２
    ０のいずれか１項記載の方法。
  22. 【請求項２２】 平滑筋細胞と、請求項１０、１２、１４、１５、１８、ま
    たは２０のいずれか１項記載の方法によって平滑筋細胞の増殖および／または移
    動を調節することが出来るものとして同定された因子とを、接触させる工程を有
    してなる、平滑筋細胞の増殖および／または移動を調節する方法。
  23. 【請求項２３】 前記平滑筋細胞が、インビトロで前記因子と接触されるこ
    とを特徴とする請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記因子が、平滑筋細胞の所望でない増殖を処置または予
    防するために、動物に投与されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記因子が、再狭窄を処置または予防するために動物に投
    与されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記因子が、動脈硬化症を処置または予防するために動物
    に投与されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記因子が、血管形成または他の脈管外傷に続く拡張した
    管腔容量を維持するために動物に投与されることを特徴とする請求項２４記載の
    方法。
  28. 【請求項２８】 動物において、平滑筋細胞の所望でない増殖を処置または
    予防する方法であって、 （ｉ）神経堤細胞の平滑筋細胞への分化の間に上方制御される遺伝子産物の生物
    学的活性を阻害する因子、または該遺伝子産物の発現を阻害する因子、を同定す
    る工程であって、該遺伝子産物が、平滑筋細胞の増殖および／または移動に必要
    な生物学的活性を有する、工程；および （ｉｉ）平滑筋細胞の所望でない増殖を阻害するのに有効な該因子の量を、その
    必要性のある動物に投与する工程、 を有してなる方法。
  29. 【請求項２９】 動物における平滑筋細胞の、異常な、病理学的、または不
    適切な増殖を処置または予防する方法であって、 （ｉ）神経堤細胞の平滑筋細胞への分化の間に上方制御される遺伝子産物を同定
    する工程であって、該遺伝子産物が、平滑筋細胞の増殖および／または移動に必
    要な生物学的活性を有する、工程； （ｉｉ）平滑筋細胞の増殖を阻害するように、該遺伝子産物の生物学的活性を阻
    害する因子または該遺伝子産物の発現を阻害する因子を同定する工程；および、 （ｉｉｉ）平滑筋細胞の所望でない増殖を阻害するのに有効な該因子の量を、そ
    の必要性のある動物に投与する工程、 を有してなる方法。
  30. 【請求項３０】 （ｉ）神経堤細胞の平滑筋細胞への分化の間に上方制御さ
    れる、平滑筋細胞の増殖および／または移動に必要な生物学的活性を有する遺伝
    子産物の生物学的活性を阻害する因子を同定する工程：および （ｉｉ）該因子またはそのアナログが平滑筋細胞の増殖および／または移動を調
    節する能力について、評価する工程、 を有してなる、平滑筋細胞の増殖を阻害する因子を同定する方法。
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