KR20000029120A - 에피솜-복제 벡터, 이의 제법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 하나 이상의 스캐폴드/매트릭스 결합 영역(S/MAR) 및 하나 이상의 바이러스 또는 진핵세포 복제원(ORI)을 포함하는 안정한 에피솜-복제 벡터; 이를 포함하는 세포; 이의 제조 방법; 및 특히 약제 또는 진단제로서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

에피솜-복제 벡터, 이의 제법 및 이의 용도{Episomally replicating vector, its preparation and use}
본 발명은 하나 이상의 스캐폴드/매트릭스 결합 영역(S/MAR: Scaffold/ Matrix Attached Region) 및 하나 이상의 바이러스 또는 진핵생물의 복제원(ORI: origin of replication)을 포함하는 안정한 에피솜-복제 벡터, 이를 포함하는 세포, 이를 제조하는 방법, 및 특히 약제 및 진단제로서의 이의 용도에 관한 것이다.
현재, 벡터가 연구 및 치료 분야에 널리 사용되고 있다. 이와 관련하여, 벡터는 특히 진핵- 및 원핵 세포 또는 세포 시스템을 형질감염시키거나 형질전환시키는데 사용되며, 이들내에서, 효과인자가, 예를 들면 약제학적/의학적으로 관련있는 단백질 또는 펩티드는 물론 벡터 그 자체를 복제하는데 필요한 단백질을 암호화하는 작용을 하도록 한다. 일반적으로, 효과인자는 숙주 세포내에서 대사적 또는 치료적 특성의 특정 효과를 유발하는 물질을 의미하는 것으로 이해된다. 통상의 효과인자는 단백질 또는 펩티드, 리보자임 또는 안티센스 RNA를 암호화하는 핵산, 또는 안티센스 DNA이다.
벡터는 유전자 치료에 있어 특히 중요하다. 유전자 치료의 기본적인 목적은 핵산을 세포내로 도입하여 효과인자 유전자를 발현시키는 것이다. 유전자 치료에 있어 세가지 기본적인 문제, 즉 a) 유전자의 도입(유전자 전달), b) 유전자의 유지(유전자 유지), 및 c) 유전자의 발현(유전자 발현)의 문제가 있다. 이와 관련하여, 유전자의 유지 그 자체와 이에 따른 유전자의 안정되고 지속적인 발현이 성공적인 유전자의 치료의 기본적인 조건이지만, 이는 현재까지 매우 만족스럽게 해결되고 있지 않다. 따라서, 이를 위한 선결조건은 적당한 벡터의 사용이다. 이와 관련하여, 유전자 치료에서 생체내 및 시험관내 방법은 원칙적으로 구별된다. 시험관내 방법의 경우, 세포를 체내로부터 제거하여 벡터로 생체외 감염시킨 후 동일한 또는 다른 체내로 다시 도입시킨다. 생체내 유전자 치료의 경우, 벡터를, 예를 들면 혈류를 통해 전신적으로 투여한다. 그러나, 유전자 치료 벡터가 조직내, 예를 들면 혈관의 감염 부위내에 국소적으로 적용되는 국소적 적용도 가능하다[참조: WO 95/27070]
따라서, 선별된 사례에서 치료적 유전자의 국소적 적용의 경우, 예를 들면 각종 방법이, 혈관벽내로 물질 또는 유전자의 직접적인 투여를 가능케하고자 하는 변형된 발룬(balloon) 카테테르를 기초로 하여 개발되었다. 이중 발룬(double balloon) 카테테르[Nabel, E.G. et al.(1990) Science, 249, 1285]를 사용한 국소 투여 후, 리포좀 및 레트로바이러스 형질감염에 의해 형질감염된 돼지의 대퇴 동맥 세포내서의 β-갈락토시다제 유전자의 일시적 발현을 검출할 수 있었다.
벡터는 특히 조직-특이적 발현의 최적화에 사용되며, 이는 만성 질환 및 유전성 질환, 예를 들면 당뇨병, 혈우병, ADA, 근이영양증, 가족성 과콜레스테롤혈증 또는 루마티즘 치료에 사용될 뿐만 아니라 급성 질환, 예를 들면 혈관 장애- 동맥경화증 또는 이의 속발증(협착증, 재협착증, 심장경색), 및 종양의 치료에 사용될 수 있다. 최종적으로, 유전자의 발현 및 특히 이에 따른 치료적 단백질 및 펩티드[이는 병리학적 또는 유전적 변형 때문에 표적 유기체(예: 인슐린) 또는 혈관세포(예: 인자 VII)에 적당한 양으로 존재하지 않거나 더이상 존재하지 않는다]의 세포내 형성이 조직-지시된 유전자 전달에 의해 일어날 수 있다.
따라서, 체세포 유전자 치료의 본질적 목표는, 치료적 유전자를 전신적 또는 국소적 투여 후 체내의 표적 세포내로 특이적으로 편입시켜 이들 세포에서 치료적 유전자를 발현시키면서도, 표적 세포 또는 면역 반응의 형질전환을 유도하지 않는 것이다.
현재까지, 이를 위한 두 부류의 벡터가 있다: a) 에피솜-복제 벡터와 b) DNA로 통합되는 벡터간에 구별이 있어야 하는 바이러스 벡터, 및 c) 안정한 형질감염이 무작위적 삽입(통합)에 의해 달성되거나 d) (일시적) 단지 잠시적인 형질감염이 존재하는 비(non)-바이러스 벡터. 통합 벡터를 사용한 방법에서 숙주 게놈으로의 무작위적 통합은, 통합 지점에 따라, 삽입 돌연변이 유발, 및 삽입된 유전자의 판독 및 발현이 일어나지 않는 소위 "사이렌싱(silencing)" 둘다를 유도할 수 있다. 일시적 발현 벡터는 이의 수명면에서 시간적 제한을 받으며, 안정하지 않고, 어떤 경우 통합되기도 하며, 때때로 숙주 세포를 형질전환시킬 수도 있다. 그러나, 이들의 가장 중요한 단점은 이들의 단명성과 관련된 제한된 발현 때문에, 종종 이들을 반복적으로 사용하여야 하는 점이다. 따라서, 이들 벡터는 본원에서 요구되는 효과, 재생산성 및 안전성 면에서 상당한 문제를 야기할 수 있다.
바이러스성 에피솜-복제 벡터 그룹은 숙주 게놈내로 통합되지 않고 숙주 세포내에 자가 복제형으로 보유되기 때문에, 상기와 같은 단점이 없다. '에피솜-복제'란 용어는, 벡터가 숙주 세포의 게놈내로 통합되지 않으면서, 병존하여, 세포 사이클중에 복제되고, 이러한 과정 동안에 벡터 복사체가, 세포 분열의 전 및 후에 존재하는 복사체의 수에 따라, 생성되는 세포내에 통계학적으로 분포하게 된다는 것을 의미한다. 플라스미드 벡터, 예를 들면 연구, 및 변형에 의한 기타 응용 목적에 적합한 pGFP-C1 벡터(Clontech UK Ltd)는 바이러스 벡터로부터 유래된 것이다. 현재, 바이러스 기원으로부터 유래되고, 몇몇 진핵세포내에서 에피솜 형태로 복제되는 소수의 벡터, 예를 들면 SV40, BPV 또는 EBV 벡터가 공지되어 있다. 그러나, 이들 벡터의 복제원은 바이러스상에 암호화된 하나 이상의 트랜스-작용(trans-acting) 인자와의 상호작용을 필요로 한다. 또한, 이들 인자는 벡터의 안정성을 위해 필수적이지만, 이는 종종 숙주 세포의 불멸화 및 형질전환을 유발하거나, 또는 체내의 면연 반응을 유도한다[Ascenzioni et al. (1997) Cancer Letters 118, 135-142]
따라서, 진핵세포 바이러스 SV40(원숭이 바이러스)는 원숭이 세포 및 일부 포유동물 세포 또는 세포주에서 에피솜 형태로 복제된다. 이 경우에, 바이러스는 숙주 세포내에서 생존하기 위하여 소위 "대형 T 항원"을 필요로 한다. "대형 T 항원"의 기능은 세포내에서 바이러스가 복제하는데 있어 매우 중요하다. "대형 T 항원"은 특히 복제원 영역내의 바이러스 DNA에 결합하여, 그곳에서 복제를 개시한다[Mohr et al. (1987) EMBO J. 6, 153-160]. 그러나, 바이러스에게 중요한 이들 활성을 가짐은 물론, "대형 T 항원"은 세포의 기능에 영향을 끼친다. 이는 특히 세포 사이클의 조절에 관여하는 단백질(사이클린, 투불린, cdc2)에 결합한다. 따라서, SV40에 의한 감염 또는 SV40 "대형 T 항원"을 암호화하는 유전자를 수반하는 벡터에 의한 형질감염은 1차 세포의 불멸화를 유발하고 동물에서 종양의 형성을 유도한다[Fried, M.(1965) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 486-491; Eckhart, W. (1969) Virology, 38, 120-125; Di Mayorca et al. (1969) Virology, 830, 126-133].
WO 98/27200에는, 숙주 게놈내로 통합되지 않으면서 사람 세포내에서 에피솜 형태로 복제되는 환상 벡터내에 클로닝된 사람 또는 포유동물의 복제원을 포함하는 작제물이 기술되어 있다. 문헌[Cossons N. et al. (1997) J. Cell. Biochem. 67, 439-450]에는, 매트릭스 결합 영역(MAR) 및 환상 벡터내에 클로닝된 상이한 포유동물의 복제원을 포함하는 벡터가 기술되어 있다. 그러나, 에피솜 복제는 단지 선택적 항생제(G418)에 의한 선택압에 의해 유지될 수 있고, 이 경우에도 단지 제한된 효율로 존재한다. 사실, 세대당 안정성은 선택압하에서 단지 80%이다. 따라서, 에피솜-복제 벡터의 안정한 유지가 관찰되지 않는다. G418과 같은 선택적 항생제를 사용하는 경우 조직 배양 실험중에 적어도 제한된 유지가 가능하다면, 사용된 항생제의 높은 독성 때문에 생체내 동물 또는 사람 유전자 치료에 적용될 수 없다.
따라서, 전반적으로 이미 공지된 벡터는 상당한 단점이 있으며, 특히 포유동물내로의 유전자 전달에 있어 적합성이 매우 제한된다. 따라서, 본 발명의 목적은, 트랜스-작용성 바이러스 인자 또는 바이러스 단백질의 발현에 의존적이지 않으면서, 안정하게 에피솜 형태로 복제되는 바이러스 벡터의 장점을 가짐으로써, 실질적으로, 어떠한 유형의 세포 형질전환 또는 면역 반응을 일으키지 않고 종래의 기술에 비해 개선된 유전자의 유지를 달성하는 벡터를 개발하는 것이다.
도 1은 예시적 태양으로서 본 발명의 벡터상에 존재하는 개략화된 영역을 지닌 벡터를 도시한다.
도 2는 pGFP-C1 벡터를 도시한다.
도 3은 본원에서 pEP I-1로 명명된 본 발명에 따른 벡터의 특정 태양을 도시한다.
도 4는 플라스미드 pTZ-E20을 도시한다.
따라서, 본 발명은, 하나 이상의 스캐폴드/매트릭스 결합 영역(S/MAR) 및 하나 이상의 바이러스 또는 진핵세포 복제원(ORI)을 포함하는, 안정한 에피솜-복제 벡터에 관한 것이다.
스캐폴드/매트릭스 결합 영역은, 진핵세포 염색체중의 크로마틴을 연속적 도메인으로, 특히 위상학상 연결된 소위 고리(loop) 도메인으로 세분할 수 있는 핵산의 서열을 의미하는 것으로 이해되므로, 특히 진핵세포 염색체의 구조 및 기능에 있어 매우 중요하다[Luderus, M.E. et al. (1994) Binding of matrix attachment regions to lamin polymers involves single-stranded regions and the minor groove, Mol. Cell Biol., 14, 6297-6305]. 이들 고리 도메인은 실질적으로, 소위 "도메인"내에 유전자의 조정된 발현에 필요한 모든 시스-조절성 요소를 포함한다. 도메인은 핵 매트릭스 또는 핵 구조(스캐폴드)상에 특이적으로 축적되는 서열에 의해 한정된다. 이들 서열은 S/MAR로 칭해지며, 통상 길이가 수백 염기쌍에 달하고, 아데노신 및 티미딘이 풍부하다(70%). 비록 클로닝된 SAR 및 MAR 요소가 공통적인 구조적 특성을 갖을 지라도, 현재까지 어떠한 공통(consensus) 서열도 동정되지 않았다[Boulikas, T. (1993) J. Cell. Biochem. 42, 14-22]. S/MAR 요소는 게놈 통합 후 이종성 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다[Klehr, D. et al. (1991) Biochem. 30, 1264-1270]. S/MAR은 DNA의 위상학적 코일링에 중요한 것으로 여겨진다[Bode, J. et al., (1992) Science 2555, 195-197]. S/MAR 요소는, 한편으로는 핵 매트릭스에 생체내 결합된 DNA의 특성을 분석하거나, 또는 다른 한편으로는 DNA-부존재 핵 매트릭스에 생체내 결합될 수 있는 DNA 단편의 특성을 분석함으로써 분리되고 동정될 수 있다[Lewin, B. (1994) Genes V, Oxford University Press, 776-778; Mielke et al. (1990) Biochem. 29, 7475-7485]. 동정 및 특성분석의 예는 문헌[Bode J. et al., (1995) (Scaffold Martrix Attachment Regions(S/MAR): Structural properties creating transcriptionally active loci, Int. Rev. Cytol. 162A, 389ff., Academic Press, Orlando) and Bode J. et al. (1992; supra)]에서 발견된다. 이러한 사실 및 당업자의 통상의 지식을 이용하여 적당한 분리가 가능하다.
"복제원"의 발현은 진핵세포 또는 원핵세포 및 바이러스의 일반적인 개시점 또는 복제원을 의미하는 것으로 이해된다. 이들 ORI가 복제를 유지시키고, 각종 복제인자에 대한 결합지점을 형성한다.
동물 세포로부터의 ORI 서열의 분리 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면 문헌[DePamphilis, M.L. (1993) Annu. Rev. Biochem. 62, 29-63]에 기술되어 있다. 전형적인 방법에는, 예를 들면 "초기 쇄 추출법"[Kaufmann, G. et al(1985) Mol. Cell. Biol., 5, 721-727] 또는 "항십자형 면역친화성 정제"[Bell, D. et al. (1991) Biochem. Biophys. Acta, 1089, 299-308]이 있다.
결론적으로, 단지 하나 이상의 S/MAR 요소가 하나 이상의 진핵세포 또는 바이러스 ORI에 연결된 벡터가, 한편으로는 종래의 기술[Wegner et al. (1989) Nucleic Acids Research 17, 9909-9932]에 따르면 통상적으로 게놈내로 통합될 것으로 기대되었으나, 그렇지 않고, 다른 한편으로는 이를 복제함에 있어 트랜스-작용 인자(바이러스 기원)에 의존하지 않으면서 안정하게 에피솜 형태로 복제된다는 것은 매우 놀라운 일이다. 또한, 놀랍게도, 본 발명에 따른 벡터가 안정하고, 약 100 세대에 걸친 항생제에 의한 선택 없이도 보유될 수 있다는 것이 입증되었기 때문에, 이는 유전자 치료, 연구 및 기타 모든 종류의 응용 분야에 있어 유익한 벡터이다. 본 발명에서, 안정한 에피솜 복제란, 형질감염된 세포가 30 세대 이상, 바람직하게는 50 세대 이상, 더 바람직하게는 80 세대 이상, 100 세대 이상 또는 200 세대 이상에 걸쳐 선택압의 적용 없이 보유되는 것을 의미한다. 벡터가 서던 블롯 분석에 의해 검출될 수 있고/있거나, 선택압(예: G418)을 재차 가한 후 조직 배양중에 단지 소수의 세포만이 사멸하는 경우, 당해 벡터는 성공적으로 보유되는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명에 따른 벡터는, 한편으로는 무작위적 통합에 따른 문제가 발생하지 않는 장점을 갖는다. 다른 한편으로는, 안정한 에피솜 복제의 결과로서, 장기간-지속적인 작용이 달성될 수 있으므로, 반복적인 치료가 불필요하다, 즉 형질전환된 세포내에서의 유전자 보유의 문제(유전자 유지)가 실질적으로 해결된다. 다른 경우, 다수의 불멸화된 세포의 숙주 게놈내에 이미 존재하는 서열로 이루어진 트랜스-작용 인자(바이러스 기원)가 없으면, 바이러스 단백질에 의한 숙주 세포의 형질전환 또는 면역화, 또는 면역반응의 유도를 걱정할 필요가 없다. 또한, 발현 시스템은 배타적으로 염색체 요소를 기초로 한다. 따라서, 본 발명에 따른 벡터는 필요한 효율, 재생산성 및 안전성을 제공한다.
일반적으로 벡터 성분은 기능상 모두 함게 작용하므로, 숙주 게놈내로 통합되는 벡터, 또는 복제를 위해 ORI에 가해질 세포에 대해 외인성인 복제 인자 없이도, S/MAR은 안정한 에피솜 복제를 가능케 한다. 이 정도로, S/MAR은 복제 인자를 대체하거나, 내생적 복제 인자의 활성을 제공한다. S/MAR에 의한 ORI의 확장은 적어도 플라스미드에서의 이의 기능성을 보장한다.
특히, 본 발명에 따른 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 발현 발터는 숙주 세포내에서 매우 상이한 유형의 유전자를 발현시킬 수 있다는 장점을 갖는다. 발현 벡터는, 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 벡터내의 유전자가 숙주-특이적 유전자-조절 서열하에 있는 벡터를 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명의 의미내에서, 이들은 유전자의 (에피솜) 발현에 적합한 벡터이고, 또한, 상응하는 유전자 서열은 전사를 위한 프로모터, 오퍼레이터 및 터미네이터 서열, 및 해독을 위한 리보좀 결합 부위의 서열을 추가로 포함한다. 선형 발현 벡터가 진핵세포 및 원핵세포 모두에서 다양한 유전자의 시험관내 발현, 또는 유전자 치료에 매우 적합하다.
또한, 본 발명에 따른 벡터는, 트랜스로 작용하는 복제 인자를 암호화하는 특정 핵산을 포함하지 않는다는 점에서 구분된다. 상기한 바와 같이, 특히 벡터상에 암호화된 정보의 복제에 필요한 바이러스 ORI를 포함하는 종래의 기술로부터 이미 공지된 벡터내에서 통상적으로 트랜스-작용을 하는 인자는 단점이 있다. 따라서, 이러한 태양의 특별한 이점은, 이들 복제 인자가 특히, 트랜스 작용을 나타내며 동시에, 예를 들면 숙주 세포내의 변화를 초래하는 것에서는 필수적인 것은 아니라는 점이다.
본 발명의 의미내에서 발현 복제 인자는, 벡터의 복제에 필요한 인자, 즉 예를 들면 ORI에 결합하고 핵산의 이본쇄화를 초래하는 인자를 의미하는 것으로 일반적으로 이해된다. 이러한 복제 인자는 단백질 및 펩티드 둘다 일 수 있다. 이와 관련하여 언급된 트랜스 작용이란 용어는 본 발명의 의미내에서 광범위하게 해석될 수 있다. 트랜스 작용은 이를 암호화하는 이의 서열의 비교적 근접한 환경에서 즉시 지시되지 않는 복제 인자의 임의의 작용이다. 본 발명의 의미내에서 복제 인자의 예는 SV40 대형 T 항원, 트랜스-작용 인자, 예를 들면 EBV 벡터로부터의 EBNA1 및 BPV 벡터의 E1 및 E2이다.
또 다른 태양에서, 벡터는, 트랜스로 작용하거나 하지 않거나 완전히 무관하게, 복제 인자- 특히 바이러스 기원의 것-을 암호화하는 특정 핵산을 포함하지 않는다. 본원의 경우, 바이러스 복제 인자에 대한 기능상의 의존성이 더 이상 없고 형질전환의 위험도 또한 잘 배제되기 때문에, 상기의 경우가 가능하다.
바이러스 단백질을 암호화하는 특정 서열을 전혀 포함하지 않는 벡터가 특히 바람직하다. 이러한 태양의 이점은, 어떠한 바이러스 단백질도 더 이상 전혀 발현되지 않으므로, 그밖의 경우 종종 발생하는 면역 반응의 유도가 완전히 억제된다는 점이며, 이러한 장점 때문에 이러한 태양이 치료에 매우 특히 적합하다. 동시에 복제 인자이자 트랜스로 작용하는 바이러스 단백질의 예로는 SV40 바이러스의 "대형 T 항원"으로 공지되어 있으며, 이는 종양-유도 또는 불멸화 작용을 하는것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명은 "복제원(ORI)"이 진핵 세포의 증식에 사용되는 벡터에 관한 것이며, 이는 바이러스 ORI, 예를 들면 EBV-ORI, BPV-ORI 또는 특히 SV40-ORI의 그룹중에서 선택된다. 진핵세포내의 증식이, 특히 치료적 적용으로 사용되고 응용분야에서의 연구 목적으로 사용된다.
ORI가 원핵세포에서 증식시키는데 사용되는 본 발명에 따른 벡터, 바람직하게는 pUC-ORI도 역시 본 발명에 속한다. 이러한 방법중에 구비된 벡터는, 원핵세포내에서 벡터를 복제하는데 이용될 수 있으므로, 비교적 간단하게 고수율로 복제될 수 있다는 장점을 갖는다.
벡터의 특히 바람직한 태양에서, 진핵세포에서의 증식을 위한 하나 이상의 "복제원" 및 원핵세포에서의 증식을 위한 하나 이상의 복제원, 바람직하게는 진핵세포에서의 증식을 위한 적어도 하나의 복제원 및 원핵세포에서의 증식을 위한 적어도 하나의 복제원이 포함될 것이다. 이러한 태양의 이점은, 한편으로는 벡터가 원핵세포내에서 용이하게 복제될 수 있으며, 다른 한편으로는 동일한 벡터가 진핵세포에서 안정하게 유지될 수 있다는 점이다.
본 발명에 따른 벡터는 S/MAR이 포유동물로부터 기원하는 것이고, 바람직하게는 사람 기원의 것이다. 이에 따른 이러한 태양의 이점은, 특히 유전자 치료의 도중에 진핵세포내에서 특히 양호하게 증식시킬 수 있다는 점이다. 이러한 점에서 특히 바람직한 S/MAR은, 플라스미드 pTZ-E20[Bode et al. (1992) supra; Fig 4]로부터의 2.0kb EcoRI/BglII 단편으로서 분리된 사람 기원의 인터페론 β유전자의 5'영역으로부터 선택된다.
또한, 에피솜-복제 벡터는 항생제 내성을 매개하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함한다. 이들은 특히 벡터로 처리한 세포의 형질감염 또는 형질전환이 성공적인지를 알아보기 위한 선별 및 대조를 위해 사용된다. 이러한 경우에, 카나마이신, 게네티신, 겐타마이신, 앰피실린, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 스펙티노마이신, 날리딕스산, 리팜피신, 클로로앰패니콜 및/또는 제오신 중에서 선택된 항생제에 대한 내성을 매개하는 유전자가 특히 바람직한데, 이는 당업자에게 공지된 이들 항생제가 선별에 적합하기 때문이며, 당업자의 전문 지식을 토대로 이들에 임의의 다른 것들을 가할 수 있다.
벡터의 특히 바람직한 태양은 SV40 ORI, 및 플라스미드 pTZ-E20[Bode et al. (1992) supra; Fig 4]로부터의 2.0kb EcoRI/BglII 단편으로서 분리된 인터페론 β유전자의 5'영역으로부터의 스캐폴드/매트릭스 결합 영역 서열을 포함한다. pUC ORI와 같은 원핵세포 ORI, 특히 카나마이신에 대한 내성을 매개하는 유전자, 및 각종 효과인자가 부가될 수 있다. 상기한 각종 영역의 삽입에 의해 변형되어 본 발명에 따른 벡터를 생성시킬 수 있는 적당한 출발 벡터는 pGFP-C1 벡터(제조원: Clontech UK Ltd)(도 2 참조)이다.
또 다른 예에서, 본 발명에 따른 벡터는 하나 이상의 프로모터 또는 활성인자 서열 및/또는 하나 이상의 효과인자를 포함한다는 점에서 구분된다.
프로모터는 통상적으로 판독될 서열의 5'에 존재하고, 유전자의 전사 속도를 조절한다. 유전자 활성을 각각 증가시키거나 감소시키는 활성인자 및 억제인자 서열사이에는 차이가 있다. "인핸서"는 활성인자 중의 하나로 여겨지며, 통상적으로 프로모터의 5' 또는 3'로부터 멀리 떨어진 곳에 위치하며, 예를 들면 사람 시토메갈로바이러스(EP 0 173 177), CMV 급-초기(immediate-early) 폴리펩티드(Pos. 216-809/Genbank Accession No.: K03104)로부터 위치-무관한 방법으로 전사 활성을 증가시킬 수 있다는 점에서 다른 조절 요소와 상이하다.
또한, 본원에서 바람직한 활성인자 서열 및 프로모터의 특정 그룹은 구성적(constitutive), 세포 사이클-특이적, 조직-특이적, 대사-조절적 및/또는 유도성 프로모터 또는 활성인자 서열이다. 전반적으로, 이들은 선택에 따라, 세포의 환경에 적당한 이점을 가지므로, 세포의 특정한 대사 상태 또는 치료적 필요성이 고려될 수 있고, 복제 또는 발현이 외부 인자에 의해 조절될 수 있다.
바람직한 효과인자는 단백질, 펩티드, 리보자임 또는 안티센스 RNA 중에서 선택된 특정 물질을 암호화하거나, 또는 안티센스 DNA이다. 본원에서 펩티드는 단백질의 일부, 또는 천연 또는 합성형의 아미노산 서열를 의미하는 것으로 이해된다. 이들 효과인자의 기능은 극히 다양하며, 특정한 치료적 필요성에 맞춰 조절될 수 있다, 광범위하게 다양한 문헌에서, 다수의 이러한 예는, 특히 치료적 단백질로서 공지된, 구입가능한 암호 서열이다. 본원의 경우 이와 관련하여 단백질, 또는 이들 단백질을 암호화하는 유전자가 치료학적으로 사용될 수 있는 몇몇 예: 일산화질소 신타제[참조: WO 95/27020], 인슐린[EP-B 100 01 929], 에리트로포이에틴(참조: EP-B1-0 148 605], 또는 인자 VII와 같은 혈액 응고 인자, 인테페론, 사이토킨, 호르몬, 성장인자 등이 언급될 수 있지만, 본 발명에 따른 벡터의 이용 가능성이 이에 제한되지 아니하거나, 이러한 목록이 전부를 의도하는 것은 아니다. 벡터에 사용되는 적합한 효과인자의 선택은 당업자의 지식에 따른다.
또 다른 본 발명의 대상은 상기한 하나 이상의 벡터를 포함하는 하나 이상의 세포이다. 따라서, 벡터의 보관 또는 증식을 위해 이미 세포내에 포함되어 있는 본 발명의 태양이 특히 기술되어 있다. 본원에서 특히 바람직한 것은 진핵- 또는 원핵세포, 특히 박테리아, 효모, 곤충류, 양서류, 어류 또는 포유류 세포이다. 이러한 경우에, 이는 예를 들면 발현이 외래 DNA의 미세주입 후 발생하는 어류 세포의 경우도 또한 공지되어 있다[Winkler et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 226, 129-140]. 유전자이식된(transgenic) 어류도 마찬가지로 생산될 수 있다[WO 96/03034; WO 96/32087; WO 98/15627].
특히 유전자 치료에서, 사람 기원의 비-불멸화된 세포가 바람직하다. 이와 관련하여 "비-불멸화된"이란 용어는, 세포의 게놈이 형질전환되지 않고, 즉 그 스스로 복제할 수는 없으나, 천연 세포 사이클에 따르게 되므로, 종양 세포와는 대조적으로, 이의 수명이 제한되며, 단지 제한된 체제내에서 복제될 수 있는 것을 의미하는 것으로 이해된다[Alberts et al., Molecular Biology of the Cell: Cancer (1995) 3rd Ed.].
본 발명의 또 다른 태양은, 본 발명에 따른 벡터 및/또는 이로부터 생성된 핵산을 포함하고, 예를 들면 유전자이식된 동물을 생성시킬 수 있는 유전자이식된, 바람직하게는 배아의 간(stem) 세포 뿐만 아니라, 동물의 일부 또는 모든 세포가 본 발명에 따른 벡터, 이로부터 생성된 핵산 및/또는, 적당한 경우, 발현 생성물 또는 유전자를 포함하는 유전자이식된 동물 그 자체이다[WO 90/03432, WO 95/06716, EP 0 169 672, DE 196 32 532, WO 96/3034; WO 96/32087; WO 98/15627].
또한, 본 발명의 또 다른 대상은, 하나 이상의 스캐폴드/매트릭스 결합 영역이 하나 이상의 ORI와 조합된 본 발명에 따른 벡터의 제조 방법이다. 가장 익히 공지된 제조 방법은 플라스미드 또는 기타 핵산으로부터 소정 영역을 분리하고, 벡터, 플라스미드 또는 기타 핵산내로 제한 엔도뉴클리아제(제한 효소)의 도움없이 삽입 또는 연결시키는 것이다.
당해 방법의 특별한 양상은 본래의 벡터내의 복제 인자를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 하나 이상의 S/MAR 영역으로 대체하는데에 있다. 이는 상기 영역을 제한 효소로 절제하고, 당업자에게 공지된 방법으로 벡터내로 S/MAR 단편을 삽입함으로써 수행된다.
본 방법의 또 다른 태양은 하나 이상의 ORI 및/또는 항생제 내성을 매개하는 유전자를 추가로 삽입하는 것으로 이루어진다. 또한, 이는 바람직하게는 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 효과인자를 벡터내로 삽입시키기 위한 많은 응용 분야에서 필요하고, 유용하다. 본원에서는 이미 설명된 기술을 이용한다.
본 발명에 따른 벡터 또는 세포에 대한 수 많은 적용으로는, 예를 들면 물질, 특히 약제학적으로 활성인 화합물의 전달, 특별히 유전자 전달이 있다. 유전자 전달은, 예를 들면 혈관 및/또는 기관 장애의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다. 본원에서 유전자 치료가 특히 중요하다. 이 경우에, 벡터내로 통합된 유전자가 표적 세포에서, 예를 들면 발현 벡터의 작용에 의해 발현된다. 이는 특히 약제학적 및 의학적으로 관련있는 단백질을 암호화하는 유전자에 적용된다. 특히, 본 발명에 따른 에피솜-복제 벡터의 사용은 치료학적 면에서 부작용 없으며, 유전자 치료에서 "왕복(shuttle) 벡터"으로서 특히 바람직하게 사용된다. "왕복 벡터"는 두 개 이상의 상이한 세포 유형, 또는 유기체에서 증식될 수 있는 벡터, 예를 들면 우선 원핵세포에서 증식되거나 복제될 수 있고, 이후 진핵세포를 형질감염시킬 수 있는 벡터를 의미하는 것으로 이해된다.
하나 이상의 유전자의 시험관내 발현은, 본 발명에 따른 벡터 또는 이의 세포의 사용시, 마찬가지로 중요하다. 따라서, 본 벡터를 사용함으로써 유전자를 강력하게 발현시킬 수 있으므로, 예를 들면 진핵 및 원핵세포 모두의 각종 세포 및 세포 시스템에서, 선택압하에서 세포를 계속적으로 공급(이는 단백질의 수율에 악영향을 주고 공정 비용을 증가시킨다)하지 않으면서도, 단백질 및 펩티드를 다량으로 제조할 수 있다. 본 벡터를 사용하므로써, 단백질 또는 펩티드를 암호화하고, 현재까지 특히 감수성 세포 시스템에서 어려움 없이 발현시키는 것이 불가능하였던 유전자를 발현시키는 것도 또한 가능하다.
또한, 본 발명의 또 다른 면은 세포를 형질감염시키는데 있어서의 본 발명에 따른 벡터의 용도이다. 형질감염은 세포내에 벡터를 포함시키는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 한편으로는, 유전자 치료에 필요한 형질감염 단계를 의미할 뿐만 아니라, 예를 들면 벡터의 증식을 위한 원핵세포의 형질전환을 의미한다.
다른 경우, 또한 본 발명은 유전자이식된 동물 또는 간 세포, 예를 들면 배아성 간 세포를 생산하는데 있어서의 본 발명에 따른 벡터의 용도를 포함하는데, 이는 이들 벡터가 특히 진핵세포에서 사용시, 및 연구 목적으로 사용시 적합하기 때문이다. 유전자이식된 동물은 세포내에 본 발명에 따른 벡터, 및 경우에 따라 이에 의해 증식된 효과인자가 존재하는 동물을 의미하는 것으로 이해된다. 유전자이식된 간 세포는 본 발명에 따른 벡터를 사용하여 형질감염된 세포를 의미하는 것으로 이해되며, 이로부터 예를 들면 유전자이식된 동물이 생산되거나 성장될 수 있다. 예가 문헌[WO 96/03034, WO 96/32087, WO 98/15627, WO 90/03432, WO 95/06716, EP 169 672 및 DE 19 632 532]에 기술되어 있다.
또한, 이러한 경우에 본 발명은 또 다른 대상으로서 본 발명에 따른 하나 이상의 벡터 및/또는 이러한 벡터를 포함하는 세포, 및 적당한 첨가제 및/또는 보조제를 포함하는 조성물을 포함한다.
적당한 첨가제 및 보조제는, 특히 보조약, 안정화제 및/또는 형질감염-촉진 물질을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 벡터와 조합되거나 관련이 있는 형질감염 벡터를 포함하는 형질감염 시스템, 및 형질감염 또는 달리 형질전환을 용이하게 하거나 또는 심지어 이를 가능케 하는 이의 세포내로의 투입도 포함된다. 보조제는 특히 PMSF와 같은 일반적인 프로테아제 억제제 및 EDTA와 같은 뉴클리아제 억제제를 의미하는 것으로 이해된다.
바람직한 형질전환 벡터는, 예를 들면 바이러스 또는 비-바이러스 벡터이다. 또한, 벡터와 함께 기타 비-바이러스성 형질감염-촉진 물질, 예를 들면 지질, 중합체, 펩티드 또는 포르피린을 형질감염에 사용할 수 있다.
유전자 치료 벡터는 본 발명에 따른 벡터를 리포좀(중성 또는 양성)과 복합체를 형성하도록 함으로써 수득될 수 있다. 따라서, 벡터는 리포좀내에 실질적으로 포함될 것이므로, 매우 높은 형질전환 효율을 갖으며[참조: WO 95/27070], DNAses로부터 실질적으로 보호된다. 소위 HVJ 리포좀(비로좀: virosome)의 형태로 센다이(Sendai) 바이러스를 이용한 핵산-리포좀 복합체로의 형질감염이, 이에 의해 형질감염 속도가 더욱 증가될 수 있기 때문에, 특히 유리하다.
리포펙션(lipofection) 도중에, 단층의 소낭이 리포좀 현탁액의 초음파 처리에 의해 양이온성 지질로부터 생성된다. 당해 벡터는 리포좀의 표면에, 정확하게는 예를 들면 순 양전하가 유지되고 벡터의 100%가 리포좀과 복합체를 형성하는 비율로, 이온력에 의해 결합된다. 문헌[Felgner, P.L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7414)에서 사용된 지질 혼합물 DOTMA(1,2-디올레일옥시프로필-3-트리메틸암모륨 브로마이드) 및 DOPE(디올레일포스파티딜에탄올아민) 외에, 지금까지 수 많은 지질 제형물이 합성되었고, 각종 세포의 형질감염에 대한 이들의 효능에 대해 시험하였다. 새로운 지질 제형물의 예는 DOTAP 또는 DOGS이다. 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 콜레스테롤로부터의 DNA-리포좀 복합체의 제조예 및 센다이 바이러스를 사용한 혈관 벽의 형질감염에서의 성공적인 사용이 문헌[WO 95/27070]에 기술되어 있다.
벡터-리포좀 복합체가 핵산-결합 단백질, 예를 들면 염색체 단백질, 바람직하게는 HMG 단백질(고 이동성 그룹 단백질), 특히 HMG1 또는 HMG2, 또는 뉴클레오솜 히스톤, 예를 들면 H2A, H2B 또는 H3 또는 H4를 포함하는 경우가 특히 유익한데, 이는 이러한 수단에 의해 벡터중에 통합된 유전자의 발현이 증가될 수 있기 때문이다. 염색체 단백질은, 예를 들면 일반적으로 공지된 방법에 따라 송아지 흉선 또는 래트 간으로부터 분리될 수 있거나, 또는 유전자 조작에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 사람의 HMG1은 사람의 cDNA 서열을 사용하여 당업자에게 공지된 방법으로 특히 용이하게 재조합될 수 있다[Wenn, L. et al. (1989) Nucleic Acid Research 17(3), 1197-1214].
막 침투를 증가시키는 히스티딘-함유 폴리펩티드도 또한 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 벡터와 함께 목적하는 효과인자를 포함하는 소위 폴리펙션(polyfection) 용액, 조직-특이적 펩티드 및 DNA-형성 부분, 예를 들면 양전하의 도메인으로부터 제조된 융합 단백질, 및 막 투과를 증가시키는 펩티드가 바람직하게 사용된다. 또한, 예를 들면 활성화된 지질 성분에 도입된 C-말단 시스테인에 의한 리포좀에의 벡터의 커플링이 공지되어 있다.
본 발명의 또 다른 대상은 하나 이상의 스캐폴드/매트릭스 결합 영역 및 하나 이상의 바이러스 또는 진핵세포 복제원을 갖는 에피솜-복제 벡터 및/또는 하나 이상의 이들 벡터-함유 세포, 및 경우에 따라 적당한 첨가제 또는 보조제(상기 참조)를 포함하는 약제 또는 진단제이다.
본 발명의 또 다른 태양은, 예를 들면 형질감염 시스템의 형태로, 하나 이상의 벡터 및/또는 이들 벡터를 포함하는 세포 및 예를 들면 세포의 형질감염을 위한 또 다른 물질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원에서는 상기한 폴리펙션 용액이 특히 바람직하다.
하기의 도면 및 실시예는 본 발명을 제한하지 않으면서 본 발명을 상세히 기술한다:
도 1은 예시적 태양으로서 본 발명의 벡터상에 존재하는 개략화된 영역을 지닌 벡터를 도시한다.
특히 바림직한 태양으로, 하기의 서열 요소가 발견되었다: 진핵세포에서의 증식을 위한 SV40 ORI(135 염기쌍), 이.콜라이와 진핵세포 모두에서의 선별을 위한 카나마이신 내성 유전자(1399 염기쌍), 이.콜라이에서의 증식을 위한 pUC-플라스미드 ORI(643 염기쌍), 및 진핵세포에서의 증식을 위한 매트릭스 결합 영역(사람 인터페론 β유전자의 5' 영역으로부터 기원, 1984 염기쌍).
매트릭스 결합 영역과 특히 SV40 ORI와의 합동작용에 의한 상기 요소와 예를 들면 효과인자와의 상호작용시, 카나마이신 내성 유전자에 의해 형질감염이 점검될 수 있고 pUC-ORI를 통해 원핵세포에서 증식되므로, 적당한 양으로 제조될 수 있는 에피솜-복제 벡터가 생성된다.
도 2는 실시예 1 및 2에 따라 사용되는 pGFP-C1 벡터를 도시하며, 이는 제조원 Clontech에 의해 공급되고, 당해 실시예 및 바람직한 제조 방법에서 사용된다.
도 3은 본원에서 pEP I-1로 명명된 본 발명에 따른 벡터의 특정 태양을 도시하며, 이를 사용하여 실시예의 일부를 수행한다.
실시예 1에 따르면, 본원에서는 S/MAR은 도 2에 따른 벡터내로 통합되므로, 본 발명에 따른 벡터가 생성된다. 이는 (S/)MAR, 도 4에 따른 인터페론 β 유전자의 5' 영역으로부터의 플라스미드 pTZ-E20의 2.0kb EcoRI/BglII 단편, SV40 ORI, pUC ORI, HSV TK 폴리 A와 프로모터 pamp와 관련 있는 내성 유전자 Kan/Neo, "인핸서" pCMV, "SV40 초기 프로모터" pSV40 및 GFP/녹색 형광성 단백질을 포함한다.
도 4는 플라스미드 pTZ-E20을 도시한다.
서열 1은 사람 인터페론 β S/MAR의 핵산 서열을 도시한다.
실시예
실시예 1
바람직한 에피솜-복제 벡터의 제조
사람 인테페론 β 유전자의 5' 영역으로부터의 S/MAR 단편(서열 1)을, 2.0kb EcoRI/BglII 단편으로서 플라스미드 pTZ-E20[Bode, J. et al., loc. cit]으로부터 분리하여 폴리링커 PGFP-C1(도 2 참조)에 삽입시킨다. 이에 의해 pEPI-1으로 명명된 본 발명에 따른 벡터가 생성된다. 또 다른 실험에서, SV40 "대형 항원"을 암호화하는 유전자를 또 다른 바이러스/플라스미드 벡터로부터 절제해내고 S/MAR로 대체함으로써 본 발명에 따른 벡터가 수득된다.
실시예 2
진핵- 및 원핵 세포의 형질감염 및 선별
중국산 햄스터 난소(CHO) 세포를, 10% FCS, 앰포테리신 B 2.5㎍/ml 및 겐타마이신 50㎍/ml를 포함하는 Ham's F12 배지에서 배양한다. 3×106개의 CHO 세포를 전기천공시키고, 실시예 1에 따라 제조된 벡터 pEPI-1(도 3) 또는 pGFP-C1(도 2) 5㎍과 함께 배양한다. 전기천공하고 1일 후, 항생제 내성 때문에 생존하는 형질감염된 세포를 500㎍/ml의 G418로 선별한다. 2주 후, 안정한 클론을 분리하고, 250㎍/ml의 G418과 함께 배양한다. 이.콜라이 세포를 이용하여 유사한 방법을 사용한다.
실시예 3
재형질감염
실시예 2에 따른 형질감염된 CHO 세포로부터 수득된 HIRT 추출물[Hirt, B. (1967) J. Mol. Biol., 26, 365-369]을 사용하여 실시예 2의 방법에 따른 새로운 CHO 세포를 형질감염시킨다.
실시예 4
실시예 1 내지 3에 따른 세포의 조사 결과
DNA의 분리, 제한 효소를 사용한 분해, 블롯팅, 및 표지된 pEPI-1 프로브를 사용한 하이브리드화 실험 후, 벡터의 무작위적 통합이 실시예 2에서 일어나지 않았으며, 임의의 클론에서도 일치한다는 것이 밝혀졌다. pEPI-1의 경우에 본 발명에 따른 벡터는 염색체 DNA와 어떠한 하이브리드화도 보여주지 않는 한편, 실시예 2 및 실시예 3에 따른 세포로부터 수득된 HIRT 추출물은 본 발명에 따른 벡터와 동일한 제한효소 패턴을 지닌 분리된 DNA를 보여준다. CHO 세포에 분리된 에피솜 DNA를 형질전환시킴으로써, 이.콜라이에서와 마찬가지로 벡터(실시예 3 참조)를 검출할 수 있다. 이는 또 다른 유형의 AT-풍부 서열을 수반하는 고도로 증폭된 벡터에서, 머리-대-꼬리 통합이 일어난다는 당업계에 공지된 결과와 모순된다[Wegner et al., (1989) Nucleic Acid Research 17, 9909-9932]. 그러나, 단지 상응하는 ORI만을 또는 단지 S/MAR만을 수반하는 벡터는 숙주의 게놈내로 무작위적으로 통합된다[참조: Klehr et al. (1992) Biochemistry, 31, 3222-3229 and Schubeler et al. (1996) Biochemistry, 35, 11160-11169]. 따라서, 다른 경우 단지 ORI만을 수반하는 벡터의 통합이 일어나지 않을 것이기 때문에 CHO 세포가 T 항원을 전혀 발현하지 않는다는 것이 부수적으로 입증된다. 더욱이, 서던 분석의 결과로부터, 본 발명에 따른 벡터가 효율적으로, 염색체외적으로 안정하게 복제되며; 따라서, 이들은 에피솜 벡터이며, 각각의 클론내에 약 20개의 벡터 복사체가 존재한다는 것이 밝혀졌다.
실시예 5
안정성 및 발현 조사
플라스미드 안정성 및 네오마이신 내성 유전자의 발현을 조사하기 위하여, 실시예 2에 따른 형질감염된 CHO 세포를 실시예 2에 따른 배지, 단 G418를 가하지 않으므로 항생제에 의한 선택압이 없는 배지에서 2 개월 이상(100 세대 이상) 동안 배양한다.
전체 배양 기간중 상이한 시점에 배양된 G418 세포의 일부를 배지에 가하는 경우, 각 경우에 단지 극소수만이 사멸했다. 서던 분석으로 임의의 시점에 별도로 에피솜 벡터를 검출하는 것도 가능하다.
그러나, 이로부터, 한편으로는 벡터가 선별 없이도 100 세대에 걸쳐 CHO 세포에서 안정하고, 다른 한편으로는 카나마이신 내성, 및 효과인자의 형태로 벡터내에 삽입된 핵산 서열이 각 세대에서 발현된다는 결론을 얻을 수 있다.
실시예 6
사람 세포내에서의 벡터의 증식
HaCat 세포(사람 피부 케라티노사이트)를 10% FSC를 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 배양한다. HaCat 세포를, 실시예 2에 기술된 바와 동일한 조건하에 동일한 방법으로 실시예 1에 따라 제조된 벡터 pEPI-1으로 형질감염시키고 선별한다. 선별을 시작하여 4주 후, 안정한 클론을 분리하고 250㎍/ml의 G418과 함께 배양한다.
실시예 7
실시예 6에 따른 세포의 조사 결과
실시예 6에 따른 6개 클론의 DNA를 분리한다. 실시예 4에 기술된 바와 같은 서던 분석을 수행하고, 추가 실험에서 전체 벡터를 PCR로 증폭시킨다. 반대로 향하는 두 개의 프라이머를 Neo Gene(neo-fwd 및 neo-up)로부터 선택하면, 단지 환상 분자만이 증폭된다. 두 실험 모두로부터, 본 발명에 따른 벡터가 효율적으로, 염색체외적으로 안정하게 복제되며; 따라서, 이들은 에피솜 벡터이며, 각각의 클론내에 약 20개의 벡터 복사체가 존재한다는 것이 밝혀졌다. 네오마이신-카셋트가 효율적으로 발현된다.
본 발명에 따른 벡터가 증식될 수 있고 사람 세포에서도 마찬가지로 에피솜 형태로 발현될 수 있다는 결과가 밝혀졌다.
본 발명의 벡터는, 트랜스-작용성 바이러스 인자 또는 바이러스 단백질의 발현에 의존적이지 않으면서, 안정하게 에피솜 형태로 복제되므로, 어떠한 유형의 세포 형질전환 또는 면역 반응을 일으키지 않으며, 종래의 기술에 비해 개선된 유전자의 유지를 제공한다.

Claims (36)

  1. 하나 이상의 스캐폴드/매트릭스 결합 영역(S/MAR: scaffold/matrix attached region) 및 하나 이상의 바이러스 또는 진핵세포 복제원(ORI: origin of replication)을 포함하는 안정한 에피솜-복제 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 선택압의 적용이 없는 상태하에서, 30 세대 이상, 바람직하게는 50 세대 이상, 더욱 바람직하게는 80 세대 이상, 100 세대 이상 또는 200 세대 이상에 걸쳐 보유되는 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스(trans) 작용을 하는 복제 인자를 암호화하는 특정 핵산 서열을 포함하지 않는 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 인자를 암호화하는 특정 핵산 서열을 포함하지 않는 벡터.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 복제 인자가 바이러스 기원인 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 단백질을 암호화하는 특정 핵산 서열을 포함하지 않는 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적 ORI가 진핵세포내에서 증식시키기 위하여 사용되는 벡터.
  9. 제8항에 있어서, ORI가 EBV ORI, BPV ORI 또는 SV40 ORI를 포함한 바이러스 ORI로 이루어진 그룹중에서 선택되는 벡터.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, ORI가 원핵세포에서 증식시키기 위하여 사용되는 벡터.
  11. 제10항에 있어서, ORI가 pUC ORI인 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵세포 및 원핵세포에서 증식시키기 위한 하나 이상의 ORI, 바람직하게는 진핵세포에서 증식시키기 위한 하나 이상의 ORI 및 원핵세포에서 증식시키기 위한 하나 이상의 ORI를 포함하는 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, S/MAR가 포유동물, 바람직하게는 사람으로부터 기원하는 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, S/MAR가 인터페론 β 유전자의 5' 영역으로부터 기원하는, 특히 도 4에 따른 플라스미드 pTZ-E20의 2.0kb EcoRI/BglII 단편인 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제 내성을 매개하는 하나 이상의 유전자를 추가로 포함하는 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 언급된 유전자가 카나마이신, 게네티신, 겐타마이신, 앰피실린, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 스펙티노마이신, 날리딕산, 리팜피신, 클로르암페니콜 및/또는 제오신 중에서 선택된 항생제에 대한 내성을 매개하는 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 프로모터 또는 활성인자 서열 및/또는 하나 이상의 효과인자를 포함하는 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 프로모터 또는 활성인자가 구성적, 세포 사이클-특이적, 조직-특이적, 대사 조절적 및/또는 유도성 프로모터 또는 활성인자인 벡터.
  19. 제17항에 있어서, 효과인자가 단백질, 펩티드, 리보자임 또는 안티센스 RNA중에서 선택된 특정 물질을 암호화하거나, 또는 안티센스 DNA인 벡터.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산을 암호화하는 하나 이상의 핵산, 바람직하게는 일산화질소 신타제, 인슐린, 에리트로포이에틴, 혈액 응고 인자, 인테페론, 사이토킨, 호르몬 또는 성장 인자를 암호화하는 핵산중에서 선택되는 핵산을 포함하는 벡터.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  22. 제21항에 있어서, 진핵- 또는 원핵 세포, 특히 박테리아, 효모, 곤충류, 양서류, 어류 또는 포유류 세포.
  23. 제22항에 있어서, 사람 기원의 비-불멸화된 세포.
  24. 하나 이상의 S/MAR를 하나 이상의 ORI과 조합시킴을 특징으로 하여, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 벡터를 제조하는 방법.
  25. 벡터내의 복제 인자를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 하나 이상의 S/MAR로 대체함을 특징으로 하여, 제1항 내지 20항 중 어느 한 항의 벡터를 제조하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 하나 이상의 ORI 및/또는 항생제 내성을 매개하는 유전자가 벡터내에 삽입되는 방법
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 효과인자, 바람직하게는 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 효과인자가 벡터내로 삽입되는 방법.
  28. 유전자 치료에 있어서, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제21항 내지 23항 중 어느 한항의 세포의 용도.
  29. 하나 이상의 유전자의 시험관내 발현에 있어서, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제21항 내지 23항 중 어느 한항의 세포의 용도.
  30. 세포의 형질감염에 있어서, 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 벡터의 용도.
  31. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 벡터 및/또는 제21항 내지 23항 중 어느 한항의 세포 및 하나 이상의 적당한 첨가제를 포함하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 벡터에 결합되거나 벡터와 배합된 형질감염 시스템을 포함하는 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 형질감염 시스템이 바이러스 또는 비-바이러스 벡터인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 형질감염 시스템이 지질, 중합체, 펩티드 또는 포르피린중에서 선택되는 조성물.
  35. 하나 이상의 S/MAR 및 하나 이상의 바이러스 또는 진핵세포 ORI를 지닌 하나 이상의 에피솜-복제 벡터 및/또는 이들 벡터를 포함하는 하나 이상의 세포, 및 경우에 따라, 적당한 첨가제 및/또는 보조제를 포함하는 약제.
  36. 하나 이상의 S/MAR 및 하나 이상의 바이러스 또는 진핵세포 ORI를 지닌 하나 이상의 에피솜-복제 벡터 및/또는 이들 벡터를 포함하는 하나 이상의 세포, 및 경우에 따라, 적당한 첨가제 및/또는 보조제를 포함하는 진단제.
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