CN108913661A

CN108913661A - 一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法

Info

Publication number: CN108913661A
Application number: CN201810649688.4A
Authority: CN
Inventors: 安徽
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-06-22
Filing date: 2018-06-22
Publication date: 2018-11-30

Abstract

本发明公开了一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于，包括以下步骤：干细胞分离器将其中的造血干细胞分离出来，其余的血液又从另一根静脉留置针流回到人体的体内，在无菌室中，将干细胞分离器中的干细胞取出，使用浓度为0.1%的胶原酶Ⅱ处理，控制胶原酶Ⅱ的温度在人体生存的最适温度36℃‑37℃，胶原酶Ⅱ酶解造血干细胞之外的其他组织，本发明涉及造血干细胞技术领域。该人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，达到了减少研究操作步骤，从而减小干细胞在以往繁杂的操作总失活的现象，便于研究干细胞分化方向，观察干细胞时可实现万向调节视野，并且便于干细胞导入放射性同位素的目的。

Description

一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法

技术领域

本发明涉及造血干细胞技术领域，具体为一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法。

背景技术

造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。它是研究历史最长且最为深入的一类成体干细胞，对研究各类干细胞，包括肿瘤干细胞，具有重要指导意义。血液系统中的成熟细胞寿命极短，因此在人的一生中，造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下，造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。

大部分白血病，特别是急性髄系白血病(AML)以及慢性髄性白血病(CML)的发生，都直接或间接与造血干细胞异常相关。CML是最经典染色体易位导致造血干细胞恶变的一类常见白血病，其他多数急性髓系白血病由祖细胞直接恶变而来。造血干细胞最先获得染色体易位等主要的致病突变，但并不影响其分化为正常功能的成熟细胞的能力，当染色体易位的造血干细胞或者其分化下游的细胞获得第二次打击之后，就会引发白血病。造血干细胞在实体肿瘤微环境调节中也有一定作用，如前列腺肿瘤细胞会模拟造血干细胞的分子信号，进入造血微环境，并引起造血干细胞表达谱的改变迫使造血干细胞离开，也可以通过表达造血细胞迁移相关的分子离开造血微环境，最终导致肿瘤的转移。

目前在对人体的造血干细胞提取研究中，跟踪干细胞分化程度较为困难，不能清楚的呈现干细胞分化走向，不利于对人体干细胞的研究，同时在干细胞提取提纯过程中干细胞失活率大。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，解决了目前在对人体的造血干细胞提取研究中，跟踪干细胞分化程度较为困难，不能清楚的呈现干细胞分化走向，不利于对人体干细胞的研究，同时在干细胞提取提纯过程中干细胞失活率大。

（二）技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、挑选一定量的成年健康志愿者，对每个健康志愿者定时、定量注射动员剂；

步骤二、两根静脉留置针分别插入人体的血管中，两根静脉留置针之间连接有干细胞分离器，干细胞分离器将其中的造血干细胞分离出来，其余的血液又从另一根静脉留置针流回到志愿者的体内；

步骤三、在无菌室中，将干细胞分离器中的干细胞取出，使用浓度为0.1%的胶原酶Ⅱ处理，控制胶原酶Ⅱ的温度在人体生存的最适温度36℃-37℃，胶原酶Ⅱ酶解造血干细胞之外的其他组织；

步骤四、向酶解后的造血干细胞溶液中加入五倍体积的人体生理盐水，经过筛网初步过滤后，放入差速离心机中进一步过滤，得到高纯度造血干细胞液；

步骤五、通过吸取管吸取步骤四中高纯度造血干细胞液，高纯度造血干细胞液放入万向调节显微镜1的载物台上，对每个造血干细胞导入放射性同位素；

步骤六、将步骤五中导入放射性同位素的造血干细胞放入无血清基础培养基中，并在无血清培养基中添加无血清营养添加物，定期更换培养基，直至产生细胞簇；

步骤七、将步骤六中产生的细胞簇提取出放入万向调节显微镜1的载物台上，对标记的同位素进行追踪；

步骤八、将剩余未被放射性同位素标记的造血干细胞冷冻封存。

优选的，所述步骤三中胶原酶Ⅱ酶与造血干细胞液混合恒温箱中处理0.5-1.5h。

优选的，所述步骤六中无血清基础培养基的温度设置为37℃，且CO2的体积分数均为0.05。

优选的，所述万向调节显微镜包括配重底板，所述配重底板顶部的中间位置转动连接有载物台，所述配重底板顶部的左侧固定连接有支撑架，所述配重底板顶部且位于载物台的两侧均固定连接有支撑杆，所述支撑杆的顶部均转动连接有万向调节吸管。

优选的，所述支撑架靠近顶部的位置固定连接有连接块，所述连接块的顶部设置有目镜，所述连接块的底部且与载物台对应的位置设置有物镜。

优选的，所述载物台底端的轴心处固定连接有调节从动轮，所述配重底板顶部的中间位置转动连接有输出转轴，所述输出转轴靠近顶端的位置固定连接有调节主齿轮，所述调节主齿轮与输出转轴啮合连接。

优选的，所述输出转轴上远离调节主齿轮的一端固定连接有输出斜齿轮，所述配重底板内部的底端转动连接有传动转轴。

优选的，所述传动转轴的左右两端均固定连接有传动斜齿轮，所述输出斜齿轮与左侧的传动斜齿轮啮合连接。

优选的，所述配重底板右侧的内部转动连接有主动转轴，所述主动转轴位于配重底板内部的底端固定连接有主动斜齿轮，所述主动斜齿轮与右侧的传动斜齿轮啮合连接。

优选的，所述主动转轴远离主动斜齿轮的一端固定连接有手动调节旋钮。

（三）有益效果

本发明提供了一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法。具备以下有益效果：

（1）、该人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，通过在无菌室中，将干细胞分离器中的干细胞取出，使用浓度为0.1%的胶原酶Ⅱ处理，控制胶原酶Ⅱ的温度在人体生存的最适温度36℃-37℃，胶原酶Ⅱ酶解造血干细胞之外的其他组织，导入放射性同位素的造血干细胞放入无血清基础培养基中，并在无血清培养基中添加无血清营养添加物，定期更换培养基，直至产生细胞簇，跟踪放射性同位素在后代细胞簇中的位置，从而进行研究干细胞分化方向，达到了减少研究操作步骤，从而减小干细胞在以往繁杂的操作总失活的现象，便于研究干细胞分化方向的目的。

（2）、该人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，通过手动扭转手动调节旋钮,手动调节旋钮带动主动转轴转动，主动转轴通过斜齿轮啮合带动传动转轴转动，传动转轴带动输出转轴转动，输出转轴通过齿轮调节传动比，从而带动载物台转动，载物台发生细微转动，同时配重底板顶部且位于载物台的两侧均设置有万向调节吸管，达到了观察干细胞时可实现万向调节视野，并且便于干细胞导入放射性同位素的目的。

附图说明

图1为本发明结构的侧视图；

图2为本发明结构的正视图；

图3为本发明结构A处的示意图；

图4为本发明结构B处的示意图；

图中：1万向调节显微镜、101配重底板、102载物台、103支撑架、104连接块、105目镜、106物镜、107支撑杆、108万向调节吸管、109调节从动轮、110输出转轴、111调节主齿轮、112输出斜齿轮、113传动转轴、114传动斜齿轮、115主动转轴、116主动斜齿轮、117手动调节旋钮。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤五、通过吸取管吸取步骤四中高纯度造血干细胞液，高纯度造血干细胞液放入万向调节显微镜（1）的载物台上，对每个造血干细胞导入放射性同位素；

步骤七、将步骤六中产生的细胞簇提取出放入万向调节显微镜（1）的载物台上，对标记的同位素进行追踪；

步骤三中胶原酶Ⅱ酶与造血干细胞液混合恒温箱中处理0.5-1.5h。步骤六中无血清基础培养基的温度设置为37℃，且CO2的体积分数均为0.05。

万向调节显微镜1包括配重底板101，配重底板101顶部的中间位置转动连接有载物台102，配重底板101顶部的左侧固定连接有支撑架103，配重底板101顶部且位于载物台102的两侧均固定连接有支撑杆107，支撑杆107的顶部均转动连接有万向调节吸管108。支撑架103靠近顶部的位置固定连接有连接块104，连接块104的顶部设置有目镜105，连接块104的底部且与载物台102对应的位置设置有物镜106。载物台102底端的轴心处固定连接有调节从动轮109，配重底板101顶部的中间位置转动连接有输出转轴110，输出转轴110靠近顶端的位置固定连接有调节主齿轮111，调节主齿轮111与输出转轴110啮合连接。输出转轴110上远离调节主齿轮111的一端固定连接有输出斜齿轮112，配重底板101内部的底端转动连接有传动转轴113。传动转轴113的左右两端均固定连接有传动斜齿轮114，输出斜齿轮112与左侧的传动斜齿轮114啮合连接。配重底板101右侧的内部转动连接有主动转轴115，主动转轴115位于配重底板101内部的底端固定连接有主动斜齿轮116，主动斜齿轮116与右侧的传动斜齿轮114啮合连接。主动转轴115远离主动斜齿轮116的一端固定连接有手动调节旋钮117。

使用时，通过在无菌室中，将干细胞分离器中的干细胞取出，使用浓度为0.1%的胶原酶Ⅱ处理，控制胶原酶Ⅱ的温度在人体生存的最适温度36℃-37℃，胶原酶Ⅱ酶解造血干细胞之外的其他组织，导入放射性同位素的造血干细胞放入无血清基础培养基中，并在无血清培养基中添加无血清营养添加物，定期更换培养基，直至产生细胞簇，跟踪放射性同位素在后代细胞簇中的位置，从而进行研究干细胞分化方向，达到了减少研究操作步骤，从而减小干细胞在以往繁杂的操作总失活的现象，便于研究干细胞分化方向，手动扭转手动调节旋钮,手动调节旋钮带动主动转轴转动，主动转轴通过斜齿轮啮合带动传动转轴转动，传动转轴带动输出转轴转动，输出转轴通过齿轮调节传动比，从而带动载物台转动，载物台发生细微转动，同时配重底板顶部且位于载物台的两侧均设置有万向调节吸管，达到了观察干细胞时可实现万向调节视野，并且便于干细胞导入放射性同位素的目的。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下。由语句“包括一个......限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素”。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于：所述步骤三中胶原酶Ⅱ酶与造血干细胞液混合恒温箱中处理0.5-1.5h。

3.根据权利要求1所述的一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于：所述步骤六中无血清基础培养基的温度设置为37℃，且CO2的体积分数均为0.05。

4.根据权利要求1所述的一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于：所述万向调节显微镜（1）包括配重底板（101），所述配重底板（101）顶部的中间位置转动连接有载物台（102），所述配重底板（101）顶部的左侧固定连接有支撑架（103），所述配重底板（101）顶部且位于载物台（102）的两侧均固定连接有支撑杆（107），所述支撑杆（107）的顶部均转动连接有万向调节吸管（108）。

5.根据权利要求4所述的一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于：所述支撑架（103）靠近顶部的位置固定连接有连接块（104），所述连接块（104）的顶部设置有目镜（105），所述连接块（104）的底部且与载物台（102）对应的位置设置有物镜（106）。

6.根据权利要求4所述的一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于：所述载物台（102）底端的轴心处固定连接有调节从动轮（109），所述配重底板（101）顶部的中间位置转动连接有输出转轴（110），所述输出转轴（110）靠近顶端的位置固定连接有调节主齿轮（111），所述调节主齿轮（111）与输出转轴（110）啮合连接。

7.根据权利要求6所述的一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于：所述输出转轴（110）上远离调节主齿轮（111）的一端固定连接有输出斜齿轮（112），所述配重底板（101）内部的底端转动连接有传动转轴（113）。

8.根据权利要求7所述的一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于：所述传动转轴（113）的左右两端均固定连接有传动斜齿轮（114），所述输出斜齿轮（112）与左侧的传动斜齿轮（114）啮合连接。

9.根据权利要求7所述的一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于：所述配重底板（101）右侧的内部转动连接有主动转轴（115），所述主动转轴（115）位于配重底板（101）内部的底端固定连接有主动斜齿轮（116），所述主动斜齿轮（116）与右侧的传动斜齿轮（114）啮合连接。

10.根据权利要求9所述的一种人体研究用造血干细胞的制备和提取方法，其特征在于：所述主动转轴（115）远离主动斜齿轮（116）的一端固定连接有手动调节旋钮（117）。