CN104739865A - 一种制备胎盘造血干细胞制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备胎盘造血干细胞制剂的方法，该方法包括如下步骤：(1)用酶溶液消化胎盘组织，得到消化产物并去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；(2)将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，得到上层的有核细胞悬液；(3)将所述有核细胞悬液与冻存液混合；其中，所述酶溶液含有Ⅰ型胶原酶、DNA酶I、分散酶和透明质酸酶；所述冻存液中含有二甲基亚砜、羟乙基淀粉、人血白蛋白和右旋糖酐。通过上述技术方案，本发明能够在提高胎盘造血干细胞分离效率的同时，还能使冻存的胎盘造血干细胞在升温至常温后直接用于干细胞治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种制备胎盘造血干细胞制剂的方法。
背景技术
胎盘干细胞是来源于新生儿胎盘组织的干细胞，其中包括胎盘亚全能干细胞、胎盘造血干细胞、胎盘间充质干细胞、胎盘母亲干细胞等。胎盘造血干细胞是存在于胎盘组织中的一群原始造血细胞造血干细胞，是血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)的祖细胞，是高度未分化细胞。
对人类胎盘的研究发现，胎盘是一个造血器官。从怀孕第三周开始直至出生，胎盘在发挥物质交换、免疫调控、活性因子分泌等功能的同时，也承担着造血功能。胎盘组织来源造血干细胞数量丰富。研究表明胎盘CD34+细胞百分率是脐带血的8.8倍，CD34+CD38-细胞和CD34+CD38+细胞百分率分别是脐带血的4.6倍和11.9倍，说明胎盘组织中含有比脐带血更丰富的造血干细胞。另外胎盘中的淋巴细胞总数、T细胞(CD3+CD2+)、B细胞(CD19-)、Th(CD3+CD4+)细胞及Th/Ts比值均明显低于脐带血，而CD8+CD28-T抑制细胞则明显高于脐带血。说明胎盘组织来源的造血干细胞的免疫原性要低于脐血和外周血造血干细胞。
骨髓和外周血造血干细胞移植技术都存在HLA配型要求严格的缺陷，很大程度上限制了其临床应用；新生儿脐血作为造血干细胞的采集不具有侵入性，HLA配型的严格性标准较低，但其中所含的CD34+细胞数目较低，约为每骨髓单位中造血干细胞的十分之一，会导致较高的移植失败风险。人胎盘是更为丰富的造血干细胞来源，平均每个胎盘可以分离出(1-4)×109单 个核细胞，完全可以满足100公斤体重以下的病人血液造血干细胞重建的需要，为其临床应用开辟了广阔前景。在建立成熟且高效的分离技术的基础上，将胎盘中获取的高纯度、高活率干细胞/组细胞制成可直接冻存的临床用细胞制剂，以密闭袋装的方式长期储存于液氮中，这样便可在移植前及时复苏而省去繁琐的细胞洗涤过程，易于质控。
已经出现了多种分离和培养胎盘造血干细胞的技术，例如CN102660499A公开了一种胎盘造血干细胞及其制备方法和胎盘造血干细胞注射剂，该制备方法联合多种胶原酶消化胎盘组织以提高细胞得率，同时提供造血干细胞注射剂制备方法；CN103789262A公布了一种临床应用级胎盘造血干细胞的制备方法及保存方法，该方法通过灌注法从绒毛血管中提取细胞。
但是，实验证实，上述方法中，胎盘的细胞分离效率较低，并且胎盘造血干细胞在冻存后必须经过复苏和培养，无法直接使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种胎盘细胞分离效率较高，并且胎盘造血干细胞在冻存后可以直接使用的制备胎盘造血干细胞制剂的方法。
本发明的发明人出乎意料地发现，通过选择特定组成的酶溶液来消化胎盘组织，并选择特定组成的冻存液来冻存细胞，能够在提高胎盘细胞分离效率的同时，还能使胎盘造血干细胞在冻存后可以直接使用，由此得到了本发明。
为了实现上述目的，本发明提供了一种制备胎盘造血干细胞制剂的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)用酶溶液消化胎盘组织，得到消化产物并去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；(2)将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，得到上层的有核细胞悬 液；(3)将所述有核细胞悬液与冻存液混合；其中，所述酶溶液含有100-400IU/mL的Ⅰ型胶原酶、20-80IU/mL的DNA酶I、1-4IU/mL的分散酶和400-1000IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有20-65mL/L的二甲基亚砜、3-30g/L的羟乙基淀粉、30-130g/L的人血白蛋白、5-40g/L的右旋糖酐、4-6.5g/L的氯化钠、3.5-6g/L的葡萄糖酸钠、3-4.5g/L的醋酸钠、0.2-0.6g/L的氯化钾和0.1-0.5g/L的氯化镁。
通过上述技术方案，本发明能够在提高胎盘造血干细胞分离效率的同时，还能使冻存的胎盘造血干细胞在升温至常温后直接用于例如异体注射的临床干细胞治疗。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的物料的体积数值均为1个标准大气压的压力和20℃的温度下的数值。
本发明提供了一种制备胎盘造血干细胞制剂的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)用酶溶液消化胎盘组织，得到消化产物并去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；(2)将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，得到上层的有核细胞悬液；(3)将所述有核细胞悬液与冻存液混合；其中，所述酶溶液含有100-400IU/mL的Ⅰ型胶原酶、20-80IU/mL的DNA酶I、1-4IU/mL的分散酶和400-1000IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有20-65mL/L的二甲基亚砜、3-30g/L的羟乙基淀粉、30-130g/L的人血白蛋白、5-40g/L的右旋糖酐、4-6.5g/L的氯化钠、3.5-6g/L 的葡萄糖酸钠、3-4.5g/L的醋酸钠、0.2-0.6g/L的氯化钾和0.1-0.5g/L的氯化镁。
根据本发明，其中，根据本发明特别优选的一种实施方式，所述酶溶液含有200-300IU/mL的Ⅰ型胶原酶、30-50IU/mL的DNA酶I、1.5-3.5IU/mL的分散酶和600-800IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有35-50mL/L的二甲基亚砜、10-20g/L的羟乙基淀粉、50-100g/L的人血白蛋白、10-20g/L的右旋糖酐、5-5.5g/L的氯化钠、4.5-5g/L的葡萄糖酸钠、3.4-3.9g/L的醋酸钠、0.3-0.45g/L的氯化钾和0.2-0.4g/L的氯化镁。在该优选实施方式中，本发明能够进一步提高胎盘细胞分离效率，并且提高冻存后的胎盘造血干细胞在恢复常温后的造血定植能力。
根据本发明，其中，所述胎盘组织与所述酶溶液的重量比可以为1：(0.5-5)，优选为1：(1-4)；所述酶解液与所述羟乙基淀粉溶液的体积比可以为1：(0.1-0.5)，优选为1：(0.2-0.4)；所述有核细胞悬液与所述冻存液的体积比为1：(6-10)，优选为1：(7-9)。
根据本发明，其中，所述羟乙基淀粉溶液可以为沉淀红细胞所用的常规的所述羟乙基淀粉溶液，例如所述羟乙基淀粉溶液可以含有10-90g/mL的羟乙基淀粉，优选含有20-80g/mL的羟乙基淀粉。
根据本发明，其中，所述羟乙基淀粉的分子量可以为450000-700000，优选为480000-600000，取代度可以为0.4-0.7，优选为0.5-0.6；所述右旋糖酐的分子量可以为32000-42000，优选为38000-41000。
根据本发明，其中，所述Ⅰ型胶原酶是指EC编号为3.4.24.3的酶，可以通过商购获得，例如可以为购自SIGMA公司的商品号为C0130的产品；所述DNA酶I是指EC编号为3.1.21.1的酶，可以通过商购获得，例如可以为购自SIGMA公司的商品号为D5025的产品；所述分散酶是指EC编号为3.4.24.4的酶，可以通过商购获得，例如可以为购自Roche公司的商品号为 04942078001的产品；所述透明质酸酶是指EC编号为3.2.1.35的酶，可以通过商购获得，例如可以为购自SIGMA公司的商品号为H4272的产品。
根据本发明，其中，所述酶溶液、所述羟乙基淀粉溶液和所述冻存液可以具有与血浆渗透压相等的渗透压，以减少细胞的破裂。
根据本发明，其中，用所述酶溶液消化所述胎盘组织的条件可以包括：温度可以为35-38℃，时间可以为20-40分钟。
根据本发明，其中，可以通过过滤和/或瞬时离心去除所述消化产物中的组织残渣。其中，所述瞬时离心的条件可以包括：时间可以为30-60秒，速度可以为210-340×g。
根据本发明，其中，可以通过静置10-30分钟和/或450-750×g的离心使混合得到的物料分层。
根据本发明，其中，将所述有核细胞悬液与冻存液混合后所得的物料可以进行冻存。进行冻存的条件可以为细胞冻存领域常规的条件，例如，可以降温速度为0.5-5℃/分钟的程序降温来是待冻存的物料的浓度降低至零下80℃至零下220℃。
根据本发明，其中，所述有核细胞悬液与冻存液混合后所得的物料在冻存后即得到本发明的胎盘造血干细胞制剂，该胎盘造血干细胞制剂可长期存放，例如可以存放3天至30年；该胎盘造血干细胞制剂可以在从冻存状态升温至常温后直接进行异体注射。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。以下实施例和对比例中，所用的Ⅰ型胶原酶、DNA酶I、分散酶、透明质酸酶、羟乙基淀粉、人血白蛋白、右旋糖酐及其它药品均为商购获得的医药级的无菌药品。其中，Ⅰ型胶原酶为购自SIGMA公司的商品号为C0130的产品；DNA酶I为购自SIGMA公司的商品号为D5025的产品；分散酶为购自Roche公司的商品号为 04942078001的产品；透明质酸酶为购自SIGMA公司的商品号为H4272的产品；羟乙基淀粉为购自四川科瑞德凯华制药有限公司的商品号为9005-27-0的产品，分子量为450000-700000，取代度为0.7；人血白蛋白为购自SIGMA公司的商品号为A1653的产品；右旋糖酐为购自上海华壹生物科技有限公司的商品号为140638的产品，分子量为40000。以下实施例中，所用的胎盘均是在符合伦理道德规范下受到捐赠而获得的；并且，所用的胎盘均是在分娩结束后24小时内用于制备胎盘造血干细胞制剂；其中，在用于制备胎盘造血干细胞制剂之前，胎盘浸泡于含有青霉素200IU/mL、链霉素0.2mg/mL、盐酸四环素0.02mg/mL和两性霉素B 0.01mg/mL的HBSS生理缓冲液中，并且在用于制备胎盘造血干细胞制剂之前，用生理盐水尽可能洗去血及粘液。
实施例1
用酶溶液在温度为37℃消化胎盘组织30分钟，得到消化产物并双层纱布过滤去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并静置20分钟使混合得到的物料分层，得到上层的有核细胞悬液；将所述有核细胞悬液与冻存液混合，得到本实施例的胎盘造血干细胞制剂。
其中，所述酶溶液含有250IU/mL的Ⅰ型胶原酶、40IU/mL的DNA酶I、2.4IU/mL的分散酶和700IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有40mL/L的二甲基亚砜、15g/L的羟乙基淀粉、80g/L的人血白蛋白、15g/L的右旋糖酐、5.2g/L的氯化钠、4.8g/L的葡萄糖酸钠、3.7g/L的醋酸钠、0.40g/L的氯化钾和0.3g/L的氯化镁。所述胎盘组织与所述酶溶液的重量比为1：3；所述酶解液与所述羟乙基淀粉溶液的体积比为1：0.3；所述有核细胞悬液与所述冻存液的体积比为1：8。所述羟乙基淀粉溶液含有60g/L的羟乙基淀粉。
实施例2
用酶溶液在温度为37℃消化胎盘组织30分钟，得到消化产物并双层纱布过滤去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并静置20分钟使混合得到的物料分层，得到上层的有核细胞悬液；将所述有核细胞悬液与冻存液混合，得到本实施例的胎盘造血干细胞制剂。
其中，所述酶溶液含有200IU/mL的Ⅰ型胶原酶、50IU/mL的DNA酶I、1.5IU/mL的分散酶和800IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有35mL/L的二甲基亚砜、10g/L的羟乙基淀粉、100g/L的人血白蛋白、20g/L的右旋糖酐、5g/L的氯化钠、5.0g/L的葡萄糖酸钠、3.4g/L的醋酸钠、0.30g/L的氯化钾和0.4g/L的氯化镁。所述胎盘组织与所述酶溶液的重量比为1：1；所述酶解液与所述羟乙基淀粉溶液的体积比为1：0.2；所述有核细胞悬液与所述冻存液的体积比为1：7。所述羟乙基淀粉溶液含有20g/L的羟乙基淀粉。
实施例3
用酶溶液在温度为37℃消化胎盘组织30分钟，得到消化产物并双层纱布过滤去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并静置20分钟使混合得到的物料分层，得到上层的有核细胞悬液；将所述有核细胞悬液与冻存液混合，得到本实施例的胎盘造血干细胞制剂。
其中，所述酶溶液含有300IU/mL的Ⅰ型胶原酶、30IU/mL的DNA酶I、3.5IU/mL的分散酶和600IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有50mL/L的二甲基亚砜、20g/L的羟乙基淀粉、50g/L的人血白蛋白、10g/L的右旋糖酐、5.5g/L的氯化钠、4.5g/L的葡萄糖酸钠、3.9g/L的醋酸钠、0.45g/L的氯 化钾和0.2g/L的氯化镁。所述胎盘组织与所述酶溶液的重量比为1：4；所述酶解液与所述羟乙基淀粉溶液的体积比为1：0.4；所述有核细胞悬液与所述冻存液的体积比为1：7。所述羟乙基淀粉溶液含有20g/L的羟乙基淀粉。
实施例4
用酶溶液在温度为37℃消化胎盘组织30分钟，得到消化产物并双层纱布过滤去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并静置20分钟使混合得到的物料分层，得到上层的有核细胞悬液；将所述有核细胞悬液与冻存液混合，得到本实施例的胎盘造血干细胞制剂。
其中，所述酶溶液含有100IU/mL的Ⅰ型胶原酶、80IU/mL的DNA酶I、1IU/mL的分散酶和1000IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有20mL/L的二甲基亚砜、30g/L的羟乙基淀粉、30g/L的人血白蛋白、40g/L的右旋糖酐、4g/L的氯化钠、6g/L的葡萄糖酸钠、3g/L的醋酸钠、0.6g/L的氯化钾和0.1g/L的氯化镁。所述胎盘组织与所述酶溶液的重量比为1:0.5；所述酶解液与所述羟乙基淀粉溶液的体积比为1：0.1；所述有核细胞悬液与所述冻存液的体积比为1：6。所述羟乙基淀粉溶液含有60g/L的羟乙基淀粉。
实施例5
用酶溶液在温度为37℃消化胎盘组织30分钟，得到消化产物并双层纱布过滤去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并静置20分钟使混合得到的物料分层，得到上层的有核细胞悬液；将所述有核细胞悬液与冻存液混合，得到本实施例的胎盘造血干细胞制剂。
其中，所述酶溶液含有400IU/mL的Ⅰ型胶原酶、20IU/mL的DNA酶I、 4IU/mL的分散酶和400IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有65mL/L的二甲基亚砜、3g/L的羟乙基淀粉、130g/L的人血白蛋白、5g/L的右旋糖酐、6.5g/L的氯化钠、3.5g/L的葡萄糖酸钠、4.5g/L的醋酸钠、0.2g/L的氯化钾和0.5g/L的氯化镁。所述胎盘组织与所述酶溶液的重量比为1：5；所述酶解液与所述羟乙基淀粉溶液的体积比为1：0.5；所述有核细胞悬液与所述冻存液的体积比为1：10。所述羟乙基淀粉溶液含有60g/L的羟乙基淀粉。
对比例1
按照实施例1的方法制备胎盘造血干细胞制剂，所不同的是，所述酶溶液中不含有分散酶。
对比例2
按照实施例1的方法制备胎盘造血干细胞制剂，所不同的是，所述酶溶液中不含有透明质酸酶。
对比例3
按照实施例1的方法制备胎盘造血干细胞制剂，所不同的是，所述冻存液中不含有右旋糖酐。
测试实施例1
根据文献(Human placenta and chorion:potential additional sources of hematopoietic stem cells for transplantation.Transfusion.2011(11)；51(Suppl 4):94S-105S)中的记载，可知带有CD34+CD45dim标记的有核细胞为胎盘造血干细胞。根据上述文献中的方法，使用流式细胞术，对实施例1-5和对比例1-3中相对于每5g重量的胎盘组织所得到的胎盘造血干细胞的数量进行统计，并计算的得到胎盘造血干细胞的收率，结果如表1所示。
表1
根据表1的数据可见，本发明能够显著地提高胎盘造血干细胞的分离效率。并且在优选所述酶溶液含有200-300IU/mL的Ⅰ型胶原酶、30-50IU/mL的DNA酶I、1.5-3.5IU/mL的分散酶和600-800IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有35-50mL/L的二甲基亚砜、10-20g/L的羟乙基淀粉、50-100g/L的人血白蛋白、10-20g/L的右旋糖酐、5-5.5g/L的氯化钠、4.5-5g/L的葡萄糖酸钠、3.4-3.9g/L的醋酸钠、0.3-0.45g/L的氯化钾和0.2-0.4g/L的氯化镁的情况下，具有更高的分离效率。
测试实施例2
将实施例1-5和对比例1-3的胎盘造血干细胞制剂以1℃/分钟的程序降温，降温至零下80℃，然后液氮中保存20天后取出，与37℃水浴中迅速恢复至常温，作为待进行异体注射的细胞治疗剂。
根据文献(The Human Term Placenta as a Source of Transplantable Hematopoietic Stem Cells.A.Atala and S.V.Murphy(eds.),Perinatal Stem Cells) 中的记载，可知能够对受到放射性射线辐射的裸鼠具有造血重建功能的细胞具有造血干细胞功能。根据上述文献中的方法，对由实施例1和对比例1-3的胎盘造血干细胞制剂在冻存和升温后所得到的细胞治疗剂的造血恢复能力进行检测，检测结果如表2所示。其中，CD45+CD3+为T细胞表面标记；CD45+CD19+为B细胞标记；CD45+CD33+为为髓系细胞标记。
表2
根据表2的数据可见，本发明的方法得到的胎盘造血干细胞制剂在从冻存状态升温至常温后直接进行异体注射，能够显示出较高的造血恢复能力，即本发明的方法得到的胎盘造血干细胞制剂在从冻存状态升温至常温后直接用于临床使用。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明 的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (9)
1.一种制备胎盘造血干细胞制剂的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)用酶溶液消化胎盘组织，得到消化产物并去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶解液；
(2)将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，得到上层的有核细胞悬液；
(3)将所述有核细胞悬液与冻存液混合；
其中，所述酶溶液含有100-400IU/mL的Ⅰ型胶原酶、20-80IU/mL的DNA酶I、1-4IU/mL的分散酶和400-1000IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有20-65mL/L的二甲基亚砜、3-30g/L的羟乙基淀粉、30-130g/L的人血白蛋白、5-40g/L的右旋糖酐、4-6.5g/L的氯化钠、3.5-6g/L的葡萄糖酸钠、3-4.5g/L的醋酸钠、0.2-0.6g/L的氯化钾和0.1-0.5g/L的氯化镁。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶溶液含有200-300IU/mL的Ⅰ型胶原酶、30-50IU/mL的DNA酶I、1.5-3.5IU/mL的分散酶和600-800IU/mL的透明质酸酶；所述冻存液中含有35-50mL/L的二甲基亚砜、10-20g/L的羟乙基淀粉、50-100g/L的人血白蛋白、10-20g/L的右旋糖酐、5-5.5g/L的氯化钠、4.5-5g/L的葡萄糖酸钠、3.4-3.9g/L的醋酸钠、0.3-0.45g/L的氯化钾和0.2-0.4g/L的氯化镁。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述胎盘组织与所述酶溶液的重量比为1：(0.5-5)；所述酶解液与所述羟乙基淀粉溶液的体积比为1：(0.1-0.5)；所述有核细胞悬液与所述冻存液的体积比为1：(6-10)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述羟乙基淀粉溶液含有10-90g/mL的羟乙基淀粉。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述羟乙基淀粉的分子量为450000-700000，取代度为0.4-0.7；所述右旋糖酐的分子量为32000-42000。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶溶液、所述羟乙基淀粉溶液和所述冻存液具有与血浆渗透压相等的渗透压。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，用所述酶溶液消化所述胎盘组织的条件包括：温度为35-38℃，时间为20-40分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，通过过滤和/或瞬时离心去除所述消化产物中的组织残渣；其中，所述瞬时离心的条件包括：时间为30-60秒，速度为210-340×g。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，通过静置10-30分钟和/或450-750×g的离心使混合得到的物料分层。
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Denomination of invention: A method for preparing placental hematopoietic stem cell preparations Granted publication date: 20181218 Pledgee: Zhejiang Hangzhou Yuhang Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Science and Technology City Branch Pledgor: HANGZHOU S-EVANS BIOSCIENCES, Ltd. Registration number: Y2024980003656 |