IT202200000788A1 - Induzione sensibile alla temperatura del programma miogenico e/o adipogenico in cellule per la produzione di tessuto muscolare e/o adiposo - Google Patents
Induzione sensibile alla temperatura del programma miogenico e/o adipogenico in cellule per la produzione di tessuto muscolare e/o adiposo Download PDFInfo
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Description
?Induzione sensibile alla temperatura del programma miogenico e/o adipogenico in cellule per la produzione di tessuto muscolare e/o adiposo?
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un metodo per la produzione di un tessuto muscolare e/o adiposo, in particolare carne colturale, che prevede l?impiego di cellule ingegnerizzate in grado di differenziare in cellule muscolari e/o adipose in maniera dipendente dalla temperatura. Formano oggetto dell?invenzione anche vettori di espressione, cellule ingegnerizzate e kit per uso in tale metodo di produzione.
STATO DELL?ARTE
Nell?ultimo decennio, l?impatto ambientale dell?allevamento intensivo, unito alle implicazioni etiche ed economiche associate al sacrificio di animali per scopi alimentari, ha spinto diversi ricercatori ad esplorare vie alternative per la produzione di prodotti aventi caratteristiche simili alla carne. Idealmente, tali approcci alternativi dovrebbero portare a prodotti (1) dalle caratteristiche nutrizionali e di gusto simili alla carne macellata, (2) ottenibili su larga scala, ma (3) aventi costi di produzione bassi e (4) impatto ambientale limitato.
La produzione di carne in coltura ha attratto negli ultimi anni un grande interesse da parte della societ? e della comunit? scientifica. La maggior parte degli studi pubblicati in quest?ambito sono incentrati sull?espansione di cellule miogeniche (mioblasti) che sono capaci di formare fibre muscolari in vitro, ma che presentano ancora importanti limitazioni in termini di applicabilit? nella produzione di carne in coltura su larga scala.
Come alternativa all?utilizzo di mioblasti come fonte cellulare della carne colturale, alcuni studi hanno proposto il possibile impiego delle cellule staminali le cui propriet? di differenziamento non siano ristrette alla formazione di fibre muscolari, quali, ad esempio, cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), oppure cellule staminali somatiche con capacit? mio/adipogenica quali le cellule mesenchimali. Tali cellule presentano il vantaggio, rispetto ai mioblasti, di possedere notevoli capacit? di espansione e sono potenzialmente in grado di poter essere cresciute/espanse in sospensione. In contrasto con le colture di mioblasti, le cellule staminali pluripotenti devono essere opportunamente istruite per attivare il processo differenziativo.
L?ingegnerizzazione cellulare con costrutti esprimenti geni cruciali per l?attuazione del programma miogenico ? un approccio che ? stato proposto sia nell?ambito della medicina rigenerativa che nel settore della produzione di carne colturale. In alcuni casi, tale approccio implica l?utilizzo di sequenze regolatorie, o versioni modificate dei geni cruciali, che siano responsivi alla somministrazione di specifiche molecole chimiche (e.g. estradiolo, doxiciclina, tetraciclina etc.). Queste ultime, tuttavia, oltre ad avere un costo rilevante, presentano un forte rischio di tossicit? per i consumatori e per l?ambiente (Genovese et al.2017).
Per le ragioni appena esposte, vi ? ad oggi ancora una grande necessit? di individuare strumenti che consentano di ottimizzare la produzione di un tessuto muscolare e/o adiposo, in particolare per la produzione di carne colturale in modo tale da renderla: (1) scalabile a livello industriale in maniera economicamente sostenibile, (2) capace di originare un prodotto dalle caratteristiche nutrizionali simili alla carne da macellazione, e (3) indipendente dall?aggiunta di sostanze chimiche potenzialmente tossiche per i consumatori.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
L?obiettivo alla base della presente invenzione ? quello di fornire dei vettori di espressione per l?ingegnerizzazione di cellule con capacit? miogenica e/o adipogenica che consentano di indurne il differenziamento in cellule muscolari e/o adipose in maniera efficacemente modulabile dall?esterno, in modo tale da superare le problematiche precedentemente illustrate con riferimento allo stato della tecnica.
In particolare, gli autori della presente invenzione hanno messo a punto dei vettori di espressione responsivi ad un parametro fisico, la variazione di temperatura, in grado di indurre l?espressione di geni master miogenici e/o adipogenici nelle cellule in maniera controllata. Tali costrutti genetici offrono il vantaggio di poter ottimizzare la produzione di tessuto muscolare e/o adiposo, evitando l?impiego nel terreno di coltura cellulare di sostanze costose e/o potenzialmente tossiche.
I vettori sviluppati dagli autori della presente invenzione sono particolarmente indicati per modificare geneticamente cellule staminali multipotenti, ad esempio cellule staminali pluripotenti indotte, nonch? cellule somatiche con capacit? mio/adipogenica, ad esempio cellule mesenchimali, e risultano in grado, di concerto, di controllarne la transizione dalla fase di espansione a quella di differenziamento a muscolo o grasso, alternativamente, in modo strettamente dipendente dalla temperatura.
Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, i vettori messi a punto dagli autori della presente invenzione comprendono: a) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 45 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di miogenesi MyoD e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante un agente capace di rimodellare la cromatina (CRA) (anche denominato nella presente descrizione come pTRE-45MyoD/CRA); e b) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 15 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi PPAR? e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi C/EBP? (anche denominato nella presente descrizione come pTRE-15PPAR?).
Vantaggiosamente, gli inventori hanno trovato che la co-espressione dei vettori pTRE-45MyoD/CRA e pTRE-15PPAR? qui descritti, unitamente all?espressione di un terzo vettore comprendente almeno una sequenza di acido nucleico codificante per HSF1 sotto il controllo del promotore costitutivo CAG (anche denominato nella presente come pCAG-HSF1), consente di modulare il rapporto di espressione tra i geni del programma miogenico e quello adipogenico in cellule con capacit? miogenica e/o adipogenica, e di conseguenza permette di regolare la proporzione di queste cellule che differenziano a muscolo o grasso.
L?impiego dei costrutti genici messi a punto dagli autori dell?invenzione offre dunque un grande potenziale per lo sviluppo di nuove metodologie per la produzione di tessuto muscolare e/o adiposo, le quali possono trovare applicazione non soltanto nell?ambito della produzione di prodotti edibili destinati al consumo umano, quale carne colturale, ma anche nell?ambito della medicina rigenerativa. I metodi oggetto della presente invenzione consentono dunque non solo di determinare, mediante un aumento della temperatura, una transizione controllata dal passaggio di proliferazione al differenziamento cellulare, ma anche di modulare la proporzione di cellule che differenziano a muscolo o a grasso per la produzione di un tessuto muscolare e/o adiposo.
Nel contesto della produzione di carne colturale, la metodologia oggetto della presente invenzione offre l?opportunit? di rendere tale processo maggiormente sicuro, efficiente da un punto di vista dei costi, scalabile sul piano industriale, traslabile a diverse specie animali e capace di garantire un controllo sul contenuto in grasso della carne cos? da ottimizzarne gusto e propriet? nutritizie.
Formano pertanto oggetto dell?invenzione:
- un vettore di espressione comprendente (i) un promotore responsivo alla temperatura operativamente collegato a (ii) almeno una sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di miogenesi e/o almeno una sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di adipogenesi;
- cellule ingegnerizzate aventi capacit? miogenica e/o adipogenica, comprendenti un vettore di espressione in grado di indurre la differenziazione delle suddette cellule in cellule muscolari e/o adipose in risposta ad una variazione di temperatura;
- un metodo in vitro per la preparazione di un tessuto muscolare e/o adiposo, il quale metodo comprende i seguenti passaggi:
a) coltivare le cellule definite in una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ad una temperatura idonea per la proliferazione di dette cellule;
b) aumentare la temperatura di coltivazione in modo da promuovere la differenziazione di dette cellule in cellule muscolari e/o adipose;
c) coltivare le cellule differenziate in modo da ottenere detto tessuto;
- un tessuto muscolare e/o adiposo ottenibile mediante un metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, preferibilmente in cui detto tessuto ? un prodotto edibile, in particolare ? carne colturale;
- un kit comprendente almeno un vettore e/o cellule secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Schema della produzione di carne colturale a partire da cellule indifferenziate in modo controllato da parametri fisici. Rappresentazione schematica di un metodo secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, per controllare la transizione dalla fase di espansione di cellule staminali pluripotenti e/o cellule somatiche con capacit? mio/adipogenica a quella di differenziamento a muscolo o alternativamente a grasso. Tale transizione dipende dal funzionamento di 2 vettori secondo una forma di realizzazione descritta nella presente, illustrati nelle Figure 2 e 3. Tali vettori garantiscono che l?innalzamento della temperatura determini l?espressione di geni promotori del differenziamento miogenico (ad esempio MyoD) e adipogenico (ad esempio PPAR?), assieme alla espressione di geni che modificando la accessibilit? al DNA e ne favoriscono l?efficacia.
Figura 2. Vettore esprimente fattori di differenziamento muscolare in modo dipendente dalla temperatura secondo una forma di realizzazione. Diagramma schematico di un vettore lentivirale bicistronico progettato per indurre l?espressione di un gene maestro della regolazione miogenica (ad esempio MyoD) e di un gene codificante un agente rimodellatore della cromatina (CRA). La trascrizione dei due geni ? sotto il controllo di sequenze regolatorie responsive alla temperatura (TRE) derivate dal promotore di HSP70 (heat shock protein 70). Le sequenze TRE sono multimerizzate 45 volte per consentire un?espressione intensa in un basso intervallo di temperatura. Per permettere la selezione rispettivamente in batteri e cellule eucariotiche sono state inserite cassette esprimenti geni codificanti le resistenze quali ad esempio la cannamicina (KANr) e la blastidicina (Blar). Il vettore contiene un?origine di replicazione batterica e le sequenze necessarie per l?impacchettamento nelle particelle virali.
Figura 3. Vettore esprimente fattori di differenziamento adiposo in modo dipendente dalla temperatura secondo una forma di realizzazione. Diagramma schematico del vettore lentivirale progettato per indurre la co-espressione dei geni maestro adipogenico PPAR? (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) e C/EBP?. La trascrizione dei due geni ? sotto il controllo di sequenze regolatorie responsive alla temperatura (TRE) derivate dal promotore di HSP70 (heat shock protein 70). Le sequenze TRE sono multimerizzate 15 volte per consentire un?espressione di media intensit? in un basso intervallo di temperatura. Per permettere la selezione rispettivamente in batteri e cellule eucariotiche sono state inserite cassette esprimenti geni codificanti resistenze quali ad esempio la cannamicina (KANr) e la neomicina (NEOr). Il vettore contiene un?origine di replicazione batterica e le sequenze necessarie per l?impacchettamento nelle particelle virali.
Figura 4. Vettore esprimente heat shock factor 1 (HSF1). Diagramma schematico del vettore lentivirale progettato per indurre l?espressione del gene heat shock factor 1 (HSF1). La trascrizione di HSF1 ? sotto il controllo di sequenze regolatorie costitutive come le sequenze CAG (CMV early enhancer fused to modified chicken ?-actin promoter). Per permettere la selezione rispettivamente in batteri e cellule eucariotiche sono state inserite cassette esprimenti geni codificanti resistenze, quali ad esempio cannamicina (KANr) e puromicina (Puror). Il vettore contiene un?origine di replicazione batterica e le sequenze necessarie per l?impacchettamento nelle particelle virali. Usato in combinazione con i vettori descritti in figura 2 e 3 questo vettore ne amplifica la capacit? trascrizionale.
Figura 5. Schema di come la temperatura moduli espansione e differenziamento delle cellule nel processo di produzione della carne colturale secondo una forma di realizzazione. Schema di un possibile processo di produzione di carne colturale che usi i costrutti descritti in questa invenzione. L?impianto comprende un bioreattore dove sono espanse le cellule staminali pluripotenti o le cellule somatiche con capacit? mio/adipogenica geneticamente modificate e un bioreattore per il differenziamento contenente gli ?scaffolds? per dare struttura al prodotto. Nel bioreattore di espansione la temperatura ? di 37?C. Una continua agitazione garantisce ossigenazione nell?intero impianto e la distribuzione omogenea di nutrienti di base (i.e., carboidrati, amminoacidi, vitamine etc. etc.). Un transiente innalzamento della temperatura del terreno all?ingresso nel bioreattore di differenziamento ? ottenibile con un sistema di resistenze e determina l?induzione dei geni responsabili del differenziamento. La diversa reattivit? alla temperatura dei costrutti esprimenti i geni del differenziamento miogenico o adipogenico permette di modulare la proporzione di cellule che differenziano alternativamente in muscolo o in grasso, controllando quindi le caratteristiche del prodotto finale.
Figura 6. Sequenza di 154 bps che comprende a monte 15 siti HSE (nGAAn) e il promotore minimo di HSPA6 (72 bps, grigio).
Figura 7. Sequenza di 204 bps che comprende a monte 45 siti HSE (nGAAn) e il promotore minimo di HSPA6 (72 bps, grigio).
Figura 8. Vettore lentivirale. La Turbo GFP ? stata inserita a valle del promotore 15HSE-Hsp70 come marcatore di attivazione del promotore. La proteina fluorescente mCherry viene utilizzata come marcatore della trasfezione del plasmide.
Figura 9. Vettore lentivirale. La Turbo GFP ? stata inserita a valle del promotore 45HSE-Hsp70 come marcatore di attivazione del promotore. La proteina fluorescente mCherry viene utilizzata come marcatore della trasfezione del plasmide.
Figura 10. Plasmide lentivirale. Il gene HSF1 ? stato inserito a valle del promotore CAG. La proteina fluorescente TagBFP2 viene utilizzata come marcatore della trasfezione del plasmide. Figura 11. Incremento della percentuale di cellule con promotore attivo (GFP+ve) da 37?C a 43?C in cellule (A) senza plasmide HSF1 e in cellule (B) trasfettate con plasmide HSF1.
Figura 12. Incremento di intensit? in cellule con promotore attivo (GFP+ve) da 37?C a 43?C in dati normalizzati. I dati sono stati normalizzati sulle intensit? di GFP e mCherry (mediana GFP / mediana mCherry), e l'incremento ? stato analizzato in cellule (A) senza plasmide HSF1 e in cellule (B) trasfettate con plasmide HSF1.
Figura 13. Istogramma che rappresenta l'intensit? GFP (indicatore di attivazione del promotore) di diverse popolazioni cellulari a 37?C. Il grafico mostra come l'aumento del numero di ripetizioni HSE e l'aggiunta di HSF1 diminuisca l'attivazione basale del promotore.
GLOSSARIO
I termini impiegati nella presente descrizione sono come generalmente compresi dall?esperto della tecnica, salvo ove diversamente indicato.
I termini ?promotore? o ?sequenza di un promotore? sono usati nella presente domanda in maniera intercambiabile e si riferiscono ad una sequenza di DNA in grado di controllare l?espressione di una sequenza nucleotidica operativamente collegata a detto promotore/sequenza di un promotore.
In particolare, il termine ?promotore responsivo alla temperatura? come impiegato nel contesto della presente invenzione, fa riferimento ad un promotore oppure ad una sequenza di un promotore avente attivit? inducibile o controllabile esternamente mediante una variazione di temperatura. In altri termini, un ?promotore responsivo alla temperatura? ? un promotore che non possiede la capacit? di controllare l?espressione della sequenza nucleotidica ad esso operativamente collegata prima che sia raggiunto un determinato valore o intervallo di valori di temperatura e che, invece, presenta la capacit? di controllare l?espressione della suddetta sequenza una volta che questo valore o intervallo di valori di temperatura siano stati raggiunti.
L?espressione ?% di identit?? come impiegata nel contesto della presente descrizione rispetto ad una sequenza nucleotidica di riferimento, ? definita come la percentuale di nucleotidi in una sequenza candidata che sono identici rispetto ai nucleotidi nella sequenza nucleotidica di riferimento, a seguito di allineamento delle sequenze ed introduzione di spazi ? se necessari ? in modo tale da raggiungere la massima percentuale di identit? di sequenza.
L?espressione ?fattore di regolazione di miogenesi? comprende, nel contesto della presente invenzione, una proteina, agente o fattore di trascrizione in grado di regolare o indurre il processo di miogenesi, ossia il processo di formazione del tessuto muscolare. Tale definizione comprende ad esempio fosfoproteine nucleari con funzione di transattivatori della trascrizione per geni specifici della cellula muscolare, quali miosina, la creatin chinasi muscolare (MCK) e il recettore nicotinico dell?acetilcolina (AChR). I fattori di regolazione di miogenesi appartengono alla famiglia di fattori di trascrizione detti ?proteine b-HLH? (Basics helix-loop-helix): tutte le proteine di questa famiglia sono in grado di legarsi al DNA in siti simili, attivando specifici geni del muscolo.
L?espressione ?fattore di regolazione di adipogenesi? comprende, nel contesto della presente descrizione una proteina, agente o fattore di trascrizione che ? coinvolto nella regolazione o induzione del processo di adipogenesi, ossia il processo attraverso il quale avviene la formazione del tessuto adiposo, in particolare attraverso il differenziamento dei preadipociti in adipociti.
Il termine ?plasmide?, come qui impiegato, si riferisce ad un filamento circolare di DNA superavvolto a doppia elica, in grado di trasportare un acido nucleico di interesse all?interno di un organismo target. Alcuni plasmidi sono in grado di replicazione autonoma all?interno di una cellula target all?interno della quale siano stati introdotti. Altri vettori possono essere integrati nel genoma di una cellula ospite, e possono dunque essere replicati con il genoma ospite. In particolare, alcuni plasmidi sono in grado di controllare l?espressione dei geni ai quali essi risultano operativamente collegati.
Il termine ?tessuto?, come qui impiegato, presenta il significato comunemente impiegato in biologia, ossia definisce un insieme di cellule, strutturalmente simili, associate per funzione. Il tessuto costituisce un livello superiore di organizzazione cellulare: pi? tessuti diversi possono associarsi tra di loro a formare strutture ulteriormente organizzate. Il tessuto muscolare ? costituito per definizione da cellule muscolari mentre il tessuto adiposo ? formato da cellule dette adipociti.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Come precedentemente accennato, gli autori della presente invenzione hanno messo a punto dei costrutti genici responsivi alla temperatura per l?ingegnerizzazione di cellule con capacit? miogenica e/o adipogenica, con lo scopo di indurre il differenziamento di queste cellule in cellule muscolari e/o adipose in maniera efficientemente controllata.
Vettori
In un primo aspetto, la presente invenzione fornisce pertanto un vettore di espressione comprendente (i) un promotore responsivo alla temperatura operativamente collegato a (ii) almeno una sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di miogenesi e/o almeno una sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di adipogenesi.
Un ?promotore responsivo alla temperatura? come qui descritto ? preferibilmente un promotore avente la capacit? di indurre l?espressione di almeno una sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di miogenesi e/o di almeno una sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di adipogenesi ad esso operativamente collegata/e.
Un ?promotore responsivo alla temperatura? idoneo ad essere impiegato in un vettore di espressione secondo la presente invenzione ? un promotore derivato da un gene inducibile mediante calore (dall?inglese heat-inducible gene), preferibilmente ? un promotore di shock termico (heat-shock promoter). In una forma preferita di realizzazione, ? usato il promotore derivato da HSP70 interamente descritto nell?articolo scientifico di (2000, ?Heat-directed gene targeting of adenoviral vectors to tumor cells?).
Secondo un aspetto preferito della presente invenzione, detto promotore responsivo alla temperatura comprende una pluralit? di elementi responsivi alla temperatura (heat shock elements, HSE, denominati alternativamente nella presente anche con l?acronimo TRE). Elementi responsivi alla temperatura sono sequenze di consenso presenti nei promotori dei geni di proteine di shock termico (heat-shock proteins, HSPs) inducibili.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detta pluralit? di HSE comprende una pluralit? di sequenze di acido nucleico 5?-NGAAN-3?, in cui la lettera N rappresenta un qualsiasi nucleotide.
Preferibilmente, una sequenza HSE consiste di almeno tre unit? pentameriche della sequenza 5?-nGAAn-3?. Ancora in una forma di realizzazione preferita, il promotore responsivo alla temperatura comprende 9 ripetizioni della sequenza contenente 5 HSE: CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA (SEQ ID No 4).
Un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, comprende preferibilmente un promotore responsivo alla temperatura in cui detti HSE sono in numero almeno pari a 2 o superiore. In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, detta pluralit? di HSE comprende un numero pari a 15 di HSE, oppure un numero pari a 45 di HSE.
Ancora secondo un aspetto della presente invenzione, il promotore responsivo alla temperatura secondo una qualsiasi delle varianti qui descritte pu? ulteriormente comprendere una sequenza di acido nucleico del promotore HSPA6, operativamente collegata a detta pluralit? di HSE.
L?acronimo HSPA6 deriva dall?inglese ?Heat shock protein family A (Hsp70) Member 6?. Secondo un aspetto della presente invenzione, detto promotore responsivo alla temperatura comprende o ? costituito da una sequenza nucleotidica avente SEQ ID NO.1.
Secondo un aspetto della presente invenzione, detto promotore responsivo alla temperatura comprende o ? costituito da una sequenza nucleotidica avente pi? del 90%, preferibilmente pi? del 95%, preferibilmente pi? del 99% di identit? con la sequenza SEQ ID No 1.
Preferibilmente, il promotore responsivo alla temperatura impiegabile in un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.2 oppure SEQ ID No.3.
? da intendersi che la sequenza del promotore responsivo alla temperatura secondo una qualsiasi delle forme qui descritte potr? comprendere una o pi? mutazioni a patto che queste non ne compromettano l?attivit? e/o funzionalit? come descritte nella presente.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il promotore responsivo alla temperatura ? un promotore sintetico.
Qualsiasi sequenza nucleotidica che codifichi per un fattore di regolazione di miogenesi e/o di adipogenesi pu? essere inserita nel vettore dell?invenzione.
? stato ampiamente dimostrato che il differenziamento muscolare pu? essere indotto tramite l?induzione di geni master del programma miogenico, quali MyoD, miogenina, MYF-5 e MRF4, PAX3 e PAX7.
Pertanto, secondo un aspetto della presente invenzione, detto fattore di regolazione di miogenesi ? selezionato tra MyoD, miogenina, MYF-5, MRF4, PAX3 e PAX7, in particolare ? uno o pi? di MyoD, miogenina, MYF-5, MRF4, PAX3 e PAX7. La sequenza amminoacidica di ciascuno di detti fattori esemplificati ? nota nella tecnica, e perci? un acido nucleico che codifica per ciascuna di dette sequenze pu? essere facilmente progettato.
La MyoD, anche nota come ?myoblast determination protein 1? ? una proteina nucleare appartenente alla famiglia dei fattori di regolazione di miogenesi, che regola la differenziazione delle cellule muscolari mediante induzione dell?arresto del ciclo cellulare, un prerequisito per l?avvio del processo di miogenesi. Questa proteina ? anche coinvolta nella rigenerazione muscolare.
Preferibilmente, la sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di miogenesi impiegata in un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ? una sequenza di acido nucleico cisgenico codificante per MyoD, ossia una sequenza derivante da un organismo animale donatore della stessa specie delle cellule che saranno modificate con detto vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte. In altri termini, detta sequenza codificante ? preferibilmente una sequenza di acido nucleico totalmente appartenente alla specie delle cellule riceventi il suddetto vettore o ad una ad essa affine, secondo una qualsiasi delle forme qui descritte.
A titolo meramente esemplificativo, detta sequenza ? la sequenza identificabile in Gene Bank mediante Gene ID: 281938.
Secondo un aspetto della presente invenzione, detto fattore di regolazione di adipogenesi ? selezionato tra PPAR? e C/EBP?.
Il recettore gamma attivato dai proliferatori dei perossisomi (PPAR? o PPARG, dall?inglese ?peroxisome proliferator-activated receptor gamma?) anche conosciuto come il recettore del glitazone o NR1C3, ? un recettore nucleare di secondo tipo che nella specie umana ? codificato dal gene PPARG. Il fattore PPAR? ? stato identificato come un importante regolatore dell?adipogenesi, infatti la proteina codificata dal gene PPAR? regola la differenziazione degli adipociti. Questo fattore fornisce in particolare una regolazione dinamica e specifica durante il differenziamento da una cellula precursore a adipocita completamente differenziato.
La proteina C/EBP?, anche nota come ?CCAAT/enhancer binding protein-??, ? un fattore di trascrizione che ? comunemente associato con la regolazione della proliferazione cellulare, codificata nell?uomo dal gene CEBPB.
Preferibilmente, la sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di adipogenesi impiegata in un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte comprende una prima sequenza codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi PPAR? ed una seconda sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi C/EBP?.
Ancor pi? preferibilmente, la sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di adipogenesi impiegata in un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte comprende una prima sequenza di acido nucleico cisgenico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi PPAR? ed una seconda sequenza di acido nucleico cisgenico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi C/EBP?, ossia sequenze derivanti da un organismo animale donatore della stessa specie delle cellule che saranno modificate con detto vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
A titolo meramente esemplificativo, la sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi PPAR? ? la sequenza identificabile in Gene Bank mediante Gene ID: 281993.
Un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte pu? ulteriormente comprendere una sequenza di acido nucleico codificante un agente capace di rimodellare la cromatina (CRA). Un esempio preferito di agente CRA ? rappresentato dal fattore BAF60C (BRGI/Brm-associated factor of 60 kDa, subunit C).
Preferibilmente, la sequenza di acido nucleico codificante per un agente CRA impiegabile in un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ? la sequenza codificante per un agente SWI/SNF (dall?inglese Switch/Sucrose Non-fermentable), una sottofamiglia di complessi capaci di rimodellare la cromatina ATP-dipendenti che si trovano negli eucarioti, ad esempio il gene SMARCD3. A titolo meramente esemplificativo, la sequenza di acido nucleico codificante per un agente CRA impiegabile in un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ? la sequenza identificabile in Gene Bank mediante Gene ID: 777769.
Secondo un aspetto preferito dell?invenzione, detta sequenza di acido nucleico codificante un agente CRA ? operativamente collegata ad almeno una sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di miogenesi, in particolare MyoD; in tal modo, l?espressione dell?agente CRA consente di favorire l?azione del fattore di regolazione di miogenesi e dunque il processo di conversione miogenica.
Preferibilmente, detta sequenza di acido nucleico codificante un agente CRA ? operativamente collegata a detta almeno una sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di miogenesi, in particolare MyoD, mediante una sequenza di acido nucleico IRES. In altri termini, l?inserimento della sequenza codificante un CRA, come ad esempio BAF60C, ? preferibilmente effettuato a valle della/e sequenza/e codificanti MyoD, con una sequenza IRES a fare da ponte per garantire l?espressione in tandem.
Secondo una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, detto vettore ? selezionato tra:
a) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 45 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di miogenesi MyoD e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante un agente capace di rimodellare la cromatina (CRA); in cui detta seconda sequenza di acido nucleico ? operativamente collegata a detta prima sequenza di acido nucleico mediante una sequenza IRES; preferibilmente in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.3; e b) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 15 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi PPAR? e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi C/EBP?; preferibilmente in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.2.
? preferibile che le sequenze di acido nucleico codificanti per MyoD, PPAR? e C/EBP? presenti nei vettori secondo la suddetta forma di realizzazione preferita siano sequenze di acido nucleico cisgeniche, ossia totalmente appartenenti alla specie delle cellule riceventi i suddetti vettori o ad una ad essa affine.
La Figura 2 illustra schematicamente una forma di realizzazione del vettore a) come descritto nella presente domanda, anche denominato pTRE-45MyoD/CRA; questo vettore contiene il cDNA esprimente MyoD sotto il controllo di un promotore derivato dal gene HSP70 caratterizzato dalla ripetizione di 45 elementi responsivi alla temperatura e robustamente inducibile mediante aumento della temperatura di pochi gradi centigradi. Il vettore pTRE-45MyoD/CRA contiene un numero elevato (45) di ripetizioni HSE (o TRE). Nello specifico, il promotore inducibile dalla temperatura presente in questo vettore contiene 9 ripetizioni della sequenza contenente 5 HSE (o TRE): CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA (SEQ ID No 4). Il vettore pTRE-45MyoD/CRA, oltre a MyoD, risulta in grado di esprimere anche un agente capace di rimodellare la cromatina e dunque in grado di favorire l?azione di MyoD e dunque la conversione miogenica in modo dipendente dall?innalzamento della temperatura.
La Figura 3 illustra schematicamente una forma di realizzazione del vettore b) come descritto nella presente domanda, anche denominato pTRE15-PPAR?; tale vettore esprime i geni master del programma adipogenico PPAR? e C/EBP?. In questo vettore i suddetti geni del programma adipogenico sono sotto il controllo di un promotore contenente 15 HSE (o TRE) dati dalla ripetizione di 3 volte della sequenza contenente 5 HSE (o TRE): CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA (SEQ ID No 4).Gli autori hanno trovato che il vettore pTRE-45MyoD/CRA presenta una maggiore efficacia di risposta alla temperatura rispetto al vettore pTRE15-PPAR?.
Una forma di realizzazione alternativa secondo la presente invenzione, si riferisce ad un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 45 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi PPAR? e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi C/EBP?; preferibilmente in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.2.
Un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ? un sistema capace di trasportare sequenze di acido nucleico di interesse all?interno di un organismo estraneo e permettere l?espressione dei geni o l?integrazione degli stessi all?interno dell?organismo target. Preferibilmente, detto organismo ? un organismo cisgenico, ossia un organismo che ? stato modificato mediante uno o pi? vettori secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, i quali vettori comprendono geni o sequenze di acido nucleico provenienti da organismi della stessa specie o comunque affini.
Una volta all?interno di una cellula target, il vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte pu? ad esempio servire al mantenimento di DNA eterologo all?interno della cellula o pu? fungere in alternativa da unit? per la replicazione del DNA.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detto vettore di espressione pu? essere di tipo virale o non-virale, ad esempio un plasmide.
Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ? un vettore virale, in particolare ? un vettore virale che si basa su un lentivirus, un adenovirus, un retrovirus o un virus herpes simplex. In una forma di realizzazione preferita secondo la presente invenzione, detto vettore ? un vettore lentivirale.
Il vettore lentivirale pu? essere nella forma di una molecola di DNA ricombinante, ad esempio un plasmide. Il vettore lentivirale pu? essere alternativamente nella forma di un vettore di particella lentivirale, comprendente ad esempio una o pi? molecole di RNA in un complesso di proteine lentivirali o altre proteine. I vettori lentivirali derivano da lentivirus, in particolare dal virus di immunodeficienza umana (HIV-1 o HIV-2), virus di immunodeficienza delle scimmie (SIV), virus di encefalite infettiva equina (EIAV), virus di artrite encefalite virale delle capre (CAEV), virus di immunodeficienza bovina (BIV) e virus di immunodeficienza felina (FN), che vengono modificati per rimuovere determinanti genetici coinvolti nella patogenicit? ed introdurre nuovi determinati utili per l?ottenimento di determinati effetti di interesse.
Un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte pu? essere prodotto attraverso una qualsiasi delle tecniche note ad un esperto del settore nell?ambito dell?ingegneria genetica e delle biotecnologie.
Cellule
Formano oggetto della presente invenzione anche cellule ingegnerizzate aventi capacit? miogenica e/o adipogenica comprendenti un vettore di espressione in grado di indurre la differenziazione delle suddette cellule in cellule muscolari e/o adipose in risposta ad una variazione di temperatura.
Con l?espressione ?cellule ingegnerizzate aventi capacit? miogenica e/o adipogenica? si fa riferimento, nel contesto della presente invenzione, a cellule isolate che siano in grado di differenziarsi in cellule muscolari e/o adipose, ossia cellule isolate che presentano il potenziale di svilupparsi in cellule muscolari e/o adipose.
Un vettore di espressione che sia in grado di indurre la differenziazione delle suddette cellule in cellule muscolari e/o adipose in risposta ad una variazione di temperatura ? un qualsiasi vettore che abbia la capacit? di attivare la differenziazione delle cellule che lo comprendono in cellule muscolari e/o adipose al raggiungimento di un determinato valore di temperatura di attivazione.
In particolare, un vettore di espressione idoneo ? un vettore che comprenda un promotore responsivo alla temperatura, ad esempio un promotore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente illustrate nella presente descrizione.
Le cellule ingegnerizzate secondo la presente invenzione possono comprendere un vettore di espressione secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte. Preferibilmente, le suddette cellule sono infettate o trasdotte, trasformate o transfettate con un vettore di espressione secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
Il termine ?trasformate o transfettate? si riferisce a cellule ospite che sono state soggette ad un processo di trasformazione o trasfezione. La trasformazione o trasfezione ? il processo mediante il quale materiale genetico esogeno ? introdotto in cellule ospite. Tale processo pu? essere effettuato in vitro o in vivo. In particolare, le cellule oggetto dell?invenzione possono essere infettate, trasformate e/o transfettate utilizzando una qualsiasi delle tecniche note ad un esperto del settore, ad esempio un metodo chimico o fisico. Le cellule possono anche essere esaminate in modo tale da selezionare le cellule che trasportano effettivamente il vettore o i geni di interesse, impiegando tecniche di screening cellulare convenzionali, quali Southern blots e/o PCR, oppure mediante l?impiego di marcatori specifici.
Cellule infettate, trasformate o transfettate correttamente risultano in grado di esprimere i geni oppure altri polinucleotidi e/o parti del vettore secondo l?invenzione in esse introdotti.
Secondo un aspetto della presente invenzione, un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ? integrato nel cromosoma delle suddette cellule ingegnerizzate che lo comprendono.
Le cellule ingegnerizzate secondo l?invenzione possono essere ottenute a partire da un animale, preferibilmente un mammifero non umano. Secondo un aspetto della presente invenzione, dette cellule sono cellule non-umane. Le cellule con capacit? miogenica e/o adipogenica qui descritte sono preferibilmente cellule di una qualsiasi specie animale edibile, e.g. bestiame o pollame. Tali cellule possono essere ad esempio cellule ottenute da specie di suino, ovino, bovino, pesce, crostaceo, uccello, o simili.
Ancor pi? preferibilmente, le cellule aventi capacit? miogenica e/o adipogenica secondo la presente invenzione comprendono uno o pi? vettori secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, i quali vettori comprendono geni o sequenze di acido nucleico provenienti da organismi della stessa specie delle suddette cellule o comunque affini.
Cellule ingegnerizzate con capacit? miogenica e/o adipogenica idonee ad essere infettate, trasdotte, trasformate o transfettate con un vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte sono cellule staminali pluripotenti, cellule staminali multipotenti e/o cellule staminali mesenchimali. Tali cellule presentano il vantaggio, rispetto ai mioblasti convenzionalmente impiegati nel settore, di possedere notevoli capacit? di espansione. Inoltre, queste cellule possono essere cresciute e/o espanse in sospensione.
Le cellule staminali pluripotenti sono cellule primitive, non specializzate, dotate della capacit? di dare origine ad una o pi? linee o tipi cellulari attraverso il procedimento di differenziamento cellulare. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono un esempio di cellule staminali tissutali o ?adulte?. Sono cellule multipotenti, cio? sono in grado di produrre diversi tipi di cellule specializzate del corpo, ma non tutte le tipologie.
Ancora secondo un aspetto della presente invenzione, le cellule staminali ingegnerizzate sono periciti, ad esempio periciti suini. Il pericita ? un tipo di cellula mesenchimale indifferenziata con funzione contrattile, che circonda parzialmente le cellule sub-endoteliali dei capillari e delle venule.
Cellule staminali ingegnerizzate secondo la presente invenzione possono essere anche cellule staminali pluripotenti indotte: queste sono un tipo di cellula staminale pluripotente derivata da una cellula non pluripotente, tipicamente una cellula somatica adulta, attraverso la manipolazione di alcuni geni.
In una ulteriore forma di realizzazione, cellule con capacit? miogenica e/o adipogenica secondo la presente invenzione comprendono fibroblasti, epatociti e/o qualsiasi altra tipologia di cellula nota ad un esperto del settore avente capacit? miogenica e/o adipogenica.
L?aumento della temperatura controlla l?espressione genica in gran parte a livello trascrizionale, attraverso l?interazione del fattore HSF1 (dall?inglese ?heat shock factor 1?), attivato mediante le sequenze HSE (o TRE) quali quelle descritte nella presente domanda, presenti nei promotori di geni inducibili dalla temperatura. HSF1 ? espresso endogenamente nella maggior parte delle tipologie cellulari. Tuttavia, la modifica delle cellule con un vettore che sia in grado di esprimere HSF1 consente di aumentare la differenza di responsivit? alla temperatura dei vettori secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
Pertanto, le cellule secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte possono comprendere ulteriormente un vettore che comprende almeno una sequenza di acido nucleico codificante per HSF1. Preferibilmente, la sequenza di acido nucleico codificante per HSF1 ? la sequenza codificante per HSF1 derivante da un organismo animale donatore della stessa specie delle cellule che saranno modificate con detto vettore secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte. A titolo meramente esemplificativo, detta sequenza ? la sequenza identificabile in Gene Bank mediante Gene ID: 506235.
Secondo un aspetto preferito, la sequenza di acido nucleico codificante per HSF secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ? sotto il controllo di un promotore costitutivo. Un promotore costitutivo pu? essere qualsiasi promotore idoneo ad indurre l?espressione del fattore HS1, preferibilmente ? il promotore CAG. La Figura 4 illustra schematicamente una forma di realizzazione di un vettore in grado di esprimere HSF1, denominato pCAG-HSF1.
Un aspetto preferito secondo la presente invenzione si riferisce in particolare a cellule ingegnerizzate secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, comprendenti i seguenti vettori:
a) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 45 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di miogenesi MyoD e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante un agente capace di rimodellare la cromatina (CRA); in cui detta seconda sequenza di acido nucleico ? operativamente collegata a detta prima sequenza di acido nucleico mediante una sequenza IRES; preferibilmente in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.3; b) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 15 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi PPAR? e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi C/EBP?; preferibilmente in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.2; e
c) un vettore che comprende almeno una sequenza di acido nucleico codificante per HSF1 sotto il controllo del promotore costitutivo CAG secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
La co-espressione del vettore c) con i vettori a) e b) secondo la presente invenzione (una forma di realizzazione dei quali ? illustrata rispettivamente nelle Figure 4, 2 e 3) consente di amplificare la capacit? di questi due vettori di indurre, rispettivamente, il programma miogenico o adipogenico nelle cellule in maniera dipendente dalla temperatura.
Metodi
Un ulteriore aspetto dell?invenzione si riferisce ad un metodo in vitro per la preparazione di un tessuto muscolare e/o adiposo, il quale metodo comprende i seguenti passaggi:
a) coltivare le cellule definite in una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ad una temperatura idonea per la proliferazione di dette cellule;
b) aumentare la temperatura di coltivazione in modo da promuovere la differenziazione di dette cellule in cellule muscolari e/o adipose;
c) coltivare le cellule differenziate in modo da ottenere detto tessuto.
Nel metodo oggetto della presente invenzione, innalzando in maniera transiente la temperatura nel mezzo di coltura nel passaggio b) rispetto al passaggio a), ed opzionalmente variando la temperatura durante il processo di differenziazione entro un intervallo prestabilito, sar? possibile modulare il rapporto di espressione dei geni del programma miogenico e/o adipogenico nelle cellule, e di conseguenza modificare in maniera controllata la proporzione di cellule che differenziano a muscolo o a grasso.
Infatti, la diversa reattivit? alla temperatura dei vettori esprimenti i geni del differenziamento miogenico o adipogenico permette di modulare la proporzione di cellule che differenziano alternativamente in muscolo o in grasso, controllando quindi le caratteristiche del prodotto finale.
I passaggi a) e c) del metodo qui descritti sono preferibilmente condotti in reattori o bioreattori separati. Con i termini ?reattori? o ?bioreattori? si intendono, nel contesto della presente invenzione, dispositivi o sistemi che consentano la coltivazione delle suddette cellule su scala di laboratorio, su media o larga scala. Esempi di reattori che possono essere impiegati in un metodo secondo la presente invenzione includono reattori aventi una capacit? da 1 L fino a 10.000 L.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il passaggio a) ? condotto in almeno un primo reattore o bioreattore comprendente un terreno di coltura. L?esperto del settore, sulla base della tipologia di cellula impiegata nel metodo qui descritto, sapr? selezionare il terreno di coltura pi? idoneo per garantire la proliferazione cellulare, tra quelli noti nella tecnica.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, il passaggio a) pu? essere condotto in due o pi? reattori o bioreattori distinti, in particolare in almeno (a?) un primo reattore o bioreattore adibito alla coltivazione di cellule aventi capacit? miogenica secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ed in almeno (a??) un secondo reattore o bioreattore adibito alla coltivazione di cellule aventi capacit? adipogenica secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
Il passaggio b) del metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte pu? essere condotto all?interno del medesimo reattore (o medesimi reattori) impiegato(i) nel passaggio a) oppure in uno o pi? reattori o recipienti differenti nel quale le cellule coltivate nel passaggio a) siano state trasferite.
Preferibilmente, il passaggio a) di coltivazione ed il passaggio c) di differenziazione cellulare di un metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte sono condotti in reattori separati tra loro.
Il passaggio c) di un metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ? preferibilmente condotto in almeno un secondo reattore comprendente un terreno di coltura, il quale secondo reattore ? operativamente collegato a mezzi per la regolazione della temperatura in detto secondo reattore.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il passaggio c) di un metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ? condotto in due o pi? reattori o bioreattori distinti, in particolare in almeno (c?) un primo reattore o bioreattore adibito alla differenziazione di cellule aventi capacit? miogenica secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, precedentemente coltivate nel passaggio (a?), ed in almeno (c??) un secondo reattore o bioreattore adibito alla differenziazione di cellule aventi capacit? adipogenica secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, precedentemente coltivate nel passaggio (a??).
Preferibilmente, i reattori, recipienti o componenti di impianto impiegati nei passaggi a), b) e c) secondo una qualsiasi delle varianti qui descritte sono tutti operativamente collegati a mezzi per la regolazione della temperatura nei suddetti reattori.
Mezzi di regolazione della temperatura idonei possono comprendere un qualsiasi sistema o dispositivo che consenta di fissare la temperatura del reattore, recipiente o componente di impianto considerato ad un valore prestabilito e/o di variare la temperatura in tale reattore, recipiente o componente di impianto in maniera controllata durante il processo di differenziamento cellulare. Preferibilmente, mezzi per la regolazione della temperatura comprendono una pluralit? di resistenze.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il reattore (o pi? reattori) impiegato(i) nel passaggio a) ?(sono) operativamente collegato(i) al reattore (o pi? reattori) impiegato(i) nel passaggio c) in modo da consentire il trasferimento delle cellule, al termine della fase di proliferazione, all?interno del reattore (o pi? reattori) deputato(i) al differenziamento cellulare.
Il passaggio b) del metodo qui descritto ? condotto preferibilmente ad una temperatura compresa tra 20 e 45?C.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la temperatura pu? essere modificata opportunamente durante il processo di differenziamento, ad esempio durante il passaggio b) o c), ad esempio pu? essere innalzata gradualmente durante il processo di differenziamento in modo tale da modulare la proporzione di cellule che differenzia in cellule muscolari o adipose.
Al fine di conferire una forma tridimensionale predefinita al tessuto muscolare e/o adiposo, nel metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, il passaggio c), ossia la fase di differenziamento cellulare, pu? essere condotta all?interno di uno o pi? scaffolds o stampi tridimensionali che siano in grado di conferire una forma predeterminata a detto tessuto.
I passaggi a), b) e c) del metodo sono condotti preferibilmente in un terreno di coltura liquido.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il metodo qui descritto pu? comprendere un ulteriore passaggio: d) preparare un prodotto edibile con il tessuto ottenuto in detto passaggio c).
Il metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte pu? ulteriormente comprendere un passaggio, precedente il passaggio di coltivazione a), nel quale le cellule ingegnerizzate secondo una qualsiasi delle varianti precedentemente descritte sono infettate, trasdotte, trasformate o transfettate con uno o pi? vettori secondo la presente invenzione.
Secondo un aspetto preferito dell?invenzione, il tessuto muscolare e/o adiposo ottenibile mediante un metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte ? carne colturale o carne sintetica.
Forma oggetto della presente invenzione anche un tessuto muscolare e/o adiposo ottenibile in vitro mediante un metodo secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
Preferibilmente detto tessuto ? un prodotto edibile, in particolare adatto per il consumo umano o animale, preferibilmente ? carne colturale o sintetica. A titolo meramente esemplificativo, detto prodotto edibile pu? essere in forma di mangime per animali.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, detto tessuto ? un tessuto idoneo ad essere impiegato nell?ambito della medicina rigenerativa, ad esempio in un metodo di riparazione o di sostituzione di un tessuto danneggiato in un paziente che ne abbia bisogno.
Un ulteriore oggetto dell?invenzione si riferisce a un kit comprendente almeno un vettore e/o cellule secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
Il kit dell?invenzione potr? comprendere anche reagenti e/o mezzi per la coltivazione delle cellule secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, opzionalmente comprender? anche istruzioni per l?uso.
Secondo una forma di realizzazione preferita, detto kit comprender? almeno i seguenti vettori:
a) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 45 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di miogenesi MyoD e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante un agente capace di rimodellare la cromatina (CRA); in cui detta seconda sequenza di acido nucleico ? operativamente collegata a detta prima sequenza di acido nucleico mediante una sequenza IRES; preferibilmente in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.3;
b) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 15 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi PPAR? e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi C/EBP?; preferibilmente in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.2; e
c) un vettore che comprende almeno una sequenza di acido nucleico codificante per HSF1 sotto il controllo del promotore costitutivo CAG secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte.
? preferibile che le sequenze di acido nucleico codificanti per MyoD, PPAR?, C/EBP? e HSF1 presenti nei vettori secondo la suddetta forma di realizzazione preferita siano sequenze di acido nucleico cisgeniche, ossia totalmente appartenenti alla specie delle cellule riceventi i suddetti vettori o ad una ad essa affine.
? oggetto della presente invenzione anche l?uso in vitro di un vettore, di cellule e/o di un kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte per la produzione di un tessuto muscolare e/o adiposo, preferibilmente in cui detto tessuto ? un prodotto edibile, in particolare ? carne colturale.
ESEMPI
Sono qui riportati a scopo illustrativo alcuni esempi di realizzazione non limitativi del metodo secondo la presente invenzione.
ESEMPIO 1
METODI
Produzione di plasmidi
I plasmidi sono stati sintetizzati da VectorBuilder. Le sequenze dei promotori sono state progettate sulla base del promotore minimo di HSPA6 (72 bps), aggiungendo a monte una ripetizione di 15 o 45 heat shock elements (HSE) (nGAAn) (Figura 6-9).
? stato anche sintetizzato un plasmide contenente il gene che codifica per il fattore di shock termico 1 (HSF1) (Figura 10). HSF1 ? un fattore di trascrizione che ? normalmente in uno stato inattivo e si attiva quando le cellule sono esposte al calore. In forma attiva, HSF1 si lega alle sequenze HSE sul promotore Hsp70 e ne induce la trascrizione.
Coltura di periciti di maiale
I periciti suini sono stati donati da C. Gargioli (Universit? di Roma Tor Vergata, Roma, Italia). Le cellule sono state coltivate in MEM ? con nucleosidi e GlutaMAX? (32571028, Gibco), 100 U/mL Penicillina, 100 ?g/mL Streptomicina (15140-122, Gibco), 20% Siero Fetale Bovino (FBS) (26140079, Gibco). Le cellule sono state staccate ogni 3 giorni utilizzando 0,25% tripsina-EDTA (25200056, Gibco).
Nucleofezione
Le cellule sono state piastrate due giorni prima della trasfezione (giorno -2). Il giorno 0, le cellule sono state staccate con tripsina e centrifugate a 200g x 5 minuti. Il pellet ? stato risospeso in MEM ? 20% FBS, ed ? stata effettuata una conta delle cellule stesse.
Successivamente, 2x10<5 >cellule sono state diluite in 100?L di Nucleofection Magic Buffer (KCl 5mM, MgCl215mM, Glucosio 10mM, K2HPO4/KH2PO4 pH 7.2120mM, H2O fino a 10 mL), ed ? stato aggiunto un totale di 2 ?g di DNA. La soluzione ? stata quindi trasferita in una cuvetta di elettroporazione Amaxa. La cuvetta ? stata poi inserita nel Nucleofector Cuvette Holder, ed ? stato applicato il programma selezionato (U23).
Una quantit? di 500?L MEM ? 20% FBS ? stata aggiunta alla soluzione, e met? della soluzione ? stata delicatamente trasferita in un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti contenente MEM ? 20% FBS (volume finale: 1mL per pozzetto). L'altra met? della soluzione ? stata trasferita in un pozzetto di un?altra piastra da 12 pozzetti. Le cellule sono state incubate a 37?C e al 5% di CO2 per 24 ore. La procedura ? stata ripetuta per ogni condizione, per un totale di 8 condizioni: 5HSE-Hsp70 ? HSF1; 15HSE-Hsp70 ? HSF1; 45HSE-Hsp70 ? HSF1; controllo negativo ? HSF1. Shock termico
Dopo 24 ore di incubazione, il giorno 1, una delle due piastre contenenti le 8 condizioni ? stata incubata a 43?C e 5% CO2 per 2 ore al fine di attivare il promotore Hsp70. La piastra ? stata quindi incubata nuovamente a 37?C e 5% di CO2 per 24 ore.
Analisi FACS
Dopo 24 ore, il giorno 2, le cellule sono state staccate per tripsinizzazione, risospese in 300?L di sorting buffer (1:1 PBS/MEM ? 20% FBS, 2% BSA, 1% Penicillina/Streptomicina) e caricate nei tubi con filtro. I campioni sono stati analizzati con il FACS Aria IIIU.
Lista delle sequenze
SEQ ID No.1 ? sequenza di acido nucleico del promotore HSPA6
GGTCGGG TGAGGCGCAAA AGGATAAAAA GCCGGTGGAA GCGGAGCTGA GCAGATCCGA GCCGGGCTGG CTGC SEQ ID No.2 - Sequenza nucleotidica del promotore 15HSE-Hsp70
AAGCTT CTCGAG GAGG CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA GTT GGTCGGG TGAGGCGCAAA AGGATAAAAA GCCGGTGGAA GCGGAGCTGA GCAGATCCGA GCCGGGCTGG CTGC AAGCTT GAATTC SEQ ID No.3 ? Sequenza nucleotidica del promotore 45HSE-Hsp70
AAGCTT CTCGAG GAGG CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA GTT GGTCGGG TGAGGCGCAAA AGGATAAAAA GCCGGTGGAA GCGGAGCTGA GCAGATCCGA GCCGGGCTGG CTGC AAGCTT GAATTC
SEQ ID No.4 ? Sequenza HSE
CGAAA CTTCT GGAAT ATTCC CGAAA
Claims (16)
1. Vettore di espressione comprendente (i) un promotore responsivo alla temperatura operativamente collegato a (ii) almeno una sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di miogenesi e/o almeno una sequenza di acido nucleico codificante per un fattore di regolazione di adipogenesi.
2. Vettore secondo la rivendicazione 1, in cui detto promotore comprende una pluralit? di elementi responsivi alla temperatura (heat shock elements, HSE), preferibilmente in cui detta pluralit? di HSE comprende un numero pari a 15 di HSE oppure un numero pari a 45 di HSE.
3. Vettore secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui detto promotore ulteriormente comprende una sequenza di acido nucleico del promotore HSPA6, operativamente collegata a detta pluralit? di HSE, preferibilmente in cui detta sequenza di acido nucleico del promotore HSPA6 ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No 1.
4. Vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.2 oppure SEQ ID No.3.
5. Vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detto fattore di regolazione di miogenesi ? selezionato tra MyoD, miogenina, MYF-5 e MRF4, preferibilmente in cui detto fattore di regolazione di miogenesi ? MyoD.
6. Vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detto fattore di regolazione di adipogenesi ? selezionato tra PPAR? e C/EBP?, preferibilmente in cui detto vettore comprende una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi PPAR? ed una seconda sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi C/EBP?.
7. Vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, selezionato tra:
a) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 45 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di miogenesi MyoD e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante un agente capace di rimodellare la cromatina (CRA); in cui detta seconda sequenza di acido nucleico ? operativamente collegata a detta prima sequenza di acido nucleico mediante una sequenza IRES; preferibilmente in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.3; e
b) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 15 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi PPAR? e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi C/EBP?; preferibilmente in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.
2.
8. Vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui detto vettore ? un vettore virale, preferibilmente in cui detto vettore ? un vettore lentivirale.
9. Cellule ingegnerizzate aventi capacit? miogenica e/o adipogenica, comprendenti un vettore di espressione in grado di indurre la differenziazione delle suddette cellule in cellule muscolari e/o adipose in risposta ad una variazione di temperatura.
10. Cellule secondo la rivendicazione 9, in cui detto vettore di espressione ? un vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8.
11. Cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 10, in cui dette cellule sono cellule staminali pluripotenti e/o cellule staminali mesenchimali, preferibilmente sono cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC).
12. Cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, in cui dette cellule comprendono i seguenti vettori:
a) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 45 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di miogenesi MyoD e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante un agente capace di rimodellare la cromatina (CRA); in cui detta seconda sequenza di acido nucleico ? operativamente collegata a detta prima sequenza di acido nucleico mediante una sequenza IRES; preferibilmente in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.3;
b) un vettore che comprende (i) un promotore comprendente 15 elementi responsivi alla temperatura, operativamente collegato ad (ii) una prima sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi PPAR? e ad (iii) una seconda sequenza di acido nucleico codificante per il fattore di regolazione di adipogenesi C/EBP?; preferibilmente in cui detto promotore ha la sequenza nucleotidica SEQ ID No.
2; e
c) un vettore che comprende almeno una sequenza di acido nucleico codificante per HSF1 sotto il controllo del promotore costitutivo CAG.
13. Metodo in vitro per la preparazione di un tessuto muscolare e/o adiposo, preferibilmente carne colturale, comprendente i seguenti passaggi:
a) coltivare le cellule definite in una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 12 ad una temperatura idonea per la proliferazione di dette cellule;
b) aumentare la temperatura di coltivazione in modo da promuovere la differenziazione di dette cellule in cellule muscolari e/o adipose;
c) coltivare le cellule differenziate in modo da ottenere detto tessuto, e opzionalmente d) preparare un prodotto edibile con il tessuto ottenuto in detto passaggio c).
14. Metodo in vitro secondo la rivendicazione 13, in cui detto passaggio c) ? condotto in almeno un secondo reattore comprendente un terreno di coltura, il quale almeno un secondo reattore ? operativamente collegato a mezzi per la regolazione della temperatura in detto secondo reattore, preferibilmente in cui detti mezzi per la regolazione della temperatura comprendono una pluralit? di resistenze.
15. Metodo in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 13 a 14, in cui detto passaggio b) ? condotto ad una temperatura compresa tra 20 e 45?C, preferibilmente in cui, in detto passaggio b) e/o c), la temperatura viene innalzata gradualmente durante il processo di differenziamento.
16. Kit comprendente almeno un vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 e/o cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 12.
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| IT102022000000788A IT202200000788A1 (it) | 2022-01-19 | 2022-01-19 | Induzione sensibile alla temperatura del programma miogenico e/o adipogenico in cellule per la produzione di tessuto muscolare e/o adiposo |
| PCT/IB2023/050422 WO2023139493A1 (en) | 2022-01-19 | 2023-01-18 | Temperature-sensitive induction of the myogenic and/or adipogenic programme in cells for the production of muscle and/or adipose tissue |
| IL314375A IL314375A (en) | 2022-01-19 | 2023-01-18 | Temperature-dependent induction of myogenic and/or adipogenic programs in cells for the production of muscle and/or fat tissue |
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| IT102022000000788A IT202200000788A1 (it) | 2022-01-19 | 2022-01-19 | Induzione sensibile alla temperatura del programma miogenico e/o adipogenico in cellule per la produzione di tessuto muscolare e/o adiposo |
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2022
- 2022-01-19 IT IT102022000000788A patent/IT202200000788A1/it unknown
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2023
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- 2023-01-18 WO PCT/IB2023/050422 patent/WO2023139493A1/en active Application Filing
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| BRADE ET AL., HEAT-DIRECTED GENE TARGETING OF ADENOVIRAL VECTORS TO TUMOR CELLS, 2000 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL314375A (en) | 2024-09-01 |
| WO2023139493A1 (en) | 2023-07-27 |
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