CN114317588B - 一种作物高温响应型基因组精准甲基化调控回路 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于高温胁迫条件下基因组甲基化的载体系统，能够快速实现DNA甲基化修饰水平变异，并且可以精确控制甲基化的时机和精确定位甲基化靶向基因的位点。该系统是包含了三个表达盒的表达载体。本发明用上述表达载体进行了水稻基因组甲基化的应用，获得了良好效果。

Description

一种作物高温响应型基因组精准甲基化调控回路

技术领域：

本发明涉及一种作物高温响应型基因组精准甲基化调控系统。

背景技术：

基因工程和合成生物技术已成为研究和改良作物性状的重要手段。随着基因编辑工具锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEs)以及CRISPR/Cas9系统的开发利用，通过靶定和修饰特异的基因组序列来研究基因功能的条件变得成熟。越来越多的研究将基因编辑工具用于表观遗传修饰以及基因调控。

DNA甲基化是表观遗传调控的重要方式，近年来逐渐揭示的DNA腺嘌呤甲基化(N6-Methyladenine，6mA)具有不同于其他表观遗传标记的调控模式，在响应环境信号、调控发育等多方面显示出重要作用，这些发现为作物提高产量和环境适应性提供了新的研究方向。已有研究发现，DNA 6mA修饰在高温胁迫中含量变化明显升高，直接参与胁迫诱导基因的表达调控。因此，在高温胁迫诱导条件下，利用表观编辑技术精确定位靶向抗逆基因，增加其DNA 6mA水平，有助于提高植物耐热性。构建高温智能响应型系统操纵植物在特定抗逆靶基因的甲基化，为创制智能适应性作物提供了可能。

发明内容：

本发明的目的是提供一种作物基因组精准甲基化载体系统。特别是提供一套用于高温胁迫条件下基因组甲基化的载体系统，能够快速实现DNA甲基化修饰水平变异，并且可以精确控制甲基化的时机和精确定位甲基化靶向基因的位点。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种包含了三个表达盒的表达载体，见如下：

表达盒1：DNA 6mA(DNA N6-Methyladenine)修饰元件，其目的是向目的基因DNA序列进行6mA修饰；

表达盒2：Cre-loxP基因开关系统，是在高温诱导条件下，介导两个LoxP位点(序列)之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。其目的是精准调控甲基化的启动时机。

表达盒3：SunTag基因靶向系统，是将多个拷贝的甲基化修饰因子挂到可用来靶向基因或其他的分子的蛋白质支架上，将甲基化修饰因子的生物活性显著放大。其目的是精确定位甲基化的位置。

所述表达盒1由SEQ ID NO:1所示的拟南芥热激启动子启动功能片段甲表达；所述功能片段甲包括SEQ ID NO:2所示的剪切酶Cre编码核苷酸序列(1116bp)

所述表达盒2由SEQ ID NO:3所示的水稻U6启动子启动功能片段乙表达；所述功能片段乙包括SEQ ID NO:4所示的gRNA表达盒；

所述表达盒3由SEQ ID NO:5所示的水稻特异性Act1启动子启动功能片段丙表达；所述功能片段丙是如下各序列的组合：

SEQ ID NO:6所示的剪切酶Cre识别序列loxP；

SEQ ID NO:7所示的dCas9的编码序列；

SEQ ID NO:8所示的10个拷贝GCN4肽的编码序列；

SEQ ID NO:9所示的单链可变片段scFv的GCN4抗体；

SEQ ID NO:10所示的sfGFP的编码序列；以及

SEQ ID NO:11所示的DNA 6mA表观修饰因子N6AMT1基因。

本发明基因组DNA甲基化的方法包括如下步骤：将前文所述的表达载体导入受体作物，实现作物基因组特定位点DNA甲基化。

但是，本发明的表达载体并不限于仅应用于水稻，本发明的设计理念可以应用于其他作物。在应用中，或许需要更换部分适用于具体作物的载体序列，例如更换合适的启动子。但是，无论何种更换，均属于本发明的发明思路和发明精神。

本发明用上述提供的表达载体进行了水稻基因组甲基化的应用，获得了良好效果，具体数据详见实施例。

所述水稻基因组DNA甲基化发生在水稻细胞核内。

调控模式图如图2所示。

附图说明：

图1为载体结构示意图。

图2为环境智能响应型表观遗传调控模式图。

图3为水稻原生质体瞬时转化载体利用共聚焦显微镜观察GFP荧光蛋白。

图4为目的载体转化水稻原生质体后利用Dot Blot检测DNA 6mA水平变化。

图5为目的载体转化水稻原生质体利用LC/MS检测DNA 6mA水平变化。

图6为目的载体转化水稻得到的转化体耐高温胁迫能力。

序列信息:

SEQ ID NO:1拟南芥热激启动子pHSFA2序列(2000bp)。

SEQ ID NO:2剪切酶Cre编码核苷酸序列(1116bp)。

SEQ ID NO:3水稻OsU6启动子序列(447bp)。

SEQ ID NO:4Guide RNA Scaffold序列(76bp)。

SEQ ID NO:5水稻组成型启动子pActin1序列(1401bp)。

SEQ ID NO:6剪切酶Cre识别序列loxP(34bp)。

SEQ ID NO:7失活Cas9蛋白(dCas9)编码核苷酸序列(4104bp)。

SEQ ID NO:8 10xGCN4单体肽核酸编码核苷酸序列(1233bp)。

SEQ ID NO:9单链抗体ScFV编码核苷酸序列(831bp)。

SEQ ID NO:10sfGFP荧光蛋白编码核苷酸序列(711bp)。

SEQ ID NO:11DNA表观修饰因子(GOI:N6AMT1)基因编码序列(645bp)。

具体实施方式:

实施例1目的载体在水稻原生质体的瞬时表达

1、目的载体的构建

根据已公布的拟南芥基因组序列，设计特异性PCR引物从拟南芥基因组扩增得到SEQ ID NO:1的所示的拟南芥热激启动子pHSFA2片段；SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6所示的各序列以质粒pKEY、pLY(参考文献：DOI:10.1038/s41598-017-14679-0)为模板通过PCR扩增得到；SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:10所示的序列以质粒(Addgene#106437)为模板通过PCR扩增得到；SEQ ID NO:11所示的序列为合成所得；各片段经过组装连接在pSB1300载体骨架上，得到如图1所示的目的载体。

2、水稻叶鞘原生质体的制备及转化后热激处理

2.1配制以下溶液：

100mM MES(4-吗啉乙磺酸)缓冲液(pH 5.7)、100mM KCl、1M MgCl₂、1M CaCl₂、100mM CaCl₂、40％PEG(pH 7.5-8.0)、MMg溶液(由终浓度为0.6M甘露醇、15mM MgCl2、4MmMES组成)、W5溶液(由终浓度为154mM NaCl、5mM KCl、2mM MES、125mM CaCl₂组成)。

1.2配制水稻原生质体酶解液

2.2原生质体制备：

(1)水稻日本晴种子露白后，避光培养8-10天。用吉列刀片将水稻幼苗茎切为1mm小段，置于盛有酶解液的烧杯中，酶解液使用时全程避光。

(2)30分钟抽真空，压力0.6-0.8；抽真空后将烧杯轻轻转移至28度摇床，50rpm，振荡4h后，贴壁缓缓加入等体积的W5溶液，经300目的筛子过滤，将滤液收集培养皿中。

(5)低速离心，170×g离心3min，加速和减速度均设置为1g。

(6)弃去上清，贴壁缓缓加入15-20mL W5溶液，低速离心，170×g离心3min，加速和减速度均设置为1g。

(8)弃去上清。加入MMg溶液250μL，轻轻混匀，得到水稻叶鞘原生质体。用细胞计数板在显微镜下计数，每100μL包含8×10⁴至2×10⁵个细胞。

(9)取100uL水稻叶鞘原生质体，加入60μg瞬时目的转化载体，轻轻混匀，得到细胞悬浮液，然后加入此时细胞悬浮液1.1倍体积的40％PEG，28℃避光放置20min后加入10倍体积的W5溶液，低速离心，170×g 3min，加速和减速度均设置为1g。

(11)用移液器吸取离心后上清液，弃去上清。再次加入W5溶液5mL，低速离心，170×g 3min，加速和减速度均设置为1g。

(12)离心完成后，转移并弃去绝大部分上清液，最后保留1mL上清液及沉淀于管底。加入1μL羧苄(100mg/mL)，发挥抑菌作用。轻轻混匀，28℃避光静止培养16h后45℃热激处理15min，并设置未热激处理的对照组。

3、原生质体转化目的载体热激处理后标记基因绿色荧光蛋白sfGFP的表达

使用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM700)进行观察，sfGFP蛋白基因开放阅读框(ORF，open reading frame)表达有功能的蛋白，在488nm下发绿光；结果如图3所示，结果表明：瞬时转化后的水稻原生质体内观察到明显的绿色荧光信号，说明通过sfGFP基因同时可以得到表达。

4、原生质体转化热激处理后目的载体后甲基酶基因的表达

进行水稻叶鞘原生质体制备和转化试验时，在转化前和转化后分别提取水稻叶鞘原生质体的基因组DNA，进行Dot-blot检测转化前后的水稻叶鞘原生质体的DNA 6mA的变化趋势。具体操作步骤如下：

(1)在200μL PCR管内使用ddH₂O设置DNA浓度梯度(50ng/uL、100ng/uL、200ng/uL、400ng/uL)，PCR仪内95℃变性3min后，立即将PCR管取出，置于冰上3min以上。

(2)取合适大小的NC膜置于塑料培养皿内，取1μL DNA样品点在NC膜上。

(3)待膜干燥后，调整紫外交联仪至200KJ/cm²，将培养皿打开盖子后放置在交联仪内进行紫外交联，20s后即可取出。

(4)在皿内加入20mL 5％脱脂奶粉封闭1h。

(5)倒掉培养皿内的脱脂奶粉，使用PBST溶液清洗膜3次，每次1min。

(6)使用5mL PBST溶液按照1:1000比例稀释anti-6mA抗体(购自SynapticSystems，货号为202003)后，加入到培养皿内，4℃过夜

(7)回收一抗至离心管内，4℃保存。使用PBST溶液清洗膜3次，每次1min。

(8)使用10mL PBST溶液按照1:5000比例稀释辣根过氧化物酶标记的anti-mouseIgG抗体后，加入到培养皿内，室温孵育1h。

(9)使用PBST溶液清洗膜3次，每次1min。

(10)将膜上的液体使用无尘纸吸干后，各取500μL ECL发光底物A液和B液充分混匀后，将膜浸没至发光底物中反应2min。

(11)使用化学发光检测成像系统检测信号并拍照分析。

实验结论：

结果如图4所示，从瞬时转化热激后的水稻原生质体中提取基因组DNA进行6mA点杂交，转化后热激处理原生质体，基因组DNA 6mA修饰水平降低，说明载体转化并热激处理后发挥甲基化修饰功能。

5、LC/MS检测DNA 6mA

进行水稻叶鞘原生质体制备和转化试验时，在转化热激前后分别提取水稻叶鞘原生质体的基因组DNA，利用LC-MS/MS法定量检测转化前后水稻叶鞘原生质体DNA 6mA修饰量的变化。具体操作步骤如下：

(1)用核酸酶P1、磷酸二酯酶I、30mM醋酸钠和2mM氯化锌调整DNA至400μL体系。

(2)37℃孵育3h后，加入1μL细菌碱性磷酸酶(10U/μL)。

(3)继续37℃孵育1h，将样品消解成单个核糖核苷。

(4)使用10kDa超滤管，12000rpm离心15min，将超滤管2mL收集管中的液体转移至进样瓶内。

(5)使用安捷伦6400三重四级杆液相色谱质谱联用仪器，屈臣氏蒸馏水(0.1％甲酸)和乙腈(0.1％甲酸)作为流动相，GOLDaQ柱子(100mm*2.1mm)孔径1.9μm，设定离子对进样检测。

实验结论：

结果如图5所示，转化前后，从瞬时转化热激后的水稻原生质体中提取基因组DNA利用LC/MS进行6mA修饰水平检测，转化后基因组DNA 6mA修饰水平升高，说明载体转化热激后发挥甲基化修饰功能。

实施例2目的载体稳定转化水稻后植株抗高温能力检测

实验材料：目的载体转化水稻品种为日本晴；

实验方法：分别用日本晴野生型和转化体种子在28℃培养箱中避光萌发，种子露白后在营养液中培养到21天，高温(45℃)处理幼苗48h，观察野生型和转化体两种植株的生长情况；

实验结果：在高温条件处理下，野生型植株表现为明显的叶片局部损伤的表型，而转化体在高温胁迫下叶片损伤程度不明显，说明转化体抗高温能力明显高于野生型植株。如图6。

实验结论：转化目的基因回路的表达载体可提高水稻苗期对高温的抵抗能力，提高存活率。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 一种作物高温响应型基因组精准甲基化调控回路

<160> 11

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2000

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 1

ctttgccaat tcctctgtcc tcgataagag ctccaatacc agaaatgagt aaaaaaccaa 60

ctccaatagt tcggattgta ctccatagct gttctttaaa gtgagtcctt tctgtggata 120

tcgtatggat cggtgcacta gcagttccaa ggacaccatc ttttgttggt tttcctacgt 180

ttctaaatgc cccaagacct ccaaaagtct cttcctccct tgcaacacca gcaataccta 240

aaagaaaaac agcaaaacat ttcccaatat tatatagaga aatggctcag aagctgctaa 300

tacaaatatg aaagcaagga cacaatccaa gtatccattc agattcaaac aaacagtctc 360

tccctcctta cccacctctt tgcaatgttc gaaccagctc actttgatcg agcctatcaa 420

ctttaaccaa tgccttaatg tattccgata acgcagaggc attcgcatgc aaagaaggtt 480

ggctttcaaa cattctgata acagcctcag gatcatttct tcgaataagt tctctcagat 540

gtgcaacctc attaacttct tctctatcac ggactctgcg agcaaagcta ccaacataac 600

tcgattgaaa cctcgttcgc ggtaaagaag ctccaccacc acccacagct atagataaaa 660

taaaaccaat ttacatcaaa aacacttcta aaacaacaag aacaactcat aaacggaatc 720

agaatttacc tccagtaact cccactctag gaaaagagga gtaagctcta acaagtaagc 780

ttcttaaact gctcaattcc ctttcatgac tcgaaacctg tcatcggtga agagaatcaa 840

tacagatgaa gttaattact aatcccaaac tcaaaatgac actagacaac acatgaaaac 900

attttgataa aagtgaatac ttttacccat tttgaatcaa aaaaattgaa actttttata 960

ccaatttcaa aattaggtga cttgggtagt caaataaatc aaatgacaat atcacagaga 1020

caatctagaa tcctaaaaga caacattttg agggcagaga agaatttgag cttctagggt 1080

ttgaaaaata tcatctttag cttatgaatc acaaagatct tgataaaacc catcagaaat 1140

tattatctaa ttagatcaaa tccactacag tatcaaacca aagtcgaaac ctttttcgta 1200

ttaaaaattg gataaagggg aaaagagaaa aatgaaacaa aaaccttggt gatgatgcgc 1260

ctccaagcca tcaatcaaat ctctccttca cgatatctta aaaattggtg ttaatgtctg 1320

ataaatcgaa gttcctcgat ctatatcgga aacaaaagac ttcttcgttg tgtttgggga 1380

agaaccgttc taatcttatt ccctaaagtc ttaaaaacac taaattacac gtgagagacc 1440

tgtttggtta tcgggtgaga gaaaaattgt gcagcaggtg gagacacgca cgagatatgt 1500

aggtcgcctc ttaagtacat aaataccctt ggacataccc aataattcat tttagtaggc 1560

tttttctggc ggcccacatt aaaaagaagg acctagaaca taaattggca tcgttagaaa 1620

tgggcttaag taaaggccca tatgatatat atataaaaaa agagattcta gattagtaac 1680

gaagtttctg gaacattgtc ttgtcttgtc gccacgtgct cacataaatg tcaaagaagc 1740

ttcaatacag tgaaatgatc ttgtcttgtc tctagaacct tctcttctct ccccttataa 1800

tttcatttct ctctcctcca cgcctcaatc tctcaactca aaactcaaca ttttctgaag 1860

aaagtcgcaa actttaccca aaacccagtt tctaatttta gcaacaaaat caaaaatatc 1920

tacttttgtt tctcgaaagt tacgaaattc atacaatcta gcttatctct gagcttatgg 1980

atttgagata aacaacgaaa 2000

<210> 2

<211> 1116

<212> DNA

<213> 噬菌体P1（bacteriophage p1 vector）

<400> 2

atggcggcgg ttaggagaag agaacgagat gtggttgaag agaatggagt tacgacgacg 60

acggtgaaac gaaggaagcc cgggatgtcc aatttactga ccgtacacca aaatttgcct 120

gcattaccgg tcgatgcaac gagtgatgag gttcgcaaga acctgatgga catgttcagg 180

gatcgccagg cgttttctga gcatacctgg aaaatgcttc tgtccgtttg ccggtcgtgg 240

gcggcatggt gcaagttgaa taaccggaaa tggtttcccg cagaacctga agatgttcgc 300

gattatcttc tatatcttca ggcgcgcggt ctggcagtaa aaactatcca gcaacatttg 360

ggccagctaa acatgcttca tcgtcggtcc gggctgccac gaccaagtga cagcaatgct 420

gtttcactgg ttatgcggcg gatccgaaaa gaaaacgttg atgccggtga acgtgcaaaa 480

caggctctag cgttcgaacg cactgatttc gaccaggttc gttcactcat ggaaaatagc 540

gatcgctgcc aggatatacg taatctggca tttctgggga ttgcttataa caccctgtta 600

cgtatagccg aaattgccag gatcagggtt aaagatatct cacgtactga cggtgggaga 660

atgttaatcc atattggcag aacgaaaacg ctggttagca ccgcaggtgt agagaaggca 720

cttagcctgg gggtaactaa actggtcgag cgatggattt ccgtctctgg tgtagctgat 780

gatccgaata actacctgtt ttgccgggtc agaaaaaatg gtgttgccgc gccatctgcc 840

accagccagc tatcaactcg cgccctggaa gggatttttg aagcaactca tcgattgatt 900

acggcgcta aggatgactc tggtcagaga tacctggcct ggtctggaca cagtgcccgt 960

gtcggagccg cgcgagatat ggcccgcgct ggagtttcaa taccggagat catgcaagct 1020

ggtggctgga ccaatgtaaa tattgtcatg aactatatcc gtaacctgga tagtgaaaca 1080

ggggcaatgg tgcgcctgct ggaagatggc gattag 1116

<210> 3

<211> 447

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 3

ttttttcctg tagttttccc acaaccattt tttaccatcc gaatgatagg ataggaaaaa 60

tatccaagtg aacagtattc ctataaaatt cccgtaaaaa gcctgcaatc cgaatgagcc 120

ctgaagtctg aactagccgg tcacctgtac aggctatcga gatgccatac aagagacggt 180

agtaggaact aggaagacga tggttgattc gtcaggcgaa atcgtcgtcc tgcagtcgca 240

tctatgggcc tggacggaat aggggaaaaa gttggccgga taggagggaa aggcccaggt 300

gcttacgtgc gaggtaggcc tgggctctca gcacttcgat tcgttggcac cggggtagga 360

tgcaatagag agcaacgttt agtaccacct cgcttagcta gagcaaactg gactgcctta 420

tatgcgcggg tgctggcttg gctgccg 447

<210> 4

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgc 76

<210> 5

<211> 1401

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 5

gtcgaggtca ttcatatgct tgagaagaga gtcgggatag tccaaaataa aacaaaggta 60

agattacctg gtcaaaagtg aaaacatcag ttaaaaggtg gtataaagta aaatatcggt 120

aataaaaggt ggcccaaagt gaaatttact cttttctact attataaaaa ttgaggatgt 180

ttttgtcggt actttgatac gtcatttttg tatgaattgg tttttaagtt tattcgcttt 240

tggaaatgca tatctgtatt tgagtcgggt tttaagttcg tttgcttttg taaatacaga 300

gggatttgta taagaaatat ctttaaaaaa acccatatgc taatttgaca taatttttga 360

gaaaaatata tattcaggcg aattctcaca atgaacaata ataagattaa aatagctttc 420

ccccgttgca gcgcatgggt attttttcta gtaaaaataa aagataaact tagactcaaa 480

acatttacaa aaacaacccc taaagttcct aaagcccaaa gtgctatcca cgatccatag 540

caagcccagc ccaacccaac ccaacccaac ccaccccagt ccagccaact ggacaatagt 600

ctccacaccc ccccactatc accgtgagtt gtccgcacgc accgcacgtc tcgcagccaa 660

aaaaaaaaaa agaaagaaaa aaaagaaaaa gaaaaaacag caggtgggtc cgggtcgtgg 720

gggccggaaa cgcgaggagg atcgcgagcc agcgacgagg ccggccctcc ctccgcttcc 780

aaagaaacgc cccccatcgc cactatatac ataccccccc ctctcctccc atccccccaa 840

ccctaccacc accaccacca ccacctccac ctcctccccc ctcgctgccg gacgacgagc 900

tcctcccccc tccccctccg ccgccgccgc gccggtaacc accccgcccc tctcctcttt 960

ctttctccgt tttttttttc cgtctcggtc tcgatctttg gccttggtag tttgggtggg 1020

cgagaggcgg cttcgtgcgc gcccagatcg gtgcgcggga ggggcgggat ctcgcggctg 1080

gggctctcgc cggcgtggat ccggcccgga tctcgcgggg aatggggctc tcggatgtag 1140

atctgcgatc cgccgttgtt gggggagatg atggggggtt taaaatttcc gccatgctaa 1200

acaagatcag gaagagggga aaagggcact atggtttata tttttatata tttctgctgc 1260

ttcgtcaggc ttagatgtgc tagatctttc tttcttcttt ttgtgggtag aatttgaatc 1320

cctcagcatt gttcatcggt agtttttctt ttcatgattt gtgacaaatg cagcctcgtg 1380

cggagctttt ttgtaggtag a 1401

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 噬菌体P1（bacteriophage p1 vector）

<400> 6

ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34

<210> 7

<211> 4104

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggacaaga agtacagcat cggcctggcc atcggcacca actctgtggg ctgggccgtg 60

atcaccgacg agtacaaggt gcccagcaag aaattcaagg tgctgggcaa caccgaccgg 120

cacagcatca agaagaacct gatcggcgcc ctgctgttcg acagcggaga aacagccgag 180

gccacccggc tgaagagaac cgccagaaga agatacacca gacggaagaa ccggatctgc 240

tatctgcaag agatcttcag caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacaga 300

ctggaagagt ccttcctggt ggaagaggat aagaagcacg agcggcaccc catcttcggc 360

aacatcgtgg acgaggtggc ctaccacgag aagtacccca ccatctacca cctgagaaag 420

aaactggtgg acagcaccga caaggccgac ctgcggctga tctatctggc cctggcccac 480

atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caacagcgac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggaaaacccc 600

atcaacgcca gcggcgtgga cgccaaggcc atcctgtctg ccagactgag caagagcaga 660

cggctggaaa atctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaatggcct gttcggcaac 720

ctgattgccc tgagcctggg cctgaccccc aacttcaaga gcaacttcga cctggccgag 780

gatgccaaac tgcagctgag caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgacctgttt ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900

ctgctgagcg acatcctgag agtgaacacc gagatcacca aggcccccct gagcgcctct 960

atgatcaaga gatacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaagc tctcgtgcgg 1020

cagcagctgc ctgagaagta caaagagatt ttcttcgacc agagcaagaa cggctacgcc 1080

ggctacatcg atggcggagc cagccaggaa gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140

gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctc gtgaagctga acagagagga cctgctgcgg 1200

aagcagcgga ccttcgacaa cggcagcatc ccccaccaga tccacctggg agagctgcac 1260

gccattctgc ggcggcagga agatttttac ccattcctga aggacaaccg ggaaaagatc 1320

gagaagatcc tgaccttccg catcccctac tacgtgggcc ctctggccag gggaaacagc 1380

agattcgcct ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca ccccctggaa cttcgaggaa 1440

gtggtggaca agggcgccag cgcccagagc ttcatcgagc ggatgaccaa cttcgataag 1500

aacctgccca acgagaaggt gctgcccaag cacagcctgc tgtacgagta cttcaccgtg 1560

tacaacgagc tgaccaaagt gaaatacgtg accgagggaa tgagaaagcc cgccttcctg 1620

agcggcgagc agaaaaaagc catcgtggac ctgctgttca agaccaaccg gaaagtgacc 1680

gtgaagcagc tgaaagagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtggaaatc 1740

tccggcgtgg aagatcggtt caacgcctcc ctgggcacat accacgatct gctgaaaatt 1800

atcaaggaca aggacttcct ggacaatgag gaaaacgagg acattctgga agatatcgtg 1860

ctgaccctga cactgtttga ggacagagag atgatcgagg aacggctgaa aacctatgcc 1920

cacctgttcg acgacaaagt gatgaagcag ctgaagcggc ggagatacac cggctggggc 1980

aggctgagcc ggaagctgat caacggcatc cgggacaagc agtccggcaa gacaatcctg 2040

gatttcctga agtccgacgg cttcgccaac agaaacttca tgcagctgat ccacgacgac 2100

agcctgacct ttaaagagga catccagaaa gcccaggtgt ccggccaggg cgatagcctg 2160

cacgagcaca ttgccaatct ggccggcagc cccgccatta agaagggcat cctgcagaca 2220

gtgaaggtgg tggacgagct cgtgaaagtg atgggccggc acaagcccga gaacatcgtg 2280

atcgaaatgg ccagagagaa ccagaccacc cagaagggac agaagaacag ccgcgagaga 2340

atgaagcgga tcgaagaggg catcaaagag ctgggcagcc agatcctgaa agaacacccc 2400

gtggaaaaca cccagctgca gaacgagaag ctgtacctgt actacctgca gaatgggcgg 2460

gatatgtacg tggaccagga actggacatc aaccggctgt ccgactacga tgtggacgct 2520

atcgtgcctc agagctttct gaaggacgac tccatcgata acaaagtgct gactcggagc 2580

gacaagaacc ggggcaagag cgacaacgtg ccctccgaag aggtcgtgaa gaagatgaag 2640

aactactggc gccagctgct gaatgccaag ctgattaccc agaggaagtt cgacaatctg 2700

accaaggccg agagaggcgg cctgagcgaa ctggataagg ccggcttcat caagagacag 2760

ctggtggaaa cccggcagat cacaaagcac gtggcacaga tcctggactc ccggatgaac 2820

actaagtacg acgagaacga caaactgatc cgggaagtga aagtgatcac cctgaagtcc 2880

aagctggtgt ccgatttccg gaaggatttc cagttttaca aagtgcgcga gatcaacaac 2940

taccaccacg cccacgacgc ctacctgaac gccgtcgtgg gaaccgccct gatcaaaaag 3000

taccctaagc tggaaagcga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060

atgatcgcca agagcgagca ggaaatcggc aaggctaccg ccaagtactt cttctacagc 3120

aacatcatga actttttcaa gaccgagatt accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180

cctctgatcg agacaaacgg cgaaacaggc gagatcgtgt gggataaggg ccgggacttt 3240

gccaccgtgc ggaaagtgct gtctatgccc caagtgaata tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300

cagacaggcg gcttcagcaa agagtctatc ctgcccaaga ggaacagcga caagctgatc 3360

gccagaaaga aggactggga ccctaagaag tacggcggct tcgacagccc caccgtggcc 3420

tattctgtgc tggtggtggc caaagtggaa aagggcaagt ccaagaaact gaagagtgtg 3480

aaagagctgc tggggatcac catcatggaa agaagcagct tcgagaagaa tcccatcgac 3540

tttctggaag ccaagggcta caaagaagtg aaaaaggacc tgatcatcaa gctgcctaag 3600

tactccctgt tcgagctgga aaacggccgg aagagaatgc tggcctctgc cggcgaactg 3660

cagaagggaa acgaactggc cctgccctcc aaatatgtga acttcctgta cctggccagc 3720

cactatgaga agctgaaggg ctcccccgag gataatgagc agaaacagct gtttgtggaa 3780

cagcacaaac actacctgga cgagatcatc gagcagatca gcgagttctc caagagagtg 3840

atcctggccg acgctaatct ggacaaggtg ctgagcgcct acaacaagca cagagacaag 3900

cctatcagag agcaggccga gaatatcatc cacctgttta ccctgaccaa tctgggagcc 3960

cctgccgcct tcaagtactt tgacaccacc atcgaccgga agaggtacac cagcaccaaa 4020

gaggtgctgg acgccaccct gatccaccag agcatcaccg gcctgtacga gacacggatc 4080

gacctgtctc agctgggagg cgac 4104

<210> 8

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaagaacttt tgagcaagaa ttatcatctt gagaacgaag tggctcgtct taagaaaggt 60

tctggcagtg gaggttctgg ctccggatct ggtggttcgg gctcaggcgg gtccggatca 120

ggcgaagaac tgctttcaaa gaattaccac ctggaaaatg aggtagctag actgaaaaag 180

gggagcggaa gtgggggctc cgggtcgggc tcagggggct ccggttcggg aggctcaggg 240

tcgggggagg agttgctgag caaaaattat catttggaga acgaagtagc acgactaaag 300

aaagggtccg gatcgggtgg ttcaggatct ggatccggag gatcagggtc cggtgggtcg 360

ggctcaggag aggagttact ctcgaaaaat tatcatctcg aaaacgaagt ggctcggcta 420

aaaaagggca gtggttctgg aggatctggg tcggggtcag gcgggtctgg atctggggga 480

tctggatctg gtgaagagct attatctaaa aactaccacc tcgaaaatga ggtggcacgc 540

ttaaaaaagg gaagtggcag tggtgggtcg ggatctggct ctggtggctc aggctcggga 600

ggttcaggtt ccggggaaga gctactatcc aagaattatc atcttgagaa cgaggtagcg 660

cgtttgaaga agggttccgg ctcaggagga tctgggtcag gatcgggggg ttccgggtca 720

ggcgggtccg ggtcaggcga ggaactgctc tcgaagaact atcatcttga aaatgaggtc 780

gctcgattaa aaaagggatc gggcagtggt gggtccggct ccggttccgg aggatcggga 840

tctgggggct cgggatccgg ggaggaacta ctttcaaaga attaccacct cgaaaacgaa 900

gtagctcgat taaagaaagg ttcagggtcg ggtggctcag gttcgggatc aggtgggtca 960

ggctccggtg gttcaggttc gggagaagaa ttactgagta aaaattatca tctggaaaat 1020

gaggtagcga gactaaaaaa ggggagtggt tctggcggtt cgggatctgg ctctgggggc 1080

tctgggtcgg gagggtctgg gtctggcgag gaattgctat cgaaaaatta tcatcttgag 1140

aacgaagttg ctaggctcaa aaagggctca ggctcaggcg ggtccgggtc agggtcggga 1200

ggttccggat ccgggggatc aggctcaggg taa 1233

<210> 9

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgggccccg acatcgtgat gacccagagc cccagcagcc tgagcgccag cgtgggcgac 60

cgcgtgacca tcacctgccg cagcagcacc ggcgccgtga ccaccagcaa ctacgccagc 120

tgggtgcagg agaagcccgg caagctgttc aagggcctga tcggcggcac caacaaccgc 180

gcccccggcg tgcccagccg cttcagcggc agcctgatcg gcgacaaggc caccctgacc 240

atcagcagcc tgcagcccga ggacttcgcc acctacttct gcgccctgtg gtacagcaac 300

cactgggtgt tcggccaggg caccaaggtg gagctgaagc gcggcggcgg cggcagcggc 360

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcagc ggcggcggca gcgaggtgaa gctgctggag 420

agcggcggcg gcctggtgca gcccggcggc agcctgaagc tgagctgcgc cgtgagcggc 480

ttcagcctga ccgactacgg cgtgaactgg gtgcgccagg cccccggccg cggcctggag 540

tggatcggcg tgatctgggg cgacggcatc accgactaca acagcgccct gaaggaccgc 600

ttcatcatca gcaaggacaa cggcaagaac accgtgtacc tgcagatgag caaggtgcgc 660

agcgacgaca ccgccctgta ctactgcgtg accggcctgt tcgactactg gggccagggc 720

accctggtga ccgtgagcag ctacccatac gatgttccag attacgctgg tggaggcgga 780

ggttctgggg gaggaggtag tggcggtggt ggttcaggag gcggcggaag c 831

<210> 10

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agcaaaggag aagaactttt cactggagtt gtcccaattc ttgttgaatt agatggtgat 60

gttaatgggc acaaattttc tgtccgtgga gagggtgaag gtgatgctac aaacggaaaa 120

ctcaccctta aatttatttg cactactgga aaactacctg ttccgtggcc aacacttgtc 180

actactctga cctatggtgt tcaatgcttt tcccgttatc cggatcacat gaaacggcat 240

gactttttca agagtgccat gcccgaaggt tatgtacagg aacgcactat atctttcaaa 300

gatgacggga cctacaagac gcgtgctgaa gtcaagtttg aaggtgatac ccttgttaat 360

cgtatcgagt taaagggtat tgattttaaa gaagatggaa acattcttgg acacaaactc 420

gagtacaact ttaactcaca caatgtatac atcacggcag acaaacaaaa gaatggaatc 480

aaagctaact tcaaaattcg ccacaacgtt gaagatggtt ccgttcaact agcagaccat 540

tatcaacaaa atactccaat tggcgatggc cctgtccttt taccagacaa ccattacctg 600

tcgacacaat ctgtcctttc gaaagatccc aacgaaaagc gtgaccacat ggtccttctt 660

gagtttgtaa ctgctgctgg gattacacat ggcatggatg agctctacaa a 711

<210> 11

<211> 645

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 11

atggcagggg agaacttcgc tacgccgttc cacgggcacg tgggccgcgg cgccttcagc 60

gacgtgtacg agcccgcgga ggacacgttt ctgcttttgg acgcgctgga ggcagcggct 120

gccgaactgg caggagtgga aatatgcctg gaagtagggt cagggtctgg tgtagtatct 180

gcattcctag cctctatgat aggccctcag gctttgtaca tgtgcactga tatcaaccct 240

gaggcagcag cttgtaccct agagacagca cgctgtaaca aagttcacat tcaaccagtt 300

attacagatt tggtcaaagg cttgctacca agattgaccg aaaaagttga tcttctggtg 360

tttaatcccc cctatgtagt gactccacct caagaggtag gaagtcacgg aatagaggca 420

gcttgggctg gtggcagaaa tggtcgggaa gtcatggaca ggttttttcc cctggttcca 480

gatctccttt caccaagagg attattctat ttagttacca ttaaagaaaa caacccagaa 540

gaaattttga aaataatgaa gacaaaaggt ctgcaaggaa ccactgcact ttccagacaa 600

gcaggccaag aaactctttc agtcctcaag ttcaccaagt cttag 645

Claims (4)

1.一种作物基因组甲基化载体系统，其特征在于，所述载体系统是包含以下三个表达盒的表达载体：

表达盒1：由SEQ ID NO:1所示的启动子启动功能片段甲表达；所述功能片段甲包括SEQID NO:2所示的剪切酶Cre编码核苷酸序列(1116bp)；

表达盒2：由SEQ ID NO:3所示的启动子启动功能片段乙表达；所述功能片段乙包括SEQID NO:4所示的gRNA表达盒；

表达盒3由SEQ ID NO:5所示的启动子启动功能片段丙表达；所述功能片段丙是如下6个序列的组合：SEQ ID NO:6—SEQ ID NO:11所示的基因。

2.权利要求1所述的载体系统的用途，是对作物进行基因组甲基化。

3.权利要求2所述的用途，所述对作物进行基因组甲基化，是在高温胁迫条件下实现作物基因组特定位点DNA甲基化。

4.权利要求1所述的载体系统的应用方法，是将所述包含三个表达盒的表达载体导入受体作物。

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