JP2653653B2 - インターフエロン誘起遺伝子及び酵素 - Google Patents
インターフエロン誘起遺伝子及び酵素Info
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Description
【発明の詳細な説明】 インターフエロン誘起の（２′−５′）オリゴＡ合成酵
素遺伝子、mRNA、cDNA、および（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼ活性を保有する諸酵素 インターフエロンの生物学的影響の多くは、IFNにさ
らされた細胞で新しく誘起されるmRNAと蛋白とに仲介さ
れるように見える（抄録:Revel,1984;Lebleu and Conte
nt,1982;Baglioni and Nilson,1983）。これらのIFN−
誘起蛋白質のうち二群が特に重要である:1）翻訳調整諸
酵素（dsRNA依存蛋白キナーゼおよび（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼ，（２′−５′）オリゴＡで活性化
されたヌクレアーゼの２′−フオスフオ デイ エステ
ラーゼ）及び２）細胞表面諸抗原（HLA−A,B,C,B2−ミ
クログロブリン,HLA−DR）．他の細胞内蛋白質や放出蛋
白質も又重要な役目を演ずるであろう（Weil et al,198
3;Chebath et al,1983;Wallach et al,1983）。HLA遺伝
子を例外として（Malissen et al,1982;Schamboeck et
al,1983）,IFN−誘起の諸蛋白質の構造と場合によつて
は機能は不明であり、従つてそれに依つて諸IFNが特定
的にこれら諸遺伝子を活性化する機構も不明である。こ
れらの疑問に答えて、幾つかのIFN−誘起遺伝子のcDNA
が最近クローン化された（Chebath et al,1983;Merlin
et al,1983;Friedman et al,1984;Samanta et al,198
4）。特に、人間の（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼをコードしたcDNAと遺伝子が研究されて，その酵素は
dsRNM−誘起のものでATPをppp（A2′pA）ｎオリゴマー
に転換し（Kerr and Brown,1978），その代わりに潜在
のRNase Ｆに結合して活性化する（Schmidt et al,197
8）。この（２′−５′）オリゴＡシンセターゼは、こ
れら三型のヒトIFN総てで細胞内で強く誘起され、そし
てその増加は、IFN活性の優れた指標である（Wallach e
t al,1982）．この酵素は造血細胞の分化中に誘起さ
れ、IFN−βのオートクリン分泌を指示する（Yarden et
al,1984）．この酵素は後に胚の同調繊維芽細胞のＳ期
にも同様に誘起される（Wells and Mallucci,1985）．
この酵素活性は細胞生長が始まると低下し（Etienne−S
mekens et al,1983;Creasey et al,1983）そして、IFN
の反生長作用に関連しているように見える（Kimchi et
al,1981）．（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ又は
（２′−５′）オリゴＡ−誘起のRNaseF欠乏は、これが
IFNのウイルス生長抑制の唯一の機構では多分無いが、
（Lebleu and Content,1982），諸INFの抗ウイルス効果
の部分消滅と関連づけられて来た（Salzberg et al,198
3;Epstein et al,1981）． この（２′−５′）オリゴＡヌクレオチドは、多くの
真核生物細胞で検出され、バクテリアでさえ見出された
（Laurence et al,1984）。そして、この合成酵素は多
分広範囲に分布したものであろう。この酵素はマウスか
ら（Dougherty et al,1980）及びヒト細胞から（Yand e
t al,1981;Revel et al,1981）純化され、大小二型の酵
素が観察されているが（Revel et al,1982;St,Laurent
et al,1983）、構造は未解明である。
素遺伝子、mRNA、cDNA、および（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼ活性を保有する諸酵素 インターフエロンの生物学的影響の多くは、IFNにさ
らされた細胞で新しく誘起されるmRNAと蛋白とに仲介さ
れるように見える（抄録:Revel,1984;Lebleu and Conte
nt,1982;Baglioni and Nilson,1983）。これらのIFN−
誘起蛋白質のうち二群が特に重要である:1）翻訳調整諸
酵素（dsRNA依存蛋白キナーゼおよび（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼ，（２′−５′）オリゴＡで活性化
されたヌクレアーゼの２′−フオスフオ デイ エステ
ラーゼ）及び２）細胞表面諸抗原（HLA−A,B,C,B2−ミ
クログロブリン,HLA−DR）．他の細胞内蛋白質や放出蛋
白質も又重要な役目を演ずるであろう（Weil et al,198
3;Chebath et al,1983;Wallach et al,1983）。HLA遺伝
子を例外として（Malissen et al,1982;Schamboeck et
al,1983）,IFN−誘起の諸蛋白質の構造と場合によつて
は機能は不明であり、従つてそれに依つて諸IFNが特定
的にこれら諸遺伝子を活性化する機構も不明である。こ
れらの疑問に答えて、幾つかのIFN−誘起遺伝子のcDNA
が最近クローン化された（Chebath et al,1983;Merlin
et al,1983;Friedman et al,1984;Samanta et al,198
4）。特に、人間の（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼをコードしたcDNAと遺伝子が研究されて，その酵素は
dsRNM−誘起のものでATPをppp（A2′pA）ｎオリゴマー
に転換し（Kerr and Brown,1978），その代わりに潜在
のRNase Ｆに結合して活性化する（Schmidt et al,197
8）。この（２′−５′）オリゴＡシンセターゼは、こ
れら三型のヒトIFN総てで細胞内で強く誘起され、そし
てその増加は、IFN活性の優れた指標である（Wallach e
t al,1982）．この酵素は造血細胞の分化中に誘起さ
れ、IFN−βのオートクリン分泌を指示する（Yarden et
al,1984）．この酵素は後に胚の同調繊維芽細胞のＳ期
にも同様に誘起される（Wells and Mallucci,1985）．
この酵素活性は細胞生長が始まると低下し（Etienne−S
mekens et al,1983;Creasey et al,1983）そして、IFN
の反生長作用に関連しているように見える（Kimchi et
al,1981）．（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ又は
（２′−５′）オリゴＡ−誘起のRNaseF欠乏は、これが
IFNのウイルス生長抑制の唯一の機構では多分無いが、
（Lebleu and Content,1982），諸INFの抗ウイルス効果
の部分消滅と関連づけられて来た（Salzberg et al,198
3;Epstein et al,1981）． この（２′−５′）オリゴＡヌクレオチドは、多くの
真核生物細胞で検出され、バクテリアでさえ見出された
（Laurence et al,1984）。そして、この合成酵素は多
分広範囲に分布したものであろう。この酵素はマウスか
ら（Dougherty et al,1980）及びヒト細胞から（Yand e
t al,1981;Revel et al,1981）純化され、大小二型の酵
素が観察されているが（Revel et al,1982;St,Laurent
et al,1983）、構造は未解明である。
IFNにさらされた細胞内に誘起された（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼ（Hobanessian et al,1977;Zilbe
rstein et al,1978）は種々の異常な特性を持つ。その
主な活性は、ATPから５′三燐酸化短オリゴＡ鎖を合成
する事である（主として２連体から５連体、最長15連Ａ
の）が、他のRAN重合酵素と違つて、オリゴＡのアデニ
ン化物の２′OHに特定的にアデニン化物又はもう１つの
ヌクレオチドを添加（Kerr and Brown,1978;Samanta et
al,1980）するか、NADのようなフリー２′OHのアデニ
ン化物を持つた他の（オリゴ）又はクレオチド（Ball,1
980）又は、tRNAにさえ（Ferbas et al,1981）添加す
る。活性を保つためには、この酵素は、最短50bp以上の
RNA複鎖部分と結合しなければならない（Minks et,al,1
979）、従つて、幾つかの結合部分を所有しなければな
らない：ヌクレオチド三燐酸用、２′OHアデノシン ポ
リヌクレオチド用および複鎖RNA用。この酵素は、２′,
5′ADF−セフアロース（Johnston et al,1980）、ポリ
（rI）（rC）−アガロース（Horanessian et al,1977）
及びCibacronブルーセフアロース（Revel et al 1981）
に吸着する。細胞の違いによつて、この（２′−５′）
オリゴシンセターゼ活性はサイトゾル（Revel et al,19
81）中で見られたり、リボソーム塩洗出物（Dougherty
et al,1980）で見られたり、核液中であつたり（Nilsen
et al,1982b）、核膜にさえ多量に見出されている。細
胞RNAはこの酵素の活性化に際し、ポリ（rI）（rc）に
代行し得る事は注意すべきである（Revel et al,198
0）、このシンセターゼは、HnRNAの加工にさえ役割を持
つかも知れない（Nielsen et al,1982a）．（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの幾らかは細胞質膜に結合
し、出芽ウイルス粒に包含される（Wallach and Revel,
1980）．このような複雑な相互作用は、（２′−５′）
オリゴＡシステムの局所的作用を確保して（Nilsen and
Beglioni,1983）正常細胞、ウイルス感染細胞で指摘さ
れる複数の役割を説明可能にする。この合成酵素の含量
は、IFN−処理細胞の全蛋白質の0.1％以下であり、その
分子構造は直接に決定できなかつた。
オリゴＡシンセターゼ（Hobanessian et al,1977;Zilbe
rstein et al,1978）は種々の異常な特性を持つ。その
主な活性は、ATPから５′三燐酸化短オリゴＡ鎖を合成
する事である（主として２連体から５連体、最長15連Ａ
の）が、他のRAN重合酵素と違つて、オリゴＡのアデニ
ン化物の２′OHに特定的にアデニン化物又はもう１つの
ヌクレオチドを添加（Kerr and Brown,1978;Samanta et
al,1980）するか、NADのようなフリー２′OHのアデニ
ン化物を持つた他の（オリゴ）又はクレオチド（Ball,1
980）又は、tRNAにさえ（Ferbas et al,1981）添加す
る。活性を保つためには、この酵素は、最短50bp以上の
RNA複鎖部分と結合しなければならない（Minks et,al,1
979）、従つて、幾つかの結合部分を所有しなければな
らない：ヌクレオチド三燐酸用、２′OHアデノシン ポ
リヌクレオチド用および複鎖RNA用。この酵素は、２′,
5′ADF−セフアロース（Johnston et al,1980）、ポリ
（rI）（rC）−アガロース（Horanessian et al,1977）
及びCibacronブルーセフアロース（Revel et al 1981）
に吸着する。細胞の違いによつて、この（２′−５′）
オリゴシンセターゼ活性はサイトゾル（Revel et al,19
81）中で見られたり、リボソーム塩洗出物（Dougherty
et al,1980）で見られたり、核液中であつたり（Nilsen
et al,1982b）、核膜にさえ多量に見出されている。細
胞RNAはこの酵素の活性化に際し、ポリ（rI）（rc）に
代行し得る事は注意すべきである（Revel et al,198
0）、このシンセターゼは、HnRNAの加工にさえ役割を持
つかも知れない（Nielsen et al,1982a）．（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの幾らかは細胞質膜に結合
し、出芽ウイルス粒に包含される（Wallach and Revel,
1980）．このような複雑な相互作用は、（２′−５′）
オリゴＡシステムの局所的作用を確保して（Nilsen and
Beglioni,1983）正常細胞、ウイルス感染細胞で指摘さ
れる複数の役割を説明可能にする。この合成酵素の含量
は、IFN−処理細胞の全蛋白質の0.1％以下であり、その
分子構造は直接に決定できなかつた。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ含量測定値をin
vitro又はin vivoで、細胞がIFNにさらされ、それに反
応しているか否かの決定に使用できる。この測定は、未
知の溶液におけるIFNの検定に、細胞を刻溶液にさら
し、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ含量を決定す
る事で使用することができる（Revel et al.,米国特許
4,302,533）。この測定は人間を含む総ての生物でIFN生
産量が増したか否かを決めるのにも又使用できる。
vitro又はin vivoで、細胞がIFNにさらされ、それに反
応しているか否かの決定に使用できる。この測定は、未
知の溶液におけるIFNの検定に、細胞を刻溶液にさら
し、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ含量を決定す
る事で使用することができる（Revel et al.,米国特許
4,302,533）。この測定は人間を含む総ての生物でIFN生
産量が増したか否かを決めるのにも又使用できる。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ測定の臨床的反応 健康個体の末梢血液単核細胞（PBMC）では（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ含量が比較的に恒常である
ことがわかつている（Schattner et al,1981b）。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの増加は、急性ウ
イルス感染患者（Schattner et al.,1981b;Schoenfeld
et al.,1985）、持続性ウイルス感染（Wallach et al.,
1982）、自己免疫病及びヤコブ−クロイツフエルト等の
ような感染病と見られる幾つかの他の症候群（Revel et
al.,1982）などに見られる。（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼの基本含量は顆粒球では低いが、ウイルス
感染により大きく増量することがみられた（Schattner
et al.,1984）。AIDS患者のPBMCにおける（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ酵素増加が最近報告された
（Read et al.,1985）。動物の場合、（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼ量の増加は速く、IFNの血中出現よ
り恒常的である（Schattner et al.1982a）．（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ量は数週間高水準を保つの
に対してIFNの最高値は短期的である。
５′）オリゴＡシンセターゼ含量が比較的に恒常である
ことがわかつている（Schattner et al,1981b）。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの増加は、急性ウ
イルス感染患者（Schattner et al.,1981b;Schoenfeld
et al.,1985）、持続性ウイルス感染（Wallach et al.,
1982）、自己免疫病及びヤコブ−クロイツフエルト等の
ような感染病と見られる幾つかの他の症候群（Revel et
al.,1982）などに見られる。（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼの基本含量は顆粒球では低いが、ウイルス
感染により大きく増量することがみられた（Schattner
et al.,1984）。AIDS患者のPBMCにおける（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ酵素増加が最近報告された
（Read et al.,1985）。動物の場合、（２′−５′）オ
リゴＡシンセターゼ量の増加は速く、IFNの血中出現よ
り恒常的である（Schattner et al.1982a）．（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ量は数週間高水準を保つの
に対してIFNの最高値は短期的である。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの造血細胞分化
中の増加は、IFN−βのオートクリン分泌の結果である
（Yarden et al,1984）。急性白血病で多数の芽細胞と
共に（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ水準の低下が
見られる（Wallach et al.1982;Schattner et al,1982
b）． （２′−５′）オリゴＡシンセターゼ測定の重要な応
用分野の他の１つは、IFN治療患者の監視である。臨床
変化の他に、PBMCの（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼ水準を測定し、患者のIFN投与への反応を決定するこ
とができ、この全身投与の場合、IFN−αの投与でもIFN
−βの投与でも酵素水準は５−10倍の増大となる（Scha
ttner et al.,1981a,Schoenfeld et al.,1984）．他
の、IFN誘起の諸活性又は諸分子の検定は、（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ酵素の検定と同様に使用可
能であることは明らかであるが、この方法が最も広く用
いられている（Read et al.,1985;Merritt et al.,198
5）．これらの研究ではすべて、ATPの（２′−５′）
（Ａ）ｎ−オリゴマーへの転換を測定する酵素的検定を
用いている（Revel et al.,米国特許4,302,533）。
中の増加は、IFN−βのオートクリン分泌の結果である
（Yarden et al,1984）。急性白血病で多数の芽細胞と
共に（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ水準の低下が
見られる（Wallach et al.1982;Schattner et al,1982
b）． （２′−５′）オリゴＡシンセターゼ測定の重要な応
用分野の他の１つは、IFN治療患者の監視である。臨床
変化の他に、PBMCの（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼ水準を測定し、患者のIFN投与への反応を決定するこ
とができ、この全身投与の場合、IFN−αの投与でもIFN
−βの投与でも酵素水準は５−10倍の増大となる（Scha
ttner et al.,1981a,Schoenfeld et al.,1984）．他
の、IFN誘起の諸活性又は諸分子の検定は、（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ酵素の検定と同様に使用可
能であることは明らかであるが、この方法が最も広く用
いられている（Read et al.,1985;Merritt et al.,198
5）．これらの研究ではすべて、ATPの（２′−５′）
（Ａ）ｎ−オリゴマーへの転換を測定する酵素的検定を
用いている（Revel et al.,米国特許4,302,533）。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの検定には、抗
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼペプチド抗体を用
いることができる。（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼのための抗体入手には、種種の（２′−５′）オリゴ
Ａ諸シンセターゼの全アミノ酸配列からペプチド配列を
選び、内在（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ分子へ
の抗体誘起のための抗原に用いることができる。兎に抗
体を作らせる為に抗原ペプチドを皮下注射した。抗体反
応が最大となる迄促進注射を繰返した。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼペプチド抗体を用
いることができる。（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼのための抗体入手には、種種の（２′−５′）オリゴ
Ａ諸シンセターゼの全アミノ酸配列からペプチド配列を
選び、内在（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ分子へ
の抗体誘起のための抗原に用いることができる。兎に抗
体を作らせる為に抗原ペプチドを皮下注射した。抗体反
応が最大となる迄促進注射を繰返した。
今回の発明は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ
活性のある１つの酵素をコードするヒトDNAに関するも
のである。DNAの型の１つは第7A図に示したヌクレオチ
ド配列を持つ。他の型のDNAはFigure7Aに示し、第7B図
に示す901−1590のヌクレオチド配列と重複する１−132
2のヌクレオチド配列を持つ。
活性のある１つの酵素をコードするヒトDNAに関するも
のである。DNAの型の１つは第7A図に示したヌクレオチ
ド配列を持つ。他の型のDNAはFigure7Aに示し、第7B図
に示す901−1590のヌクレオチド配列と重複する１−132
2のヌクレオチド配列を持つ。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活性を持つ１つ
の酵素は、第7A図に示すアミノ酸配列を持つ。（２′−
５′）オリゴンＡシンセターゼ活性をもつもう１つの酵
素は、第7A図に示す１−364のアミノ酸配列を持ち、第7
B図に示す290−400のアミノ酸配列と重複する。
の酵素は、第7A図に示すアミノ酸配列を持つ。（２′−
５′）オリゴンＡシンセターゼ活性をもつもう１つの酵
素は、第7A図に示す１−364のアミノ酸配列を持ち、第7
B図に示す290−400のアミノ酸配列と重複する。
第7A図と第7B図のヌクレオチド配列と相補的なヌクレ
オチド配列を持つ1.6Kbと1.8KbのRNAが単離されてい
る。
オチド配列を持つ1.6Kbと1.8KbのRNAが単離されてい
る。
患者のインターフエロン投与に対する反応を監視する
方法は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼmRANの細
胞内又は体内濃度をそれに相補的なDNAとそのmRNAとを
ハイブリツド形成を行うことによつて測定することから
成つている。
方法は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼmRANの細
胞内又は体内濃度をそれに相補的なDNAとそのmRNAとを
ハイブリツド形成を行うことによつて測定することから
成つている。
現発明の抗原性蛋白質は第7A図と第7B図に示したアミ
ノ酸配列の中に含まれるアミノ酸配列を持つ。この抗原
諸ペプチドに対して生じた諸抗体は（２′−５′）オリ
ゴＡシンセターゼを認識し、免疫沈澱を行う。
ノ酸配列の中に含まれるアミノ酸配列を持つ。この抗原
諸ペプチドに対して生じた諸抗体は（２′−５′）オリ
ゴＡシンセターゼを認識し、免疫沈澱を行う。
被検体でのインターフエロン活性を監視する方法は、
被検体の細胞内又は体液の（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼ含量を、既定の時間隔で測定する事、被検体の
細胞内又は体液内でのシンセターゼ含有量の相異を種々
の時間隔で決定し、そこから被検体の細胞内や体液内で
のシンセターゼの量を決定し、それによつて被検体のイ
ンターフエロン活性をはかるものである。このシンセタ
ーゼは、シンセターゼを今回の発明による抗体と接触さ
せて複合体を作り、作られた複合体の量を決定すること
によつて測定される。
被検体の細胞内又は体液の（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼ含量を、既定の時間隔で測定する事、被検体の
細胞内又は体液内でのシンセターゼ含有量の相異を種々
の時間隔で決定し、そこから被検体の細胞内や体液内で
のシンセターゼの量を決定し、それによつて被検体のイ
ンターフエロン活性をはかるものである。このシンセタ
ーゼは、シンセターゼを今回の発明による抗体と接触さ
せて複合体を作り、作られた複合体の量を決定すること
によつて測定される。
更に、今回の発明は（２′−５′）オリゴＡシンセタ
ーゼの２つの抗体に関するもので、その抗体は、（２′
−５′）オリゴＡシンセターゼのアミノ酸配列の一部を
持つ抗原を調整することにより得られるものである。そ
の抗−（２′−５′）オリゴシンセターゼペプチド抗体
は、その酵素を検出する為に使用できるものである。
ーゼの２つの抗体に関するもので、その抗体は、（２′
−５′）オリゴＡシンセターゼのアミノ酸配列の一部を
持つ抗原を調整することにより得られるものである。そ
の抗−（２′−５′）オリゴシンセターゼペプチド抗体
は、その酵素を検出する為に使用できるものである。
図面の概説 第１図は（２′−５′）オリゴＡシンセターゼE1cDNA
クローン174−３の構造と配列とを示す： 第1A図はE1cDNAクローン174−３の制限酵素切断位置
地図を示す。挿入の諸塩基対は、pBR322DNAと同じ順序
で番号付けしてある。pBREcoRI位置は右にある。挿入の
どちらの鎖も（点線）、縦線で示した制限切断位置から
配列決定をした（Maxam ＆ Gilbert,1980）。コード鎖
は、右から左に向つて５′から３′のものである。右Ps
t１位置につづいて17Gと72Tがあり、２ヌクレオチドのG
Aが続き、（Ｂ）に示した配列であり従つて尾の一部で
ない3Tと続く。３′の末端には45Aと10Cの尾があり左Pc
t１位置で終結する。
クローン174−３の構造と配列とを示す： 第1A図はE1cDNAクローン174−３の制限酵素切断位置
地図を示す。挿入の諸塩基対は、pBR322DNAと同じ順序
で番号付けしてある。pBREcoRI位置は右にある。挿入の
どちらの鎖も（点線）、縦線で示した制限切断位置から
配列決定をした（Maxam ＆ Gilbert,1980）。コード鎖
は、右から左に向つて５′から３′のものである。右Ps
t１位置につづいて17Gと72Tがあり、２ヌクレオチドのG
Aが続き、（Ｂ）に示した配列であり従つて尾の一部で
ない3Tと続く。３′の末端には45Aと10Cの尾があり左Pc
t１位置で終結する。
第1B図は細長のコード枠を持つたヌクレオチド配列を
示す。最初のＴはヌクレオチド92であり、挿入の尾（Ａ
の右端）の後に位置する。挿入部のSau3A1位置とEcoR1
位置は示した配列の夫々129と480に当る。
示す。最初のＴはヌクレオチド92であり、挿入の尾（Ａ
の右端）の後に位置する。挿入部のSau3A1位置とEcoR1
位置は示した配列の夫々129と480に当る。
Figure2はSV80とNamalva細胞内のE1特定の諸mRNAの大
きさとその誘導を示す。
きさとその誘導を示す。
第2A図はクローンE1のニツクトランスレーシヨンを行
つた［32P］−cDNAのSV80細胞からの変成ポリA+−RNA電
気泳動諸ブロツトへの交配を示す。その諸RNAはIFN−ベ
ーター１の添加から、示してある時間数の後に調整され
た。RNAの見かけの大きさはオートラジオグラフイに示
される。左レーン:rRNA諸マーカー。
つた［32P］−cDNAのSV80細胞からの変成ポリA+−RNA電
気泳動諸ブロツトへの交配を示す。その諸RNAはIFN−ベ
ーター１の添加から、示してある時間数の後に調整され
た。RNAの見かけの大きさはオートラジオグラフイに示
される。左レーン:rRNA諸マーカー。
第2B図は第2A図と同じくIFN−アルフアで示したある
時間数の処理をしたNamalva細胞よりのRNAである。左レ
ーン:rRNA諸マーカー。
時間数の処理をしたNamalva細胞よりのRNAである。左レ
ーン:rRNA諸マーカー。
第３図はIFN−処理したSV80細胞（Ｉ）又は非処理細
胞（Ｃ）からのIFN−誘起のmRNAポリ（Ａ）+RNAの為のc
DNAを含んだ組換プラズミドクローンC56のRNA諸ブロツ
トへの交配による特性決定を示し、７ミクログラムがア
ガロースゲルで電気泳動され、ニトロセルローズにブロ
ツトの後に、C56クローン、ヒトHLA cDNAクローン又は
ラツトのチユブリンcDNAクローンのいずれかの、ニツク
トランスレーシヨンを行つた［32P］−プラズミドDNAと
交配した。接触時間は48時間である。リボソームRNAマ
ーカーの放射性18Sの位置が示してある。
胞（Ｃ）からのIFN−誘起のmRNAポリ（Ａ）+RNAの為のc
DNAを含んだ組換プラズミドクローンC56のRNA諸ブロツ
トへの交配による特性決定を示し、７ミクログラムがア
ガロースゲルで電気泳動され、ニトロセルローズにブロ
ツトの後に、C56クローン、ヒトHLA cDNAクローン又は
ラツトのチユブリンcDNAクローンのいずれかの、ニツク
トランスレーシヨンを行つた［32P］−プラズミドDNAと
交配した。接触時間は48時間である。リボソームRNAマ
ーカーの放射性18Sの位置が示してある。
第４図はC56 450bp挿入部の制限酵素切断位置地図の
一部とヌクレオチド配列を示す。C56プラスミドはHind
３で消化し、アルフアー［32P］−dCTPを用いてDNAポリ
メラーゼＩ−大断片（クレノウ酵素、Boehringer）で標
識され、そのHind３−Pst１断片が１％アガロースゲル
上で分離された。相補鎖の配列を決めるため、そのプラ
スミドのBg12位置をガンマ［32P］−ATPを用いてT4−ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Biolabs）で５′−標識をし
た後にそのBgl２−Pst１断片を分離した。配列決定はMa
xam and Gilbert法で行つた。コード鎖Ａの配列（右か
ら左へ）は下のパネルに示してある。Ａ鎖配列の最初の
２個のチミヂン残基は多分上部の図にあるAT尾に対応す
るのであろう。
一部とヌクレオチド配列を示す。C56プラスミドはHind
３で消化し、アルフアー［32P］−dCTPを用いてDNAポリ
メラーゼＩ−大断片（クレノウ酵素、Boehringer）で標
識され、そのHind３−Pst１断片が１％アガロースゲル
上で分離された。相補鎖の配列を決めるため、そのプラ
スミドのBg12位置をガンマ［32P］−ATPを用いてT4−ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Biolabs）で５′−標識をし
た後にそのBgl２−Pst１断片を分離した。配列決定はMa
xam and Gilbert法で行つた。コード鎖Ａの配列（右か
ら左へ）は下のパネルに示してある。Ａ鎖配列の最初の
２個のチミヂン残基は多分上部の図にあるAT尾に対応す
るのであろう。
第５図はIFNによるC56 mRNA誘起の時間経過を示す： 第5A図はポリ（Ａ）+RNAでIFN−アルフア1000U/mlで
示された時間数の処理を受けたNamalva細胞からの７ミ
クログラムをアガロースゲルで電気泳動し、ブロツトし
た後にニツクトランスレーシヨンを行つた［32P］−C56
プラスミドDNAと交配したものを示す。
示された時間数の処理を受けたNamalva細胞からの７ミ
クログラムをアガロースゲルで電気泳動し、ブロツトし
た後にニツクトランスレーシヨンを行つた［32P］−C56
プラスミドDNAと交配したものを示す。
第5B図はポリ（Ａ）+RNAで、200U/mlのIFN−ベータで
示された時間数処理したSV80細胞からの７ミクログラム
のものを示す。星マークは単クローン抗体のカラム（２
×108U/mg）で純化したIFN−ベーター１で処理した細胞
から得たRNAを示す。
示された時間数処理したSV80細胞からの７ミクログラム
のものを示す。星マークは単クローン抗体のカラム（２
×108U/mg）で純化したIFN−ベーター１で処理した細胞
から得たRNAを示す。
第5C図はポリ（Ａ）+RNAで、（5B）と同様に処理した
SV80からの１マイクログラムがC56DNAの断片１（Fig.4
を見よ）の３′末端に標識したもと液中交配したものを
示す。交配体はS1−ヌクレアーゼで処理し、変性ゲルで
分析した。mRNA−交雑検針（→）は自己再結合のもの より短かい。
SV80からの１マイクログラムがC56DNAの断片１（Fig.4
を見よ）の３′末端に標識したもと液中交配したものを
示す。交配体はS1−ヌクレアーゼで処理し、変性ゲルで
分析した。mRNA−交雑検針（→）は自己再結合のもの より短かい。
第６図は（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの1.6
及び1.8Kb mRNAのための諸cDNAの制限酵素切断地図を
示す。
及び1.8Kb mRNAのための諸cDNAの制限酵素切断地図を
示す。
第6A図は1.6KbのcDNAの地図である。E1cDNA（Merlin
et al.,1983）の位置とラムダgt10cDNAのものが示して
ある。pAはポリアデニレーシヨンの起る位置である。エ
クソンの端は縦点線で示してある。各エクソンを持つゲ
ノムDNA諸断片の大きさは括弧内に示す。縦矢は1.8Kb
RNAに更に存在するスプライス位置を示す。９−21及び
５−−21両CDNAの配列決定法を示した。３′EcoR1位置
（Ｅ）からPst１位置（Ｐ）の配列はE1 cDNAの中で決
定した（Merlin et al.,1983）． 第6B図は1.8Kb cDNAの地図である。ラムダgt10クロ
ーン48−１は1.8Kb RNAのエクソン８を含むゲノム断片
Pst１−Psｔ−１を用いて分離した。（図９）諸エクソ
ンは1.6KbのE1cDNAの場合と同じく番付けした。切詰め
たエクソン７は7aとした。
et al.,1983）の位置とラムダgt10cDNAのものが示して
ある。pAはポリアデニレーシヨンの起る位置である。エ
クソンの端は縦点線で示してある。各エクソンを持つゲ
ノムDNA諸断片の大きさは括弧内に示す。縦矢は1.8Kb
RNAに更に存在するスプライス位置を示す。９−21及び
５−−21両CDNAの配列決定法を示した。３′EcoR1位置
（Ｅ）からPst１位置（Ｐ）の配列はE1 cDNAの中で決
定した（Merlin et al.,1983）． 第6B図は1.8Kb cDNAの地図である。ラムダgt10クロ
ーン48−１は1.8Kb RNAのエクソン８を含むゲノム断片
Pst１−Psｔ−１を用いて分離した。（図９）諸エクソ
ンは1.6KbのE1cDNAの場合と同じく番付けした。切詰め
たエクソン７は7aとした。
第7A図と第7B図は２個の（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼcDNAのヌクレオチド配列を示す。1.8Kb cDNA
クローン48−１の諸ヌクレオチドは1.6Kb cDNAクロー
ン９−21に準じて番付けした。アミノ酸の番付けは括弧
内に示す。翻訳はATGATG配列の第１又は第２のコドンか
ら始まる。諸エクソンの端は縦棒で示してある。（Glyc
os.）はE18の中にあるグリコキシレーシヨンの可能性位
置を示す。多分対立形質の相異による単塩基変異はクロ
ーンとゲノムDNAの相異として1.6Kb配列の376番（Ｔと
Ｃ）、525番（ＧとＡ）、807（ＧとＣ）、811（Ａと
Ｇ）;1.8Kb配列の1087（ＧとＡ）、1115（ＧとＣ）とし
て発見された。
セターゼcDNAのヌクレオチド配列を示す。1.8Kb cDNA
クローン48−１の諸ヌクレオチドは1.6Kb cDNAクロー
ン９−21に準じて番付けした。アミノ酸の番付けは括弧
内に示す。翻訳はATGATG配列の第１又は第２のコドンか
ら始まる。諸エクソンの端は縦棒で示してある。（Glyc
os.）はE18の中にあるグリコキシレーシヨンの可能性位
置を示す。多分対立形質の相異による単塩基変異はクロ
ーンとゲノムDNAの相異として1.6Kb配列の376番（Ｔと
Ｃ）、525番（ＧとＡ）、807（ＧとＣ）、811（Ａと
Ｇ）;1.8Kb配列の1087（ＧとＡ）、1115（ＧとＣ）とし
て発見された。
第８図はE16とE18の（２′−５′）オリゴＡシンセタ
ーゼのＣ−末端のハイドロパシ−プロツトを示す。Kyte
とDolittle（1982）のコンピユータープログラムを用い
た。疎水的部分は中央の線の上にある。E18の酸性部位
はFigure7のアミノ酸の353から358に相当する。
ーゼのＣ−末端のハイドロパシ−プロツトを示す。Kyte
とDolittle（1982）のコンピユータープログラムを用い
た。疎水的部分は中央の線の上にある。E18の酸性部位
はFigure7のアミノ酸の353から358に相当する。
第９図はヒト（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ遺
伝子の制限酵素切断位置地図を示す。三つの重複するゲ
ノムクローンから作成した地図は1.6Kb RNAの７つのエ
クソンと1.8Kb RNA（黒棒）に更に１つある８番目のエ
クソンを示す。挿入は、ゲノムDNAのサザンブロツトと
プローブ用の48−1cDNAのものを示す。Slol1はDaudi DN
A;Slot2は２倍体繊維芽細胞FS11のDNA。
伝子の制限酵素切断位置地図を示す。三つの重複するゲ
ノムクローンから作成した地図は1.6Kb RNAの７つのエ
クソンと1.8Kb RNA（黒棒）に更に１つある８番目のエ
クソンを示す。挿入は、ゲノムDNAのサザンブロツトと
プローブ用の48−1cDNAのものを示す。Slol1はDaudi DN
A;Slot2は２倍体繊維芽細胞FS11のDNA。
第10図はヒト（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ遺
伝子のプロモーター部分を示す。Sph１−Sph１間の0.85
Kb断片で、Figure9の4.2Kb EcoR1ゲノムDNA断片に由来
するものの制限酵素切断位置地図を示す。諸mRNAの５′
末端はcapとマークしてある。
伝子のプロモーター部分を示す。Sph１−Sph１間の0.85
Kb断片で、Figure9の4.2Kb EcoR1ゲノムDNA断片に由来
するものの制限酵素切断位置地図を示す。諸mRNAの５′
末端はcapとマークしてある。
第11図はヒト（２′−５′）オリゴＡシンセターゼプ
ロモーター部位を示す。Figure10で示したSau3a−Hpa１
断片の配列は、ヒトIFN−ベーター１遺伝子のプロモー
ター部位との対比のためにならべた（Degrava et al.,1
981）。番付けはcap位置と予想される部分から始まる。
IFN−ベーター１プロモーター内で約−75に位置するプ
リンに富んだ転写制御配列（Zinn et al.,1983）で、−
10附近で繰返されるものは、アンダーラインで示した。
TATAボツクスは二重アンダーラインとした。
ロモーター部位を示す。Figure10で示したSau3a−Hpa１
断片の配列は、ヒトIFN−ベーター１遺伝子のプロモー
ター部位との対比のためにならべた（Degrava et al.,1
981）。番付けはcap位置と予想される部分から始まる。
IFN−ベーター１プロモーター内で約−75に位置するプ
リンに富んだ転写制御配列（Zinn et al.,1983）で、−
10附近で繰返されるものは、アンダーラインで示した。
TATAボツクスは二重アンダーラインとした。
第12図は合成ペプチドに抗血清で免疫沈澱させたIFN
処理のWISH細胞からの35S−メチオニンで標識した蛋白
質のSDS−アクリルアミドゲル電気泳動を示す。
処理のWISH細胞からの35S−メチオニンで標識した蛋白
質のSDS−アクリルアミドゲル電気泳動を示す。
第13図はE16cDNAの大腸菌内発現を示す。大腸菌の溶
原菌Agt11−E16で42℃でIPTGによつて誘起されたものの
抽出物はポリ（rI）（rC）アガロース粒上で（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼについて検定した。Cont＝
lacZ遺伝子の配向と逆配向のE16cDNAを用いた大腸菌の
抽出物.Nam＝IFN−処理Namalva細胞の抽出物。アルカリ
フオスターゼで作用させ、32P−ａ−ATPで標識した産物
のpH3.5による電気泳動が示してある。
原菌Agt11−E16で42℃でIPTGによつて誘起されたものの
抽出物はポリ（rI）（rC）アガロース粒上で（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼについて検定した。Cont＝
lacZ遺伝子の配向と逆配向のE16cDNAを用いた大腸菌の
抽出物.Nam＝IFN−処理Namalva細胞の抽出物。アルカリ
フオスターゼで作用させ、32P−ａ−ATPで標識した産物
のpH3.5による電気泳動が示してある。
第14図はヒト末梢白血球中の（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼRNAの迅速なアツセイ法を図示している。
シンセターゼRNAの迅速なアツセイ法を図示している。
第15図は、Figure14の方法に従つての、ヒトPBMCの
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ、ERNAに対するク
イツクセルブロツトを図示している。示されている番号
の細胞とインターフエロン（16H処理）を用いた。
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ、ERNAに対するク
イツクセルブロツトを図示している。示されている番号
の細胞とインターフエロン（16H処理）を用いた。
32P−cDNAに関してオートラジオグラフイーを行つ
た。
た。
第16図は、抗−Ｂ及び抗−Ｃ IgG−タンパク−Ａ−
セフアロースに吸着されている（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼ活性が例に示されているように測定された
ことを図示している。下のスキームは、Benechら（1985
b）によつて配列が決定された２つの（２′−５′）オ
リゴＡシンテターゼの型、E16とE18におけるペプチドＢ
とペプチドＣの位置を示している。黒く塗つた領域は、
E16がE18分子と異なつている部分を示している。
セフアロースに吸着されている（２′−５′）オリゴＡ
シンセターゼ活性が例に示されているように測定された
ことを図示している。下のスキームは、Benechら（1985
b）によつて配列が決定された２つの（２′−５′）オ
リゴＡシンテターゼの型、E16とE18におけるペプチドＢ
とペプチドＣの位置を示している。黒く塗つた領域は、
E16がE18分子と異なつている部分を示している。
第17図は例２に記載のヒト細胞由来の抽出物の電気泳
動およびイムノブロツテイングを示す。（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼの４型の位置は各ブロツトＭ＝14
C−タン白分子量マーカーの右側の数により示す。IFN処
理は＋により示す。
動およびイムノブロツテイングを示す。（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼの４型の位置は各ブロツトＭ＝14
C−タン白分子量マーカーの右側の数により示す。IFN処
理は＋により示す。
第18図はアンチ−（２′−５′）オリゴＡシンセター
ゼ ペプチドＢをもつヒトSV80細胞由来の抽出物の電気
泳動イムノブロツトを示す。左：粗細胞質抽出物（S1.
5）、細胞液（S100）およびミクロソーム（P100）。
右：ミクロソーム（DOC−可溶性）のナトリウムデオキ
シコレート10％抽出物、ミクロソームの高塩洗浄（RW
F）および塩抽出後のミクロソームペレツト（ミクロソ
ーム−KCl）。
ゼ ペプチドＢをもつヒトSV80細胞由来の抽出物の電気
泳動イムノブロツトを示す。左：粗細胞質抽出物（S1.
5）、細胞液（S100）およびミクロソーム（P100）。
右：ミクロソーム（DOC−可溶性）のナトリウムデオキ
シコレート10％抽出物、ミクロソームの高塩洗浄（RW
F）および塩抽出後のミクロソームペレツト（ミクロソ
ーム−KCl）。
第19図はS100の分画化およびDNAE−セルロースとカル
ボキシメチルセルロースによるミクロソームの高塩洗浄
（RWF）続くグリセロール勾配を示す。アンチ−Ｂによ
り示した（２′−５′）オリゴＡシンセターゼプロフイ
ルとタン白は勾配の下に示す。電気泳動イムノブロツト
は左のブロツトに対するフラクシヨン CM（DEAE−セルロースに吸着されないS100タン白由来の
CM−セルロース溶離液）を示す。左側のブロツトフラク
シヨンに、 DE（RWFのDEAE−セルロース溶離液）とフラクシヨンGG
（フラクシヨンDEのグリセロール勾配からの80−100Kd
のヘビイーピーク）。
ボキシメチルセルロースによるミクロソームの高塩洗浄
（RWF）続くグリセロール勾配を示す。アンチ−Ｂによ
り示した（２′−５′）オリゴＡシンセターゼプロフイ
ルとタン白は勾配の下に示す。電気泳動イムノブロツト
は左のブロツトに対するフラクシヨン CM（DEAE−セルロースに吸着されないS100タン白由来の
CM−セルロース溶離液）を示す。左側のブロツトフラク
シヨンに、 DE（RWFのDEAE−セルロース溶離液）とフラクシヨンGG
（フラクシヨンDEのグリセロール勾配からの80−100Kd
のヘビイーピーク）。
第20図はSV80細胞からの（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼの種々の型にRNA複鎖の要求されるものを示
す。諸断片はFigure19に準じて標識した。酵素活性はポ
リ（rI）（rc）の示された濃度について測定した。
セターゼの種々の型にRNA複鎖の要求されるものを示
す。諸断片はFigure19に準じて標識した。酵素活性はポ
リ（rI）（rc）の示された濃度について測定した。
第21図は例３に述べられたように抗−Ｂ IgGと125I
−蛋白質Ａを用いて行つた（２′−５′）オリゴンＡシ
ンセターゼの放射線−免疫検定を示す。オートラジオズ
ラフイーが示してある。細胞は500U/mlのIFN−β１で16
時間処理か又は無処理であつた。
−蛋白質Ａを用いて行つた（２′−５′）オリゴンＡシ
ンセターゼの放射線−免疫検定を示す。オートラジオズ
ラフイーが示してある。細胞は500U/mlのIFN−β１で16
時間処理か又は無処理であつた。
第22図はウイルス病患者の血液から得たリンパ球（中
段）の（２′−５′）オリゴＡシンセターゼレベルの上
昇を免疫蛍光顕微鏡で検知するに抗−Ｂを用いる事を示
す。右：正常血清によるコントロール：左：抗−Ｂ色素
入りの健康献血者の血液。（リンパ球は染色しない、マ
クロフアージ又は顆粒白血球が不特定のバツクグラウン
ドを為す。
段）の（２′−５′）オリゴＡシンセターゼレベルの上
昇を免疫蛍光顕微鏡で検知するに抗−Ｂを用いる事を示
す。右：正常血清によるコントロール：左：抗−Ｂ色素
入りの健康献血者の血液。（リンパ球は染色しない、マ
クロフアージ又は顆粒白血球が不特定のバツクグラウン
ドを為す。
発明の詳説 現発明は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活性
を持つ酵素のコードを持つたヒトDNAで、第7A図に示す
ヌクレオチド配列を持つものに関している。このDNAは
第7A図に示した１−1322のヌクレオチド配列でも、又第
7B図に示したそれと重複する901−1590のヌクレオチド
配列であつても良い。現発明のDNAは、第９図に示した
制限酵素切断位置を持つ。
を持つ酵素のコードを持つたヒトDNAで、第7A図に示す
ヌクレオチド配列を持つものに関している。このDNAは
第7A図に示した１−1322のヌクレオチド配列でも、又第
7B図に示したそれと重複する901−1590のヌクレオチド
配列であつても良い。現発明のDNAは、第９図に示した
制限酵素切断位置を持つ。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活性を持つ酵素
は、第7A図に示すアミノ三配列を持つ。この酵素は約36
4のアミノ酸より成り、約41,500ダルトンの分子量を示
す。他の酵素で（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活
性を持つものは、第7A図に示す１−364のアミノ酸配列
に加えて第7B図に示す290−400のアミノ酸配列を持つ。
この酵素は約400のアミノ酸より成り、その分子量は約4
6,000ダルトンである。
は、第7A図に示すアミノ三配列を持つ。この酵素は約36
4のアミノ酸より成り、約41,500ダルトンの分子量を示
す。他の酵素で（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活
性を持つものは、第7A図に示す１−364のアミノ酸配列
に加えて第7B図に示す290−400のアミノ酸配列を持つ。
この酵素は約400のアミノ酸より成り、その分子量は約4
6,000ダルトンである。
現発明は第7A図に示したヌクレオチド配列と相補のヌ
クレオチド配列を持つた1.6KbのRNAを提供する。第7A図
に示す１−1322のヌクレオチド配列に相補的であると同
時にFigure7Bに示す901−1590にも相補的であるヌクレ
オチド配列より成る1.8Kb RNAも提供する。
クレオチド配列を持つた1.6KbのRNAを提供する。第7A図
に示す１−1322のヌクレオチド配列に相補的であると同
時にFigure7Bに示す901−1590にも相補的であるヌクレ
オチド配列より成る1.8Kb RNAも提供する。
現発明の転移ベクターは現発明のlambda−gt 11−E16
DNAとlacZ遺伝子とより成り、そのDNAはlacZ遺伝子と
相的に接着していて、適当な寄主細胞中でDNA発現を可
能にする。微生物はこの転移ベクターで形質転換を受け
る。大腸菌はこの形質転換に適した微生物である。
DNAとlacZ遺伝子とより成り、そのDNAはlacZ遺伝子と
相的に接着していて、適当な寄主細胞中でDNA発現を可
能にする。微生物はこの転移ベクターで形質転換を受け
る。大腸菌はこの形質転換に適した微生物である。
患者のインターフエロンに対する反応を監視する方法
は、患者の細胞又は体液の（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼmRNAの濃度をこれと相補のDNAで交配させて測
定する事より成る。そのmRNAは現発明の1.6Kb又は1.8Kb
のRNAであろう。
は、患者の細胞又は体液の（２′−５′）オリゴＡシン
セターゼmRNAの濃度をこれと相補のDNAで交配させて測
定する事より成る。そのmRNAは現発明の1.6Kb又は1.8Kb
のRNAであろう。
インターフエロンに対する細胞や組織の反応の評価の
方法はインターフエロンで処理した細胞又は組織より得
たRNAをそのRNAと相補のcDNAと交配し、その交雑量を決
定することより成る。そのRNAはインターフエロンにさ
らした細胞又は組織から抽出し、膜フイルター上で固定
し、インターフエロン−誘起したmRNAに特定の、標識付
CDNで交配する。この方法は組織切片を標識付CDNAで原
位置交雑し、顕微鏡観察オートグラフイ又は蛍光で標価
する事より成る。分析する細胞又は組織はヒト又は他の
動物起源であろう。
方法はインターフエロンで処理した細胞又は組織より得
たRNAをそのRNAと相補のcDNAと交配し、その交雑量を決
定することより成る。そのRNAはインターフエロンにさ
らした細胞又は組織から抽出し、膜フイルター上で固定
し、インターフエロン−誘起したmRNAに特定の、標識付
CDNで交配する。この方法は組織切片を標識付CDNAで原
位置交雑し、顕微鏡観察オートグラフイ又は蛍光で標価
する事より成る。分析する細胞又は組織はヒト又は他の
動物起源であろう。
細胞又は組織のインターフエロンに対する反応を評価
する方法を実施する為のキツトには、第7A図又は第7B図
に示すた配列に相補のcDNA、デオキシリボヌクレアーゼ
Ｉと［32P］−ガンマ−dCTPで割れ目移動をする際の交
雑テストを実施するに必要な試薬類、ニトロセルローズ
膜上で交雑する為の試薬類および細胞からRNAを抽出す
るための試薬類を含んでいる。
する方法を実施する為のキツトには、第7A図又は第7B図
に示すた配列に相補のcDNA、デオキシリボヌクレアーゼ
Ｉと［32P］−ガンマ−dCTPで割れ目移動をする際の交
雑テストを実施するに必要な試薬類、ニトロセルローズ
膜上で交雑する為の試薬類および細胞からRNAを抽出す
るための試薬類を含んでいる。
第7A図と第7B図に示したアミノ酸配列に含まれるアミ
ノ酸配列を持つた抗原性諸ペプチドも又提供されてい
る。
ノ酸配列を持つた抗原性諸ペプチドも又提供されてい
る。
現発明による抗原性ペプチドの１つはＣ−末端アミノ
酸の17個を第7A図に示した配列で所持し、そのアミノ酸
配列がARG−PRO−PRO−ALA−SER−SER−LEU−PRO−PHE
−ILE−PRO−ALA−PRO−LEU−HIS−GLU−ALAである。も
う一つの抗原性ペプチドのアミノ酸配列は、GLU−LYS−
TYR−LEU−ARG−ARG−GLN−LEU−THR−LYS−PRO−ARG−
PRO−VAL−ILE−LEU−ASP−PRO−ALA−ASPである。
酸の17個を第7A図に示した配列で所持し、そのアミノ酸
配列がARG−PRO−PRO−ALA−SER−SER−LEU−PRO−PHE
−ILE−PRO−ALA−PRO−LEU−HIS−GLU−ALAである。も
う一つの抗原性ペプチドのアミノ酸配列は、GLU−LYS−
TYR−LEU−ARG−ARG−GLN−LEU−THR−LYS−PRO−ARG−
PRO−VAL−ILE−LEU−ASP−PRO−ALA−ASPである。
現発明の抗原性両ペプチドに対して生ずる諸抗体は
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼを識別し、免疫沈
澱する。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼを識別し、免疫沈
澱する。
被験体でのインターフエロン活性を監視する方法は、
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの細胞又は体液中
での濃度を既定の時間間隔で測定し、被験体の細胞又は
体液中の該シンセターゼ量の相異を、異なる時間間隔の
間で決定し、それから被験体でのシンセターゼの量を決
定し、それにより被験体でのインターフエロン活性を決
める事より成る。シンセターゼの量はそのシンセターゼ
を現発明の抗体と接触させ、そこで複合体を形成し、こ
の形成された複合体量決定する事から測定される。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの細胞又は体液中
での濃度を既定の時間間隔で測定し、被験体の細胞又は
体液中の該シンセターゼ量の相異を、異なる時間間隔の
間で決定し、それから被験体でのシンセターゼの量を決
定し、それにより被験体でのインターフエロン活性を決
める事より成る。シンセターゼの量はそのシンセターゼ
を現発明の抗体と接触させ、そこで複合体を形成し、こ
の形成された複合体量決定する事から測定される。
インターフエロン活性を監視する方法は、更に（２′
−５′）オリゴＡシンセターゼをインターフエロンにさ
らした細胞又は体液から抽出し、この抽出シンセターゼ
を識別し得るマーカーで標識付をしてラベル付シンセタ
ーゼを作り、このラベル付シンセターゼを現発明の抗体
と適当な条件下で接触させて、標識付のシンセターゼ−
抗体複合体を作らせ、複合体中の標識を検出し、それに
よつてシンセターゼを検出する。その標識は35S−メチ
ンニンであるだろう。
−５′）オリゴＡシンセターゼをインターフエロンにさ
らした細胞又は体液から抽出し、この抽出シンセターゼ
を識別し得るマーカーで標識付をしてラベル付シンセタ
ーゼを作り、このラベル付シンセターゼを現発明の抗体
と適当な条件下で接触させて、標識付のシンセターゼ−
抗体複合体を作らせ、複合体中の標識を検出し、それに
よつてシンセターゼを検出する。その標識は35S−メチ
ンニンであるだろう。
インターフエロン活性を監視する方法を実施する為の
キツトは、現発明の抗体を１つ、シンセターゼ抽出用諸
材料、シンセターゼ標識付けの諸材料及び標識を検出
し、シンセターゼ量を決定する為の諸材料より成る。
キツトは、現発明の抗体を１つ、シンセターゼ抽出用諸
材料、シンセターゼ標識付けの諸材料及び標識を検出
し、シンセターゼ量を決定する為の諸材料より成る。
現発明は又、インターフエロンにさらした後ヒト細胞
に現れる諸メツセンジヤーRNAと特定的に交雑するクロ
ーン化したDNAを提出する。そのクローン化cDNAは、3.
6,1.8と1.6キロベースの（２′−５′）オリゴＡシンセ
ターゼ両mRNAに特定的であろう。現発明のクローン化DN
Aは56,000Mr蛋白質のmRNAに特定的であり、そのmRNAは
２キロベースで第１図に示す配列を持つ。
に現れる諸メツセンジヤーRNAと特定的に交雑するクロ
ーン化したDNAを提出する。そのクローン化cDNAは、3.
6,1.8と1.6キロベースの（２′−５′）オリゴＡシンセ
ターゼ両mRNAに特定的であろう。現発明のクローン化DN
Aは56,000Mr蛋白質のmRNAに特定的であり、そのmRNAは
２キロベースで第１図に示す配列を持つ。
ヒトSV80細胞から得た（２′−５′）オリゴＡシンセ
ターゼmRNAのための部分cDNAクローン（E1）は、それが
アフリカツメガエル卵細胞中での翻訳で（Merlin et a
l,1983）（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活性を起
すmRNAを交配で選別する能力を通じて始めて獲得され
た。E1cDNAの挿入（675bp）はRNAの1.6,1.8および3.6kb
の三種類で、SV80細胞のIFNに符合するものと交雑し、1
2時間の蓄積で細胞質ポリソーム分画に見出される（Ben
ech et al,1985）。他の二種の早期転写体（2.7および4
Kb）は、より少い分量で現れる。ヒト細胞の種々の型の
分析から、これら諸RNAは各細胞の特定の方法で別個に
発現される事がわかつた。Ｂリンパ芽細胞では（Namalv
a,Daudi）1.8KbのRNAが集積するが、一方、羊膜のWISH
細胞、組織球のリンパ腫U937細胞、およびHeLa細胞では
1.6KbのRNAが幾らかの3.6Kb RNAと共に主としてIFNで
誘起されるが1.8Kb RNAは殆ど作られない。２倍体繊維
芽細胞FS11内、SV80繊維プラストイド細胞内およびＴ細
胞CENT系では安定RNAの三型全部が発現される（Benech
et al,1985）。（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの
発現される型は用いたIFNの種（α，βまたはγ）の相
異には依らず、むしろ細胞内で発生的に規制されるよう
に見える。
ターゼmRNAのための部分cDNAクローン（E1）は、それが
アフリカツメガエル卵細胞中での翻訳で（Merlin et a
l,1983）（２′−５′）オリゴＡシンセターゼ活性を起
すmRNAを交配で選別する能力を通じて始めて獲得され
た。E1cDNAの挿入（675bp）はRNAの1.6,1.8および3.6kb
の三種類で、SV80細胞のIFNに符合するものと交雑し、1
2時間の蓄積で細胞質ポリソーム分画に見出される（Ben
ech et al,1985）。他の二種の早期転写体（2.7および4
Kb）は、より少い分量で現れる。ヒト細胞の種々の型の
分析から、これら諸RNAは各細胞の特定の方法で別個に
発現される事がわかつた。Ｂリンパ芽細胞では（Namalv
a,Daudi）1.8KbのRNAが集積するが、一方、羊膜のWISH
細胞、組織球のリンパ腫U937細胞、およびHeLa細胞では
1.6KbのRNAが幾らかの3.6Kb RNAと共に主としてIFNで
誘起されるが1.8Kb RNAは殆ど作られない。２倍体繊維
芽細胞FS11内、SV80繊維プラストイド細胞内およびＴ細
胞CENT系では安定RNAの三型全部が発現される（Benech
et al,1985）。（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの
発現される型は用いたIFNの種（α，βまたはγ）の相
異には依らず、むしろ細胞内で発生的に規制されるよう
に見える。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼの異つた転写物
は、１遺伝子に由来するようである（Benech et al,198
5）。制限酵素切断位置地図に依れば、１）E1cDNAは1.6
Kb RNAの３′末端に相当する、２）1.8Kb RNAは1.6Kb
RNAと異つた３′末端を持ち、下流エクソン１つを余
分に持つ、３）3.6Kb RNAは1.8Kb RNAと共通の３′末
端を持つが、不完全にスプライスされている。特定のゲ
ノムDNA断片を用いた交雑−翻訳試験は、これも1.8と1.
6Kbの両RNAは、積極的に（２′−５′）オリゴＡシンセ
ターゼをコードする事を示した（Benech et al,198
5）。
は、１遺伝子に由来するようである（Benech et al,198
5）。制限酵素切断位置地図に依れば、１）E1cDNAは1.6
Kb RNAの３′末端に相当する、２）1.8Kb RNAは1.6Kb
RNAと異つた３′末端を持ち、下流エクソン１つを余
分に持つ、３）3.6Kb RNAは1.8Kb RNAと共通の３′末
端を持つが、不完全にスプライスされている。特定のゲ
ノムDNA断片を用いた交雑−翻訳試験は、これも1.8と1.
6Kbの両RNAは、積極的に（２′−５′）オリゴＡシンセ
ターゼをコードする事を示した（Benech et al,198
5）。
1.6と1.8Kb両RNAのためのcDNA諸クローンは単離され
配列決定が行われ、これはヒト細胞に二型あるIFN−誘
起の（２′−５′）オリゴＡシンセターゼのアミノ酸配
列の由来解明を可能にした。二種の蛋白質はｃ−末端を
異にし、1.6Kb RNA産物（E16）では疎水性であり、1.8
Kb RNAの産物（E18）では酸性である。（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼ遺伝子の完全地図では、1.6Kb R
NAは７つのエクソンにコードされ、1.8Kb RNAは８つの
エクソンにコードされる。IFN−誘起のヒト（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ遺伝子の転写開始位置と仮
定される位置の配列はヒトIFN−β１遺伝子のプロモー
ター部位と強い相同性を示す。
配列決定が行われ、これはヒト細胞に二型あるIFN−誘
起の（２′−５′）オリゴＡシンセターゼのアミノ酸配
列の由来解明を可能にした。二種の蛋白質はｃ−末端を
異にし、1.6Kb RNA産物（E16）では疎水性であり、1.8
Kb RNAの産物（E18）では酸性である。（２′−５′）
オリゴＡシンセターゼ遺伝子の完全地図では、1.6Kb R
NAは７つのエクソンにコードされ、1.8Kb RNAは８つの
エクソンにコードされる。IFN−誘起のヒト（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ遺伝子の転写開始位置と仮
定される位置の配列はヒトIFN−β１遺伝子のプロモー
ター部位と強い相同性を示す。
例 １ （２′−５′）オリゴＡシンセターゼmRNAのcDNAクロー
ンによる測定 Ａ） Ｅ−cDNA諸クローンの単離 全RNAは109のSV80細胞（SV40−形質転換ヒト繊維芽細
胞）をml当り200単位IFN−ベータで12時間処理して調整
した。そのRNAは3MのLiCl−6M尿素で抽出し、オリゴdT
−セルロースの上を通して純化した。得たポリA+−RNA
の0.4mgは1.5％アガロース/6M尿素25mMクエン酸ナトリ
ウムpH3.5で、ゲル電気泳動装置のプレパレーシヨン中
で分画された。その17−18sRNA分画がが次のようにcDNA
の調整に用いられた:2ミリグラムのRNAを１分間、90℃
で２ミクログラムのオリゴ（dT）12-18と、60ミクロリ
ツトルの水中で熱した、次に０℃で冷却、その後塩の最
終濃度が50mM Tri−HCl pH8.3、10mM MgCl2、75mM
KClとなるように補足し、５分間42℃で保温後に1mMヂチ
オトレイトール、各1mMのdATP、dTGP、0.5mMのdCTP、20
ミクロ−Ciの32p−dCTP（300（Ci/mmol））、4mMのピロ
燐酸ナトリウムと20単位の逆転写酵素を最終容量0.1ml
にして加える。この混合物を42℃で45分間保温し、10mM
EDTAで反応を止め、0.2％ナトリウム−ドヂシル硫
酸、そしてcDNAはフエノール−クロロフオルムで抽出
し、0.3NのNaOHで20時間52℃の処理をし、中性化した。
そのcDNAをSephadex Ｇ−75で濾過し、エタノール沈澱
をし、そしてdATPと末端トランスフアラーゼとで尾付け
をした。第二のcDNA鎖の合成はオリゴ（dT）でプライム
付けをし、第一鎖と同様に２時間42℃で進行させたが、
放射性ヌクレオチドとピロ燐酸は用いなかつた。末尾の
整形を確保する為にds cDNAは大腸菌ポリメラーゼＩ大
断片と共に先ず20mMTris−HCl pH8、75mM KCl、5mM M
gCl1、1mMチチオトレイトールで５分間37℃（角切り反
応）で処理し、次にATP存在下に充填条件に置いた。そ
のds cDNAは５−20％の蔗糖傾斜で沈澱分画し、最も重
い分画にdCTPで尾付けをして、等モル量のPst１−切断p
BR322プラスミドDNAのdCTPで尾付けしたものでアニール
した。約7ngのDNAを100ミクロリツトルの凍結し、CaCl2
−処理した大腸菌MM294と混合した。０℃で30分と37℃
で５分の処理後、そのバクテリアは2mlのLB−ブロス中
で37℃で２時間の生育をさせ、LB−寒天プレートに10ミ
クログラム/mlのテトラサイクリンで接種した。約1.4×
105のテトラサイクリン−耐性でアンピシリン−感受性
のコロニーが、ミリグラム当りの組換プラズミドDNAか
ら得られた。
ンによる測定 Ａ） Ｅ−cDNA諸クローンの単離 全RNAは109のSV80細胞（SV40−形質転換ヒト繊維芽細
胞）をml当り200単位IFN−ベータで12時間処理して調整
した。そのRNAは3MのLiCl−6M尿素で抽出し、オリゴdT
−セルロースの上を通して純化した。得たポリA+−RNA
の0.4mgは1.5％アガロース/6M尿素25mMクエン酸ナトリ
ウムpH3.5で、ゲル電気泳動装置のプレパレーシヨン中
で分画された。その17−18sRNA分画がが次のようにcDNA
の調整に用いられた:2ミリグラムのRNAを１分間、90℃
で２ミクログラムのオリゴ（dT）12-18と、60ミクロリ
ツトルの水中で熱した、次に０℃で冷却、その後塩の最
終濃度が50mM Tri−HCl pH8.3、10mM MgCl2、75mM
KClとなるように補足し、５分間42℃で保温後に1mMヂチ
オトレイトール、各1mMのdATP、dTGP、0.5mMのdCTP、20
ミクロ−Ciの32p−dCTP（300（Ci/mmol））、4mMのピロ
燐酸ナトリウムと20単位の逆転写酵素を最終容量0.1ml
にして加える。この混合物を42℃で45分間保温し、10mM
EDTAで反応を止め、0.2％ナトリウム−ドヂシル硫
酸、そしてcDNAはフエノール−クロロフオルムで抽出
し、0.3NのNaOHで20時間52℃の処理をし、中性化した。
そのcDNAをSephadex Ｇ−75で濾過し、エタノール沈澱
をし、そしてdATPと末端トランスフアラーゼとで尾付け
をした。第二のcDNA鎖の合成はオリゴ（dT）でプライム
付けをし、第一鎖と同様に２時間42℃で進行させたが、
放射性ヌクレオチドとピロ燐酸は用いなかつた。末尾の
整形を確保する為にds cDNAは大腸菌ポリメラーゼＩ大
断片と共に先ず20mMTris−HCl pH8、75mM KCl、5mM M
gCl1、1mMチチオトレイトールで５分間37℃（角切り反
応）で処理し、次にATP存在下に充填条件に置いた。そ
のds cDNAは５−20％の蔗糖傾斜で沈澱分画し、最も重
い分画にdCTPで尾付けをして、等モル量のPst１−切断p
BR322プラスミドDNAのdCTPで尾付けしたものでアニール
した。約7ngのDNAを100ミクロリツトルの凍結し、CaCl2
−処理した大腸菌MM294と混合した。０℃で30分と37℃
で５分の処理後、そのバクテリアは2mlのLB−ブロス中
で37℃で２時間の生育をさせ、LB−寒天プレートに10ミ
クログラム/mlのテトラサイクリンで接種した。約1.4×
105のテトラサイクリン−耐性でアンピシリン−感受性
のコロニーが、ミリグラム当りの組換プラズミドDNAか
ら得られた。
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼmRNAのcDNAクロ
ーンを識別するため、総計3,000のプラズミドクローン
をIFN−処理SV80細胞のRNAと交雑しスクリーンし、その
DNAで選抜したRNAをXenopus laevis卵細胞に注射してテ
ストし、Shulman and Revel（1980）の方法で（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ活性測定した。12の個別の
クローン（各３ミクログラムのDNA;EcoR1で分断）から
のプラズミドDNAの合併物は直径0.4cmのニトロセルロー
ズ濾紙を通し、37℃２時間の予備交雑を50％フオルムア
ミド、2mM pipes緩衝液pH6.4、0.75M Nacl、1mM EDT
A（緩衝液Ａ）中で行つた。pBR322DNAによる濾紙３本、
組換DNAによる濾紙30本を300ミクログラムのポリA+−RN
Aと共に（仮定の（２′−５′）オリゴＡシンセターゼm
RNA量、0.09ミクログラム又は0.03％の10倍過剰のcDNA
の添加になる計算で）、1mlの緩衝液Ａ中で37℃で20時
間保温した。これらの濾紙は37℃の緩衝液Ａで２回、20
mM Tris−HClのpH7.5と0.15M NaClと1mM EDTAと0.5
％ナトリウムドデシル硫酸の混合物で４回（１度は37℃
で、残り３度は52℃で）、そして10mM Tris−HClのpH
7.5と1mM EDTAの混合物（緩衝液Ｃ）で52℃において４
回の諸洗滌を行つた。各濾紙は、次に個別にして緩衝液
Ｃで52℃の洗滌をし、次に96℃で0.3mlの緩衝液Ｃに1ml
当り40ミクログラムの兎肝tRNAを加えたもの、中で２分
間加熱してRNAを取り出した。そのエタノール沈澱物を
急冷の後、そのRNAは２ミクロリツトルの水に溶解し
た。0.7ミクロリツトルのRNAを10個のアフリカツメガエ
ル卵細胞に注射し、19℃18時間の保温後、その卵細胞を
孵卵液中でホモゲナイズし（Shulman and Revel,198
0）、そのホモゲネート0.15mlをポリ（rI）（rC）−ア
ガロース粒と混合した。
ーンを識別するため、総計3,000のプラズミドクローン
をIFN−処理SV80細胞のRNAと交雑しスクリーンし、その
DNAで選抜したRNAをXenopus laevis卵細胞に注射してテ
ストし、Shulman and Revel（1980）の方法で（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼ活性測定した。12の個別の
クローン（各３ミクログラムのDNA;EcoR1で分断）から
のプラズミドDNAの合併物は直径0.4cmのニトロセルロー
ズ濾紙を通し、37℃２時間の予備交雑を50％フオルムア
ミド、2mM pipes緩衝液pH6.4、0.75M Nacl、1mM EDT
A（緩衝液Ａ）中で行つた。pBR322DNAによる濾紙３本、
組換DNAによる濾紙30本を300ミクログラムのポリA+−RN
Aと共に（仮定の（２′−５′）オリゴＡシンセターゼm
RNA量、0.09ミクログラム又は0.03％の10倍過剰のcDNA
の添加になる計算で）、1mlの緩衝液Ａ中で37℃で20時
間保温した。これらの濾紙は37℃の緩衝液Ａで２回、20
mM Tris−HClのpH7.5と0.15M NaClと1mM EDTAと0.5
％ナトリウムドデシル硫酸の混合物で４回（１度は37℃
で、残り３度は52℃で）、そして10mM Tris−HClのpH
7.5と1mM EDTAの混合物（緩衝液Ｃ）で52℃において４
回の諸洗滌を行つた。各濾紙は、次に個別にして緩衝液
Ｃで52℃の洗滌をし、次に96℃で0.3mlの緩衝液Ｃに1ml
当り40ミクログラムの兎肝tRNAを加えたもの、中で２分
間加熱してRNAを取り出した。そのエタノール沈澱物を
急冷の後、そのRNAは２ミクロリツトルの水に溶解し
た。0.7ミクロリツトルのRNAを10個のアフリカツメガエ
ル卵細胞に注射し、19℃18時間の保温後、その卵細胞を
孵卵液中でホモゲナイズし（Shulman and Revel,198
0）、そのホモゲネート0.15mlをポリ（rI）（rC）−ア
ガロース粒と混合した。
その粒は30℃で16時間、2.5mMの（32P）−アルフア−
ATP（0.3Ci/m mol）と10mMジチオトレイトールとの混合
物中で保温し、この10ミクロリツトルの液相部を0.35単
位のバクテリア アルカリ フオスフアターゼと共に30
mMのTris−base中で37℃60分の保温をした。その消化物
はWatman 3MM濾紙上で濾紙電気泳動に3,000Vで４時間か
け、（２′−５′）ApAと（２′−５′）ApApAに相当す
る汚点を切り取り、シンチレーシヨン測定をした。DNA
−選抜RNAから、１ミクロリツトルを取り網赤血球分解
物でWeissenbach et al,（1979）に述べられたようにin
vitro翻訳に用い、資料の全mRNA活性の測定を行つた。
ATP（0.3Ci/m mol）と10mMジチオトレイトールとの混合
物中で保温し、この10ミクロリツトルの液相部を0.35単
位のバクテリア アルカリ フオスフアターゼと共に30
mMのTris−base中で37℃60分の保温をした。その消化物
はWatman 3MM濾紙上で濾紙電気泳動に3,000Vで４時間か
け、（２′−５′）ApAと（２′−５′）ApApAに相当す
る汚点を切り取り、シンチレーシヨン測定をした。DNA
−選抜RNAから、１ミクロリツトルを取り網赤血球分解
物でWeissenbach et al,（1979）に述べられたようにin
vitro翻訳に用い、資料の全mRNA活性の測定を行つた。
DNA選抜RNA資料中の（２′−５′）オリゴＡシンセタ
ーゼ活性の全mRNA活性に対する比は各濾紙毎に計算し
た。12の各個別プラズミドからの250合併資料のプール1
74を持つ濾紙は、他の合併資料のものやpBR322DNAのも
のに比し10倍高い値が常に現れた。プール174の各個の
クローンのプラズミドを各個別の濾紙で試し、174−３
が常に、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼmRNAの全
mRNAに対しての濃度について全RNA又はpBR322のDNA選抜
RNAに比し35−100倍の高さを示した（Tablel）。クロー
ン174−３は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼcDN
Aと同定され、Ｅ−cDNAと命名した。このcDNAの構造と
配列とを第１図に示す。このＥ−cDNAクローンはその酵
素のカルホキシ末端のアミノ酸を100個塩基配列中に保
有し、ポリＡの尾の前に翻訳されない192塩基長の部位
を持つ。
ーゼ活性の全mRNA活性に対する比は各濾紙毎に計算し
た。12の各個別プラズミドからの250合併資料のプール1
74を持つ濾紙は、他の合併資料のものやpBR322DNAのも
のに比し10倍高い値が常に現れた。プール174の各個の
クローンのプラズミドを各個別の濾紙で試し、174−３
が常に、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼmRNAの全
mRNAに対しての濃度について全RNA又はpBR322のDNA選抜
RNAに比し35−100倍の高さを示した（Tablel）。クロー
ン174−３は、（２′−５′）オリゴＡシンセターゼcDN
Aと同定され、Ｅ−cDNAと命名した。このcDNAの構造と
配列とを第１図に示す。このＥ−cDNAクローンはその酵
素のカルホキシ末端のアミノ酸を100個塩基配列中に保
有し、ポリＡの尾の前に翻訳されない192塩基長の部位
を持つ。
Table １ （２′−５′）オリゴＡシンセターゼcDNAのクローンの
交雑−翻訳による同定 誘起RNA の卵細胞注射（２）により測定したEmRNA の
活性 Ｂ） Ｅ−cDNAの交雑による、インターフエロン−誘起
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼmRNAの測定 クローン174−３（Ｅ−cDNA）のプラズミドDNAは細胞
の全RNAによる電気泳動諸汚点から相補的RNAを検出する
のに使用できる。ポリA+−RNAは2000/mlのインターフエ
ロンビータで種々の回数処理したSV80細胞から調整し
て、その７ミクログラムのRNAは50％フオルムアミドと
６％のフオルムアルデヒド中で変性し、1.3％のアガロ
ースと６％のフオルムアルデヒド中で電気泳動にかけ、
Thomas（1980）とFellous et al,（1982）の手順でニト
ロセルローズにブロツトした。Merlin et al,（1980）
に依り、（32P）−ガンマ−dCTPを用いて割れ目移動で
構識付けしたそのＥ−cDNAプズミドは、先のニトロセル
ローズの汚点と交雑した。
交雑−翻訳による同定 誘起RNA の卵細胞注射（２）により測定したEmRNA の
活性 Ｂ） Ｅ−cDNAの交雑による、インターフエロン−誘起
（２′−５′）オリゴＡシンセターゼmRNAの測定 クローン174−３（Ｅ−cDNA）のプラズミドDNAは細胞
の全RNAによる電気泳動諸汚点から相補的RNAを検出する
のに使用できる。ポリA+−RNAは2000/mlのインターフエ
ロンビータで種々の回数処理したSV80細胞から調整し
て、その７ミクログラムのRNAは50％フオルムアミドと
６％のフオルムアルデヒド中で変性し、1.3％のアガロ
ースと６％のフオルムアルデヒド中で電気泳動にかけ、
Thomas（1980）とFellous et al,（1982）の手順でニト
ロセルローズにブロツトした。Merlin et al,（1980）
に依り、（32P）−ガンマ−dCTPを用いて割れ目移動で
構識付けしたそのＥ−cDNAプズミドは、先のニトロセル
ローズの汚点と交雑した。
SV80細胞中で、インターフエロン処理で同時に誘起さ
れた三種のRNA、3.6キロベースの大きいRNA1つと1.85、
1.65キロベースの小さいRNAは、Ｅ−cDNAと交雑する
（第２図）。非処理のSV80細胞ではＥ−限定のRNAは見
出せない。４時間目に現れるのに三種のRNAは12時間で
最大値となり、その後除除に減少する。この諸RNAはイ
ンターフエロン処理後24時間でも明瞭に検出される。わ
ずか４時間後に出現する別のRNA諸種は、更に安定度の
高い諸種の前駆体である可能性が強い。同じ三種のRNA
は、インターフエロン処理を受けたヒト２倍体繊維芽細
胞にも見られる。しかし、リンパ芽球Namalva細胞のよ
うな造血細胞系の細胞では、一つの主要種だけがＥ−cD
NAと雑種化し（第２図）それは1.85キロベースのRNA種
に相当する。同様のRNAパターンが多種のリンパ芽球細
胞である赤血球HL−60および原モノサイトU937に見られ
る。
れた三種のRNA、3.6キロベースの大きいRNA1つと1.85、
1.65キロベースの小さいRNAは、Ｅ−cDNAと交雑する
（第２図）。非処理のSV80細胞ではＥ−限定のRNAは見
出せない。４時間目に現れるのに三種のRNAは12時間で
最大値となり、その後除除に減少する。この諸RNAはイ
ンターフエロン処理後24時間でも明瞭に検出される。わ
ずか４時間後に出現する別のRNA諸種は、更に安定度の
高い諸種の前駆体である可能性が強い。同じ三種のRNA
は、インターフエロン処理を受けたヒト２倍体繊維芽細
胞にも見られる。しかし、リンパ芽球Namalva細胞のよ
うな造血細胞系の細胞では、一つの主要種だけがＥ−cD
NAと雑種化し（第２図）それは1.85キロベースのRNA種
に相当する。同様のRNAパターンが多種のリンパ芽球細
胞である赤血球HL−60および原モノサイトU937に見られ
る。
繊維芽細胞やリンパ細胞に見られる異型のＥ−限定RN
Aパターンは、これらの細胞内の（２′−５′）オリゴ
Ａシンセターゼの異型に相当する。リンパ細胞は分子量
30,000ダルトンの酵素を持つが、繊維芽細胞では分子量
80,000ダルトンと30,00ダルトンの２型をRevel et al,
（1982）の発表のように含有している。小さい1.85キロ
ベースmRNAは30,000Mrの酵素をコードするに十分な長さ
があるが、大型の方には足りない。一方、3.6キロベー
スのＥ−mRNAは80,000Mrの型の酵素をコードする。三型
のＥ−限定RNA種は全部ヒトのゲノムDNAの単クローンと
交雑し、3.6キロベースのRNAは1.85キロベースのRNAと
比べてインターフエロンエクソンを一つ余分に持つてい
る。
Aパターンは、これらの細胞内の（２′−５′）オリゴ
Ａシンセターゼの異型に相当する。リンパ細胞は分子量
30,000ダルトンの酵素を持つが、繊維芽細胞では分子量
80,000ダルトンと30,00ダルトンの２型をRevel et al,
（1982）の発表のように含有している。小さい1.85キロ
ベースmRNAは30,000Mrの酵素をコードするに十分な長さ
があるが、大型の方には足りない。一方、3.6キロベー
スのＥ−mRNAは80,000Mrの型の酵素をコードする。三型
のＥ−限定RNA種は全部ヒトのゲノムDNAの単クローンと
交雑し、3.6キロベースのRNAは1.85キロベースのRNAと
比べてインターフエロンエクソンを一つ余分に持つてい
る。
白血球インターフエロン−アルフアは繊維芽細胞のイ
ンターフエロン−ベータと同じようにE.限定RNAを誘起
する。RNAに複数種がある事はＥ−cDNAとの交雑から明
らかとなつた。インターフエロンにも異同がある。それ
らは総て（２′−５′）オリゴＡシンセターゼを誘起す
るが、違つた型のRNAや酵素も誘起するだろう事を示唆
する。異つたインターフエロン種は、Ｅ−mRNA誘起の効
率に差のある事もあり得る。
ンターフエロン−ベータと同じようにE.限定RNAを誘起
する。RNAに複数種がある事はＥ−cDNAとの交雑から明
らかとなつた。インターフエロンにも異同がある。それ
らは総て（２′−５′）オリゴＡシンセターゼを誘起す
るが、違つた型のRNAや酵素も誘起するだろう事を示唆
する。異つたインターフエロン種は、Ｅ−mRNA誘起の効
率に差のある事もあり得る。
上記のＥ−cDNAとの交雑検定で処理されるRNAは、種
々の培養細胞から又はインターフエロン治療を受けてい
る患者から又はウイルス病の病人から或いは（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの昂進する病気（Schattne
r et al.,1981）から調整できる。RNAは他に白血球のよ
うな末梢血液からの血球からも調整できる。電気泳動ブ
ロツトは点−交雑法で代行でき、それではRNAの資料
を、ニトロセルローズの上に一定の広さで円形、矩形等
で直接設置する。そして放射性cDNAはニトロセルローズ
布上で直接に交雑される。各円形又は矩形は次に直接計
測又はオートラヂオグラフフイルムの選別後にオートラ
ヂオグラフする事で測定される。
々の培養細胞から又はインターフエロン治療を受けてい
る患者から又はウイルス病の病人から或いは（２′−
５′）オリゴＡシンセターゼの昂進する病気（Schattne
r et al.,1981）から調整できる。RNAは他に白血球のよ
うな末梢血液からの血球からも調整できる。電気泳動ブ
ロツトは点−交雑法で代行でき、それではRNAの資料
を、ニトロセルローズの上に一定の広さで円形、矩形等
で直接設置する。そして放射性cDNAはニトロセルローズ
布上で直接に交雑される。各円形又は矩形は次に直接計
測又はオートラヂオグラフフイルムの選別後にオートラ
ヂオグラフする事で測定される。
代替法としては、インターフエロンにさらした組織を
生検して組織切片に原位置交雑で行う。脳のウイルス病
又は腫瘍のためインターフエロンの投与を受けた患者に
対し投薬が莢壁内注射であつたか体内注射であつた時に
脳インターフエロン処理を受けているかを測るのに脳生
検として優先的に応用される。この方法はインターフエ
ロン投与が局所的に皮膚病斑の軟膏として行われた時に
皮膚生検に対して行われる。他に様々な応用ができる事
は明白である。組織片は固定し、原位置で放射性DNAと
交雑し、次に感度の良い感光剤でオートラヂオグラフに
かける。このcDNAは蛍光ヌクレオチドで又は蛍光分子と
結合するよう改造したヌクレオチドで標識し、組織切片
と交雑すれば蛍光顕微鏡で監視できる。
生検して組織切片に原位置交雑で行う。脳のウイルス病
又は腫瘍のためインターフエロンの投与を受けた患者に
対し投薬が莢壁内注射であつたか体内注射であつた時に
脳インターフエロン処理を受けているかを測るのに脳生
検として優先的に応用される。この方法はインターフエ
ロン投与が局所的に皮膚病斑の軟膏として行われた時に
皮膚生検に対して行われる。他に様々な応用ができる事
は明白である。組織片は固定し、原位置で放射性DNAと
交雑し、次に感度の良い感光剤でオートラヂオグラフに
かける。このcDNAは蛍光ヌクレオチドで又は蛍光分子と
結合するよう改造したヌクレオチドで標識し、組織切片
と交雑すれば蛍光顕微鏡で監視できる。
Ｅ−cDNAの交雑が増加すれば、通常のコントロール細
胞RNA又は組織資料と比較して、その細胞や組織がイン
ターフエロンにさらされた事を意味する。この方法は速
断性（４−24時間）と高感応性（ml当り１〜200単位の
インターフエロン）のために外来のインターフエロン投
与又は患者の血液や組織での内生インターフエロンの形
成の後に非常に有用である。
胞RNA又は組織資料と比較して、その細胞や組織がイン
ターフエロンにさらされた事を意味する。この方法は速
断性（４−24時間）と高感応性（ml当り１〜200単位の
インターフエロン）のために外来のインターフエロン投
与又は患者の血液や組織での内生インターフエロンの形
成の後に非常に有用である。
例−２ インターフエロンで誘導した56,000Mrタンパク Ａ） クローニングしたC56−cDNAの単離 クローニングしたcDNAを例１に記述した組み換えプラ
スミツドのライブラリーから単離した。
スミツドのライブラリーから単離した。
1. 使用された方法の原理は、判別ハイブリツド形成で
あつた。ニトロセルローズロ紙上に、生育させた3,000
のバクテリアのクローンの２つの重複セツトを、インタ
ーフエロン−β（200U/ml）で処理したSV80細胞の17Sか
ら18SのポリA+−RNAからの（32P）−cDNAか、もしく
は、無処理のSV80細胞の全ポリA+−RNAからの（32P）−
cDNAとハイブリツド形成を行なつた。放射活性のcDNA
は、例１におけるように、mRNAから逆転写した。バクテ
リアのクローンのうち、約40％が“インターフエロン”
処理"cDNAプローブと、強くハイブリツドを形成し、８
％が、明確な判別シグナルを与え、“無処理"cDNAとく
らべて、優先的または、特別に“インターフエロン処
理"cDNAとハイブリツド形成を行なつた。後者のグルー
プのクローンを、次に、ニツクトランスレーシヨンによ
つて放射活性ラベルをした各クローンからのプラスミツ
ドDNAを、インターフエロンで処理したSV80細胞から、
及び、無処理の細胞から、RNAの電気泳動ブロツトとハ
イブリツドを形成することによつてスクリーニングを行
なつた。この基準によつて、最初の3,000のバクテリア
のクローンのうち、１−２％が、インターフエロンによ
つて誘導されたmRNAに相当するプラスミツドcDNAクロー
ンを含んでいることが見出された。これらのプラスミツ
ドcDNAクローンのうち、C56と呼んだ１つが、特別に強
い判別ハイブリツド形成を示した。このC56DNAは、イン
ターフエロンで処理した細胞に存在するが、コントロー
ル細胞RNAには存在しない18S RNAとハイブリツドを形
成する（第３図）。対照的に、インターフエロン処理に
よつて、SV80細胞に、５倍に増加しているHLA−A,B,C
mRNAは、C56mRNAよりも誘導がはるかに少いようであ
り、Fig.3の実験条件下では、“無処理"RNAとも明確な
シグナルを与える。
あつた。ニトロセルローズロ紙上に、生育させた3,000
のバクテリアのクローンの２つの重複セツトを、インタ
ーフエロン−β（200U/ml）で処理したSV80細胞の17Sか
ら18SのポリA+−RNAからの（32P）−cDNAか、もしく
は、無処理のSV80細胞の全ポリA+−RNAからの（32P）−
cDNAとハイブリツド形成を行なつた。放射活性のcDNA
は、例１におけるように、mRNAから逆転写した。バクテ
リアのクローンのうち、約40％が“インターフエロン”
処理"cDNAプローブと、強くハイブリツドを形成し、８
％が、明確な判別シグナルを与え、“無処理"cDNAとく
らべて、優先的または、特別に“インターフエロン処
理"cDNAとハイブリツド形成を行なつた。後者のグルー
プのクローンを、次に、ニツクトランスレーシヨンによ
つて放射活性ラベルをした各クローンからのプラスミツ
ドDNAを、インターフエロンで処理したSV80細胞から、
及び、無処理の細胞から、RNAの電気泳動ブロツトとハ
イブリツドを形成することによつてスクリーニングを行
なつた。この基準によつて、最初の3,000のバクテリア
のクローンのうち、１−２％が、インターフエロンによ
つて誘導されたmRNAに相当するプラスミツドcDNAクロー
ンを含んでいることが見出された。これらのプラスミツ
ドcDNAクローンのうち、C56と呼んだ１つが、特別に強
い判別ハイブリツド形成を示した。このC56DNAは、イン
ターフエロンで処理した細胞に存在するが、コントロー
ル細胞RNAには存在しない18S RNAとハイブリツドを形
成する（第３図）。対照的に、インターフエロン処理に
よつて、SV80細胞に、５倍に増加しているHLA−A,B,C
mRNAは、C56mRNAよりも誘導がはるかに少いようであ
り、Fig.3の実験条件下では、“無処理"RNAとも明確な
シグナルを与える。
ニトロセルローズロ紙に固定化したC56 cDNAとハイ
ブリツドを形成することによつて選ばれたmRNAは、続い
てフイルムから溶出され、（例１におけるように）網状
赤血球溶解産物のセルフリー系で翻訳し、35S−メチオ
ニンでラベルした翻訳産物を、Leamle（1970）から応用
したWeissenbackら（1979）が記述した方法に従つてNa
−dodecyl sulfate中でポリアクリルアミドゲル電気泳
動によつて分析した。C56のcDNAで選ばれたRNAは、56,0
00Mrタンパクに翻訳された。C56cDNAの塩基配列のう
ち、56,000Mrの、カルボキシル末端の65のアミノ酸が、
その道の技術を持つた人により、導き出された（第４
図）。
ブリツドを形成することによつて選ばれたmRNAは、続い
てフイルムから溶出され、（例１におけるように）網状
赤血球溶解産物のセルフリー系で翻訳し、35S−メチオ
ニンでラベルした翻訳産物を、Leamle（1970）から応用
したWeissenbackら（1979）が記述した方法に従つてNa
−dodecyl sulfate中でポリアクリルアミドゲル電気泳
動によつて分析した。C56のcDNAで選ばれたRNAは、56,0
00Mrタンパクに翻訳された。C56cDNAの塩基配列のう
ち、56,000Mrの、カルボキシル末端の65のアミノ酸が、
その道の技術を持つた人により、導き出された（第４
図）。
インターフエロン−β（200U/ml）で、時間を種々変
えて処理したSV80から抽出したRNAに対するC56cDNAのハ
イブリツド形成からC56mRNAが、インターフエロンを加
えてから１時間後に現れ始めるということがわかる（第
５図）。C56RNAは４時間後にその極大に達するが、しか
し、減少はするものも、24時間後もまだ検出できる。C
56mRNAの誘導は、倍数体、繊維芽細胞、及びリンパ芽球
様細胞においても示される。誘導は、インターフエロン
10から200単位/mlの間で濃度に比例していた。C56mRNA
は、後者は能率が悪かつたが、インターフエロン−α、
インターフエロン−γによつても誘導された。このmRNA
が、未処理の細胞に存在していないことと、インターフ
エロンを添加した後、急速に増加することにより、C56c
DNAは、細胞のインターフエロンに対する反応を評価す
るための素晴らしいプローブとなつている例１中のＥ−
cDNAに対して、記述された技術は、同様にC56cDNAにも
適用できる。
えて処理したSV80から抽出したRNAに対するC56cDNAのハ
イブリツド形成からC56mRNAが、インターフエロンを加
えてから１時間後に現れ始めるということがわかる（第
５図）。C56RNAは４時間後にその極大に達するが、しか
し、減少はするものも、24時間後もまだ検出できる。C
56mRNAの誘導は、倍数体、繊維芽細胞、及びリンパ芽球
様細胞においても示される。誘導は、インターフエロン
10から200単位/mlの間で濃度に比例していた。C56mRNA
は、後者は能率が悪かつたが、インターフエロン−α、
インターフエロン−γによつても誘導された。このmRNA
が、未処理の細胞に存在していないことと、インターフ
エロンを添加した後、急速に増加することにより、C56c
DNAは、細胞のインターフエロンに対する反応を評価す
るための素晴らしいプローブとなつている例１中のＥ−
cDNAに対して、記述された技術は、同様にC56cDNAにも
適用できる。
インターフエロンによつて誘導されたmRNAに相当する
多数のcDNAが手に入るということは、新しい展望を提供
している。特に、Ｅ−mRNAやC56mRNAを誘導するためよ
りも、HLA−A,B,C mRNAを誘導するために、インターフ
エロンは、1/100の濃度しか必要としない。（Wallach
ら、（1982））；他方、α−ｄのようなインターフエロ
ン−αの亜種は、HLA−A,B,C mRNAを誘導するのに必要
な濃度より100倍低い濃度でＥ−mRNAを誘導できる。異
つた、クローン化されるcDNAを同じRNAサンプルとハイ
ブリツド結合させることにより、どういう種類のインタ
ーフエロンが含まれるかを示すことができる。かくし
て、唯１つのcDNAプローブを用いるよりも、異つたcDNA
の比較からもつと多くの知識が誘導できる。
多数のcDNAが手に入るということは、新しい展望を提供
している。特に、Ｅ−mRNAやC56mRNAを誘導するためよ
りも、HLA−A,B,C mRNAを誘導するために、インターフ
エロンは、1/100の濃度しか必要としない。（Wallach
ら、（1982））；他方、α−ｄのようなインターフエロ
ン−αの亜種は、HLA−A,B,C mRNAを誘導するのに必要
な濃度より100倍低い濃度でＥ−mRNAを誘導できる。異
つた、クローン化されるcDNAを同じRNAサンプルとハイ
ブリツド結合させることにより、どういう種類のインタ
ーフエロンが含まれるかを示すことができる。かくし
て、唯１つのcDNAプローブを用いるよりも、異つたcDNA
の比較からもつと多くの知識が誘導できる。
例 ３ インターフエロン誘導mRNAsの測定のためのキツト このキツトは、デオキシ−リボヌクレアーゼＩと（32
P）−γ−dCTPとのニツク翻訳のための試薬ニトロセル
ローズメンブラン上のハイブリツド形成のための試薬、
及び細胞からのRNA抽出用の試薬と同じく（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼのmRNAに対して、特異的
な、そして、ここに記述した、56,000MrタンパクのmRNA
に特異的なクローン化したcDNAを提供するだろう。
P）−γ−dCTPとのニツク翻訳のための試薬ニトロセル
ローズメンブラン上のハイブリツド形成のための試薬、
及び細胞からのRNA抽出用の試薬と同じく（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼのmRNAに対して、特異的
な、そして、ここに記述した、56,000MrタンパクのmRNA
に特異的なクローン化したcDNAを提供するだろう。
例 ４ 1.6KB（２′−５′）オリゴＡシンセターゼmRNAに対す
るcDNAの配列 ヒトの細胞中のインターフエロンによる1.6kb（２′
−５′）オリゴＡシンテターゼの末端であることがわか
つた（Benechら、1985）部分的なE1cDNAクローン（Merl
inら、1983）が、SV80細胞RNAから、ラムダ−gt10cDNA
ライブラリーをスクリーニングするのに用いられた（Wo
lfとRotter、1985）。制限酵素を用いたマツピングによ
り、クローンラムダ−gt10 ９−２はpBR（９−21cDN
A）中にサブクローンニングを行つた1.32KbEcoR1インサ
ート（第6A図）の３′の端に、E1cDNAを含むことが見出
された。配列決定は、第6A図に概説したように行なわ
れ、似前にE1cDNAについて報告されたｃ−末端と３′の
翻訳されていない配列を含むことが確認された（Merlin
ら、1983）。９−21cDNA配列（第７図）は、ATGATG配列
において出発する364アミノ酸のオープンリーデイング
フレームを予告する。タンパクのコーデイング配列の３
塩基周期性に基いたコンピユータープログラム（Trifon
ov,1984）により唯一の矛盾しないリーデイングフレー
ムは、このATGATGから出発するものであることがわかつ
た。翻訳が、この場合の２番目のATGにおいてはじまる
ことは可能である。何故なら、それは、−３におけるＡ
が前にあり、コンセンサス翻訳イニシエーシヨン配列と
相同性がある唯一のものであるからである（Kozak,198
4）。
るcDNAの配列 ヒトの細胞中のインターフエロンによる1.6kb（２′
−５′）オリゴＡシンテターゼの末端であることがわか
つた（Benechら、1985）部分的なE1cDNAクローン（Merl
inら、1983）が、SV80細胞RNAから、ラムダ−gt10cDNA
ライブラリーをスクリーニングするのに用いられた（Wo
lfとRotter、1985）。制限酵素を用いたマツピングによ
り、クローンラムダ−gt10 ９−２はpBR（９−21cDN
A）中にサブクローンニングを行つた1.32KbEcoR1インサ
ート（第6A図）の３′の端に、E1cDNAを含むことが見出
された。配列決定は、第6A図に概説したように行なわ
れ、似前にE1cDNAについて報告されたｃ−末端と３′の
翻訳されていない配列を含むことが確認された（Merlin
ら、1983）。９−21cDNA配列（第７図）は、ATGATG配列
において出発する364アミノ酸のオープンリーデイング
フレームを予告する。タンパクのコーデイング配列の３
塩基周期性に基いたコンピユータープログラム（Trifon
ov,1984）により唯一の矛盾しないリーデイングフレー
ムは、このATGATGから出発するものであることがわかつ
た。翻訳が、この場合の２番目のATGにおいてはじまる
ことは可能である。何故なら、それは、−３におけるＡ
が前にあり、コンセンサス翻訳イニシエーシヨン配列と
相同性がある唯一のものであるからである（Kozak,198
4）。
このようにして、1.6Kb（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼRNAによつてコードされた酵素は、41,700の分
子量を持ち、E1cDNAとハイブリツド結合をしたin vitro
翻訳産物（Merlinら1983）のSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によつてみられる、みかけ上の38,000−Mr
のタンパクとよく一致する。オープンリーデイングフレ
ームによつて予告されたｃ−末端へプタデカペプチドが
化学的に合成され、ラビツトを免疫するのに用いられ
た。得られた抗血清（第12図のｃ）は、未処理の細胞に
は存在していないインターフエロンによつて処理した細
胞の35−Ｓメチオニンラベルの抽出物からのSDS電気泳
動中の38,000−Mrに移動するタンパクを特異的に沈澱さ
せる。２つの実験により、このタンパクは、（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼ活性をもつことが確かめら
れた。それは、ポリ（rI）（rC）アガロース・カラムを
通すことによつて抽出物から除かれ、免疫沈澱後残つて
いる上澄液は酵素活性の大部分がなくなつた。
テターゼRNAによつてコードされた酵素は、41,700の分
子量を持ち、E1cDNAとハイブリツド結合をしたin vitro
翻訳産物（Merlinら1983）のSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によつてみられる、みかけ上の38,000−Mr
のタンパクとよく一致する。オープンリーデイングフレ
ームによつて予告されたｃ−末端へプタデカペプチドが
化学的に合成され、ラビツトを免疫するのに用いられ
た。得られた抗血清（第12図のｃ）は、未処理の細胞に
は存在していないインターフエロンによつて処理した細
胞の35−Ｓメチオニンラベルの抽出物からのSDS電気泳
動中の38,000−Mrに移動するタンパクを特異的に沈澱さ
せる。２つの実験により、このタンパクは、（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼ活性をもつことが確かめら
れた。それは、ポリ（rI）（rC）アガロース・カラムを
通すことによつて抽出物から除かれ、免疫沈澱後残つて
いる上澄液は酵素活性の大部分がなくなつた。
例 ５ 1.8KB（２′−５′）オリゴシンテターゼmRNAに対するc
DNAの配列 1.8KbRNAの追加のエクソン（Benechら、1985;第９図
をみよ。）に相当する遺伝子DNA断片SV80RNAと同じラム
ダーgt10cDNAライブラリーからE18cDNAクローン−８−
１を単離するプローブとして用いられた。E18cDNAクロ
ーンの制限マツプ（第6B図）はその５′末端がE16cDNA
の一部であるが、３′末端は違つているということを確
かめた。配列決定の結果（第７図）結合部は、E16 ９
−21cDNAクローンの1071のヌクレオチドの位置にあり、
E16の最後の247ヌクレオチドが異なるポリアデニル化の
位置によつて終つている515のヌクレオチドの長い配列
によつて置き換つている。この差は、ノーザンブロツト
上にみられる２つのmRNAの間の大きさの差0.2Kbを説明
する。E18cDNAの５′の部分は、E16cDNAの配列から、塩
基の変化がないことを示しているが、未完成である。下
に述べられる遺伝子のマツピングによると、1.6と1.8Kb
mRNAsの両者とも同じ５′未端を有している。
DNAの配列 1.8KbRNAの追加のエクソン（Benechら、1985;第９図
をみよ。）に相当する遺伝子DNA断片SV80RNAと同じラム
ダーgt10cDNAライブラリーからE18cDNAクローン−８−
１を単離するプローブとして用いられた。E18cDNAクロ
ーンの制限マツプ（第6B図）はその５′末端がE16cDNA
の一部であるが、３′末端は違つているということを確
かめた。配列決定の結果（第７図）結合部は、E16 ９
−21cDNAクローンの1071のヌクレオチドの位置にあり、
E16の最後の247ヌクレオチドが異なるポリアデニル化の
位置によつて終つている515のヌクレオチドの長い配列
によつて置き換つている。この差は、ノーザンブロツト
上にみられる２つのmRNAの間の大きさの差0.2Kbを説明
する。E18cDNAの５′の部分は、E16cDNAの配列から、塩
基の変化がないことを示しているが、未完成である。下
に述べられる遺伝子のマツピングによると、1.6と1.8Kb
mRNAsの両者とも同じ５′未端を有している。
E16配列から分れた18cDNAの３′領域は、54のコドン
の後終るオープンリーデイングフレームを含んでいる。
350のヌクレオチドの長さの翻訳されない領域を残して
いるリーデイングフレームは、タンパク−コーデイング
配列の３塩基の周期性に基いたコンピユータープログラ
ム（Trifonov,1984）によつて確かめられた。交互のよ
り長いオープンリーデイングフレームは、E16cDNAに共
通な５′部分のように、同じコンピユーテイツドフレー
ズの中にはないだろう。1.6と1.8Kb mRNAタンパク産物
のｃ−末端上のハイドロパシープロツト（KyteとDoolit
tle,1982）により（２′−５′）オリゴシンテターゼ
（第８図）の２つの形の間に著しい違いが示される。E1
6タンパクのｃ未端は、非常に疎水性であるが、E18タン
パクのｃ未端は親水性であり、２つの酸性領域をもつて
いる（ASP−Asp−Glu−Thu−Asp−Asp−とGlu−Glu−As
p）（第７図）さらに、E18産物のｃ未端に可能なグリコ
シル化の場所が存在している。（第７図）９−24 cDNA
をlac Z遺伝子とフエーズをあわせて融合するように、
λatllにサブクローンニングを行なつた。このフエーズ
を含んでいるE.Coliのリソーゲンは、ポリ（rI）（rC）
アガロースに結合した後、明らかに（２′−５′）オリ
ゴＡシンテターゼ活性を示した。一方、９−21cDNAが反
対の方向に融合した場合には、何も活性が生じなかつた
（第13図）。このE.coliにおける発現は、cDNAは確かに
dsRNAで活性化された（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼをコードする構造遺伝子に相当しており、インター
フエロンで誘導されたRNAによりコードされた約40Kdの
タンパクは、酵素そのものであり、制御因子ではないと
いうことを証明している。このタンパクは、酵素活性を
示すために、翻訳後の修飾は必要としないようである。
の後終るオープンリーデイングフレームを含んでいる。
350のヌクレオチドの長さの翻訳されない領域を残して
いるリーデイングフレームは、タンパク−コーデイング
配列の３塩基の周期性に基いたコンピユータープログラ
ム（Trifonov,1984）によつて確かめられた。交互のよ
り長いオープンリーデイングフレームは、E16cDNAに共
通な５′部分のように、同じコンピユーテイツドフレー
ズの中にはないだろう。1.6と1.8Kb mRNAタンパク産物
のｃ−末端上のハイドロパシープロツト（KyteとDoolit
tle,1982）により（２′−５′）オリゴシンテターゼ
（第８図）の２つの形の間に著しい違いが示される。E1
6タンパクのｃ未端は、非常に疎水性であるが、E18タン
パクのｃ未端は親水性であり、２つの酸性領域をもつて
いる（ASP−Asp−Glu−Thu−Asp−Asp−とGlu−Glu−As
p）（第７図）さらに、E18産物のｃ未端に可能なグリコ
シル化の場所が存在している。（第７図）９−24 cDNA
をlac Z遺伝子とフエーズをあわせて融合するように、
λatllにサブクローンニングを行なつた。このフエーズ
を含んでいるE.Coliのリソーゲンは、ポリ（rI）（rC）
アガロースに結合した後、明らかに（２′−５′）オリ
ゴＡシンテターゼ活性を示した。一方、９−21cDNAが反
対の方向に融合した場合には、何も活性が生じなかつた
（第13図）。このE.coliにおける発現は、cDNAは確かに
dsRNAで活性化された（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼをコードする構造遺伝子に相当しており、インター
フエロンで誘導されたRNAによりコードされた約40Kdの
タンパクは、酵素そのものであり、制御因子ではないと
いうことを証明している。このタンパクは、酵素活性を
示すために、翻訳後の修飾は必要としないようである。
９−21cDNAを含むトランスフオームした細胞は、Esch
erichia coliラムダーgtll−E16と呼ばれ、取得番号149
6の下にCollection Nation Cultures de Micro−organi
smes,パストール研究所、25rue du Docteur Reux,75724
−Paris−Cedex 15、フランスに預けられている。この
寄託は、パテントの手続きの目的のために、微生物の寄
託の国際的認識に関するブタペスト条件に従つて行なわ
れたものである。
erichia coliラムダーgtll−E16と呼ばれ、取得番号149
6の下にCollection Nation Cultures de Micro−organi
smes,パストール研究所、25rue du Docteur Reux,75724
−Paris−Cedex 15、フランスに預けられている。この
寄託は、パテントの手続きの目的のために、微生物の寄
託の国際的認識に関するブタペスト条件に従つて行なわ
れたものである。
例 ６ ヒト（２′−５′）オリゴシンテターゼ遺伝子の組織化 ３つの重なり合つた遺伝子のクローンが、１つが、ヒ
ト血球細胞DNA（Moryら、1981）の部分的EcoR1消化物の
ライブラリーから（Maniatisら、1978）E1cDNAをプロー
ブとして用いた単離した。（Benechら、1987）。遺伝子
クローンは、ヒトDNAの約29Kbを表しており、ライブラ
リーをスクリーニングしても、１個のＥ遺伝子以上に対
する証拠は存在しなかつた。遺伝子的DNAのサザーンブ
ロツトは、単一遺伝子の存在と一致していた（第９
図）。ノーザンブロツト解析によつて、遺伝子DNA断片
をプローブとするノーザンブロツト解折により、S1ヌク
レアーゼマツピングと配列決定により、E16cDNA9−21
は、遺伝子上の５エキソンに相当することが示された。
（第９図）ATGATG配列は、エクソン３に見出されたが、
停止コドンと1.6Kb RNAのポリアデニレーシヨンの位置
を持つた翻訳されない領域は、エクソン７中に見出され
た。別の５′エクソン１と２の構造が下に記してある。
イントロ−エキソン境界の配列が決定され（Table 2）
スプライスアクセプター、ドナーサイトに対するCAGとG
T規則にしたがう（Breathnach and Chambon,1981）。最
近Keller（1984）によつて総説されたように、CTGAC/T
は、共通してスプライスアクセプターから遠くないとこ
ろに見出される。（アクセプターサイト:Table 2）Kele
r（1984）により、ラリアートモデルで役割を演じてい
ることが指摘されているCTGAC配列とイントロン−ドナ
ーの相補性に加えて、CTGAC/T領域が、イントロン／エ
クソンの３′境界の配列と相補性があるということは注
目すべきことである。
ト血球細胞DNA（Moryら、1981）の部分的EcoR1消化物の
ライブラリーから（Maniatisら、1978）E1cDNAをプロー
ブとして用いた単離した。（Benechら、1987）。遺伝子
クローンは、ヒトDNAの約29Kbを表しており、ライブラ
リーをスクリーニングしても、１個のＥ遺伝子以上に対
する証拠は存在しなかつた。遺伝子的DNAのサザーンブ
ロツトは、単一遺伝子の存在と一致していた（第９
図）。ノーザンブロツト解析によつて、遺伝子DNA断片
をプローブとするノーザンブロツト解折により、S1ヌク
レアーゼマツピングと配列決定により、E16cDNA9−21
は、遺伝子上の５エキソンに相当することが示された。
（第９図）ATGATG配列は、エクソン３に見出されたが、
停止コドンと1.6Kb RNAのポリアデニレーシヨンの位置
を持つた翻訳されない領域は、エクソン７中に見出され
た。別の５′エクソン１と２の構造が下に記してある。
イントロ−エキソン境界の配列が決定され（Table 2）
スプライスアクセプター、ドナーサイトに対するCAGとG
T規則にしたがう（Breathnach and Chambon,1981）。最
近Keller（1984）によつて総説されたように、CTGAC/T
は、共通してスプライスアクセプターから遠くないとこ
ろに見出される。（アクセプターサイト:Table 2）Kele
r（1984）により、ラリアートモデルで役割を演じてい
ることが指摘されているCTGAC配列とイントロン−ドナ
ーの相補性に加えて、CTGAC/T領域が、イントロン／エ
クソンの３′境界の配列と相補性があるということは注
目すべきことである。
1.6KbのmRNAによつて生産される（２′−５′）オリ
ゴＡシンテターゼのコーデイング領域を含む５エリクソ
ンの配列は、酵素が異なるアミノ酸組成（Table 3）を
もつた領域から成立つていることを示している。最初の
エクソンのドメイン（60アミノ酸）は、アスパラギン酸
に富んでおり、２番目では（アミノ酸61から156）アル
ギニンが優先しており、２番目の次のエクソンは（アミ
ノ酸157から218と219から295）リジンに富み、
産物（296から364）のｃ末端はプロリンとアラニンに富
んでいる。エクソンの番号のつけ方については、第７図
と第９図を見よ。CGAT/Cまたは、CTTAC,CTGTC（Keller,
1984）とスプライスアクセプターCAGの間の自己・補性
領域に下線が引いてある。
ゴＡシンテターゼのコーデイング領域を含む５エリクソ
ンの配列は、酵素が異なるアミノ酸組成（Table 3）を
もつた領域から成立つていることを示している。最初の
エクソンのドメイン（60アミノ酸）は、アスパラギン酸
に富んでおり、２番目では（アミノ酸61から156）アル
ギニンが優先しており、２番目の次のエクソンは（アミ
ノ酸157から218と219から295）リジンに富み、
産物（296から364）のｃ末端はプロリンとアラニンに富
んでいる。エクソンの番号のつけ方については、第７図
と第９図を見よ。CGAT/Cまたは、CTTAC,CTGTC（Keller,
1984）とスプライスアクセプターCAGの間の自己・補性
領域に下線が引いてある。
ヒト（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ遺伝子のエク
ソン−イントロン境界 1.6及び1.8Kb RNAs（第７図を見よ）の保持されたウ
ンデカヌクレオチドをもつたポリアデニレーシヨンサイ
トには、下に点線が記されている。カツコ内の数は、イ
ントロンまたはエクソン（第９図を見よ）をになつてい
るEcoRI遺伝子断片の大きさである。各エクソンの出発
点と終点は、第７図の９−21EcDNAにおけるように数字
がついている。
ソン−イントロン境界 1.6及び1.8Kb RNAs（第７図を見よ）の保持されたウ
ンデカヌクレオチドをもつたポリアデニレーシヨンサイ
トには、下に点線が記されている。カツコ内の数は、イ
ントロンまたはエクソン（第９図を見よ）をになつてい
るEcoRI遺伝子断片の大きさである。各エクソンの出発
点と終点は、第７図の９−21EcDNAにおけるように数字
がついている。
E16とE18の（２′−５′）オリゴシンテターゼのエクソ
ンドメイン E18cDNA48−１は不完全であるけれども、我々は、エ
クソン１−６（第９図）がノーザンブロツト上の1.6Kb
と同様に1.8KbのmRNAとハイブリツド結合することを見
出した。２つのRNAの構造はエクソン７迄は同一である
ことはかなり確からしい。E18cDNAを特徴づけるエクソ
ン７の中央からエクソン８への追加的スプライシング
は、遺伝子DNAクローン中のこれらのイントロン−エク
ソンの境界の配列を決定することにより確かめられた
（Table 2）。E18cDNA中に存在する切りつめたエクソン
7aは1.6kbRNAのポリアデニレーシヨンの位置を含む1.6K
bのイントロンに続いている。エクソン８はその遺伝子
のユニークなBam H1の位置から、98bp下流で始まる（T
able 2,第９図）AATAAAシグナルの二連の繰返しによつ
て特徴づけられる1.8Kb RNAのポリアデニレーシヨンサ
イトによつて終る。エクソン７と８は相同性がないけれ
ども、その中で３番目のシチジンが、ポリアデニル化さ
れている保持されたウンデカヌクレオチドACCATTTATTC
が両方のエクソン（Table 2）を端に存在している。以
前に指摘されたように、（Benechら、1985）ヘアピンル
ープ構造が、両方の場合にその保持されたウンデカヌク
レオチドと、AATTAAA領域の間に形成されることができ
る。このような構造が、転写物の開裂と、ポリアデニル
化が、エクソン７の端でおこるか、エクソン８の端でお
こるかを決定する、細胞特有のメカニズムに関与してい
るかもしれない。
ンドメイン E18cDNA48−１は不完全であるけれども、我々は、エ
クソン１−６（第９図）がノーザンブロツト上の1.6Kb
と同様に1.8KbのmRNAとハイブリツド結合することを見
出した。２つのRNAの構造はエクソン７迄は同一である
ことはかなり確からしい。E18cDNAを特徴づけるエクソ
ン７の中央からエクソン８への追加的スプライシング
は、遺伝子DNAクローン中のこれらのイントロン−エク
ソンの境界の配列を決定することにより確かめられた
（Table 2）。E18cDNA中に存在する切りつめたエクソン
7aは1.6kbRNAのポリアデニレーシヨンの位置を含む1.6K
bのイントロンに続いている。エクソン８はその遺伝子
のユニークなBam H1の位置から、98bp下流で始まる（T
able 2,第９図）AATAAAシグナルの二連の繰返しによつ
て特徴づけられる1.8Kb RNAのポリアデニレーシヨンサ
イトによつて終る。エクソン７と８は相同性がないけれ
ども、その中で３番目のシチジンが、ポリアデニル化さ
れている保持されたウンデカヌクレオチドACCATTTATTC
が両方のエクソン（Table 2）を端に存在している。以
前に指摘されたように、（Benechら、1985）ヘアピンル
ープ構造が、両方の場合にその保持されたウンデカヌク
レオチドと、AATTAAA領域の間に形成されることができ
る。このような構造が、転写物の開裂と、ポリアデニル
化が、エクソン７の端でおこるか、エクソン８の端でお
こるかを決定する、細胞特有のメカニズムに関与してい
るかもしれない。
上記の遺伝子マツピングに基いて、1.8Kb mRNAによ
つてコードされる酵素は、最初の346のアミノ酸中のE16
産物と同一であるべきであり、その次にアスパラギン
酸、グルタミン酸、ヌクレオチンに富んでいる。54のア
ミノ酸の長い領域が続く。400のアミノ酸の長さの、E18
酵素は46,000の分子量を持つているのであろう。
つてコードされる酵素は、最初の346のアミノ酸中のE16
産物と同一であるべきであり、その次にアスパラギン
酸、グルタミン酸、ヌクレオチンに富んでいる。54のア
ミノ酸の長い領域が続く。400のアミノ酸の長さの、E18
酵素は46,000の分子量を持つているのであろう。
例 ７ 同一遺伝子を二者選一的スクプラシングによつて生産さ
れるヒト（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの２つの
形 SV80RNAsのノーザンブロツト分析の結果、インターフ
エロンに接触した後、12時間迄に、E1cDNAとハイブリツ
ドを作る３種の（1.6,1.8及び3.6Kb）が蓄積することが
明らかになつた（Merlinら,1983）。更にその外に不安
定な転写物もみられた。これらのRNAsの間の関係を遺伝
的DNAクローン上の転写マツピングによつて研究した。
２つのヒト遺伝的ライブラリーにおいて、E1cDNAは、ヒ
トDNA（第９図）の29Kbを表す重なり合つている遺伝的D
NAのクローンの一系列のみを同定し、明らかにユニーク
な（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ遺伝子（Benech
ら,1955a）を含むことが見出された。S1ヌクレアーゼ分
析と部分的遺伝子の配列決定により、９−21（E1）のcD
NAが５つのエクソンに相当することが見出された。（第
9A図と第７図の配列に３−７の番号がついている）この
cDNAの３′未満とポリアデニレーシヨンの位置は、エク
ソン７の端にあることが同定された（第９図）。しか
し、SV80RNAのノーザンブロツトに対する、さらに下流
のジエノミツクDNA断片のハイブリツド形成により、1.6
KbのRNAだけが、エクソン７のポリアデニレーシヨンの
位置に終つており、1.8と3.6KbのRNAsは1.6Kb下流に位
置しており、やはり、ポリアデニレーシヨンの位置に終
つている（エクソン8,第９図）、更に、別のエクソンと
ハイブリツド形成を行なうことが明らかとなつた。この
ようにして、９−21（E1）cDNAは、1.6KbRNAを呈してお
り、E16cDNAと名前をつけ直した。さらに、エクソンの
３′の半分は、1.8KbのRNAとはハイブリツド結合せず、
転写がエクソン７からエクソン８への中間からスプライ
シングイベントによつて形成されるということを示して
いる。５′の上流のエキソンはすべて、1.6及び1.8KbRN
Asとハイブリツド結合し、2RNAsは、その３′未端にお
いてのみ異なることを示している。このことは、SV80λ
gt10cDNAライブラリーから1.8KbRANに対する判別スプラ
イシングを証明しており、エクソン８（第４図）のポリ
アデニレーシヨンの位置で終つている、（第４図）cDNA
クローンの単離によつて確かめられた（クローン48−１
または、E18cDNA,第7B図）。同様なcDNAクローンが、Sa
undersとWilliams（1984）によるDaudi cDNAライブラリ
ーにおいて見出された。E18の配列は、515のヌクレオチ
ドによつて置きかえられているE16の最後の247のヌクレ
オチドをロツクしており、1.6Kbと1.8KbRNAsの間の大き
さの差を説明している。
れるヒト（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの２つの
形 SV80RNAsのノーザンブロツト分析の結果、インターフ
エロンに接触した後、12時間迄に、E1cDNAとハイブリツ
ドを作る３種の（1.6,1.8及び3.6Kb）が蓄積することが
明らかになつた（Merlinら,1983）。更にその外に不安
定な転写物もみられた。これらのRNAsの間の関係を遺伝
的DNAクローン上の転写マツピングによつて研究した。
２つのヒト遺伝的ライブラリーにおいて、E1cDNAは、ヒ
トDNA（第９図）の29Kbを表す重なり合つている遺伝的D
NAのクローンの一系列のみを同定し、明らかにユニーク
な（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ遺伝子（Benech
ら,1955a）を含むことが見出された。S1ヌクレアーゼ分
析と部分的遺伝子の配列決定により、９−21（E1）のcD
NAが５つのエクソンに相当することが見出された。（第
9A図と第７図の配列に３−７の番号がついている）この
cDNAの３′未満とポリアデニレーシヨンの位置は、エク
ソン７の端にあることが同定された（第９図）。しか
し、SV80RNAのノーザンブロツトに対する、さらに下流
のジエノミツクDNA断片のハイブリツド形成により、1.6
KbのRNAだけが、エクソン７のポリアデニレーシヨンの
位置に終つており、1.8と3.6KbのRNAsは1.6Kb下流に位
置しており、やはり、ポリアデニレーシヨンの位置に終
つている（エクソン8,第９図）、更に、別のエクソンと
ハイブリツド形成を行なうことが明らかとなつた。この
ようにして、９−21（E1）cDNAは、1.6KbRNAを呈してお
り、E16cDNAと名前をつけ直した。さらに、エクソンの
３′の半分は、1.8KbのRNAとはハイブリツド結合せず、
転写がエクソン７からエクソン８への中間からスプライ
シングイベントによつて形成されるということを示して
いる。５′の上流のエキソンはすべて、1.6及び1.8KbRN
Asとハイブリツド結合し、2RNAsは、その３′未端にお
いてのみ異なることを示している。このことは、SV80λ
gt10cDNAライブラリーから1.8KbRANに対する判別スプラ
イシングを証明しており、エクソン８（第４図）のポリ
アデニレーシヨンの位置で終つている、（第４図）cDNA
クローンの単離によつて確かめられた（クローン48−１
または、E18cDNA,第7B図）。同様なcDNAクローンが、Sa
undersとWilliams（1984）によるDaudi cDNAライブラリ
ーにおいて見出された。E18の配列は、515のヌクレオチ
ドによつて置きかえられているE16の最後の247のヌクレ
オチドをロツクしており、1.6Kbと1.8KbRNAsの間の大き
さの差を説明している。
1.8KbのRNAは、したがつて、E16タンパクとそのＣ末
端が異なつている46,000−Mrのタンパクをコードしてい
る。E16タンパクと同様に、E18産物は、dsRNA結合を有
しており、（２′−５′）E18固有のDNA断片へのハイブ
リツド形成によつて選ばれたmRNAの翻訳によつて示され
た（Benechら,1985）。このことは、２種のタンパクに
共通な最初の346アミノ酸が触媒の場所を含んでいるこ
とを示唆している。エクソン組成を試験することによ
り、この共通の部分は、３つの塩基性領域が続いている
Ｎ末端酸性ドメインから構成されているように思われ
る。E16タンパクの最後の18残基は、非常に疎水性の領
域を形成しており、それはE18においては、潜在的グリ
コシル化の位置を含んでいるもつと長い水溶性で酸性の
領域でおきかえられている。２つの酸素の間のこの差
は、それらが二量化したり、または他のタンパク類や細
胞構造と相互作用を行なう能力を決定するかもしれな
い。例えば、E16は膜と結合するが、E18はリボゾームや
核の中の塩基性タンパクと相互作用を行なうかもしれな
い。
端が異なつている46,000−Mrのタンパクをコードしてい
る。E16タンパクと同様に、E18産物は、dsRNA結合を有
しており、（２′−５′）E18固有のDNA断片へのハイブ
リツド形成によつて選ばれたmRNAの翻訳によつて示され
た（Benechら,1985）。このことは、２種のタンパクに
共通な最初の346アミノ酸が触媒の場所を含んでいるこ
とを示唆している。エクソン組成を試験することによ
り、この共通の部分は、３つの塩基性領域が続いている
Ｎ末端酸性ドメインから構成されているように思われ
る。E16タンパクの最後の18残基は、非常に疎水性の領
域を形成しており、それはE18においては、潜在的グリ
コシル化の位置を含んでいるもつと長い水溶性で酸性の
領域でおきかえられている。２つの酸素の間のこの差
は、それらが二量化したり、または他のタンパク類や細
胞構造と相互作用を行なう能力を決定するかもしれな
い。例えば、E16は膜と結合するが、E18はリボゾームや
核の中の塩基性タンパクと相互作用を行なうかもしれな
い。
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの２つの形は、
インターフエロン処理のヒト細胞（Revelら,1982）の抽
出物中ゲルロ過を行なうことによつて見出された（Reve
lら、1982）、即ち、E16またはE18タンパクの単量形に
相当するかもしれない30−40Kdの酵素と、今後同定しな
ければならない60−80Kdのタンパクである。転写物のマ
ツピングが、このRNAは、1.8KbのRNAから除去されるイ
ントロン領域を（例えば、エクソン７と８の間）含んで
おり、そしてオープンリーデイングフレームがないこと
を示したので、3.6KbのRNAは、大きい酵素をコードして
いるとは思われない。我々は、接合子における翻訳にお
いて、大きなmRNAを観察できなかつた。精製ヒト（HeL
a）合成酵素中に80Kdタンパクが報告された（Yandら,19
81）が、その酵素活性は証明されなかつた。Namalvaと
とCML細胞から精製して（Revelら,1981b）酵素におい
て、我々はSDS中に、40Kdのバンドを検出できた。した
がつて、60−80Kd酵素が、40Kdタンパクのダイマーであ
る可能性が残つている。ヒトのシンテターゼは、30Kd酵
素（主に核の）をコードしている1.5KbRNAに加えて、80
Kd酵素（主に細胞質の）をコードする大きな3.8KbのRNA
が、変性条件でみられるマウスの細胞中のそれとは異な
つているかもしれない（St.Laurentら、1983）。ヒトEc
DNAは、3.8 Mbと0.6−1.7KbのRNAを検出し、大きなR
NAは、E18に特異的なDNAとハイブリツド形成をする（Ma
llucciら、1985）。ヒトの細胞では、大きなRNAが更に
加工されて、1.8Kb RNAとなり、それがマウスの細胞に
みられないという可能性がある。Shulmanら、1984）
は、ヒト細胞の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの
大きさは、ヒト細胞中でも、ヒト−げつし類のハイブリ
ツド細胞染色体へのシンテターゼ遺伝子をマツプするマ
ウスの細胞中よりも、もつと小さいタンパクとして挙動
するという事実を用いた。E16とE18に特異的な抗血清
は、これからのタンパクと２種の天然のままの酵素の２
つの形の間の関係を解明するのに役立つであろう。
インターフエロン処理のヒト細胞（Revelら,1982）の抽
出物中ゲルロ過を行なうことによつて見出された（Reve
lら、1982）、即ち、E16またはE18タンパクの単量形に
相当するかもしれない30−40Kdの酵素と、今後同定しな
ければならない60−80Kdのタンパクである。転写物のマ
ツピングが、このRNAは、1.8KbのRNAから除去されるイ
ントロン領域を（例えば、エクソン７と８の間）含んで
おり、そしてオープンリーデイングフレームがないこと
を示したので、3.6KbのRNAは、大きい酵素をコードして
いるとは思われない。我々は、接合子における翻訳にお
いて、大きなmRNAを観察できなかつた。精製ヒト（HeL
a）合成酵素中に80Kdタンパクが報告された（Yandら,19
81）が、その酵素活性は証明されなかつた。Namalvaと
とCML細胞から精製して（Revelら,1981b）酵素におい
て、我々はSDS中に、40Kdのバンドを検出できた。した
がつて、60−80Kd酵素が、40Kdタンパクのダイマーであ
る可能性が残つている。ヒトのシンテターゼは、30Kd酵
素（主に核の）をコードしている1.5KbRNAに加えて、80
Kd酵素（主に細胞質の）をコードする大きな3.8KbのRNA
が、変性条件でみられるマウスの細胞中のそれとは異な
つているかもしれない（St.Laurentら、1983）。ヒトEc
DNAは、3.8 Mbと0.6−1.7KbのRNAを検出し、大きなR
NAは、E18に特異的なDNAとハイブリツド形成をする（Ma
llucciら、1985）。ヒトの細胞では、大きなRNAが更に
加工されて、1.8Kb RNAとなり、それがマウスの細胞に
みられないという可能性がある。Shulmanら、1984）
は、ヒト細胞の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの
大きさは、ヒト細胞中でも、ヒト−げつし類のハイブリ
ツド細胞染色体へのシンテターゼ遺伝子をマツプするマ
ウスの細胞中よりも、もつと小さいタンパクとして挙動
するという事実を用いた。E16とE18に特異的な抗血清
は、これからのタンパクと２種の天然のままの酵素の２
つの形の間の関係を解明するのに役立つであろう。
例 ８ ２つ（２′−５′）のオリゴＡシンタテーゼの細胞特異
的な発現 多数のヒトの細胞系からのRNAが、ノーザンブロツト
中で、EcDNAプローブについて試験された（Merlinら、1
983;Benechら、1985）。Table 4は、ヒト細胞が、イン
ターフエロンで誘導された重要EmRNA種にしたがつて、
３つの細胞にわけることができることを示している。Bu
rkittリンパ腫からのリンパ芽球様Ｂ細胞系は、主とし
て1.8Kb RNAを有している。そうではなくて、いくつか
の細胞系は、1.6と3.6Kb RNAをもつているが、1.8Kbの
RNAは殆どもつていない。もし3.6KbRNAが部分的にスプ
ライスを受けた1.8KbRNAのプリカーサーだとすると、こ
れらの細胞は、3.6KbRNAの加工に阻害をしているのかも
しれない。Ｔ−リンパ球系（急性白血病からのCEMTとヘ
アリー細胞白血病からのGash）は、繊維芽細胞と同様
に、すべての3ERNAシリーズを含んでいる。だから、E18
ポリアデニレーシヨンの位置は、すべての人の細胞の中
で利用され、3.6か1.8KbRNAを生産しているように思わ
れる。E16pAの位置は、Ｂリンパ芽球様細胞では用いら
れていないようである。E16とE18pAの位置の両方におい
て、存在している保存されているウンデカヌクレオチド
は（第9B図）AATAAAシグナルとヘアピンループを作るこ
とができ、場所の選択に役割を演じるかもしれない（Be
nechら、1985）。E18は、AATAAAシグナル（第9B図）の
２連性繰返しを有しており、より強いpAの位置であるか
もしれない。E18のpAの位置で終る転写は、インターフ
エロン添加の後、1.6Kb RNA（Benechら、1985）よりも
早く蓄積する。
的な発現 多数のヒトの細胞系からのRNAが、ノーザンブロツト
中で、EcDNAプローブについて試験された（Merlinら、1
983;Benechら、1985）。Table 4は、ヒト細胞が、イン
ターフエロンで誘導された重要EmRNA種にしたがつて、
３つの細胞にわけることができることを示している。Bu
rkittリンパ腫からのリンパ芽球様Ｂ細胞系は、主とし
て1.8Kb RNAを有している。そうではなくて、いくつか
の細胞系は、1.6と3.6Kb RNAをもつているが、1.8Kbの
RNAは殆どもつていない。もし3.6KbRNAが部分的にスプ
ライスを受けた1.8KbRNAのプリカーサーだとすると、こ
れらの細胞は、3.6KbRNAの加工に阻害をしているのかも
しれない。Ｔ−リンパ球系（急性白血病からのCEMTとヘ
アリー細胞白血病からのGash）は、繊維芽細胞と同様
に、すべての3ERNAシリーズを含んでいる。だから、E18
ポリアデニレーシヨンの位置は、すべての人の細胞の中
で利用され、3.6か1.8KbRNAを生産しているように思わ
れる。E16pAの位置は、Ｂリンパ芽球様細胞では用いら
れていないようである。E16とE18pAの位置の両方におい
て、存在している保存されているウンデカヌクレオチド
は（第9B図）AATAAAシグナルとヘアピンループを作るこ
とができ、場所の選択に役割を演じるかもしれない（Be
nechら、1985）。E18は、AATAAAシグナル（第9B図）の
２連性繰返しを有しており、より強いpAの位置であるか
もしれない。E18のpAの位置で終る転写は、インターフ
エロン添加の後、1.6Kb RNA（Benechら、1985）よりも
早く蓄積する。
優先的に存在する（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ
RNA種 優先して作られるシンテターゼの型は、ヒトの細胞が
異なれば変化する。我々は、シンテターゼの細胞質また
は核の高圧と細胞中に存在するRNAの型との間になんら
相関関係を見出さなかつた。しかし、ゲルロカを行なつ
たとき、Namalava細胞は、主として、30 O Kd酵素で
あつたが、一方HeLaとSV80細胞は、60−80Kd型ももつて
いた（Revelら、1982） 例 ９ （２′−５′）グリコＡシンテターゼの…………領域 E16cDNA9−21クローンのエクソン３の部分を含んでい
る4.2Kb Eco R1フラグメント（Fig.9）から、0.85Kb
（Fig.10）のSph１−Sph１が、1.6,1.8,2.7及び3.6KbRN
Asとノーザンブロツクで、ハイブリツドを形成した。し
かし、上流域はハイブリツド形成をしなかつた。いくつ
かの実験により、その断片の転写の出発点の位置がわか
るようになつた。S1ヌクレアーゼによる分析によつて、
まず、エクソン３が、９−21cDNAの終りの、上流約50ヌ
クレオチドから出発していることがわかつた。９−21cD
NAの終りからのオリゴヌクレオチドを用いてのプライマ
ーの拡張実験により、mRNAの５′末端は、このcDNAの
５′の端からの、約230ヌクレオチドであるということ
を示した。リボプローブとのRNAのハイブリツド形成は
（Greenら、1983）及びRNaseによる分解によ
つてエクソン３の前に、70及び、110ヌクレオチドの２
つのエクソンの存在が示された。ユニークなHpalの位置
（第９図）において、ラベルしたプローブを用いてS1ヌ
クレアーゼを解折することによつて、mRNAの５′末端
は、最終的にHpalの位置から17ヌクレオチド上流に位置
していることがわかつた。この領域の配列は、第６図に
示されている。Hpal siteの前の17残基の転写開始位置
の決定は、−30の位置に、TATAAボツクスが存在するこ
とによつて支持されている。上流配列の著しい特徴は、
プリン含量が高いことであり（69.6％）、主としてアデ
ニン（58.9％）である。他の既知のプロモーターの上流
配列との、相同性のマトリツクスを比較したところ、ヒ
トインターフエロンプロモーター、とりわけ、インター
フエロンβ１遺伝子プロモーター（Degraveら、1981）
の配列と著しい相同性が明らかになつた。Zinnら（198
3）によつて記述された本質的な転写シグナルを含むIFN
−β１プロモーターの−75から−85のプリンに富んだ領
域は、TATAAボツクス（−40から−50）の丁度上流にあ
る（２′−５′）オリゴシンテターゼの のプロモー
ターの領域との９％の相同性を示した（第11図）このプ
リンに富んだシグナルは、TATAAボツクスとそのキヤツ
プの位置の間の小片の中のIFNβ１プロモーターの中に
繰返されている。やはり、制御的な機能をもつているか
もしれない（Nirら、1984）この領域において、IFN−β
１遺伝子と（２′−５′）オリゴシンテターゼ遺伝子は
高い。対照的に、インターフエロンで活性化される（Fe
llousら、1982;Rosaら、1983b;Friedmanら、1984）HLA
遺伝子や（Malissenら1982;Schamboeckら、1983）
II遺伝子（KarinとRichards、1982）は、この（２′
−５′）オリゴＡシンテターゼ遺伝子のプロモーターに
おいて、なんら明らかな配列関係を生じなかつた。INF
−β１の遺伝子本体とは、やはり、有意な相同性はみら
れなかつた。
RNA種 優先して作られるシンテターゼの型は、ヒトの細胞が
異なれば変化する。我々は、シンテターゼの細胞質また
は核の高圧と細胞中に存在するRNAの型との間になんら
相関関係を見出さなかつた。しかし、ゲルロカを行なつ
たとき、Namalava細胞は、主として、30 O Kd酵素で
あつたが、一方HeLaとSV80細胞は、60−80Kd型ももつて
いた（Revelら、1982） 例 ９ （２′−５′）グリコＡシンテターゼの…………領域 E16cDNA9−21クローンのエクソン３の部分を含んでい
る4.2Kb Eco R1フラグメント（Fig.9）から、0.85Kb
（Fig.10）のSph１−Sph１が、1.6,1.8,2.7及び3.6KbRN
Asとノーザンブロツクで、ハイブリツドを形成した。し
かし、上流域はハイブリツド形成をしなかつた。いくつ
かの実験により、その断片の転写の出発点の位置がわか
るようになつた。S1ヌクレアーゼによる分析によつて、
まず、エクソン３が、９−21cDNAの終りの、上流約50ヌ
クレオチドから出発していることがわかつた。９−21cD
NAの終りからのオリゴヌクレオチドを用いてのプライマ
ーの拡張実験により、mRNAの５′末端は、このcDNAの
５′の端からの、約230ヌクレオチドであるということ
を示した。リボプローブとのRNAのハイブリツド形成は
（Greenら、1983）及びRNaseによる分解によ
つてエクソン３の前に、70及び、110ヌクレオチドの２
つのエクソンの存在が示された。ユニークなHpalの位置
（第９図）において、ラベルしたプローブを用いてS1ヌ
クレアーゼを解折することによつて、mRNAの５′末端
は、最終的にHpalの位置から17ヌクレオチド上流に位置
していることがわかつた。この領域の配列は、第６図に
示されている。Hpal siteの前の17残基の転写開始位置
の決定は、−30の位置に、TATAAボツクスが存在するこ
とによつて支持されている。上流配列の著しい特徴は、
プリン含量が高いことであり（69.6％）、主としてアデ
ニン（58.9％）である。他の既知のプロモーターの上流
配列との、相同性のマトリツクスを比較したところ、ヒ
トインターフエロンプロモーター、とりわけ、インター
フエロンβ１遺伝子プロモーター（Degraveら、1981）
の配列と著しい相同性が明らかになつた。Zinnら（198
3）によつて記述された本質的な転写シグナルを含むIFN
−β１プロモーターの−75から−85のプリンに富んだ領
域は、TATAAボツクス（−40から−50）の丁度上流にあ
る（２′−５′）オリゴシンテターゼの のプロモー
ターの領域との９％の相同性を示した（第11図）このプ
リンに富んだシグナルは、TATAAボツクスとそのキヤツ
プの位置の間の小片の中のIFNβ１プロモーターの中に
繰返されている。やはり、制御的な機能をもつているか
もしれない（Nirら、1984）この領域において、IFN−β
１遺伝子と（２′−５′）オリゴシンテターゼ遺伝子は
高い。対照的に、インターフエロンで活性化される（Fe
llousら、1982;Rosaら、1983b;Friedmanら、1984）HLA
遺伝子や（Malissenら1982;Schamboeckら、1983）
II遺伝子（KarinとRichards、1982）は、この（２′
−５′）オリゴＡシンテターゼ遺伝子のプロモーターに
おいて、なんら明らかな配列関係を生じなかつた。INF
−β１の遺伝子本体とは、やはり、有意な相同性はみら
れなかつた。
（２′−５′）オリゴシンテターゼmRNA（エクソン1,
2,及びエクソン３の１部）の翻訳されないリーダーは、
その位置がFig.6に示されたような、S1分析によつて、
仮に決定された２つの短いイントロンを含んでいる。全
体のヒト（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ遺伝子
は、約13Kb（第９図）であり、エクソンの総計はmRNAs
の観察された大きさと一致している。
2,及びエクソン３の１部）の翻訳されないリーダーは、
その位置がFig.6に示されたような、S1分析によつて、
仮に決定された２つの短いイントロンを含んでいる。全
体のヒト（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ遺伝子
は、約13Kb（第９図）であり、エクソンの総計はmRNAs
の観察された大きさと一致している。
例10 （２′−５′）オリゴＡシンテターゼのラムダー−GT10
cDNAクローン ヒトSV80細胞のポリＡ＋RNAから調整したλgt10cDNA
ライブラリー（WolfとRotter、1985）を、前に記述され
た（Merlinら、1985）E1cDNAプラスミツドPst1−Pst1イ
ンサートをプローブとしてスクリーニングした。1.6KbE
RNAの３′の端に相当するインサート（Benechら、198
5）を、アガロースゲル電気泳動によつて精製し、ニツ
ク−トランスレーシヨンを行なつた（Rigbyら、197
7）。プラークを、9cmのプレート（105フアージ）から
繰返し拾いあげ、小量のλDNA調製物を、ルーチン法に
よつて（Maniatisら、1982）制限マツピングによつて解
析した。E1cDNA断片をふくむ15のλgt10 cDNAクローン
が単離され、最も長いインサートをもつたフアージ９−
２と５−２を、EcoR1できり、インサートをpBR322にサ
ブクローニングを行ない、Fig.1AのE16cDNAクローン９
−21と５−21を得た。同じライブラリーが、1.8Kb RNA
と特異的にハイブリツドを作る１断片であるフアージλ
chE1（Benechら、1985）からのヒト遺伝子的Pst1−Pst1
0.9Kb断片についてスクリーニングされた。その際、我
々は、部分的にスプライスを行なつたRNAを表している
他のcDNAクローンとともに、第1B図のλgt10cDNAクロー
ン48−１を単離した。配列決定は、MaxamとGilbert（19
80）に従つて行なわれた。制限酵素は、New England Bi
olabsと、Boehringerからであつた。PustellとKafatos
（1982a,b）の相同性マトリツクスと、ハイドロプロツ
トコンピユータープログラムは、IBMPCで行なつた。タ
ンパクのコーデイングフレームの位置を決める３塩基の
周期性は、Trifonov（1984）に従つて計算した。
cDNAクローン ヒトSV80細胞のポリＡ＋RNAから調整したλgt10cDNA
ライブラリー（WolfとRotter、1985）を、前に記述され
た（Merlinら、1985）E1cDNAプラスミツドPst1−Pst1イ
ンサートをプローブとしてスクリーニングした。1.6KbE
RNAの３′の端に相当するインサート（Benechら、198
5）を、アガロースゲル電気泳動によつて精製し、ニツ
ク−トランスレーシヨンを行なつた（Rigbyら、197
7）。プラークを、9cmのプレート（105フアージ）から
繰返し拾いあげ、小量のλDNA調製物を、ルーチン法に
よつて（Maniatisら、1982）制限マツピングによつて解
析した。E1cDNA断片をふくむ15のλgt10 cDNAクローン
が単離され、最も長いインサートをもつたフアージ９−
２と５−２を、EcoR1できり、インサートをpBR322にサ
ブクローニングを行ない、Fig.1AのE16cDNAクローン９
−21と５−21を得た。同じライブラリーが、1.8Kb RNA
と特異的にハイブリツドを作る１断片であるフアージλ
chE1（Benechら、1985）からのヒト遺伝子的Pst1−Pst1
0.9Kb断片についてスクリーニングされた。その際、我
々は、部分的にスプライスを行なつたRNAを表している
他のcDNAクローンとともに、第1B図のλgt10cDNAクロー
ン48−１を単離した。配列決定は、MaxamとGilbert（19
80）に従つて行なわれた。制限酵素は、New England Bi
olabsと、Boehringerからであつた。PustellとKafatos
（1982a,b）の相同性マトリツクスと、ハイドロプロツ
トコンピユータープログラムは、IBMPCで行なつた。タ
ンパクのコーデイングフレームの位置を決める３塩基の
周期性は、Trifonov（1984）に従つて計算した。
例11 （２′−５′）オリゴシンテターゼ遺伝子を含む遺伝子
DNAのクローン ３つの重なりのある遺伝子のクローンが、以前に記述
したように単離された（Benechら、1985）。すなわち、
部分的にEcoR1で切つたDNAライブラリーからの、λch
E1（Moryら、1981）と部分的な、Alu1/Hae3 DNAライブ
ラリー（Maniatisら、1978）からのλchE2とE3である。
これらのフアージのEcoR1遺伝子断片が、pBR322サブク
ローニングされた。エクソンマツピングは、１）サブク
ローニングを行なつた遺伝子断片の制限酵素による分解
物のサザンブロツトを、種々のcDNAプローブに、ハイブ
リツド形成を行なわせることにより、２）遺伝子DNAの
制限酵素断片を、記述されてあるように（Benechら、19
85）IFNで処理したが、処理していない細胞から、ポリ
Ａ＋RNAのノーザンブロツトとハイブリツド結合させる
ことにより、そして、３）cDNAと比較して、イントロン
−エクソンの境界の配列を決めることによつて行なつ
た。
DNAのクローン ３つの重なりのある遺伝子のクローンが、以前に記述
したように単離された（Benechら、1985）。すなわち、
部分的にEcoR1で切つたDNAライブラリーからの、λch
E1（Moryら、1981）と部分的な、Alu1/Hae3 DNAライブ
ラリー（Maniatisら、1978）からのλchE2とE3である。
これらのフアージのEcoR1遺伝子断片が、pBR322サブク
ローニングされた。エクソンマツピングは、１）サブク
ローニングを行なつた遺伝子断片の制限酵素による分解
物のサザンブロツトを、種々のcDNAプローブに、ハイブ
リツド形成を行なわせることにより、２）遺伝子DNAの
制限酵素断片を、記述されてあるように（Benechら、19
85）IFNで処理したが、処理していない細胞から、ポリ
Ａ＋RNAのノーザンブロツトとハイブリツド結合させる
ことにより、そして、３）cDNAと比較して、イントロン
−エクソンの境界の配列を決めることによつて行なつ
た。
mRNAの５′末端を含む遺伝子4,2Kb EcoR1断片の内部
Sph1−Sph1 0.78Kb小片を配決定を行なう前にpBR322の
Sph1の位置にサブクローニングを行なつた。mRNA（Dr.
D.Segev,Interyedaのおくりもの）に相補的な18−20塩
基の合成オリゴヌクレオチドを用いて、以前と同様にプ
ライマー拡張を行なつた（Roseら、1983a）。SP6ベクタ
ー中のサブクローニングの後、リボプロープの合成は、
Promega Biotecの教えに従つて行なつた。Daudiリンパ
芽球様細胞と、FS11包皮繊維芽細胞からのDNAは、Wigle
rら（1979）に従つて調整し、サザンブロツトアナリシ
スは、製造者（New England Nuclear）によつて推奨さ
れているハイブリツド形成操作Ｂを用いてGene−Screen
Plusナイロンフアイバー上で行なつた。
Sph1−Sph1 0.78Kb小片を配決定を行なう前にpBR322の
Sph1の位置にサブクローニングを行なつた。mRNA（Dr.
D.Segev,Interyedaのおくりもの）に相補的な18−20塩
基の合成オリゴヌクレオチドを用いて、以前と同様にプ
ライマー拡張を行なつた（Roseら、1983a）。SP6ベクタ
ー中のサブクローニングの後、リボプロープの合成は、
Promega Biotecの教えに従つて行なつた。Daudiリンパ
芽球様細胞と、FS11包皮繊維芽細胞からのDNAは、Wigle
rら（1979）に従つて調整し、サザンブロツトアナリシ
スは、製造者（New England Nuclear）によつて推奨さ
れているハイブリツド形成操作Ｂを用いてGene−Screen
Plusナイロンフアイバー上で行なつた。
例12 （２′−５′）オリゴＡシンテターゼのRNAのインター
フエロン作用の臨床モニター用の迅速セル・ブロツト・
アツセイ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼの測定の有用性
は、患者のインターフエロン−βに対する反応をモニタ
ーするため、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）において（Sc
hattnerら、1981a）と、筋肉注射（Schoenfeldら、198
4）によつて示された、正常な個人個人におけるPBMCの
酵素レベルは、どちらかというと一定であるからこのア
ツセイによつて、PBMCや、顆粒状の酵素の増加（Schatt
erら、1981b,1984;Schonfeldら、1985）によつて、証拠
づけられるウイルスの感染の診断が可能となつた。酵素
の減少は、様々な芽細胞に関する急性白血病をもちつづ
ける（Wallachら、1982;Schattnerら、1982）。この技
術はまた、Milliamsら（1981）によつて開拓され、現在
では、広く用いられている。
フエロン作用の臨床モニター用の迅速セル・ブロツト・
アツセイ （２′−５′）オリゴＡシンテターゼの測定の有用性
は、患者のインターフエロン−βに対する反応をモニタ
ーするため、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）において（Sc
hattnerら、1981a）と、筋肉注射（Schoenfeldら、198
4）によつて示された、正常な個人個人におけるPBMCの
酵素レベルは、どちらかというと一定であるからこのア
ツセイによつて、PBMCや、顆粒状の酵素の増加（Schatt
erら、1981b,1984;Schonfeldら、1985）によつて、証拠
づけられるウイルスの感染の診断が可能となつた。酵素
の減少は、様々な芽細胞に関する急性白血病をもちつづ
ける（Wallachら、1982;Schattnerら、1982）。この技
術はまた、Milliamsら（1981）によつて開拓され、現在
では、広く用いられている。
シンテターゼＥは、すべての３種の型のインターフエ
ロン、α，β，γによつて処理された細胞で強く誘導さ
れ、その増加は、インターフエロン活性のよいマーカー
である（Wallachら、1982）。したがつて、Ｅレベルの
測定を用いて、in vitroまたは、in vivoの細胞がイン
ターフエロンに触れ、それに反応するかどうかを決定す
ることが可能である。この測定は、該溶液に細胞をさら
し、Ｅレベルの増加を決定することによつて、その測定
をインターフエロンのアツセイに用いることができる
（Fevelら、U.S.Patent No.4,302,533）この測定は、ま
た、インターフエロンが人をはじめとして、全生体中に
増加して生産されるかどうかを確立するためにも用いら
れる。
ロン、α，β，γによつて処理された細胞で強く誘導さ
れ、その増加は、インターフエロン活性のよいマーカー
である（Wallachら、1982）。したがつて、Ｅレベルの
測定を用いて、in vitroまたは、in vivoの細胞がイン
ターフエロンに触れ、それに反応するかどうかを決定す
ることが可能である。この測定は、該溶液に細胞をさら
し、Ｅレベルの増加を決定することによつて、その測定
をインターフエロンのアツセイに用いることができる
（Fevelら、U.S.Patent No.4,302,533）この測定は、ま
た、インターフエロンが人をはじめとして、全生体中に
増加して生産されるかどうかを確立するためにも用いら
れる。
インターフエロン−βの自動的分泌作用の結果とし
て、造血性細胞の分化を通じて、（２′−５′）オリゴ
Ａシンテターゼは増加する（Yardenら、1984）。もう１
つのＥ測定の重要な応用は、インターフエロン治療を行
なつている患者のモニターを行なうことにある。臨床的
変化の外に、全身性のインターフエロンβ処理と同様
に、インターフエロンα処理によつて５−10倍増加する
PBMCEレベルを測定することによつて、患者が、インタ
ーフエロンに反応していることを確立することが可能で
ある（Schattnerら、1981a;Schoenfeldら、1984）。他
のIFNによつて誘導された活性はまた分子が、Ｅ酵素の
アツセイと同様に用いられるかもしれない。しかし、こ
の方法は、もつとも広く用いられている（Williamsら、
Borden）。
て、造血性細胞の分化を通じて、（２′−５′）オリゴ
Ａシンテターゼは増加する（Yardenら、1984）。もう１
つのＥ測定の重要な応用は、インターフエロン治療を行
なつている患者のモニターを行なうことにある。臨床的
変化の外に、全身性のインターフエロンβ処理と同様
に、インターフエロンα処理によつて５−10倍増加する
PBMCEレベルを測定することによつて、患者が、インタ
ーフエロンに反応していることを確立することが可能で
ある（Schattnerら、1981a;Schoenfeldら、1984）。他
のIFNによつて誘導された活性はまた分子が、Ｅ酵素の
アツセイと同様に用いられるかもしれない。しかし、こ
の方法は、もつとも広く用いられている（Williamsら、
Borden）。
さて、ヒトPBMC中のERNAのアツセイが同じ目的に使わ
れる。９−21EcDNAをプローブとして用い、素早いセル
ブロツトが（CheleyとAnderson,1984）PMBCについて開
発された（第14図）。EcDNAから誘導したオリゴヌクレ
オチドも、プローブとして使うことができる。10U/mlの
インターフエロンの効果は、この方法で容易に検出でき
る（第15図）107単位/1日のインターフエロンα−Ｃに
よつて処理された患者において陽性の結果が得られた。
れる。９−21EcDNAをプローブとして用い、素早いセル
ブロツトが（CheleyとAnderson,1984）PMBCについて開
発された（第14図）。EcDNAから誘導したオリゴヌクレ
オチドも、プローブとして使うことができる。10U/mlの
インターフエロンの効果は、この方法で容易に検出でき
る（第15図）107単位/1日のインターフエロンα−Ｃに
よつて処理された患者において陽性の結果が得られた。
例13 （２′−５′）オリゴＡシンテターゼに対する抗体の獲
得 天然の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性分子
に対する抗体の誘導のための抗原として役立てるため、
E16及びE18の全アミノ酸配列が選ばれた。
得 天然の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性分子
に対する抗体の誘導のための抗原として役立てるため、
E16及びE18の全アミノ酸配列が選ばれた。
ペプチドB: GLU LYS TYR LEU ARG ARG GLN LEU THR LYS PRO ARG PR
O VAL ILE LEU ASP PRO ALA ASP は、E18とE16配列に共通なアミノ酸284から303迄を含ん
でいる。
O VAL ILE LEU ASP PRO ALA ASP は、E18とE16配列に共通なアミノ酸284から303迄を含ん
でいる。
ペプチドC: ARG PRO PRO ALA SER SER LEU PRO PHE ILE PRO ALA PR
O LEU HIS GLU ALA E16（348から364迄の残基）のＣ末端を含んでいる。両
ペプチドともBaranyとMerrifield（1980）の固相ペプチ
ド合成法によつて合成された。セフアデツクスG25カラ
ム上で2Mの酢酸中で精製し、ペプチドは、Keyhole Limp
et Hemocyanin（Calbiochem.）と結合した。ペプチドＣ
のアミノ末端アルギニンのアミノ基を、Ｐ−アミノフエ
ニール酢酸でエステル化することによつて、そのアミノ
末端を通じて、キヤリアータンパンクと共軛ペプチド結
合することができる（Spirerら、1977）。ペプチドＢ
は、エチレンジアミンカルボジイミド（HoareとKoshlan
d,1967）によつて、キヤリヤータンパクとカツプルさせ
た。
O LEU HIS GLU ALA E16（348から364迄の残基）のＣ末端を含んでいる。両
ペプチドともBaranyとMerrifield（1980）の固相ペプチ
ド合成法によつて合成された。セフアデツクスG25カラ
ム上で2Mの酢酸中で精製し、ペプチドは、Keyhole Limp
et Hemocyanin（Calbiochem.）と結合した。ペプチドＣ
のアミノ末端アルギニンのアミノ基を、Ｐ−アミノフエ
ニール酢酸でエステル化することによつて、そのアミノ
末端を通じて、キヤリアータンパンクと共軛ペプチド結
合することができる（Spirerら、1977）。ペプチドＢ
は、エチレンジアミンカルボジイミド（HoareとKoshlan
d,1967）によつて、キヤリヤータンパクとカツプルさせ
た。
ラビツトに完全なFreundのアジユバンド中に乳化させ
た1mgのキヤリヤーカツプしたペプチド（0.2mgの純粋な
ペプチドに相当する）を皮下注射した。ラビツトは２週
間おきに２回強化注射により、不完全アジユバンド中の
0.5mgのキヤリヤーにカツプルしたペプチドを与え、最
大の抗体反応が出るまで続けた。ラビツトの血清中の抗
体の力価は、キヤリヤーフリーのペプチドを用いて、エ
ンザイムにリンクした、イミユノソルベントアツセイ
（Greenら、1982）において測定された。
た1mgのキヤリヤーカツプしたペプチド（0.2mgの純粋な
ペプチドに相当する）を皮下注射した。ラビツトは２週
間おきに２回強化注射により、不完全アジユバンド中の
0.5mgのキヤリヤーにカツプルしたペプチドを与え、最
大の抗体反応が出るまで続けた。ラビツトの血清中の抗
体の力価は、キヤリヤーフリーのペプチドを用いて、エ
ンザイムにリンクした、イミユノソルベントアツセイ
（Greenら、1982）において測定された。
例14 酵素を探知するための抗−（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼ活性ペプチドの抗体の使用 インターフエロン処理のヒト細胞培養物の抽出物 繊維芽様細胞系SV80と羊皮細胞系Wishをプラスチツク
でプレートでコンフルエンモノレイヤー培養を行なつ
た。Daudi細胞系は、サスペンジヨンで、1.5×106細胞/
mlまで生育させた。培養液をrIFN−β1,500μ/mlで16−
24時間処理した。ヒトrIFN−β１は、遺伝子工学にかけ
たCHO細胞によつて生産され、モノクロナール抗体クロ
マトグラフイーによつて均一になるまで精製した（Cher
najovskyら、1984）。
テターゼ活性ペプチドの抗体の使用 インターフエロン処理のヒト細胞培養物の抽出物 繊維芽様細胞系SV80と羊皮細胞系Wishをプラスチツク
でプレートでコンフルエンモノレイヤー培養を行なつ
た。Daudi細胞系は、サスペンジヨンで、1.5×106細胞/
mlまで生育させた。培養液をrIFN−β1,500μ/mlで16−
24時間処理した。ヒトrIFN−β１は、遺伝子工学にかけ
たCHO細胞によつて生産され、モノクロナール抗体クロ
マトグラフイーによつて均一になるまで精製した（Cher
najovskyら、1984）。
細胞は、４℃で、燐酸緩衝液を含んだ食塩水で２度洗
い、緩衝液、即ち20mM Hepes緩衝液、pH7、5.5mM酢酸
マグネシウム、30mMβ−メルカプトエタノール100μＭ
フエニルメチルスルフオニルフラロイド（PMSF）10％グ
リセロール及び0.5％Nonidet P−40（ND40）中で冷時融
解した。核と、こわれていない細胞を1500γで10分間遠
心分離して除いた。上澄（S1.5）をEppendorf Microfug
e中で、ミトコンドリアとライソゲームのない上澄（S1
5）を得るため、Eppendorf Microfuge中で、15,000γで
10分遠心分離した。タンパクの濃度は、ミクロアツセイ
（Bradford1976）によつて測定した。
い、緩衝液、即ち20mM Hepes緩衝液、pH7、5.5mM酢酸
マグネシウム、30mMβ−メルカプトエタノール100μＭ
フエニルメチルスルフオニルフラロイド（PMSF）10％グ
リセロール及び0.5％Nonidet P−40（ND40）中で冷時融
解した。核と、こわれていない細胞を1500γで10分間遠
心分離して除いた。上澄（S1.5）をEppendorf Microfug
e中で、ミトコンドリアとライソゲームのない上澄（S1
5）を得るため、Eppendorf Microfuge中で、15,000γで
10分遠心分離した。タンパクの濃度は、ミクロアツセイ
（Bradford1976）によつて測定した。
Beckmann冷凍遠心器中で、S15を、100,000γで２時間
遠心分離して細胞液（S1000）とミクロソーム（P100）
区分を調製した。
遠心分離して細胞液（S1000）とミクロソーム（P100）
区分を調製した。
例15 （２′−５′）オリゴＡシンテターゼのアツセイ １−２μｇのタンパクを含むS15の割当て量を20μ
の、25mM Hpes緩衝液、pH7.5、20mMg Acetate,1mM di
thiothreitol,1.5mM ATP,4μCiの32P−α−ATP,50μg/
ml poly（rI）（rC）（PL−Biochemicalから）を含む反
応液中で30℃２時間インキユベートした。５分間沸とう
させた後、Microfuge遠心分離した後、バクテリアのア
ルカリ性フオスフアターゼを250U/ml加え、反応物を37
℃で２時間インキユベートした。２から７μをwhatma
nn3mm濾紙にスポツトし、ピリジン酢酸中pH3.5で3,000V
で電気泳動を行なつて分折した。オートラジオグラフイ
ーで分折した後、（A2′ｐ）nAオリゴマースポツトを切
出し、カウントした。
の、25mM Hpes緩衝液、pH7.5、20mMg Acetate,1mM di
thiothreitol,1.5mM ATP,4μCiの32P−α−ATP,50μg/
ml poly（rI）（rC）（PL−Biochemicalから）を含む反
応液中で30℃２時間インキユベートした。５分間沸とう
させた後、Microfuge遠心分離した後、バクテリアのア
ルカリ性フオスフアターゼを250U/ml加え、反応物を37
℃で２時間インキユベートした。２から７μをwhatma
nn3mm濾紙にスポツトし、ピリジン酢酸中pH3.5で3,000V
で電気泳動を行なつて分折した。オートラジオグラフイ
ーで分折した後、（A2′ｐ）nAオリゴマースポツトを切
出し、カウントした。
例16 電気泳動−トランスフアーインミユノブロツト 粗細胞区分の一部分（30μプロテイン）を、Laemmli
のナトリウム−ドデシル−サルフエート−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動ローデイング緩衝液で調節し（Laem
mli,1970）で10分間沸騰してから、7.5または、10％ゲ
ル上で電気泳動にかけた。Amershamの14C−メチル化し
たタンパクを分子量標準物質として用いた（104cpm）。
ニトロセルローズペーパーへの電気泳動トランスフアー
は、（Schleicher及びSchull EA85）25mMトリスベー
ス、192mMグリシン及び20％メタノール中で行なわれ
た。ブロツトを0.09M NaCl,0.01Mトリス−塩酸、pH7.
5、10％（v/v）の１％フアツトミルク溶液、10％（v/
v）の熱で不活性化した仔牛胎児血清、そして、0.05％
トウイーン−20、中で37℃で２時間か、４℃で一夜、続
いて、37℃で30分予備的インキユベーシヨンを行なつ
た。次に、ブロツトは、ラビツト1gG0.1mg/mlの形で、
アンチ−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼペプチド
Ｂ抗体と２時間37℃でインキユベートした。ブロツト
は、４％仔牛血清中で10分間５回洗い、106cpm/mlのの
125I−タンパクＡ（Amersham,30mCi/mg）を含む完全な
上記前インキユベーシヨン混合物中で、37℃で１時間イ
ンキユベートし、ブロツトを洗い、オートラヂオグラフ
イーにかけた。
のナトリウム−ドデシル−サルフエート−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動ローデイング緩衝液で調節し（Laem
mli,1970）で10分間沸騰してから、7.5または、10％ゲ
ル上で電気泳動にかけた。Amershamの14C−メチル化し
たタンパクを分子量標準物質として用いた（104cpm）。
ニトロセルローズペーパーへの電気泳動トランスフアー
は、（Schleicher及びSchull EA85）25mMトリスベー
ス、192mMグリシン及び20％メタノール中で行なわれ
た。ブロツトを0.09M NaCl,0.01Mトリス−塩酸、pH7.
5、10％（v/v）の１％フアツトミルク溶液、10％（v/
v）の熱で不活性化した仔牛胎児血清、そして、0.05％
トウイーン−20、中で37℃で２時間か、４℃で一夜、続
いて、37℃で30分予備的インキユベーシヨンを行なつ
た。次に、ブロツトは、ラビツト1gG0.1mg/mlの形で、
アンチ−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼペプチド
Ｂ抗体と２時間37℃でインキユベートした。ブロツト
は、４％仔牛血清中で10分間５回洗い、106cpm/mlのの
125I−タンパクＡ（Amersham,30mCi/mg）を含む完全な
上記前インキユベーシヨン混合物中で、37℃で１時間イ
ンキユベートし、ブロツトを洗い、オートラヂオグラフ
イーにかけた。
例17 （２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性とラベルタン
パクの免疫沈澱 ５−10μのアンチ−オリゴＡシンテターゼペプチド
Ｂラビツト血清の最初の適量を、３％牛血清アルブミン
（BSA）とともに、PBS中で平衡させた3mgのタンパクＡ
−セフアロース（pharmacia）に吸着させ、30分室温
で、次にPBS−１％BSAで洗つた。（２′−５′）オリゴ
Ａシンテターゼ酵素活性の免疫沈澱には、２μｇのS15
タンパクの適量を緩衝液Ａ最終量20μとして、上のペ
レツトにした1gG−タンパクＡセフアローズに、２時間
４℃で吸着させた。緩衝液は、バツフアーＡで５倍にう
すめ、上澄液を別のチユーブに移した。ペレツトを0.5m
lのバツフアーＡで３回洗い、次に、25μの酵素反応
液中でけん濁させた（上を見よ）。活性は、結合してい
ない上澄の一部についても測定を行なつた。
パクの免疫沈澱 ５−10μのアンチ−オリゴＡシンテターゼペプチド
Ｂラビツト血清の最初の適量を、３％牛血清アルブミン
（BSA）とともに、PBS中で平衡させた3mgのタンパクＡ
−セフアロース（pharmacia）に吸着させ、30分室温
で、次にPBS−１％BSAで洗つた。（２′−５′）オリゴ
Ａシンテターゼ酵素活性の免疫沈澱には、２μｇのS15
タンパクの適量を緩衝液Ａ最終量20μとして、上のペ
レツトにした1gG−タンパクＡセフアローズに、２時間
４℃で吸着させた。緩衝液は、バツフアーＡで５倍にう
すめ、上澄液を別のチユーブに移した。ペレツトを0.5m
lのバツフアーＡで３回洗い、次に、25μの酵素反応
液中でけん濁させた（上を見よ）。活性は、結合してい
ない上澄の一部についても測定を行なつた。
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼをラベルするた
めに、Wish細胞をコンフルエントモノレイヤー迄、3cm
のプラスチツク皿で生育させ、12時間、500U/mlのrIFN
−β１で処理した。培地は、500μCiの、35S−メチオニ
ン（Amersham400mCi/mmol）を含むメチオニンフリーDME
M（GIBCO）で置き換え、細胞は、２時間インキユベート
し、PBSで洗いバツフアーＡでホモジナイズした。S15を
免疫沈澱に用いた。約107cpmのS15タンパクをペレツト
状にしたタンパクＡ−セフアロースに加え４℃で２時間
混合した。ビーズを１％BSA、１％NP40、PBS中の2M KC
lで洗い、そして、PBSだけで２回洗つた。サンプルをナ
トリウム−ドデシル−サルフエート−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によつて解折した。
めに、Wish細胞をコンフルエントモノレイヤー迄、3cm
のプラスチツク皿で生育させ、12時間、500U/mlのrIFN
−β１で処理した。培地は、500μCiの、35S−メチオニ
ン（Amersham400mCi/mmol）を含むメチオニンフリーDME
M（GIBCO）で置き換え、細胞は、２時間インキユベート
し、PBSで洗いバツフアーＡでホモジナイズした。S15を
免疫沈澱に用いた。約107cpmのS15タンパクをペレツト
状にしたタンパクＡ−セフアロースに加え４℃で２時間
混合した。ビーズを１％BSA、１％NP40、PBS中の2M KC
lで洗い、そして、PBSだけで２回洗つた。サンプルをナ
トリウム−ドデシル−サルフエート−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によつて解折した。
例18 （２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を検知するた
めの抗ペプチド抗体の使用 アンチ−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性ペプ
チド抗体におる（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活
性の免疫沈澱 抗血清Ｂは、E16とE18配列に共通なペプチドに対して
作り、一方、抗血清Ｃは、E16においてのみ使用された
ペプチドに対して作つた。我々は、これらの抗体が、
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を、特異的に
沈澱させるかどうかを確かめるために用いた。免疫1gG
−タンパクＡセフアロース上に吸着した合成活性と、上
澄に残つている同活性は、免疫していないIgGから得ら
れた同じ分画と比較した。1.6Kb NA（Wish細胞）また
は、1.8Kb RNA（Daudi cell）を、優先的に表している
２つの細胞系からの抽出物を比較した。正常血清のバツ
ククラウンドを差し引くことにより、抗−Ｂ、抗Ｃに特
異的に結合するものを評価できるようになる（第16
図）。抗Ｃは、Wish細胞からの（２′−５′）オリゴＡ
シンテターゼ活性を保持していたが、Daudi細胞からの
活性は保持していなかつた。これは、これらの細胞にE1
6mRNAそして、40Kdタンパクが存在しないことと一致し
ている（例19をみよ）。抗Ｂは、DaudiとWishの細胞抽
出物から（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を吸
着した。
めの抗ペプチド抗体の使用 アンチ−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性ペプ
チド抗体におる（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活
性の免疫沈澱 抗血清Ｂは、E16とE18配列に共通なペプチドに対して
作り、一方、抗血清Ｃは、E16においてのみ使用された
ペプチドに対して作つた。我々は、これらの抗体が、
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を、特異的に
沈澱させるかどうかを確かめるために用いた。免疫1gG
−タンパクＡセフアロース上に吸着した合成活性と、上
澄に残つている同活性は、免疫していないIgGから得ら
れた同じ分画と比較した。1.6Kb NA（Wish細胞）また
は、1.8Kb RNA（Daudi cell）を、優先的に表している
２つの細胞系からの抽出物を比較した。正常血清のバツ
ククラウンドを差し引くことにより、抗−Ｂ、抗Ｃに特
異的に結合するものを評価できるようになる（第16
図）。抗Ｃは、Wish細胞からの（２′−５′）オリゴＡ
シンテターゼ活性を保持していたが、Daudi細胞からの
活性は保持していなかつた。これは、これらの細胞にE1
6mRNAそして、40Kdタンパクが存在しないことと一致し
ている（例19をみよ）。抗Ｂは、DaudiとWishの細胞抽
出物から（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性を吸
着した。
クローニングを行なつたcDNAsから、引き出したペプ
チドに対してつくられたアンチボデイーは、従つて、特
異的に異つた（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの形
を認識する。
チドに対してつくられたアンチボデイーは、従つて、特
異的に異つた（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの形
を認識する。
例19 ヒト細胞からの（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活
性の異なる形のインミユノブロツト分析 ペプチドＢに対する抗体を、ナトリウム−ドデシル−
サルフエート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
し、電気泳動的に、ニトロセルローズ紙にブロツトされ
たヒト細胞の抽出物中の（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼに特異的に結合する能力について調べた。インミ
ユノブロツト中の抗体によつて認識される存在の他に、
我々は、インターフエロン処理によつて誘導される抽出
物中に存在する天然の（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼタンパクを期待している。そこで我我は、インミユ
ノタンパクによつて明らかとなる誘導タンパクのみを調
べた（第17図）。
性の異なる形のインミユノブロツト分析 ペプチドＢに対する抗体を、ナトリウム−ドデシル−
サルフエート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
し、電気泳動的に、ニトロセルローズ紙にブロツトされ
たヒト細胞の抽出物中の（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼに特異的に結合する能力について調べた。インミ
ユノブロツト中の抗体によつて認識される存在の他に、
我々は、インターフエロン処理によつて誘導される抽出
物中に存在する天然の（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼタンパクを期待している。そこで我我は、インミユ
ノタンパクによつて明らかとなる誘導タンパクのみを調
べた（第17図）。
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼmRNAs（例18を
みよ）の表現のパターンの差のために、Daudi,Wish及び
SV80の細胞系を比較した（例18をみよ）。抗体Ｂは、期
待されたように、E18産物に大きさが類似している45−4
6Kdのタンパクを、Daudi細胞中に検出し、Daudi細胞中
に発現されていないmRNAのE16に相当すると考えられる4
0Kdを検出できない。対照的に、40KdE16タンパクが、Wi
sh細胞には存在し、これらの細胞に、1.8KbRNAが存在し
ていないことと一致して、46KdE18が存在しない。両方
のタンパクともSV80細胞中に検出された。これらの結果
は、ヒトの細胞が、40と46Kdタンパクを生産し、そして
それは、細胞がそれぞれ、1.6と1.8KbRNAsを表現する場
合のみに起るということを、この結果は示している。
みよ）の表現のパターンの差のために、Daudi,Wish及び
SV80の細胞系を比較した（例18をみよ）。抗体Ｂは、期
待されたように、E18産物に大きさが類似している45−4
6Kdのタンパクを、Daudi細胞中に検出し、Daudi細胞中
に発現されていないmRNAのE16に相当すると考えられる4
0Kdを検出できない。対照的に、40KdE16タンパクが、Wi
sh細胞には存在し、これらの細胞に、1.8KbRNAが存在し
ていないことと一致して、46KdE18が存在しない。両方
のタンパクともSV80細胞中に検出された。これらの結果
は、ヒトの細胞が、40と46Kdタンパクを生産し、そして
それは、細胞がそれぞれ、1.6と1.8KbRNAsを表現する場
合のみに起るということを、この結果は示している。
抗−Ｂのインミユノブロツトは、また、ヒトの細胞に
は（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの２つの形のみ
ならず、多分４つの形があることを明らかにしている。
この事実は、インターフエロンによつて誘導される100K
dと67Kdの２つの他のタンパクを、抗−Ｂが、40と46Kd
のタンパクの外にはつきりと検出したという事実から導
き出せる。100KdはDaudi細胞には検出されず、抗Ｂによ
つて検出される大きなタンパクも、やはり、細胞特異的
なパターンで表現されるということを示した。抗−Ｂ
が、天然の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの形の
配列から誘導されたペプチドに対し作られ、インターフ
エロンによつて、２つのより大きいタンパクが誘導され
るということから、それらが（２′−５′）オリゴＡシ
ンテターゼシステムに属する可能性が非常に高い。これ
らが（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの形であるこ
とを確かめるために、我々は、SV80の異なる細胞区分か
ら、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼを精製した、
そして平行して抗体Ｂによつて検出されたタンパクを追
跡した。
は（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの２つの形のみ
ならず、多分４つの形があることを明らかにしている。
この事実は、インターフエロンによつて誘導される100K
dと67Kdの２つの他のタンパクを、抗−Ｂが、40と46Kd
のタンパクの外にはつきりと検出したという事実から導
き出せる。100KdはDaudi細胞には検出されず、抗Ｂによ
つて検出される大きなタンパクも、やはり、細胞特異的
なパターンで表現されるということを示した。抗−Ｂ
が、天然の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの形の
配列から誘導されたペプチドに対し作られ、インターフ
エロンによつて、２つのより大きいタンパクが誘導され
るということから、それらが（２′−５′）オリゴＡシ
ンテターゼシステムに属する可能性が非常に高い。これ
らが（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの形であるこ
とを確かめるために、我々は、SV80の異なる細胞区分か
ら、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼを精製した、
そして平行して抗体Ｂによつて検出されたタンパクを追
跡した。
２つの異なる（２′−５′）オリゴＡシンテターズ活性
型の分離 抗体Ｂによつて探知された異なる２つのタンパクの分
離が、Fig.18とFig.19に示してある40Kdタンパクの大部
分は、SV80細胞からのNP40細胞質抽出物の100,000gの上
澄（S100）中に残つている。それは、低塩濃度では、DN
AE−セルローズには吸着されず、高濃度で吸着、溶出さ
れる。対照的に、100Kdタンパクは、S100からのものに
殆ど存在せず、ミクロゾームペレツト（P100）に存在し
ており、それから、Na deoxy cholate（DOC）または0.5
MKClによつて溶解することができる。このタンパクは、
DEAE−セルローズに低塩濃度に吸着し、高塩濃度て溶出
される。67Kdと45−46Kdは、１部S100に残つているが、
比較的ミクロゾームペレツト中のmgタンパクあたりに比
較的濃縮されている。それらは、ミクロゾームからDOC
または、KClによつて容易に抽出されにくいようであ
る。
型の分離 抗体Ｂによつて探知された異なる２つのタンパクの分
離が、Fig.18とFig.19に示してある40Kdタンパクの大部
分は、SV80細胞からのNP40細胞質抽出物の100,000gの上
澄（S100）中に残つている。それは、低塩濃度では、DN
AE−セルローズには吸着されず、高濃度で吸着、溶出さ
れる。対照的に、100Kdタンパクは、S100からのものに
殆ど存在せず、ミクロゾームペレツト（P100）に存在し
ており、それから、Na deoxy cholate（DOC）または0.5
MKClによつて溶解することができる。このタンパクは、
DEAE−セルローズに低塩濃度に吸着し、高塩濃度て溶出
される。67Kdと45−46Kdは、１部S100に残つているが、
比較的ミクロゾームペレツト中のmgタンパクあたりに比
較的濃縮されている。それらは、ミクロゾームからDOC
または、KClによつて容易に抽出されにくいようであ
る。
グリセロールグリーデイエント沈降により、CM−セル
ローズ精製後S100から精製した活性は、40KdタンパクE1
6の沈降と平行していることがわかつた。P100から精製
し、DEAE−セルローズから溶出し、100及び46Kdタンパ
ク類を含む分画は、グリセロールグレーデイエントで２
つのピークにわかれ、80,000及び45,000Mrタンパクとし
て沈澱した。重いピーク中の、（２′−５′）オリゴＡ
シンテターゼは、100Kdタンパクの存在と平行してい
る。
ローズ精製後S100から精製した活性は、40KdタンパクE1
6の沈降と平行していることがわかつた。P100から精製
し、DEAE−セルローズから溶出し、100及び46Kdタンパ
ク類を含む分画は、グリセロールグレーデイエントで２
つのピークにわかれ、80,000及び45,000Mrタンパクとし
て沈澱した。重いピーク中の、（２′−５′）オリゴＡ
シンテターゼは、100Kdタンパクの存在と平行してい
る。
種々の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性型の異
なる酵素的性質 グリセロールグレーデイエントからの40Kdタンパク
は、その活性に対する至適pHが6.8であり、pH7.8では25
％しか活性がない。さらに、poly（rl）（rc）の濃度が
１μg/mlより低いと、40Kd（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼの活性は全く認められず、最大活性には、50−
100μg/mlを必要とする（第20図）。同じ高いdsRNA要求
性が、E.coliにおける組み換えDNA技術によつて作られ
た。E16 cDNA産物について見出された。
なる酵素的性質 グリセロールグレーデイエントからの40Kdタンパク
は、その活性に対する至適pHが6.8であり、pH7.8では25
％しか活性がない。さらに、poly（rl）（rc）の濃度が
１μg/mlより低いと、40Kd（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼの活性は全く認められず、最大活性には、50−
100μg/mlを必要とする（第20図）。同じ高いdsRNA要求
性が、E.coliにおける組み換えDNA技術によつて作られ
た。E16 cDNA産物について見出された。
グリセロールグレーデイエントの後100Kdタンパクは
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼについての至適pH
は、7.6であり、酸性では活性がより低い。それは、極
度に低いpoly（rl）（rC）の濃度あるいは、存在しない
状態で、既に最大の活性を有し、そして高濃度のdsRNA
で阻害さえ起る。これは、異なる（２′−５′）オリゴ
Ａシンテターゼの形がそれらの細胞質中の局在位置及び
酵素的性質が違つているため、異なる条件で使用される
ことを強く示唆している。
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼについての至適pH
は、7.6であり、酸性では活性がより低い。それは、極
度に低いpoly（rl）（rC）の濃度あるいは、存在しない
状態で、既に最大の活性を有し、そして高濃度のdsRNA
で阻害さえ起る。これは、異なる（２′−５′）オリゴ
Ａシンテターゼの形がそれらの細胞質中の局在位置及び
酵素的性質が違つているため、異なる条件で使用される
ことを強く示唆している。
多くの観察の結果、インターフエロンで誘導された
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼは、（1984年Reve
lによつて総説されている）その抗ウイルス効果に加え
て２つの、みたところ反対の細胞成長のフエーズ（セル
サイクリングと成長の阻害）に関与していることが示唆
される。これは、複数の（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼの型の問題と関係しているかもしれない。同調細
胞培養において、我々は、（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼが、セルサイクルタンパクとして作用すること
を観察した（Mallucciら、1985）。このようにして、マ
ウス胚芽の繊維芽細胞の同調培養により、（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼ活性と、（２′−５′）Ａ
シンテターゼmRNAが、Ｓ−期の終りに上昇し、細胞がG2
期に進むと、そのRNAと酵素活性が急速に消えることが
示された。抗マウスインターフエロン抗体は、オリゴＡ
シンテターゼ誘導を減少した。この系において、我々
は、Ｓ−フエーズにおいて蓄積する（２′−５′）オリ
ゴＡシンテターゼは、外生インターフエロンで処理した
とき、同じ細胞に蓄積する1.7KbRNA種とは異つた大きな
４−5Kbの転写物であることも観察した。このことは、
Ｓ−フエーズの（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ
は、外から加えたインターフエロンによつて成長を止め
られた細胞中のシンテターゼとは異なる形であることを
示唆している。その大きなmRNAのため、それは、低いds
RNAを要求する形である100Kdに近いものと思われる。抗
−Ｂ抗体は、マウス細胞中に、（２′−５′）オリゴＡ
シンテターゼの複数の型を検出している。これらの観察
は、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの４つの型を
別々にアツセイすることが出来ることの利点を、わかり
易く説明している。このシンテターゼは、個々に、種々
の生理的条件及び病気によつて変化しうる。
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼは、（1984年Reve
lによつて総説されている）その抗ウイルス効果に加え
て２つの、みたところ反対の細胞成長のフエーズ（セル
サイクリングと成長の阻害）に関与していることが示唆
される。これは、複数の（２′−５′）オリゴＡシンテ
ターゼの型の問題と関係しているかもしれない。同調細
胞培養において、我々は、（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼが、セルサイクルタンパクとして作用すること
を観察した（Mallucciら、1985）。このようにして、マ
ウス胚芽の繊維芽細胞の同調培養により、（２′−
５′）オリゴＡシンテターゼ活性と、（２′−５′）Ａ
シンテターゼmRNAが、Ｓ−期の終りに上昇し、細胞がG2
期に進むと、そのRNAと酵素活性が急速に消えることが
示された。抗マウスインターフエロン抗体は、オリゴＡ
シンテターゼ誘導を減少した。この系において、我々
は、Ｓ−フエーズにおいて蓄積する（２′−５′）オリ
ゴＡシンテターゼは、外生インターフエロンで処理した
とき、同じ細胞に蓄積する1.7KbRNA種とは異つた大きな
４−5Kbの転写物であることも観察した。このことは、
Ｓ−フエーズの（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ
は、外から加えたインターフエロンによつて成長を止め
られた細胞中のシンテターゼとは異なる形であることを
示唆している。その大きなmRNAのため、それは、低いds
RNAを要求する形である100Kdに近いものと思われる。抗
−Ｂ抗体は、マウス細胞中に、（２′−５′）オリゴＡ
シンテターゼの複数の型を検出している。これらの観察
は、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの４つの型を
別々にアツセイすることが出来ることの利点を、わかり
易く説明している。このシンテターゼは、個々に、種々
の生理的条件及び病気によつて変化しうる。
例20 抗−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性ペプチド
抗体を（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性のイン
ミユノアツセイに使用すること 抗−Ｂ抗体は、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ
のすべての型を認識するので、それは、培養または直接
患者から得られたヒト細胞からの分別前の抽出物中にお
いての（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのインミユ
ノアツセイのために用いることができる。
抗体を（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ活性のイン
ミユノアツセイに使用すること 抗−Ｂ抗体は、（２′−５′）オリゴＡシンテターゼ
のすべての型を認識するので、それは、培養または直接
患者から得られたヒト細胞からの分別前の抽出物中にお
いての（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのインミユ
ノアツセイのために用いることができる。
固相のラジオインミユノアツセイの例が、第21図に示
される。インターフエロンで処理してあるか、処理して
いないか、いずれのWishとDaudi CellをNP40を含む、Bu
fferAで融解し、上記の如く、microfuge遠心で、S15を
調整した。１〜10μｇのタンパクを含む１部をとり、直
接にニトロセルローズペーパー（もしくは、他のタンパ
ク結合性紙）に適用し、そのシートを、正規のインミユ
ノプロツト（例19）に対する場合のように抗−Ｂで処理
した。Fig.11のオートラジオグラフイーが示すように、
125I−タンパクＡは、インターフエロン処理細胞から由
来するサンプルのみと結合する。このアツセイは、ラベ
ルタンパクＡを、パーオキシダーゼかβガラクトシダー
ゼを共軛させた抗−ラビツトIgGと置き換えることによ
つて、エンザイム−リンクト−インミユノアツセイ（EL
ISA）の形でも使うことができるのは明らかである。
される。インターフエロンで処理してあるか、処理して
いないか、いずれのWishとDaudi CellをNP40を含む、Bu
fferAで融解し、上記の如く、microfuge遠心で、S15を
調整した。１〜10μｇのタンパクを含む１部をとり、直
接にニトロセルローズペーパー（もしくは、他のタンパ
ク結合性紙）に適用し、そのシートを、正規のインミユ
ノプロツト（例19）に対する場合のように抗−Ｂで処理
した。Fig.11のオートラジオグラフイーが示すように、
125I−タンパクＡは、インターフエロン処理細胞から由
来するサンプルのみと結合する。このアツセイは、ラベ
ルタンパクＡを、パーオキシダーゼかβガラクトシダー
ゼを共軛させた抗−ラビツトIgGと置き換えることによ
つて、エンザイム−リンクト−インミユノアツセイ（EL
ISA）の形でも使うことができるのは明らかである。
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのインミユノア
ツセイは迅速であり、細胞抽出物調製に20分、抗−Ｅと
タンパク−Ａ吸着及び洗浄に２時間である。このアツセ
イは感度が高く、非常に少量の細胞抽出物でも、その
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼレベルを測るのに
十分である。それは特異性があり、インターフエロン処
理をしていない細胞においては、全くシグナルが表れな
い。
ツセイは迅速であり、細胞抽出物調製に20分、抗−Ｅと
タンパク−Ａ吸着及び洗浄に２時間である。このアツセ
イは感度が高く、非常に少量の細胞抽出物でも、その
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼレベルを測るのに
十分である。それは特異性があり、インターフエロン処
理をしていない細胞においては、全くシグナルが表れな
い。
例21 細胞中の（２′−５′）オリゴＡシンテターゼの免疫蛍
光顕微鏡法 酵素的アツセイによつて、ウイルスに感染した患者の
末梢血単核細胞において、（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼが上昇することが確立された（前の研究をみ
よ）。抗−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼペプチ
ド抗体は、細胞一般、特に白血球中の（２′−５′）オ
リゴＡシンテターゼの上昇を探知するために、抗−
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼを免疫蛍光顕微鏡
法の形で用いることができる。
光顕微鏡法 酵素的アツセイによつて、ウイルスに感染した患者の
末梢血単核細胞において、（２′−５′）オリゴＡシン
テターゼが上昇することが確立された（前の研究をみ
よ）。抗−（２′−５′）オリゴＡシンテターゼペプチ
ド抗体は、細胞一般、特に白血球中の（２′−５′）オ
リゴＡシンテターゼの上昇を探知するために、抗−
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼを免疫蛍光顕微鏡
法の形で用いることができる。
健康な供血者及び急性ウイルス疾患をもつた患者から
血液（2ml）を採血した。単核血液細胞をFicoll−Hypaq
ue（フアルマシア）遠心によつて分離し、カバーグラス
の上に、直接かまたはサイトスピンミクロフユージ（ミ
クロヘマトクリツト）を用いてひろげた。細胞をPBSで
洗い、３％フオルムアルデヒド常温で30分間固定し、PB
Sですすぎ、Hankの塩中で0.5％Triton−X100で５分間処
理し、再びPBSとPBS−２％ゼラチンですすいだ。次に、
PBSゼラチンで1:5に稀釈した抗Ｂ血清40μの小滴をパ
ラフイルム上に加え、カバーグラスを重ね、インキユベ
ートした。室温で60分後、カバーグラスPBS−ゼラチン
及び1:20に稀釈したFIIG共軛抗−ラビツトIgG（Bioyed
a）中ですすぎ、パラフイルム操作にかけた。室温で20
分たつてから、カバーグラスをPBS−ゼラチンで２回洗
い、次に水で洗い、Miviol ４−88（ヘキスト）−グリ
セロール（2.5gMoviol,6gグリセロール及び12mlの0.2M
トリス塩酸pH8.5を加えた水6ml、50℃でインキユベート
し、5,000gで15分沈澱物をのぞいたもの）とともに、顕
微鏡スライド状にマウントする。同時に、抗−Ｂの代り
に、正常のラビツトの血清を用いてカバーグラスを処理
した。スライドをツアイス蛍光顕微鏡で観察し、30秒の
露出で、ポロライドフイルムに写した。
血液（2ml）を採血した。単核血液細胞をFicoll−Hypaq
ue（フアルマシア）遠心によつて分離し、カバーグラス
の上に、直接かまたはサイトスピンミクロフユージ（ミ
クロヘマトクリツト）を用いてひろげた。細胞をPBSで
洗い、３％フオルムアルデヒド常温で30分間固定し、PB
Sですすぎ、Hankの塩中で0.5％Triton−X100で５分間処
理し、再びPBSとPBS−２％ゼラチンですすいだ。次に、
PBSゼラチンで1:5に稀釈した抗Ｂ血清40μの小滴をパ
ラフイルム上に加え、カバーグラスを重ね、インキユベ
ートした。室温で60分後、カバーグラスPBS−ゼラチン
及び1:20に稀釈したFIIG共軛抗−ラビツトIgG（Bioyed
a）中ですすぎ、パラフイルム操作にかけた。室温で20
分たつてから、カバーグラスをPBS−ゼラチンで２回洗
い、次に水で洗い、Miviol ４−88（ヘキスト）−グリ
セロール（2.5gMoviol,6gグリセロール及び12mlの0.2M
トリス塩酸pH8.5を加えた水6ml、50℃でインキユベート
し、5,000gで15分沈澱物をのぞいたもの）とともに、顕
微鏡スライド状にマウントする。同時に、抗−Ｂの代り
に、正常のラビツトの血清を用いてカバーグラスを処理
した。スライドをツアイス蛍光顕微鏡で観察し、30秒の
露出で、ポロライドフイルムに写した。
Fig.22は、リンパ球が、ウイルスの感染患者からの血
液サンプル中においては、抗−（２′−５′）−オリゴ
−シンテターゼで染まり、健康な供血サンプルでは染ら
ず、マクロフアージと顆粒球だけに弱い蛍光がみられる
にすぎないことを示している。正常の血清は、リンパ球
を染めないが、マクロフアージまたは顆粒球において
も、低いバツクグラウンドを与える。従つて、本抗−
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼペプチド抗体は、
細胞が、インターフエロンと反応して、（２′−５′）
オリゴＡシンテターゼを蓄積したかどうかを評価するた
めに、培養、血液組織片中の細胞の顕微鏡的観察に用い
ることができる。
液サンプル中においては、抗−（２′−５′）−オリゴ
−シンテターゼで染まり、健康な供血サンプルでは染ら
ず、マクロフアージと顆粒球だけに弱い蛍光がみられる
にすぎないことを示している。正常の血清は、リンパ球
を染めないが、マクロフアージまたは顆粒球において
も、低いバツクグラウンドを与える。従つて、本抗−
（２′−５′）オリゴＡシンテターゼペプチド抗体は、
細胞が、インターフエロンと反応して、（２′−５′）
オリゴＡシンテターゼを蓄積したかどうかを評価するた
めに、培養、血液組織片中の細胞の顕微鏡的観察に用い
ることができる。
先行技術の文献名 REFERENCES −Baglioni C.and Nilsen T.W.（1983）in Gresser,I.
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viral diseases.Lancet 2,497−500. −Schattner A.,Merlin G.,Shapira A.,Revel M.,Walla
ch D.（1982a）Comparison of（２′−５′）Oligoaden
ylate Synthese and Interferon Blood−Levels in Mic
e early after viral Infection.J Interferon Res 2:2
85−289. −Schattner A.,Wallach D.,Merlin G.,Hahn T.,Levin
S.,Ramot B.,Revel M.（1982b）.Variations of（２′
−５′）oligo A synthetase level in lymphocytes an
d granu−locytes of patients with viral infections
and leu−kemia.J.Interferon Res.2,355−361. −Schattner A.,Merlin G.,Bregman U.,Hahn T.,Levin
S.,Revel M.,Wallach D.（1984）．（２′−５′）olig
o A synthetase in human polymorphonuclear cells in
creased activity in interferon treatment and in vi
ral infec−tions.Clin.Exp.Immunol.57,265−270. −Schoenfeld A.,Nitke S.,Schattner A.,Wallach D.,C
respi M.,Hahn T.,Levavi H.,Ovadia J.,Shoham J.,Doe
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feron−β1injections in treatment of condylomate a
cuminata,Lancet i,1038−1042. −Schoenfeld A.,Ovadia J.,Levavi C.,Nitke S.,Walla
ch D.,Schattner A.,Revel M.（1985）.Indentificatio
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（２′−５′）oligoadenylate synthetase.Early Huma
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9）Cell 16,777−785. −Williams BRG and Read SE（1981）.Detection of el
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299:833−836. −Wallach D.,Schattner A.,Merlin G.,Kimchi A.,Fell
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983）in DeMaeyer,E.,Schellekens,H.（eds）The Biolo
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9. −Weissenbach J.,Zeevi M.,Landau T.and Revel M.（1
979）,Eur.J.Biochem 98:1−8. −Wells V.and Mallucci L.（1985）J.Cell.Biol.,in p
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9）Cell 16,777−785. −Williams BRG and Read SE（1981）.Detection of el
evated levels of the interferon−induced enzyme,2
−5 synthetase,in infectious disease and in purtur
ition.In DaMaeyer E.,Galasso C.,Schellekens H.（ed
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ier/North Holland Biome−dical Press.pp 111−114. −Wolf D.and Rotter V.（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.U
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28. −Yarden A.,Shure−Gottlieb H.,Chebath J.,Revel M.
and Kimchi A.（1984）EMBO J.3,969−973. −Zilberstein A.,Kimchi,A.Schmidt A.and Revel M.
（1978）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75,4734−4738. −Zinn K.,DiMaio D.and Maniatis T.（1983）Cell 34,
865−879.
第１図は、（２′−５′）オリゴＡ合成酵素E1cDNAクロ
ーン174−３の構造と配列を示す。 第２図は、SV80及びNamalva細胞中のE1特異性mRNAの大
きさ及び誘導を示す。 第３図は、IFN−誘導mRNAのための保有cDNAの、組換え
プラスミドクローンC56のRNAのブロツトとハイブリツド
を形成することによる、特性決定を示す。 第４図は、部分的制限地図及び挿入C56450bpのヌクレオ
チド配列を示す。 第５図は、IFNによるC56mRNAの誘導の時間経過を示す。 第6A図及び第6B図は、それぞれ、1.6Kb及び1.8KbのcDNA
の地図である。 第7A図及び第7B図は、それぞれ、1.6Kb1.8Kbに対するcD
NAの塩基配列を示す。 第８図は、２個の（２′−５′）オリゴＡ合成酵素のＣ
−末端のハイドロパシープロツトを示している。 第９図は、ヒト（２′−５′）オリゴ合成酵素遺伝子の
制限地図を示している。 第10図は、ヒト（２′−５′）オリゴ合成酵素遺伝子の
プロモーター領域を示している。 第11図は、ヒト（２′−５′）オリゴＡシンテターゼプ
ロモーター領域の塩基配列を示している。 第12図は、（２′−５′）オリゴＡ合成酵素の免疫沈降
反応を示している。 第13図は、E.COliにおけるE16cDNAの発現を示してい
る。 第14図はヒト末梢白血球中の（２′−５′）オリゴＡシ
ンテターゼRNAの迅速なアツセイ法を示している。 第15図は、ヒトPBMCの（２′−５′）オリゴシンテター
ゼERNAに対するに対するクイツクセルブロツトを示して
いる。 第16図は、抗ペプチド抗原による（２′−５′）Ａ合成
酵素活性の特異免疫沈降反応を示している。 第17図は、ヒト細胞とサブフラクシヨンにおける（２′
−５′）Ａ合成酵素の異型を示している。 第18図は、SV80細胞中の（２′−５′）Ａ合成繊維の諸
型を示している。 第19図は、２′−５′Ａ合成酵素の４型の分析と細胞内
の位置を示している。 第20図は、SV80由来の（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼの諸型の二重螺線RNA要求性を示している。 第21図は（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのラジオ
インミユノアツセイを示している。 第22図は末梢血液単核細胞と抗OASE血清の免疫抗体蛍光
染色によるウイルス性疾患の診断を示している。
ーン174−３の構造と配列を示す。 第２図は、SV80及びNamalva細胞中のE1特異性mRNAの大
きさ及び誘導を示す。 第３図は、IFN−誘導mRNAのための保有cDNAの、組換え
プラスミドクローンC56のRNAのブロツトとハイブリツド
を形成することによる、特性決定を示す。 第４図は、部分的制限地図及び挿入C56450bpのヌクレオ
チド配列を示す。 第５図は、IFNによるC56mRNAの誘導の時間経過を示す。 第6A図及び第6B図は、それぞれ、1.6Kb及び1.8KbのcDNA
の地図である。 第7A図及び第7B図は、それぞれ、1.6Kb1.8Kbに対するcD
NAの塩基配列を示す。 第８図は、２個の（２′−５′）オリゴＡ合成酵素のＣ
−末端のハイドロパシープロツトを示している。 第９図は、ヒト（２′−５′）オリゴ合成酵素遺伝子の
制限地図を示している。 第10図は、ヒト（２′−５′）オリゴ合成酵素遺伝子の
プロモーター領域を示している。 第11図は、ヒト（２′−５′）オリゴＡシンテターゼプ
ロモーター領域の塩基配列を示している。 第12図は、（２′−５′）オリゴＡ合成酵素の免疫沈降
反応を示している。 第13図は、E.COliにおけるE16cDNAの発現を示してい
る。 第14図はヒト末梢白血球中の（２′−５′）オリゴＡシ
ンテターゼRNAの迅速なアツセイ法を示している。 第15図は、ヒトPBMCの（２′−５′）オリゴシンテター
ゼERNAに対するに対するクイツクセルブロツトを示して
いる。 第16図は、抗ペプチド抗原による（２′−５′）Ａ合成
酵素活性の特異免疫沈降反応を示している。 第17図は、ヒト細胞とサブフラクシヨンにおける（２′
−５′）Ａ合成酵素の異型を示している。 第18図は、SV80細胞中の（２′−５′）Ａ合成繊維の諸
型を示している。 第19図は、２′−５′Ａ合成酵素の４型の分析と細胞内
の位置を示している。 第20図は、SV80由来の（２′−５′）オリゴＡシンテタ
ーゼの諸型の二重螺線RNA要求性を示している。 第21図は（２′−５′）オリゴＡシンテターゼのラジオ
インミユノアツセイを示している。 第22図は末梢血液単核細胞と抗OASE血清の免疫抗体蛍光
染色によるウイルス性疾患の診断を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 33/573 33/573 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ，13（４）（1985）Ｐ．1267 −1281 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，80（16）（1983）Ｐ．4904 −4908
Claims (14)
- 【請求項１】（２′−５′）オリゴＡ合成酵素活性を有
し、以下に示されたアミノ酸配列をもつ酵素をコードす
るDNA配列。 - 【請求項２】（２′−５′）オリゴＡ合成酵素活性を有
し、以下に示されたアミノ酸１−364の配列、及び以下
に示されたアミノ酸347−400配列をもつ酵素をコードす
るDNA配列。 - 【請求項３】以下の制限酵素地図を示す特許請求の範囲
第１項記載のDNA配列。 - 【請求項４】以下に示すヌクレオチド配列を包含する特
許請求の範囲第１項記載のDNA配列。 - 【請求項５】以下に示すヌクレオチド１−1071の配列及
び以下に示すヌクレオチド1072−1590の配列を包含する
特許請求の範囲第２項記載のDNA配列。 - 【請求項６】（２′−５′）オリゴＡ合成酵素活性を有
し以下のＡに示されたアミノ酸配列をもつ酵素をコード
するDNA配列によってコードされる酵素のＣ末端ペプタ
デカペプチドをコードし、以下のＢに示すヌクレオチド
1075−1124の配列を包含するDNA配列。 - 【請求項７】以下に示すDNA配列を有するプロモーター
を包含する特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれかの
DNA配列。 - 【請求項８】以下に示すヌクレオチド配列を包含するDN
A配列から本質的に成る挿入DNA配列を包含するDNA発現
ベクター。 - 【請求項９】挿入DNA配列がコード配列発現に適切なlac
Z遺伝子と相中に融合されたλgt ll−E16である、特許
請求の範囲第８項のDNA発現ベクター。 - 【請求項１０】以下に示すヌクレオチド１−1071の配列
及び以下に示すヌクレオチド1072−1590の配列を包含す
るDNA配列から本質的になる挿入DNA配列を包含するDNA
発現ベクター。 - 【請求項１１】以下に示すヌクレオチド配列を包含する
DNA配列から本質的に成る挿入DNA配列を包含するDNA発
現ベクターにより形質転換された微生物。 - 【請求項１２】挿入DNA配列がコード配列発現に適切なl
acZ遺伝子と相中に融合されたλgt ll−E16である、特
許請求の範囲第11項の微生物。 - 【請求項１３】以下に示すヌクレオチド１−1071の配列
及び以下に示すヌクレオチド1072−1590の配列を包含す
るDNA配列から本質的になる挿入DNA配列を包含するDNA
発現ベクターである特許請求の範囲第11項の微生物。 - 【請求項１４】Echerichia coliである特許請求の範囲
第11項から第13項のいずれかに記載の微生物。
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| IL78445 | 1986-04-08 | ||
| IL7844586A IL78445A (en) | 1986-04-08 | 1986-04-08 | Antibodies to subtypes of (2'-5') oligo-a-synthetase, an assay for said subtypes, and a method and kit for monitoring interferon activity |
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