JP2002511267A - 骨髄増殖性障害および白血病に関連する単離されたｓｈ３遺伝子ならびにその使用 - Google Patents

骨髄増殖性障害および白血病に関連する単離されたｓｈ３遺伝子ならびにその使用

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ジュリー アール コレンバーグ
シャオ−ニン チェン
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セダーズ−シナイ ヘルス システム、イーティー エーエル
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、一連のＳＨ３遺伝子、類似物、断片、突然変異体およびそれらの変種の孤立核酸および対応アミノ酸に関する。本発明は、ポリペプチド、融解タンパク、混合染色体、アンチセンス分子、抗体およびその使用方法を提供する。本発明はまた、対象物が、巨核球異常、骨髄芽球不秩序、血小板不秩序、細網内皮系無秩序、もしくは白血病、もしくは神経系異常発達に伴う無秩序か否かを決定する診断方法およびその治療方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【研究の背景】
本発明に繋がる研究は国立健康研究所（the National Institutes of Health
）からのthe Clinical Molecular Core grant NICHD P01HD17449 によって一部
支持されている。この政府機関は本発明に対して一定の権利を有するであろう。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一連のＳＨ３遺伝子、類似物、断片、突然変異体およびそれらの変
種の孤立核酸および対応アミノ酸に関する。本発明は、ポリペプチド、融解タン
パク、混合染色体、アンチセンス分子、抗体およびその使用方法を提供する。本
発明はまた、対象物が、巨核球異常、骨髄芽球不秩序、血小板不秩序、細網内皮
系無秩序、もしくは白血病、もしくは神経系異常発達に伴う無秩序か否かを決定
する診断方法およびその治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 人間のＳＨ３Ｄ１Ａ構造およびホモロジーを示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月８日（２０００．１２．８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 骨髄増殖性障害および白血病に関連する単離されたＳＨ３遺伝
子ならびにその使用
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明に至る研究の一部は、米国国立衛生研究所のＣｌｉｎｉｃａｌ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｏｒｅ基金ＮＩＣＨＤ Ｐ０１ＨＤ１７４４９による援助を受
けた。政府は本発明に対し所定の権利を有する。
【０００２】 発明の分野 本発明は、一連のＳＨ３遺伝子、その類似物、フラグメント、変異体、および
改変体の単離された核酸および対応するアミノ酸に関する。本発明は、ポリペプ
チド、融合タンパク質、キメラ、アンチセンス分子、抗体、およびそれらの使用
を提供する。また、本発明は、被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障
害、造血障害、もしくは白血病、または異常神経発達に関連する障害を有するか
どうかを判定する診断方法、およびそれらの治療的処置に関する。
【０００３】 発明の背景 ダウン症候群はヒト第２１染色体（ＨＳＡ２１）のトリソミーによって生じ、
精神遅滞の最も一般的な常染色体の形態である。世界的に罹患および死亡の重要
な原因であるダウン症候群（ＤＳ）と白血病との間の関連について記載した最初
の報告は、１９３０年に発表された。それ以降、ＤＳ患者の急性白血病の発症率
の増加が明確に確定されている。しかし、Ｍ７サブタイプ、ＡＭＫＬ、急性巨核
芽球性白血病はＤＳに多く認められるが、非ＤＳでは比較的まれである。骨髄増
殖の制御における不安定は、素因因子と見なされている。ＤＳを伴う急性骨髄性
白血病患者の発症率は、蒙古症を伴わない小児の該疾患の発症率に類似している
ことを指摘するものもいる。第２１染色体は、ヒト染色体の異数性の研究のため
のモデルであり、その身体および転写マップは異数性依存性表現型を分子レベル
で理解するのに必要な工程である。
【０００４】 ヒト第２１染色体は、ほぼ完全な身体マップを有しており、その長さのほとん
どに渡る連続する組の重複ＹＡＣｓは良好に特徴付けられている（Ｃｈｕｍａｋ
ｏｖら、１９９２；Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９５；Ｋｏｒｅｎｂｅｒｇら、１９
９５）。遺伝子の単離を目的とする配列決定用コンティグおよびクローンが必要
になったことから、コスミド（Ｐａｔｉｌら、１９９４；Ｓｏｅｄａら、１９９
５）中、より最近ではＰ１誘導性人工染色体（ＰＡＣｓ；Ｏｅｇａｗａら１９９
６およびＨｕｂｅｒｔら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４１：２１８−２２６）
中により分析能が高い多くのコンティグを構築することが進められた。精神遅滞
を含むＤＳのいくつかの表現型の特徴を有するトリソミー個体の部分には重複領
域が多く認められるため、ＣＢＲからＤ２１Ｓ５５の領域をマッピングすること
がかなり試みられている。しかし、遠位および隣接の４〜５ＭｂのＤ２１Ｓ５５
〜ＭＸ１領域も、ＤＳ−ＣＨＤおよびＤＳの他の特徴に関連する（Ｋｏｒｅｎｂ
ｅｒｇら、１９９２、１９９４）。
【０００５】 第２１染色体の完全なモノソミーは通常子宮内で（ｉｎ ｕｔｅｒｏ）致死性
であるが、まれに第２１染色体の欠失を伴う個体が生存する場合がある。これら
の個体は、精神運動および精神遅滞、先天的心疾患、全前脳症、小眼球症、骨格
の奇形、および生殖器形成不全を含む臨床特徴の特徴的部分集合を示す。巨核球
異常がこの集合に加えられ、該疾患は、第２１染色体の重複欠失および血小板減
少を伴う４例の患者の臨床、細胞遺伝学、および分子分析によって、この特長に
対する最小の「重複」領域を規定する。
【０００６】 非キメラＹＡＣｓは数個のギャップを有するこの距離に渡るが、より高い分析
能のマップは、Ｄ２１Ｓ５５〜ＭＸ１領域のほとんどに対して利用することがで
きない。ＤＥＬ２１ＲＷは、２つの介在性欠失（１つはＹＡＣ６２Ｇ５〜ＹＡＣ
７６０Ｈ５によって規定される２１ｑ２１．３−２２．１であり、第２はＩＦＮ
ＡＲ〜ＣＢＲを欠失する２１ｑ２２．２である）を保有する。ＤＥＬ２１ＬＳは
、ＹＡＣ７６０Ｈ５〜ＡＭＬ１遺伝子の２１ｑ２２．１の介在性欠失を保有する
。Ｋｏｒｅｎｂｅｒｇらは、患者のＤＥＬ２１ＨＪの欠失はＤ２１Ｓ９３〜ＡＭ
Ｌ１を含むことを報告した。ＤＥＬ２１ＳＶは、可能な末端欠失、２１ｑ２２．
１３−ｑｔｅｒを有し、Ｄ２１Ｓ３２４〜Ｄ２１Ｓ１２３のちょうど近位から延
長している。従って、一般的な欠失された領域、または重複領域は、Ｄ２１Ｓ３
２４〜ＡＭＬ１であり、ただ３つの既知の遺伝子（ＡＭＬ１、ＫＣＮＥ１、およ
びＵＮＯ２）を含有する２Ｍｂ未満の領域である。２例の患者、ＤＥＬ２１ＨＪ
およびＤｅｌ２１ＲＷの骨髄検査は、正常な骨髄造血、正常な赤血球生成、およ
び低葉状（ｈｙｐｏｌｏｂａｔｅｄ）核を有する小さな異形成性巨核球を有する
正常細胞骨髄を示した。これらの２例の患者は、正常な血小板超構造を有するア
ゴニストによって血小板の活性化が低下していた。４例の全ての患者は、３１〜
１１３×１０９個／Ｌの範囲の低い血小板数を特徴とする血小板機能不全を有す
る。さらに、この領域を含まない第２１染色体の欠失を有する４例の全ての被験
体は、正常な数の血小板を有する。
【０００７】 ＳＨ３ドメイン含有遺伝子を単離するための研究で、ＳＨ３Ｐ１７遺伝子の３’
フラグメントが見出された（Ｓｐａｒｋｓら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：７４１）。これは、公開されている配列に一致する
データベースを使用することにより、多くのグループによって、２１または２１
の大きなサブ領域にマッピングされた。Ｋａｔｓａｎｉｓ Ｎら（Ｈｕｍ Ｇｅ
ｎｅｔ １９９７ Ｓｅｐ；１００（３−４）：４７７−４８０）は、様々なＥ
ＳＴ配列決定計画によって作成された情報を利用して、第２１染色体の転写マッ
プを富化し、ＳＨ３Ｐ１７〜２１ｑ２２．１のマッピングおよびＮａｇａｓｅら
によって予めＨＳＡ２１にマッピングされた２つの遺伝子の局在化（それぞれ２
１ｑ２２．２および２１ｑ２２．３に対してＫＩＡＡ０１３６およびＫＩＡＡ０
１７９）について報告した。Ｃｈｅｎ Ｈ、およびＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓ Ｓ
Ｅ（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ１９９７；７８（３−４）：２
１３−２１５）は、ヒト第２１染色体上の遺伝子の一部を同定し、ハイブリダイ
ゼーションおよびＰＣＲ増幅を使用して、ＤＮＡマーカー（Ｄ２１Ｓ３１９およ
びｄ２１Ｓ６５）間の２１ｑ２２．１――＞ｑ２２．２内で遺伝子をＹＡＣｓお
よびコスミドにマッピングした。最後に、Ｇｕｉｐｐｏｎｉら、１９９８、Ｇｅ
ｎｏｍｉｃｓ５３：３６９−３７６は、彼らが交互の転写物から産生されるＸｅ
ｎｏｐｕｓ Ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ（ＩＴＳＮ）の２つのイソ型のヒト相同物
を同定したことを報告した。報告によると、そのうち第１のものは短い転写物が
偏在的に発現される一方、第２のより長い転写物は、脳組織において排他的に発
現される。後に、Ｇｕｉｐｐｏｎｉら、１９９８、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｃｅｌ
ｌ Ｇｅｎｅｔ．８３：２１８−２２０は、彼らが、ヒトインターセクチン（ｉ
ｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ）遺伝子のゲノムの構造、配列および正確なマッピングを
同定したことを報告し、該遺伝子は、ダウン症候群の特定の表現型の特徴を判定
するのに役割を果たし得ることを推測した。著者らは、ダウン症候群に関係し得
ること以外に、発見された遺伝子の役割に関する証拠および対応する観察または
推測を示さなかった。また、それら自体は、本発明で具体化される研究および発
明と識別可能である。
【０００８】 本発明は、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子およびそのクローンを含むいくつかのＳＨ３遺
伝子の全ヌクレオチド配列、ダウン症候群に見られる白血病の危険率の増加の一
部を含む血小板機能不全および白血病と該配列との関連、ならびに神経の発達お
よび特にＣＮＳにおける発達に伴う機能不全との関連を提供する。
【０００９】 発明の概要 １つの実施態様において、本発明は、ＳＨ３Ｄ１ＡおよびそのｃＤＮＡクロー
ンなどのヒトＳＨ３遺伝子をコードする単離された核酸であって、またその類似
物、フラグメント、改変体、および変異体を含む上記核酸を提供する。本発明は
、ＥＨドメインおよびＳＨ３ドメインにおいて１つ以上のミリストイル化部位を
形成するアミノ酸配列をコードする単離された核酸に関する。本発明は、１つ以
上のＥＨドメインおよび１つ以上のＳＨ３ドメインを形成するアミノ酸配列をコ
ードする単離された核酸を提供する。１つの実施態様において、２つのＥＨドメ
インおよび４つのＳＨ３ドメインを形成するアミノ酸配列をコードする核酸。図
１に示すように、該アミノ酸配列をコードする核酸は、ＥＨドメインおよびＳＨ
３ドメインにおいて１つ以上のミリストイル化部位を含む。
【００１０】 本発明の１つの実施態様において、単離された核酸は、アミノ酸配列１５〜配
列１０２であるＥＨ１ドメインのアミノ酸配列をコードする。本発明の１つの実
施態様において、該核酸は、アミノ酸配列２１５〜配列３１０であるＥＨ２ドメ
インのアミノ酸配列をコードする。本発明のもう１つの実施態様において、該核
酸は、アミノ酸配列７４０〜配列８００であるＳＨ３−１ドメインのアミノ酸配
列をコードする。本発明のもう１つの実施態様において、該核酸は、アミノ酸配
列９０８〜配列９６６であるＳＨ３−２ドメインのアミノ酸配列をコードする。
本発明のもう１つの実施態様において、該核酸は、アミノ酸配列９９９〜配列１
０６２であるＳＨ３−３ドメインのアミノ酸配列をコードする。本発明のもう１
つの実施態様において、該核酸は、アミノ酸配列１０８０〜配列１１３８である
ＳＨ３−４ドメインのアミノ酸配列をコードする。本発明のもう１つの実施態様
において、該核酸は、アミノ酸配列７４０〜配列８００であるＳＨ３−１ドメイ
ンのアミノ酸配列をコードする。好ましい実施態様において、該核酸は、配列番
号２および図５、９、１１、１３および１５に記載のアミノ酸をコードする。
【００１１】 本発明は、本明細書に記載のように、ＳＨ３Ｄ１Ａおよびそのクローンをコー
ドする単離された核酸を提供する。該単離された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、
具体的にはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであってもよい。この単離された核酸は
また、変異ＳＨ３Ｄ１Ａまたは野生型タンパク質をコードする。単離された核酸
は、実質的に図５に記載の配列と同じアミノ酸配列を有するヒトＳＨ３Ｄ１Ａを
コードする。本明細書および請求の範囲において使用されている通り、ヒトＳＨ
３Ｄ１Ａをコードするかまたは発現する核酸という用語は、図４、図８、１０、
１２または１４に記載の配列を有し得る単離された核酸を理解し、そして含むこ
とが意図される。
【００１２】 本発明は、ヒトＳＨ３Ｄ１Ａのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのク
ローンに関する。本明細書および請求の範囲において使用される通り、ＳＨ３Ｄ
１Ａのポリペプチドまたはタンパク質は、本明細書に記載の図９、１１、１３、
もしくは１５に記載のポリペプチド、またはそれらの類似物もしくはフラグメン
トを含むかあるいはそうでなければ対応するポリペプチドを理解し、そして含む
ことが意図される。さらに、該ポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル
およびモノクローナル抗体が開示され、そして同様にキメラ（二特異的）抗体が
考慮される。
【００１３】 本発明は、被験体がＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子に変異を保有するかどうかを判定する
方法であって、（ａ）前記被験体から適切な核酸サンプルを取得し、（ｂ）工程
（ａ）由来の核酸が変異体ＳＨ３Ｄ１Ａをコードする核酸であるか、または前記
核酸から誘導されるかを判定し、それによって、被験体がＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子に
変異を保有するかどうかを判定する、各工程を含む方法を提供する。
【００１４】 本発明は、被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病または
神経障害を有するかどうかを判定する方法であって、（ａ）前記被験体から適切
なサンプルを取得し、そして（ｂ）前記サンプルと請求項３５に記載の抗体とを
接触させ、それによって被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白
血病または神経障害を有するかどうかを判定する、各工程を含む方法を提供する
。
【００１５】 本発明は、被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病または
神経障害の素因を有するかどうかを判定する方法であって、（ａ）前記被験体か
ら適切な核酸サンプルを取得し、そして（ｂ）工程（ａ）の核酸サンプルがＳＨ
３Ｄ１Ａをコードする核酸であるか、または前記核酸から誘導されるかを判定し
、それによって、被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病ま
たは神経障害の素因を有するかどうかを判定する、各工程を含む方法。
【００１６】 本発明は、被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病または
神経障害を有するかどうかを判定する方法であって、（ａ）前記被験体から適切
な核酸サンプルを取得し、そして（ｂ）工程（ａ）の核酸サンプルがヒトＳＨ３
Ｄ１Ａをコードする核酸であるか、または前記核酸から誘導されるかを判定し、
それによって、被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病また
は神経障害を有するかどうかを判定する、各工程を含む方法。
【００１７】 本発明は、腫瘍内のＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の体性改変についてヒト被験体由来の
腫瘍サンプルをスクリーニングする方法であって、前記腫瘍は、前記腫瘍サンプ
ル由来のＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子、前記腫瘍サンプル由来のＳＨ３Ｄ１Ａ ＲＮＡお
よび前記腫瘍サンプル由来のｍＲＮＡから作製されるＳＨ３Ｄ１Ａ ｃＤＮＡか
ら成る群より選択される第１の配列と、前記被験体の非腫瘍サンプル由来のＳＨ
３Ｄ１Ａ遺伝子、非腫瘍サンプル由来のＳＨ３Ｄ１Ａ ＲＮＡおよび前記非腫瘍
サンプル由来のｍＲＮＡから作製されるＳＨ３Ｄ１Ａ ｃＤＮＡから成る群より
選択される第１の配列とを比較することを含み、ここで、前記腫瘍サンプル由来
のＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子、ＳＨ３Ｄ１Ａ ＲＮＡまたはＳＨ３Ｄ１Ａ ｃＤＮＡの
配列と前記非腫瘍サンプル由来のＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子、ＳＨ３Ｄ１Ａ ＲＮＡま
たはＳＨ３Ｄ１Ａ ｃＤＮＡの配列との差異は、前記腫瘍サンプル内のＳＨ３Ｄ
１Ａ遺伝子の体性改変を示す、上記方法を提供する。
【００１８】 本発明は、巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病または異常神経
病態の処置を受けている被験体の処置の進行および正確性を監視する方法であっ
て、処置の様々な段階でのヒトＳＨ３Ｄ１Ａをコードする核酸のレベルを監視す
ることを含む、上記方法を提供する。
【００１９】 本発明は、癌細胞に対する遺伝子に基づく治療、巨核球異常、造血異常、骨髄
増殖性障害、血小板障害、ダウン症候群、白血病、神経異常もしくは機能不全全
体または一部に基づく他の障害の素因の診断、および該疾患の診断および処置、
ならびに腫瘍の胎児診断および処置の作成に必要な手段を提供する。これらの治
療剤は、適切なベクターに配置されるかまたはＳＨ３Ｄ１Ａタンパク質の機能が
再構成されるようなより直接的な方法で標的細胞に送達されるＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝
子のすべてまたは一部を含むポリペプチドの形態を取り得る。治療剤はまた、Ｓ
Ｈ３Ｄ１Ａの一部の配列または全配列のいずれか一方に基づくポリペプチドの形
態を取ってもよい。
【００２０】 本発明は、本明細書で規定される所定量のヒトＳＨ３Ｄ１Ａのポリペプチドお
よび薬学的に有効なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００２１】 本発明は、巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病または神経異常
または機能不全を有する被験体を処置する方法であって、単離された核酸がＳＨ
３Ｄ１Ａを発現するような条件下で前記単離された核酸を前記被験体に導入する
ことを含む上記方法を提供する。
【００２２】 本発明は、巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病または神経異常
または機能不全を有する被験体を処置する方法であって、治療有効量の薬学的組
成物を前記被験体に投与することを含む上記方法を提供する。
【００２３】 最後に、本発明はまた、分析物において、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子またはその一部
を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを検出するためのキットであって、
該キットは、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子、結合パートナー、類似物またはそれらの他の
一部、適切な容器内に包装された遺伝子、およびキットの使用のための取扱説明
書を含む、上記キットを提供する。
【００２４】 発明の詳細な説明 本発明は、ＳＨ３遺伝子のファミリー、特に新規のＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子、およ
びクローン、ならびに対応するタンパク質（翻訳されかつ全長である）について
開示する。該ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子は第２１染色体上にあり、一般に血小板の発達
および白血病の病因、かつ特に巨核細胞系統に関与する事象に寄与する。本発明
は、以下のものを診断および処置するのに有用な方法を提供する：急性白血病、
血小板減少、巨核球異常、造血障害、骨髄増殖性異常、血小板異常、白血病、ダ
ウン症候群における白血病、白血病、第２１染色体に対する血小板異常、２１に
対する欠失における低血小板、第２１染色体の増進と白血病および巨核球機能不
全に関連する障害との関連、ならびに脳の先天異常および対応する認識不全、小
頭症、脳回欠損、膣頭症（ｃｏｌｐｏｃｅｈａｌｙ）、全前脳症。
【００２５】 本発明は、上記で規定されるヒトＳＨ３Ｄ１Ａをコードする単離された核酸で
あって、図８、１０、１２および１４に記載の核酸などの類似物、非制限的例示
で本明細書において示されるフラグメント、その改変体、および変異体を含む上
記核酸を提供する。１つの実施態様において、該核酸は、配列番号１に記載の配
列をコードする核酸に少なくとも８５％の類似性を有するヌクレオチド配列を有
する。本発明は、ＥＨドメインおよびＳＨ３ドメインにおいて１つ以上のミリス
トイル化部位を形成するアミノ酸配列をコードする単離された核酸に関する。本
発明は、１つ以上のＥＨドメインおよび１つ以上のＳＨ３ドメインを形成するア
ミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供する。１つの実施態様において、
２つのＥＨドメインおよび４つのＳＨ３ドメインを形成するアミノ酸配列をコー
ドする核酸。図１に示すように、ＥＨドメインおよびＳＨ３ドメインにおいて１
つ以上のミリストイル化部位を含むアミノ酸配列をコードする核酸。
【００２６】 本発明の１つの実施態様において、単離された核酸は、以下の領域、アミノ酸
配列１５〜配列１０２に対応するＥＨ１ドメインのアミノ酸配列をコードする。
本発明のもう１つの実施態様において、該核酸は、アミノ酸配列２１５〜配列３
１０であるＥＨ２ドメインのアミノ酸配列をコードする。本発明のもう１つの実
施態様において、該核酸は、アミノ酸配列７４０〜配列８００であるＳＨ３−１
ドメインのアミノ酸配列をコードする。本発明のもう１つの実施態様において、
該核酸は、アミノ酸配列９０８〜配列９６６であるＳＨ３−２ドメインのアミノ
酸配列をコードする。本発明のもう１つの実施態様において、該核酸は、アミノ
酸配列９９９〜配列１０６２であるＳＨ３−３ドメインのアミノ酸配列をコード
する。本発明のもう１つの実施態様において、該核酸は、アミノ酸配列１０８０
〜配列１１３８であるＳＨ３−４ドメインのアミノ酸配列をコードする。本発明
のもう１つの実施態様において、該核酸は、アミノ酸配列７４０〜配列８００で
あるＳＨ３−１ドメインのアミノ酸配列をコードする。好ましい実施態様におい
て、該核酸は、図５に記載のアミノ酸配列か、または非制限的例示によって本明
細書において示される図９、１１、１３および１５に記載の対応する類似物をコ
ードする。本発明は、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子、その類似物、フラグメント、改変体
、変異体に対応する核酸またはアミノ酸配列を意図する。対応する核酸またはア
ミノ酸は、本明細書において開示される核酸、もしくはアミノ酸に基づくか、あ
るいはＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子を規定するＥＨドメインおよびＳＨ３ドメインの構造
および機能に基づく。
【００２７】 本発明は、ＳＨ３Ｄ１Ａをコードする単離された核酸を提供する。本単離され
た核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、具体的にはｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであっ
てもよい。本単離された核酸はまた、変異ＳＨ３Ｄ１Ａまたは野生型タンパク質
をコードする。単離された核酸はまた、図５に記載の配列と実質的に同一のアミ
ノ酸配列を有するヒトＳＨ３Ｄ１Ａをコードする。具体的には、単離された核酸
は、図４に記載の配列を有する。
【００２８】 本発明は、ＤＮＡウイルスの単離された核酸分子を含む複製可能なベクターを
提供する。ベクターとしては、単離された核酸分子の少なくとも一部を含有する
プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人口染色体（ＹＡＣ）が挙げられ
るが、これらに限定されない。これらのベクターを得るための例として、挿入物
およびベクターＤＮＡを両方とも制限酵素に暴露し、相互に塩基対を形成し、次
いでＤＮＡリガーゼによってともに連結される両分子上で相補末端を作製し得る
。あるいは、リンカーを、ベクターＤＮＡの制限部位に対応する挿入ＤＮＡに連
結することができ、次いで、該部位で切断する制限酵素で消化する。また、他の
手段を利用することもでき、当業者に公知である。
【００２９】 発現に必要な調節エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼおよびリボソーム結合の
ための転写開始配列に結合するためのプロモーターまたはエンハンサー配列を含
む。例えば、細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーターなどのプロモーターなら
びに転写のためにシャイン・ダルガノ配列および開始コドンＡＵＧを含む。同様
に、真核細胞発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ異種または同種プロモー
ター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソーム分離
のための終止コドンを含む。そのようなベクターは、市販のものを入手してもよ
いし、当該分野において周知の方法、例えば、一般的にベクターを構築するため
の上記の方法によって記載の配列から組み立ててもよい。
【００３０】 本発明は、上記のベクターを含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、該宿
主細胞に人工的に導入された単離されたＤＮＡ分子を含有してもよい。宿主細胞
は、真核または細菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉなど）、酵素細胞、菌類細胞、昆虫細胞
および動物細胞であってもよい。適切な動物細胞としては、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅ
Ｌａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞および様々な初代哺乳動物細胞が挙げられる
が、これらに限定されない。
【００３１】 用語「ベクター」とは、ウイルス発現系、自己複製環状ＤＮＡ（プラスミド）
を指し、発現および非発現両プラスミドを含む。「発現ベクター」の宿主として
組換え微生物または細胞の培養について記載する場合、これは、染色体外環状Ｄ
ＮＡおよび宿主の染色体に取り込まれているＤＮＡの両方を含む。ベクターが宿
主細胞によって維持されている場合、該ベクターは、有糸分裂中に自立性構造と
して細胞によって安定に複製されるか、または宿主ゲノム内に組み込まれるかの
いずれか一方であり得る。
【００３２】 用語「プラスミド」とは、細胞内で複製可能な自立性環状ＤＮＡ分子を指し、
発現および非発現型の両方を含む。「発現ベクター」の宿主として組換え微生物
または細胞培養について記載する場合、これは、宿主染色体に組み込まれた潜伏
ウイルスＤＮＡを含む。プラスミドが宿主細胞によって維持されている場合、プ
ラスミドは、有糸分裂中に自立性構造として細胞によって安定に複製されるか、
または宿主ゲノム内に組み込まれるかのいずれか一方であり得る。
【００３３】 以下の用語は、２つ以上の核酸分子またはポリヌクレオチド間の配列の関係を
表現するのに使用される。「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」
、「配列同一性の百分率」、および「実質的同一性」。「参照配列」は、配列比
較の基礎として使用される規定された配列である。参照配列は、例えば、配列表
に記載の全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列としてより大きな配列の部分集合であ
るか、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列であり得る。
【００３４】 比較ウインドウを整列するための配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈお
よびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の
局所相同アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａ
ｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４の類似性検索方法、またはこれらのアルゴリズム
のコンピュータ化手段（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａ
ｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕ
ｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ
のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）
【００３５】 「実質的同一性」または「実質的配列同一性」は、２つのペプチド配列が、デ
フォルトギャップを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどにより
最適に整列されている場合、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なく
とも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％以上の配列同一性を
共有することを意味する。「アミノ酸同一性の百分率」または「アミノ酸配列同
一性の百分率」は、最適に整列された場合に同一アミノ酸の指定された百分率付
近を有する２つのポリペプチドのアミノ酸の比較を指す。例えば、「９５％アミ
ノ酸同一性」は、最適に整列された場合に９５％アミノ酸同一性を有する２つの
ポリペプチドのアミノ酸の比較を指す。好ましくは、同一ではない残基の位置は
、保存的アミノ酸置換とは異なる。例えば、電荷または極性などの類似の化学的
特性を有するアミノ酸の置換は、タンパク質の特性に影響を与えるとは思われな
い。例としては、グルタミンからアスパラギンへの置換またはグルタミンからア
スパラギン酸への置換が挙げられる。
【００３６】 語句「をコードする核酸」は、特異的なタンパク質またはペプチドの発現を指
令する核酸分子を指す。核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列およびタ
ンパク質に翻訳されるＲＮＡの両方を含む。核酸分子は、全長核酸配列および全
長タンパク質から誘導される非全長配列を含む。該配列は、導入されて特定の宿
主細胞においてコドンの性能を提供し得る天然の配列の縮重コドンを含むことが
さらに理解されている。
【００３７】 本発明は、ヒトＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の単離された核酸の配列に相補的な配列を
有する核酸を提供する。具体的には、本発明は、ヒトＳＨ３Ｄ１Ａをコードする
核酸内に存在するヌクレオチドの配列に特異的にハイブリダイズし得る少なくと
も１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを提供する。もう１つの実施態様にお
いて、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。もう１つの実施態様において、オリゴ
ヌクレオチドは検出マーカーで標識される。もう１つの実施態様において、オリ
ゴヌクレオチドは放射性同位元素、発色団または酵素である。
【００３８】 相補的なオリゴヌクレオチドは以下の通りに得ることができる。次いで、２つ
のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を行う。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ［７４］を参照のこと。ＰＣＲ増幅後、上記で列挙した３つの特異的核酸
プローブにハイブリダイズする能力について、ウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅され
た領域を試験することができる。あるいは、上記の核酸プローブに対するウイル
スＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ウイルスＤＮＡ増幅を伴わないサザンブ
ロット手順により、本明細書に記載のストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件下で行うことができる。
【００３９】 プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドは
、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ［６９］に記載のように、自動合成
機を用い、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ［１９］に最初に記載
された固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従い、化学的に合成される。Ｐ
ｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．およびＲｅｇｎｉｅｒ、Ｆ．Ｅ．［７５Ａ］に記載のよ
うに、オリゴヌクレオチドの精製は、生のアクリルアミドゲル電気泳動かまたは
陰イオン交換ＨＰＬＣのいずれか一方による。合成オリゴヌクレオチドの配列は
、Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．およびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．［６３］の化学分解法を用
いて確認することができる。
【００４０】 高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、規定されたイオン強度お
よびｐＨで特異的配列に対して融点（Ｔｍ）より約５℃低い温度で選択する。Ｔ
ｍは、標的配列の５０％が好ましく一致するプローブにハイブリダイズする（規
定されたイオン強度およびｐＨ下での）温度である。典型的に、ストリンジェン
ト条件は、塩濃度がｐＨ７で少なくとも約０．０２モルであり、温度が少なくと
も約６０℃である。他の要因は、中でも総補佐の塩基組成およびサイズ、有機溶
媒の存在、即ち塩またはホルムアルデヒド濃度、および塩基ミスマッチの程度を
含むハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに顕著に影響を及ぼすため、
パラメータの組み合わせは、任意の１つの絶対的測定よりも重要である。例えば
、高ストリンジェンシーは、例えば、６×ＳＳＣ溶液中約６８℃での１晩のハイ
ブリダイゼーション、室温で６×ＳＳＣ溶液による洗浄、その後６×ＳＳＣ、０
．６×ＳＳＸ中約６８℃での洗浄により達成し得る。
【００４１】 中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、例えば、１）３×
塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５０％ホルムアミド、０．１
Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、５×デンハルト溶液でのプリハイブリダイ
ゼーションおよびハイブリダイゼーション、２）３７℃で４時間のプリハイブリ
ダイゼーション、３）３，０００，０００ｃｐｍに等価な量の標識プローブによ
る３７℃で１６時間のハイブリダイゼーション、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤ
Ｓ溶液中での洗浄、５）それぞれ室温で１分間の洗浄を４回、およびそれぞれ６
０℃で３０分間の洗浄を４回、ならびに６）乾燥してフィルムに暴露することに
よって達成し得る。
【００４２】 語句「選択的にハイブリダイズする」は、標的配列が全細胞ＤＮＡまたはＲＮ
Ａの調製物中に存在する場合、核酸プローブが特定の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配
列にのみハイブリダイズ、複製、または結合することを指す。選択的にハイブリ
ダイズすることにより、ハイブリダイゼーションの高ストリンジェンシー条件下
で非標的配列とは異なる様式で検出可能な標識で、プローブが所定の標的に結合
することを意味する。「相補的」または「標的」核酸配列とは、核酸プローブに
選択的にハイブリダイズする核酸配列を指す。適切なアニーリング条件は、例え
ば、プローブの長さ、塩基組成、ならびにミスマッチの数およびそれらのプロー
ブ上での位置に依存し、しばしば経験的に判定されなければならない。核酸プロ
ーブの設計およびアニーリング条件に関する考察については、例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、［８１］またはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら、［８］を参照のこと。
【００４３】 参照が特定の配列表に対して作成される場合、そのような参照は、相補配列に実
質的に対応する配列、および若干の配列決定エラー、単一の塩基の変更、欠失、
置換などを含む配列、本明細書に記載のクローン改変体であって、任意のそのよ
うな配列の改変が、適切な配列表が関連する病原性生物または疾患マーカーの核
酸配列に対応するクローン改変体を含む配列を含むことは、当業者であれば容易
に理解することができ、本明細書において意図されていることである。
【００４４】 核酸プローブ技術は、そのようなプローブの長さが顕著に変動し得、そして放
射性同位元素または蛍光染料などの検出可能な標識で標識されて、該プローブの
検出を容易にし得ることを容易に理解する当業者には周知である。ＤＮＡプロー
ブ分子は、ＤＮＡウイルスの単離された核酸分子の全長またはフラグメントを有
するＤＮＡ分子をプラスミドまたはバクテリオファージなどの適切なベクターに
挿入し、続いて適切な細菌宿主細胞に形質転換し、形質転換された細菌宿主細胞
において複製し、そして当該分野において周知の方法を用いてＤＮＡプローブを
回収することによって生成され得る。あるいは、ＤＮＡ合成機から化学的にプロ
ーブを作製してもよい。
【００４５】 ＤＮＡウイルスの単離された核酸分子の全長もしくはフラグメントを、Ｔ３、
Ｔ７またはＳＰ６などのバクテリオファージプロモーターの下流に挿入すること
によって、ＲＮＡプローブを作製することができる。標識されたヌクレオチドを
、ＤＮＡウイルス線状化された単離された核酸分子またはそのフラグメントとも
にインキュベートすることによって、大量のＲＮＡを生成することができる。こ
こで、該核酸分子は適切なＲＮＡポリメラーゼの存在下で上流プロモーターを含
有する。
【００４６】 本明細書において規定されるように、核酸プローブはＤＮＡフラグメントであ
っても、ＲＮＡフラグメントであってもよい。ＤＮＡフラグメントは、例えば、
プラスミドＤＮＡを消化することによって、もしくはＰＣＲの使用によって調製
することができ、またはＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ［１９］
により記載されたホスホロアミダイト法か、もしくはＭａｔｔｅｕｃｃｉら、［
６２］によるトリエステル法（両方とも参考として本明細書に援用される）のい
ずれか一方によって合成することができる。次いで、所望であれば、適切な条件
下で化学的に合成された一本鎖をアニーリングすることによって、または適切な
プライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成することによ
って、二本鎖フラグメントを得ることができる。核酸プローブに対する特異的な
配列が与えられる場合、該相補鎖も同定され、含まれることが理解される。該相
補鎖は、標的が二本鎖の核酸である状況であっても、同様に良好に作用するであ
ろう。特異的配列が核酸プローブの使用のために同定される場合、長さが２５塩
基対である掲載された配列のサブ配列も、プローブとしての使用のために包含さ
れる。
【００４７】 本発明のＤＮＡ分子はまた、ポリペプチド類似物、フラグメントまたは１種以
上のアミノ酸残基の同一性または局在化について天然に存在する形態とは異なる
抗原性ポリペプチドの派生物（タンパク質について明記された全ての残基より少
ない残基を含有する欠失類似物、１種以上の残基が他の残基に置き換えられてい
る置換類似物および１種以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端もしくは中間
部位に付加されている付加類似物）をコードするＤＮＡ分子を含み、天然に存在
する形態の特性のいくつかまたは全てを共有する。これらの分子は、選択された
非哺乳動物宿主による発現に「好適な」コドンの取り込み、制限酵素による切断
のための部位の供給、および容易に発現されるベクターの構築を容易にするさら
なる開始、末端または中間ＤＮＡ配列の供給を含む。
【００４８】 また、本発明は、ヒトＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の単離された核酸に特異的にハイブ
リダイズし得るアンチセンス分子を提供する。本発明は、単離されたＤＮＡ分子
によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの発現を阻止し得るアンタゴ
ニストを提供する。１つの実施態様において、アンタゴニストは二本鎖ＤＮＡ分
子にハイブリダイズし得る。もう１つの実施態様において、アンタゴニストはＤ
ＮＡ分子にハイブリダイズし得る三重鎖オリゴヌクレオチドである。もう１つの
実施態様において、三重鎖オリゴヌクレオチドはヌクレオチド配列を有する単離
されたＤＮＡ分子の少なくとも一部に結合し得る。
【００４９】 アンチセンス分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその改変体（即ち、タンパク
質バックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡ）であってもよい。本発明は、アン
チセンス核酸でＭＲＮＡを遮蔽するかまたは該ＭＲＮＡをリボザイムで切断する
かのいずれか一方によって、特異的ｍＲＮＡの翻訳時にレセプター認識タンパク
質の発現を妨害するために使用され得るアンチセンスヌクレオチドおよびリボザ
イムの調製にまで及ぶ。
【００５０】 アンチセンス核酸は、特異的ＭＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ
またはＲＮＡ分子である。細胞において、それらは該ＭＲＮＡにハイブリダイズ
し、二本鎖分子を形成する。細胞はこの二本鎖の形態ではＭＲＮＡを翻訳しない
。従って、アンチセンス核酸はＭＲＮＡからタンパク質への発現を妨害する。
【００５１】 アンチセンスヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝
子の発現を防止または減少するのに有用であり、このことは当業者に理解されて
いる。例えば、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子もしくはＳＨ３Ｄ１Ａ領域（特にＳＨ３Ｄ１
Ａ遺伝子に隣接する領域）由来の他の配列の全てまたは一部を含有するポリヌク
レオチドベクターを、アンチセンス方向でプロモーターの制御下に配置して、細
胞に誘導してもよい。細胞内のそのようなアンチセンス構築物の発現は、ＳＨ３
Ｄ１Ａ転写および／または翻訳および／または複製を妨害する。約１５ヌクレオ
チドのオリゴマーおよびＡＵＧ開始コドンにハイブリダイズする分子は合成が容
易で、細胞への導入には大きな分子よりも問題が少ないと思われるため、それら
は効率的である。
【００５２】 本発明は、胚期で哺乳動物に導入された単離されたＤＮＡ分子の少なくとも一
部を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。トランスジェニック非
ヒト哺乳動物を生成する方法は、当業者に公知である。
【００５３】 本発明はまた、単離されたＤＮＡによりコードされるポリペプチドの製造方法
方法であって、ポリペプチドの産生を可能にする適切な条件下で上記の宿主ベク
ター系を増殖させることおよびそのようにして産生されるポリペプチドを回収す
ることを含む、ポリペプチドの製造方法を提供する。
【００５４】 本発明は、ヒトＳＨ３Ｄ１Ａのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
１つの実施態様において、アミノ酸配列は図５に記載されている。さらに、単離
されたＤＮＡ分子によりコードされる単離されたポリペプチドは、核酸分子によ
りコードされる第２のポリペプチドに結合し、適切な宿主細胞における発現によ
り融合細胞を形成し得る。１つの実施態様において、第２の核酸分子は、βガラ
クトシダーゼをコードする。融合タンパク質を形成するために使用される他の核
酸分子は、当業者に公知である。
【００５５】 本発明は、単離されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドに特異的
に結合する抗体を提供する。１つの実施態様において、該抗体はモノクローナル
抗体である。もう１つの実施態様において、該抗体はポリクローナル抗体である
。抗体またはＤＮＡ分子は、放射性同位体元素標識、または比色、発光、または
蛍光マーカー、あるいは金を含むがこれらに限定されない検出マーカーによって
標識され得る。放射性同位元素としては、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５ Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５９Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、 １３１ Ｉ、および１８６Ｒｅが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光マー
カーとしては、フルオレセイン、ローダミンおよびオーラミンが挙げられるがこ
れらに限定されない。比色マーカーとしては、ビオチン、およびジゴキシゲニン
が挙げられるがこれらに限定されない。ポリクローナルまたはモノクローナル抗
体を産生する方法は当業者に公知である。
【００５６】 さらに、抗体または核酸分子複合体は、アルカリホスファターゼまたは西洋ワ
サビペルオキシダーゼなどの酵素に連結され得る第２抗体によって検出され得る
。使用され得る他の酵素は当業者に周知である。
【００５７】 「抗体に特異的に結合する」または「特異的に免疫反応性である」は、タンパ
ク質またはペプチドに関する場合、ＳＨ３Ｄ１Ａ以外のウイルスを含むタンパク
質または他の生物製剤の異種集団の存在下で、本発明のＳＨ３Ｄ１Ａの存在を判
定する結合反応を指す。従って、示されたイムノアッセイ条件下で、指定された
抗体はＳＨ３Ｄ１Ａ抗原に結合し、サンプル中に存在する他の抗原に有意量で結
合しない。そのような条件下での特異的結合は、特定のタンパク質に対する特異
性について選択される抗体を必要とし得る。例えば、本明細書に記載のヒトＳＨ
３Ｄ１Ａ免疫原に対して惹起される抗体を選択して、ＳＨ３Ｄ１Ａタンパク質に
特異的に免疫反応性であり、他のタンパク質にはそうではない抗体を得ることが
できる。これらの抗体はヒトＳＨ３Ｄ１Ａタンパク質に相同なタンパク質を認識
する。特定のタンパク質に特異的に免疫反応性である抗体を選択するために、多
様なイムノアッセイ形式を使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイム
ノアッセイは、タンパク質に特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選
択するために、日常的に使用される。特異的な免疫反応性を判定するために使用
することができるイムノアッセイ形式および条件についてはＨａｒｌｏｗおよび
Ｌａｎｅ［３２］を参照のこと。
【００５８】 本発明は、抗体を作製するために、ＤＮＡウイルスの単離されたＤＮＡ分子に
よりコードされるペプチド上の特異的領域を選択するための方法を提供する。タ
ンパク質の配列は、ｃＤＮＡ配列から判定することができる。アミノ酸配列は、
該アミノ酸が構築するタンパク質において、該アミノ酸が疎水または親水領域を
生成するかどうかを判定するために、当業者に周知の方法によって分析すること
ができる。細胞膜タンパク質の場合、疎水領域は細胞膜の脂質二重層に挿入され
るタンパク質の部分を形成することが周知であるが、親水領域は細胞表面、水性
環境に位置する。通常、親水領域は、疎水領域よりもより免疫原性である。従っ
て、ＤＮＡウイルスをコードする単離された核酸分子によってコードされるポリ
ペプチドに特異的な抗体を作製するために、親水性アミノ酸配列を選択し、使用
することができる。選択されたペプチドは、市販の機械を使用して調製すること
ができる。代替物として、ｃＤＮＡまたはそのフラグメントなどのＤＮＡをクロ
ーニングし、そして発現させ、得られたポリペプチドを回収して免疫原として使
用することができる。
【００５９】 これらのペプチドに対するポリクローナル抗体は、選択されたペプチドを使用
して、動物を免疫化することによって産生され得る。モノクローナル抗体は、免
疫化した動物由来の抗体産生Ｂ細胞とメラノーマ細胞とを融合し、所望の抗体を
産生する得られたハイブリドーマ細胞株を選択することにより、ハイブリドーマ
技術を使用して調製される。あるいは、モノクローナル抗体は、当業者に公知の
ｉｎ ｖｉｔｒｏ技術によって産生され得る。先に本明細書に記載のように、キ
メラ（二特異的）抗体は、周知の技術により調製することができ、同様に本明細
書において考慮されている。任意または全てのこれらの抗体は、臍帯動物、ヒト
、あるいは動物またはヒトから単離される生物学的組織もしくは液体中のＤＮＡ
ウイルスの単離されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの発現を検
出するのに有用である。
【００６０】 抗体は、当該分野に周知の従来の標識技術を利用して、検出可能に標識するこ
とができる。従って、抗体は、例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および３５ Ｓなどの放射性同位元素を使用して、放射性標識することができる。抗体はまた
、当該分野において公知の技術を用い、蛍光標識、酵素標識、フリーラジカル標
識、またはバクテリオファージ標識を使用して標識することができる。典型的な
蛍光標識としては、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコ
エリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン（ａｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎ
ｉｎ）、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが挙げられる。
【００６１】 特異的酵素は、共有結合で他の分子に結合することができるため、該酵素は、
トレーサー物質の生成のための標識としても使用することができる。適切な酵素
としては、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびペルオキシダーゼが
挙げられる。エンザイムイムノアッセイの２つの主なタイプは、酵素免疫吸着測
定法（ＥＬＩＳＡ）、および多元酵素免疫測定法（ＥＭＩＴ、Ｓｙｖａ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）としても知られている均一エン
ザイムイムノアッセイである。ＥＬＩＳＡ系では、例えば、固相に結合した抗体
を使用することによって分離を達成することができる。ＥＭＩＴ系は、トレーサ
ー−抗体複合体における酵素の不活化に依存し、従って、分離工程を必要とする
ことなく活性を測定することができる。
【００６２】 さらに、化学発光化合物を標識として使用してもよい。典型的に、化学発光化
合物としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウム（ａｃｒｉ
ｄｉｎｉｕｍ）エステル、イミダゾール、アクリニジウム塩、およびシュウ酸エ
ステルが挙げられる。同様に、標識するために生物発光化合物を利用してもよく
、生物発光化合物として、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリン、および
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質が挙げられる。一旦標
識すれば、抗体を用いて、当該分野において周知の技術を利用して免疫学的対応
物（抗体または抗原性ポリペプチド）を同定および定量することができる。
【００６３】 ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に関する記載は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ［５２］に見られ、特にＣｈａｒｄ，Ｔ．による「ラジ
オイムノアッセイおよび関連技術への導入」（参考として本明細書に援用される
）という題目の章が参考になろう。ウイルスの一般的免疫測定アッセイに関する
記載については、以下の米国特許第４，３７６，１１０（Ｄａｖｉｄら）または
同第４，０９８，８７６号（Ｐｉａｓｉｏ）に認められ得る。
【００６４】 イムノアッセイを使用して、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子、特異的ペプチド、またはウ
イルスもしくはペプチドに対する抗体を検出することができる。適用可能な技術
の一般的概要については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ［３２］（参考として本
明細書に援用される）に認められる。
【００６５】 １つの実施態様において、ヒトＳＨ３Ｄ１Ａに対する交代を使用して、サンプ
ル中の因子を検出することができる。簡単に説明すると、因子またはペプチドに
対する抗体を産生させるためには、標的されている配列を、トランスフェクトさ
れた細胞、好ましくは細菌細胞において発現させ、そして精製する。生成物を、
抗体を産生し得る哺乳動物に注入する。遺伝子産物に特異的なモノクローナルま
たはポリクローナル抗体（および任意の組換え抗体）のいずれか一方を、様々な
イムノアッセイに使用することができる。そのようなアッセイとしては、競合的
イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、間
接的免疫蛍光アッセイなどが挙げられる。競合的イムノアッセイについては、Ｈ
ａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ［３２］５６７−５７３頁および５８４−５８９頁を
参照のこと。
【００６６】 本発明のさらなる実施態様において、疑わしい標的細胞に対する所定の結合活
性または所定の結合活性能の有無を判定するために、医学専門家による使用に適
切な市販の試験キットを調製することができる。上記の試験技術に従えば、その
ようなキットの１つのクラスは、少なくとも標識されたポリペプチドまたはその
結合パートナー、例えば、該ポリペプチドに対する抗体、およびもちろん選択さ
れた方法（例えば、「競合的」、「サンドイッチ」、「ＤＡＳＰ」など）に依存
する説明書を含有する。キットはまた、緩衝剤、安定化剤などの周辺試薬も含有
する。
【００６７】 モノクローナル抗体または組換え抗体は、当業者に知られるさまざまな技術で
得ることができる。簡単に説明すると、所望の抗原で免疫化した動物由来の脾臓
細胞または他のリンパ球は、通常、メラノーマ細胞と融合させることによって不
死化される（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ［５０］（参考として本明細
書に援用される）を参照のこと）。免疫化の代替的方法は、エプスタイン・バー
ルウイルスによる形質転換、オンコジーン、もしくはレトロウイルス、または当
該分野において周知の他の方法を含む。単一の不死化された細胞から生じるクロ
ーンは、抗原に対する所望の特異性および親和性を有する抗体の産生についてス
クリーニングされ、そのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収
率は、脊椎動物宿主の腹腔に注入することを含む様々な技術によって増強され得
る。組換えファージ抗体発現系を使用する新しい技術を使用して、モノクローナ
ル抗体を作製することもできる。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊら［６４］
；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ら、［３９］；およびＭａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．
ら［６０］を参照のこと。
【００６８】 そのようなペプチドは、細菌、酵母、糸状菌、昆虫（特にバキュロウイルスベ
クターを用いる）、および哺乳動物細胞などの組換え操作により作製された細胞
において特異的配列を発現させることによって、産生され得る。当業者であれば
、ヘルペスウイルスタンパク質の発現に利用可能な多くの発現系について知識を
有する。
【００６９】 簡単に説明すると、ウイルスタンパク質をコードする天然または合成核酸の発
現は、所望の配列またはその一部をプロモーター（構成性であるかもしくは油堂
可能のいずれか一方である）に作動可能に連結させ、そして発現ベクターに取り
込ませることによって典型的に達成される。ベクターは、原核細胞または真核細
胞のいずれか一方において複製もしくは組み込みに適切である。典型的なクロー
ニングベクターは、ウイルス遺伝子の発現に有用な抗生物質耐性マーカー、形質
転換体の選択のための遺伝子、誘導または調節可能なプロモーター領域、および
翻訳ターミネーターを含有する。
【００７０】 クローニングされた遺伝子を細菌で発現させる方法もまた周知である。一般に
、真核細胞系においてクローニングされた遺伝子を高レベルで発現させるには、
ｍＲＮＡの転写を指令する強力なプロモーターを含有する発現ベクターを構築す
るのが望ましい。Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換されたＤＮＡベクターに選択マーカー
を含めることも有用である。そのようなマーカーの例としては、抗生物質に対す
る耐性を指定する遺伝子が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉの使用ための選択マーカー
およびプロモーターに関する詳細については、［８１］（前掲）を参照のこと。
適切な真核細胞宿主は、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母、および糸状
菌を含む。
【００７１】 核酸から誘導されるペプチド、ペプチドフラグメントは、組換え技術によって
産生され、当業者に周知の標準的な技術によって精製され得る。組換え的に産生
された配列は、直接発現されるかまたは融合タンパク質として発現され得る。次
いで、タンパク質は細胞溶解（例えば、音波処理）およびアフィニティークロマ
トグラフィーによって精製され得る。融合産物の場合、その後、適切なタンパク
質分解酵素で融合タンパク質を消化することによって、所望のペプチドが遊離す
る。
【００７２】 硫酸アンモニウムなどの物質による選択的な沈殿、カラムクロマトグラフィー
、免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などを含む当該分野に
おいて周知の標準的な技術によって、タンパク質は実質的な純度に精製される。
例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ［８４］（参考として本明細書に援用される）を参照
のこと。
【００７３】 本発明は、単離された核酸および上記のアミノ酸配列を含むポリペプチドの類
似物に関する。該類似物は、アミノ酸配列を含むポリペプチドのＮまたはＣＯＯ
Ｈ末端に作動可能に結合したＮ末端メチオニンもしくはＮ末端ポリヒスチジンを
有し得る。
【００７４】 もう１つの実施態様において、本発明は、ポリペプチドのタンパク質消化産物
から生じるポリペプチドのペプチドフラグメントを考慮する。もう１つの実施態
様において、ポリペプチドの誘導物は、該ペプチドに結合した１種以上の化学部
分を有する。もう１つの実施態様において、化学部分は水溶性ポリマーである。
もう１つの実施態様において、化学部分はポリエチレングリコールである。もう
１つの実施態様において、化学部分はモノ−、ジ−、トリ−またはテトラペグレ
ート化（ｐｅｇｌａｔｅｄ）されている。もう１つの実施態様において、化学部
分はＮ末端モノペグレート化されている。
【００７５】 ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は哺乳動物において極めて毒性が低い（Ｃ
ａｒｐｅｎｔｅｒら、１９７１）ため、の化合物への結合は特に有用である。例
えば、アデノシンデアミナーゼのＰＥＧ付加物は、重度の複合免疫不全症候群の
処置のためのヒトにおける使用が米国で承認された。ＰＥＧの結合によって付与
される第２の利点は、異種化合物の免疫原性および抗原性を効果的に抑制するこ
とである。例えば、ヒトタンパク質のＰＥＧ付加物は、重度の免疫応答を誘発す
る危険性を伴うことなく、他の哺乳動物種の疾患の処置に有用であり得る。本発
明の化合物は、化合物もしくは化合物を生成し得る細胞に対する宿主の免疫応答
を抑制または防止するように、マイクロカプセル化装置で送達され得る。本発明
の化合物はまた、リポソームなどの膜内でマイクロカプセル化されて送達され得
る。
【００７６】 タンパク質の直接反応に適切なＰＥＧについては、多くの活性型形態が説明さ
れている。タンパク質のアミノ基に反応するための有用なＰＥＧ試薬は、カルボ
ン酸の活性エステルまたは特に、遊離基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−
ニトロフェノール、イミダゾールまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロベンゼン−
４−スルホネートであるカルボネート誘導体を含む。マレイミドまたはハロアセ
チル基を含有するＰＥＧ誘導体は、スルヒドリル基を含まないタンパク質を修飾
するための有用な試薬である。同様に、アミノヒドラジンまたはヒドラジド基を
含有するＰＥＧ試薬は、タンパク質の炭水化物基の過ヨウ素酸酸化により生成さ
れるアルデヒドとの反応に有用である。
【００７７】 １つの実施態様において、本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸残基は、
「Ｌ」異性型であるのが好ましい。もう１つの実施態様において、「Ｄ」異性型
の残基は、レクチン活性の所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限
り、任意のLアミノ酸残基に置換され得る。ＮＨ２は、ペプチドのアミノ末端に
存在する遊離のアミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシ末端に
存在する遊離のカルボキシ基を指す。本明細書において使用される省略記号は、
標準的なポリペプチド命名方法、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２
−５９（１９６９）に一致する。
【００７８】 本明細書では、全てのアミノ酸残基の配列は、左右の方向がアミノ酸からカルボ
キシ末端への従来の方向である式によって表されていることに注意するべきであ
る。さらに、アミノ酸残基の配列のはじめまたは終わりの破線は、１種以上のア
ミノ酸残基のさらなる配列に結合したペプチドを示すことに注意するべきである
。
【００７９】 合成ポリペプチドは、固層、液層、もしくはペプチド濃縮技術、またはそれら
の任意の組み合わせに関する周知の技術を用いて調製され、天然または非天然の
アミノ酸を含み得る。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅ
ｌｄ（１９６３．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）
の本来の固層手順の標準的な脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコル
を伴う標準的なＢｏｃ（Ｎα−アミノ保護Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）
アミノ酸残基、またはＣａｒｐｉｎｏおよびＨａｍ（１９７２，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃ
ｈｅｍ．３７：３４０３−３４０９）により最初に記載された塩基依存性Ｎα−
アミノ保護９−フルオロレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸である
。従って、本発明のポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−およびＬ−アミノ酸の
組み合わせ、ならびに様々な「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミ
ノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸およびＮα−メチルアミノ酸など）を含み、特定の
特性を有し得る。合成アミノ酸は、リジンに対するオルニチン、フェニルアラニ
ンに対するフルオロフェニルアラニン、およびロイシンまたはイソロイシンに対
するノルロイシンを含む。さらに、特定のカップリング工程で特異的アミノ酸を
割り当てることによって、αヘリックス、βターン、βシート、γターン、およ
び環状ペプチドを作製することができる。
【００８０】 本発明の１つの局面において、ペプチドはＣＯ２ＨまたはＣＯＮＨ２側鎖のい
ずれか一方を取り込むＣ末端で特定のアミノ基を含み、遊離のグリシンもしくは
グリシン−アミド基を刺激し得る。この特定の残基を考慮するためのもう１つの
方法は、ビーズに対するリンカーまたは結合から成る側鎖を有するＤもしくはＬ
アミノ類似物である。１つの実施態様において、擬似遊離Ｃ末端残基は、Ｄまた
はＬ光学的配置であり得、もう１つの実施態様では、Ｄ−およびＬ−異性体のラ
セミ混合物を使用し得る。
【００８１】 さらなる実施態様において、ピログルタミン酸は、ペプチドのＮ末端残基とし
て含まれ得る。ピログルタミン酸は、Ｎ末端ピログルタミン酸を有する所定のビ
ーズ上のペプチドに対し５０％しか置換を制限せず、エドマン分解による配列に
従わないが、ビーズ上の非ピログルタミン酸ペプチドは配列決定には十分に残留
する。当業者であれば、この技術がＮ末端でエドマン分解に耐性な残基を取り込
む任意のペプチドの配列決定のために使用され得ることを容易に理解するであろ
う。所望の活性を示す個々のペプチドを特徴付けるための他の方法については、
下記に詳述している。ブッロクされたＮ末端基（例えば、ピログルタミン酸）を
含むペプチドの特異的活性は、ペプチドの５０％に特定のＮ末端基が存在する場
合、完全（１００％）にブロックされたペプチドとブロックされていない（０％
）ペプチドとを比較することによって示される。
【００８２】 さらに、本発明は、より良好に規定された構造特性を有するペプチドを調製す
ること、ならびにペプチド類似物、およびエステル結合などのペプチド類似物結
合を使用して新規の特性を有するペプチドを調製することを予想する。もう１つ
の実施態様において、ペプチドは、還元型ペプチド結合、即ち、Ｒ１−ＣＨ２−
ＮＨ−Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２はアミノ酸残基または配列である）を取り込
むペプチドを作製し得る。還元型ペプチド結合は、ジペプチドサブユニットとし
て導入され得る。そのような分子は、ペプチド結合の加水分解、例えば、プロテ
アーゼ活性に耐性である。そのようなペプチドは、代謝分解、またはプロテアー
ゼ活性に対する耐性によるｉｎ ｖｉｖｏでの半減期の延長などの独特な機能お
よび活性を有するリガンドを提供する。さらに、特定の系において、限定された
ペプチドは、増強された機能活性を示す（Ｈｒｕｂｙ，１９８２，Ｌｉｆｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ ３１：１８９−１９９；Ｈｒｕｂｙら、１９９０，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ Ｊ．２６８：２４９−２６２）。本発明は、他の位置でランダム配列を取
り込む限定されたペプチドを産生する方法を提供する。
【００８３】 限定された、環状または剛性化されたペプチドは、合成的に調製される。但し
、ペプチドの配列の少なくとも２つの位置で、架橋し得る化学的官能基を提供す
るアミノ酸もしくはアミノ酸類似物が挿入され、処置後にペプチドを限定、環化
または剛性化して架橋を形成する。ターン導入性アミノ酸を取り込ませる場合は
、環化が好ましい。ペプチドを架橋し得るアミノ酸の例として、ジスルフィドを
形成するシステイン、ラクトンまたはラクターゼを形成するアスパラギン酸、お
よび遷移金属をキレートして架橋を形成するγ−カルボキシルグルタミン酸（Ｇ
ｌａ）（Ｂａｃｈｅｍ）などのキレーターがある。保護されたγ−カルボキシル
グルタミン酸は、Ｚｅｅ−ＣｈｅｎｇおよびＯｌｓｏｎ（１９８０，Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９４：１１２８−１１３２）に
より記載の合成を改変することによって調製され得る。ペプチド配列が、架橋し
得る少なくとも２種のアミノ酸を含むペプチドは、例えば、システイン残基を酸
化し、ジスルフィドを形成するかまたは金属イオンを付加して、ペプチドを架橋
して限定された、環状、または剛性化されたペプチドを形成するようにキレート
を形成することによって、処置され得る。
【００８４】 本発明は、系統的に架橋を調製するためのストラテジーを提供する。例えば、
４つのシステイン残基がペプチド配列に取り込まれる場合、異なる保護基を使用
することができる（Ｈｉｓｋｅｙ，１９８１，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３巻、Ｇｒｏｓｓおよ
びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
、１３７−１６７頁；Ｐｏｎｓａｎｔｉら、１９９０，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
４６：８２５５−８２６６）。システインの第１の対を脱保護および酸化し得
、次いで、第２の組を脱保護および酸化し得る。この方法で、ジスルフィド架橋
の規定された組を形成し得る。あるいは、架橋が異なる化学的性質を有するよう
に、システインの対および照合アミノ酸類似物の対を取り込むことができる。
【００８５】 特定のコンホメーションモチーフを導入するために、以下の非古典的アミノ酸
をペプチドに導入し得る。１，２，３，４−テトラヒドロイソキノン−３−カル
ボキシレート（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉら、１９９１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．１１３：２２７５−２２８３）；（２Ｓ，３Ｓ）−メチルフェニルアラニン
、（２Ｓ，３Ｒ）−メチルフェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチルフェニル
アラニンおよび（２Ｒ，３Ｒ）−メチルフェニルアラニン（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋ
ｉおよびＨｒｕｂｙ，１９９１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）；２−
アミノテトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸（Ｌａｎｄｉｓ，１９８９，Ｐ
ｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ）；ヒド
ロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−テトラヒドロイソキノン−３−カルボ
キシレート（Ｍｉｙａｋｅら、１９８９，Ｊ．Ｔａｋｅｄａ Ｒｅｓ．Ｌａｂｓ
．４３：５３−７６）；βカルボリン（ＤおよびＬ）（Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ，
１９８８，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏ
ｎａ）；ＨＩＣ（ヒスチジンイソキノリンカルボン酸）（Ｚｅｃｈｅｌら、１９
９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４３）；ならびにＨＩＣ
（ヒスチジン環状尿素）（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａ）。
【００８６】 以下のアミノ酸類似物およびペプチド類似物をペプチドに取り込ませて、特異
的な二次構造を導入または与える：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロ
ペニドン−６−カルボン酸）、βターン誘導性ジペプチド類似物（Ｋｅｍｐら、
１９８５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：５８３４−５８３８）；βシート誘導
性類似物（Ｋｅｍｐら、１９８８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：
５０８１−５０８２）；βシート誘導性類似物（Ｋｅｍｐら、１９８８，Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：５０５７−５０６０）；αヘリックス誘導
性類似物（Ｋｅｍｐら、１９８８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：
４９３５−４９３８）；γターン誘導性類似物（Ｋｅｍｐら、１９８９，Ｊ．Ｏ
ｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４：１０９：１１５）；ならびに以下の参考文献によって提
供される類似物：ＮａｇａｉおよびＳａｔｏ，１９８５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔ．２６：６４７−６５０；ＤｉＭａｉｏら、１９８９，Ｊ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１６８７頁；また、Ｇｌｙ−Ａｌａタ
ーン類似物（Ｋａｈｎら、１９８９，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３０
：２３１７）；アミド結合等配電子体（Ｊｏｎｅｓら、１９８８，Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２９：３８５３−３８５６）；テトラゾール（Ｚａｂｒ
ｏｃｋｉら、１９８８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：５８７５−５８
８０）；ＤＴＣ（Ｓａｍａｎｅｎら、１９９０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｐｅｐ．Ｒｅｓ．３５：５０１：５０９）；ならびにおよびＯｌｓｏｎら、１９
９０、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１２：３２３−３３３およびＧａｒｖｅ
ｙら、１９９０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６：４３６において教示される類似
物。βターンおよびβバルジのコンホメーションが制限された類似物、ならびに
それらを含有するペプチドについては、１９９５年８月、Ｋａｈｎが提出した米
国特許第５，４４０，０１３号に記載されている。
【００８７】 本発明は、本発明のポリペプチドまたはペプチドの修飾もしくは誘導体化をさ
らに提供する。ペプチドの修飾については当業者に周知であり、リン酸化、カル
ボキシメチル化、およびアシル化を含む。修飾は化学的または酵素的手段によっ
て行われ得る。もう１つの局面において、グリコシル化または脂肪アシル化ペプ
チド誘導体を調製することができる。グリコシル化または脂肪アシル化ペプチド
の調製については、当該分野において周知である。脂肪アシルペプチド誘導体も
調製することができる。例えば、制限的でない方法により、遊離のアミノ基（Ｎ
末端またはリシル）をアシル化、例えば、ミリストイル化することができる。も
う１つの実施態様において、構造の脂肪族側鎖−（ＣＨ２）ｎＣＨ３を含むアミ
ノ酸をペプチドに取り込ませることができる。本発明の使用に適切な本および他
のペプチド−脂肪酸結合物は、英国特許ＧＢ−８８０９１６２．４、国際特許出
願ＰＣＴ／ＡＵ８９／００１６６、および参考文献５（前掲）に開示されている
。
【００８８】 特定のコドンを、異なるアミノ酸をコードするコドンに変更するように、ポリ
ペプチドをコードする核酸において変異を作製し得る。最も小さな変更を可能に
することによって、そのような変異を一般に作製することができる。この種の置
換変異を作製して、非保存的方法（即ち、特定のサイズもしくは特徴を有するア
ミノ酸の群に属するアミノ酸由来のコドンをもう１つの群に属するアミノ酸に変
更することによって）または保存的方法（即ち、特定のサイズもしくは特徴を有
するアミノ酸の群に属するアミノ酸由来のコドンを同じ群に属するアミノ酸に変
更することによって）において得られるタンパク質のアミノ酸を得変更すること
ができる。そのような保存的変更は、一般に得られるタンパク質の構造および機
能のより小さな変更をもたらす。非保存的変更は、得られるタンパク質の構造、
活性または機能を改変するようである。本発明は、得られるタンパク質の活性ま
たは結合特性を有意に改変しない保存的変更を含有する配列を含むことを考慮す
るべきである。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメン
バーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン
、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトフ
ァンおよびメチオニンが挙げられる。芳香環構造を含有するアミノ酸は、フェニ
ルアラニン、トリプトファン、およびチロシンである。極性中性アミノ酸として
は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、お
よびグルタミンが挙げられる。陽性電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、
アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。陰性電荷を有する（酸性）
アミノ酸としては、グルタミン酸が挙げられる。そのような改変は、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動、または等電点によって判定される見かけ上の分子量に影
響を与えることが予想される。
【００８９】 特に好ましい置換は、 陽性電荷が維持され得るＬｙｓからＡｒｇへおよびその逆の置換、 陰性電荷が維持され得るＧｌｕからＡｓｐへおよびその逆の置換、 遊離の−ＯＨが維持され得るＳｅｒからＴｈｒへの置換、 遊離のＮＨ２が維持され得るＧｌｎからＡｓｎへの置換、 である。
【００９０】 合成ＤＮＡ配列は、類似物または「変異タンパク質」を発現する遺伝子の簡便
な構築を可能にする。タンパク質への非天然アミノ酸の部位特異的取り込みのた
めの一般的方法については、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−
１８８（１９８９年４月）に記載されている。この方法を使用して、非天然のア
ミノ酸を有する類似物を作製することができる。
【００９１】 本発明に従えば、当該分野内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤ
ＮＡ技術を使用し得る。そのような技術は、参考文献に十分に説明されている。
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ−ＩＩＩ巻
［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９４）］；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第Ｉ−ＩＩＩ巻［Ｊ．Ｅ．Ｃｅ
ｌｉｓ編（１９９４）］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ−ＩＩＩ巻［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）
］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａ
ｉｔ編、１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；「Ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍ
ｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］；「Ｉｍｍｏｂ
ｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，
（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄ Ｔ
ｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）を参照のこと。
【００９２】 さらなる実施態様において、ピログルタミン酸は、ペプチドのＮ末端残基とし
て含まれ得る。ピログルタミン酸は、Ｎ末端ピログルタミン酸を有する所定のビ
ーズ上のペプチドに対し５０％しか置換を制限せず、エドマン分解による配列に
従わないが、ビーズ上の非ピログルタミン酸ペプチドは配列決定には十分に残留
する。当業者であれば、この技術がＮ末端でエドマン分解に耐性な残基を取り込
む任意のペプチドの配列決定のために使用され得ることを容易に理解するであろ
う。所望の活性を示す個々のペプチドを特徴付けるための他の方法については、
下記に詳述している。ブッロクされたＮ末端基（例えば、ピログルタミン酸）を
含むペプチドの特異的活性は、ペプチドの５０％に特定のＮ末端基が存在する場
合、完全（１００％）にブロックされたペプチドとブロックされていない（０％
）ペプチドとを比較することによって示される。
【００９３】 誘導体化のための化学部分。誘導体化に適切な化学部分は、水溶性ポリマーの
間から選択され得る。選択されたポリマーが結合する成分が（生理学的環境など
の）水性環境中で沈殿しないように、該選択されたポリマーは水溶性であるべき
である。好ましくは、最終生成調製物の治療用途については、ポリマーは薬学的
に受容可能である。当業者であれば、ポリマー／成分結合物が治療目的で使用さ
れるかどうか、もしそうであれば、所望の容量、循環時間、タンパク質分解に対
する耐性、および他の考慮事項などの条件に基づいて、所望するポリマーを選択
することができる。本発明の成分については、本明細書において提供されるアッ
セイを用いてこれらを確かめることができる。
【００９４】 水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／
プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラ
ン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラ
ン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、
ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか一方）、なら
びにデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール
、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙ
ｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオ
ールおよびポリビニルアルコールから成る群より選択され得る。ポリエチレング
リコールプロピオンアルデヒドは、水中で安定であるため、製造において有利で
ある。
【００９５】 そのように結合するポリマーの数は変動し得、当業者は機能に対する効果につ
いて確かめることができる。モノ誘導体化するか、または同じまたは異なる化学
部分（例えば、異なる重量のポリエチレングリコールなどのポリマー）を有する
誘導体化のジ−、トリ−、テトラ−またはいくつかの組み合わせを提供すること
ができる。ポリマー分子の成分分子に対する割合にはばらつきがあり、反応混合
物中のそれらの濃度も同様である。一般に、（過剰な未反応成分およびポリマー
が存在しない反応の効率についての）最適な割合は、誘導体化（例えば、モノ−
、ジ−、トリ−など）の所望される程度、選択されたポリマーの分子量、ポリマ
ーに分枝があるかまたは分枝がないか、および反応条件などの要因によって判定
される。
【００９６】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）は、タンパク質の機能ま
たは抗原ドメインに対する影響を考慮して成分に結合させるべきである。当業者
に利用可能な多くの結合方法（例えば、ＥＰ０４０１３８４（ＰＥＧをＧ−ＣＳ
Ｆにカップリングする）（本明細書において参考として援用される））がある。
また、Ｍａｌｉｋら、１９９２，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１
０３５（塩化トレシルを使用するＧＭ−ＣＳＦのペグレート化を報告している）
を参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離のアミノ酸またはカル
ボキシル基などの反応基を介して、アミノ酸残基に共有結合し得る。反応基は、
活性化されたポリエチレングリコールが結合し得る基である。遊離のアミノ基を
有するアミノ酸残基としては、リジン残基および末端アミノ酸残基が挙げられ、
遊離のカルボキシル基を有する残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン
酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられる。スルフヒドリル基もポリエチレ
ングリコール分子に結合する反応基として使用することができる。治療目的では
、Ｎ末端またはリジン基での結合などのアミノ基での結合が好ましい。
【００９７】 本発明は、被験体がＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子に変異を保有するかどうかを判定する
方法であって、ａ）前記被験体から適切な核酸サンプルを取得し、そしてｂ）工
程（ａ）由来の核酸が変異体ＳＨ３Ｄ１Ａをコードする核酸であるか、または前
記核酸から誘導されるかを判定し、それによって、被験体がＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子
に変異を保有するかどうかを判定する、各工程を含む方法を提供する。１つの実
施態様において、工程（ａ）の核酸サンプルは変異体ＳＨ３Ｄ１Ａをコードする
ＤＮＡの転写物に対応するｍＲＮＡを含み、そして、工程（ｂ）の判定方法は、
（ｉ）ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとを、複合体を形成するようにｍＲＮＡの
オリゴヌクレオチドへの結合を可能にする条件下で接触させ、（ｉｉ）そのよう
にして形成される複合体を単離し、そして（ｉｉｉ）前記単離された複合体にお
いてｍＲＮＡを同定し、それによって前記ｍＲＮＡが変異体ＳＨ３Ｄ１Ａをコー
ドする核酸であるか、または前記核酸から誘導されるかを判定する、各工程を含
む。もう１つの実施態様において、工程（ｂ）の判定方法は、ｉ）工程（ａ）の
核酸サンプルおよび単離された核酸と制限酵素とを、前記核酸サンプルおよび前
記単離された核酸を異なる、区別可能な核酸の断片に消化することを可能にする
条件下で接触させ、（ｉｉ）核酸の断片を単離し、そして（ｉｉｉ）核酸サンプ
ルから誘導される核酸の断片と、単離された核酸から誘導される核酸の断片とを
接触させ、それによって前記核酸サンプルが変異体ＳＨ３Ｄ１Ａをコードする核
酸であるか、または前記核酸から誘導されるかを判定する、各工程を含む。
【００９８】 本発明は、ヌクレオチドをポリマー化して、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の少なくとも
８構成性ヌクレオチドから成る配列を得ることを含むポリヌクレオチドの調製方
法、およびアミノ酸をポリマー化して、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子内でコード化される
少なくとも５種のアミノ酸を含む配列を得ることを含むポリペプチドの調整方法
をさらに提供する。
【００９９】 本発明は、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子をスクリーニングして、変異を同定する方法を
さらに提供する。そのような方法は、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の一部を増幅する工程
をさらに含み得、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の一部の増幅のためのプライマーである１
組のポリヌクレオチドを提供する工程をさらに含む。本方法は、巨核球異常、造
血障害、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病；神経異常または他の障害の素因
の診断、および診断および処置、ならびに腫瘍の出生前診断および処置のいずれ
か一方において使用するために、変異を同定するのに有用である。有用な診断技
術としては、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接ＤＮＡ
配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット分析、一本鎖コンホメーション分析（
ＳＳＣＡ）、Ｒｎａｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（
ＡＳＯ）、ドットブロット分析およびＰＣＲ−ＳＳＣＰなどが挙げられるが、そ
れらに限定されず、下記においてさらに詳述される。
【０１００】 ＤＮＡ配列の改変を検出するために使用され得る方法がいくつかある。直接Ｄ
ＮＡ配列決定は、手動配列決定または自動化蛍光配列決定のいずれかであり、並
列の改変を検出することができる。ＳＨ３Ｄ１Ａのような大きな遺伝子について
は、手動配列決定は極めて労力を要するが、至適条件下では、遺伝子のコード配
列の変異は、まれに見失われる。もう１つのアプローチは一本鎖コンホメーショ
ン多型アッセイ（ＳＳＣＡ）（Ｏｒｉｔａら、１９８９）である。本方法は、全
ての配列の変更を検出するのではない（特に、ＤＮＡフラグメントのサイズが２
００ｂｐより大きい場合）が、ほとんどのＤＮＡ配列の改変を検出するために最
適化することができる。検出感度の低下は欠点であるが、ＳＳＣＡによるスルー
プット能の増加は、研究レベルで変異の検出のために直接配列決定をすることに
対する魅力ある可能な代替方法である。ＳＳＣＡゲル上で移動度のシフトが認め
られるフラグメントは、次いで配列決定され、ＤＮＡ配列の改変について正確な
性質が判定される。２つの相補的ＤＮＡ鎖間のミスマッチの検出に基づく他のア
プローチとしては、クランプ化変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）（Ｓｈｅｆｆｉｅ
ｌｄら、１９９１）、ヘテロ二本鎖分析（ＨＡ）（Ｗｈｉｔｅら、１９９２）お
よび化学ミスマッチ切断（ＣＭＣ）（Ｇｒｏｍｐｅら、１９８９）が挙げられる
。上記の方法はいずれも大きな欠失、複製、または挿入を検出したり、タンパク
質の転写もしくは翻訳に影響を与える調節変異を検出したりすることはない。こ
れらのクラスの変異を検出し得るタンパク質短縮アッセイまたは非対称性アッセ
イなどの他の方法は、特定のタイプの変異しか検出せず、ミスセンス変異を検出
しない。ＤＮＡ配列の改変を検出するための現在利用可能な方法についての検討
については、Ｇｒｏｍｐｅ（１９９３）による最近の検討において見出され得る
。一旦変異が認められれば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハ
イブリダイゼーションなどの対立遺伝子特異的検出アプローチを利用して、同変
異について、多数の他のサンプルを迅速にスクリーニングすることができる。
【０１０１】 １つ以上の制限酵素、好ましくは、多数の制限酵素で切断されたＤＮＡの一連の
サザンブロットを観察することによって、ＤＮＡ配列の体系を検出するための迅
速な予備分析を実施することができる。それぞれのブロットは、一連の正常個体
および一連の腫瘍を含有する。ハイブリダイズしているフラグメント（ＳＨ３Ｄ
１Ａ遺伝子にほぼ近いか、または該遺伝子を含む配列でプローブされた場合、対
照ＤＮＡとは長さが異なる）を示すサザンブロットは、可能性のある変異を示す
。極めて大きな制限断片を生成する制限酵素を使用する場合、パルスフィールド
ゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を使用する。
【０１０２】 ポイント変異の検出は、ＳＨ３Ｄ１Ａ対立遺伝子の分子クローニングおよび当
該分野において周知の技術を使用する該対立遺伝子の配列決定によって達成され
得る。あるいは、遺伝子配列を、既知の技術を用いて、腫瘍組織由来のゲノムＤ
ＮＡ調製物から直接増幅することができる。次いで、増幅された配列のＤＮＡ配
列を決定することができる。感受性対立遺伝子を確認するためのより完全でなお
間接的な試験のための周知の６つの方法がある：１）一本鎖コンホメーション分
析（ＳＳＣＡ）（Ｏｒｉｔａら、１９８９）；２）変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧ
ＧＥ）（Ｗａｒｔｅｌｌら、１９９０；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、１９８９）；３
）ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎら、１９９０；Ｋｉｎｓｚ
ｌｅｒら、１９９１）；４）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）
（Ｃｏｎｎｅｒら、１９８３）；５）Ｅ．ｃｏｌｉ ｍｕｔＳタンパク質などの
ヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質の使用（Ｍｏｄｒｉｃｈ、１９９
１）；および６）対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ｒａｎｏ＆Ｋｉｄｄ、１９８９）。
対立遺伝子特異的ＰＣＲについては、プライマーの３’末端で特定のＳＨ３Ｄ１
Ａ変異にハイブリダイズするプライマーを使用する。特定のＳＨ３Ｄ１Ａ変異が
存在しない場合、増幅産物は認められない。増幅耐性変異系（Ａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲ
ＭＳ）を使用することもできる。これは欧州特許出願公開第０３３２４３５号、
Ｎｅｗｔｏｎら、１９８９において開示されている。クローニング、配列決定お
よび増幅によっても遺伝子の挿入および欠失を検出ことができる。さらに、遺伝
子または周辺のマーカー遺伝子に対する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを
使用して、多型フラグメントにおける対立遺伝子または挿入の改変を評価するこ
とができる。そのような方法は、個体に見出されるＳＨ３Ｄ１Ａ変異の存在につ
いて、罹患個体の相対物をスクリーニングするのに特に有用である。当該分野に
おいて公知である挿入および欠失を検出するための他の方法を使用することがで
きる。
【０１０３】 同様の様式で、ＤＮＡプローブを使用し、酵素的または化学的切断を介してミ
スマッチを検出することができる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、１９８８；Ｓｈｅ
ｎｋら、１９７５；Ｎｏｖａｃｋら、１９８６を参照のこと。あるいは、マッチ
した二本鎖と比較してミスマッチの二本鎖の電気泳動移動度のシフトによって、
ミスマッチを検出することができる。例えば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ、１９８８を参
照のこと。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれか一方により、ハイブリ
ダイゼーションの前にＰＣＲを用いて（以下を参照のこと）、変異を含有し得る
細胞ｍＲＮＡまたはＤＮＡを増幅することができる。特に変化が欠失および挿入
などの著しい再配列である場合、サザンハイブリダイゼーションを用いて、ＳＨ
３Ｄ１Ａ遺伝子のＤＮＡの変化を検出することもできる。
【０１０４】 対立遺伝子特異的プローブを使用して、ＰＣＲの使用によって増幅されたＳＨ３
Ｄ１Ａ遺伝子のＤＮＡ配列をスクリーニングすることができる。これらのプロー
ブは核酸オリゴマーであり、それらのそれぞれは既知の変異を有するＳＨ３Ｄ１
Ａ遺伝子の領域を含有する。例えば、１つのオリゴマーは、長さが約３０ヌクレ
オチドであり、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子配列の一部に対応する。そのような対立特異
的プローブのバッテリーを使用することによって、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニ
ングして、ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子において予め同定されている変異の存在を同定す
ることができる。増幅されたＳＨ３Ｄ１Ａ配列による対立遺伝子特異的プローブ
のハイブリダイゼーションを、例えば、ナイロンフィルター上で行うことができ
る。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下での特定のプローブに対す
るハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブの場合と同様に、腫瘍
組織において同変異の存在を示す。
【０１０５】 当該分野において公知である任意の技術によって、ＳＨ３Ｄ１Ａ ｍＲＮＡ発
現の改変を検出することができる。これらは、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ増
幅およびＲＮａｓｅ保護を含む。ｍＲＮＡ発現の低減は野生型ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝
子の改変を示す。野生型ＳＨ３Ｄ１Ａタンパク質の改変をスクリーニングするこ
とによって、野生型ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の改変を検出することもできる。例えば
、ＳＨ３Ｄ１Ａに免疫反応性であるモノクローナル抗体を使用して、組織をスク
リーニングすることができる。同種抗原の欠損はＳＨ３Ｄ１Ａ変異を示す。変異
対立遺伝子の産物に特異的な抗体を使用して、変異体ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の産物
を検出することができる。そのような免疫学的アッセイを、当該分野において公
知の任意の簡便な形式で行うことができる。これらは、ウエスタンブロット、免
疫組織学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを含む。改変されたＳＨ３Ｄ１Ａ
遺伝子タンパク質を検出するための任意の手段を使用して、野生型ＳＨ３Ｄ１Ａ
遺伝子の改変を検出することができる。タンパク質結合判定基などの官能アッセ
イを使用することができる。さらに、ＳＨ３Ｄ１Ａの生物化学的能を検出するア
ッセイを使用することができる。変異体ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子産物を見出すことは
、野生型ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の改変を示す。変異体ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子または遺
伝子産物は、血清、糞便、尿および痰などの他のヒト身体サンプルでも検出する
ことができる。
【０１０６】 本発明はまた、ＳＨ３Ｄ１Ａポリペプチドおよびフラグメントを含む融合ポリ
ペプチドを提供する。同種ポリペプチドは、２つ以上のＳＨ３Ｄ１Ａポリペプチ
ド配列間またはＳＨ３Ｄ１Ａと関連タンパク質との配列間の融合であってもよい
。同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組み合わせを示す異種融合を構
築してもよい。例えば、リガンド結合または他のドメインは、異なる新規の融合
ポリペプチドまたはフラグメント間で「交換され」得る。そのような同種または
異種融合ポリペプチドは、例えば、強度または特異性が改変された結合を示し得
る。融合パートナーとしては、免疫グロブリン、細菌性βガラクトシダーゼ、ｔ
ｒｐＥ、タンパク質Ａ、βラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲ
ナーゼおよび酵母α接合因子が挙げられる。例えば、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら、１９
８８を参照のこと。融合タンパク質は、典型的に、以下に記載の組換え核酸方法
によって作製され得るかまたは化学的に合成され得る。ポリペプチドの合成のた
めの技術については、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３に記載されてい
る。
【０１０７】 本発明は、被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、または白血病を
有するかどうかを判定する方法であって、（ａ）前記被験体から適切なサンプル
を取得し、そして（ｂ）前記サンプルと抗体とを接触させ、それによって被験体
が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害または白血病を有するかどうかを判
定する、各工程を含む方法を提供する。
【０１０８】 本発明は、被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病または
神経異常または他の障害の素因を有するかどうかを判定する方法であって、（ａ
）前記被験体から適切な核酸サンプルを取得し、そして（ｂ）工程（ａ）の核酸
サンプルがＳＨ３Ｄ１Ａをコードする核酸であるか、または前記核酸から誘導さ
れるかを判定し、それによって、被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板
障害、または白血病の素因を有するかどうかを判定する、各工程を含む方法を提
供する。
【０１０９】 本発明は、被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病または
神経異常または他の障害を有するかどうかを判定する方法であって、（ａ）前記
被験体から適切な核酸サンプルを取得し、そして（ｂ）工程（ａ）の核酸サンプ
ルがヒトＳＨ３Ｄ１Ａをコードする核酸であるか、または前記核酸から誘導され
るかを判定し、それによって、被験体が巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障
害、白血病または神経異常または他の障害を有するかどうかを判定する、各工程
を含む方法を提供する。１つの実施態様において、工程（ａ）の核酸は、ヒトＳ
Ｈ３Ｄ１ＡをコードするＤＮＡの転写に対応するｍＲＮＡを含み、そして工程（
ｂ）の判定方法は、（ｉ）ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとを、複合体を形成す
るようにｍＲＮＡのオリゴヌクレオチドへの結合を可能にする条件下で接触させ
、（ｉｉ）そのようにして形成される複合体を単離し、そして（ｉｉｉ）前記単
離された複合体においてｍＲＮＡを同定し、それによって前記ｍＲＮＡがヒトＳ
Ｈ３Ｄ１Ａをコードする核酸であるか、または前記核酸から誘導されるかを判定
する、各工程を含む。本発明に従う特定の所見は、成人脳において生じ得るその
ような疾患が本発明に関して観察されており、従って、成人患者を診断し得、可
能であれば該患者に本発明の主題を適用することによって処置し得る。
【０１１０】 本発明は、細胞を抑制するのに有効な量で、精製されたヒトＳＨ３Ｄ１Ａを前
記細胞に導入することを含む、自己を調節し得ない細胞を抑制する方法を提供す
る。
【０１１１】 本発明は、被験体において自己を調節し得ない細胞を抑制し得る化学化合物を
同定する方法であって、（ａ）ＳＨ３Ｄ１Ａと化学化合物とを、前記ＳＨ３Ｄ１
Ａと前記化学化合物との間の結合を可能にする条件下で接触させ、（ｂ）前記Ｓ
Ｈ３Ｄ１Ａに対する前記化学化合物の特異的結合を検出し、そして（ｃ）前記化
学化合物がＳＨ３Ｄ１Ａを阻害するかどうかを判定して、自己を調節し得ない細
胞を抑制し得る化学化合物を同定する、各工程を含む方法を提供する。
【０１１２】 本発明は、腫瘍内のＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の体性改変についてヒト被験体由来の
腫瘍サンプルをスクリーニングする方法であって、前記腫瘍は、前記腫瘍サンプ
ル由来のＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子、前記腫瘍サンプル由来のＳＨ３Ｄ１Ａ ＲＮＡお
よび前記腫瘍サンプル由来のｍＲＮＡから作製されるＳＨ３Ｄ１Ａ ｃＤＮＡか
ら成る群より選択される第１の配列と、前記被験体の非腫瘍サンプル由来のＳＨ
３Ｄ１Ａ遺伝子、前記非腫瘍サンプル由来のＳＨ３Ｄ１Ａ ＲＮＡおよび前記非
腫瘍サンプル由来のｍＲＮＡから作製されるＳＨ３Ｄ１Ａ ｃＤＮＡから成る群
より選択される第２の配列とを比較することを含み、ここで、前記腫瘍サンプル
由来のＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子、ＳＨ３Ｄ１Ａ ＲＮＡまたはＳＨ３Ｄ１Ａ ｃＤＮ
Ａの配列と前記非腫瘍サンプル由来のＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子、ＳＨ３Ｄ１Ａ ＲＮ
ＡまたはＳＨ３Ｄ１Ａ ｃＤＮＡの配列との差異は、前記腫瘍サンプル内のＳＨ
３Ｄ１Ａ遺伝子の体性改変を示す、上記方法を提供する。
【０１１３】 本発明は、腫瘍内のＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の体性改変の存在についてヒト被験体
由来の腫瘍サンプルをスクリーニングする方法であって、前記被験体の前記腫瘍
サンプル由来のＳＨ３Ｄ１Ａポリペプチドと前記被験体の非腫瘍サンプル由来の
ＳＨ３Ｄ１Ａポリペプチドとを比較して、前記ポリペプチド間の差異を分析する
ことを含み、ここで、前記比較方法は、（ｉ）それぞれのサンプルにおける全長
ポリペプチドまたは短縮型ポリペプチドのいずれかを検出するか、あるいは（ｉ
ｉ）改変されたＳＨ３Ｄ１Ａポリペプチドのエピトープまたは野生型ＳＨ３Ｄ１
Ａポリペプチドのエピトープのいずれかに特異的に結合する抗体をそれぞれのサ
ンプル由来のＳＨ３Ｄ１Ａポリペプチドに接触させ、そして結合している抗体を
検出することによって行われ、ここで、前記腫瘍サンプル由来のＳＨ３Ｄ１Ａポ
リペプチドと前記非腫瘍サンプル由来のＳＨ３Ｄ１Ａポリペプチドとの間の差異
は、前記腫瘍サンプル内のＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の体性改変の存在を示す、上記方
法を提供する。
【０１１４】 本発明は、巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病または神経異常
もしくは不全に関与する病態の処置を受けている被験体の処置の進行および正確
性を監視する方法であって、処置の様々な段階でのヒトＳＨ３Ｄ１Ａをコードす
る核酸のレベルを監視することを含む、上記方法を提供する。
【０１１５】 本発明は、所定量のポリペプチドおよび薬学的に有効なキャリアまたは希釈剤
を含む、薬学的組成物を提供する。
【０１１６】 本発明は、巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、または白血病を有する
被験体を処置する方法であって、単離された核酸がＳＨ３Ｄ１Ａを発現し、それ
によって前記被験体を処置する条件下で、前記核酸を前記被験体に導入すること
を含む、上記方法を提供する。
【０１１７】 本発明は、巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、または白血病を有する
被験体を処置する方法であって、治療有効量の薬学的組成物を前記被験体に投与
することを含む、上記方法を提供する。
【０１１８】 本発明は、以下に関する診断方法および治療的処置に関する：ウィルムス腫、
リー−フラウメニ（Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｃｉｎｉ）症候群、網膜芽腫、家族性大腸
癌、および急逝骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ならびに骨髄異形成症候群（ＭＤＳｓ
）。
【０１１９】 さらに、開示された本発明は血小板産生の多様化された遺伝性障害に関するこ
とが本発明によって考慮される。血小板産生の遺伝性障害としては、軽度の皮膚
点状出血または随時性鼻出血から赤血球および血小板の輸注を要する重度の出血
の範囲のこれらの障害における臨床的問題が挙げられるがこれらに限定されない
。そして、血小板構造、機能および数の異常がこれらの患者のうちのいくらかで
臨床検査により見出されている。止血（ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ）中の血小板応答
の様々な成分における正常からの逸脱が、多くの家族について良好に特徴付けら
れており、当業者に公知である。これらは、血小板付着の欠損、貯蔵顆粒からの
分泌、およびその後の凝集を含む。
【０１２０】 本発明は、被験体において巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、または
白血病を診断する方法であって、（ａ）前記被験体の腫瘍病巣から核酸分子を取
得し、（ｂ）前記核酸分子と、単離されたＤＮＡに特異的にハイブリダイズし得
る少なくとも１５ヌクレオチドの標識された核酸分子とをハイブリダイズ条件下
で接触させ、そして（ｃ）ハイブリダイズした核酸分子の存在を判定する、ここ
で、該核酸の存在は、被験体において巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害
、または白血病を示し、これによって、被験体において巨核球異常、骨髄増殖性
障害、血小板障害、または白血病を診断する、各工程を含む上記方法を提供する
。
【０１２１】 １つの実施態様において、腫瘍病巣由来のＤＮＡ分子は工程（ｂ）の前に増幅
される。もう１つの実施態様では、ＰＣＲを使用して、該核酸分子を増幅する。
核酸分子を増幅する方法は当業者に公知である。
【０１２２】 上記の方法において、ポリアクリルアミドゲルによって生じるサイズ画分を使
用し得る。１つの実施態様において、該サイズ画分はアガロースゲルによって生
じる。さらに、ＤＮＡフラグメントを固相マトリックスに移すことが、ハイブリ
ダイゼーション工程の前に用いられ得る。そのような固相マトリックスの例は、
ニトロセルロース紙である。
【０１２３】 本発明は、被験体において巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病
または神経異常もしくは機能不全を診断する方法であって、（ａ）前記被験体の
適切な体液から核酸分子を取得し、（ｂ）前記核酸分子と、単離されたＤＮＡに
特異的にハイブリダイズし得る少なくとも１５ヌクレオチドの標識された核酸分
子とをハイブリダイズ条件下で接触させ、そして（ｃ）ハイブリダイズした核酸
分子の存在を判定する、ここで、該核酸の存在は、被験体において巨核球異常、
骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病または神経異常もしくは機能不全を示し、
これによって、被験体において巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、また
は白血病を診断する、各工程を含む上記方法を提供する。
【０１２４】 本発明は、被験体においてＤＮＡウイルスを診断する方法であって、（ａ）前
記被験体から適切な体液を取得し、（ｂ）前記被験体の適切な体液を、すでに抗
体に結合して有する支持体に接触させて、前記抗体を特異的抗原に結合させ、（
ｃ）前記支持体から未結合の体液を除去し、そして（ｄ）抗原が結合した抗体の
レベルを判定することによって、巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害、白
血病または神経障害について前記被験体を診断する、各工程を含む上記方法を提
供する。
【０１２５】 本発明は、被験体において巨核球異常、骨髄増殖性障害、血小板障害または白
血病を診断する方法であって、（ａ）前記被験体から適切な体液を取得し、（ｂ
）前記被験体の適切な体液を、すでに抗体に結合して有する支持体に接触させて
、抗原を特異的抗体に結合させ、（ｃ）前記支持体から未結合の体液を除去し、
そして（ｄ）抗体が結合した抗原のレベルを判定することによって、巨核球異常
、骨髄増殖性障害、血小板障害、白血病または神経障害を診断する、各工程を含
む上記方法を提供する。
【０１２６】 適切な体液としては、血清、血漿、脳髄液、リンパ球、尿、漏出液、または参
出液が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施態様において、体液サ
ンプルは、血清または血漿である。さらに、体液サンプルは骨髄由来の細胞、ま
たは細胞培養物由来の上清であってもよい。被験体から適切な体液サンプルを得
る方法は、当業者に公知である。抗体または抗原のレベルを判定する方法として
は、ＥＬＩＳＡ、ＩＦＡ、およびウエスタンブロッティングが挙げられるが、こ
れらに限定されない。
【０１２７】 本発明の診断アッセイは、核酸ハイブリダイゼーションアッセイなどの核酸ア
ッセイおよび特異的核酸の増幅を検出するアッセイであり、本明細書に記載のヒ
トＳＨ３Ｄ１Ａの核酸配列を検出する。
【０１２８】 ハイブリダイゼーションアッセイを行うための受け入れられた手段は公知であ
り、該技術に関する一般的検討は以下のものの検討から有し得る：Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ［７２］；Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ［４
１］；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［４］およびＩｎｎｉ
ｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ［７４］（前掲）、これらの全ては参考とし
て本明細書に援用される。
【０１２９】 標的特異的プローブを核酸ハイブリダイゼーション診断に使用してもよい。プ
ローブは、目的の標的に特異的であるかまたは相補的である。正確な対立遺伝子
の区別化のために、プローブの長さは約１４ヌクレオチドであるべきであり、好
ましくは約２０〜３０ヌクレオチドである。本発明のヒトＳＨ３Ｄ１Ａのより一
般的な検出のために、核酸プローブは約５０〜約１０００ヌクレオチド、最も好
ましくは、約２００〜約４００ヌクレオチドである。
【０１３０】 特異的核酸プローブは、ＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチドもしくはオリゴ
ヌクレオチド、あるいはそれらの類似物であり得る。プローブは一本鎖ヌクレオ
チドであっても、二本鎖ヌクレオチドであってもよい。本発明のプローブは、当
該分野において周知の方法を方法用いて酵素的（例えば、ニックトランスレーシ
ョン、プライマー伸長、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応など）に、または化学的
（例えば、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ［１９］により記載の
ホスホロアミダイト法などの方法、もしくはＭａｔｔｅｕｃｃｉら［６２］によ
るトリエステル法（両方とも参考として本明細書に援用される））に合成され得
る。
【０１３１】 ヒトＳＨ３Ｄ１Ａの存在を判定するための代替的方法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイ
ブリダイゼーションまたはより最近では、ｉｎ ｓｉｔｕポリメラーゼ連鎖反応
である。ｉｎ ｓｉｔｕＰＣＲについては、Ｎｅｕｖｏら［７１］ポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）増幅Ｃ型肝炎ｃＤＮＡの細胞内局在化；Ｂａｇａｓｒａら［
１０］ｉｎ ｓｉｔｕポリメラーゼ連鎖反応による単核細胞における１型免疫不
全ウイルスのプルウイルスの検出；およびＨｅｎｉｆｏｒｄら［３５］ｉｎ ｓ
ｉｔｕ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって示される細胞ＥＧＦレセプターｍＲ
ＮＡ発現の変動に記載されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッ
セイは周知であり、一般にＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．［６７］（参考と
して本明細書に援用される）に記載されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼ
ーションでは、細胞は固相支持体、典型的にはガラススライドに固定される。次
いで、中程度の温度で細胞をハイブリダイゼーション溶液に接触させ、標的−標
識された特異的プローブのアニーリングを可能にする。プローブは、好ましくは
ラジオアイソトープまたは蛍光レポーターで標識される。
【０１３２】 上記のプローブはまた、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは本遺伝
子を発現する組織の局在化、あるいは様々な生物学的組織における本遺伝子もし
くはそのＭＲＮＡの存在のための他のハイブリダイゼーションアッセイにも有用
である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、抗原の発現にも天然対変性
条件にも依存しない高感度の局在化方法である。
【０１３３】 簡単に説明すると、阻害核酸治療アプローチは、ＤＮＡ配列を標的化するアプロ
ーチ、ＲＮＡ配列を標的化するアプローチ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む
）、タンパク質を標的化するアプローチ（センス鎖アプローチ）、ならびに標的
核酸の切断または化学修飾を引き起こすアプローチに分類することができる。
【０１３４】 ＤＮＡを標的化するアプローチはいくつかのカテゴリーに分かれる。二本鎖Ｄ
ＮＡの大溝に結合して、三重ヘリックスまたは「三重鎖」を形成する核酸を設計
することができる。あるいは、複製または転写中の二本鎖ＤＮＡの開口から生じ
る一本鎖ＤＮＡの領域に結合する阻害核酸が設計される。
【０１３５】 より一般的には、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体に結合する阻害核酸が設計さ
れる。プレｍＲＮＡの成熟を防止するために、阻害核酸が使用される。阻害核酸
は、ＲＮＡのプロセシング、スプライシングまたは翻訳を妨害するために設計し
てもよい。
【０１３６】 阻害核酸は、ｍＲＮＡに対して標的化される。本アプローチでは、コードされ
たタンパク質の翻訳を特異的に阻止するために阻害核酸が設計される。本アプロ
ーチを用いて、阻害核酸を使用し、重要なタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻
訳を阻害することによって、特定の細胞機能を選択的に抑制することができる。
例えば、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの領域に相補的な阻害核酸は、ｃ−ｍｙｃプロト
オンコジーンの過剰発現するヒト全骨髄球白血病細胞株、ＨＬ６０において、ｃ
−ｍｙｃタンパク質の発現を阻害する。Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ Ｅ．Ｌ．ら［９３
］およびＨａｒｅｌ−Ｂｅｌｌａｎ，Ａ．ら［３１Ａ］を参照のこと。Ｈｅｌｅ
ｎｅおよびＴｏｕｌｍｅにおいて記載のように、ｍＲＮＡを標的化する阻害核酸
は、いくつかの異なる機構によって作用し、コードされたタンパク質の翻訳を阻
害することが明らかにされている。
【０１３７】 最後に、阻害核酸を使用して、化学不活性化または標的遺伝子もしくはｍＲＮ
Ａの切断を誘導することができる。化学不活性化は、細胞内の阻害核酸と標的核
酸との間の架橋を誘導することによって生じ得る。適切に誘導体化された阻害核
酸によって誘導される標的核酸の他の化学修飾を使用することもできる。
【０１３８】 標的核酸の切断、即ち不活性化は、活性化されて切断反応を誘導し得る阻害核
酸に置換基を結合させることによって生じ得る。置換基は、化学、または酵素切
断のいずれか一方に影響を及ぼす置換基であり得る。あるいは、切断は、リボザ
イムまたは触媒的ＲＮＡの使用によって誘導され得る。本アプローチでは、阻害
核酸は、天然に存在するＲＮＡ（リボザイム）または触媒活性を有する合成核酸
のいずれか一方であり得る。
【０１３９】 本明細書で使用される「薬学的組成物」は、ＳＣＦ（幹細胞因子）治療におい
て有用な適切な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／また
はキャリアを伴う治療有効量の本発明のポリペプチド産物を意味し得る。本明細
書で使用される「治療有効量」は、所定の状態に対する治療効果および投与レジ
メンを提供する量を指す。そのような組成物は、液体または凍結乾燥されたもし
くはそうでなければ乾燥された製剤であり、様々な緩衝剤含有物（例えば、Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）の希釈剤、ｐＨおよびイオン強度、表面吸収
を防止するためのアルブミンまたはゼラチンなどの添加物、界面活性剤（例えば
、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、胆汁酸塩）、可
溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール）、抗酸化剤（例えば
、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール
、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質または浸透圧改変剤（例えば、ラ
クトース、マンニトール）、タンパク質に対するポリエチレングリコールのなど
のポリマーの共有結合、金属イオンによる錯体形成、あるいはポリ乳酸、ポリグ
リコール酸、ヒドロゲルなどの高分子化合物の粒状調製物またはリポソーム、マ
イクロエマルジョン、ミセル、単層ラメラまたはマルチラメラビヒクル、赤血球
ゴースト、またはスフェロプラスト内もしくは上への物質の取り込みを含む。そ
のような組成物は、物理状態、溶解度、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの放出速度、
およびｉｎ ｖｉｖｏでのＳＣＦのクリアランスの速度に影響を及ぼす。組成物
の選択は、ＳＣＦ活性を有するタンパク質の物理的および化学的特性に依存する
。例えば、ＳＣＦの膜結合形態から誘導される製品は、界面活性剤を含有する製
剤を必要とし得る。制御放出性または徐放性組成物は、脂質親和性の貯蔵物（例
えば、脂肪酸、ワックス、オイル）中に製剤を含む。また、ポリマー（例えば、
ポロキサマーまたはポロキサミン）で被覆された粒状組成物および組織特異的レ
セプター、リガンドもしくは抗原に対する抗体または組織特異的レセプターのリ
ガンドに結合したＳＣＦも本発明によって理解される。本発明の組成物の他の実
施形態は、保護被服剤を形成する粒状物、プロテアーゼ阻害剤または非経口、肺
、鼻および口を含む様々な投与経路のための浸透増強剤を取り込む。
【０１４０】 さらに、本明細書で使用される「薬学的に受容可能なキャリア」は当業者に周
知であり、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０
．８％生理食塩水を含むが、これらに限定されない。さらに、そのような薬学的
に受容可能なキャリアは水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョン
であってもよい。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレ
ングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注入可
能な有機エステルがある。水性キャリアとしては、水、アルコール／水溶液、エ
マルジョンまたは懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝化媒体を含む。非経
口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキスト
ロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル（ｌａｃｔａｔｅｄ Ｒｉｎｇｅ
ｒ’ｓ）または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、リンゲルデキス
トロースなどに基づく補充物のような液体および栄養補充物、電解質補充物が挙
げられる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、付帯剤（ｃｏｌｌａｔｉｎｇ ａｇ
ｅｎｔ）希ガスなどの保存剤および他の添加物が存在してもよい。
【０１４１】 用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合
物を指す。アジュバンとは、抗原を徐々に放出する組織貯蔵物および免疫応答を
非特異的に増強するリンパ系活性化物質として作用し得る（Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、１９８４、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍ
ｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、３８４頁）。しばしば、アジュバ
ンと非存在下での抗原のみの初回攻撃では、液性または細胞性免疫応答を誘発す
ることができない。アジュバンとは、完全フロイントアジュバント、不完全フロ
イントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシ
チンなどの表面活性物質、プルロニック、ポリオール、ポリアニオン、ペプチド
、オイルまたは炭化水素エマルジョン、キーホールリンペッとヘモシアニン、ジ
ニトロフェノール、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅ
ｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に
有用なヒトアジュバントが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、ア
ジュバントは薬学的に受容可能である。
【０１４２】 制御放出性または徐放性組成物は、脂質親和性の貯蔵物（例えば、脂肪酸、ワ
ックス、オイル）中に製剤を含む。また、ポリマー（例えば、ポロキサマーまた
はポロキサミン）で被覆された粒状組成物および組織特異的レセプター、リガン
ドもしくは抗原に対する抗体または組織特異的レセプターのリガンドに結合した
化合物も本発明によって理解される。本発明の組成物の他の実施形態は、保護被
服剤を形成する粒状物、プロテアーゼ阻害剤または非経口、肺、鼻および口を含
む様々な投与経路のための浸透増強剤を取り込む。
【０１４３】 投与する場合、化合物はしばしば迅速に粘膜表面または循環から浄化され、従
って、比較的短命の薬理学的活性を発揮する。従って、治療効果を維持するため
には、比較的多量の生態活性化合物を頻回投与する必要があり得る。ポリエチレ
ングリコール、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポ
リマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルあるコール、
ポリビニルピロリドンまたはポリプロリンなどの水溶性ポリマーの共有結合によ
って修飾された化合物は、対応する非修飾の化合物よりも静脈内注入後の血中半
減期がより長いことが知られている（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、１９８１；Ｎｅ
ｗｍａｒｋら、１９８２、Ｋａｔｅら、１９８７）。そのような修飾はまた、水
溶液中の化合物の溶解度を増大し、凝集を消失し、化合物の物理的および化学的
安定性を増強し、化合物の免疫原性および反応性を顕著の減少する。その結果、
所望されるｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性は、そのようなポリマー−化合物外転物
（ａｂｄｕｃｔ）を、非修飾化合物より少ない回数、または少ないよう量で投与
することによって達成され得る。
【０１４４】 用量。効率的な量は、約１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇであるがこれに限
定されない。量は１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。組成物の薬学的に受容可能な
形態は薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【０１４５】 有効成分を含有する治療組成物の調製は当該分野において良く理解されている
。典型的に、そのような組成物は、鼻咽頭に送達されるポリペプチドのエアゾル
、注入可能物、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製されるが、注入前の
液体における溶液、または懸濁液に適切な固体の形でも調製することができる。
調製物は、乳化してもよい。有効治療成分は、しばしば薬学的に受容可能である
賦形剤と混合され、有効成分に適合される。例えば、適切な賦形剤は、水、生理
食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合
わせである。さらに、所望であれば、組成物は、有効成分の効果を増強する湿潤
または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの少量の助剤物質を含有することができる。
【０１４６】 有効成分は、中和された薬学的に受容可能な塩の形態として、治療組成物に製
剤化され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸添加塩（ポリペプチドまたは抗体の
遊離のアミノ基と共に形成される）を含み、例えば、塩酸もしくはリン酸などの
無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される
。遊離のカルボキシル基から形成される塩も、例えば、水酸化ナトリウム、水酸
化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無
機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタ
ノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩から誘導することができる。
【０１４７】 組成物中の少なくとも約７５重量％のタンパク質、ＤＮＡ分子、ベクター（Ａ
およびＢが属する種のカテゴリーに依存する）が「Ａ」である場合、「Ａ」（こ
こで、「Ａ」は単一のタンパク質、ＤＮＡ分子、ベクターなどである）は実質的
に「Ｂ」（ここで、「Ｂ」は１以上の混入タンパク質、ＤＮＡ分子、ベクターな
どである）を含まない。好ましくは、「Ａ」は、組成物中に少なくとも約９０重
量％のＡ＋Ｂ種を含み、最も好ましくは約９９重量％を含む。
【０１４８】 語句「治療有効量」は、宿主の活動、機能および応答において臨床的に重要な
欠陥を少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少な
くとも９０％だけ抑制する、最も好ましくは防止するのに十分な量を意味するた
めに本明細書において使用される。
【０１４９】 本発明によれば、本発明の治療組成物の成分は、非経口的、経粘膜的、例えば
、経口、鼻、肺、もしくは直腸、または経皮的に導入され得る。好ましくは、投
与は非経口的、例えば、静脈内注射であり、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔
内、室内、および頭内投与が含まれるが、これらに限定されない。肺炎双球菌は
、一般に鼻咽頭および肺粘膜にコロニーを形成するため、好ましくは、口または
肺送達は粘膜免疫を活性化し得る。用語「単位用量」は、本発明の治療組成物に
関して使用する場合、ヒトの単位用量として適切な物理的な分離単位を指す。そ
れぞれの単位は、所望の治療効果を生じるために必要とされる希釈剤、即ちキャ
リアまたはビヒクルと関連して算出された予め定められた量の有効物質を含有す
る。
【０１５０】 もう１つの実施態様において、有効化合物はビヒクル、特にリポソームで送達
され得る（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３（１９９
０）；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏ
ｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅ
ｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ及びＦｉｄｌｅｒら、Ｌｉｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、３５
３−３６５項、本明細書に記載、３１７−３２７頁を参照のこと；全般的に本明
細書の参考文献を参照のこと）。
【０１５１】 もう１つの実施態様において、治療化合物は制御放出系で送達され得る。例え
ば、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他
の投与方法を使用して、投与することができる。１つの実施態様において、ポン
プを使用し得る（Ｌａｎｇｅｒ、前掲；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅ
ｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、
Ｓｕｒｇｅｒｙ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ
．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。もう１つの実施態様に
おいて、高分子物質を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒおよ
びＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄ
ａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌ
ｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａ
ｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（
１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ
．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと
；また、Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎ
ら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．
Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）を参照のこと）。もう１つの実
施態様において、制御放出系は、治療標的付近、即ち、全身用量の僅かな小部分
のみを必要とする脳に配置され得る（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、
前掲、第２巻１１５−１３８頁（１９８４））。好ましくは、制御放出装置は不
適切な免疫活性化または腫瘍の部位の付近において被験体に導入される。他の制
御放出系も、Ｌａｎｇｅｒ１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３
３による検討において考察されている。
【０１５２】 細菌感染について、前記の有効成分の投与が有効な治療レジメンである被験体
は、好ましくはヒトであるが、任意の動物であり得る。従って、当業者によって
容易に理解され得るように、本発明の方法および薬学的組成物は、特に動物、好
ましくは哺乳動物への投与が適切であり、特に限定はされないが、ネコまたはイ
ヌ被験体などの家畜動物、特に限定はされないがウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、お
よびブタ被験体などの畜産動物、野生動物（野生内または動物園内のいずれであ
っても）、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなどの（
即ち、獣医用途のための）研究用動物を含む。
【０１５３】 本発明の治療方法および組成物では、治療有効用量の有効成分が提供される。
治療有効用量は、当該分野において周知の患者の特徴（年齢、体重、性、症状、
合併症、他の疾患など）に基づいて、当業者によって判定され得る。さらに、さ
らなる日常的研究が行われれば、様々な患者における様々な状態の処置のための
適切な用量レベルに関してより特定の情報が生じ、当業者はレシピエントの治療
状況、年齢および一般的健康状態を考慮しながら適切な用量を確かめることがで
きる。一般に、静脈内注射または注入の場合、用量は腹腔内、筋肉内、または他
の投与経路よりも低くなり得る。用量スケジュールは、循環半減期、および使用
される製剤に依存して変動してよい。組成物は、用量製剤に適合した様式で、治
療有効量で投与される。投与に必要とされる有効成分の正確な量は、実施者の判
断に依存し、それぞれの個体に特有である。しかし、適切な用量は、個体の体重
キログラムあたり１日あたり約０．１〜２０、好ましくは０．５〜約１０、およ
びより好ましくは１〜７ミリグラムの有効成分の範囲であり得、投与経路に依存
する。初回投与および追加投与についての適切なレジメンも変更可能であるが、
初回投与によって分類され、初回投与に続いて１時間以上の感覚を置いて次の注
射または他の投与が反復される。あるいは、１０ナノモル〜１０マイクロモルの
血中濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が考慮される。
【０１５４】 本発明を以下の実験の詳細な説明のセクションで例示する。これらのセクショ
ンは、発明の理解を助けるために記載されているが、請求の範囲に記載の発明の
内容を任意の方法で制限することを意図するものではなく、またそのように解釈
するべきではない。
【０１５５】 実験の詳細な説明のセクション 本発明は、第２１染色体の欠失において低血小板に関する５０〜２００ｋｂの
小さな候補領域を開示する。現在のところ、家族性血小板障害に関する候補領域
は３，０００ｋｂより大きく、１５０もの多くの遺伝子を含有する領域である。
ＳＨ３Ｄ１Ａは、第２１染色体の低血小板に関する小さな候補領域にマッピング
されている。ＳＨ３Ｄ１Ａ由来の新規の配列を使用するノーザン分析は、罹患個
体対正常対照から誘導されるリンパ芽球細胞由来のＲＮＡの発現が有意に高い異
常なバンドを示す。ＤＮＡ配列分析は、発達への関与および撹乱された場合に癌
をもたらすなどの細胞調節現象を示唆するドメインに相同性を示す。これらは、
ＳＨ３ドメインおよびＥＨドメインを含む。両方ドメインともタンパク質−タン
パク質相互作用に関連し、後者は、細胞骨格の維持に関連する。従って、変異、
または発現の増減は、究極的に家族性血小板障害およびおそらくはＤＳ白血病、
非ＤＳ白血病の部分集合、ならびに第２１染色体の欠失に関連する異常血小板を
究極的にもたらす進行の原因である。
【０１５６】 材料および方法 ＥＳＴでＢＡＣライブラリーをスクリーニングすることによって得られるゲノム
クローン：ＳＨ３Ｄ１Ａの遺伝子構造を研究するために、Ｈｕｒｂｅｔら、１９
９７に記載の手順に従い、放射性標識ＥＳＴ（ｃＤＮＡ）（ｄｂＥＳＴ＃４８２
４９６，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＡＬ）でヒトＢＡＣライブラリ
ーＢをスクリーニングすることによってゲノムクローンを得た。３つの陽性クロ
ーンが認められた。
【０１５７】 染色体２１ｑ２２，１１−１２上のＢＡＣ１１９Ｅ１６の細胞遺伝学的局在化
を確認するための蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）：先
の公開物（Ｈｕｒｂｅｒｔら、１９９７）に記載のように、ＢＡＣ ＤＮＡを作
製せいた。プローブとしてのＢＡＣ ＤＮＡをビオチン化し、Ｋｏｒｅｎｂｅｒ
ｇおよびＣｈｅｎ（１９９５）により記載の手順に従って正常ヒト染色体調製物
上でＦＩＳＨを行った。５０個を超える細胞を検討することによって、ＢＡＣ１
１９Ｅ１６を染色体２１ｑ２２．１１−１２上のマップに対して確認した。配列
情報に基づいたＳＨ３Ｄ１Ａに対する注文設計されたプライマーを使用し、ＰＣ
Ｒにより同様に、このことをさらに確認した。
【０１５８】 ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの一部の配列決定：総脳ｃＤＮＡまたは遺伝子を
含有するＢＡＣ１１９Ｅ１６に対してテンプレート化されたＲＴ−ＰＣＲ産物を
使用して、ｃＤＮＡの配列を決定した。
【０１５９】 逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＴ）：標準的な方法を用いるＲＴ
−ＰＣＴによって、ＳＨ３Ｄ１Ａ ｃＤＮＡを増幅した。簡単に説明すると、Ｔ
ＲＩキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．
Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を使用し、対照ＲＮＡを正常男性細胞株から単離
した。次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、ｃＤＮＡの
第一鎖を生成させた。標準的なＰＣＲ手順により、注文設計されたプライマーと
ＰＣＴ−１００ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｒとにより、ＰＣＲ反応を行った。配列決定前にＧｅｎｅｃｌｅａｎキット
（ＢＩＯ１０１，Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を使った精製により、配列決定
のためのＰＣＲ産物を調製した。より明確な配列を生成するために、配列決定す
る前に、いくつかのＰＣＲ産物をｐＣＲ−２．１ベクター（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．）にサブクローニングした。
【０１６０】 ゲノムＤＮＡのＰＣＲ：ＢＡＣ１１９Ｅ１６ＤＮＡをテンプレートとして用い
ることにより、ＰＣＲを介して３つのゲノム（エキソン）フラグメントを作製し
、上記および下記のように精製し、配列決定した。
【０１６１】 ＳＨ３Ｄ１Ａの配列決定： ＡＢＩＰＲＩＳＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤＮＡ配列決定キット（ＰＥＲＫ
ＩＮ ＥＬＭＥＲ）および注文作製されたプライマーを使用するチェインターミ
ネーター法により、両コード鎖および非コード鎖のヌクレオチド配列についてそ
の全体を判定した。上記のように、ＤＮＡ配列決定のためのテンプレートはＰＣ
Ｒ産物またはサブクローンのいずれかであった。
【０１６２】 ＳＨ３Ｄ１Ａの上流領域の配列決定： ＳＨ３Ｄ１Ａの５’末端の配列決定を完了し、転写開始部位を同定するために、
以下の２つの方法を利用した： １．５’ＲＡＣＥ： ５’Ｍａｒａｔｈｏｎ ＲＡＣＥキット（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ＣＡ）を用いて５’ＲＡＣＥを行った。次いで、反応産
物を１％ＳｅａｌＰｌａｑｕｅ ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕ
ｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）上で電気泳動を行った。次いで、ネステッド
ＰＣＲフラグメントを配列決定することにより、最も大きなサイズ（＞２Ｋｂ）
の産物をさらに確認した。
【０１６３】 ２．ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡの単離 Ｙａｍａｋａｍａら、（１９９５）に記載のように、ｃＤＮＡライブラリース
クリーニングからヒトｃＤＮＡクローンを得た。ｃＤＮＡをオリゴプライム化し
、方向を定めずにベクターのＥｃｏＲＩおよびＣｈｏＩ部位にクローニングした
。電気泳動、次いで配列決定を使用することにより、クローンのサイズを分析し
た。
【０１６４】 配列決定分析： トレースの質を評価し、配列データを組み立てるＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ
Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＡＢＩ Ａｕｔｏａｓｓｅｍｂｌｅプログラ
ム）を用いて、データ処理を行った。ベクターのクリッピングは手動で行った。
配列の正確さを確実にするために、終了した配列の全ての領域が１を超えるサブ
クローンまたはＰＣＲフラグメント（通常、３−５Ｘ）に含まれた。常に、逆方
向へ配列決定した。ヒトＳＨ３Ｄ１Ａの配列をＧｅｎｂａｎｋ（ＢＬＡＳＴＮ&
ＢＬＡＳＴＸ）に対してスクリーニングした。Ｖ−ｇｃｇプログラムを使用する
ことによって、該配列も、先に公開されたＳＨ３Ｐ１７配列（Ｈｓｕ６１１６６
）と比較した。先に公開されたＳＨ３Ｐ１７配列と今回新たに配列が決定された
ＳＨ３Ｄ１Ａとの間には有意な差異が認められた。これらは、約８％のヌクレオ
チドが同等であった。再起の配列は全部で僅か３，２３０ｂｐｓの３’末端しか
有さないが、本発明の配列は５，２００ｂｐであった。Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｌｅａ
ｖｉｓにおける全相同配列ｇｂ＃ＡＦ０３２１１８との比較では、同タンパク質
開始部位を示し、同様であるが同一の構造ではないことを示した、図１および２
を参照のこと。
【０１６５】 ＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の構造 タンパク質の構造はｃＤＮＡ配列分析に基づいた。４つのＳＨ３ドメインが先
に確認された（Ｓｐａｒｋｓら、１９９６）。しかし、細胞周期の制御および形
態形成に関与するタンパク質の相互作用に関連しているＮ末端においてＥＨドメ
イン（Ｅｐｓ相同ドメイン）を含むさらなるドメインの規定が最も重要であった
。これらのことは、ヒト胚形成および癌（特にダウン症候群（ＤＳ）に伴う白血
病、Ｆａｎｎｉｎら、１９９５により報告されている第２１染色体の欠失に関連
する血小板の減少、ならびにＤｏｗｔｏｎら（１９８５）およびＨｏら、（１９
９６）により報告された家族性血小板障害、地図の全ての位置はＳＨ３Ｐ１７を
含む。）の両方に役割がある可能性を示唆する。
【０１６６】 ノーザンブロッティングによる遺伝子発現研究： ヒトの複数の組織から作製したノーザンブロットを用い、製造者の支持（ＣＬ
ＯＮＥＴＨｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）に従い本研究を行っ
た。図６について、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、筋、腎臓および膵臓に含まれる
試験した成人ヒト組織において、発現されるべき遺伝子が認められた。
【０１６７】 ＳＨ３Ｄ１Ａに対応する全長ｃＤＮＡクローンの調製 ＳＨ３Ｄ１Ａの単離および配列の決定について、上記のような様式で胎児脳に
基づくｃＤＮＡをスクリーニングした。即ち、５つの異なるサイズのｃＤＮＡク
ローンの配列決定を行い、少なくとも３つのイソ型が存在することが示された。
図８に示される配列決定されたすべてのｃＤＮＡにいてみると、番号２１は１２
２１アミノ酸をコードする５４３８ヌクレオチドを含有する全長ｃＤＮＡであっ
た。番号１１は１２１５アミノ酸をコードする５１７９ヌクレオチドを含有する
より短い全長ｃＤＮＡであった。クローン番号５および９は、それぞれ２１９２
ｂｐ、３１９３ｂｐおよび３１２８ｂｐ長のｃＤＮＡを表すが、番号５は、ただ
２つのＥＨドメインを含有する５’ＵＴＲで番号２１および１１に同一であった
。
【０１６８】 本研究において作製されたｃＤＮＡと先に公開された相同物との間の比較、ま
たは本研究において単離されたそれぞれのｃＤＮＡ間の比較では、本発明者らは
図８に見られるような有意な差異を見出した。番号２１とＩＴＳ、番号２１と番
号１１および番号９とＳＨ３Ｐ１７との間の差異をここに列挙する：番号２１は
、位置１１４で１アミノ酸のみの差異を示すタンパク質レベルで、ＩＴＳ（ＡＦ
０６４２４３；Ｇｕｉｐｐｏｎｉら、１９９８）に９９．８％同一であるが、５
’ＵＴＲでは、過剰の１６０ｂｐおよび３’ＵＴＲの番号２１においてヌクレオ
チドレベルで９６．７％の同一性を与えるＸＸｂｐの差異が認められた。番号１
１は、ＳＨ３−Ａ内のｃＤＮＡ２５７３−２５８６の位置で５アミノ酸を消失し
ており、番号２１と比較すると３’ＵＴＲ領域内で２２２ヌクレオチドを消失し
ていた。番号９は、コード領域でＳＨ３Ｐ１７（ＧｅｎＢａｎｋ Ｈｓｕ６１１
６６，Ｓｐａｒｋｓら、１９９６）に１００％同一であったが、ヌクレオチドレ
ベルでは７６．８％の同一性を示し、主な差異は３’ＵＴＲで認められ、合計で
２２２ｂｐが２１８９（３９６３−１７７４）〜２４１１の位置で消失しており
、番号１１と番号２１で見られる同一の位置で認められた。番号９およびＳＨ３
Ｐ１７は、ＳＨ３−Ｃドメインを消失した４つのＳＨ３ドメイン（Ｇｕｉｐｐｏ
ｎｉら、１９９８）が認められるのみであった（図３）。
【０１６９】 Ｇｕｉｐｐｏｎｉら１９９８により記載の通り、ＩＴＳＮの他のタンパク質に
対する相同性も図２に含まれる（Ｓｐａｒｋｓら１９９６およびＧｕｉｐｐｏｎ
ｉら１９９８）。
【０１７０】 ＩＴＳＮ遺伝子のゲノム組織化およびＳＨ３Ｐ１７およびＩＴＳ／ＩＴＳ１との
比較： 第２１染色体上のこの領域において、ヒトＳＨ３Ｄ１Ａと配列決定されたヒト
ゲノムＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ ＡＰ００００５０、ＡＰ００００４９お
よびＡＰ００００４８）とを比較したところ、この遺伝子は、２９エキソンから
成り（図３および正確なエキソン−イントロンの境界については表２）、そのサ
イズは４４〜１５１６ｂｐで変動することが示された。イントロンのサイズは、
３５５ｂｐ〜７．５Ｋｂの範囲である。全てのイントロンは、一般的なＧＴ−Ａ
Ｇモチーフが確認されるドナーおよびアクセプター部位をスプライシングする。
推定ＳＨＤ１Ａ翻訳開始コドンはエキソン２上に位置するが、終止コドンはエキ
ソン２８上に存在する。
【０１７１】 ５’上流配列の特徴付け ヒトＳＨ３Ｄ１Ａ遺伝子の５’上流配列を決定するため、ＰＡＣ Ｔ１２７６
を使用してプロモーターを検索するための分析を行った。
【０１７２】 複数の成人および胎児組織における複合体ｍＲＮＡ発現（図１７：ＩＴＳに関す
る研究の概要を参照のこと） 表および図に見られるように、複数の成人および胎児組織におけるＳＨ３Ｄ１
Ａのノーザンブロットは、予想以上に複雑な結果を示した。発現研究のために、
合計で１４のプローブを使用した（第１部）。６つの主なｍＲＮＡ転写物が検出
され、これらは、図の上部において示された使用される任意のプローブを使用し
て、成人組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、筋、腎および膵臓）および胎児組織
（脳、肺、肝臓および腎臓）において偏在的に発現された５．４ｋｂのｍＲＮＡ
フラグメントを含む。２．５ｋｂフラグメントは成人において遍在的に発現され
たが、プローブ番号１（エキソン１）を使用すると筋で強く認められた。２．０
ｋｂフラグメントはプローブ番号２、３および番号１２−１３（エキソン２−７
およびエキソン２８−２９）を除く全てのプローブを使用すると成人および胎児
において偏在的に発現された。最も強い発現は成人の筋、ならびに胎児の肝臓お
よび脳に認められた。４．５ｋｂフラグメントは偏在的に発現されるが、プロー
ブ番号４、６、９および１２（エキソン７〜１７およびエキソン２３〜２５）を
使用すると胎児のみの肝でより強い発現が見られた。最後に、１１ｋｐより大き
なフラグメントはプローブ番号２および３（エキソン２〜７）を使用することに
よって、成人および胎児組織において脳で特異的に、プローブ番号９（エキソン
２２〜２８）を使用することによって成人でのみ発現された。さらに、プローブ
番号４および６（エキソン７〜１７）を使用することによって、胎児組織の肝に
おいて小さなフラグメント１．０ｋｂも認められた。
【０１７３】 結果 本明細書において示されたデータにより、白血病ならびに神経異常および機能
不全に関する状態における本発明の遺伝子の役割が確認される。上記で述べたよ
うに、該遺伝子では、白血病に関する領域、および成人脳で認められる脳以上に
関する領域で変化が生じることが観察される。神経および白血病状態の両方につ
いて調節におけるこのファミリーの遺伝子の役割は、本明細書に記載の診断およ
び治療モダリティー上、該遺伝子の適用を指令する発達ならびにホメオスタシス
の両方において、広範な調節機構による影響を及ぼすことである。
【０１７４】 本発明は、本発明の本質的特長から逸脱することなく他の形態でも具体化され
、他の方法で実施することができる。従って、本発明の開示内容は全ての局面に
おいて例示であり、添付の請求の範囲に示される本発明の範囲を制限することは
意図しない。全ての変更は、本発明の等価物の意味および範囲内にあり、本明細
書に包含されることが意図される。
【０１７５】 様々な参考文献が本明細書において同定され、言及されている。そのような参
考文献ならびに他の公開物、特許公開、または本明細書において引用された文書
の開示内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒトＳＨ３Ｄ１Ａの構造および相同性を表す。
【図２】 ＳＨ３Ｄ１Ａドメイン構造および相同性 − ヒト対Ｘｅｎｏｐ
ｕｓを表す。
【図３】 巨核球異常の原因である第２１染色体の領域を表す。
【図４】 ヒトＳＨ３Ｄ１Ａの核酸配列を表す。
【図５】 ヒトＳＨ３Ｄ１Ａのアミノ酸配列を表す。
【図６】 心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、筋、腎臓および膵臓において発現さ
れるＳＨ３Ｄ１Ａのノーザンブロットを表す。
【図７】 本発明に従って、４つのｃＤＮＡクローンを示すマップ（長さお
よびタンパク質ドメインを含む）を表す。
【図８】 クローン番号２１として本明細書において同定されているｃＤＮ
Ａクローンの核酸配列を表す。
【図９】 クローン番号２１のアミノ酸配列。図の上部は翻訳されたタンパ
ク質配列、図の下部は全タンパク質配列を示す。
【図１０】 クローン番号１１として本明細書において同定されているｃＤ
ＮＡクローンの核酸配列を表す。
【図１１】 クローン番号１１のアミノ酸配列。図の上部は翻訳されたタン
パク質配列、図の下部は全タンパク質配列を示す。
【図１２】 クローン番号５として本明細書において同定されているｃＤＮ
Ａクローンの核酸配列を表す。
【図１３】 クローン番号５のアミノ酸配列。図の上部は翻訳されたタンパ
ク質配列、図の下部は全タンパク質配列を示す。
【図１４】 クローン番号９として本明細書において同定されているｃＤＮ
Ａクローンの核酸配列を表す。
【図１５】 クローン番号５のアミノ酸配列。図の上部は翻訳されたタンパ
ク質配列、図の下部は全タンパク質配列を示す。
【図１６】 移動およびＣＮＳにおける形成中の神経芽においてＩＴＳＮ発
現を示すマウス胚（９日目）に対する組織免疫化学染色を表す。
【図１７】 ＩＴＳＮに関する研究の概要： Ｉ．遺伝子の配列：第１の線は、ＩＴＳＮ ｃＤＮＡのスケールを示す。第２の
線はエキソンの合計数とそれぞれのエキソンが局在する位置を示す。 ＩＩ．タンパク質ドメイン対ヌクレオチド配列：ＩＴＳＮは、マップ上に掲載さ
れた１１タンパク質ドメイン（２つのＥＨドメイン、５つのＳＨ３ドメイン、お
よびそれぞれ１つずつのＧＥＦ、ｐＨおよびＣ２ドメイン）から成ると推定され
た。ｃＤＮＡレベルにおけるそれらの相対的位置を示すため、それぞれのドメイ
ンの下に番号を付した。 ＩＩＩ．ヒト成人および胎児組織の遺伝子発現：この部分では、広範かつ代替的
スプライシングを生じる組織によりおよび発達段階特異的発現によりＩＴＳＮが
偏在的に発現されたことを示すノーザンブロットの結果について概説した。
【図１８】 本発明の核酸分子およびコンセンサス配列を示すインターセク
チン（ＩＴＳＮ）間の配列比較を表す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/68 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 48/00 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 48/00 5/00 Ｂ (71)出願人 Ｓｕｉｔｅ 2112，8700 Ｂｅｖｅｒｌｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅ ｌｅｓ、ＣＡ 90048−1865 Ｕ．Ｓ．Ａ． (72)発明者 チェン シャオ−ニン アメリカ合衆国、カリフォルニア 91006、 アルカディア、ニコラス レイン 723 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA29 AA40 BB20 CB01 CB17 CB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 FB07 FB08 FB12 4B024 AA01 AA11 BA44 CA01 CA07 CA12 HA11 HA14 HA15 HA17 4B063 QA01 QA08 QA18 QA19 QQ42 QQ53 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR55 QS33 QS34 QX01 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA13 MA13 MA24 MA52 MA56 MA66 MA67 NA14 ZA022 ZA512 ZB272 4H045 AA10 AA11 BA10 BA41 CA40 EA20 EA24 FA74

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 類似物、断片、突然変異体およびそれらの変種を含み、人間
    の遺伝子ＳＨ３Ｄ１Ａを符号化した孤立核酸。
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