CN1261407A - 生物样品中生物分子的噬菌体检测法 - Google Patents

生物样品中生物分子的噬菌体检测法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用丝状噬菌体来检测生物样品中目的分子的存在情况方法。它由一系列根据所用噬菌体特点设计和定义的操作组合而成。这些噬菌体具有展示于衣壳表面的至少一种分子(通常是但不限于是蛋白质),该分子能够与所述生物样品中的至少一个目的分子结合。根据本发明的方法,利用噬菌体衣壳表面展示的分子与噬菌体自身基因组间的联系可以检测是否存在所述分子。衣壳上展示的分子所特有的形成特异复合体的能力确保形成噬菌体—目的分子复合体,后者可以通过扩增噬菌体DNA中的已知序列来进行检测。本发明所述方法非常灵敏,特别适用于诊断和预测。

Description

生物样品中生物分子的噬菌体检测法
本发明涉及一种用于检测生物材料中是否存在目的分子的方法。该方法是为了解决许多科学研究领域中的一种常见需要。实际上，能够鉴定生物样品中是否存在与例如临床病理学相关的分子，一直是研究工作，特别是在医药领域中的一个重要目标。
毫无疑问，生物医学领域是该方法的主要(尽管不是唯一的)应用领域。实际上已提出了一些涉及此类方法的申请，其目的在于逐渐提高检测的灵敏度，特别是达到诊断水平。
最常用于检测细胞或组织提取物中是否存在特异分子的生物化学手段是抗体，这是因为它们具有极好的灵敏度和较高的结合特异性。
当这些方法中与目的分子发生了相互作用时，可以用与抗体自身相连的标记物(例如荧光物质、具有酶活性的蛋白质或放射标记物)来使之显现。
已发现，在所有情况中通过使用所谓的信号放大方法可以显著增强这些标记物的检测能力。用这些标记物，例如通过将标记物与能结合第一个抗体(初级抗体)的第二个抗体(次级抗体)，而非与用来进行特异识别的抗体(初级抗体)连接在一起，能获得更强的检测信号。已建立了利用次级抗体的许多方法，其中次级抗体共价键连接了某些标记物分子，例如荧光物质(比如荧光素或诺丹明)、具有酶活性的蛋白质(比如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)，在用电子显微镜进行检测的情况中，还可使用铁蛋白或胶体金球体。
可替代的放大系统利用了分子的高结合亲和力，比如生物素(一种小的水溶性维生素)和链霉抗生物素蛋白(细菌蛋白质)之间的亲和力，或者卵磷脂(能识别并结合特异糖基的蛋白质)和糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖等分子之间的亲和力。
在这一基本构思上可以做非常广泛的改动，包括那些导致形成标记物网、能相当大地放大检测信号的改动。无论如何，所有这些方法都与抗体作为能特异识别目标分子的分子这一用途相关，并且它们的灵敏度也受到目标分子浓度的限制。
最近设计的一些方法可以克服后一种限制，这些方法基于运用PCR(聚合酶链反应)技术来代替酶检测法。实际上它们也是基于单克隆抗体能够抗特异配体的用途，但是在这种情况中，所述配体不是与蛋白质、而是与序列已知的多核苷酸以物理方法偶联在一起的。
这样就可以采用聚合酶链反应(PCR)有效地扩增已知DNA序列进行随后的检测(V.Ruzicka等，1993；T.Sano等，1992；H.Zhou等，1993)。
这种称为免疫PCR的方法，实际上甚至能检测到与目标分子结合的单个抗体。这些方法灵敏度有了相当的提高，但引发了一系列问题，其中包括多核苷酸与抗体的直接连接，以及抗体与目标分子结合过程中多核苷酸带来的无法避免的干扰所导致的高背景。
另外，考虑到扩增反应的特异性以及产量要取决于混合试剂时的温度，如果在低于引物杂交最佳温度的温度下进行PCR反应，就有可能产生非特异性的杂交产物。
通过仅在体系已经达到“热启动”(“Hot Start”)引物能特异杂交的温度，才向扩增反应加入关键试剂，目前这个问题已得以解决。通过机械地隔离一种试剂(D.E.Birch等，1996)或者用抗体封闭DNA聚合酶的酶活性(J.Cheng等，1996)可以实现这个步骤。
近来，还建立了一种在细胞上进行的PCR方法，称为原位PCR(G.J.Nuovo，1994)，这种方法是在原位杂交反应之后进行扩增。根据这种方法，要将DNA模板和引物保持物理隔离直至细胞发生裂解之时，其优点是避免了任何非特异杂交反应(EP24808 Hoffmann La RocheInc.)。
另外，有一系列专利都涉及新的诊断方法，这些方法预期能克服现有方法的许多常见问题，从而可提高反应信号的扩增。这些专利含有多种以此为主题的方法，比如利用与发现特定蛋白质相关的PCR(WO9421676)；利用与配体(例如HIV-1病毒的表位)偶联的基因工程化杂合酶(WO942636)；利用由抗原结合蛋白所结合的核酸制备的病毒表位(WO9406934)；利用部分病毒cDNA(例如取自HCV的cDNA)来表达与调控序列有关的病毒表位和针对该表位的单克隆抗体。在后一种情况中，目的cDNA区使得能够在抗体应答以及与DNA杂交后的反应之间进行交互参照(EP388232)。
另外一项专利，与此不同，其主题是构建抗原决定区文库，这是用DNA酶-I消化病毒(例如HIV)基因组，之后采用合适的载体来表达这些片段，然后利用抗体挑选出所述表达产物而获得的(EP373070)。
本文中，本发明的价值在于发明主题是一种多用的方法，可以应用于非常不同的情况和目的，根据这些方法，能克服本领域现有的多种问题。
根据本发明的方法实际上不必制备特异抗体，而是利用在衣壳上展示任何能与待测样品中的目的分子相互作用的分子的重组丝状噬菌体。
当有展示合适分子的噬菌体时，该方法还能检测任何类型的目的分子(而不仅是氨基酸)，即使这些目的分子在各种来源的生物样品(取自人体或动物体的样品，以及其他类型的样品，例如水、饮料或食物)中以极微量存在。构成本发明主题的一组操作也经过设计以便消除DNA和试剂之间的非特异性结合和它所导致的损害结果清晰度的背景。
这些优点是由这一事实带来的，即用于经PCR进行检测的DNA不直接与试剂接触，而是包含在所用重组噬菌体内。
蛋白衣壳包被实际上防止了用于后续检测的DNA在配体分子(衣壳上展示的)和受体分子(样品中的目的分子)结合反应过程中造成的干扰。
然后，在配体分子和受体分子的相互作用之后，进行适当的洗涤操作来清除没有通过特异相互作用与受体结合的噬菌体。最后，通过加入必需试剂来扩增噬菌体DNA的核苷酸序列，加入试剂的过程应避免非特异性的发生。事实上，在起始阶段，待扩增的DNA仍受到噬菌体衣壳蛋白的保护，这些蛋白直到聚合反应开始时才会变性。
另一个优点源于这一事实，即用于构建受体噬菌体的基础重组噬菌粒基本是由大肠杆菌以含有单链DNA的颗粒形式分泌出来。实际上，从现有技术知道，用单链DNA模板进行PCR能产生优于双链DNA的结果。
参考附图可以更清楚地理解本发明。
图1显示噬菌体P787 DNA的扩增结果，该噬菌体在衣壳表面展示一种能结合抗HCV抗体的肽，是通过UV荧光照射含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶显迹的。M是用限制酶Hinf I水解质粒DNA pUC19得到的分子量参照物。
图2显示的是噬菌体混合物与来自血清中含有抗HCV抗体的患者的C17和C22血清温育后的DNA扩增结果，是通过UV荧光照射含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶显迹的。PC89是用来构建噬菌体文库的非重组噬菌体，此处作为阴性对照。
图3显示图2所用的同一噬菌体混合物与来自血清中不含抗HCV抗体的两名志愿者的N57和N60血清温育后的DNA扩增结果，将其作为阴性对照。通过UV荧光照射含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶显示结果。PC89是实施例1中描述的阴性对照噬菌体。M是用限制酶Hinf I水解质粒DNA pUC19得到的分子量参照物。
本发明的主题是一种用于确定和测量某些目标分子(本文中也将它们称为受体分子)存在情况的方法，该方法基于这些分子能被展示在噬菌体衣壳上的至少一种分子(此处作为配体分子)特异识别。
有必要强调的是，在本说明书中“配体分子”和“受体分子”的概念是严格相对的，并且与具体的研究内容严格相关。由此，仅根据展示于衣壳表面上的分子能与样品中预计存在的分子特异地结合的能力，即可将它定义为“配体”，将样品中其存在性或浓度待测的分子定义为“受体”，反之亦然。
在本发明中，任何得自生物体液、细胞或组织表面等来源的分子，如果可以通过它与如上定义的特异性“配体”的相互作用来确定其存在性，就都被认为是“受体”。例如，识别已得到明确鉴定的抗原(比如病毒抗原、肿瘤抗原或正常组织中存在的抗原)的抗体，或者其确切分子特性还未确定的抗原，都属于“配体”类(尽管这类中不仅是这些分子)。在这种情况中，可认为这些抗原是‘受体’。这些定义与某种情况有关，例如这些抗原在待检生物体液或细胞和组织表面上的存在情况和/或浓度是有诊断价值的指标这样的情况。但是，根据本发明所述方法，如果要确定其存在性或浓度的目的受体分子是由抗体组成的，则可以用抗原本身作为配体。
同样，如果必要，可以认为“受体”，甚至存在于单个细胞或组织细胞的细胞膜上的特异受体，以及生物体液中存在的可溶性受体，能作为“配体”。在这种情况中，这些分子能用可与它们特异性结合的分子来检测。自然，当目的分子不是由膜受体(这种情况中作为“配体”)而是由它们的特异性配体(这种情况中作为“受体”)组成，可以颠倒这一关系。
因此可以理解，任何分子，当它在受检样品中的存在具有诊断和/或预测价值(已确定它与特定病理学表现相关后)，或者由于无论何种目的而感兴趣时，都可以包括在“受体”的范畴内。
显然本方法具有许多应用，特别是在医学和兽医领域，还有其他领域，例如食品和环境领域。
本发明人验证了通过扩增存在于噬菌体基因组中，并与“配体”物理上或基因上相关联的特异核苷酸序列，用丝状噬菌体(重组或非重组的)来检测“配体”和样品中存在的(即使浓度非常低的)受体分子之间的相互作用的可能性后，得到了本发明所述方法。
简而言之，本发明的方法可以应用于能鉴定以下分子的任何情况中：
A)受体分子或者一组同种“受体”，其在生物体液中或者细胞或组织表面上的存在与特定病理学有关，或者具有较高的价值，例如可用于诊断目的；
B)“配体”或一组“配体”，例如多肽类的，其结构使得它们能展示在噬菌体衣壳上，并保持与受体分子特异结合的能力。
因此本发明的主题是基本上基于以下操作的一种方法：
a)将目的分子固定，同时不破坏其与噬菌体表面上展示的分子相互作用的能力；
b)使如上固定了的目的分子与至少一种重组丝状噬菌体特异地结合，该噬菌体内含有其序列至少部分已知的单链DNA分子，并在衣壳表面展示有能与存在于生物样品中的至少一个目的分子特异结合的至少一种分子；
c)从反应体系中分离这样得到的分子—噬菌体复合体；
d)洗涤除去因分子和噬菌体之间非特异性相互作用产生的复合体；
e)加入试剂以便进行以下g)所述操作；
f)裂解如上挑选出的噬菌体蛋白衣壳的构成蛋白；
g)经聚合酶链反应(PCR)扩增以上所得DNA；
h)检测如上扩增的DNA，例如用常规方法。
用于检测扩增DNA的方法可以是例如在含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶上电泳，毛细管电泳、与特异放射性标记探针或发光探针杂交。
g)所代表的操作，具体来说是指噬菌体DNA的扩增，是利用PCR技术，用一对寡核苷酸来进行的，这对寡核苷酸中的至少一个与噬菌体DNA的已知序列互补。另外，已经发现，采用在DNA发生变性的温度(通常落在93-96℃)水解噬菌体衣壳蛋白质的方法，将使引物和DNA模板在相同的温度进行接触，从而可以得到PCR的“热启动”，因此有益地消除了非特异反应产物。
本方法的一个重要应用是目的分子是抗体的情况。
另一个具体应用是在固相中，以及通过被动吸附和/或利用分子自身的特异抗体来固定目的分子的情况中。
无论如何，还可以利用细菌或至少一种选自金黄色葡萄球菌(Staffilococcus aureus)蛋白A、C组链球菌蛋白G以及任何其他能结合动物免疫球蛋白的细菌蛋白质来进行固定。
本发明另外特别有价值的应用，是那样一些应用：在这些应用中，所用噬菌体在衣壳表面展示病毒抗原、自身抗原(可存在于生物体液所来源的动物中的抗原)、变应原、细胞膜受体、能模拟受检生物体液中所述分子或寡肽存在情况的其部分，以及特异的细胞表面受体或由此衍生的肽，或氨基酸类的配体(该配体的受体存在于待测体液中)。
本方法的基本方面中，首先是这样一个事实，用于检测的手段总是丝状噬菌体，通常是重组型M13、f1或fd，它们能在衣壳表面展示1或多个作为配体、能与待测受体特异性地相互作用的分子，优选氨基酸类分子。由于不再直接使用配体分子，而是用含有经适当挑选的天然“配体”、其部分或模拟分子的噬菌体，这一点构成创造性的第一要素。
较之过去描述的其他检测方法，比如免疫PCR(这种方法中是将抗体人工地与作为探针的序列已知之多核苷酸分子结合)，本发明优越之处在于是用噬菌体内所含遗传信息来确定是否存在目的分子。
另外，因能同时使用不同噬菌体，这样便可以同时检测目的分子的不同部分，甚至是多种目的分子。
但是，最重要的特点是噬菌体表面展示的“配体”与用于经PCR来进行检测的噬菌体DNA之间的联系。噬菌体DNA可以由编码“配体”的遗传信息组成，但更普遍的是由噬菌体基因组中的任何核苷酸序列组成。
因此，用本发明所述方法可以挑选到与检测所用“配体”相关联的核苷酸序列，从而提高特异性并减少扩增反应时间。实际上，为了完成PCR反应，此时可以提前选择寡核苷酸引物的序列、每次温育采用的时间和温度，以及每个反应的循环次数，以便获得非常迅速和高度特异的扩增。
实际上，由于噬菌体内存在的用于检测之遗传信息的特性，很容易用现有的PCR方法将其扩增，这就使得可以将反应管中存在的即使单个DNA分子显示出来。用目前使用的其他检测方法不容易达到用聚合酶链反应所能达到的灵敏度。
另一个优点源于与这一事实的密切联系：可以设计扩增所用的寡核苷酸探针，以便在即使还存在来自其他噬菌体(不包括该特定序列)的DNA时特异地扩增噬菌体中的特定序列。例如，可以设计探针从而只扩增噬菌体含有特定插入片段(例如编码展示在衣壳上可作为“配体”的分子的插入片段)的DNA，即使还存在不含该片段插入噬菌体DNA或者含有序列不同的插入片段的噬菌体DNA。这一点的最直接结果是能使受检的受体分子(或者多种受体分子)与含有不同噬菌体的混合物反应，并在有其他结合的情况下鉴定出每一种噬菌体的结合。
另外，DNA包含于蛋白衣壳内的事实能克服PCR方法在检测灵敏度方面通常存在的限制。这种限制是需要根据两个引物的序列将DNA模板与扩增探针在较低的温度接触。当升高温度开始第一次扩增循环时，部分DNA仍复合了探针，导致DNA模板上的探针本身的非特异延伸。已提出多种方法来祢补这个问题(4，5)。本发明所述方法，如上所述能完美地解决该问题，因为它使用了天然包裹的DNA，这样能防止DNA在衣壳水解前与特异探针接触。在这方面，仅仅通过完善方法和采用能使DNA和特异探针仅在高温接触的热水解法就可达到非常高的特异性。
采取这种相当简单并且非常实用的实施方案的方式，可以达到技术术语中所称的PCR“热启动”。
至此已对本发明进行了大致的描述。借助以下实施例，将给出更详细描述的具体实施方案，以便更清楚地理解本发明的目的、特点、优点和实施方法。这些实施例仅做例证，并不能限制所附权利要求所限定的发明范围。实施例1用于检测患者血清中人丙型肝炎病毒(HCV)抗原之特异抗体存在情况的方法
依照本发明使用了如下方法：
将一定量特异识别Fc部位的人的山羊抗IgG免疫球蛋白吸附在聚碳酸酯培养板的孔中(该培养板有96孔，普遍用于PCR方法中，Thermowell-IITM6509型，Costar制造)。温育后，用磷酸盐缓冲液清洗培养板，并在重悬了粉末状脱脂牛奶的缓冲液中温育以封闭剩余的吸附位点(如文献所述)。将以下物质加入这样制备好的培养板的孔中：1)一定量不同稀释度的受检人血清；在本实施例中使用来自于感染了HCV并含有抗HCV抗体的患者的人血清型C17和C22。血清型N57和N60得自没有发现抗HCV抗体的明显健康个体。将一定量这些血清与非重组型噬菌体混合，该噬菌体作为非特异性载体。还要加入重组噬菌体2A，该噬菌体能够在PCR反应中被扩增但在衣壳上不展示特异配体(在本实施例中即是能结合人抗HCV抗体的肽)；可选择地加入2B(HCV特异的噬菌体P787)。
于37℃温育90分钟后，倒空培养板并用磷酸缓冲液清洗以除去所有未特异结合的重组噬菌体。然后向每个孔中加入以下混合体系：包含在适用于PCR反应的缓冲液中的扩增所用特异DNA探针、聚合酶Taq、脱氧核苷三磷酸。
将培养板转移到恒温反应器中做PCR，并继续进行循环反应，首先于95℃加热5分钟。这个过程尤其重要，因为只有在该温度下噬菌体蛋白质才发生裂解，从而使特异探针接触到待扩增的DNA。PCR反应由高温起始(热启动)，并继续做25个如下循环：94℃10秒和72℃10秒。于72℃温育2分钟来终止反应。
在含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶上经电泳使这样扩增的噬菌体P787DNA显迹，如图1的具体例子所示。实施例2利用噬菌体组合物来诊断患者血清中抗HCV抗体的存在情况
用多种特别挑选的噬菌体的组合物来诊断血清中抗HCV抗体的存在情况，该组合物中的每种噬菌体模拟人丙型肝炎病毒的不同蛋白区域。由于可以根据噬菌体所带序列但更简单地可根据插入片段的长度来区别噬菌体，这样就能在琼脂糖凝胶上观察到与噬菌体DNA插入片段的大小对应的不同长度之DNA片段的扩增情况。
在本实施例中说明用噬菌体的混合物如何能在琼脂糖凝胶上实现如实施例1中所述的反应。本实施例表明噬菌体混合体系比用单个噬菌体时的预见性更好。
令人惊讶的是在血清中能鉴定不同抗原的抗体，而扩增反应是特异的。图2和图3所示结果即含有这样的反应，该反应可以用实施例1中描述的电泳进行分析。实施例3用于体外检测人抗IL6抗体的方法
本实施例描述这样一种方法，在该方法中将IL-6的受体固定在培养板上，并用表达IL-6的噬菌体来检测在胞外培养基中IL-6抗体的存在情况。
将编码hIL-6的人cDNA与如文献所述得自M13的噬菌粒基因III的氨基端融合在一起。该重组hIL-6/M13-pIII噬菌体可以被用来检测是否存在人白细胞介素6受体。现有技术中已给出了如何挑选表达hIL-6的噬菌体的描述，如文献所述，该hIL-6在体外能结合hIL-6/R和抗hIL-6抗体。我们已证明，使用本发明所述方法可以进行识别并且更为有效。
在固体支持物(例如塑料珠)上，将1μg抗hIL-6单克隆抗体混入10mM NaHCO3(pH9.2)中于4℃保温过夜。在1ml TBS/6％BSA中于4℃封闭4小时之后，将珠子与hIL-6一起于4℃保温过夜。将珠子进行两次如下操作：用2ml TBST洗两次，然后在1ml TBST/0.1％BSA中于20℃保温1小时。再在500μl 100mM甘氨酸-HCl(pH2.2)中洗脱噬菌体，并用3M Tris-HCl(pH8.9)中和洗脱液。可如本发明所述经PCR来检测与抗体结合的噬菌体。实施例4用于检测工程化CHO细胞的培养物中可溶型人IL-6受体的方法
本实施例描述这样一种方法，在该方法中根据本发明所述方法检测工程化卵巢癌细胞中表达的人IL-6受体，并且在可能的情况下用能表达IL-6或IL-6超拮抗剂的噬菌体进行定量。
CHO细胞系CsRh14能分泌可溶性白细胞介素6受体(ref)。用100μl经甲苯磺酰活化的Dynabeads M450(unipath)，采用磁粒子浓缩器制备其浓缩物，用50mM硼酸钠(pH9.5)清洗，并在400μl同样的缓冲液中于25℃保温24小时，该缓冲液中含有15μg抗hIL-6Rα单克隆抗体。于4℃在TBS/0.1％BSA中饱和12小时后，将珠子与400μl不含血清的条件培养基于25℃温育4小时，该培养基得自细胞系CsRh14，并含有250ng shIL-6Rα。洗几次后，将已结合了shIL-6Rα的珠子与表达hIL-6的噬菌体(以1∶4的比率)一起于4℃温育16小时。通过加入适量的TBS/0.1％BSA将反应体积补至1ml。用1ml TBST将珠子洗3次，并在400ml 100mM柠檬酸盐缓冲液(pH3.2)中洗脱噬菌体。用3M Tris-HCl(pH8.9)进行中和后，根据本发明的特点经PCR扩增来检测结合噬菌体。
参考目录
1.V.Ruzicka，W.Marz，A.Russ和W.Gross：1993科学260：698-699。
2.T.Sano，C.L.Smith，C.R.Cantor：1992科学258：120-122。
3.H.Zhou，R.J.Fischer和T.S.Papas：1993核酸研究21：6038-6039。
4.D.E.Birch，L.Kolmodin，J.Wong，G.A.Zangenberg和M.A.Zoccoli：1996自然381：445-446。
5.J.Cheng，M.A.Shoffner，G.E.Hvichia，L.J.Kricka和P.Wilding：1996核酸研究24：380-385。
6.G.J.Nuovo《PCR原位杂交：方法和应用》Rower Press1994。

Claims (15)

1.一种用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，该方法包括一组以下操作：
a)将目的分子固定，同时不破坏其与噬菌体表面上展示的分子相互作用的能力；
b)使如上固定了的目的分子与至少一种重组丝状噬菌体特异地结合，该噬菌体内含有其序列至少部分已知的单链DNA分子，并在衣壳表面展示有能与存在于生物样品中的至少一个目的分子特异结合的至少一种分子；
c)从反应体系中分离以这种方式得到的分子—噬菌体复合体；
d)洗涤除去因分子和噬菌体间非特异相互作用产生的复合体；
e)加入试剂以便进行以下g)中描述的操作；
f)裂解如上挑选出的噬菌体之蛋白衣壳的构成蛋白；
g)经聚合酶链反应(PCR)扩增以上所得DNA；
h)检测如上扩增的DNA。
2.权利要求1所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中f)指出的操作是在DNA发生变性(构成随后g)操作的一个步骤)的温度下进行的，并紧接着进行衣壳蛋白的裂解，并是在同样的温度下进行，从而达到PCR的“热启动”。
3.权利要求1或2所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中的目的分子是抗体。
4.权利要求1至3任何一项所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中的目的分子被固定于固相上。
5.权利要求4所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中目的分子经被动吸附固定于固相上。
6.权利要求4所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中利用了该目的分子的特异抗体将它们固定于固相上。
7.权利要求3所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中利用细菌或至少一种选自金黄色葡萄球菌蛋白A、C组链球菌蛋白G以及能结合动物免疫球蛋白的任何其他细菌蛋白质将所述分子固定在固相上。
8.权利要求1至7任何一项所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中所述噬菌体在衣壳表面上展示病毒抗原、其部分或者能模拟它们在受检生物体液中存在的效果的寡肽。
9.权利要求1至7任何一项所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中所述噬菌体在衣壳表面上展示自身抗原、其部分或者能模拟它们在受检生物体液中存在的效果的寡肽。
10.权利要求1至7任何一项所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中所述噬菌体在衣壳表面上展示变应原、其部分或者能模拟它们在受检生物体液中存在的效果的寡肽。
11.权利要求1至7任何一项所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中所述噬菌体在衣壳表面上展示细胞膜受体、该受体的部分或者能模拟它们的生物学活性的寡肽。
12.权利要求1至7任何一项所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中所述噬菌体在衣壳表面上展示特异的细胞膜受体或由此衍生的肽。
13.权利要求1至7任何一项所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中所述噬菌体在衣壳表面上展示预计待测体液中存在其受体的氨基酸类配体。
14.权利要求1至7任何一项所述用于检测生物样品中目的分子存在情况的方法，其中所述噬菌体在衣壳表面上共同展示权利要求11、12、13、14、15和/或16所述分子。
15.用于检测生物样品中如上所描述、举例和要求保护的目的分子存在情况的方法。
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