DE69326685T2

DE69326685T2 - Amplifikation von test reporters durch nukleinsäure replikation

Info

Publication number: DE69326685T2
Application number: DE69326685T
Authority: DE
Inventors: David Collier; Richard Ebersole; Tina Hatfield; Edwin Hendrickson; John Moran
Original assignee: NEN Life Science Products Inc
Current assignee: Revvity Health Sciences Inc
Priority date: 1992-02-04
Filing date: 1993-02-04
Publication date: 2000-06-08
Anticipated expiration: 2013-02-05
Also published as: EP0625211B1; WO1993015229A2; WO1993015229A3; ATE185378T1; CA2129444A1; HK1003719A1; AU3618593A; DE69326685D1; EP0625211A1; JPH07505765A

Description

AMPLIFIKATION VON TESTREPORTERS DURCH NUKLEINSÄUREREPLIKATION

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur amplifizierten Detektion eines Analyten in Fluid, worin die Amplifikation durch Replizieren einer Target- bzw. Ziel- Nukleinsäure-Sequenz, welche in Antwort auf den Analyten immobilisiert wurde, erreicht wird.

Hintergrund der Erfindung

Die Einführung von Immunoassays bzw. Immuntests in den 60er und 70er Jahren erhöhte die Anzahl von Analyten, die für präzise und genaue Messungen zugänglich sind, drastisch. Radioimmunoassays (RIAs) und immunradiometrische Tests (IRMA) verwenden Radioisotope, welche entweder einen Antikörper oder ein konkurrenzierendes Antigen markieren, um einen Analyten zu messen. Detektionssysteme basierend auf Enzymen oder fluoreszierenden Markierungen wurden dann als eine Alternative zu isotopischen Detektionssystemen entwickelt. D. L. Bates, Trends in Biotechnology, 5(7), 204 (1987), beschreibt ein derartiges Verfahren basierend auf Enzymamplifikation. In diesem Verfahren wird ein zweites Enzymsystem an eine primäre Enzymmarkierung gebunden, beispielsweise kann das primäre Enzym katalytisch an ein zusätzliches System, wie einen Substratzyklus oder eine Enzymkaskade, gebunden werden. Die Enzymamplifikation resultiert aus der Kopplung von katalytischen Verfahren entweder durch direkte Mcdifikation oder durch Wechselwirkung mit dem Produkt des Kontrollenzyms.
Das US-Patent 4,668,621 beschreibt die Verwendung eines Enzymgebundenen Koagulierungstests (ELCA) in einem amplifizierten Immuntest unter Verwendung einer Gerinnungs- bzw. Clottingkaskade, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Das Verfahren umfaßt die Ausbildung von Clots bzw. Gerinnseln aufgrund der Thrombin-aktivierten Fibrinbildung aus löslichem Fibrinogen und markiertem, gelöstem Fibrinogen. Die Amplifizierung der Menge von berichtbaren bzw. angebbaren Liganden, die an feste Phase gebunden ist, wird nur durch Kombinieren der Verwendung von Gerinnungsfaktor-Konjugaten mit nachfolgenden Koagulierungskaskaden-Reaktionen erhalten.
Substrat/Cofaktor-Zyklisierung ist eine andere Variation der Enzym-mediatisierten Amplifikation und sie ist auf der Zyklisierung eines Cofaktors oder eines Substrats begründet, welche durch eine primäre Enzymmarkierung generiert ist. Das Produkt des primären Enzyms ist ein katalytischer Aktivator eines Amplifizierungszyklus, welcher im Verhältnis zu der Konzentration des Substrats und daher der Konzentration der Enzymmarkierung antwortet. Ein Beispiel dieses Typs eines Substratzyklisierungssystems ist in dem US-Patent 4,745,054 beschrieben.
Vary et al., Clin. Chem., 32, 1696 (1986) beschreibt ein Enzym-Amplifizierungsverfahren, das auf die Nukleinsäure- Detektion abgestimmt ist. Dieses Verfahren ist ein Strangverlagerungstest, welcher die einzigartige Fähigkeit eines Polynukleotids verwendet, um als eine Substratmarkierung, welche durch eine Phosphorylase freigesetzt werden kann, zu wirken.
Bobrow et al., J. of Immunol. Methods, 125, 279 (1989) offenbart ein Verfahren zum Verbessern der Detektion oder Quantifizierung eines Analyten durch katalysierte Reporterabscheidung. Die Amplifikation des Detektorsignals wird durch Aktivieren eines Konjugats, bestehend aus einem detektierbaren, markierten Substrat, welches für das Enzymsystem spezifisch ist, worin dieses Konjugat dann mit dem Analyt-abhängigen Enzymaktivierungssystem reagiert, um ein aktiviertes Konjugat zu bilden, welches sich abscheidet, wo immer der Rezeptor für das Konjugat immobilisiert ist, erreicht.
Nukleotidhybridisierungstests wurden als ein Mittel zur Detektion von spezifischen Nukleinsäuresequenzen entwickelt. Das US-Patent 4,882,269 offenbart einen amplifizierten Nukleinsäurehybridisierungstest, in welchem eine Ziel- Nukleinsäure mit einer komplementären, primären Probe, die ein polymeres Ende aufweist, kontaktiert wird. Eine Vielzahl von Sekundärsignal-bildenden Proben, die fähig sind, sich an das polymere Ende zu binden, werden zugesetzt, um eine amplifizierte Detektion der Ziel-Nukleinsäure zu erreichen. Änderungen dieser Methodologie sind in der PCT- Anmeldung WO 89/03891 und in der europäischen Patentanmeldung 204 510 geoffenbart, welche Hybridisierungstests, in welchen ein Amplifizierungs- oder mulitmere Oligonukleotide an eine einzelsträngige Nukleinsäureeinheit hybridisiert werden, welche an das angestrebte Ziel-Nukleinsäure- Segment gebunden wurden. Die Signalamplifizierung wird durch Hybridisierung von Signal-aussendenden Nukleinsäurebasen an diese Amplifizierungs- und multimeren Stränge erreicht. In all diesen Offenbarungen wird die Amplifizierung durch Mechanismen erreicht, welche zusätzliche Stellen für die Anlagerung bzw. Festlegung von Signal-aussendenden Proben immobilisieren.
Im Gegensatz dazu verwendet die vorliegende Erfindung ein vollständig unterschiedliches Konzept beim Erreichen der Signalamplifizierung. Als Antwort auf den Analyten wird eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz immobilisiert und repliziert unter Verwendung von Nukleinsäure-Replikationstechniken. Die Signalverstärkung wird durch Generieren und Detektieren von Replikaten der Zielsequenz erreicht.
US 4,994,368 offenbart einen Nukleinsäure-Hybridisierungstest, welcher die Detektion von Polynukleotidanalyten durch Herstellung von replizierten Kopien einer primären Polynukleotidsequenz durchführt. Die interessierende Zielsequenz wird zuerst eingeschränkt, um ein freies 3'OH-Ende zur Verfügung zu stellen, und dann an eine komplementäre Bindungssequenz, die an dem 3'-Ende von zwei oder mehr Schablonensequenzen in einem einzelsträngigen Muster-Polynukleotid angeordnet sind, hybridisiert. Die Kettenverlängerung wird an der Zielsequenz durchgeführt und dieses Verlängerungsprodukt wird dann in Fragmente gespalten bzw. geschnitten, welche nachfolgend mit einzelsträngigen Musternukleotid hybridisiert werden. Der Polymerisations-, Spaltungs-, Rehybridisierungs-, Polymerisierungszyklus wird wiederholt, bis eine detektierbare Anzahl von Kopien erreicht wurde. In einer analogen Art beschreibt die PCT- Anmeldung WO 90/0345 einen Nukleinsäure-Detektionstest, worin das Reportermolekül ein Addukt ist, umfassend 1) eine Oligonukleotid-Probensequenz, welche komplementär zu der angestrebten Stelle ist; 2) eine Primersequenz, die fähig ist, eine Primerextension zu initiieren; und 3) ein Sequenzsegment, welches komplementär zu der Primersequenz ist. Wenn es zuerst zu der Testnukleinsäureprobe zugesetzt wird, nimmt das Addukt eine Haarnadelstruktur an, welche den Primer inaktiv macht. Nach Hybridisierung des Addukts an eine Zielsequenz in der Probe wird das Addukt jedoch aktiviert und seine Primersequenz wird verfügbar, ein Primerextensionsprodukt zu initiieren. Diese Methode gemäß der Technik differiert von jener der Anmelder darin, daß die Technik signifikant unterschiedliche und beschwerliche Versuche zur Herstellung von mehrfachen Kopien einer detektierbaren Nukleinsäure anwendet. Auch sind diese Verfahren auf die Detektion von Nukleotidsequenzen beschränkt, wohingegen das Verfahren der Anmelder auf einen weiten Bereich von Analyten anwendbar ist.
Die Verwendung von RNA als einen Reporter für immunologische Tests wurde in der Literatur beschrieben. Die WO 87/06270 lehrt die Verwendung einer RNA, die fähig ist, autokatalytisch durch eine RNA-abhängige RNA-Polymerase als ein Reporter für das Testen von Biopolymeren durch Im-munotests oder durch Nukleinsäure-Probehybridisierung repliziert zu werden.
Analog beschreibt die WO 91/17442 verschiedene Protein/Nukleinsäurehybridproben, welche zum Amplifizieren des detektierbaren Signals in Immunotests verwendet werden können. Das Signal wird durch ein Verfahren, umfassend erstens das Immobilisieren eines antigenischen Analyten an einem festen Substrat, Binden des Analyten an eine Protein/Nukleinsäurehybridprobe, umfassend einen doppelsträngigen RNA-T7-Polymerasepromotor, der entweder wirksam an ein einzelsträngiges oder doppelsträngiges Nukleinsäuretemplate bzw. eine Nukleinsäureschablone gebunden ist, ein Entfernen von jeder nicht gebundenen Probe, Transkribieren bzw. Umschreiben von mehrfachen Kopien von RNA-Oligonmeren und Detektieren und Quantifizieren der Transkripte bzw. Umschreibungsprodukte, erreicht. Die Template- bzw. Matrizenreplikation liegt in der Größenordnung von 10¹ bis 10&sup4; Kopien pro Template.
Die obigen Verfahren sind zur Beschleunigung des Detektionsniveaus von Analyten durch Immonotestes verwendbar, jedoch leiden beide Verfahren an signifikanten Beschränkungen. Beispielsweise beziehen sich beide Verfahren auf die Verwendung von RNA-abhängigen Polymerasen für Nukleinsäure-Replikation, was inhärent eine geringere Amplifikation ergibt als andere Nukleinsäure-Amplifizierungsverfahren, wie Polymerase Chain Reaction (PCR) (Polymerase- Kettenreaktion) oder Ligase Chain Reaction (LCR) (Ligase- Kettenreaktion) Verfahren und resultiert nicht in einem molekular definierten Produkt. Es ist in der Technik gut bekannt, daß beispielsweise PCR eine Amplifikation in der Größenordnung von 10&sup6; bis 10¹&sup4; Kopien pro Ziel bzw. Target mit diskreter Länge ergibt. Weiters sind die obigen Verfahren nicht leicht auf die Detektion von mehr als einem Analyten in einer Probe adaptierbar.
Sano et al., Science, 258, 120, (2. Oktober 1992) beschreiben ein Antigen-Detektionssystem, das Immuno-PCR genannt wird, in welchem ein spezifisches DNA-Molekül als ein Reporter verwendet wird. Eine Streptavidin-Protein-A- Chimäre wurde verwendet, um eine biotinylisierte DNA an einen Antigen-monoklonalen Antikörperkomplex anzulagern, welcher in Vertiefungen von Mikrotiterplatten immobilisiert wurde. Ein Segment der komplexierten DNA wurde durch Polymerase Chain Reaction (Polymeraseketten-Reaktion) (PCR) amplifiziert und die PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese analysiert. Dieses Verfahren ist durch das Erfordernis von mehrfachen Reagenszusätzen und übertriebene Wascherfordernisse beschränkt.
Die WO-A 89/11546 offenbart ein Verfahren zur Detektion eines Gens, worin einer von zwei Primern an ein magnetisches Teilchen gebunden ist. Die zu amplifizierende Ziel- DNA wird mit dem Tröpfchen- bzw. Kügelchen-immobilisierten Primer und einem zweiten, freien Primer unter für die Amplifizierung geeigneten Bedingungen kontaktiert. Nach Amplifikation wird der immobilisierte Primer entfernt und die amplifizierte DNA wird detektiert. Die WO 89/11546 lehrt das Verfahren der Anmelder der Detektion von Analyten nicht und offenbart kein Verfahren zur simultanen Detektion einer Vielzahl von Messungen an einer einzigen Testprobe.
Die EP-A 0 544 212 offenbart ein Verfahren zur Detektion eines Analyten, worin der Analyt durch ein Aufnahme- bzw. Fängerreagens immobilisiert wird, mit einem Reporterrest, umfassend ein Ziel-DNA-Molekül, umgesetzt wird und durch Amplifikation der Ziel-DNA detektiert wird. Die EP-A 0 544 212 lehrt nicht, wie dieses Verfahren für ein gleichzeitiges zum Detektieren von mehrfachen Messungen in einer einzigen Testprobe verwendet werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Anmelder offenbaren ein empfindliches Verfahren für die simultane Detektion von mehreren Analyten durch Amplifizieren der detektierbaren Antwort eines Analyt-abhängigen Reportersystems. Die Amplifikation wird unter Verwendung von Nukleinsäure-Replikation von einzigen bzw. einzigartigen Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen, die unterschiedliche Längen aufweist, nachdem die Zielsequenz in Antwort auf die Anwesenheit eines Analyten immobilisiert wurde, erreicht.
Die Erfindung ist in den Ansprüchen beschrieben.
Die Erfindung wendet ein Verfahren einer amplifizierten Detektion für die Detektion und Quantifizierung von Analyten in einer fluiden Probe an. Das Verfahren umfaßt erstens das Immobilisieren von Analyten, um das auszubilden, was die Anmelder als ein "Analyt-abhängiges Reportersystem" (ADRS) bezeichnet haben. Das ADRS wird aus einer Ziel- Nukleinsäure-Sequenz, welche in Antwort auf die Anwesenheit eines Analyten in der Probe immobilisiert wurde, bestehen. Dann wird die immobilisierte Ziel-Nukleinsäure-Sequenz des ADRS mit einer Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung unter Bedingungen kontaktiert, worin die Zielsequenz repliziert werden kann, und die Replikation des Ziels bzw. Targets wird durchgeführt. Und schließlich werden die replizierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen detektiert, wodurch die Anwesenheit des Analyten bestimmt werden kann.
Das Verfahren der amplifizierten Detektion der Anmelder kann spezifisch ausgebildet sein, um in einer Anzahl von verschiedenen Wegen angewandt zu werden. Beispielsweise haben die Anmelder vier verschiedene Variationen des Verfahrens präsentiert (siehe Fig. 1, 2, 3 und 6).
In einer bevorzugten Ausbildung des Verfahrens der Anmelder sollen Referenz-Nukleinsäuresequenzen, welche unterschiedlich von den Zielsequenzen sind, mit dem ADRS in einem oder mehreren Schritten zusammengefaßt werden und gleichzeitig mit den Zielsequenzen unter den Versuchsbedingungen des Verfahrens repliziert werden. Diese Referenz-Sequenzen werden so designt, um Sequenzen zu generieren, welche detektierbar gesondert von den replizierten Zielsequenzen sind, und werden daher als Maß der internen Kontrolle für jede spezielle Testmethodologie dienen.
In einer anderen bevorzugten Ausbildung, welche in den Fig. 1 und 5 dargestellt ist, kann das Verfahren verwendet werden, um mehrere Analyten in einer Probe zu detektieren, indem die Länge des "variablen Segments" der Ziel-Nukleinsäure, die in dem Reporterkonjugat für jeden Analyten verwendet wird, verändert wird. Auf diese Weise können dieselben Primer für alle Replikationen innerhalb einer Probe verwendet werden und die Größentrennung der replizierten Nukleinsäure-Ziele wird eine geeignete Detektion von mehreren bzw. unterschiedlichen Analyten in einer Probe ermöglichen.
In noch einer anderen Ausbildung, welche in Fig. 6 gezeigt ist, wird eine geeignete Variation des Verfahrens geoffenbart, worin ein Liganden-Reporterkonjugat verwendet wird, um mit Probenanalyten um Verbindungsstellen auf dem Aufnahme- bzw. Fängerreagens zu konkurrenzieren. Zielsegmente der nicht gebundenen Liganden-Reporterkonjugate können dann repliziert werden, was die Gegenwart von Analyten in der Probe anzeigt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 beschreibt die "Direct Target Deposition Method" ("direktes Zielabscheidungsverfahren") zum Amplifizieren der Antwort eines Analyt-abhängigen Reportersystems.
Fig. 2 beschreibt die "Catalyzed Target Deposition Method" ("katalysiertes Zielabscheidungsverfahren") des Amplifizierens der Antwort eines Analyt-abhängigen Reportersystems.
Fig. 3 beschreibt die "Catalyzed Indirect Target Deposition Method" ("katalysiertes, indirektes Zielabscheidungsverfahren") eines Amplifizierens eines Analyt-abhängigen Reportersystems.
Fig. 4 beschreibt die Verwendung des "direkten Zielabscheidungsverfahrens", um mehr als einen Analyten pro Probe zu detektieren.
Fig. 5 beschreibt ein in der Länge variables Reporterkonjugat, welches zur Verwendung in dem "direkten Zielabscheidungsverfahren" designt ist, um mehr als einen Analyten pro Probe zu detektieren.
Fig. 6 beschreibt die "Competitive Binding Method" ("konkurrenzierendes Bindungsverfahren") des Amplifizierens eines Analyt-abhängigen Reportersystems.
Fig. 7 ist ein Foto eines elektrophoretischen Agarosegels, welches verwendet wird, um die replizierten Zielsequenzen in einem "direkten Zielabscheidungs"-Test der gegenwärtigen Erfindung zu trennen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Anmelder offenbaren ein empfindliches Verfahren zur Detektion von Analyten durch Amplifizieren der detektierbaren Antwort eines Analyt-abhängigen Reportersystems. Die Amplifizierung wird unter Verwendung einer Nukleinsäure- Replikation von Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen in Antwort auf die Anwesenheit von Analyten erreicht.
Das Verfahren zum Amplifizieren verwendet die Antwort eines Analyt-abhängigen Reporterkomplexes (ADRC). Der ADRC wird in Antwort auf den Analyten gebildet und enthält den gebundenen Analyten. Der ADRC kann direkt eine Ziel-Nukleinsäure immobilisieren oder kann mit anderen Reagentien reagieren, um schließlich in Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen zu resultieren, welche auf den Rezeptoren immobilisiert sind. Das resultierende Produkt ist ein Nukleinsäure-Replikationssystem, welches fähig ist, zahlreiche Kopien einer Ziel-Nukleinsäure-Sequenz auszubilden, wenn die geeigneten Replikationsreagentien zugesetzt werden. Das vollständige, immobilisierte Replikationssystem wurde von den Anmeldern als das Analyt-abhängige Reportersystem (ADRS) bezeichnet. Kopien der resultierenden, amplifizierten Nukleinsäuren aus dem ADRS können detektiert werden und stellen ein Mittel zur Verfügung, das für die Detektion und Messung von Analyten in Testfluiden verwendbar ist.
Der Ausdruck "Analyt" bezieht sich auf eine Substanz, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung detektiert oder getestet werden soll. Typische Analyten können Proteine, Peptide, Nukleinsäuresegmente, Moleküle, Zellen, Mikroorganismen und Fragmente und Produkte derselben oder jegliche Substanz, für welche Bindungsstellen, Anhaftungselemente oder Rezeptoren (wie Antikörper) entwickelt werden können, umfassen, jedoch sind sie nicht auf diese beschränkt.
Der Ausdruck "Analyt-abhängiges Reportersystem" (ADRS) bezieht sich auf ein immobilisiertes System, welches in Antwort auf die Gegenwart eines Analyten gebildet wird. Das System wird eine immobilisierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenz enthalten. Der Analyt wird nachfolgend durch Detektion von amplifizierten Kopien dieser Ziel-Nukleinsäure-Sequenz detektiert oder quantifiziert.
Der Ausdruck "Analyt-abhängiger Reporterkomplex" (ADRC) bezieht sich auf eine Komponente des obigen Systems. Der ADRC bezieht, sich auf ein immobilisiertes Analytaufnahme- bzw. - fängerreagens, einen Analyten und ein Reporterkonjugat.
Der Ausdruck "immobilisiertes Aufnahmereagens bzw. Fängerreagens" bezieht sich auf jegliche Substanz, die fähig ist, einen Analyten zu binden, wie einen Antikörper, Rezeptor, Lecithin, Nukleinsäure oder Bindungsprotein, welches durch Anlagerung an einen geeigneten Support immobilisiert wurde. In einigen Fällen kann das immobilisierte Aufnahmereagens auch einfach aus einer festen Trägermatrix bestehen, an welche ein Analyt sich ohne die Hilfe einer intermediären bzw. Zwischensubstanz binden kann.
Der Ausdruck "Reporterkonjugat" bezieht sich entweder auf: 1) ein Konjugat, umfassend eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz, die an ein Glied eines Bindungspaars, wie einen Antikörper, Lecithin, Rezeptor oder ein Bindungsprotein oder einem anderen Rest, welcher sich an Analyten binden kann (wie in Fig. 1), gekoppelt ist; oder alternativ 2) an ein Konjugat, umfassend ein Enzym, das an ein Glied eines Bindungspaars, wie einen Antikörper, Lecithin, Rezeptor oder ein Bindungsprotein (wie in Fig. 2 und 3), gekoppelt ist.
Der Ausdruck "Ziel-Nukleinsäure-Sequenz" oder "Zielsequenz" oder "Ziel" bzw. "Target" bezieht sich auf die Template- Nukleinsäure bzw. Matrizen-Nukleinsäure, worin der ADRS repliziert wird, um replizierte Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen zu bilden.
Der Ausdruck "Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, umfassend die Bestandteile, die für die Durchführung einer Nukleinsäure-Replikation erforderlich sind. Die Anmelder nehmen an, daß die Replikation durch jedes von zahlreichen, in dieser Technik bekannten Schemata durchgeführt werden kann, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf die Polymeraseketten-Reaktion (PCR) oder die Ligaseketten-Reaktion (LCR). Wenn die PCR- Methodologie gewählt wird, wird die Replikationszusammensetzung beispielsweise umfassen Nukleotidtriphosphate, zwei Primer mit geeigneten Sequenzen, DNA- oder RNA- Polymerase und Proteine. Diese Reagentien und Details, die Verfahren für ihre Verwendung beim Amplifizieren von Nukleinsäuren beschreiben, sind in den US-Patent 4,683,202 (1987, Mullis, et al.) und dem US-Patent 4,683,195 (1986, Mullis, et al.) zur Verfügung gestellt, welche hier als Bezug umfaßt sind. Wenn die LCR-Methodologie gewählt wird, dann wird die Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung beispielsweise umfassen eine thermostabile Ligase, z. B. T aquaticus Ligase, zwei Sätze von benachbarten Oligonukleotiden, worin ein Glied von jedem Satz komplementär zu jedem der Zielstränge ist, Tris-HCl-Puffer, KCl, EDTA, NAD, Dithiothreitol und Lachssperma-DNA. Siehe beispielsweise Tabor, S. und Richardson, C. C. (1985) Proc. Acad. Sci. USA 82, 1074-1078), welche hier als Bezugnahme umfaßt ist.
Der Ausdruck "replizierte Zielsequenz" bezieht sich auf Kopien der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz, die in dem Replikationsverfahren hergestellt wird.
Der Ausdruck "Nukleinsäure-Replikationssubstrat" bezieht sich auf ein Konjugat, umfassend eine Ziel-Nukleinsäure- Sequenz, die gegebenenfalls über einen Abstandhalter an einen Rest gebunden ist, der zur Aktivierung durch ein Enzym fähig ist.
Der Ausdruck "aktiviertes Nukleinsäure-Replikationszwischenprodukt" bezieht sich auf ein Produkt, welches aus der Reaktion des Nukleinsäure-Replikationssubstrats mit dem Enzym des ADRC erhalten wird.
Der Ausdruck "abgeschiedenes Nukleinsäure-Replikationsprodukt" bezieht sich auf das Produkt, das aus der Abscheidung des aktivierten Nukleinsäure-Replikationszwischenprodukts auf einem Rezeptor erhalten wird.
Der Ausdruck "Abscheidung" oder "Ablagerung" bedeutet gerichtete Bindung an einen immobilisierten Rezeptor. Eine derartige Abscheidung kann beispielsweise aus der Bildung einer kovalenten Bindung, direkten Bindung an eine feste Matrix oder aus einer spezifischen Bindungspaar-Wechselwirkung resultieren.
Der Ausdruck "Rezeptor" bedeutet jede Stelle, welche sich an ein aktiviertes Konjugat des ADRS entweder durch die Ausbildung einer kovalenten Bindung oder durch eine spezifische Bindungspaar-Wechselwirkung binden wird. Beispielsweise können in Schema II und III (siehe Fig. 1 und 2) die Rezeptoren für die aktivierten Konjugate von Schritt 2 an demselben Support, der das ADRC (wie dargestellt) immobilisiert, angeordnet sein; oder alternativ können die Rezeptoren für die aktivierten Konjugate von Schritt 2 an verschiedenen, unlöslichen Trägern angeordnet sein.
Der Audruck "Bindungssubstrat" bezieht sich auf ein Konjugat, umfassend ein erstes Glied einer Bindungspaarspezies, gegebenenfalls einen Abstandhalter, und einen Rest, der fähig ist, durch ein Enzym aktiviert zu werden.
Der Ausdruck "Bindungspaar" umfaßt jedes der Klasse Von Immuntyp-Bindungspaaren, wie Antigen/Antikörper oder Hapten/Antihapten-Systeme, und auch jedes aus der Klasse der Nicht-Immuntyp-Bindungspaare, wie Biotin/Avidin; Biotin/Streptavidin; Folsäure/Folatbindungsprotein; komplementäre Nukleinsäure-Segmente; Protein A oder G/Immunoglobuline; und Bindungspaare, welche kovalente Bindungen bilden, wie Sulfhydryl-reaktive Gruppen, umfassend Maleimide und Halo acetylderivate, und Amin-reaktive Gruppen, wie Isothiocyanate, Succinimidylester und Sulfonylhalogenide.
Der Ausdruck "aktivierte Bindungszwischenprodukte" bezieht sich auf das Produkt, welches aus der Reaktion des Bindungssubstrats mit dem Enzym des ADRC erhalten wird.
Der Ausdruck "abgeschiedenes Bindungsprodukt" bezieht sich auf ein aktiviertes Bindungszwischenprodukt, welches auf einem Rezeptor abgeschieden wurde.
Der Ausdruck "Nukleinsäure-Replikationskonjugat" bezieht sich auf ein Konjugat, umfassend ein zweites Glied einer Bindungspaarspezies, gegebenenfalls einen Spacer bzw. Abstandhalter, und eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz.
Der Ausdruck "Nukleinsäure-Replikationsbindungspaarkomplex" bezieht sich auf den Komplex, der zwischen dem abgeschiedenen Bindungsprodukt und dem Nukleinsäure-Replikationskonjugat ausgebildet ist.
Der Ausdruck "Replikationskontrolle" bezieht sich auf eine Mischung, umfassend eine Referenz-Nukleinsäuresequenz und einen verwandten Satz von Primern, welche designt wurden, um die Nukleinsäurereplikation der Referenz-Sequenz zu erleichtern.
Der Ausdruck "Referenz-Nukleinsäuresequenz" oder "Referenz- Sequenz" bezieht sich auf eine Template- bzw. Matrizennukleinsäure, welche von der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz unterschiedlich ist. Die Referenz-Sequenz kann in dem ADRS inkorporiert sein und zusätzlich repliziert werden, um als eine Testkontrolle zu dienen, welche die Quantifizierung verbessert.
Der Ausdruck "Referenz-Nukleinsäure-Konjugat" bezieht sich auf ein Konjugat, umfassend eine Referenz-Nukleinsäuresequenz, gegebenenfalls einen Spacer, und den Analyten oder das Analytäquivalent.
Der Ausdruck "Signal-generierende Nukleinsäuren" bezieht sich auf jede Nukleinsäure, welche mit einem Rest modifiziert oder markiert wurde, der zur Detektion über enzymatische Mittel oder Energieemission fähig ist; umfassend, jedoch nicht darauf beschränkt, fluoreszierende Reste, radioaktive Markierungen oder lichtemittierende Reste.
Der Ausdruck "Primer" bezieht sich auf eine Nukleinsäure- Sequenz, welche komplementär zu einem Bereich von wenigstens einem Strang der Ziel-Nukleinsäure ist und deren Zweck es ist, die Nukleinsäure-Replikation auf die Zielsequenz zu fördern und zu richten. Primer sind designt, um komplementär zu spezifischen Segmenten der Ziel- oder Referenz-Sequenzen zu sein, und können in Kombination mit einem anderen Primer verwendet werden, um so ein sogenanntes "Primer-Set" oder "Primerpaar" zu bilden. Erfordernisse für die Primergröße, Basensequenz, Komplementarität und Zielwechselwirkung sind in dem Abschnitt "Primer" der detaillierten Beschreibung der Erfindung beschrieben. Der Ausdruck "Primer" als solcher wird allgemein hier durch die Anmelder verwendet, um jedes Sequenz-bindende Oligonukleotid, welches zum Initiieren des Nukleinsäure-Replikationsprozesses dient, zu umfassen, derartige Replikationsprozesse können beispielsweise PCR, LCR oder andere enzymatische Reaktionen umfassen, welche eher einzelne als auch multiple Oligonukleotid-Initiatoren anwenden.
Die Phrase "replizierte Nukleinsäure-Sequenzen" oder "replizierte Sequenzen" bezieht sich auf die Nukleinsäure-Replikationsprodukte, welche innerhalb des ADRS-Testschemas produziert wurden, und wird in diesem Zusammenhang verwendet, um sowohl replizierte Zielsequenzen als auch replizierte Referenz-Sequenzen zu umfassen.
Der Ausdruck "Ligand" wird sich auf ein Glied eines Analytspezifischen Bindungspaars, wie ein Molekül, Protein, Peptid, Nukleinsäuresegment, therapeutischen Agentien, Polypeptid, Toxin, Nukleotid, Kohlenhydrat, Zelle, Mikroorganismus, Antikörper, Lecithin, Rezeptor, Bindungsprotein oder chemisches Agens, beziehen, das entweder ident mit oder strukturell zu einem Analyten verwandt ist und welches fähig ist, sich an das zweite Glied des Analyt-spezifischen Bindungspaars zu binden. Der Ligand kann strukturell modifiziert werden, um die chemische Anlagerung zu ermöglichen.
Der Ausdruck "Ligand-Reporterkonjugat" bezieht sich auf ein Konjugat, umfassend eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz, die an einen Liganden gekoppelt ist. Der Ligand kann entweder an dem 3'-Ende, dem 5'-Ende oder in jeder Position zwischen dem 3'- und dem 5'-Ende des Ziels gekoppelt sein. Zusätzlich ist der Ligand fähig, mit Probenanalyten um Analytenbindungsstellen auf einem immobilisierten Fängerreagens zu konkurrenzieren.
Der Ausdruck "immobilisierter Analytkomplex" bezieht sich auf einen Komplex, der zwischen einem Analyten und einem immobilisierten Aufnahmereagens gebildet ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur amplifiziertes Detektion für die simultane Detektion und Quantifizierung von mehreren Analyten in einer Probe zur Verfügung. Das Verfahren umfaßt in Schritt i) das Immobilisieren eines Analyten, um das auszubilden, was die Anmelder ein "Analytabhängiges Reportersystem" (ADRS) genannt haben. Das ADRS wird aus einer immobilisierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenz bestehen, die in Antwort auf die Anwesenheit eines Analyten in der Probe immobilisiert wurde. Danach wird in Schritt ii) die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz des ADRS mit einer Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung unter Bedingungen kontaktiert, worin die Zielsequenz repliziert werden kann. In Schritt iii) werden die Zielsequenzen repliziert. Jedes aus zahlreichen bekannten Verfahren der Replikation von Nukleinsäuren kann angewandt werden. Die Replikationszusammensetzung, welche zugesetzt wird, wird aus den für die Replikation für die Zielsequenz erforderlichen Reagentien bestehen. Und schließlich werden in Schritt iv) die replizierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen detektiert, wobei die Anwesenheit eines Analyten bestimmt werden kann. Die replizierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen können unter Verwendung von jedem aus einer Anzahl von gegenwärtig verfügbaren Reporterdetektionsschemata detektiert werden, wie der Größendifferenzierung, der Ligandenaufnahme, der radioaktiven Detektion, der Lumineszenzdetektion, der Fluorophoreszenzdetektion und jeder Kombination derselben, worin jedes dieser Detektionsschemata enzymatisch mediatisiert sein kann.
Das amplifizierte Detektionsverfahren der Anmelder kann spezifisch designt und in einer Anzahl von verschiedenen Wegen angewandt werden. Beispielsweise haben die Anmelder vier verschiedene Variationen des Verfahrens (siehe Fig. 1, 2, 3 und 6) präsentiert, welche sich in der Art unterscheiden, in welcher die Zielsequenz letztendlich in dem ADRS gebildet ist.
Zahlreiche Ziel-Nukleinsäure-Reagentien werden gleichzeitig innerhalb eines Tests für die Detektion von verschiedenen Analyten verwendet, oder um Testkontrollen zur Verfügung zu stellen. In einer bevorzugten Ausbildung des Verfahrens der Anmelder sollen Referenz-Nukleinsäure-Sequenzen, welche unterschiedlich von den Zielsequenzen sind, in dem ADRS in einem oder mehreren Schritten inkludiert werden und gleichzeitig mit der Zielsequenz unter den Testbedingungen dieses Verfahrens repliziert werden. Diese Referenz- Sequenzen sollen so designt sein, um Sequenzen zu bilden, welche gesondert von den replizierten Zielsequenzen detektierbar sind, und werden daher als Maß für die interne Kontrolle von jeder speziellen Testmethodologie dienen.
Zahlreiche Ziel-Nukleinsäure-Reagentien, die jeweils spezifisch für einen gesonderten Analyten sind, werden gemeinsam in demselben Testmillieu angewendet, um die simultane Detektion von zahlreichen Analyten zu erleichtern.
Jene der folgenden Ausbildungen, welche nur einen Analyten bestimmen, fallen nicht in den Rahmen der Erfindung.
Eine Ausbildung, welche das "direkte Zielabscheidungsverfahren" genannt ist, ist in Fig. 1 beschrieben.
In Schritt a dieser Ausbildung wird die Testprobe, enthaltend den Analyten (A) zuerst mit einem immobilisierten Aufnahmereagens (B), wie einem Antikörper, umgesetzt und dann mit einem Reporterkonjugat, umfassend eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz (C), um einen Analyt-abhängigen Reporterkomplex (ADRC) (D) zu bilden, aus welchem überschüssige Reagentien durch Waschen abgetrennt werden. In Schritt b wird der ADRC mit einer Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung kontaktiert und ein Replikationsverfahren wird durchgeführt, um replizierte Nukleinsäuren (E) auszubilden. In Schritt c werden die replizierten Nukleinsäuren detektiert. In dieser Ausbildung ist das Reporterkonjugat ein Konjugat, umfassend eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz, wie beispielsweise einen Antikörper oder ein anderes Analyt- Bindungsreagens.
Eine naheliegende Variation des Verfahrens, welche leicht durch einen Fachmann ausgeführt werden kann, ist eine Adaptierung, worin nach Schritt a jeder Überschuß an nichtimmobilisiertem Reporterkonjugat, welches frei in Lösung verbleibt, von dem immobilisierten Aufnahmereagens-Analytkomplex abgetrennt wird. Die Überschußmenge von nicht-immobilisiertem Reporterkonjugat, welche frei in der Analytprobe verbleibt, wird proportional zu der Menge an Analyt sein, die ursprünglich in der Probe vorhanden war. Dieses nicht-immobilisierte Reporterkonjugat könnte nach der Abtrennung von dem gebundenen Analytkomplex beispielsweise repliziert werden, während es frei in Lösung vorliegt und die replizierten Nukleinsäuren werden detektiert, wodurch die Anwesenheit von Analyt in der Probe bestimmt wird.
Eine andere Ausbildung, die das "katalytische Zielabscheidungsverfahren" genannt wird, ist in Fig. 2 gezeigt. In Schritt a dieser Ausbildung ist die Testprobe, enthaltend den Analyten (A), zuerst mit einem immobilisierten Aufnahmereagens (B), wie einem Antikörper, und dann mit einem Reporterkonjugat (C) umgesetzt, um einen Analyt-abhängigen Reporterkomplex (D) zu bilden, von welchem Überschußreagentien durch Waschen abgetrennt werden. In dieser Ausbildung besteht das Reporterkonjugat (C) aus einem Enzym, das fähig ist, einen Rest des Nukleinsäure-Replikationssubstrats (F) (wie Meerrettichperoxidase) und ein Glied eines Bindungspaars (wie einem Antikörper) zu aktivieren. In Schritt b wird der ADRC, der in Schritt a gebildet wurde, mit einem Nukleinsäure-Replikationssubstrat (F) umgesetzt, welches die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz enthält, um ein aktiviertes Nukleinsäure-Replikationszwischenprodukt (G) zu bilden, welches sich abscheidet, wo immer der Rezeptor für das aktivierte Nukleinsäure-Replikationszwischenprodukt immobilisiert ist, um ein abgeschiedenes Nukleinsäure-Replikationsprodukt (H) zu bilden. Überschußreagentien werden ausgewaschen. In Schritt c ist das abgeschiedene Nukleinsäure-Replikationsprodukt mit einer Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung kontaktiert, um replizierte Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen (E) zu bilden. In Schritt d werden die replizierten Nukleinsäuren detektiert.
Eine andere Ausbildung, die das "katalysierte, indirekte Zielabscheidungsverfahren" genannt wird, ist in Fig. 3 ge zeigt. In Schritt a dieser Ausbildung wird eine Testprobe, enthaltend den Analyten (A), zuerst mit einem immobilisierten Aufnahmereagens (B) (wie einem Antikörper) umgesetzt und dann mit einem Reporterkonjugat (C), um einen Analytabhängigen Reporterkomplex (D) zu bilden, aus welchem Überschußreagentien durch Waschen abgetrennt werden. In dieser Ausbildung besteht das Reporterkonjugat (C) aus einem Enzym (wie Meerrettichperoxidase), welches fähig ist, einen Rest auf dem Bindungssubstrats (I) zu aktivieren. (I), das Bindungssubstrat, ist ein Konjugat, bestehend aus diesem Substrat und einem Glied eines Bindungspaars. In Schritt b wird der ADRC mit dem Bindungssubstrat (I) umgesetzt, um ein aktiviertes Bindungszwischenprodukt (J) zu bilden, welches sich abscheidet, wo immer der Rezeptor für das aktivierte Bindungszwischenprodukt immobilisiert ist, um ein abgescheidenes Bindungsprodukt (K) zu bilden. Überschußreagentien werden dann ausgewaschen. In Schritt c wird das abgeschiedene Bindungsprodukt mit einem Nukleinsäure- Replikationskonjugat (L), welches die Ziel-Nukleinsäure- Sequenz und das zweite Glied des Bindungspaars enthält, umgesetzt, um einen Nukleinsäure-Replikationsbindungspaarkomplex (M) zu bilden. Überschußreagentien werden dann ausgewaschen. In Schritt d ist der Nukleinsäure-Replikationsbindungspaarkomplex mit einer Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung kontaktiert, um replizierte Ziel- Nukleinsäure-Sequenzen (E) zu bilden. In Schritt e werden diese Nukleinsäuren detektiert.
Die Erfindung ist in Fig. 4 dargestellt. Das Ziel dieser Ausbildung ist es, ein Verfahren zum Detektieren von vielen verschiedenen Analyten in einer einzigen Probe zur Verfü gung zu stellen, und es kann auch als das "Multianalyt- Verfahren" bezeichnet werden.
In Fig. 4 wird in Schritt a die Testprobe, enthaltend verschiedene Analyten (A und A'), zuerst mit den immobilisierten Aufnahme- bzw. Fängerreagentien (B und B') und dann mit den Reporterkonjugaten (C und C') umgesetzt, welche jeweils eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz enthalten, um die Analyt-abhängigen Reporterkomplexe (D und D') zu bilden, aus welchen Überschußreagentien durch Waschen abgetrennt werden. In Schritt b werden die ADRC mit einer Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung umgesetzt und ein Replikationsverfahren wird durchgeführt, um replizierte Nukleinsäuren (E und E') zu bilden. In Schritt c werden die replizierten Nukleinsäuren detektiert. In dieser Ausbildung liegt mehr als ein Reporterkonjugat vor, welche jeweils einen Analyt-spezifischen Antikörper oder ein anderes Analytbindungsreagens aufweisen, das an eine Ziel- Nukleinsäure-Sequenz gebunden ist. Die Ziel-Nukleinsäure- Sequenz für jeden Typ von Reporterkonjugat hat eine spezifische Länge, welche unterschiedlich in der Länge von dem Ziel von jedem anderen Reporterkonjugat ist. Die Replikation der Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen ergibt so Amplifikationsprodukte mit unterschiedlichen Längen und die Anwesenheit von verschiedenen Analyten kann geeignet durch Analyse der Amplifikationsprodukte auf Basis der Größe, wie in einer Gelelektrophorese detektiert werden. In einer speziell bevorzugten Ausbildung werden die Ziel-Nukleinsäure- Sequenzen, welche in der Länge differieren, designt, um dieselben 5'- und 3'-Primerbindungsbereiche zu umfassen, sodaß dieselben Primer verwendet werden können, um alle verschiedenen Ziele, die in der Probe vorhanden sind, zu replizieren. In einer anderen bevorzugten Ausbildung der Multianalyt-Detektion, welche für die Detektion einer Vielzahl von Sequenzen in Probenukleinsäuren verwendbar ist (der "Multigentest"), werden die Reporterkonjugate aus Zielsequenzen bestehen, welche an andere Nukleinsäure-Sequenzen gekoppelt wurde, welche komplementär zu spezifischen Nukleinsäuren sind, die in der Probe vorhanden sein können. Die komplementären Sequenzen werden zu Sequenzen hybridisiert, die in den Probenukleinsäuren vorhanden sind, wodurch die Reporterkonjugate immobilisiert werden. Zielsegmente der Reporterkonjugate werden dann repliziert, was die Anwesenheit der spezifischen Probesequenzen anzeigt.
Eine zusätzliche Ausbildung, die das "kompetitive bzw. konkurrenzierende Bindungsverfahren" genannt wird, ist in Fig. 6 gezeigt.
In Fig. 6 wird in Schritt a dieser Ausbildung die Testprobe, enthaltend den Analyten (A) zuerst mit einem immobilisierten Aufnahmereagens (B), wie einem Antikörper, umgesetzt und dann mit einem Liganden-Reporterkonjugat (Q), umfassend eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz, die an einen Liganden gebunden ist, worin der Ligand fähig ist, mit dem Analyten (A) um Bindungsstellen an dem immobilisierten Aufnahmereagens (B) zu konkurrieren. Die Reaktion resultiert in der Ausbildung eines immobilisierten Analytkomplexes (N), welcher das Liganden-Reporterkonjugat (Q) ungebunden zurückläßt. Das Liganden-Reporterkonjugat (Q) und der immobilisierte Analytkomplex (N) werden dann durch Waschen abgetrennt. In Schritt b kann entweder der immobilisierte Analytkomplex (N) oder das Liganden-Reporterkonjugat mit einer Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung kontaktiert werden. In dem Fall, wo das Liganden-Reporterkonjugat (Q) kontaktiert wird, tritt die Nukleinsäure-Replikation auf und die Anwesenheit von Analyt wird detektiert. In dem Fall, wo der immobilisierte Analytkomplex (N) kontaktiert wird, tritt keine Replikation auf und keine replizierten Nukleinsäuren (E) werden hergestellt. In dieser Ausbildung ist das Liganden-Reporterkonjugat ein Konjugat, umfassend eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz und beispielsweise ein Antigen oder ein anderes Bindungsreagens, welches fähig ist, mit dem Analyten um Bindungsstellen an dem Aufnahmereagens zu konkurrieren.
Zusätzlich wird ein Fachmann erkennen, daß die obigen zahlreichen Ausbildungen durchgeführt werden können, indem alternative Immobilisierungspunkte während des Versuchs ausgeführt werden. Beispielsweise könnte in Fig. 6 das Liganden-Reporterkonjugat immobilisiert werden und das Aufnahmereagens könnte frei in Lösung verbleiben.
Daher wird in allen obigen Ausbildungen die Herstellung von replizierten Nukleinsäuren aus einer Ziel-Nukleinsäure- Sequenz verwendet, um die Detektion des Analyten zu amplifizieren.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um die Anwesenheit einer großen Vielzahl von Analyten zu detektieren. Allgemein umfassen diese, jedoch sind sie nicht darauf beschränkt, Pflanzen, Tiere, Nukleinsäure- Segmente, Moleküle, Zellen, Mikroorganismen und Fragmente und Produkte derselben oder jede Substanz, für welche Bindungsstellen, Bindungselemente oder Rezeptoren (wie Antikörper) entwickelt werden können. Von speziellem Interesse sind Pathogene, Viren und Bakterien. Es ist beabsichtigt, daß das Probenmaterial eine Flüssigkeit, ein Gas oder ein Feststoff, der darin gelöst wird, aus diesem extrahiert wird oder in einem Testfluid suspendiert wird, ist. Das Probenmaterial wird höchstwahrscheinlich von medizinischer, veterinärer, Umweltschutz-, Ernährungs- oder industrieller Bedeutung sein. Obwohl dies kein Versuch zur Einschränkung ist, ist beabsichtigt, daß Proben für menschliche, tierische oder mikrobiologische Quellen oder Habitate durch das vorliegende Verfahren getestet werden können, umfassend Körperfluide, wie Urin, Blut, Serum, Plasma, Milch, Sputum, Fäkalien, Lungenaspirate, Exudate, mikrobielle Kulturfluide, Aerosole; Getreidematerialen; Böden und Grundwässer.
Das immobilisierte Aufnahmereagens, welches den Testanalyt bindet, wird allgemein bestehen aus beispielsweise einem Bindungsprotein, Lecithin, Nukleinsäure oder einem Antikörper, der an einen geeigneten Support bzw. Träger gebunden ist. Jeder bekannte Antikörper könnte als der Antikörper des immobilisierten Aufnahmereagens dienen. Zusätzlich können spezifische Antikörper hergestellt und in diesem Verfahren verwendet werden. In bestimmten Fällen kann der Analyt direkt durch nicht-spezifische Wechselwirkung mit dem Support aufgenommen werden, wie beispielsweise in hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Polystyrol.
Geeignete Immobilisierungssupporte, die in dem ADRC verwendet werden können, Rezeptorträger und Affinitätsträger (um die replizierten Nukleinsäuren aufzunehmen), umfassen synthetische Polymerträger, wie Polystyrol, Polypropylen, Polyglycidylmethacrylat, Polystyrol, substituiertes Polystyrol (z. B. aminiertes oder carboxyliertes Polystyrol; Polyacrylamide; Polyamide; Polyvinylchloride; etc.); Glaskügelchen; Agarose; oder Nitrozellulose, etc. Diese Materialien können als Filme, Vertiefungen, Kügelchen, Teilchen, Stifte, Stöpsel oder Membranen verwendet werden. Alternativ könnten die Supporte magnetische und nichtmagnetische Teilchen umfassen.
Diese Träger können verwendet werden, um verschiedene immobilisierte Reagentien herzustellen. Beispielsweise in Abhängigkeit von dem Zugang und der Reagenskonfiguration könnten gesonderte immobilisierte Trägerreagentien zum Binden des ADRC, zum Binden des aktivierten Konjugatrezeptors oder zur Aufnahme der Produkte der Nukleinsäure-Replikation während dem Detektionsschritt hergestellt werden. Alternativ könnten unter bestimmten Umständen, in welchen der Analyt, Rezeptor und die Produktbindungsaktivitäten mit den anderen Bindungsfunktionen nicht konkurrieren oder wechselwirken, der Analyt, das Konjugat und die Produktbindungsreagentien auf demselben Träger koimmobilisiert werden. Auf diese Weise könnten der ADRC und der Rezeptorsupport bzw. -träger hergestellt und als gesonderte Supporte verwendet werden oder die Bindungsreagentien könnten auf demselben Träger kombiniert werden. Analytbindungsmoleküle und Rezeptoren können auf dem festen Träger unter Verwendung von den Fachleuten gut bekannten Techniken immobilisiert werden. H. Weetall, Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides, (1975) Marcell Dekker, Inc., New York.
Typischerweise kann das immobilisierte Aufnahmereagens aus Glycidylmethacrylatkügelchen von etwa 30 um Durchmesser und einem Antikörper, wie z. B. Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG- Antikörper bestehen. Testkügelchen und Antikörper werden bei 4ºC inkubiert, gefolgt von einem Waschen, um überschüssigen Antikörper zu entfernen. Die Kügelchen werden dann mit Rinderserumalbumin behandelt, um nicht-reagierte Epoxidgruppen zu binden, und in Puffer resuspensiert.
Beim Ausführen der vorliegenden Erfindung wurden zwei unterschiedliche Arten von Reporterkonjugaten von den Anmeldern in Betracht gezogen. Der erste Typ besteht aus einer Ziel-Nukleinsäure-Sequenz, die an einen Antikörper oder ein anderes Bindungsglied, welches einen Analyt erkennt, gekoppelt ist. Diese können unter Verwendung von Abwandlungen von Verfahren, die den Fachleuten zum Binden von Proteinen an Aminooligonukleotide bekannt sind, hergestellt werden. Beispielsweise kann dies unter Verwendung von enzymatischen Teilungs- bzw. Schneideverfahren durchgeführt werden, in welchen ein Amino-modifiziertes dNTP an das 3'-Ende der Nukleinsäure addiert wird. A. Kumar, Anal. Biochem., 169, 376 (1988). Alternativ können Amino-modifizierte Basen synthetisch in die Nukleinsäure-Basissequenz eingebaut werden. P. Li, et al., Nucleic Acids Res., 15, 5275 (1987). Antikörper können dann an die Aminosäure-modifizierten Nukleinsäuren durch Substituieren eines Antikörpers für ein Enzym in dem Verfahren von Urdea, M. S. Urdea, Nucleic Acids Res., 16, 4937 (1988), gebunden werden.
Spezifischer umfaßt die bevorzugte Herstellung von Nukleinsäure/Antikörper-Konjugaten das Koppeln von hetero-bifunktionellen Quervernetzern an die DNA-Oligonukleotid- Ziele, welche wiederum an Antikörper gebunden werden unter Verwendung der von Tseng et al. in USSn 07/946247 beschriebenen Technik. Ein Schlüsselvorteil dieser Verbindungschemie über Standardprotokolle in der Technik ist jener, daß sie das Auftreten von unerwünschten Reaktionen, wie Homo-DNA oder Homo-Antikörperpolymeren reduziert.
Um die chemische Anlagerung von Oligonukleotiden an die Antikörper zu vereinfachen, werden die Oligonukleotide Amino-modifiziert, indem eine primäre Aminogruppe an ihr 5'-Ende während der Synthese unter Verwendung von Cyanoethylphosphoramidit-Chemie eingeführt wird. Die Amino-modifizierten Oligonukleotide werden weiter durch ein heterobifunktionelles Reagens modifiziert, welches Sulfhydrylgruppen einführt. Das Reagens N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA) ist ein heterobifunktionelles Quervernetzungsagens, welches die reaktive Gruppe des primären Amins, N-Hydrxoylsuccinimid (NHS), verwendet, um an die Amino-modifizierten Oligonukleotide zu koppeln, wodurch eine Acetyl-geschützte Sulfhydrylgruppe eingeführt wird. Die Antikörper werden mit einem anderen NHS-Quervernetzungsagens, Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) modifiziert. Das SMCC reagiert mit primären Aminogruppen in den Peptiden (z. B. den &epsi;- Gruppen an Lysin) des Antikörpers, indem eine Maleimidgruppe (eine freie, Sulfhydryl-reaktive Gruppe) an den Antikörper eingeführt wird. Die Maleimid-modifizierten Antikörper werden mit den SATA-modifizierten Antikörpern vermischt. Die Acetyl-geschützten Sulfhydrylgruppen an den SATA-modifizierten Oligonukleotiden werden durch den Zusatz von Hydroxylamin aktiviert, um reaktive, freie Sulfhydrylgruppen zu bilden (US-A 5,324,650). Die freies Sulfhydryl enthaltenden Oligonukleotide reagieren unmittelbar mit Maleimid-modifizierten Antikörpern bildender DNA zu Antikörper-Konjugaten.
Der zweite Konjugattyp umfaßt ein Enzym, das an einen Antikörper oder ein anderes Glied eines Bindungspaars gebunden ist. Diese können ebenfalls unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Verfahren hergestellt werden. D. G. Williams, J. Immun. Methods, 79, 261 (1984). Alternativ können Enzymbindungskonjugate unter Verwendung von rekombinanter DNA und genetischen Verfahrenstechniken gebildet werden. I. Pastan und D. Fitzgerald, Science, 254, 1173 (1991). Enzyme, die zur Verwendung in einem Reporterkonjugat geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Hydrolasen, Lyasen, Oxidoreduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen. Andere sind Peroxidase, Glukoseoxidase, Phosphatase, Esterase und Glykosidase. Spezifische Beispiele umfassen alkalische Phosphatase, Lipasen, β-Galaktosidase, Meerrettichperoxidase und Schweineleber-Esterase. Die Auswahl des Reporterkonjugats hängt davon ab, welche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in der Praxis verwendet wird.

Ziel-Nukleinsäure:

Logarithmische Nukleinsäure-Replikationstechnologie (beispielsweise die Polymeraseketten-Reaktion (PCR) oder die Ligaseketten-Reaktion (LCR)) stellen hochsensible Mittel zum Amplifizieren von Kopien einer spezifischen Nukleinsäure-Sequenz zur Verfügung. Diese Technologien bieten zwei sehr bedeutsame Fähigkeiten an. Eine ist die Spezifität des Replikationsverfahrens, die Information einer einzigen Sequenz kann in der Anwesenheit von Proben, enthaltend komplexe Mischungen von Nukleinsäuren und hohe Konzentrationen von Proteinen, spezifisch repliziert werden. Die zweite ist die hohe Empfindlichkeit, die durch das Verfahren geboten wird. Replikationen der Ziel-DNA in der Größenordnung von > 10&sup6;-fach können durch ein Temperaturrezyklierungsverfahren erreicht werden. Gegenwärtig können Pathogene in Mischungen von unbekannten Proben durch Sequenzproben detektiert werden, jedoch erreicht die Empfindlichkeit nur etwa 10³ Zellen/ml. Logarithmische Sequenzreplikation der Ziel-DNA hat nun die Probentestempfindlichkeit stark erhöht, was es ermöglicht, so wenige wie 1 bis 5 Zellen pro 100 ml zu detektieren. A. K. Bej et al., App. Environ. Microbiol., 56, 307 (1990).
Wie oben festgehalten, wird die Ziel-Nukleinsäure repliziert, um amplifizierte Kopien der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz herzustellen. Das Design der Zielsequenz ist wichtig, da die Replikation (einen) geeignete(n), komplementäre(n) Primer erfordert; und auch da das Ziel verschiedene Mittel der Detektion und der Flexibilität bei den Reaktionsbedingungen zur Verfügung stellen kann.
Spezifisch kann die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz in der Länge von 20 bis 5000 Basen variieren. Vorzugsweise, wenn das Ziel bzw. Target für die PCR-Amplifikation zu verwenden ist, wird sie zwischen 30 und 3000 Basen aufweisen. Wenn das Ziel für die LCR-Amplifikation verwendet wird, wird die Ziellänge in dem Bereich zwischen 100 und 500 Basen rangieren. Das Ziel kann doppelsträngig (ds) sein, umfassend ein Hybridduplex von zwei komplementären Nukleinsäure- Strängen, oder kann alternativ einzelsträngig (ss) sein. Doppelsträngige Ziele erfordern die Herstellung eines komplementären Strangs zur Teilnahme an der logarithmischen Kettenpolymerisierung nicht. Einer oder beide Stränge können modifizierten Basen tragen, die für das Verbinden oder die Detektion verwendet werden. Wenn nur ein Strang des Targets an den Träger gebunden wird, wird der komplementäre Strang frei, um sich mit Primern in der Lösungsphase zu verbinden bzw. anzulagern. Sobald sie von der Support- bzw. Trägermatrix entfernt sind, ist die Strangreplikation nicht gehindert. Doppelsträngige Ziele werden so insbesondere für immobilisierte Ziele bzw. Targets verwendbar, da Hitzedenaturierung einen Strang freisetzen wird, welcher von dem Träger für die Replikation befreit wird.
Einzelstränge von doppelsträngigen Zielen können jedoch auch verwendet werden, wenn Konjugatreagentien hergestellt werden. Beispielsweise, wie dies unten gezeigt wird, wird nur ein Strang des Ziels während des ersten Amplifikationszyklus verwendet. Das Verschmelzen und Verlängern des Primers #1 kann dann das einzelsträngige Ziel in ein doppelsträngiges Duplex umwandeln. Indem sie gemeinsam in nachfolgenden Zyklen wirken, werden die Primer #1 und #2 zu logarithmischer Replikation der neu synthetisierten, doppelsträngigen Ziel-Nukleinsäure führen. Einzelsträngige Ziele bieten einige Reagensherstellungsvorteile dahingehend, daß sie 1) billiger sind, da nur ein Strang hergestellt werden muß, und 2), daß kein vorzeitiges Verschmelzen mit dem komplementären Strang erforderlich ist. Dieselben Primer können für die Amplifizierung von geeignet ausgebildeten ss- oder ds-Zielen verwendet werden.
In einer bevorzugten Vereinfachung der Erfindung der Anmelder kann die logarithmische Replikation unter Verwendung eines einzelsträngigen Ziels und eines einzigen Primers erreicht werden. Dies wird durch Designen der Targetsequenz erreicht, dass sie eine Primerbindungssequenz an einem Ende des ss-Ziels, und eine Komplementsequenz zur Primerbindungsstelle an dem entgegengesetzten Ende des Zielstrangs enthält. Das Verschmelzen und die Extension des Primers wird in der Ausbildung eines komplementären Zielstrangs, enthaltend die identen Primerbindungsstellen resultieren. Auf diese Weise werden sowohl der (+) und der (- Strang des resultierenden ds-Ziels eine idente Primerstelle an den entgegengesetzten Enden des Targetduplex enthalten und derselbe Primer, in Kombination mit der Polymerase und der Ziel-Nukleinsäure verwendet, promotet die Replikation von sowohl + als auch - Targetsträngen.
Der Einzelprimerzugang bietet Vorteile bei reduzierter Testkomplexität und erhöhter Reproduzierbarkeit. Eine Vereinfachung wird erreicht, da nur ein Primer für die Detektion hergestellt und zur Verfügung gestellt werden muß. Bedeutender kann der Einzelprimer die Produktivität des Nukleinsäure-Replikationsverfahrens beschleunigen, da jeder Primer exakt dieselbe Schmelztemperatur (Tm) aufweist. Temperaturrezyklierungs-Beschränkungen sind so leichter zu steuern. Weiters ist die Wahrscheinlichkeit einer nichtspezifischen Nukleinsäure-Bildung, die aus der Primer- Dimerreplikation resultiert, reduziert.
In anderen bevorzugten Ausbildungen kann die Basenzusammensetzung und Sequenz der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz variiert werden, um unterschiedliche Testerfordernisse zu erfüllen.
Beispielsweise kann das Ziel Sequenzsegmente enthalten, welche nicht während der Replikation amplifiziert werden, oder es können variable Bereiche verwendet werden, um die Länge der Zielsequenz zu verändern. Es ist beispielsweise beabsichtigt, daß eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz ausgebildet werden kann, um eine Kopplungsbindung für die Anlagerung eines Antikörpers oder eines Liganden an dem 5'- Ende und eine Primer-Bindungsstelle an dem 3'-Ende mit einem variablen, dazwischen eingesetzen Bereich, zu enthalten. Der variable Bereich könnte jede Länge oder Zusammensetzung aufweisen, die nur durch die Erfordernisse des Ziel-Amplifizierungsverfahrens beschränkt ist. Dies ist in Fig. 5 gezeigt, welche ein Beispiel eines Reporterkonjugats zur Verfügung stellt, worin die Ziel-Nukleinsäure an einen Antikörper durch eine chemische Kopplungsbindung an dem 5'-Ende konjugiert wurde. Das Ziel-Oligonukleotid kann einen 5'-Bindungsbereich komplementär zu einem der Replikationsprimer enthalten und eine 3'-Stelle für das Binden des anderen replizierten Primers. Innerhalb der Zielsequenz besteht ein variabler Bereich von Nukleinsäure-Basen, welcher variabel in der Länge oder der Sequenz sein könnte, wodurch alternative Mittel der Detektion der replizierten Ziele basierend auf der Größe oder anderen Faktoren, wie der Bindungsfähigkeit oder der Fähigkeit, unterscheidende Signale auszusenden (wie Fluoreszenz, Radioaktivität, etc.), zur Verfügung gestellt werden.
Eine andere bevorzugte Ausbildung zur Multianalyt-Detektion ist in Fig. 4 gezeigt, worin Ziel-Nukleinsäuren, welche in der Länge variieren, zum Detektieren verschiedener Analyten verwendet werden. Beispielsweise könnte eine Serie von Nukleinsäure-Zielen, die dieselben Primerbindungsstellen und dieselbe Sequenz aufweisen, jedoch nur in der Länge des inneren Zielbereichs differieren, hergestellt werden und an unterschiedliche Bindungspaare gekoppelt werden, welche fähig sind, sich an die unterschiedlichen Analyten zu binden (wie Analyt-spezifische Antikörper, Lecithine, Rezeptoren, etc.). Die Replikationsprodukte von jedem dieser Rezeptorkonjugate können dann leicht auf der Basis der Größe unterschieden werden und entsprechend sichtbar gemacht werden, beispielsweise durch Gelelektrophorese. In einem "Multigentest", wo die zu detektierenden Analyten spezifische Sequenzen von RNA oder DNA, die in den Probenukleinsäuren enthalten sind, sind, bestehen die Reporterkonjugate aus Zielen mit variierenden Längen, die an Nukleinsäure-Sequenzen gekoppelt sind, welche komplementär zu spezifischen Bereichen der Probenukleinsäure sind. Auf diese Weise können zahlreiche Gene oder Sequenzstellen in einer Probe geeignet in einem Test gescreent werden. Die hohe Auflösungsfähigkeit der Nukleinsäure-Trennung, worin Sequenzen, welche in der Länge durch nur eine Base unterschiedlich sind, aufgelöst werden können, macht dieses Verfahren extrem attraktiv, wenn große Anzahlen von Proben, enthaltend mehrere Analyten, zu screenen sind.
Zusätzlich kann die Zielsequenz designt werden, um die Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren, welche fähig sind, detektierbare Signale zu emittieren, zu erleichtern. Beispielsweise kann die Zielsequenz zur Inkorporierung von markierten Primern oder markierten Basen (z. B. Fluoreszenz, radioaktiv, Licht emittierend) zur Verfügung gestellt werden, um die entsprechend markierten, Signal-bildenden Nukleinsäuren herzustellen. Der Typ, die Anzahl der markierten Basen und die Position innerhalb einer Kette und zwischen den komplementären Ketten kann designt werden, um die Signaldetektion zu erleichtern. In einer bevorzugten Ausbildung ist es gewünscht, spezifisch markierte Basen in der Sequenz so zu positionieren, um den Energietransfer zwischen Fluorophoren zu ermöglichen oder um das Enzym- Kanalisieren bzw. -Channeling zwischen benachbart positionierten, gekoppelten Enzymen zu ermöglichen.
Spezifisch kann der Energietransfer zwischen geeignet markierten Basen erreicht werden, wenn der Abstand zwischen dem anregenden Fluorophor (F1) und dem Emissionsfluorphor (F2) innerhalb von zwölf Basen (ca. 50 Å) in der helix-förmigen, Duplexanordnung liegt. R. A. Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790 (1988). Ein bevorzugterer Abstand liegt zwischen 5 und 12 Basen. Dies kann erreicht werden, indem das Ziel und die Primersequenzen so designt sind, daß eine der markierten Basen (F1 und F2) alternierend in die Signalnukleinsäure bei jeder Drehung der Helix inkorporiert ist. Alternativ kann die Basensequenz des Ziels oder der Primer so designt sein, daß F1 und F2 in gegenüberliegenden Strängen der Signalnukleinsäure inkorporiert sind. Die Position der markierten Basen ist so gesteuert, daß bei der Stranghybridisierung F1 und F2 innerhalb des Duplex in einem Abstand von < 50 Å angeordnet sind. Bevorzugter werden F1 und F2 an derselben Seite des Duplex eine Drehung beabstandet positioniert. So können in der Signalnukleinsäure sowohl Interketten- als auch Intraketten-markierte Basen die Fluorophore in einem geeigneten Abstand für den Energietransfer positionieren.
Die Erfordernisse für Fluorophore, welche an dem Energietransfer teilnehmen, sind gut dokumentiert. L. E. Morrison, Anal. Biochem., 174, 101 (1988). Um einen Energietransfer zu erreichen, ist es allgemein auch bedeutend, die geeignete Kombination von Fluorophoren, die für das Markieren der Anregungs- (F1) und der Emissions- (F2) -Basen verwendet werden, auszuwählen, sodaß das Emissionsspektrum des Anregungs-Fluorphors (F1) mit dem Adsorptions- oder Anregungsspektrum des Emissionsfluorophors (F2) überlagert. Beispielsweise umfassen die folgenden Fluorophor- Kombinationen üblicherweise erhältliche, geeignete Kandidaten für den Energietransfer:

Anregungsfluorophor (F1) Emissionsfluorophor (F2)

Pyrenbutyrat β-Phycoerythrin
Fluorescein Texas Rot
Luzifer Gelb Rhodamin
Luzifer Gelb Texas Rot
Fluorescein Rhodamin
Fluorescamin Fluorescein
In einer anderen bevorzugten Ausbildung können die Sequenzen des Ziels und der Primer designt sein, um Basen, die mit dem ersten Glied eines Bindungspaars (z. B. Digoxigenin, Biotin) markiert sind, zu inkorporieren. Diese inkorporierten, markierten Basen können verwendet werden, um entweder die resultierenden Nukleinsäuren zu immobilisieren oder diese mit einem zweiten Glied des Bindungspaars, welches mit einem Reporter markiert ist (z. B. Streptavidinalkalische Phosphatase, Antidigoxigenin-alkalische Phosphatase) zu komplexieren. Es ist beabsichtigt, daß die Zielsequenz designt werden kann, um die Inkorporierung von unterschiedlichen Basen oder Primern, eine(r) oder mehrere markiert mit Bindungsgliedern (z. B. Biotin); eine oder mehrere markiert mit (einem) Reporter(n) zu ermöglichen. Es ist wünschenswert, die Sequenz so zu kontrollieren, daß die Biotin-markierten Basen vorherrschend an einem Ende einer Kette inkorporiert werden und die Reporterbasen an dem anderen Ende oder in einigem Abstand von den Bindungsgliedern inkorporiert werden. Nichtsdestotrotz ist es beim Design der Basissequenz bedeutend, sowohl aufeinanderfolgende Läufe von C's und G's (drei oder mehr) an den 3'-Enden ebenso wie mit palindromischen Sequenzen zu vermeiden. Beispielsweise könnte eine Zielgensequenz die folgende Sequenz enthalten:
Die Nukleinsäure-Replikationssubstrate bestehen aus einer Ziel-Nukleotid-Sequenz umfaßt, gegebenenfalls einem Spacer bzw. Abstandhalter, und einem Rest, der fähig ist, durch ein Enzym aktiviert zu werden. Die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz wird gemäß den oben beschriebenen Richtlinien hergestellt. Der Rest, der zur Aktivierung durch ein Enzym fähig ist, kann jeglicher Rest sein, welcher ein reaktives Zwischenprodukt bildet, das sich an einen Rezeptor auf dem festen Träger des immobilisierten Aufnahmereagens binden kann. In bevorzugten Ausbildungen ist der Enzym-reaktive Rest Tyramin.
Reporterkonjugate, umfassend das Nukleinsäure-Replikationssubstrat und das Nukleinsäure-Replikationskonjugat, können ein molekulares Abstandssegment umfassen, das die zwei funktionellen Elemente des Konjugats verbindet. Ein Zweck des Spacers bzw. Abstandhalters ist es, das Replikationssegment des Ziels oder Bindungsfunktionen von der Oberfläche des Festphasenträgers zu erstrecken. Verwendbare Spacer sind in der Technik der Affinitätschromatografie gut bekannt. Beispielsweise beschreibt H. Schoot, Affinity Chromatograph, (1984), Mercell Deckker, Inc., New York, unterschiedliche Spacer und ihre Verwendung. Vorzugsweise umfaßt der Spacer eine Kette von bis zu 50 Atomen, vorzugsweise 5 bis 30 Atome. In Zusammensetzung können Spacer bzw. Abstandselemente ein polyfunktionelles Segment sein, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, eine oder mehrere aus den Gruppen: Peptid, Kohlenwasserstoff, Polyalkohol, Polyether, Polyamin, Polyimin und Kohlenhydrat, z. B. -Glycyl-Glycyl-Glycyl- oder ändere Oligopeptide, Carbonyldipeptide oder Omega-Aminoalkancarbonylradikale, wie -NH-(CH&sub2;)&sub2;-CO-, ein Spermin- oder Spermidinradikal, Omega-Alkandiaminradikal, wie -NH- (CH&sub2;)&sub6;-NH- oder -HN-CH&sub2;- CH&sub2;-NH-. Das Abstandssegment kann auch aus polymeren Einheiten bestehen, wie Polysaccharid, Polyethylenoxidradikalen, Glyceryl, Pentaerythritol und ähnlichen Radikalen. Das Abstandssegment kann direkt gebunden sein oder über divalente, hetero-bifunktionelle oder homo-bifunktionelle Koppler, beispielsweise SATA (N-Succinimidyl-S- acetylthioacetat), SMCC (Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat), p-Phenyldiisothiocyanat, Dithiobissuccinimidylproprionat, 1,4-Butandioldiglycidylether, ein Diisocyanat, Carbodiimid, Glyoxal, Glutaraldehyd oder Sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'nitrophenylamino)- hexanoat.
Die Länge der Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen kann über die Stellen der Primeranlagerung bzw. -festlegung erstreckt werden. Die erstreckte Länge des Ziels kann so alternativ Spacer zur Verfügung stellen und so die Länge reduzieren oder das Erfordernis eines molekularen Spacers eliminieren und auch möglicherweise die Effizienz der Zielreplikation erhöhen. Beispielsweise werden Basen, die an der Ziel- Anlagerungsstelle addiert werden, das Zielsegment von dem Punkt der Immobilisierung weg erstrecken. Auf diese Weise kann die Spacerlänge reduziert werden oder in einigen Fällen eliminiert werden. Allgemein wird das Addieren von 5 bis 30 Basen an das Ziel ausreichend sein, um die Effizienz der immobilisierten Zielreplikation zu erhöhen. Die Zusammensetzung und Länge der molekularen Spacer sind designt, um die Wechselwirkung während der Amplifikation der Nukleotid-Target-Sequenzen zu verhindern. Neue Ergebnisse zeigen, daß Zielsequenzen nahe dem Aminoverbindungsspacer für die Primeranlagerung und die logarithmische Kettenreaktion zugänglich sind. (S. Stamm und J. Brosius, Nucleic Acids Research, 19, 1350 (1991)).
Sobald die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz designt ist, können die Nukleinsäure-Replikationssubstrate hergestellt werden unter Verwendung gut eingeführter Verfahren, die für die Herstellung von Enzym-markierten Oligonukleotidproben ent wickelt wurden. Siehe z. B. G. H. Keller und Manak. M. M., DNA Probes, (1989), Seiten 136-148, Stockton Press, New York. Spezifischer kann während der Synthese der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz eine mit einem Spacerarm modifizierte Base, enthaltend ein primäres Amin, entweder an dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende des Ziels eingeführt werden. Reagentien zum Einführen einer Base, enthaltend eine 5'-Aminogruppe, sind im Handel erhältlich (C8-Aminohexyl-ATP und N6-Aminohexyl-ATP, Sigma Co.) und Verfahren zum Durchführen des Einführens in die Sequenz sind in der Technik bekannt. Das N-Monomethoxytrityl-C6-Amino-modifizierte Cyanoethylphosphoramiditreagens (Clontech Laboratories Inc., 4030 Fabian Way, Palo Alto, CA 94303) oder Aminolink ® 2 (Applied Biosystems, Inc.) stellen ein einfaches Mittel zum Einfügen eines 5'-terminalen, primären, aliphatischen Amins an ein Oligonukleotid während der Synthese eines Zieloligonukleotids zur Verfügung. Detaillierte Verfahren für die Kopplungsreaktion sind von Clontech Bulletin Nr. PB022789-1 oder von Applied Biosystems Inc., Modell 392 Manual, erhältlich. Sobald das Amino-modifizierte Nukleinsäure-Target hergestellt wurde, kann es dann mit Succinanhydrid reagiert werden, was die Länge der Seitenkette erstreckt und auch eine terminale Carbonsäure zur Verfügung stellt, welche unter Verwendung von Standardverfahren aktiviert werden kann, um das N-Hydroxysuccinimid (NHS) Zwischenprodukt (1) zu bilden. Dieses Zwischenprodukt kann dann chemisch beispielsweise an Tyramin gebunden werden, um ein Nukleinsäure-Replikationssubstrat (2) zu bilden.
(1) NHS(C)n-Verbinder-5'-Ziel 3'
(2) Tyramin-(C)n-Verbinder-5'-Ziel 3'
Gattungsgemäße Reagentien sind ebenfalls von Cruachem (460 Spring Park, Herndon, VA 22070), Clontech Laboratory (4030 Fabian Way, Palo Alto, CA 44303) oder Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) erhältlich, um interne einzelne oder mehrfache Aminogruppen in die Gensequenz einzuführen. Jedoch tendieren endmarkierte Oligomere dazu, einfacher für die Bindung und die Reaktion zugänglich zu sein als im Inneren markierte Nukleinsäuren.
In einer anderen bevorzugten Ausbildung wird beabsichtigt, daß die Sequenzen der Ziel-Nukleinsäure designt werden können, um einen Liganden zu inkorporieren. Wie er hier verwendet wird, wird der Ausdruck Ligand sowohl Liganden, welche strukturell zu den Analyten bezogen sind, als auch Liganden, welche Analytbindungen nachahmen, umfassen, solange die Liganden die Fähigkeit haben, mit einem Analyten um Rezeptorbindungsstellen zu konkurrieren. Derart können Ligand-Zielkonjugate als ein erstes Glied eines Bindungspaars fungieren und können die Bindungseigenschaften eines Analyten mimen, um mit der Bindung eines Analyten an ein zweites Glied eines Bindungspaars (z. B. einen Antikörper) zu konkurrieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Liganden mit weniger als 3000 Molekulargewicht bevorzugt, wohingegen Liganden mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500 insbesondere bevorzugt sind.
Die Veränderbarkeit in der Positionsausrichtung und in der Anzahl der inkorporierten Liganden gewährt dem Targetdesign eine Flexibilität, wobei eine erhöhte Testempfindlichkeit und optimierte Konjugat-Wechselwirkung mit den Aufnahmereagentien erlaubt wird. Es wird beabsichtigt, daß Liganden in einen oder beide Stränge einer Duplex-Ziel-Nukleinsäure inkorporiert werden können. Positionell können Liganden entweder an den 5'- oder 3'-Enden des Ziels inkorporiert werden oder an inneren Basen in der Nukleinsäure-Sequenz inkorporiert werden, wobei die Inkorporation an den Enden allgemein bevorzugt ist. Es ist beabsichtigt, daß jede Anzahl von Liganden pro Ziel inkorporiert werden kann, jedoch, wobei es das Ziel ist, eine maximale Empfindlichkeit des Tests zu erreichen, eine relativ geringe Anzahl von Liganden bevorzugt ist, wobei ein Bereich von ein bis zwei insbesondere bevorzugt ist. In der Situation, wo eine maximale Rate der Konjugataufnahme gewünscht ist, ist eine hohe Anzahl von Liganden pro Ziel bevorzugt.
Das Verfahren der Inkorporierung des Liganden in die Nukleinsäure-Sequenzen kann entweder durch chemische oder enzymatische Mittel erreicht werden oder durch direkte Inkorporation von mit Liganden markierten Basen in die Zielsequenz. Die chemische Inkorporation würde eine Chemie ähnlich zu jener verwenden, die für die Synthese des Tyramin- Replikationssubstrats, wie zuvor diskutiert verwendet wird. Typischerweise kann eine Base, die mit einem Abstandsarm modifiziert ist, enthaltend ein primäres Amin, an entweder dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende des Ziels inkorporiert werden, welches weiter durch ein N-Hydroxysuccinimid (NHS) Zwischenprodukt modifiziert werden kann, welches wiederum chemisch an den Liganden gebunden werden kann.
In einem bevorzugten Zugang werden Liganden-inkorporierte Sequenzen hergestellt unter Verwendung von Liganden-markierten Basen oder Primern während der Polymeraseketten-Re aktion. Es ist beabsichtigt, daß die Ligandenmarkierung entweder durch die Inkorporation von mit Ligand(en) modifizierten Primern oder durch Verwendung von mit Liganden markierten dNTPs durchgeführt werden kann. Liganden-markierte Primer können unter Verwendung von Standard-Oligonukleotid-Cyanoethylphosphoramidit-Chemie durch Substituieren von ausgewählten Basen mit Liganden-modifizierten Phosphoramiditbasen während der Primersynthese hergestellt werden. Wenn alternativ Primer mit modifizierten Basen, enthaltend einen verbindbaren, molekularen Spacer, hergestellt werden, können die Liganden chemisch an den Spacer nach der Primersynthese gebunden werden. Ein anderes Verfahren würde von Liganden markierten dNTPs oder Amino-modifizierten dNTPs Gebrauch machen, welche in die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz während des Amplifikationsverfahrens inkorporiert werden können.
Es bestehen zahlreiche Vorteile für die Synthese von Liganden-inkorporierten Nukleinsäure-Sequenzen durch PCR im Vergleich zu chemischen oder enzymatischen Mitteln. Beispielsweise können aufgrund eines Fehlers bzw. Versagens von in der chemischen Synthese inhärenten Sequenzen Targets mit mehr als 100 Basen leichter hergestellt werden. Zusätzlich ist es dort, wo markierte Primer verwendet werden, möglich, sowohl die Positionierung als auch die Anzahl der Liganden innerhalb eines oder beider Stränge der Zielsequenz durch eine geeignete Anordnung des Liganden in den Primern zu kontrollieren.
Demgegenüber ist, obwohl die Verwendung von markierten dNTPs die Herstellung von multivalenten Reporterkonjugaten erleichtert, die präzise Kontrolle über die Liganden-Anzahl und das Markierungsmuster weniger zuverlässig. Dies deshalb, da die dNTP-Ligandeninkorporierung sowohl von der Polymerasediskriminierung zwischen dNTP und modifizierten dNTP-Analogen als auch der Frequenz des Auftretens einer spezifischen Base in der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz abhängig ist.
Es sollte festgehalten werden, daß die obige Diskussion in bezug auf die Herstellung von Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen und -Replikationskonjugaten in gleicher Weise auf die Herstellung und das Design von Referenz-Nukleinsäuresequenzen und Referenz-Replikationskonjugaten anwendbar ist.
Das Bindungssubstrat besteht aus einem ersten Glied einer Bildungspaar-Spezies, gegebenenfalls einem Spacer bzw. Abstandhalter, und einem Rest, der zur Aktivierung durch ein Enzym fähig ist. Der Spacer und der Rest sind dieselben, wie sie für das Nukleinsäure-Replikationssubstrat beschrieben wurden. Glieder der spezifischen Bindungspaare, die für die Verwendung bei der Durchführung dieser Erfindung geeignet sind, können vom Immun- oder Nicht-Immuntyp sein. Immunspezifische Bindungspaare sind durch Antigen/Antikörper-Systeme oder Hapten/Antihapten-Systeme dargestellt. Das Antikörperglied des Bindungspaars, entweder polyklonal, monoklonal oder ein immunoreaktives Fragment davon, kann durch übliche Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, hergestellt werden. Die Ausdrücke "immunoreaktives Antikörperfragment" oder "immunoreaktives Fragment" beziehen sich auf Fragmente, welche den Bindungsbereich des Antikörpers enthalten. Derartige Fragmente können Fab-Typ-Fragmente sein, welche als Fragmente definiert sind, denen der Fc- Bereich, z. B. Fab, Fab', und F(ab')2-Fragmente, fehlen abgeleitet sind, oder sie können "Halbmolekül"-Fragmente sein, die durch die reduktive Spaltung der Disulfidbindungen, die schwer- bzw. langkettige Komponenten des intakten Antikörpers verbinden, erhalten wurden. Wenn das Antigenglied des spezifischen Bindungspaars nicht immunogen ist, z. B. ein Hapten, kann es kovalent an ein Trägerprotein gekoppelt werden, um dieses immunogen zu machen.
Nicht-Immun-Bindungspaare umfassen Systeme, worin die zwei Komponenten eine natürliche Affinität für einander, jedoch nicht Antikörper sind. Beispielhafte, Nicht-Immun-Bindungspaare sind Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin, Folsäure-Folatbindungsprotein, komplementäre Probennukleinsäuren, Proteine A, G und Immunoglobuline usw. Auch umfaßt sind Nicht-Immun-Bindungspaare, welche eine kovalente Bindung miteinander ausbilden. Beispielhafte, kovalente Bindungspaare umfassen Sulfhydryl-reaktive Gruppen, wie Maleimide und Haloacetylderivate, und aminreaktive Gruppen, wie Isothiocyanate, Succinimidylester und Sulfonylhalogenderivate, usw. In bevorzugten Ausbildungen würde ein exemplarisches Bindungssubstrat ein Konjugat von Biotin, das an Tyramin über ein N-Hydroxysuccinimido-Verbindungsmolekül gekoppelt ist, sein. Das Bindungssubstrat kann unter Verwendung von gut bekannten Verfahren synthetisiert werden. M. N. Bobrow, et al., J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989).
Das Nukleinsäure-Replikationskonjugat besteht aus einem zweiten Glied einer Bindungspaar-Spezies, gegebenenfalls einem Spacer, und einer Ziel-Nukleinsäure-Sequenz. Die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz und der Abstandhalter sind gemäß den oben beschriebenen Prinzipien designt und hergestellt.
Das zweite Glied der Bindungspaar-Spezies ist so gewählt, daß es komplementär zu dem ersten Glied der Bindungspaar- Spezies ist, die in dem Bindungssubstrat verwendet ist. Wie oben festgehalten, besteht in einer bevorzugten Ausbildung das Bindungssubstrat in einem Konjugat, bestehend aus Biotin, einem Spacer und Tyramin. Daher wird die Auswahl des zweiten Glieds der Bindungspaar-Spezies, die in dem Nukleinsäure-Replikationskonjugat verwendet wird, Avidin oder Streptavidin sein und daher wird das Bindungssubstrat Avidin oder Streptavidin als das zweite Glied der Bindungspaar-Spezies umfassen. Die Nukleinsäure-Replikationskonjugate können gemäß gut eingeführten Verfahren hergestellt werden. Siehe beispielsweise G. H. Keller und Manak, M. M., DNA Probes, (1989), Seiten 136-148, Stockton Press, New York. Spezifischer könnte während der Synthese des Zieloligonukleotids eine mit einem Spacerarm, enthaltend ein primäres Amin, modifizierte Base an entweder dem 5'-Ende oder an dem 3'-Ende eingeführt werden. Reagentien zum Einführen einer 5'-Aminogruppe sind käuflich erwerbbar (z. B. Aminolink ® 2; Applied Biosystems Inc., 800 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404). Aminolink ® 2 wird in dem letzten Schritt in der Synthese des Oligomers zugesetzt. Die Amino-modifizierte Ziel-Nukleinsäure wird dann durch einen bifunktionellen Ester aktiviert, um sowohl die Länge der Seitenkette zu erstrecken als auch eine terminale Carbonsäure zur Verfügung zu stellen, welche dann unter Verwendung von Standardverfahren zur Ausbildung von N- Hydroxysuccinimid (NHS) Zwischenprodukt (1) aktiviert werden kann. Dieses Zwischenprodukt kann chemisch mit Avidin gekoppelt werden, um das Nukleinsäure-Replikationskonjugat (3) auszubilden:
(1) NHS(C)n-Verbinder-5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3'
(2) Avidin-(C)n-Verbinder-5' XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX 3'
Gattungsgemäße Reagentien sind ebenfalls von Cruachem und Clontech zum Einführen von internen, einzelnen oder mehrfachen Aminogruppen in die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz erhältlich. Jedoch tendieren endmarkierte Oligomere dazu, einfacher für die Bindung und Reaktion zugänglich zu sein, als intern markierte Nukleinsäuren.

Primer:

In der gegenwärtigen Praxis erfordert die Replikation der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz "Primer"-Oligonukleotide, welche, wie hier verwendet, sich auf alle Oligonukleotide beziehen, welche sich an Target- bzw. Zielsequenzen anlagern bzw. mit diesen verschmelzen, um die Replikation des Ziels zu erleichtern.
Wenn die Zielreplikation durch Polymeraseketten-Reaktion durchgeführt wird, werden zwei spezifische Primer verwendet. Jeder Primer hybridisiert spezifisch mit einem der zwei komplementären Stränge des Targets (oder wenn das Ziel einzelsträngig (ss) ist, ist einer der Primer spezifisch für den zweiten Strang nach der Synthese). Die Replikation des Ziels erfordert, daß das 5'-Ende des Primers, welches komplementär zu dem (-) -Sinn-Zielstrang ist (Primer #2), einen einem Bereich des (+) -Sinn-Strangs entspricht, welcher das 5'- bis das 3'-Ende des (+) gerichteten Strangs des spezifischen Primers (#1) ist. Zusätzlich sollten die Primer keine Bereiche enthalten, welche ausreichend komplementär sind, um Primerdimere auszubilden. Innerhalb dieser Beschränkung kann die Gesamtlänge der Primer von kürzer als bis länger als das Ziel rangieren. Allgemein sind Primer mit 10 bis 30 Basen Länge besonders praktisch. <
------- 5' Primer #1
+ Sinn 5' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
- Sinn 3' -YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY-5'
Primer #2 5' ----------->
Primer können auch Sequenzen an ihren 5'-Enden enthalten, welche kein Komplement in dem Ziel besitzen (5'-Überhang oder 5'-Ungleichheit).
< -------5' Primer #1
+ Sinn 5' -XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
5' -----------> Primer #2
- Sinn 3' -YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY-5'
(X, Y stellen komplementäre Basen dar)
Dieser 5'-Überhang oder diese 5'-Ungleichheit kann verwendet werden, um funktionalisierte Basen (z. B. Signal-erzeugende oder Bindungsglied-derivatisierte Basen) an den Primern zu inkorporieren oder um die Länge der replizierten Nukleinsäure-Produkte durch Anlagern von Extrasequenzen zu erstrecken, verwendet werden. Diese Additionen können zum Aufnehmen der resultierenden Nukleinsäuren und/oder zur Signaldetektion nützlich sein. In dem Primer kann ein zu dem Ziel komplementäres 3'-Segment an eine Vielzahl von unterschiedlichen 5'-Segmenten gebunden sein. So kann eine Serie von Primern mit einem festgelegten Hybridisierungsbereich, der an unterschiedliche, Signal-bildende Enden gebunden ist, hergestellt werden. Das gebildete Signal würde von dem 5'-Bereich des Primers bzw. der Primer, der (die) verwendet wird (werden), abhängen und könnte an das interessierende Detektionsverfahren angepaßt werden. Es kann jedoch eine Einzelzielsequenz mit unterschiedlichen Primern, enthaltend unterschiedliche 5'-Überhänge oder - Ungleichheiten, verwendet werden, um eine Anzahl von unterschiedlichen Sequenz-spezifischen Antworten zu generieren.
Typischerweise weisen in den PCR-Typ-Amplifizierungstechniken die Primer unterschiedliche Sequenzen auf und sind nicht zueinander komplementär. Abhängig von den gewünschten Testbedingungen sollten die Sequenzen der Primer designt sein, um sowohl effiziente als auch zuverlässige Replikationen der Ziel-Nukleinsäure zur Verfügung zu stellen. Einige einfache Regeln sind bei der Auswahl und dem Design der Primer verwendbar. Typischerweise sollten die Primer 10 bis 35 Basenpaare lang sein, wobei sie eine 50 bis 60%-ige G+C-Zusammensetzung aufweisen. Die berechneten Tm's für ein gegebenes Primerpaar sollten ausgeglichen sein. Für diesen Zweck können 2ºC für A oder T und 4ºC für G oder C gemeinsam addiert werden, um Tm des Oligonukleotids abzuschätzen (Thein und Wallace, "The use of oligonucleotide as specific hybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders", in Human Genetic Diseases: A Practical Approach, K. E. Davis Ed., (1986), Seiten 33-50 IRL Press, Herndon, Virginia). In Abhängigkeit von den gewählten Bedingungen sind Tm's zwischen 55ºC und 80ºC geeignet. Zusätzlich zu den Tm's ist die Komplementarität an dem 3'- Ende der Primer ein wichtiger Betrachtungspunkt. Allgemein sollte eine Komplementarität von Primerpaaren vermieden werden, insbesondere an den 3'-Enden. Auch sollten aufeinanderfolgende Läufe von C's und G's (3 oder mehr) an den 3'-Enden der Primer gemeinsam mit palindromischen Sequenzen vermieden werden. Es sollte auch auf die Konzentration der Primermoleküle in dem Replikationsmilieu geachtet werden. Primerkonzentrationen zwischen 0,01 und 1,0 uM sind allgemein geeignet, wobei Konzentrationen von etwa 0,05 bis 1,0 uM optimal sind.
Wenn die Ligaseketten-Reaktion (LCR) für die Replikation einer doppelsträngigen Ziel-Nukleinsäure verwendet wird, werden zwei Sätze von zielspezifischen Primern erforderlich sein. Die Glieder von einem Satz von Primern sind komplementär zu benachbarten Sequenzen, die an einem gegebenen Strang des Ziels gefunden werden, wohingegen die Glieder des zweiten Satzes komplementär zu benachbarten Sequenzen an dem gegenüberliegenden Strang sind. Auf diese Weise ist ein Satz von benachbarten Primern spezifisch für jeden Zielstrang. Während des Replikationsverfahrens wird die Ziel-Nukleinsäure erhitzt, um die zwei Zielstränge zu denaturieren. Die vier komplementären Oligonukleotidprimer, die die zwei Primersätze umfassen, werden dann nahe ihrer Schmelztemperatur zu den getrennten Zielsträngen hybridisiert. Eine thermisch stabile Ligase wird kovalent die benachbarten Primer an jedem Zielstrang anlagern. Nur benachbarte Primer, welche perfekt komplementär zu dem Ziel sind, werden miteinander verbunden. Auf diese Weise werden die Produkte aus der ersten Stufe der Ligation bzw. Bindung Ziele für die nächste Runde der Ligation. Die Produkte erhöhen sich so exponentiell mit fortgesetzten Zyklen der Zieldenaturierung, Primerhybridisierung und Ligationsschritten.
Die Erfordernisse für die Nicht-Komplementarität zwischen den Primern, die Größen-, Basenzusammensetzungs- und Schmelztemperaturerfordernisse der Primer tendieren dazu, analog zu jenen zu sein, welche oben für die PCR-Repli kation beschrieben wurden. Allgemein sollten Primer für die LCR-Replikation ausreichend lang sein, sodaß jeder bevorzugt an seine spezifische Bindungsstelle an die Ziel- Nukleinsäure binden wird. Um die Spezifität der Bindung sicherzustellen, können Reaktionen nahe der Schmelztemperatur (Tm) der Oligonukleotidprimer durchgeführt werden. Bei höheren Temperaturen kann eine Einzelbasenungleichheit bei der Verbindung ausgebildet werden. Dies resultiert nicht nur in einer nicht perfekten Doppelhelix, sondern destabilisiert die Hybridisierung der ungleichen Oligonukleotide.
In jeder der PCR- oder LCR-Typ-Replikationen können die Primer Basen enthalten, die mit Reporter(n) markiert sind oder mit einem Glied eines spezifischen Bindungspaars markiert sind. Beispielsweise können Biotin- und Fluoresceinreste in den Primer während der CE-Phosphoramiditsynthese inkorporiert werden (NEN Products, Du Pont, Boston, MA; oder Clontech). Die Inkorporierung der Primer während der Amplifikation wird auch in Nukleinsäure-Produkten, enthaltend Biotin und Fluorescein, resultieren. Auf diese Weise kann die Primerinkorporierung während des Replikationsverfahrens als ein bevorzugtes Mittel zur Einführung von Reportern und Affinitätsmarkierungen in den replizierten Nukleinsäuren verwendet werden.

Testbedingungen:

Die Ausführung von Analyt-abhängigen Reportersystemen erfordert mehrere Schritte. Erstens wird ein Analyt-abhängiger Reporterkomplex (ADRC) ausgebildet. Dies wird unter Verwendung von gut bekannten Immunotest-Reagentien und -Techniken durchgeführt. Die Reagentien können für sequen tielle, kompetitive Sandwich- und immunometrische Immuntestversuche konfiguriert sein. Harlow, E. und Lane, D. L., Antibodies - A Laboratory Manual, (1988), Seiten 555-612, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.
Sobald der ADRC-Komplex gebildet wurde, werden überschüssige, freie Reagentien entfernt. Dies ist ein bedeutender Schritt, da jedes freie Reagens und jeder nicht-spezifisch gebundene Reporter zu dem Replikationsverfahren beitragen kann. Um bei der Reduktion der nicht-spezifischen Bindungen zu helfen, können strenge Waschbedingungen, welche keine Dissoziation des ADRC bewirken, wie sie bei Nukleinsäure- Hybridisierungstest verwendet werden, angewandt werden, da die Zielreplikation und das Auslesen auf der Nukleinsäure- Chemie beruhen. Beispielsweise können Erhitzen, pH-Änderungen oder (und) der Zusatz von Formamid, Detergentien und Salzen verwendet werden, um die Effizienz des Waschschritts zu erhöhen. Zu strenge Bedingungen können zur Dissoziation des ADRC oder zur Zerstörung des Immunotest-Reporters führen. Die Toleranz gegenüber strengen Waschbedingungen wird mit der Art des Analyten, dem Bindungsglied und dem spezifisch verwendeten Reporter variieren. Die strengen Bedingungen müssen daher experimentell für jeden Test optimiert werden. Wenn jedoch beim Waschen, um die nichtspezifischen Bindungen zu reduzieren, einiges des ADRC verloren wird, kann dies durch zusätzliche Zielreplikation kompensiert werden kann, die durch Erhöhen der Anzahl der Temperaturrecyclingschritte realisiert wird.
In Fällen, wo der ADRC empfindlich gegenüber strengen Waschbedingungen ist, kann ein katalysierter Reportertest (Fig. 2) verwendet werden. In dieser Konfiguration resul tiert die Reaktion des ADRC mit dem Substrat in kovalenter Kopplung zwischen der Ziel-Nukleinsäure und dem Träger. Nach dem Koppeln wird der feste Träger gewaschen, was den kovalent gebundenen Ziel-Nukleinsäure-Komplex zurückläßt. Spezifisch könnte ein Tyramin-Zielsubstrat mit einem HRP- Enzymreporter verwendet werden, um kovalent das Ziel an den Träger zu koppeln. Auf diese Weise könnten Enzymamplifikationen durchgeführt werden und vor der Zielreplikation strenge Waschbedingungen verwendet werden.
In dem nächsten Schritt wird die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz repliziert. Wenn PCR die verwendete Replikationsmethode ist, wird die Zielsequenz mit der Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung (100 ul) vermischt, umfassend zwei Primer (100 pMol/Primer), eine thermisch stabile DNA-Polymerase, wie Taq-DNA-Polymerase (2 Einheiten), erforderliche Nukleotide (dNTP 200 uM/Base), welche Signal-generierende oder Liganden-enthaltende Nukleinsäuren sein können, Tween® 20 Detergens (0,05%), 20 mM TRIS/HCl-Puffer (pH 8,3), MgCl&sub2; (1,5 mM), KCl (25 mM) und Nuklease-freie Gelatine (100 ug/ml).
Allgemein kann überschüssiges Mg&spplus;&spplus; in der Replikationsreagenszusammensetzung in der nicht-spezifischen Amplifikation resultieren, wohingegen unzureichendes Mg&spplus;&spplus; die Ausbeuten reduzieren wird. Es ist bekannt, daß Deoxynukleotidtriphosphate (dNTP) Mg&spplus;&spplus; binden und die Menge bzw. das Ausmaß der Bindung hängt von der dNTP-Konzentration ab. In einer Reaktionszusammensetzung, enthaltend alle vier Basen (dNTP), läßt dies eine freie Endmagnesiumkonzentration von ca. 0,7 mM der ursprünglichen 1,5 mM Mg&spplus;&spplus;. Wenn die dNTP- Konzentration signifikant geändert werden, kann eine kompensatorische Änderung an MgCl&sub2; notwendig sein.
Aufgrund der Verschiedenheit der Anwendungen, in welchen die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, können die Einstellungen in bezug auf die Konzentration und Reagenszusammensetzungen der Nukleinsäure-Replikationsrea-genszusammensetzung erforderlich sein. Praktische Richtlinien zum Optimieren und Einstellen des Replikationsmilieus können in R. K. Saiki und Gelfand, D. H., in PCR Technology, (1989), Seiten 7-22, Stockton Press, New York, gefunden werden.
Die Reaktionsmischung wird mit Mineralöl bedeckt, um eine Verdampfung zu vermeiden. Die Ziel-Nukleinsäure wird dann denaturiert, um die doppelten Nukleinsäure-Stränge zu trennen. Allgemein wird dies bei einer hohen Temperatur (90 bis 95ºC) für 15 s ausgeführt; jedoch kann eine längere Anfangszeit erforderlich sein, um eine vollständige Denaturierung sicherzustellen. Verschmelzen der Oligonukleotidprimer mit dem Ziel-Nukleinsäure-Matrize bzw. - Template wird üblicherweise durch Absenken der Temperatur auf 37 bis 60ºC für 30 bis 60 s durchgeführt. Die Polymeraseextension der Primer kann dann durch Äquilibrierung bei 72ºC für 10 bis 60 s in Abhängigkeit von der Länge der Signal-generierenden Produkte durchgeführt werden. Die Denaturierungs-, Primerverschmelzungs- und Primerextensionsschritte werden wiederholt aufeinanderfolgend ausgeführt, um die Stranganzahl des Signal-generierenden Produkts zu amplifizieren. Das Temperaturzyklieren wird typischerweise 10 bis 40 Mal in Abhängigkeit von dem gewünschten Grad der Replikation durchgeführt. Die Reaktion kann dann durch Zusatz von EDTA (10 mM) und Abschrecken auf 4ºC durchgeführt werden.
Wenn LCR das Replikationsprotokoll ist, wird allgemein die Zielsequenz des ADRC mit zwei Sätzen von benachbarten Oligonukleotiden (jeweils 40 fMol) gemischt; jeder Satz wird zu einer der komplementären Nukleinsäure-Zielstränge komplementär sein; in 10 ul Puffer, enthaltend 20 mM Tris.HCl- Puffer pH 7,6, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 10 mM NAD, 10 mM Dithiothreitol, 4 ug Lachssperma-DNA und 15 Schnitt- bzw. Spalt-schließende Einheiten einer thermostabilen Ligase, beispielsweise T. aquatics Ligase, (Tabor, S. und Richardson, D. C. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1074- 1078).
Die Reaktionsmischung wird dann vor einem Verdampfen geschützt, beispielsweise durch Überdecken mit einem Tropfen Mineralöl, und dann auf 94ºC erhitzt, um die Trennung der Zielstränge sicherzustellen. Schmelzen der Oligonukleotidprimer an das Ziel wird üblicherweise durch Absenken der Temperatur auf zwischen 37 und 60ºC durchgeführt. Eine optimale Temperatur nahe der Schmelztemperatur der Primer wird üblicherweise gewählt, jedoch muß sie in Abhängigkeit von der verwendeten Primerlänge und der Zusammensetzung der spezifischen Primer bestimmt werden. Der Schmelz- und Primeranlagerungszyklus werden dann 10 bis 30 Mal wiederholt. Die Reaktion wird dann auf 4ºC abgeschreckt, um die Reaktion zu stoppen.
Der nächste Schritt umfaßt die Detektion oder Visualisierung der amplifizierten Nukleinsäuren. Dies kann durch verschiedene Mittel durchgeführt werden, umfassend (a) die direkte Detektion der doppelten Nukleinsäuren unter Verwendung von eindringenden bzw. zwischengeschalteten Farben; (b) indirekte oder direkte Detektion von Liganden, Isotopen oder Reportern, die in den Nukleinsäuren inkorporiert sind; (c) Hybridisierung von Reporterproben an die amplifizierten Nukleinsäuren; oder (d) direkte Detektion des replizierten Produkts, folgend auf die Abtrennung des replizierten Produkts aus dem Reaktionsmillieu, basierend auf der angestiegenen Größe des Replikationsprodukts.
Spezifisch können amplifizierte Nukleinsäuren in der Reaktionsmischung durch Zusatz von eindringenden Farben detektiert werden. Von spezieller Verwendung sind jene Farbstoffe aus Ethidium, Phenazinen, Furocumarinen, Phenothiasinen und Chinolintypen, welche beim Eindringen bzw. Einlagern zwischen die doppelten Stränge von Nukleinsäuren ihre Farbstoffdetektionseigenschaften ändern. Allgemeine Reviews und weitere Information können in Berman et al. Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 20, 87 (1981), erhalten werden. Beispielsweise ist ein bevorzugter Farbstoff Ethidiumbromid, welches bei der Nukleinsäuren-Interkalation durch Anregung der Detektionsmischung mit kurzwelligem UV-Licht (259 nm) detektiert werden kann.
Die Inkorporierung von modifizierten, freien Basen oder modifizierten Primern während der Nukleinsäure-Replikation stellt ein Mittel zum Einführen von Basen, die mit Liganden, Isotopen oder Reportern modifiziert sind, zur Verfügung. Wenn die Ligase-Typ-Replikation verwendet wird, könnten Oligonukleotide, denen bereits Basen inkorporiert sind, verwendet werden, um die Zielsequenzen zu replizieren. Diese Techniken ermöglichen zahlreiche Detektionsstra tegien. Beispielsweise stellt die Inkorporation von biotinylierten oder Liganden-modifizierten Basen ein Mittel zur Isolierung der amplifizierten Nukleinsäure-Produkte von der Lösung auf einem festen Träger und Verwerfen der nichtinkorporierten Basen zur Verfügung. Zusätzlich erleichtert dann ein Avidin-Signal-bildendes Konjugat die Detektion. Die amplifizierten Sequenzen können auch Signal-bildende, markierte Basen enthalten. Diese können direkt auf dem Festphasenträger detektiert werden. Alternativ sind Verfahren eines Sammelns und Detektierens von biotinylierten DNA-Fragmenten an magnetischen Kügelchen, enthaltend immobilisiertes Avidin oder Streptavidin, durch J. Wahlberg et al., Mol. Cell Probes, 4 285 (1990), beschrieben.
In einer anderen Alternative könnte die Sequenz des amplifizierten Segments designt sein, um fluoreszierende Basen in den Signalnukleinsäuren für den Energietransfer zu positionieren oder die biotinylierten Basen so zu positionieren, daß die Bindung von Avidin-markierten Enzymreportern in einem Enzym-Channeling resultieren würde. Unter Verwendung dieser Techniken kann das amplifizierte Ziel ohne das Erfordernis der Abtrennung von nicht-inkorporierten Basen detektiert werden. Gemäß der molekularen Modelldarstellung und kürzlichen Berichten von R. A. Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790 (1988), kann der Energietransfer über Distanzen zwischen den Fluorophoren von bis zu 12 Basen Entfernung erreicht werden. Jedoch erscheint die optimale Distanz irgendwo zwischen 5 und 12 Basen zu liegen. Bei einer Fluorophorenbase pro Helixumdrehung positioniert dies die Donor- und Akzeptorfluorophore in geeigneter Nähe für den Energietransfer.

Analyt-Quantifizierung:

Die Antwort des Analyt-abhängigen Reportersystems (ADRS) hängt von der Menge des in der Probe vorhandenen Analyten und auch von der Effizienz der Sequenzamplifizierung ab. Obwohl Analytkonzentrationen in Proben aus Standardkurven durch experimentell bestimmte Testantworten unter fixen Reaktionsbedingungen und bekannten Analytkonzentrationen interpoliert werden können, ist die Effizienz der Sequenzreplikation und Kontrolle aufgrund der prozedualen und Reaktionsvariablen schwierig vorherzusagen. Weiters ist die Amplifizierung sehr empfindlich. Wenn jedoch falsche, negative Testantworten identifiziert werden können, kann die Abwesenheit von Analyt zuverlässiger bestimmt werden und der verwendbare Bereich des Tests ausgedehnt werden.
Die Anmelder beabsichtigen, daß wenigstens zwei Typen von internen Kontrollen verwendet werden können, um Änderungen in der Effizienz der Sequenzreplikation zu kompensieren und um Mittel zum Identifizieren von falschen negativen Testantworten zur Verfügung zu stellen. Die Anmelder beziehen sich auf diese als "Amplifikations- oder Replikationskontrolle" oder "Aufnahmekontrolle". Eine "Amplifikationskontrolle" bezieht sich auf eine Nukleinsäure-Sequenz, die als die "Referenz-Sequenz" bezeichnet wird (spezifisch eine unterschiedliche Sequenz zu der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz) und ihre(n) entsprechenden, verwandten Primer. In der Verwendung könnten die Referenz-Sequenz und die verwandten Primer in die Nukleinsäure-Replikationsreagenszusammensetzung inkludiert sein und würden dazu dienen zu demonstrieren, daß die Reaktionsbedingungen für die Sequenzamplifikation zulässig sind. Während des Testens, ob die Amplifikationskontrolle ein Signal ergibt, die Zielsequenz jedoch nicht, kann dann das Fehlen der Zielsequenz- Amplifizierung nicht das Resultat der Testbedingungen, die nicht für die Amplifikation zulässig sind, sein und das Ergebnis zeigt eine Analytkonzentration unter dem detektierbaren Niveau an.
Die Amplifikationskontrolle bzw. -steuerung kann auch als der interne Standard für die Analytquantifizierung dienen. Für diese Anmeldung wird die Referenz-Sequenz in einer bekannten Konzentration zugesetzt, welche sich an die zu detektierende Analytkonzentration, annähert. Während der Replikationsreaktion wird die Referenz-Sequenz theoretisch mit derselben Effizienz wie die Zielsequenz amplifiziert. Indem das Verhältnis der Signalantworten aus der Referenz- Sequenz und der Zielsequenz bestimmt wird, kann die Konzentration des Analyten bestimmt werden. In diesem Versuch werden Standardkurven bestimmt, indem das Verhältnis der Antworten, die aus der Zielsequenz und der Referenz-Sequenz in Proben, enthaltend einen Bereich von bekannten Analytkonzentrationen und eine festgelegte Konzentration der Referenz-Sequenz, bestimmt werden. Auf diese Weise können Änderungen in der Effizienz von Nukleinsäure-Replikationen kompensiert werden. Die Testantwort kann so genauer einer Analytkonzentration zugeordnet sein.
Die Referenz-Sequenz muß ähnlich im Molekulargewicht zu der Amplifikationssequenz sein, jedoch muß sie fähig sein, eine gesonderte und unterschiedene "replizierte Referenznukleinsäure" zu bilden, welche unterscheidend von der replizierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenz detektierbar ist. Dies kann durch Designen von Ziel- und Referenz-Sequenzen erreicht werden, damit diese einzigartige Basen enthalten. Auf diese Weise kann während der Replikation eine einzige Base oder ein Primer, die (der) mit Liganden, Reportern, Isotopen oder reaktiven Gruppen markiert ist, entsprechend in die Nukleinsäure-Produkte von sowohl den Referenz-Sequenz-Nukleinsäuren als auch den Ziel-Sequenz-Nukleinsäuren inkorporiert werden. Die resultierenden Nukleinsäuren sind so mit gesonderten Reportern markiert oder können zur Detektion über Hybridisierungsreaktionen isoliert werden oder durch Binden mit komplementären Gliedern eines spezifischen Liganden-Bindungspaars.
Eine "Aufnahmekontrolle" umfaßt ein Analyt-Referenz-Sequenz-Konjugat (geeignet konfiguriert für jede Ausbildung, siehe unten) und verwandte Primer. Das Aufnahmekontroll-Sequenzkonjugat würde während des Analytaufnahmeschritts des Tests inkludiert werden; und das verwandte Primerpaar würde in die Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung inkludiert werden. In dieser Konfiguration könnte ein Versagen beim Detektieren der Aufnahmekontroll-Replikationen entweder in einem Fehlen der Aufnahme oder in für die Amplifikation nicht zulässigen Bedingungen resultieren. Durch Verwendung von unterschiedlichen Sequenzen für die Aufnahme- und die Amplifikationskontrollen können beide Kontrollen bzw. Steuerungen in jeder Reaktionskammer inkludiert sein, was eine Differenzierung zwischen einer versagenden Aufnahme und versagenden Replikationsreaktionsbedingungen erlauben würde. Der Einschluß dieser Kontrollen ist nur möglich, da jede der drei Amplifikationsstellen (Zielsequenz, Amplifikationskontrolle und Aufnahmekontrolle) designt werden könnten, um ein Sequenz-spezifisches, differentiell detektierbares Signal zu generieren.
dNTP- und Primerniveaus sollten eingestellt werden, sodaß jede der drei Replikationsreaktionen bis zur Vollständigkeit geführt werden kann. Ziele und verwandte Primer sollten ähnliche Tm's, Längen und andere Charakteristika aufweisen, welche die Amplifikationseffizienz bewirken.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele sollen Schlüsselausbildungen der Erfindung illustrieren, jedoch sollen sie nicht so verstanden sein, um sie in irgendeiner Weise zu beschränken.

Herstellung von Reagentien

Als die Reporter oder als Primer zu verwendende Oligonukleotide werden unter Verwendung von Standard-Cyanoethyl- (CE)-Phosphoramidit-Kopplungschemie auf kontrollierten Porenglasträgern (CPG) in einem automatisierten DNA-Oligonukleotidsynthetisierer hergestellt (Generator®; Du Pont Co., Wilmington, DE, und Modell 392, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) (Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Lett., 22 (20), 1859 (1981); Caruthers et al., Genetic Engineering, Vol. 4, Ed., (1982); Stelow und Hollaender, Plenum Publishing Corp., New York). Das aminomodifizierende Phosphoramiditreagens Aminolink ® 2 wird von Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, erhalten. Oligonukleotide sind mit [ r³²P] Cordycepin 5'-Triphosphat radiomarkiert und das Scintillationsfluid (Biofluor®) zur Scintillationszählung wird von NEN Products, Du Pont Co., Boston, MA, erhalten und die Scintillationszählung wird unter Verwendung eines Beckman® Modell LS3801 Scinillationszählers (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) durchgeführt.
Deoxynukleotydyltransferase wird von Promega, Inc., Madison, WI, erhalten. Pol-Tergent SLF-18 wird von Olin Corp., Stamford, CT, erhalten. Kodak® Xomat® AR 2 Röntgenfilm für die Autoradiografie wird von Eastman Kodak Co., Rochester, NY, erhalten. Die Reagentien, SATA (N-Succinimidyl-S-acetylthioaceatat) und SMCC (Succinimidyl-4-(N- maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat) werden von Pierce, Rockford, IL, erhalten. Die SATA- und SMCC-Kopplungschemie wird von Tseng et al. in US-A 5,324,650 beschrieben. Der in dem Reporterkonjugat verwendete Reporterantikörper (AffiniPure® Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, H+L) wird von Jackson ImmunoResearch Labs., Inc., Produkt Nr. 111-005-045, erhalten. Antikörper-Reaktionskomponenten werden aus den Oligonukleotidkomponenten durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) unter Verwendung einer Zorbax® 250 Gelausschlußsäule (9,4 · 250 mm, mit 0,2 Mol Natriumphosphatpuffer pH 7,0 und einer Säulenflußrate von 1 ml/min) (MacMod Analytical Inc., Chadds Ford, PA) verbunden mit einem Waters 600 E Systemregler und einem Waters 991 Fotodioden-Felddetektor (Millipore Corp., Milford, MA) abgetrennt. Injektionen wurden mit einem Waters 700 Satellit- WISP-automatisierten Injektionssystem durchgeführt. Testkügelchen von Glycidylmethacrylat (Oxiranacrylkügelchen) die als die immobilisierte Aufnahme fungieren, werden von Sigma (Produkt Nr. O-9754, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) erstanden. Die in den folgenden Beispielen verwendeten Dichtemesser waren entweder ein Densigraph® 100 (Graphic Technology Inc., Cherry Hill, NJ) oder das Modell RD107R Quanta Log Densitometer (MacBeth Corp., Newbough, NY). Basische Polymeraseketten-Reaktion (PCR) Protokolle sind in Saiki, R. S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. A. Erlich und N. Amheim, 1985, Science 230:1350, beschrieben und die Amplifikationsreaktion wird unter Verwendung von Reagentien, die in dem Perkin Elmer-Cetus GeneAmp® Satz (N801-0055), dem Perkin Elmer-Cetus 9600 GeneAmp® PCR System thermischen Zyklisierer (Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, CT) erhalten werden, durchgeführt. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten PCR-Protokolle waren modifiziert, um kurze (< 150 Basen), einzelsträngige DNA- Zielsequenzen zu amplifizieren. In allen unten zur Verfügung gestellten Beispielen ist der ADRS-Versuch unter Verwendung von Polymeraseketten-Reaktion (PCR) Replikationstechniken gezeigt, wobei jedoch verstanden werden sollte, daß jedes geeignete Verfahren der Nukleinsäure-Replikation verwendet werden kann, umfassend die Ligaseketten-Reaktion und isotherme oder autokatalytische Verfahren.

Beispiel 1

Amplifizierte Analytendetektion in einem Maus-IgG-Test unter Verwendung des direkten Zielabscheidungsverfahrens

Oligonukleotidherstellung:

Während keinerlei Beschränkung beabsichtigt ist, und lediglich zu Illustrationszwecken können die Sequenzen und Primer, die in der Replikation verwendet werden, mit den folgenden Sequenzen synthetisiert werden.
Zielsequenz für Einzel-Primeramplifikation:
5' ATC CTA CCT GTA AGT AAA GCT GCT ACG CAT 3' SEQ ID Nr.: 3 3' TAG GAT GGA CAT TCA TTT CGA CGA TGC GTA 5' SEQ ID Nr.: 4
Ziel/Primer-Bindungsstellen für Einzel-Primeramplifikation:
Zielsequenz für Doppel-Primeramplifikation:
5' ATG CGT AGC AGC TTT ACC GCA GAG ATC ATG CCT ATG TAC CAT GCT 3' 3' TAC GCA TCG TCG AAA TGG CGT CTC TAG TAC GGA TAC ATG GTA CGA 5'
5' ATC CTA CCT GTA AGT CAT AGC TGT TTC CTG 3' SEQ ID Nr.: 1 3' TAG GAT GGA CAT TCA GTA TCG ACA AAG GAC 5' SEQ ID Nr.: 2
Primer 1:
5' ATG CGT AGC AGC TTT AC 3' SEQ ID Nr.: 5
Primer 2:
3' CAG TAT CGA CAA AGG AC 5' SEQ ID NR.: 6
Zielsequenz/Primer-Bindungsstellen für Doppel-Primeramplifikation:
5' ATG CGT AGC AGC TTT ACC GCA GAG ATC ATG CCT ATG TAC CAT GCT 3' 3' TAC GCA TCG TCG AAA TGG CGT CTC TAG TAC GGA TAC ATG GTA CGA 5' 5' ATG CGT AGC AGC TTT AC 3' Primer 1 SEQ ID Nr.: 5
3' CA GTA TCG ACA AAG GAC 5' Primer 2 SEQ ID Nr.: 6 5' ATC CTA CCT GTA AGT CAT AGC TGT TTC CTG 3' SEQ ID Nr.: 1 3' TAG GAT GGA CAT TCA GTA TCG ACA AAG GAC 5' SEQ ID Nr.: 2
Zahlreiche alternative Basensequenzen und Kettenlängen könnten ebenfalls innerhalb der hier beschriebenen Richtlinien angewandt werden.
Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung: Die beim Amplifizieren des Sequenzziels verwendbare Replikationszusammensetzung in Polymerasetyp-Amplifikationen kann eine Lösung, enthaltend Replikationspuffer (25 mM KCl, 20 mM TRIS- Hydrochlorid [pH 8,13], 1, 5 mM MgCl&sub2;, 0,05% Tween® 20 und 0,1 mg/ml autoklavierte Gelatine [Gew./Vol.]), 200 mM von jedem drs dNTPs, 1,0 uM von jedem Primer, 2,5 U Taq DNA Polymerase, die in doppelt destilliertem Wasser, enthaltend 0,1 Gew.-% /Vol. Diethylpyrocarbonat, aufgearbeitet wurde, umfassen. Wenn die Nukleinsäure-Replikation unter Verwendung von markierten Deoxynukleotidtriphosphaten durchgeführt wird, kann die obige Replikationszusammensetzung so modifiziert sein, daß eine oder mehrere der Deoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) durch markierte Basen ersetzt ist. Biotinylierte dUTP (bio-dUTP) (Enzo Biochem, New York, NY) und Fluorescein-markierte dCTP (F-dCTP) (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) können von Bethesda Research Laboratories, Inc., Maryland, erhalten werden und können entsprechend für dTTP und dCTP in einem 1 : 3 Molverhältnis von markierter zu unmarkierter Base substituiert sein. Allgemein ist eine 20 bis 30%-ige Inkorporation von markierten Basen bevorzugt, um eine effiziente Hybridisierung aufrecht zu erhalten. V. T. Chan et al., Nucleic Acids Res., 13, 8083 (1985).
Nukleinsäure-Amplifikation: Ziel- und Referenz-Sequenz-Replikation können unter Verwendung eines DNA Thermal Cycler (thermischer Zyklisierer) und eines Gene Amp Kits unter Verwendung von nativer Taq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus Corp., Norwalk, Conn.) durchgeführt werden.
Zur Amplifikation können 50 bis 100 ul der obigen Replikationszusammensetzung zu der ADRC-Testvertiefung, enthaltend die immobilisierte Zielsequenz, zugesetzt werden. Die Replikationszusammensetzung wird geschüttelt bzw. gerüttelt, um den Kontakt mit dem Träger sicherzustellen, und dann mit 75 ul Mineralöl überlagert (BDH Paraffinöl). Die Nukleinsäure-Sequenzen werden dann bei 94ºC für 1 bis 3 min denaturiert. Eine Gesamtzahl von 25 bis 10 Temperaturzyklen könnte unter den folgenden Bedingungen durchgeführt werden: Denaturierung bei 94ºC für 0,5 bis 1 min. Primeranlagerung bzw. -verschmelzung bei 37 bis 60ºC für 0,5 bis 1 min. DNA-Extension bei 72ºC für 1 bis 2 min.
Herstellung von N-hydrxysuccinimid-aktivierter Ziel-Nukleinsäure: Die Herstellung eines 5'-aktivierten Spacerarms kann durch Substituieren von Thymidinbasen in der Zielsequenz mit C5-Thymidin-Analogen, die mit einem C12-Spacer- Verbindungsarm substituiert sind, der in einem aktiven Ester endet, durchgeführt werden, wie dies von J. Ruth et al., Fed. Proc., 44 (5), 1622 (1985) beschrieben ist. Das C5-Amino-modifizierte Thymidinanaloge kann synthetisch in die Oligonukleotidsequenz unter Verwendung von konventioneller Phosphoramidit-Aktivierungschemie inkorporiert werden (Applied Biosystems; Foster City, CA, Modell 392 DNA Synthetisierer) und dann mit DSS (Disuccinimidylsuberat), Pierce, Rockford, IL, wie von Ruth et al., (1985) beschrieben, derivatisiert werden, um einen aktiven N-Hydroxysuccinimidester (NHS) zu bilden.

Herstellung von Antikörper/Nukleinsäure-Recorterkonjugat:

Eine Lösung des NHS-Oligonukleotids (0,5 uM Äquivalente) kann mit 0,25 uM Ziegen-Anti-Maus-IgG (Fab-Fragment spezi fisch) Antikörper (ICN) in einem 1 M NaHCO&sub3;-Puffer bei pH 9,0 gekoppelt werden. Die Reaktionsmischung wird dann für 2 h bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert. Das Antikörper- Reporterkonjugat wird von der freien Nukleinsäure und Antikörper unter Verwendung von Polyacrylamid (4 bis 7%) Gelelektrophorese unter nicht-denaturierenden Bedingungen (TBE Puffer) gereinigt. Das Konjugat wird durch Ausschneiden des Konjugatbands und Placieren desselben in eine gehemmte Econo-Säule ® (Bio-Rad), enthaltend Phosphatpuffer- Kochsalzlösung (pH 7,4), wie dies von G. H. Keller und Manak, M. M., in DNA Probes, (1989), Seiten 129-142, Stockton Press, New York, beschrieben wurde, eingebracht. Das Konjugat wird dann durch Zentrifugieren unter Verwendung eines vorgewaschenen Centricon® 10 (Amicon) Mikrokonzentrierers konzentriert.
Polystyrolküggelchen (etwa 1 bis 4 i Mikrosphärenküggelchen, PolySciences, Inc., Warrington, PA) werden mit Ziegen-Anti-Maus-IgG (Fc-Fragment spezifisch) Antikörper (Sigma Chemical, St. Louis, MO) in 0,1 Carbonatpuffer pH 9,6 beschichtet, um die Festphasen- Antikörpersupports bzw. -träger herzustellen. Nach Inkubieren über Nacht bei 4ºC wird die Antikörperlösung durch Zentrifugieren und Absaugen entfernt. Die Kügelchen werden mit einer Lösung von 2% Rinderserumalbumin (BSA), das in dem obigen Carbonatpuffer gelöst ist, blockiert. Die Kugeln werden dann von Überschußreagens freigewaschen, indem sie 3 Mal mit 10 mM Phosphatgepufferter (pH 7,4) Kochsalzlösung mit 0,05% Tween® (PBST) gewaschen werden und dann neuerlich in PBST resuspendiert werden. Die Verdünnungen von Maus-IgG (mIgG) werden durch Verdünnung in PBST-Lösung, enthaltend 1% BSA (BSA-PBST), durchgeführt.
Aliquote von Maus-IgG-Lösung werden zu Röhrchen, enthaltend die Mikrosphärenkügelchen, zugesetzt, um einen Bereich an Maus-IgG-Konzentrationen von 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 bis 10 ng/Röhrchen an mIgG zu erhalten. Eine Lösung (5 ul), enthaltend 0,01 ug/ml des Antikörper/Ziel- Reporterkonjugats, das zuvor beschrieben wurde, wird dann zugesetzt und die Testmischung wird für 1 h inkubiert. Überschußreagens wird dann durch Waschen der Mikrokügelchen mit dreimaligem Austauschen von PBST-Waschfluid entfernt.
Die Zielreplikation wird dann durch Zusetzen von 100 ul Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung zu den Testmikrosphärenkügelchen erreicht. Die Testlösungen werden gemischt, um den Kontakt mit dem Träger sicherzustellen, und dann mit 50 ul Mineralöl (BDH Parrafinöl) überlagert. Die Zielsequenz wird dann bei 94ºC für 1 bis 3 min denaturiert. Die Reaktionsmischungen werden thermisch unter Verwendung von einem DNA Thermal Cycler® (Perkin-Elmer Cetus Corp., Norwalk, Conn.) in Übereinstimmung mit den Instruktionen des Herstellers zyklisiert.
Die Messung der Testantwort in Zielsequenz-amplifizierten Vertiefungen könnte nach der Äquilibrierung mit der obigen Sequenzamplifikationszusammensetzung, die modifiziert wurde, um biotinylierte dATP und Fluorescein-markierte dCTP, wie oben beschrieben, zu enthalten, erreicht werden.
Zur Detektion der amplifizierten, Signal-bildenden Nukleinsäuren wird das Amplifikationsreaktionsfluid in jeder Vertiefung entfernt und auf Mikrotiterplattenvertiefungen transferiert, die mit Streptavidin wie folgt beschichtet werden: Polystyrol-EIA-Mikrotiterstreifen (NUNC) werden mit Streptavidin-Lösung (Sigma, St. Louis, MO), die in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,6 hergestellt ist, befüllt. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur (RT) kann die Lösung entfernt werden und die Streifen mit einer Lösung von 2% Rinderserumalbumin (BSA), das in dem obigen Carbonatpuffer gelöst ist, blockiert werden. Die Streifen können dann frei von überschüssigem Reagens gewaschen werden, indem sie dreimal mit PBST gewaschen werden. Die Testfluide werden dann in den Avidin-beschichteten Vertiefungen für 30 min inkubiert und dann frei von nicht gebundenem Target bzw. Ziel gewaschen. Die Vertiefungen werden dann mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) Kochsalzpuffer (PBS) befüllt und die Fluoreszenz in jeder Vertiefung wird gemessen.
Die Testantwort in diesem Beispiel wird aus dem Binden des Antikörper-Reporterkonjugats an die Oberfläche der Testvertiefungen resultieren. Die Zielsequenz, die in dem Reporterkonjugat enthalten ist, wird unter Verwendung der Replikationszusammensetzung, enthaltend biotinylierte Basen und Basen, die mit Fluorphor, wie zuvor beschrieben, markiert sind, repliziert. Die Inkorporation dieser Basen während der Sequenzreplikation resultiert in der Bildung von Nukleinsäuren, enthaltend sowohl biotinylierte als auch floureszierende Basen. Zur Detektion werden die Nukleinsäuren durch Aufnahme auf einen Avidin-Festphasenträger isoliert und könnten dann durch Messen der Signalnukleinsäure-Fluoreszenz detektiert werden. Die Testintensität würde im Verhältnis zu der Konzentration des Maus-IgG- Analyten in der Probe ansteigen.

Beispiel 2

Amplifizierte Analytdetektion in einem Maus-IgG-Test unter Verwendung der indirekten Zielabscheidungsmethode

Herstellung von Tyramin-Nukleinsäure-Substrat: Eine Lösung des NHS-Zieloligonukleotids (0,5 uM Äquivalente) kann mit 0,5 uM Tyramin (das aus Wasser rekristallisiert ist, Aldrich, Milwaukee, WI) in 2,5 ml Dimethylformamid durch Zusatz von 1,0 ml 1M Triethanolammoniumbicarbonat, pH 7,5, gekoppelt werden und dann auf 50ºC für 3 h erhitzt werden. Die Lösung kann dann auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit konzentriert werden und durch Rekristallisation aus Wasser oder durch HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasensäule in einem Perkin-Elmer Hochleistungs- Flüssigkeitschromatografen gereinigt werden.
Herstellung von Streptavidin-Nukleinsäure-Konjugat: Eine Lösung des NHS-Oligonukleotids (0,5 uM Äquivalente) könnte mit 0,25 mM Streptavidin (Sigma) in einem 1M NaHCO&sub3;-Puffer, pH 9,0, gekoppelt werden. Die Reaktionsmischung kann für 2 h bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert werden. Das Konjugat kann von freier Sequenz und Avidin unter Verwendung von Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-denaturierenden Bedingungen unter Verwendung eines TBE-Puffers, wie von M. S. Ureda, Methods in Enzymol., 146, 22 (1987) und M. S. Ureda et al., Nucleic Acids Res., 16, 4937 (1988) beschrieben, gereinigt werden.
Polystyrolmikroküggelchen (etwa 1 bis 4 i)) werden mit Ziegen-Anti-Maus-IgG (Fc-Fragment spezifisch) Antikörper in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,6 beschichtet. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wird die Antikörperlösung durch Zentrifugieren und Absaugen abgetrennt. Die Mikro kügelchen werden mit einer Lösung von 2% Rinderserumalbumin (BSA), das in dem obigen Carbonatpuffer gelöst ist, blockiert. Die Kügelchen werden dann frei von überschüssigem Reagens gewaschen, indem sie dreimal mit PBST gespült werden. Antigen-Verdünnungen von Maus-IgG werden in PBST, enthaltend 1% BSA (BSA-PBST), wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt und dann zu zwei Sätzen von Röhrchen, enthaltend die Kügelchen, zugesetzt. Die Kügelchen werden bei 37ºC für 1 h inkubiert, gefolgt von einem Waschen mit PBST. Ziegen-Anti-Maus-IgG-HRP (Boehringer Mannheim) wird, wie vom Hersteller gefordert, verdünnt und für 1 h bei 37ºC inkubiert. Überschüssiges Reagens wird dann durch Waschen und Absaugen dreimal mit PBST abgetrennt.
Eine Stammlösung von Biotin-Tyramin-Konjugat (1 mg/ml) in Dimethylsulfoxid wird dann wie oben beschrieben hergestellt. Kurz vor der Verwendung wird die Stammlösung in 0,1 M Boratpuffer pH 8,5, enthaltend 0,01% H&sub2;O&sub2;, verdünnt, um eine Substratlösung, enthaltend 10 ug/ml Biotin-Tyramin, herzustellen. Die Substratlösung wird dann zu beiden Sätzen der Testkügelchen zugesetzt und für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nicht umgesetztes Substrat wird dann entfernt und die Testkügelchen werden mit PBST bei 37ºC gewaschen.
Für einen Vergleich der Detektionsempfindlichkeit wird Streptavidin-alkalische Phosphatase (Sigma Co., St. Louis, MO), wie vom Hersteller empfohlen, verdünnt und zu einem Satz Testkügelchen als eine Bezugskontrolle zugesetzt. Für die Ziel-Nukleinsäure-Replikation wird Streptavidin-Zielsequenz-Konjugat (1 ug/ml) in PBST zu dem zweiten Satz von Kügelchen zugesetzt. Beide Sätze von Testkügelchen werden dann bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert und dreimal mit PBST gewaschen, um nicht-umgesetztes Konjugat zu entfernen.
Die Messung der Antwort in Referenz-Kontrollvertiefungen wird dann durch Zusatz von p-Nitrophenylphosphat-Lösung (1 mg/ml) in 10 mM Diethanolamin (pH 9,5) und 0,5 mM MgCl&sub2;- Puffer zu beiden Sätzen von Testkügelchen erreicht. Nach 15 min bei 37ºC wird die Farbentwicklung durch Zusatz von 50 ul 0,1 M ETA gestoppt und die optischen Dichten werden bei 405 nm in einem Mikrotiterplattenleser (Molecular Devices Corp., CA) gelesen.
Die Messung der Testantwort der Ziel-Nukleinsäure-amplifizierten Vertiefungen wird erreicht, indem zuerst der zweite Satz von Kügelchen mit der Replikationszusammensetzung, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, äquilibriert wird. Die Testmischungen werden geschüttelt, um den Kontakt mit den Kugelträgern sicherzustellen, und dann mit 75 ul Mineralöl (BDH Paraffinöl) überlagert. Die Zielsequenz wird bei 95ºC für 1 bis 3 min denaturiert. Die Reaktionsmischungen werden thermisch 30 Mal unter Verwendung eines DNA Thermal Cyclers gemäß den Instruktionen des Herstellers rezykliert. Zur Detektion der amplifizierten Ziel-Nukleinsäuren wird 1 ul einer Stammlösung aus 100 ml Ethidiumbromid (0,5 mg/ml) in einem Tris-Acetat-EDTA-Puffer (pH 8,1), enthaltend 40 mM Tris-Base, 2 mM Essigsäure, 0,2 mM EDTA, zu der überstehenden Lösung der Reaktion zugesetzt. Die Lösung wird dann mit kurzwelligem Licht bei 254 nm angeregt und die Fluoreszenz wird detektiert.
Die Testantwort in diesem Beispiel würde aus der ADRC-HRP- katalysierten Abscheidung von Biotin/Tyramin-Reporter auf der Testkugeloberfläche, gefolgt von dem nachfolgenden Binden des Streptavidin-Signal-bildenden Sequenzziels resultieren. Das Ziel wird dann unter Verwendung von Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung, wie in Beispiel 1 beschrieben, amplifiziert und die resultierenden Nukleinsäure-Produkte werden durch Farbabstufung detektiert. Die Testintensität würde proportional zu der Konzentration von Maus-IgG in Proben ansteigen und könnte bei mIgG-Konzentration detektiert werden, welche unter jener liegt, die mit einem nicht-amplifizierten ADRC-AP-Reporter detektierbar ist.

Beispiel 3

Amplifizierte Analytdetektion in einem Maus-IgG-Test unter Verwendung von katalysierter, direkter Zielabscheidungsmethode

Polystyrolmikroküggelchen (1-4 i)) werden mit Ziegen-Anti- Maus-IgG (Fc-Fragment spezifisch) Antikörper 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,6 beschichtet. Nach Inkubieren übber Nacht bei Raumtemperatur (RT) wird die Antikörperlösung entfernt und die Streifen mit einer Lösung von 2% Rinderserumalbumin (BSA), das in dem obigen Carbonatpuffer gelöst ist, blockiert. Die Kugeln werden dann frei von überschüssigen Reagentien gewaschen, indem sie dreimal mit 10 inH Phosphatgepufferter (pH 7,4) Kochsalzlösung, enthaltend 0,05% Tween® 20 (PBST), gespült werden. Antigen-Verdünnungen von Maus-IgG (mIgG), gelöst in einer Lösung von PBST, enthaltend 1% BSA (BSA-PBST), werden dann zu den Kügel chen, wie in Beispiel 1 beschrieben, zugesetzt. Die Kügelchen werden dann bei 37ºC für 1 h inkubiert, gefolgt von einem dreimaligen Waschen mit PBST und mit Ziegen-Anti- Maus-IgG-HRP, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt.
Zur katalysierten Reporterabscheidung wird eine Stammlösung aus Tyramin-Gen-Zielsubstrat (1 mg/ml) in Dimethylsulfoxid hergestellt. Kurz vor der Verwendung wird die Stammlösung in 0,1 M Boratpuffer pH 8,5, enthaltend 0,01% H&sub2;O&sub2; verdünnt, um eine Substratlösung, enthaltend Tyraminsequenz-Zielsubstrat (10 ug/ml) herzustellen. Die Substratlösungen werden dann zu den Testkugeln zugesetzt und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionsmischung wird dann entfernt und die Testvertiefungen werden mit PBST bei 37ºC gewaschen.
Die Messung der Testantwort in den Sequenz-amplifizierten Vertiefungen wird nach Äquilibrierung von jedem Satz von Testkugeln mit der obigen Sequenzreplikationszusammensetzung, die modifiziert ist, um biotinylierte und Fluorescein-markierte Nukleotide, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, zu enthalten, erreicht. Die Testlösungen werden gemischt, um den Kontakt mit dem Träger sicherzustellen, und mit 75 ul Mineralöl (BDH Paraffinöl) überlagert. Die Zielsequenz wird dann bei 95ºC für 1 bis 3 min denaturiert und dann werden die Reaktionsmischungen thermisch 30 Mal unter Verwendung eines DNA Thermal Cyclers ® gemäß den Instruktionen des Herstellers rezykliert.
Zur Detektion der amplifizierten, Signal-bildenden Nukleinsäuren wird das Replikationsreaktionsfluid in jedem Satz von Testkügelchen-Vertiefungen entfernt und auf Vertie fungen von Mikrotiterplatten, welche mit Streptavidin wie folgt beschichtet sind, transferiert: Polystyrol-EIA-Mikrotiterplattenvertiefungen sind mit Streptavidin-Lösung (Sigma), die in 0,1 M Carbonat-Puffer pH 9,6 hergestellt ist, befüllt. Nach Inkubation bei Raumtemperatur (RT) über Nacht wird die Streptavidin-Lösung von jeder Vertiefung entfernt und die Mikrotiterplatten werden mit einer Lösung von 2% Rinderserumalbumin (BSA), das in dem obigen Carbonat-Puffer gelöst ist, blockiert. Die Vertiefungen werden dann frei von überschüssigen Reagentien gewaschen, indem sie dreimal mit einer 10 mM Phosphat-gepufferten (pH 7,4) Kochsalzlösung, enthaltend 0,05% Tween® 20 (PBST), gespült werden. Sobald sie hergestellt wurden, werden die obigen Testfluids dann transferiert und in den Avidin-beschichteten Vertiefungen für 30 min inkubiert und dann frei von nicht gebundenen Zielreplikationsreagentien gewaschen. Die Vertiefungen werden dann mit PBS-Puffer gefüllt und die Fluoreszenz in jeder Vertiefung wird gemessen.
Die Testantwort in diesem Beispiel würde aus der ADRC-HRP- katalysierten Abscheidung von Tyraminsequenz-Zielreportern auf der Testkugeloberfläche resultieren. Die immobilisierte Ziel-Nukleinsäure wird dann unter Verwendung von Sequenzreplikationszusammensetzung, enthaltend biotinylierte Basen und Basen, die mit einem Fluorophor markiert sind, amplifiziert. Die Inkorporation dieser Basen während der Sequenzreplikation würde in Nukleinsäuren resultieren, die sowohl Biotin- als auch Fluoreszenz-markierte Basen enthalten. Zur Detektion werden die Nukleinsäuren durch Fangen auf einem Avidin-Festphasenträger isoliert und dann durch Messen der Nukleinsäure-Fluoreszenz detektiert. Die Fluoreszenzintensität steigt mit der Konzentration an Maus- IgG-Analyten in der Probe an.

Beispiel 4

Detektion und Quantifizierung von Maus-IgG unter Verwendung eines internen Referenzbezugstests

Herstellung von Biotin-, Isotop- und Fluoreszenz-markierten Basen:

Die Ziel- oder Referenz-Sequenzen und Primersequenzen können designt sein, um die Inkorporierung von Biotin-, Isotop- und (oder) Fluoreszenz-markierten Basen oder Primern zu ermöglichen. Auf diese Weise kann das Sequenzreplikationsverfahren Nukleinsäure-Stränge produzieren, die Mittel sowohl für die Aufnahme als auch die Detektion zur Verfügung stellen. Beispielsweise könnte entweder die Ziel- Nukleinsäure oder eine Referenz-Sequenz mit den folgenden Basen hergestellt werden:
Referenznukleinsäure/Primer-Bindungsstellen:
Primer 1 (Aufnahme):
5' Biotin - ATG CGT AGC AGC TTT AC 3' SEQ ID Nr.: 5
Primer 5 (Reporter)
3' AT CAT CTT TGT CGA CTG - Fluorophor (Flu) 5' SEQ ID Nr.: 13
Zielsequenz/Primer-Bindungsstellen:
5' ATG CGT AGC AGC TTT ACC GCA GAG ATC ATG CCT ATG TAC CAT GCT 3' 3' TAC GCA TCG TCG AAA TGG CGT CTC TAG TAC GGA TAC ATG GTA CGA 5' Biotin-ATG CGT AGC AGC TTT AC 3' SEQ ID Nr.: 5
3' AT CAT CTT TGT CGA CTG - Flu 5' SQ ID Nr.: 13 5' ATC CTA CCT GTA ATA GTA GAA ACA GCT GAC 3' SEQ ID Nr.: 7 3' TAG GAT GGA CAT TAT CAT CTT TGT CGA CTG 5' SEQ ID Nr.: 8
Alternativ könnten Sequenzen so designt sein, daß die Positionen der Fluoreszenz-markierten Basen in geeigneter, räumlicher Ausrichtung vorliegen, um effizient Energie zwischen Fluorophoren zu transferieren.
Polystyrol-Mikroküggelchen (1-4 i Durchmesser) werden mit Ziegen-Anti-Maus-IgG (Fc-Fragment spezifisch) Antikörper (ICN) in 0,1 Carbonatpuffer pH 9,6 beschichtet. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wird die IgG-Lösung entfernt und die Kügelchen mit einer Lösung von 2% Rinderserumalbumin (BSA), das in dem obigen Carbonatpuffer gelöst ist, blockiert. Die Kügelchen werden dann frei von überschüssigem Reagens gewaschen, indem sie dreimal mit 10 mM PBST gespült werden. Zur Kalibrierung wird eine Standardkurve gebildet, indem die Testantwort aus einer Serie von Proben, enthaltend bekannte Konzentrationen an Maus-IgG (mIgG), bestimmt wird. Um die Standardlösungen herzustellen, werden Verdünnungen von mIgG durch Lösen von mIgG in PBST-Lösung, enthaltend 1% BSA (BSA-PBST) hergestellt. Jeder Standard wird zu derselben Menge an Testkugeln zugesetzt. Auf diese Weise können Proben, enthaltend einen Bereich an Maus-IgG-Konzentration von 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 bis 10 ng/Röhrchen mIgG hergestellt werden. Eine Testprobe, enthaltend eine unbekannte Konzentration an mIgG wird auch einem gesonderten Satz an Kugeln zugesetzt.
Die Röhrchen, enthaltend sowohl den Test als auch Standardkügelchen, werden dann mit 10 ul einer Lösung (0,1 ug/ml) des obigen Anti-mIgG-Antikörper/Zielreporterkonjugats inkubiert. Überschüssige Reagentien werden dann durch Waschen mit PBST entfernt.
Amplifikation der Ziel-Nukleinsäure sowohl an dem Antikörper-Zielreporterkonjugat als auch einer Referenz-Sequenz wird durch Zusatz zu den Testvertiefungen von 100 ul einer Replikationszusammensetzung, welche auch Replikationskontrolle bei geeigneter Sequenz und Primerkonzentrationen enthält, erreicht. Die Testlösungen werden gemischt, um den Kontakt mit dem Träger sicherzustellen und dann mit 50 ul Mineralöl (BDH Paraffinöl) überlagert. Das Ziel und die Referenz-Sequenzen können dann bei 94ºC für 1 bis 3 min denaturiert werden und die Reaktionsmischungen werden thermisch 30 Mal unter Verwendung eines DNA-Thermal Cyclers ® gemäß den Instruktionen des Herstellers, wie in Beispiel 1 beschrieben, rezykliert.
In diesem Beispiel ist der Aufnahmeprimer #1 für sowohl das Ziel als auch die Referenznukleinsäure ident und wird so hergestellt, daß biotinyliertes dUTP an dem 5'-Ende des Primerstrangs enthalten ist. Die Reporterprimer (#2) für zwei verschiedene Ziele werden zwei unterschiedliche Sequenzen enthalten, eine, die spezifisch für die Ziel-Nukleinsäure ist, und eine spezifisch für die Referenznukleinsäure. Jede Primersequenz ist komplementär zu dem Antisense-Strang und seinem entsprechenden Ziel. Sowohl der Reporterprimer als auch der Referenzprimer können an ihrem 5'-Ende mit aminomodifizierendem Phosphoramiditreagens während ihrer Synthese aus einem automatisierten DNA-Synthetisierer Amino-modifiziert werden. Der Amino-modifizierte Reporterprimer kann mit einem Fluorescein-NHS-Ester, der das 5'-Ende des Primers mit Fluorescein markiert, umgesetzt werden. Der Amino-modifizierte Referenzprimer kann mit einem Rhodaminfluorophor-NHS-Ester unter Verwendung derselben Chemie markiert werden.
Zur Detektion der amplifizierten Nukleinsäuren wird das Amplifikationsreaktionsfluid in jeder Testvertiefung entfernt und auf Mikrotiterplattenvertiefungen transferiert, die zuvor mit Streptavidin wie folgt beschichtet wurden: Polystyrol-EIA-Mikrotiter-Streifen (NUNC) werden mit Streptavidin-Lösung (Sigma, St. Louis, MO), die in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,6 hergestellt wurden, befüllt. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur werden die Streptavidin-Lösungen entfernt und die Streifen mit einer Lösung aus 2% Rinderserumalbumin (BSA), das in dem obigen Carbonatpuffer gelöst ist, blockiert. Die Streifen können dann frei von überschüssigem Reagens gewaschen werden, indem sie dreimal mit einer 10 mM Phosphat-gepufferten (pH 7,4) Kochsalzlösung, enthaltend 0,05% Tween® 20 (PBST) gewaschen werden. Die aus den obigen Nukleinsäure-Replikationen resultierenden Testfluids werden dann in den Streptavidin-beschichteten Vertiefungen für 60 min inku biert und dann frei von nicht gebundenen Signal-Nukleinsäure-Produkten und -Reagentien gewaschen. Die Rhodamin- und Fluorescein-Fluoreszenz in jeder Vertiefung wird sowohl für die Standard- als auch die Testprobe gemessen und das Verhältnis von Rhodamin- zu Fluorescein-Fluoreszenz in den Standardproben und Testproben wird aufgezeichnet. Die Fluorescein-Antwort in der Testprobe wird dann korrigiert, basierend auf der durchschnittlichen Rhodamin : Fluorescein- Antwort, die in den Standardproben bestimmt wurde. Die korrigierte Fluorescein-Antwort wird dann verwendet, um die mIgG-Konzentration durch Interpolation der Fluorescein- Antwort, die in den mIgG-Standardvertiefungen gemessen wurde, zu bestimmen. Die Fluorescein-Intensität in den Testproben wird porportional zu der Konzentration von Maus- IgG-Analyten in der Probe ansteigen.

Beispiel 5

Herstellung eines 75 Basen Oligonukleotid-Reporter-Antikörper-Konjugats unter Verwendung von hetero-bifunktioneller Vernetzungschemie zur Verwendung in der direkten Zielabscheidungsmethode

Oligonukleotidsynthese oder -herstellungen:

Das 75 Basen aufweisende Oligonukleotid, das als ein Nukleinsäure-Reporter (Ziel) verwendet wurde, wurde an dem 5'- Ende Amino-modifiziert, d. h. eine primäre Amingruppe wurde an dem 5'-Ende des Oligonukleotidtargets eingeführt. Die primäre Amingruppe wurde später in der NHS-hetereo-bifunktionellen Chemie verwendet, um das DNA-Target an den Test-Antikörper (Ab) zu binden. Die Aminomodifikation wurde unter Verwendung der CE-Phosphoramidit-Chemie während der Synthese des Ziels auf einem automatisierten DNA- Synthetisierer durchgeführt (Smith, L. M., S. Fung, M. W. Hunkapiller und L. E. Hood (1985) Nucleic Acids Res. 13:2399-2412; Sproat, B. S., B. Beijer und P. Rider (1987) Nucleic Acids Res. 15 : 6181-6196). Animolink 2TM (Applied Biosystems), ein Amino-modifizierendes Phosphoramidit-Reagens, wurde während dem letzten Phosphoramidit-Kopplungszyklus der Oligonukleotidsynthese zugefüggt.
Die folgenden Ziel-Primersequenzen wurden designt und synthetisiert, um als die Zielsequenz in dem Konjugatreporter verwendet zu werden.
Zielsequenz (75mer) für Doppel-Primerkonjugat-Reportersystem:
5'X-GGC AGG AAG ACA AAC ACT GGC TGG TCT GTG GTG CTG TGC TTG TTC CCC TGT ..CT AGT ATT GTT TTC TGG GTT GGT 3' SEQ ID Nr.: 9
(X = Aminolink 2TM Amino-modifizierer)
Primer 3 (3'-Primer für das 75mer) (17mer) Sequenz:
5'ACC AAC CCA GAA AAC AA 3' SEQ ID Nr.: 10
Die Primer-Bindungsstelle für den Primer 3 (3' -Primer für das 75mer) ist unten angegeben:
5'X-GGC AGG AAG ACA AAC ACT GGC TGG TCT GTG GTG CTG TGC TTG TTC CCC TGT ..CCT AGT ATT GTT TTC TGG GTT GGT 3' SEQ ID Nr.: 9 3' AA CAA AAG ACC CAA CCA 5' SEQ ID Nr.: 10
Die unterstrichene Sequenz ist die komplementäre Sequenz des Primers 3 oder die "3'-Primer-Bindungsstelle".
Der doppelsträngige 75mer-Reporter, der aus der Primerextension produziert wurde (Replikation), ist unten angegeben:
5'X-GGC AGG AAG ACA AAC ACT GGC TGG TCT GTG GTG CTG TGC TTG TTC CCC TGT 3' CCG TCC TTC TGT TTG TGA CCG ACC AGA CAC CAC GAC ACG AAC AAG GGG ACA
..CCT AGT ATT GTT TTC TGG GTT GGT 3' SEQ ID Nr.: 9 ..GGA TCA TAA CAA AAG ACC CAA CCA 5' SEQ ID Nr.: 11
Primer 4 (5'-Primer des 75mer) (16mer) Primer-Bindungsstelle ist unten angegeben:
5'X-GGC AGG AAG ACA AAC ACT GGC TGG TCT GTG GTG CTG TGC TTG TTC CCC TGT 3' CCG TCC TTC TGT TTG TGA CCG ACC AGA CAC CAC GAC ACG AAC AAG GGG ACA 5' GGC AGG AAG ACA AAC A 3' SEQ ID Nr.: 12
..CCT AGT ATT GTT TTC TGG GTT GGT 3' SEQ ID Nr.: 9 ..GGA TCA TAA CAA AAG ACC CAA CCA 5' SEQ ID Nr.: 11
Die unterstrichene Sequenz ist die komplementäre Sequenz des Primers 4 oder die "5'-Primer-Bindungsstelle".
Die rohen Ziel- und Primeroligonukleotide wurden in bezug auf vollständig lange Produkte und Fehler-Sequenzen mittels 8% Polyacrylamid/8,3 M Harnstoffgel (denaturierende) Elektrophorese (Sanger, F. und A. R. Coulson. 1978. FEBS Lett. 87 : 107) und Standard-Autoradiografie analysiert. Die Oligonukleotide waren radiomarkiert an dem 3-Ende mit [ 8³²P] Cordycepin 5'-triphosphat (5000 Ci/mMol) unter Verwendung von terminaler Deoxynukleotidyltransferase (TdT) Dies wurde durch Zusetzen von 100 ng des Oligonukleotids zu 10 ul Reaktionslösung, enthaltend 100 mM Cacodylat, pH 6,8, 1 mMCoCl&sub2;, 0,1 mM DTT, 100 igg/ml BSA und 10 Einheiten TdT durchgefühhrt. Die Reaktion wurde bei 37ºCC für 30 min inkubiert. Ein Aliquot, 2 ul, der markierten Oligonukleotide wurde zu 6 ul einer Beladungslösung (90% Formamid, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylolcyanol FF) zugesetzt, gemischt und erhitzt (90ºC für 1 min) und auf ein 8%-iges Polyacrylamid/8,3 M Harnstoffgel (40 · 30 · 0,04 cm) in 1X TBE-Puffer (8,9 mM Tris-borat, pH 8,2, 2mM EDTA) geladen. Die Elektrophorese wurde durch Anlegen von 55 W (oder 1,35 W/cm) an das Gel für 2,5 h oder bis das Bromphenolblau zu dem Boden des Gels läuft, durchgeführt. Das Gel wurde auf ein Stück Whatman® 3 mm Papier (Whatman International, Ltd., Maidstone, England) transferiert und auf einem Modell 583 Geltrockner (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) bei 80 ºC für 1 h getrocknet. Das getrocknete Gel und der Röntgenfilm (Kodak® Xomat® AR 2) wurden in eine Röntgenkassette, enthaltend einen intensivierenden Schirm (Du Pont Cronex® Lighting Plus TM, Du Pont Co., Wilmington, DE) placiert und der Film wurde für eine geeignete Zeit belichtet, um ein autoradiografisches Bild zu erhalten.

Synthese des Reporterkonjugats:

Das Grundprinzip für die Strategie, die zum Synthetisieren des Reporterkonjugats verwendet wird, ist dasselbe, wie das in der Beschreibung ausgeführt ist. Das Protokoll umfaßt zuerst das Koppeln einer Sulfhydrylgruppe an das 75 Basen aufweisende, Amino-modifizierte Oligonukleotid unter Verwendung des SATA-Reagens, gefolgt von der Addition einer Maleimidgruppe an den Ziegen-Antikörper unter Verwendung des SMCC-Reagens und schließlich das Verbinden des SATAmodifizierten, 75 Basen aufweisenden Oligonukleotids an den Maleimid-modifizierten Ziegen-Antikörper.

Koppeln einer Sulfhydrylgruppe an das 75-basige, Aminomodifizierte Oligonukleotid:

Das 75-basige, Amino-modifizierte Oligonukleotid, 1,4 mg (60 nM), wurde zu 667 ul Reaktionsmischung, enthaltend 100 mM Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,0, 13,3 mg SATA (N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat), 50% Dimethylformamid (DMF), zugefügt. Das SATA-Reagens wurde durch Lösen von 20 mg in 500 ul DMF hergestellt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei 25ºC laufen gelassen und dann unmittelbar auf eine Sephadex® G-25 Säule (Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden), 1 · 20 cm, aufgegeben und bei Raumtemperatur mit 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, mit einer Flußrate von 1 ml/min eluiert. Die Fraktionen wurden durch die Absorption bei 280 nm (Pharmacia LKB #2138 Unvicord® S Monitor) beobachtet und auf einem Pharmacia-Modell Frac 100 Fraktionssammler gesammelt. Die ersten Spitzen- bzw. Peakfraktionen (1,0 ml), die die SATA-modifizierten Oligonukleotide enthalten, wurden gesammelt und auf ungefähr 1 ml unter Verwendung eines Amicon Centricon® 3 Konzentrators (Amicon, W. R. Grace & Co., Danvers, MA) konzentriert. Der Centricon® 3 s wurde in einem SM24-Rotor (Du Pont Sorvall, Newtown, CT) angeordnet und in einer Du Pont Sorval® RC5B gekühlten Supergeschwindigkeitszentrifuge, @7500 U/min (7000 · g), für 45 min bei 20ºC zentrifugiert. Die Proben wurden gesammelt, in einen anderen Satz von Centricon® 3 s gegeben und neuerlich für 45 min zentrifugiert, unter Verwendung desselben Zentrifugen-protokolls. Das SATA-modifizierte Oligonukleotidkonzentrat (etwa 1 ml) wurde unter Verwendung des Protokolls, das von dem Hersteller vorgeschlagen wurde (Amicon) rückgewonnen und bei 20ºC im Dunklen gelagert, bis es für das abschließende DNA-Ab-Kopplungsprotokoll benötigt wurde.

Koppeln von Maleimidgruppen an den Ziegen-Antikörper:

Der in dem Reporterkonjugat verwendete Reporter-Antikörper (AffiniPure® Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, H+L, 1,5 mg/ml), 3 mg, wurde zu einer 2,7 ml Reaktionsmischung, enthaltend 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 2 mg SMCC, 1,5% Dimethylformamid (DMF), zugesetzt. Das SMCC wurde durch Lösen von 5 mg in 84 ul DMF (60 mg/ml) hergestellt. Diese Reaktion wurde 75 min. nachdem das 75 Basen aufweisende, Amino-modifizierte Oligonukleotid mit dem SATA-Reagens umgesetzt wurde, gestartet. Die Reaktionsmischung wurde für 30 min bei 25ºC laufen gelassen und dann unmittelbar auf eine Sephadex® G-25 Säule, 1 · 20 cm, aufgegeben und bei Raumtemperatur mit 100 mM Natriumphosphat, pH 6,5, mit einer Flußrate von 1 ml/min eluiert. Die Fraktionen wurden durch die Absorption bei 280 nm beobachtet und auf einem Pharmacia-Modell Frac 100 Fraktionssammler gesammelt. Die ersten Peak-Fraktionen (1,0 ml), enthaltend den SMCC-modifizierten (Maleimid-modifizierten) Ziegen-Antikörper, wurden in einem Röhrchen (4-6 ml) gesammelt. Das Reaktionsprodukt war bereit für das Koppeln an die SATA-modifizierten Oligonukleotide.

Koppeln der SATA-modifizierten Oligonukleotide an die Ziegen-Maleimid-modifizierten Antikörper:

Die gesammelten, Maleimid-modifizierten Antikörper-Fraktionen (5 ml) wurden einem 15 ml Falcon® 2059 Röhrchen (Becton and Dickinson and Co., Lincoln Park, NJ) zugesetzt. Das konzentrierte, 75 Basen aufweisende, SATA-modifizierte Oligonukleotid (etwa 1 ml) wurde demselben Reaktionsröhrchen zugesetzt und gut mit dem Maleimid-modifizierten Ziegen-Antikörper vermischt. Die Kopplungsreaktion wurde durch Zusetzen von 75 ul 1 M Hydroxylamin (HA) (Pierce, Rockford, IL), pH 7,0, 50 mM EDTA gestartet und gut vermischt. Die Reaktion wurde auf einen Amicon-Modell 3 Mini- Cell (6 ml gerührte Zelle) Konzentrator aufgegeben, der mit einem YM5-Filter (Amicon) ausgestattet war. Die MiniCell war an eine Heliumquelle gebunden, die auf 60 psi eingestellt war, und auf einem Magnetrührer angeordnet war. Die Reaktion wurde laufen gelassen, während die Reaktions hauptkomponenten (modifizertes Abs, modifizierte Oligonukleotide und neugebildetes DNA/Ab-Konjugat) bei Raumtemperatur mit einer Aluminiumfolie abgedeckt konzentriert wurden. Das Reaktionsvolumen wurde auf etwa 1,0 ml (60 min) reduziert. Die Reaktion wurde aus der MiniCell entfernt und in eine Wheaton® 224812, 4 ml Bernsteinphiole (Wheaton, Millville, NJ) transferiert und bei Raumtemperatur auf einem Lab Quake® (Labindustries, Inc., Berkeley, CA) inkubiert und rotiert, bis die Gesamtreaktionszeit 2 h erreichte. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 10 ul 10 mM N-Ethylmaleimid in DMF beendet.

Isolation der Oligonukleotid-Antikörper-Konjugate von der modifizierten Oligonukleotidkomponente:

Das 75-basige Oligonukleotid-Ziegen-Antikörper-Konjugat (das Reporterkonjugat oder das Oligonukleotid-Antikörper- Konjugat) und die Antikörper-Reaktionskomponenten wurden von den Oligonukleotidkomponenten durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) entfernt. Dies wurde unter Verwendung einer Zorbax® 250 Gelausschließungssäule (9,4 · 250 mm, mit 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, und einer Säulenflußrate von 1 ml/min), die an einen Waters® 600 E Systemsteurer und an einen Waters® 991 Fotodioden-Felddetektor gebunden waren, durchgeführt. Injektionen (200 ul) wurden mit einem Waters® 700 Satellite WISP - automatisierten Injektionssystem - durchgeführt. Die ersten Peak- Fraktionen (0,5 ml) resultieren in einer Mischung des Oligonukleotid-Antikörper-Konjugats und der Maleimid-modifizierten Antikörper-Reaktionskomponente.
Die Fraktionen wurden weiters in bezug auf das Oligonukleotid-Antikörper-Konjugat durch Gelelektrophorese und Standard-Autoradiografie analysiert. Das Konjugat-gebundene Oligonukleotid war an dem 3' -Ende mit einem [ e³²P] Cordycepin 5'-Triphosphat (5000 Ci/mMol) unter Verwendung von TdT radiomarkiert. Dies wurde durch Zusetzen von 2 ul der HPLC-isolierten Fraktion zu einer 10 ul Reaktionslösung, enthaltend 100 mM Cacodylat, pH 6,8, 1 mM CoCl&sub2;, 0,1 mM DTT, 10 igg/ml BSA, 10 Einheiten TdT und 1 iCCi von [ i³²P] Cordycepin 5'-Triphosphat durchgefühhrt. Die Reaktion wurde bei 37ºCC für 30 min inkubiert. Die Proben wurden dann auf einer Standard-Natriumdodecylsulphat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE; Laemmli, U. K. 1970 Nature 227: 680-685) und Standard-DNA-denaturierenden Polyacrylamidgelen (Harnstoff) (Sanger, F. und A. R. Coulson, 1978, FEBS Lett. 87 : 107) analysiert.
Ein Aliquot, 4 ul, der markierten Produkte wurde zu 12 ul Proteingel-Ladungspuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10 % Glycerin, 0,01% Bromphenolblau) zugesetzt. Die Proben wurden auf ein SDS-PAGE-Proteingel (8% Polyacrylamid- Trennungsgel (15 · 15 · 0,075 cm), 375 mM Tris, pH 8,8, 0,5 % SDS; 4% Polyacrylamid-Stapelgel, 0,12 M Tris, pH 6,8, 1 % SDS; in Laemmli-Laufpuffer, 0,25 mM Tris.HCl, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,3) geladen. Die Elektrophorese wurde bei 100 V (6,7 V/cm) gestartet und auf 225 V (15 V/cm), nachdem die Probe durch das Stapelgel bewegt war, erhöht. Die Elektrophorese wurde fortgesetzt, bis die Farbstofffront etwa 13 bis 14 cm durchwandert hat.
Ein zweites Aliquot von 2 ul wurde zu 6 ul einer Ladungslösung (90% Formamid, 0,05% Bromphenolblau und 0,05% Xylolcyanol FF) zugesetzt, gemischt und auf ein 8% Polyacrylamid/8,3 M Harnstoffgel (40 · 30 · 0,4 cm) in 1X TBE- Puffer (8, 9 mM Tris-Borat, pH 8,2, 2 mM EDTA) geladen. Die Gelelektrophorese wurde durch Anlegen von 55 W (oder 1,35 W/cm) auf das Gel durchgeführt, bis das Bromphenolblau am Boden des Gels auslief.
Zur Autoradiografie wurden sowohl das SDS-PAGE-Proteingel als auch das DNA-denaturierende PAGE-Gel auf ein Stück Whatman® 3MM Papier transferiert und auf einem Bio-Rad- Modell 583 Geltrockner bei 80ºC für 1 h getrocknet. Das getrocknete Gel und der Röntgenfilm (Kodak® Xomat® AR 2) wurden in einer Röntgenkassette placiert, enthaltend einen intensivierenden Schirm (Du Pont Cronex® Lighting PlusTM)) und der Film wurde für einen ausreichenden Zeitraum belichtet, um ein autoradiografisches Bild zu erhalten.
Die spektrofotometrischen Aufnahmen der HPLC-Fraktion und der erhaltenen Daten aus den oben beschriebenen, Autoradiografie-Verfahren wurden verwendet, um die in den Oligonukleotid-Antikörper-Konjugat enthaltenen HPLC-Fraktionen, die frei von dem 75-basigen SATA-modifizierten Oligonukleotidvorläufer sind, zu bestimmen. Die Peak-Fraktionen wurden gesammelt und bei 4ºC gelagert.

Beispiel 6

Amplifikation eines Kaninchen-IgG-Tests unter Verwendung des direkten Zielabscheidungsverfahrens

Herstellung von immobilisiertem Aufnahmereagens für die Immunotests:

Das immobilisierte Aufnahmereagens (Testkügelchen) wurde durch Zusatz von 100 mg Glycidylmethacrylat-Küggelchen (Ox iranacryl-Küggelchen 30 i)) zu einer 500 ul Lösung des Aufnahme-Antikörpers, Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (0,5 mg) (AffiniPure® Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, H+L, 1,5 mg/ml) in PBS-Puffer hergestellt. Die Testkügelchen wurden durch Rotation für 20 h bei 4ºC inkubiert. Der überschüssige Ziegen-Antikörper wurde durch Zentrifugieren und Belüften abgetrennt. Die Testkugeln wurden dann mit Rinderserumalbumin (BSA) vorbehandelt, um die nicht-umgesetzten Epoxidgruppen zu beruhigen. Die Testkugeln wurden mit einer 1 mg/ml Lösung BSA in PBS-Puffer (10 mM Phosphat-gepufferte (pH 7,4) Kochsalzlösung) für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Testkugeln wurden mit Wasser gewaschen, um BSA zu entfernen, dann viermal mit PBS-Puffer gewaschen und schließllich in 1,0 ml PBS-Puffer (0,1 ml/ill), enthaltend 0,02% Azid, resuspendiert.

Die Immunreaktivität und das Immunotestverfahren des immobilisierten Aufnahmereagens:

Die Immunreaktivität der Testkugeln wird in zwei Replikaten durch Zusetzen von 0,5 mg der Testkugeln zu 250 ul Tris- Probepuffer (TSB) (50 mM Tris. HCl, 75 mM Natriumchlorid, 0,1% Poly-Tergent SLF-18, 0,1% BSA und 0,02% Azid) in 500 ul "Eppendorf"-Röhrchen (Eppendorf®, Brinkmann Instruments Co., Westbury, NY) getestet. Um Röhrchen, die das Testantigen aufnehmen, zu testen, wurde Kaninchen-IgG (gereinigtes Kaninchen-IgG), 20 ul der Stammlösung, 0,1 g/l, zugesetzt und die Lösungen wurden bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Zu den Kontroll-Teströhrchen (Testkügelchen ohne zugesetztes Antigen) wurden 20 ul TSB-Puffer zugesetzt und die Lösungen wurden bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Die Testkugeln wurden durch Zentrifugieren pelletiert und die überstehenden Lösungen wurden durch Absaugen entfernt. Jeder Test wurde dreimal mit TSB-Puffer gewaschen. Jeder Test wurde dann bei Raumtemperatur mit 50 ul des Ziegen-Anti-R-IgG-alkalischen Phosphatase-Konjugats (Sigma Produkt Nr. A-8025) Stammlösung in einem Endreaktionsvolumen von 250 ul für 1 h inkubiert. Das Konjugatreagens wurde durch Zentrifugieren und Belüften entfernt und dann wurde jeder Test viermal mit TSB-Puffer gewaschen. Das BCIP-Reagens (Bromchlorindoylphosphat: Sigma Produkt Nr. 710-3) (20 ul) wurde dann zu jedem Röhrchen zugesetzt und bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Die in dem Test entwickelte Farbe (blaugrün) wurde gelesen, um den Grad der Immunoaktivität zu bestimmen.

Bestimmung der Reporterkonjugat-Immunoaktivität und des Immuntest-Signals auf Geräuschantwort:

Das Oligonukleotid-Antikörper-Konjugat (75 Basen Zieloligonukleotid, das an das Ziegen-Anti-R-IgG konjugiert ist) war an dem 3' -Ende mit [ p³²P] Cordycepin 5' -Triphosphat (5000 uCl/mMol) unter Verwendung von TdT radiomarkiert. Dies wurde durch Zusetzen von 10 ul der gesammelten HPLC- Peakfraktionen des Oligonukleotid-Antikörperkonjugats zu 20 ul Reaktionslösung, enthaltend 100 mM Cacodylat, pH 6,8, 1 mM CoCl&sub2;, 0,1 mM DTT, 100 igg/ml BSA, 30 Einheiten TdT und 20 mci [ /³²P] Cordycepin 5'-Triphosphat durchgefühhrt. Die Reaktion wurde bei 37ºCC für 30 min inkubiert. 10 ill des markierten Oligonukleotid-Antikörperkonjugats wurden zu 50 ul "kaltem" Konjugat zugesetzt. Serienverdünnnungen von 5 ul bis zu 0,005 ul hinunter des Oligonukleotid-Antikörperkonjugats wurden in bezug auf die Immunoreaktivität getestet. Für jede zu untersuchende Verdünnung wurden zwei Testreplikate durch Zusetzen von 0,5 mg Testkugeln zu 250 ul TSB-Puffer in 500 ul "Eppendorf"-Röhrchen angesetzt. Zu Teströhren, die das Testantigen aufnehmen, Kaninchen-IgG (gereinigtes Kaninchen-IgG: Sigma, N I-5006), 20 ul der Stammlösung (105 igg/ml) waren zugesetzt und die Lösungen wurden bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Zwei Kontrollversuchstests (Testkugeln ohne zugesetztes Antigen) wurden für jede Konjugatverdünnung hergestellt. Zu jedem Vergleichstest wurden 20 ul TSB-Puffer zugesetzt und die Lösungen wurden bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Die Testkugeln wurden durch Zentrifugieren pelletisiert und die überstehenden Lösungen wurden durch Ansaugen entfernt. Jeder Test wurde dreimal mit TSB-Puffer gewaschen. Als nächstes wurde jeder Test bei Raumtemperatur für 1 h in 250 ul TSB-Puffer und der geeigneten Verdünnnung des [ n³²p]-markierten Oligonukleotid-Antikörperkonjugats inkubiert. Das nicht-umgesetzte, markierte Reporterkonjugat- Reagens wurde durch Zentrifugieren und Absaugen entfernt und dann wurde jeder Test viermal mit TSB-Puffer gewaschen. Jedes Röhrchen mit Versuchstestkügelchen oder Versuchskontrollkügelchen wurde in 10 ul TSB-Puffer resuspendiert und in eine Scintillationsphiole überführt, enthaltend 10 ml Scintillationsfluid (Biofluor®). Das Ausmaß an Radiomarkierung in jedem Test wurde in einem Beckman® Modell LS 2801 Scintillationszähler (Beckman) gezählt. Das Ausmaß von Signal und nicht-spezifischer Markierung für jede Verdünnung wurde grafisch aufgezeichnet. Diese Daten wurden verwendet, um eine Verdünnung des 75-basigen Oligonukleotid-Ziegen-Ab-Konjugats zu bestimmen, bei welchem die nicht-spezifische Reaktivität nicht vom Untergrund unterscheidbar war. Diese Verdünnung und die Zwischenverdünnungen unter dieser Verdünnung des Reporterkonjugats wurden in Immunotests wie folgt verwendet.

Dosis-abhängiger Immunotest unter Verwendung von Reporterkonjugat:

Aliquote, die aus Serienverdünnnungen der Testanalyt-Stammlösung gefertigt wurden, Kaninchen-IgG (100 igg/ml) (Sigma, N I-5006), 1 ug, 1 ng und 1 pg wurden zu 500 ul Röhrchen, enthaltend 0,5 mg Testküggelchen in 250 ul TSB zugesetzt. Es bestand auch ein Kontrollversuchsröhrchen, enthaltend 250 ul TSB-Puffer, 0,5 mg Testkügelchen und kein Kaninchen- IgG. Die Testlösungen wurden bei Raumtemperatur (Antigen- Aufnahmeschritt) für 30 min inkubiert. Die Testkugeln wurden durch Zentrifugieren pelletiert und die überstehenden Lösungen wurden durch Absaugen entfernt. Jeder Test wurde dreimal mit TSB-Puffer gewaschen und dann bei Raumtemperatur mit 250 ul Äquivalentverdünnung der TSB-haltigen 0,02 ul des Oligonukleotid-Antikörperkonjugats für 30 min inkubiert. Die überstehenden Lösungen wurden durch Zentrifugieren und Absaugen entfernt. Die Testkugeln wurden viermal mit TSB und dann einmal mit Wasser gewaschen. Die Kugeln wurden in 50 ul Wasser resuspendiert.

Zielsequenz (Oligonukleotid) Amplifikationsverfahren:

Die Amplifikation der 75-basigen Oligonukleotid-Zielsequenz, die an den Reporter-Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, Jackson ImmunoResearch Labs.) konjugiert wurde, wurde unter Verwendung der Polymeraseketten-Reaktion (PCR) durchgeführt. Das Protokoll erfordert zwei gesonderte Zusätze von Primern. Die erste Addition wurde vor dem Anfangszyklus durchgeführt; der 3-Primer wurde in einem zehnfachen Überschuß gegenüber dem 5'-Primer zugesetzt. Eine zweite Addition von Primern wurde nach dem fünfzehnten Replikationszyklus durchgeführt, wobei beide Primer in derselben Konzentration zugesetzt wurden. Die Amplifika tionsreaktion wurde unter Verwendung der obengenannten Reagentien unter folgenden Bedingungen durchgeführt. Für jede Testprobe wurde ein Endreaktionsvolumen von 50 ul (enthaltend 10 mM Tris.HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,001% Gelatine, 100 iMM dATP, 100 iMM dCTP, 100 iMM dGTP, 100 iMM dTTP und 0,25 Einheiten Taq DNA Polymerase) hergestellt. Für die Anfangsreaktion wurden 2,5 ul des 3'-Primers (400 nM Stammlösung), 2,5 ul des 5'- Primers (40 nM Stammlösung) zu einer MikroAmpTM Reaktionsröhre (Perkin Elmer-Cetus), enthaltend 25 ul destilliertes Wasser, zugesetzt. 5 ill der in Wasser resuspendierten Testkügelchen wurden zu den Primern zugesetzt und das Röhrchen wurde bei 95ºC für 5 min angeordnet. Die Lambda- Primer und die DNA, der "Satz"-Vergleich, wurden auch als eine zusätzliche Probe für die PCR-Reagenskontrolle (unter Verwendung der von den Herstellern angeregten Reaktantenkonzentration für Primer und Lambda-DNA) laufen gelassen. Eine Master-Reaktionsmischung wurde unter Verwendung des Perkin Elmer-Cetus Reaktantensatzes und Taq DNA Polymerase (Amplitaq®: Perkin Elmer-Cetus) ([n+1] · 15 ul, worin n gleich der Zahl der Testproben ist) hergestellt und wurde auf 72ºC erhitzt. Die Master-Reaktionsmischung wurde zu jeder Testprobe aliquotiert (15 ul), gemischt und in den thermischen Zyklisiererblock transferiert, welcher bei einer Haltetemperatur von 72ºC unterbrochen wurde. Nachdem alle Proben zu dem thermischen Zyklisierer zugesetzt waren, wurden sie 15 Zyklen von 90ºC für 15 s (denaturierende Bedingungen) und dann bei 42ºC für 10 s (Primerverschmelzungsbedingungen) unterworfen. Da die Zielsequenz kurz war (75 Basen), war eine zusätzliche Stufe zur Polymerisierung nicht erforderlich. Die Polymerisierung wurde während des Ansteigens auf 90ºC zur Denaturierung (< 1ºC/s) durch geführt. Nach 20 Zyklen wurde die Reaktion bei 72ºC für den Zusatz von 2,5 ul des 3' -Primers (400 nM Stammlösung) und 2,5 ul des 5'-Primers (400 nm Stammlösung) gehalten. Die Reaktionen wurden weiteren 15 Zyklen unter Verwendung desselben wie oben beschriebenen Zyklisierungsprogramms unterworfen. Die Reaktionen wurden dann für 45 s auf 65ºC gebracht und dann auf 4ºC zum Halten für die weitere Analyse.

Analyse der Amplifikationsprodukte

Amplifikationsprodukte wurden zu Beginn durch Unterwasser- Gelelektrophorese analysiert. Nach der Amplifikation des 75 Basen Ziels (des Reporteroligonukleotids, das an das Ziegen-Ab konjugiert ist) wurden 15 ul der amplifizierten Probe mit 3 ul Agarosegel-Ladungspuffer (30% Glycerin und 0,25% Bromphenolblau) gemischt und auf einem 3% Agarosegel (8,5 · 6,0 · ~ 0,5 cm : 25 ml Agaroselösung), enthaltend 0,1 igg/ml Ethidiumbromid und 0,5 · TBE-Puffer, analysiert. Die Gelelektrophorese wurde durch Anlegen von 50 V (oder 5,9 V/cm) an das Gel für 40 min durchgefühhrt. Die Ergebnisse, Ethidiumbromid-gefärbte DNA-Banden, wurden mit einem UV-Transilluminator (310 nm Wellenlänge, Modell TM 20, UVP, Inc., San Gabriel, CA) visualisiert und auf einem Polaroid®-artigen 57-Schwarz/Weiß-Film (Polaroid Corp., Cambridge, MA) aufgezeichnet. Die Banden erscheinen auf dem Film als weiße oder lichtgraue Banden auf dem dunkelgrauen oder schwarzen Hintergrund (dem Gel). Weitere Analyse der Amplifikationsprodukte wurde durch Messen der Reflexionsdichte der Ethidiumbromid-gefärbten DNA-Banden auf dem Polaroid®-Typ 57 Film unter Verwendung eines Dichtemessers, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Reflexions dichtemesser wurden zuerst auf Standarddichteplatten standardisiert, welche spezifische Dichtereflexionen in Dichteeinheiten ergaben. Als nächstes wurde der Gelhintergrund vermessen. Dann wurden die Ethidiumbromid-gefärbten DNA- Banden, die jeweils eines der Amplifikationsprodukte darstellen, gemessen. Auf diese Weise wurde die Amplifikationsantwort von jedem Versuch gemessen, was die Menge an in der Probe vorhandenem Antigen reflektiert, wenn es mit einer Standardkurve (einer dosisabhängigen Kurve) verglichen wird.
Bezugnehmend auf Fig. 7 zeigen die Reihen 3 bis 6 die Amplifikationsantwort auf die 75-basige Reportersequenz unter Verwendung von 0,02 ul des Konjugats in Antwort auf unterschiedliche Mengen an in dem Immunotest vorhandenem Antigen. Die in den Reihen 3, 4 und 5 getesteten Proben enthielten 1 ug, 1 ng bzw. 1 pg. Reihe 6 ist eine Kontrolle, wo kein Analyt dem Test für die Menge der nichtspezifischen Bindung (n.s.b.) zugesetzt war. Reihe 1 ist Hae III digested Ö X174 Molekulargewichtmarker und Reihe 2 ist ein ëX-Kontrollprimer-Dimeres.
In Tabelle 1 unten zeigen die Ergebnisse die Dosisantwort auf den Immunotest von Fig. 7. Die Quantifizierung des 75- basigen Produkts wurde durch Messen des Polaroid® 57 Films in bezug auf die Prozent-Reflexion unter Verwendung des Modell RD107R Quanta Log Densitometers durchgeführt. Die als relative Intensitätsdaten der Ethidiumbromidfarbe (Prozent Reflexion) ausgedrückten Daten zeigen die Testantwort als eine Funktion der Menge an Analyt (Kaninchen- IgG), die vorhanden ist, an. Tabelle 1 Relative Bandendichte von Amplifikationsprodukten, hergestellt in Antwort auf ansteigende R-IgG-Analytkozentrationen in dem direkten Zielverfahren
Wie aus den Daten ersehen werden kann, wurde die Testamplifikation erreicht, wenn der Analyt mit 1 ng oder mehr vorhanden war.

Sequenzauflistung

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: EBERSOLE RICHARD C. COLLIER, DAVID N. HENDRICKSON, EDWIN R. HATFIELD, TINA M. MORAN, JOHN
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: AMPLIFIKATION VON TESTREPOR- TERN DURCH NUKLEINSÄURE-REPLIKATION
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 13
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
(B) STRASSE: 1007 MARKET STREET
(C) STADT: WILMINGTON
(D) STAAT: DELAWARE
(E) LAND: U.S.A.
(F) POSTLEITZAHL: 19898
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MITTLERER TYP: Diskette, 3,50 Zoll, 1,0 MB
(B) COMPUTER: MACINTOSH
(C) BETRIEBSSYSTEM: MACINTOSH 6,0
(D) SOFTWARE: MICROSOFT WORD, 4,0
(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: CR-8959-A
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) FRÜHERE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: US 07/833,837
(B) ANMELDEDATUM: 4. FEBRUAR 1992
(viii) ANWALT/AGENT INFORMATION:
(A) NAME: GEIGER, KATHLEEN W.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 35.880
(C) REFERENZ/AKTENZAHL: CR-8959-A
(xi) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: 302-892-8112
(B) TELEFAX: 302-892-7949
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 1:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 1:
ATGCGTAGCA GCTTTACQGC AGAGATCATG CCTATGTACC ATGCTATCCT ACCTGTAAGT 60 CATAGCTGTT TCCTG 75
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 2:
(1) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 75 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 2:
CAGGAAACAG CTATGACTTA CAGGTAGGAT AGCATGGTAC ATAGGCATGA TCTCTGCGGT 60 AAAGCTGCTA CGCAT 75
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 3:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 3:
ATGCGTAGCA GCTTTACCGC AGAGATCATG CCTATGTACC ATGCTATCCT ACCTGTAAGT 60 AAAGCTGCTA CGCAT 75
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 4:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 4:
ATGCGTAGCA GCTTTACTTA CAGGTAGGAT AGCATGGTAC ATAGGCATGA TCTCTGCGGT 60 AAAGCTGCTA CGCAT 75
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 5:
(1) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 5:
ATGCGTAGCA GCTTTAC 17
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.; 6:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 6:
CAGGAAACAG CTATGAC 17
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 7:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 7:
ATGCGTAGCA GCTTTACCGC AGAGATCATG CCTATGTACC ATGCTATCCT ACCTGTAATA 60 GTAGAAACAG CTGAC 75
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 8:
(1) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 8:
GTCAGCTGTT TCTACTATTA CAGGTAGGAT AGCATGGTAC ATAGGCATGA TCTCTGCGGT 60 AAAGCTGCTA CGCAT 75
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 9:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 75 Hasenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 9:
GGCAGGAAGA CAAACACTGG CTGGTCTGTG GTGCTGTGCT TGTTCCCCTG TCCTAGTATT 60 GTTTTCTGGG TTGGT 75
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 10:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 10:
ACCAACCCAG AAAACAA 17
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 11:
(1) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 11:
ACCAACCCAG AAAACAATAC TAGGACAGGG GAACAAGCAC AGCACCACAG ACCAGCCAGT 60 GTTTGTCTTC CTGCC
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 12:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA
(A) LÄNGE: 16 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 12:
GGCAGGAAGA CAAACA 16
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.: 13:
(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA
(A) LANGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGARTIGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.: 13:
GTCAGCTGTT TCTACTA 17

Claims

1. Verfahren zur gleichzeitigen, mehrfachen Messung in einer einzigen Testprobe, worin jede Messung gleichzeitig durch eine einzige Target- bzw. Ziel-Nukleinsäure-Sequenz, die in einem Reporterkonjugat in der Testprobe enthalten ist, amplifiziert wird, wobei jedes Konjugat ein Glied eines Bindungspaars und eine einzige Ziel-Nukleinsäure- Sequenz, welche als Antwort auf wenigstens einen Nicht- Nukleinsäureanalyten immobilisiert wurde, enthält, umfassend die Schritte:

(i) Ausbilden von Analyt-abhängigen Reporterkomplexen durch Reaktion von Analyt und einem Reporterkonjugat mit einem immobilisierten Aufnahme- bzw. Fängerreagens, enthaltend eines oder mehrere Glieder eines Bindungspaars;

(ii) Kontaktieren der Reporterkomplexe mit einer Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung;

(iii) Replizieren der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz; und

(iv) Detektieren der replizierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen, worin die Sequenzen auf Basis der Sequenzlänge differenziert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin jedes Reporterkonjugat aus einem Glied eines Bindungspaars, das chemisch an eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz gebunden ist, besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin jedes Reporterkonjugat eine einzige Ziel-Nukleinsäure-Sequenz enthält, worin die Sequenz von anderen Zielsequenzen auf Basis der Sequenzlänge unterschieden werden kann.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Zielsequenzen mit einem einzigen Satz von Primern repliziert werden können.

5. Verfahren zum gleichzeitigen Detektieren einer Vielzahl von replizierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen, die in einer einzigen Testprobe enthalten sind, umfassend die Schritte:

(a) Ausbilden von Analyt-abhängigen Reportkomplexen, worin jeder in einem immobilisierten Aufnahme- bzw. Fängerreagens enthalten ist, eines Analyten und eines Reporterkonjugats, umfassend ein Enzym;

(b) Kontaktieren der Komplexe mit einem Nukleinsäure-Replikationssubstrat, um aktivierte Nukleinsäure-Replikationszwischenprodukte auszubilden, welche auf immobilisierten Rezeptoren abgeschieden sind, wodurch abgeschiedene Nukleinsäure-Replikationsprodukte produziert werden;

(c) Kontaktieren der abgeschiedenen Nukleinsäure-Replikationsprodukte mit Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung;

(d) Replizieren der Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen des abgeschiedenen Nukleinsäure-Replikationsprodukts; und

(e) Detektieren der replizierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen, worin die Sequenzen auf Basis der Sequenzlänge differenziert werden.

6. Verfahren zum gleichzeitigen Detektieren einer Vielzahl von replizierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen, die in einer einzigen Testprobe enthalten sind, umfassend die Schritte:

(a) Ausbilden eines Analyt-abhängigen Reporterkomplexes, worin jeder in einem immobilisierten Aufnahme- bzw. Fängerreagens enthalten ist, eines Analyten und eines Reporterkonjugats, umfassend ein Enzym;

(b) Kontaktieren der Komplexe mit einem Bindungssubstrat, um aktivierte Bindungszwischenprodukte auszubilden, welche sich auf immobilisierten Rezeptoren abscheiden, wodurch abgeschiedene Bindungsprodukte produziert werden;

(c) Kontaktieren der abgeschiedenen Bindungsprodukte mit einem Nukleinsäure-Replikationskonjugat, um abgeschiedene Nukleinsäure-Replikations-Bindungspaarkomplexe zu bilden;

(d) Kontaktieren der abgeschiedenen Bindungspaarkomplexe mit Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung;

(e) Replizieren der Zielsequenzen des abgeschiedenen Bindungspaarkomplexes; und

(f) Detektieren der replizierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen, worin die Sequenzen auf Basis der Sequenzlänge unterschieden werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das zusätzliche Zusetzen zu der Probe von einer oder mehreren Referenz-Nukleinsäuresequenzen und den Mitteln zum Replizieren dieser Referenz-Sequenzen, wobei diese Referenz-Sequenzen zusätzlich zu den Zielsequenzen repliziert werden und dadurch als interne Kontrolle für eine genauere Detektion und Quantifizierung von mehr als einem Analyten dienen.

8. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend in Schritt (ii) Kontaktieren der Reporterkomplexe mit einer Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung, welche zusätzlich wenigstens eine Replikationskontrolle unter Bedingungen enthält, worin Referenz-Sequenzen der Replikationskontrolle in Schritt (iii) gleichzeitig mit den Zielsequenzen repliziert werden; und in Schritt (iv) Detektieren und gesondertes Quantifizieren der replizierten Referenz-Sequenzen, wobei beim Bestimmen des Verhältnisses der replizierten Referenz- Sequenzen zu den replizierten Zielsequenzen die Konzentrationen der Analyten bestimmt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend: in Schritt (i) Immobilisieren in der Probe von wenigstens einem Referenz-Nukleinsäure-Sequenzkonjugat zusätzlich zu den immobilisierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen; in Schritt (ii) Kontaktieren der Reporterkomplexe mit Nukleinsäure- Replikationszusammensetzung, worin diese Zusammensetzung zusätzlich die Mittel zum Replizieren der Referenz- Sequenzen der Referenz-Nukleinsäure-Sequenzkonjugate enthält; in Schritt (iii) Replizieren der Referenz- Sequenzen gleichzeitig mit den Zielsequenzen; und in Schritt (iv) Detektieren und gesondertes Quantifizieren der replizierten Referenz-Sequenzen, wobei beim Bestimmen das Verhältnis der replizierten Referenz-Sequenzen zu den replizierten Zielsequenzen die Konzentration der Analyten bestimmt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 4 oder 7, worin Nukleinsäure-Sequenzreplikation unter Verwendung einer thermisch stabilen Nukleinsäure-Polymerase durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 4 oder 7, worin die Ziel- oder Referenz-Nukleinsäuresequenzen einzelsträngig sind und an einem Ende eine erste Primerbindungssequenz enthalten und an dem anderen Ende eine Sequenz enthalten, welche komplementär zu der ersten Primerbindungsequenz ist, wodurch die Replikation mit einem einzigen Primer ermöglicht wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 4 oder 7, worin die Nukleinsäure-Sequenzreplikation unter Verwendung von Primern durchgeführt wird, welche Sequenzen an ihren 5'-Enden enthalten, die nicht komplementär zu den Ziel- oder Refe-renzsequenzen sind.

13. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 4 oder 7, worin die Nukleinsäure-Sequenzreplikation unter Verwendung einer thermisch stabilen Ligase durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 4 oder 7, worin wenigstens ein signalbildender Rest in den replizierten Nukleinsäure-Sequenzen eingebaut wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die signalbildenden Reste radioaktiv sind.

16. Verfahren nach Anspruch 14, worin die signalbildenden Reste lumineszierend sind.

17. Verfahren nach Anspruch 14, worin die signalbildenden Reste chemilumineszierend sind.

18. Verfahren nach Anspruch 14, worin die signalbildenden Reste Enzyme sind.

19. Verfahren nach Anspruch 14, worin die signalbildenden Reste fluorophoretisch sind.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die fluorophoretischen Reste in den replizierten Sequenzen positioniert werden, um eine Energieübertragung zwischen den fluorophoretischen Resten zu ermöglichen.

21. Verfahren nach Anspruch 19, worin die fluorophoretischen Reste in den replizierten Nukleinsäure-Sequenzen, um nicht mehr als etwa 12 Basen entfernt angeordnet werden.

22. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 4 oder 7, worin die mit einem ersten Glied eines Bindungspaars markierten Primer in den amplifizierten Nukleinsäuresequenzen inkorporiert werden.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin die Detektion und Quantifizierung der replizierten Nukleinsäure-Sequenzen durch Immobilisierung der replizierten Nukleinsäure-Sequenzen durch Abscheidung der Sequenzen auf einem immobilisierten Rezeptor, welche ein zweites Glied des Bindungspaars enthält, und weiteres Detektieren der immobilisierten, replizierten Nukleinsäure-Sequenzen durchgeführt wird.

24. Verfahren nach Anspruch 22, worin das erste Glied eines Bindungspaars Biotin ist.

25. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend nach Schritt (iii) das Abtrennen der replizierten Nukleinsäure- Sequenzen von den nicht-inkorporierten, signalbildenden Resten unter Verwendung von Größentrennungstechniken; und (iv) Detektieren der replizierten Nukleinsäure-Sequenzen.

26. Verfahren zur simultanen bzw. gleichzeitigen Detektion und Quantifizierung einer Vielzahl von Analyten, die in einer einzigen Testprobe enthalten sind, worin die Amplifizierung durch Replikation von Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen erreicht wird und worin das Verfahren auf der konkurrenzierenden Bindung eines Liganden-Reporterkonjugats basiert, umfassend die Schritte:

(a) Zusetzen eines immobilisierten Aufnahme- bzw. Fängerreagens zu der Testprobe, umfassend wenigstens ein Glied eines Bindungspaars; dann

(b) Zusetzen von Liganden-Reporterkonjugaten, die jeweils eine einzige Ziel-Nukleinsäure-Sequenz enthalten, worin die Liganden des Reporterkonjugats mit den Analyten zum Binden des immobilisierten Aufnahmereagens konkurrieren werden;

(c) Waschen der nicht gebundenen Liganden-Reporterkonjugate aus dem immobilisierten Analytkomplex;

(d) Kontaktieren der gewaschenen und gebundenen Ligandenkonjugate mit Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung;

(e) Replizieren der Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen; und

(f) Detektieren der Anwesenheit von replizierten Nukleinsäure-Zielsequenzen, worin die Sequenzen auf Basis der Sequenzlänge differenziert werden, wobei die Anwesenheit von Analyten in der Probe bestimmt wird.

27. Verfahren zur amplifizierenden Detektion einer Vielzahl von Analyten, die in einer einzigen Testprobe enthalten sind, worin die Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen der nichtimmobilisierten Reporterkonjugate amplifiziert werden, umfassend die Schritte:

(a) Kontaktieren der Testprobe mit immobilisiertem Aufnahme- bzw. Fängerreagens, wobei Analyten immobilisiert werden;

(b) Zusetzen von wenigstens einem Reporterkonjugat zu der Probe, wobei immobilisierte, Analyt-abhängige Reporterkomplexe als Antwort auf die Analyten gebildet werden;

(c) Abtrennen von jeglichen überschüssigen Reporterkonjugaten von der Probe, welche frei in Lösung verblieben sind;

(d) Kontaktieren der freien Reporterkonjugate von Schritt

(c) mit Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung;

(e) Replizieren der Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen von freien Reporterkonjugaten von Schritt (d); und

(f) Detektieren und Quantifizieren der replizierten Zielnukleinsäuren von Schritt (e), worin diese Nukleinsäure-Sequenzen auf Basis der Sequenzlänge unterschieden werden, wobei die Anwesenheit von Analyten in der Probe bestimmt wird.

28. Verfahren zur gleichzeitigen, mehrfachen Messung in einer einzigen Testprobe, worin jede Messung gleichzeitig durch eine einzige Ziel-Nukleinsäure-Sequenz amplifiziert wird, umfassend wenigstens ein Reporterkonjugat in der Testprobe, wobei jedes Konjugat ein Glied eines Bindungspaars und eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz umfaßt, welche in Antwort auf wenigstens einen Nicht-Nukleinsäureanalyten immobilisiert wurde, wobei die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz von anderen Zielsequenzen auf der Basis der Sequenzlänge unterschieden werden kann und worin die Zielsequenzen durch einen einzigen Satz von Primern repliziert werden können, umfassend die Schritte:

(i) Ausbilden eines Analyt-abhängigen Reporterkomplexes durch Reaktion von Analyten und Reporterkonjugat mit einem immobilisierten Aufnahme- bzw. Fängerreagens, enthaltend eines oder mehrere Glieder eines Bindungspaars;

(ii) Kontaktieren det Reporterkomplexe mit einer Nukleinsäure-Replikationszusammensetzung;

(iii) Replizieren der Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen; und

(iv) Detektieren der replizierten Ziel-Nukleinsäure-Sequenzen, worin die Sequenzen auf der Basis der Sequenzlänge unterschieden werden.