DE69825465T2

DE69825465T2 - Versuchsanordnung mit erweiterter bandbreite

Info

Publication number: DE69825465T2
Application number: DE69825465T
Authority: DE
Inventors: C. Norman NELSON
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1998-10-30
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2018-10-31
Also published as: AU741568B2; US6350579B1; US6180340B1; DE69825465D1; JP3550358B2; CA2305415A1; ATE272841T1; ES2226189T3; JP2002508504A; WO1999023490A1; EP1027604B1; AU1291899A; EP1027604A1; CA2305415C

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zum Detektieren von Analyten, die in einem großen Bereich von möglichen Konzentrationen vorliegen können, durch die Verwendung von mindestens zwei markierten Bindungspartnern oder Sonden, und bezieht sich im Speziellen auf die Verwendung von markierten Bindungspartnern oder Sonden, die sich gegenseitig ausschließende Target-Bereiche des gleichen Analyten spezifisch binden, so dass die Verwendung der mindestens zwei Bindungspartner oder Sonden den dynamischen Bereich eines Assays zur Analytdetektion erweitert.
Hintergrund der Erfindung
Assays zur Detektion und/oder Quantifikation von Analyten existieren in vielen verschiedenen Formen und Formaten. In vielen Fällen ist die Menge des Analyten in einer Probe nicht groß genug für eine direkte Detektion oder Quantifikation. In solchen Fällen muss ein sekundäres Molekül, das an dem Analyten binden oder mit diesem interagieren kann, verwendet werden, um die Anwesenheit oder Menge eines Analyten in der Probe anzuzeigen. Sofern das sekundäre Molekül nicht direkt detektierbar ist, muss das sekundäre Molekül mit einem Marker konjugiert sein, der detektiert wird, wenn das sekundäre Molekül an den Analyten bindet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden solche sekundären Moleküle, die an Analyten binden oder mit ihnen interagieren können, als „Bindungspartner" oder „Sonde" bezeichnet. Beispiele für detektierbare Analyten beinhalten Antikörper, Proteine, Zell-Oberflächenrezeptoren, Cytokine, Hormone, Antigene, Nukleinsäuren, Metalle, Molekülkomplexe wie zum Beispiel polymere Anordnungen von Proteinen oder anderen Makromolekülen, und ähnliche. Desgleichen können Bindungspartner oder Sonden zum Detektieren dieser Analyten Antikörper, Proteine, Antigene, Haptene, Nukleinsäuresonden, chelatbildende Agenzien, Enzymen, Enzymsubstraten und Analoga davon sein.
Ein allgemein verwendetes Assayformat ist das Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA). In diesem Assayformat wird der Analyt mit einem primären Antikörper in Kontakt gebracht, der an mindestens eine Domäne oder „Target-Bereich" des Analyten binden kann. Nachdem die überschüssigen Antikörper von dem sich ergebenden Analyt:Antikörper-Komplex abgewaschen worden ist, wird der primäre Antikörper an einen Enzym-markierten sekundären Antikörper spezifisch gebunden. Ein chromogenes Enzymsubstrat wird dann bereitgestellt und unter Bedingungen, die eine Enzym-vermittelte Reaktion des Substrats begünstigen, inkubiert. Das sich daraus ergebende gefärbte Produkt und seine Intensität nach einer gewissen Reaktionszeit sind Hinweise für die Anwesenheit bzw. Menge des Analyten, der ursprünglich in der Probe vorhanden war. Geeignete in ELISA verwendete Enzyme sind zum Beispiel die β-Galaktosidase, die saure Phosphathase, und die alkalische Phosphathase, und geeignete Enzymsubstrate für die Verwendung mit diesen Enzymen beinhalten x-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-Pyranosid) und p-Nitrophenylphosphat, wenngleich andere Enzyme und Substrate dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt sind. Es existieren Variationen eines ELISA's: zum Beispiel kann der primäre Antikörper an ein Enzym gebunden sein, wodurch der sekundäre Antikörper-Schritt eliminiert wird. Nichtsdestotrotz beinhalten diese Assayverfahren allgemeine Schritte des In- Kontakt-Bringens eines Analyten mit einem markierten Bindungspartner und darauf folgendes Detektieren des Analyt-gebundenen Markers als Hinweis für die Anwesenheit oder Menge des Analyten.
Frengen (US. Pat. Nr. 5,739,042) beschreibt ein binäres Assaysystem, in dem zwei unabhängig voneinander bestimmbare Formen von Festphasen-gebundenen Bindungspartnern (z. B. monoklonale Antikörper) eher Schritt für Schritt als gleichzeitig mit dem Analyten und dem markierten Liganden eine Reaktion eingehen. Die Analytkonzentration wird durch Auslesungen, die von diesen beiden Formen abstammen, durch Vergleich mit einer Doppel-Standardkurve erhalten.
Campbell, et al. (US Pat. Nr. 4,496,958) beschreiben chemilumineszierende Akridinium-markierende Verbindungen zum Markieren von Bindungspartnern in Mehrfachassayformaten. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0709466 beschreibt Zusammensetzungen und Verfahren zum gleichzeitigen Detektieren und Quantifizieren von mehreren Nukleinsäureanalyten in einer einzelnen Probe. Andere Verbindungen zum Markieren, wie zum Beispiel Radionuklide, Fluoreszenz-, Biolumineszenz-, Phosphoreszenz-, Lumineszenz-, Chemilumineszenz- oder Elektrochemilumineszenzverbindungen, Chromophore und Farbstoffe sind im Stand der Technik bekannt und werden weithin als Agenzien zum Markieren in einer Vielzahl von Assayformaten, sowohl direkten als auch indirekten, die Immunoassays und Nukleinsäurehybridisationsassays beinhalten, verwendet.
Assays werden anhand der Art des zu detektierenden Analyten, der Art des Bindungspartners an dem der Analyt bindet und der Art des verwendeten Markers voneinander unterschieden. Assays können ebenso auf der Grundlage klassifiziert werden, ob das Verfahren die Immobilisation des Analyten oder des Analyt-Bindungspartnerkomplexes einschließt. In einem allgemein bekannten Assayformat, das als „heterogenes" oder biphasisches Assaysystem bekannt ist, lässt man eine Sonde, für gewöhnlich unter Bedingungen des Sondenüberschusses, seinen Analyten binden. Entweder der Analyt oder die Sonde kann an einem festen Träger immobilisiert sein, wodurch die sich daraus ergebende Sonde immobilisiert wird: Analytkomplex. Häufig wird der Komplex in der flüssigen Phase gebildet und dann immobilisiert. Nachdem die Sonden:Analyt-Komplexe immobilisiert worden sind, wird der Überschuss an unkomplexierten Sonden weggewaschen. Wenn die Sonden direkt markiert werden, dann wird der Marker als ein Hinweis auf die Anwesenheit des Analyten detektiert. Alternativ dazu können Sonden:Analyt-Komplexe von der freien Sonde durch Mittel, wie zum Beispiel Gelfiltrationschromatographie, Elektrophorese, Elektrofokussierung oder andere Methoden, die auf Grundlage der Größe oder Ladung des Sonden:Analyt-Komplexes trennen, getrennt werden.
Andere Assays, die „homogene" Assays genannt werden, finden gänzlich in einer einzelnen Phase statt, ohne einen Schritt zum Trennen des Proben:Analyt-Komplexes von der freien Sonde. In diesen wird für gewöhnlich entweder der Sonden:Analyt-Komplex oder die freie Sonde nach der Ausbildung des Komplexes verändert, um die getrennte Detektion des Analyten in der Anwesenheit der freien Sonde zu ermöglichen. Eine Möglichkeit der Differenzierung einer freien Sonde von einer Sonde, die an eine Analyten gebunden ist, schließt vielmehr die Veränderung oder selektive Inaktivierung des an die Sonde gebundenen Markers ein als die der freien Sonde selbst. Arnold et al. (US Pat. Nr. 5,283,174) beschreibt homogene Verfahren, die eine mit einem Marker verbundene Oligonukleotidsonde verwenden, die zur selektiven Inaktivierung oder Veränderung in der Lage ist, je nachdem, ob die markierte Sonde an ein Target gebunden ist oder nicht. Diese Verfahren können in einem einzelnen Röhrchen, ohne das es notwendig wäre, sie zu Waschen oder Dekantieren, verwendet werden. Ein anderes homogenes Assay verwendet ein Energie-Transfer-System, das die unmittelbare Nähe von Licht-emittierenden Spezies und Licht-absorbierender Spezies, deren Absorptionsspektrum mit dem Emissionsspektrum der Licht-emittierenden Spezies überlappt (Kanadische Pat. Nr. 1185177 von Morrison et al.), erfordert. Dieses Assayverfahren verwendet mehrere Antikörper zum Detektieren eines Antigens mit mehreren Bindungsstellen: ein Antikörper ist an einen chemilumineszierenden Katalysator konjugiert, der in Anwesenheit von geeigneten chemilumineszierenden Reagenzien Licht emittiert, und der andere Antikörper (der „Absorber/Emitter") ist mit einem Rest konjugiert, der bei einer Wellenlänge Licht absorbiert und bei einer anderen Wellenlänge Licht emittiert. Wenn die getrennt voneinander markierten Antikörper an ein einzelnes Antigen in unmittelbarer Nähe binden, kommt es zu einem hocheffizienten Energietransfer vom Antikörper-konjugierten chemilumineszierenden Katalysator auf den Absorber/Emitter, der ein Lichtsignal erzeugt, der mit der Menge des Antigens in Beziehung steht.
Es gibt Assays, die sowohl Aspekte von homogenen als auch heterogenen Assays ausnutzen, die „Hybrid"-Assays genannt werden. Diese Verfahren können, zum Beispiel, eine einzelphasige selektive Veränderung der Sonde oder des Sonden:Analyt-Komplexes, gefolgt von einen Trennungsschritt zum weiteren Verringerung des Hintergrundniveaus im Assay (z. B., siehe US Pat. Nr. 5,658,737 von Nelson et al.) verwenden.
Unabhängig von dem verwendeten Assayformat existieren eine Reihe von Faktoren in allen Assays, die ihre Empfindlichkeit und den Bereich an möglichen Analytkonzentrationen, die genau detektiert oder gemessen werden können, begrenzen. Ein Faktor ist das Hintergrundniveau, das im Assay vorhanden ist. Der „Hintergrund" beschreibt im Allgemeinen eine Sonde oder einen Marker im Assay, der nicht-spezifisch an einen Analyten gebunden ist und der positive Ergebnisse bei niedrigen Analytniveaus maskieren kann. Zum Beispiel kann in einem heterogenen Assay der Hintergrund durch eine kleine Menge einer Sonde, die während der physikalischen Trennung des Sonden:Analyt-Komplexes nicht von der freien Sonde entfernt worden ist, bereitgestellt werden. Wenn die Sonde markiert ist wird diese kleine Menge an Sonde als Restniveau des detektierbaren Signals detektiert. In einem homogenen Assay kann der Hintergrund durch die Unfähigkeit alle freie Sonden- oder an Sonden geknüpfte markierte Moleküle vollständig zu verändern, bereitgestellt werden. Auf jeden Fall ist ein niedrigeres Signalniveau im Allgemeinen zwischen 0,001% und 10% des Gesamtsignals, noch allgemeiner zwischen etwa 0,01% und 1%, als „Basislinie" vorhanden, unter der man sich auf die Ergebnisse aus Gründen der Exaktheit nicht stützen kann. Daher begrenzt das einem bestimmten Assay innewohnende Hintergrundniveau die niedrigste Menge eines Analyten, die detektiert und/oder gemessen werden kann.
Der Hintergrund in einem Assay spielt eine Rolle bei der Begrenzung des „dynamischen Bereiches" des Assays. Mit „dynamischen Bereich" ist eine lineare oder vorhersagbare akkurate Übereinstimmung zwischen dem Analytniveau, der in der zu untersuchenden Probe vorhanden ist und der Menge des Signals, das vom Marker erhalten wird, der die Anwesenheit des Analyten anzeigt, gemeint. Für den Durchschnittsfachmann ist leicht ersichtlich, dass der dynamische Bereich eines Assays nicht unter das Hintergrundniveau, das durch die Detektion von nicht-spezifischem Marker beigesteuert wird, erweitert werden kann. Demnach ist der dynamische Bereich umso mehr begrenzt, je höher der Hintergrund ist. Wenn darüber hinaus hohe Mengen eines Analyten zu detektieren sind, müssen dementsprechend große Mengen der Sonde verwendet werden, was zu höheren Hintergründen führt.
Andere Faktoren können den dynamischen Bereich eines Assays beschränken. Häufig ist eine Begrenzung die maximale Menge eines Signals, das durch die Marker-Detektionsvorrichtung, die im Assay verwendet wird, detektiert werden kann. Wenn ein Instrument daher genau nur, zum Beispiel, eine Zählung von bis zu einer Millionen pro Sekunde durchführen kann und die Probe erzielt ein Zählung von zwei Millionen pro Sekunde, wird die zusätzliche Zählung von einer Millionen von dem Instrument nicht gemeldet und die obere Ausdehnung des dynamischen Bereiches des Assays ist nur die Hälfte von dem was für eine genaue Quantifizierung der Probe erforderlich wäre.
Auch die Instrumente, die zum Detektieren des markierten Sonden:Analyt-Komplexes verwendet werden, können ein inhärentes elektronisches „Rauschen" (manchmal auch als „Hintergrund" bezeichnet) aufweisen und sie können ebenso zur Beschränkung der Genauigkeit bei der Analytdetektion beitragen. Auch wenn das elektronische Signal-Rausch-Verhältnis eines Instruments verbessert werden kann, verbindet sich das Rauschen mit dem oben beschriebenen inhärenten Hintergrund des Assays, was die Fähigkeit zum Detektieren oder Quantifizieren von Analyten in einem großen Bereich von Konzentrationen weiter beschränkt. Um diese Beschränkungen auszuräumen besorgen sich die Praktiker von Assays im Allgemeinen mehrere Proben von einer einzelnen Quelle oder testen zahlreiche Verdünnungen von Proben, um die Anwesenheit einer unbekannten Menge eines Analyten zu detektieren.
Einige Verfahren erhöhen die Empfindlichkeit eines Assays ohne den dynamischen Bereich zu erweitern. Das heißt, dass diese Verfahren es einem ermöglichen, eine geringere Menge eines Analyten zu detektieren als zuvor mit der gleichen Reaktionsart detektiert wurde. Einige Verfahren zum Erhöhen der Empfindlichkeit beruhen auf der Verwendung von Mischungen von Bindungspartnern. Zum Beispiel beschreibt Canfield et al. (US Pat. Nr. 4,514,505) ein Antigen-Detektionsverfahren mit erhöhter Empfindlichkeit, das Mischungen von monoklonalen Antikörpern mit mindestens zwei Antikörper, die gleichzeitig an mindestens zwei unterschiedliche antigenische Stellen binden können, verwendet. Die Menge für jeden monoklonalen Antikörper variiert, doch für gewöhnlich ist die bevorzugte Menge jedes Antikörpers relativ zur Menge der anderen Antikörper im wesentlichen die Gleiche wie das Verhältnis der Bindungskonstanten der Antikörper zu dem zu detektierenden Antigen. Ein anders Assayverfahren verwendet Nukleinsäurebindungspartner um Nahrungsmittel durch Verwendung einer oder mehrerer Salmonella-spezifischer markierter Sonden, zum Binden eines einzelnen Salmonella Chromosoms (Europäische Pat. Anmeldung Nr. 0114668), auf bakterielle Kontaminationen zu testen. In diesen System werden mehrere Sonden verwendet, um die Empfindlichkeit des Assays zu erhöhen, da jedes Chromosom mehrere Marker bindet.
Im Stand der Technik besteht ein Bedarf für Verfahren und Zusammensetzungen zum Detektieren und/oder Quantifizieren von Analyten in einem einzelnen Assay ohne die Notwendigkeit, Probenverdünnungen oder das Testen von doppelten Proben durchzuführen. Bevorzugt würden solche Verfahren und Zusammensetzungen eine einmalige Zugabe von Sonden zum Detektieren von Analytkonzentrationen, die sich über einen Bereich von etlichen Größenordnungen in unterschiedlichen Proben unterscheiden, einschließen. Diese Verfahren sind bevorzugt ebenso unabhängig vom Analyttyp, Sondentyp, Markertyp und verwendetem Instrument für die Detektion des Analyten, wodurch für den zu detektierenden Analyten oder die verwendeten Zusammensetzungen oder Vorrichtungen spezifische Modifikationen möglich werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Detektieren eines Analyten über einem Bereich von Konzentrationen in einer einzelnen Probe. Dieses Verfahren beinhaltet die Schritte: Bereitstellen eines Sondenreagenzes, das mindestens zwei Sonden umfasst, wobei jede Sonde einen Target-bindenden Rest und einen detektierbaren Marker umfasst und in dem jede Sonde in einer Menge vorhanden ist, die es ermöglicht, einen Bereich von Analytkonzentrationen zu detektierten, der sich von dem durch eine andere Sonde im Reagenz detektierbaren Bereich von Analytkonzentrationen unterscheidet, wobei das Sondenreagenz eine erste Sonde enthält, die mindestens in einem 10-fach molaren Überschuss relative zu einer zweiten Sonde vorhanden ist, so dass das Sondenreagenz in der Lage ist, einen Bereich von Analytkonzentrationen zu detektieren, der größer ist als der Bereich von Analytkonzentrationen, der durch eine einzelne Sonde im Reagenz detektierbar ist; und in-Kontakt-bringen des Sondenreagenzes in einem einzigen Behälter mit einer Probe, die einen Analyten enthält. Dann beinhaltet das Verfahren die Schritte zum Inkubieren der Probe und des Sondenreagenzes unter Bedingungen, welche ein spezifisches Binden des Target-bindenden Restes jeder Sonde an einem Target-Bereich des Analyten begünstigt, wobei der von jeder Sonde erkannte Target-Bereich sich von Target-Bereich, der durch eine andere Sonde im Sondenreagenz erkannt wird, unterscheidet, wodurch ein spezifischer Bindungskomplex, der den Analyten und mindestens eine Sonde umfasst, hergestellt wird; und Detektieren der Anwesenheit des spezifischen Bindungskomplexes durch Detektieren eines Signals von einem Marker, das auf die Anwesenheit mindestens einer Sonde in dem spezifischen Bindungskomplex hinweist, wodurch die Anwesenheit des Analyten in der Probe innerhalb des Bereichs von Analytkonzentrationen, der durch die Sonde in dem spezifischen Bindungskomplex detektierbar ist, angezeigt wird. In einer Ausführungsform produziert der detektierbare Marker einer Sonde im Sondenreagenz ein Signal, das vom Signal, dass eine Folge des detektierbaren Markers einer anderen Sonde im Reagenz ist, unterscheidbar ist. In einer anderen Ausführungsform wird im Detektionsschritt ein Signal gemessen, das für die Kinetik einer Reaktion charakteristisch ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird im Bereitstellungsschritt ein Sondenreagenz verwendet, in dem die spezifische Aktivität einer Sonde sich von der spezifischen Aktivität einer anderen Sonde im Reagenz unterscheidet. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird im Bereitstellungsschritt ein Sondenreagenz verwendet, wobei der detektierbare Marker einer ersten Sonde ein Signal produziert, das von einem Signal, das von einem detektierbaren Marker einer zweiten Sonde im Reagenz produziert wird, unterscheidbar ist und wobei sich die spezifische Aktivität der ersten Sonde von der spezifischen Aktivität der zweiten Sonde im Reagenz unterscheidet. Bevorzugt ist das Signal das von der ersten Sonde produziert wird, von dem Signal, das von der zweiten Sonde produziert wird, durch Messen der Kinetiken einer Reaktion im Detektionsschritt unterscheidbar. In einer Ausführungsform ist der detektierbare Marker von mindestens einer Sonde ein direkter Marker, so dass im Detektionsschritt ein Signal gemessen wird, das vom Marker produziert wird. In einer anderen Ausführungsform weist mindestens eine Sonde einen detektierbaren Marker auf, der ein Fluoreszenzmarker, ein Lumineszenzmarker, ein radioaktiver Marker, ein Chromophor, ein Enzym oder ein Enzymsubstrat ist. Bevorzugt ist der detektierbare Marker eine Chemilumineszenzmarker. In einer Ausführungsform des Verfahrens weist mindestens eine Sonde des Sondereagenzes einen detektierbaren Marker auf, der ein Ligand ist, der einen signalerzeugenden Bindungspartner spezifisch binden kann. Bevorzugt detektiert der Detektionsschritt ein Signal, das Licht emittierend, Licht absorbierend, radioaktiv, präzipitierend oder ein Produkt einer Enzymreaktion ist. In einer Ausführungsform des Verfahrens verwendet der Schritt des in-Kontakt-bringens ein Sondenreagenz, wobei eine erste Sonde in einem mindestens 10-fach molaren Überschuss relativ zur zweiten Sonde vorhanden ist. In anderen Ausführungsformen ist die erste Sonde in mindestens einem 100-fach molaren Überschuss oder einem mindestens 1.000-fachen molaren Überschuss oder einem mindestens 10.000-fachen molaren Überschuss relativ zur zweiten Sonde vorhanden. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet der Schritt des in-Kontakt-bringens einen Analyten, der eine Nukleinsäure, ein Protein, ein Fett, ein Kohlenhydrat oder eine Verbindung, die eine Kombination davon darstellt, ist. Bevorzugt beinhaltet der Schritt des in-Kontakt-bringens einen Analyten, der eine Nukleinsäure ist, und noch bevorzugter ist der Analyt RNA. In einer anderen Ausführungsform ist mindestens eine Sonde im Sondenreagenz eine Nukleinsäure, ein Protein, ein Fett, ein Kohlenhydrat oder eine Zusammensetzung, die eine Kombination davon darstellt. Bevorzugt ist mindestens eine Sonde, eine Nukleinsäure oder ein Analogon davon. Noch bevorzugter ist mindestens eine Sonde eine DNA, eine RNA, ein DNA-Analogon, ein RNA-Analogon oder eine Molekül, das eine Kombination davon beinhaltet.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die als Sondenreagenz zum Detektieren eines Analyten in einer einzelnen Probe verwendet werden kann. Die Zusammensetzung beinhaltet mindestens zwei Sonden, wobei jede Sonde einen Target-bindenden Rest, der an einen Target-Bereich des Analyten spezifisch bindet, und ein detektierbaren Marker umfasst, wobei jede Sonde an einen Target-Bereich bindet, der sich von dem Target-Bereich einer anderen Sonde im Sondenreagenz unterscheidet und wobei jede Sonde in einer Menge vorhanden ist, die sie dazu befähigt, einen Bereich von Analytkonzentrationen zu detektieren, der sich von einem Bereich von Analytkonzentrationen, der durch eine andere Sonde im Reagenz detektierbar ist, unterscheidet, so dass das Sondenreagenz den Analyten über einen erweiterten Bereich von Analytkonzentrationen, der größer ist als der Bereich von Analytkonzentrationen, der durch eine einzelne Sonde im Reagenz detektierbar ist und wobei eine erste Sonde im Sondenreagenz in einer Menge vorhanden ist, die sich durch einen mindestens 10-fachen molaren Überschuss relativ zur zweiten Sonde im Sondenreagenz unterscheidet, detektieren kann. In einer anderen Ausführungsform ist jede Sonde von einer anderen Sonde im Sondenreagenz aufgrund ihrer spezifischen Aktivität, einet Eigenschaft in Folge ihres detektierbaren Markers oder einer Kombination davon unterscheidbar. Eine andere Ausführungsform der Zusammensetzung beinhaltet für jede Sonde ein Nukleinsäureoligonukleotid mit einem Target-bindenden Rest, der eine Basensequenz ist. In einer Ausführungsform weist jede Sonde einen detektierbaren Marker auf, der ein Acridiniumesterderivat ist. Bevorzugt weist jede Sonde einen andersartigen detektierbaren Marker auf und jede Sonde weist eine andersartige spezifische Aktivität im Vergleich zu einer anderen Sonde im Reagenz auf. In einer anderen Ausführungsform ist jede Sonde ein Nukleinsäureoligonukleotid in dem der Target-bindende Rest an einen Target-Bereich, der eine Nukleinsäurebasensequenz ist, spezifisch bindet und bevorzugt weist jede Sonde einen detektierbaren Marker auf, der ein Acridiniumesterderivat ist.
Kurze Beschreibung der Figuren
1A, 1B und 1C zeigen die Strukturen einer Anzahl von Acridiniumester („AE")-derivaten und ihre entsprechende Nomenklatur, die unterschiedliche chemilumineszierende Reaktionseigenschaften aufweisen, so dass bestimmte Kombinationen dieser Marker als voneinander unterscheidbare Marker verwendet werden können. Die dargestellten Verbindungen sind: in 1A, Standard AE, Naphthyl-AE, ortho-AE („o-AE"), 1- oder 3-Methyl-AE („1 oder 3-ME-AE"), 2,7-Dimethyl-AE („2,7-diMe-AE"), und 4,5-Dimethyl-AE („4,5-diMe-AE"); in 1B, ortho-Dibromo-AE („o-diBr-AE"), ortho-Dimethyl-AE („o-diMe-AE"), meta-Dimethyl-AE („m-diMe-AE"), ortho-Methoxy-AE („o-MeO-AE"), ortho-Methoxy(cinnamyl)-AE („o-MeO(cinnamyl)-AE"), und ortho-Methyl-AE („o-Me-AE"); und in 1C, ortho-Fluoro-AE („o-F-AE"), 1- oder 3-Methyl-ortho-fluoro-AE („1- oder 3-Me-o-F-AE"), 1- oder 3-Methyl-meta-difluoro-AE („1- oder 3-Me-m-diF-AE"), und 2-Methyl-AE („2-Me-AE").
2 ist eine Darstellung der Kinetiken der Lichtemission für 1-Me-m-diF-AE (☐), 1-Me-AE (♢) und o-MeO(cinnamyl)-AE (☐)(wobei auf der y-Achse relative Lichteinheiten („RLU") aufgetragen sind und auf der x-Achse Zeitintervalle (in 0,2 Sek.), die zeigt, das 1-Me-m-diF-AE am schnellsten reagiert, danach 1-Me-AE reagiert, und o-MeO(cinnamyl)-AE reagiert über einen langen Zeitraum.
3A und 3B zeigen doppellogarithmisch-skalierte Graphen, welche die Chemilumineszenzsignale (y-Achse, log RLU) darstellen, die in separaten Experimenten von zwei unterschiedlichen und unterschiedlich markierten Oligonukleotidsonden (3A für eine o-F-AE-markierte Sonde 1 (⦁,o), und 3B für eine 2-Me-AE-markierte Sonde 2 (
,☐)), die gegen den gleichen Target-RNA-Analyten als eine Funktion der Target-Menge (x-Achse, log Analyt in fmol) gerichtet sind, erhalten worden sind; Sonde 2 (3b) war bei einer 100-fach geringeren spezifischen Aktivität vorhanden als bei der Sonde 1 (3A). Auch wenn alle erhaltenen Datenpunkte dargestellt worden sind, wurden nur einige (o,
) verwendet, um die Ausgleichsgerade zu berechnen.
4 ist ein doppellogarithmisch skalierter Graph für die Chemilumineszenzsignale, die unter Verwendung der gleichen Sonden, Marker und Targets, wie in 3A und 3B erhalten worden sind, jedoch wurde das gesamte Assay (Sonden in der gleichen Reaktionsmischung, die an den Analyten binden, und Chemilumineszenz) im gleichen Behälter durchgeführt; die für die Datenpunkte verwendeten Symbole sind die gleichen wie in 3A und 3B.
5A bis 5C sind doppellogarithmisch skalierte Graphen, welche die Chemilumineszenzsignale (y-Achse, log RLU) als Funktion der Target-Menge (x-Achse, log Analyt in fmol), die in separaten Experimenten unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Sonden (Sonden 3 und 4), die mit dem gleichen Chemilumineszenzmarker markiert wurden und untersucht wurden mittels: Sonde 3 alleine (5A), Sonde 4 alleine (5B) und Sonden 3 und 4 zusammen (5C), erhalten worden sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren und Zusammensetzungen gerichtet, welche die Detektion mindestens eines Analyten über einen breiteren totalen Konzentrationsbereich als es andernorts üblicherweise möglich ist, wenn eine einzelne Sonde verwendet wird oder mehrere Sonden in anderen Assayarten (z. B., wie beschrieben von Taber in EP 114,668 ), ermöglichen. Für gewöhnlich verwendet das Verfahren zwei oder mehr markierte Sonden, wobei jede Sonde auf den gleichen Analyten in einem unterschiedlichen Target-Bereich gerichtet ist. Jede markierte Sonde wird verwendet, um einen Analyten innerhalb eines unterschiedlich spezifizierten Konzentrationsbereiches zu detektieren und ist im Assay in einer Menge vorhanden, die auf eine definierte Art und Weise mit der maximalen molaren Menge eines Analyten innerhalb dieses Bereiches übereinstimmt. Das Sondenreagenz enthält eine erste Sonde, die in einem mindestens 10-fachen molaren Überschuss relativ zu einer zweiten Sonde vorhanden ist. Dadurch sind die markierten Sonden im Assay bei unterschiedlichen Konzentrationen, die mit zum Detektieren gesuchten unterschiedlichen Analytkonzentrationsbereichen übereinstimmen, vorhanden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die durch jeden der Marker erzeugten Signale durch das Messen der gleichen Art von Eigenschaftsänderung (z. B., die Detektion von Licht), detektiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das durch jeden Marker erzeugte Signal unabhängig voneinander unterscheidbar (z. B., durch das Detektieren unterschiedlicher Eigenschaften, die mit jedem Marker in Verbindung stehen, wie zum Beispiel Licht und radioaktiver Zerfall oder unterscheidbare Messungen der gleichen Eigenschaft, wie zum Beispiel Licht bei unterschiedlichen Wellenlängen). Darüber hinaus kann jede Sonde bei der gleichen oder bevorzugt bei unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten markiert sein.
Ein Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zum Detektieren von Analyten und Erweitern des Bereichs von Analytkonzentrationen bei denen die Analyten detektiert werden können durch die Verwendung von zwei oder mehreren Sonden. Jede Sonde ist mit einem detektierbaren Marker markiert und gegen einen unterschiedlichen Target-Bereich des gleichen Analyten gerichtet.
Bevorzugt sind die Marker, an die die Sonden gebunden sind, separat detektierbar. Mit „separat detektierbar" ist gemeint, dass die Marker im gleichen Reaktionsgefäß vorhanden sein können und jeder in der Anwesenheit des anderen unterschieden werden kann. Solche Marker können von gleicher allgemeiner Art sein, wie zum Beispiel Radionuklide (zum Beispiel ³²P und ¹²⁵I; wobei der erste durch Emission von β-Teilchen und der andere durch Emission von γ-Strahlen detektierbar ist), Chemilumineszenzmarker und Fluoreszenzmarker. Alternativ dazu kann eine Sonde mit einer bestimmten Art eines Markers markiert werden und eine andere Sonde kann mit einer anderen Art von Marker, wie zum Beispiel die erste Sonde mit einem Radionuklid und die zweite Sonde mit einem Fluoreszenzmarker, markiert sein. In anderen Ausführungsformen sind die Marker und Sonden nicht getrennt voneinander unterscheidbar (d. h., die gleiche messbare Eigenschaft wird detektiert), solange sie auf jeder Sonde in unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten vorhanden sind.
Mit „markiert" ist gemeint, dass die Sonde mit einer Verbindung zum Markieren verbunden ist. Der Marker kann entweder direkt oder indirekt gebunden sein. Ein Beispiel für das indirekte Markieren ist die Verwendung eines Intermediärmoleküls, wie zum Beispiel einem sekundären Antikörper oder einem Intermediäroligonukleotid, das seinerseits entweder direkt oder indirekt markiert ist. Das direkte Markieren kann über kovalente Bindungen oder über nicht-kovalente Wechselwirkungen, wie zum Beispiel Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobische und ionische Wechselwirkung oder über die Bildung von Chelaten oder Koordinationskomplexen erfolgen.
Wenn auf die Konzentration oder die Menge einer bestimmten Sonde, die einer Menge eines Analyten, für den die Sonde zur Detektion gestaltet worden ist, entspricht, Bezug genommen wird, versteht es sich, dass mit „dementsprechend" gemeint ist, dass die Konzentrationen oder Mengen der Sonde und des Analyten in einer vorhersagbaren und reproduzierbaren Art und Weise zueinander in Beziehung stehen; zum Beispiel durch ein bestimmtes Verhältnis bei einer Auswahl von Assaybedingungen.
Mit „Oligonukleotid" oder „Oligomer" ist eine multimerische Verbindung gemeint, die Nukleoside oder Nukleosidanaloga umfasst, die Stickstoffbasen oder Basenanaloga aufweisen, die einen Nukleinsäureanalyten spezifisch binden können, um einen stabilen Sonden:Analyt-Komplex auszubilden. Die Nukleoside können über Phosphordiesterbindungen miteinander verknüpft werden, um ein Polynukleotid auszubilden oder können auf jede andere Art und Weise verknüpft sein, welche die Bildung eines Target-spezifischen Komplexes mit einer Target-Nukleinsäure ermöglicht. Andere Verknüpfungen können zum Beispiel Phosphorthioat-Verknüpfungen, Methylphosphonat-Verknüpfungen und Peptidbindungen beinhalten. Peptidnukleinsäuren, so wie sie hier verwendet werden, sind in den Verbindungen enthalten, die als Oligonukleotide bezeichnet werden. Zuckerreste (Ribose, Desoxyribose) können mir Gruppen substituiert werden, welche die Stabilität der Hybridisationsreaktion (jedoch nicht die Ausbildung eines Sonden:Analyt-Komplexes verhindern), wie zum Beispiel mit 2'-Methoxysubstitutionen und 2'-Halogensubstitutionen, wie zum Beispiel 2'-F, beeinflussen. Die Basen können herkömmliche Basen (A, G, C, T, oder U) oder Analoga davon sein (siehe z. B., The Biochemistry of the Nucleid Acids 5–36, Adams et al., Hrsg. 11. Ausgabe, 1992).
Mit „spezifischer Aktivität" sind Einheiten von erhaltenen detektierbaren Signalen aus der Marker-pro-Einheit-Messung der Sonde gemeint. Die Einheiten von detektierbaren Signalen können in Zählungen pro Minute (cpm), Lichtabsorptionseinheiten bei einer spezifischen Wellenlänge, relative Lichteinheiten („RLU"), Einheiten an enzymatischer Aktivität oder jeder anderen Einheit für das Messen der Menge an vorhandenem Marker, ausgedrückt werden. Gleichermaßen können die Einheiten der Sondenmessungen als Einheiten der Masse (z. B., μg) oder als eine Messung der Anzahl der Moleküle (z. B., μmol) ausgedrückt werden.
Mit dem Begriff „Bindungspartner" oder „Sonde" ist eine Molekülverbindung gemeint, die mit einem Analyten binden oder Wechselwirken kann. Ein Bindungspartner oder Sonde wird dafür verwendet, um die Anwesenheit oder Menge eines Analyten in einer Probe anzuzeigen. Wenn nicht der Bindungspartner oder die Sonde von Natur aus oder direkt detektierbar ist, ist ein Marker direkt oder indirekt mit der Sonde konjugiert. Analyten die detektiert werden können beinhalten zum Beispiel Nukleinsäuren, Antikörper, Proteine, Enzyme, Lipide, Kohlenhydrate, Zelloberflächenrezeptoren, Cytokine, Hormone, Antigene, Metalle, Molekülkomplexe, wie zum Beispiel polymere Anordnungen von Proteinen oder anderen Makromolekülen und ähnlichem. Gleichermaßen können Bindungspartner oder Sonden zum Detektieren dieser Analyten zum Beispiel Nukleinsäuresonden, Antikörper, Antigene, Haptene, chelatierende Agenzien, Enzyme, Enzymsubstrate, Proteine und Analoga davon beinhalten.
Mit „Target-Bereich" oder „Bereich" ist jeder Teil eines Analyten, kontinuierlich oder nicht-kontinuierlich, gemeint, der an eine Sonde oder einen Bindungspartner spezifisch bindet. Wenn zum Beispiel der Analyt eine Nukleinsäure ist, kann ein Target-Bereich eine Nukleotidbasensequenz umfassen, die eine Sonde spezifisch bindet. Der Target-Bereich kann ebenso eine sekundäre oder tertiäre Struktur des Analyten, an den die Sonde spezifisch bindet, umfassen. Wenn, wie in einem anderen Beispiel, der Analyt ein Protein oder ein Peptid ist, kann ein Target-Bereich eine Aminosäuresequenz oder eine Konformationsdomäne des Proteins oder Peptids, an welche die Sonde spezifisch bindet, sein. Bevorzugt kann ein Target-Bereich einen anderen Target-Bereich des gleichen Analyten nicht überlappen, so dass das gleichzeitige in-Kontakt-bringen mehrerer Sonden mit dem Analyten nicht mit einem Wettkampf zwischen den Sonden enden wird.
Es ist ein Ziel der Erfindung, Verfahren zur Detektion eines großen Bereiches von Target-Analytkonzentrationen bereit zu stellen. Üblicherweise steigern die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit den Analyten über mindestens zwei Größenordnungen genau zu detektieren. Durch das Verwenden von zusätzlichen Sonden mit separat voneinander unterscheidbaren Markern kann der dynamische Bereich eines Assays für eine einzelne Probe über 3 bis 6 Größenordnungen oder mehr erweitert werden. Diese Verfahren erlauben die Analytdetektion in einer einzelnen Probe ohne das Durchführen von Probenverdünnungen oder das Testen von Wiederholungsproben unter unterschiedlichen Bedingungen. Bevorzugt wird die dynamische Reaktion des Assays für ein erwartetes Analytniveau a priori entwickelt, um einen Bereich von Analytmengen abzudecken. Das Verfahren ermöglicht bevorzugt Probenanalysen in einem einzelnen Röhrchen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist das Bereitstellen von Zusammensetzungen für die Detektion oder Quantifikation eines Analyten, die von einer Person mit einem Minimum an spezialisierten Übungen in medizinischen, klinischen oder wissenschaftlichen Verfahren verwendet werden kann. Durch die Möglichkeit nach einem Analyten zu suchen, der in einer Probe bei einer Konzentration innerhalb eines großen Bereiches von möglichen Konzentrationen vorhanden sein kann, stellt die Erfindung Zusammensetzungen bereit, welche die Automation vieler Aspekte von Assays ermöglicht, während die Probenhandhabung und das Risiko eines Fehlers minimiert werden. Daher stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die das Trainingsniveau für das Laborpersonal minimieren, das für die Durchführung von Assays benötigt wird, die eine Assayautomatisierung ermöglichen und die Variabilität der Resultate verringern.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Detektieren oder Messen eines oder mehrerer in einer Probe vorhandener Analyten, das die Schritte des in-Kontakt-bringens der Probe mit einem Sondenreagenz, das zwei oder mehr Sonden beinhaltet, unter Bedingungen, welche das Binden der Sonden mit dem Analyten begünstigen, beinhalten. Jede Sonde ist an einen Marker gebunden und bindet spezifisch an einen separaten Target-Bereich des Analyten, so dass jede markierte Sonde so ausgestaltet ist, um den Analyten über einen anderen Bereich von Analytkonzentrationen zu detektieren und die Menge jeder im Sondenreagenz vorhandenen Sonde der Menge des Analyten, der durch die Sonde detektiert werden soll, entspricht. Dann beinhaltet das Verfahren den Schritt des Detektierens der Anwesenheit von mindestens einem Marker als ein Hinweis auf die Anwesenheit oder Menge des Analyten in der Probe, wobei der Bereich der möglichen Analytmengen in der Probe, der detektiert oder durch das Sondenreagenz gemessen werden kann, größer ist als der Bereich von Analytmengen in der Probe, der durch eine markierte Sonde oder eine Kombination von Sonden, wie im Stand der Technik beschrieben (z. B., siehe EP 114,668 ) detektiert oder gemessen werden kann. Bevorzugt wird sowohl der Schritt des in-Kontakt-bringens als auch der Schritt des Detektierens im gleichen Behälter durchgeführt. In einer Ausführungsform macht das Verfahren Gebrauch von separat voneinander unterscheidbaren Markern. In einer anderen Ausführungsform macht das Verfahren Gebrauch von zwei oder mehr markierten Sonden, die unterschiedliche spezifische Aktivitäten aufweisen.
Sonden sind im Sondenreagenz in unterschiedlichen Mengen vorhanden. Das Sondenreagenz enthält eine erste Sonde, die in mindestens einem 10-fach molaren Überschuss relativ zu einer zweiten Sonde vorhanden ist. Die Menge jeder Sonde entspricht und definiert die obere Grenze des Bereichs von Konzentrationen des Analyten, den die markierte Sonde spezifisch bindet und den sie detektiert. Dieses Merkmal ist wichtig, da die Menge jeder markierten Sonde im Assay die Menge des vorhandenen Hintergrunds definieren kann. Auch wenn die Sonden in ihrer spezifischen Aktivität unterschiedlich sind, ist die Sonde mit der höchsten spezifischen Aktivität im Allgemeinen in der geringsten Menge vorhanden, während die Sonde mit der geringsten spezifischen Aktivität im Allgemeinen in der größten Menge vorhanden ist. Dadurch wird der Hintergrund eines Markers, der mit einer ungebundenen Sonde in Verbindung steht, minimiert.
Ein anderes Ziel der Erfindung stellt Zusammensetzungen und Kits zum Detektieren von Analyten, die in einer Probe innerhalb eines großen Bereichs von möglichen Konzentrationen vorhanden sein können, bereit. Solche Zusammensetzungen beinhalten ein Sondenreagenz, das zwei oder mehr markierte Sonden beinhaltet, die an separate Target-Bereiche des Analyten binden können. Die markierten Sonden im Reagenz können den Analyten über verschiedene Bereiche von möglichen Analytkonzentrationen detektieren, da die Konzentration jeder Sonde im Reagenz der maximalen Konzentration des durch die bestimmte Sonde zu detektierenden Analyten entspricht. Ein Analyt kann zwei oder mehrere Sonden binden und jede Sonde ist dazu in der Lage an einen Target-Bereich des Analyten spezifisch zu binden. Eine Sonde und/oder ein Analyt kann eine Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid, ein Protein (z. B., ein Antigen, Antikörper, Hormon, Cytokin oder zellulärer Rezeptor) oder eine Peptidnukleinsäure sein.
Das vorliegende Verfahren beinhaltet Verfahren, Kits und Zusammensetzungen zur Detektion und zum Messen eines Analyten, der in einer Probe innerhalb eines breiten Konzentrationsbereiches vorhanden sein kann. Das Verfahren vermeidet die Notwendigkeit Proben zu verdünnen oder Wiederholungstests einer einzelnen Probe unter unterschiedlichen Bedingungen durchzuführen. Die Erfindung stellt ein kosten-, zeit- und personaleffizientes Format zur Detektion eines Analyten, der zwei oder mehr Bindungspartner binden kann, bereit.
Die Erfindung schließt drei für Analyt-Detektionsassays übliche Beobachtungen ein. Die erste Beobachtung ist, dass jedes Assaysystem, das einen Marker zur Analytdetektion verwendet, ein Hintergrundniveau eines nicht-spezifischen Signals ergibt, das durch „freie" Marker erzeugt wird. Mit „freier" Marker ist ein Marker gemeint, der in einem Assay in einer ungebundenen Form vorhanden ist, nachdem das Assay durchgeführt worden ist oder markierten Sonden, die keinen Analyten gebunden haben und ein detektierbares Signal erzeugen. Assayformate haben üblicherweise ein inhärentes Hintergrundniveau, das von Assay zu Assay variieren kann, jedoch üblicherweise im Bereich von etwa 0.01% bis etwa 10% oder noch bevorzugter im Bereich von etwa 0.01% bis etwa 1% des im Assay gemessenen Gesamtsignals liegt. Der Hintergrund kann ebenso das elektronische Rauschen beinhalten, das in dem Instrument vorhanden ist, das zum Detektieren des Markers verwendet wird.
Die zweite Beobachtung ist, das jedes Instrument oder Verfahren, das zum Detektieren des Markers verwendet wird, ein maximales Niveau für die Signaldetektion aufweist, jenseits dessen ein zusätzliches Signal nicht detektiert wird. Zum Beispiel könnte ein Luminometer ein maximales Detektionsniveau von zwei Millionen relativen Lichteinheiten („RLU") aufweisen und wenn eine Probe einen Marker enthält, der vier Millionen RLU ergibt und von diesem Instrument ausgelesen wird, wird es die Menge des in der Probe vorhandenen Markers nur auf die Hälfte (d. h., es wird zwei Millionen RLU anzeigen) einschätzen. Dieses Phänomen wird als Verlust des dynamischen Bereiches am „oberen Ende" beschrieben. Bei einer Kombination mit der ersten Beobachtung wird erkennbar, dass es sowohl Begrenzungen beim Minimal- als auch beim Maximalniveau für den Analyten gibt, der mit einem Standardassaysystem detektiert werden kann.
Die dritte Beobachtung ist, dass unterschiedliche Marker getrennt voneinander in der Anwesenheit des jeweils anderen detektiert werden können. Daher wird der durch einen ersten Marker beigebrachte Hintergrund für gewöhnlich im Wesentlichen nicht die Detektion eines anderen unabhängig davon detektierbaren Markers stören. Obwohl keine Wechselwirkung zwischen unterschiedlichen Markern von Vorteil ist, verhindert die unerhebliche Wechselwirkung nicht die unabhängige Detektion von zwei oder mehr Markern.
Der durch markierte Sonden erzeugte Hintergrund wirft dann ein Problem auf, wenn unterschiedliche Sonden nicht voneinander unterschieden werden können. Der durch eine in großen Mengen vorhandenen Sonde erzeugte Hintergrund kann geringe Signalmengen einer anderen in geringen Mengen vorhandenen Sonde verdecken. Dieses Problem kann auf zweierlei Art und Weise gelöst werden, wie im Detail weiter unter beschrieben wird. Als erstes können Sonden mit unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten verwendet werden, so dass eine markierte Sonde, die in großen Mengen vorhanden ist, keinen signifikanten Hintergrund erzeugen wird, wenn ihre spezifische Aktivität gering ist. Wenn zweitens die markierten Sonden mit der gleichen spezifischen Aktivität unabhängig voneinander erkennbar sind, wird der durch eine markierte Sonde erzeugte Hintergrund nicht das Signal überlagern, das durch eine andere in geringen Mengen vorhandene Sonde erhalten wird.
Wenn Populationen unterschiedlicher Sonden jeweils auf separate Target-Bereiche eines Signalanalyten gerichtet sind, werden die unterschiedlichen Sonden nicht miteinander um die Analytbindung konkurrieren. Daher binden die unterschiedlichen Sonden separat voneinander und zeigen die Anwesenheit des Analyten an. Wenn markierte Sonden verwendet werden ist die separate Detektion jedes Target-Bereiches möglich, da jeder Sonden:Target-Bereich-Komplex einen unabhängigen Hinweis auf die Anwesenheit des Analyten gibt. Durch das Bereitstellen jeder markierten Sonde in einer Mischung bei unterschiedlicher Konzentration in Bezug auf jede andere markierte Sonde, ist jeder Target-Bereich ein Hinweis auf eine Analytkonzentration innerhalb eines Bereichs von Konzentrationen. Daher bildet eine Sammlung dieser Sonden eine Sequenz von Konzentrationsbereichen, die detektiert werden können.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwenden ähnliche, jedoch unterschiedliche Arten für das Erweitern des Konzentrationsbereiches eines Assays, das unter Verwendung von mehr als einer Sonde oder Bindungspartners einen Analyten detektiert. Um dies deutlicher darzustellen, werden weiter unten drei Modellsysteme beschrieben.
Modellsystem 1: Verwendung von nicht zu unterscheidenden Markern und Sonden mit unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten
Zum Zwecke der Darstellung werden drei Sonden verwendet, wobei jede auf unterschiedliche Target-Bereiche des gleichen Analyten gerichtet ist. Es versteht sich, dass jede Anzahl von Sonden, die größer als 1 ist, in anderen Anwendungen des Verfahrens gleichermaßen verwendbar wäre. Jede Sonde ist mit einer einzelnen Art von Markern markiert. In der Praxis könnte dieser Marker von Sonde zu Sonde unterschiedlich sein, wie zum Beispiel unterschiedliche Radionuklide oder unterschiedliche Fluoreszenzmoleküle, jedoch wird für das von jedem Marker abgegebene Signal angenommen, dass es von dem durch andere Marker abgegebenen Signal nicht zu unterscheiden ist.
In diesem Modellassay kommt die Mischung der markierten Sonden 1, 2 und 3 mit dem Analyten unter Bedingungen in Kontakt, welche das Binden aller Sonden an ihre entsprechende Target-Bereiche auf dem Analyten begünstigen. Nach dem Binden wird ein Schritt zum Unterscheiden der gebundenen Sonden von den ungebundenen Sonden eingefügt; dieser Schritt kann einfach durch den Durchschnittsfachmann bestimmt werden, abhängig davon ob eine heterogenes oder homogenes Assaysystem verwendet wird (z. B., ein physikalischer Trennungsschritt oder Hydrolyseschritt, der den Marker auf ungebundenen Sonden selektiv inaktiviert). Dann werden die gebundenen, markierten Sonden unter geeigneten Bedingungen, die durch den Durchschnittsfachmann abhängig von den verwendeten Markern (z. B., durch das Detektieren von Licht, radioaktiven Zerfall oder Produkten einer Enzym-Substratreaktion) einfach bestimmt werden können, detektiert. Die im Folgenden dargestellten Berechnungen gehen von einer 100%-igen Effizienz der Detektion aus.
In allen dargestellten Modellsystemen wird davon ausgegangen, dass jede Sonde auf einen Target-Bereich gerichtet ist, der in einer einzelnen Kopie für jede Analyteinheit, z. B. eine für eine Target-Nukleinsäure einzigartigen Nukleotidsequenzbereich oder eine für ein Target-Polypeptid einzigartige Domäne, vorhanden ist. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass eine Vielzahl solcher Stellen für jeden Target-Bereich, für den eine bestimmte Sonde zum Binden entworfen worden ist, existieren kann. Auch wenn die folgenden Berechnungen von einer eins zu eins Entsprechung zwischen den Target-Bereichen und dem Analyten ausgehen, würden diese Berechnungen für den Fall das zwei oder mehr Target-Bereiche für jede Analyteinheit vorhanden sind, sich nur dadurch unterscheiden, dass eine einfache Korrektur genügt, um dieser Tatsache Rechnung zu tragen. Das heißt, dass der Durchschnittsfachmann feststellen wird, dass die unten bereitgestellten Berechnungen für Analyten, die zwei Target-Bereiche pro Analyt enthalten mit zwei, für Analyten, die drei Target-Bereiche pro Analyt enthalten mit drei, und so weiter, multipliziert werden sollten.
Für diese Berechnung wird angenommen, dass die gewünschten detektierbaren Analytmengen von 0,01 fmol (1 fmol entspricht 10^–15 mol) bis 10.000 fmol variieren. Drei Sonden mit unterschiedlichen Konzentrationen werden in dem Assay verwendet: 1 fmol von Sonde 1, 100 fmol von Sonde 2 und 10.000 fmol von Sonde 3. Diese Sonden werden mit unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten markiert, die mit der Menge der Sonde im Assay in umgekehrter Beziehung stehen. Für diese Darstellung wird davon ausgegangen, dass Sonde 1 mit 10⁸ Einheiten an Marker/pmol (10^–12 mol) an Sonde, Sonde 2 mit 10⁶ Einheiten an Marker/pmol und Sonde 3 mit 10⁴ Einheiten an Marker/pmol markiert ist. Das ergibt die gleiche Menge an Marker (10⁵ Einheiten), die von jeder Sonde bei der Reaktion bereitgestellt wird.
Für diese Darstellung wird davon ausgegangen, dass, wenn kein Analyt in der Probe vorhanden ist, der Hintergrund 0,1% des gesamten detektierbaren Signals im Assay ist. Auf dem oben genannten basierend ist diese Menge 0,1% × 10⁵ Einheiten = 100 Einheiten an Hintergrund für jede Sonde, insgesamt 300 Einheiten für alle drei Sonden. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass diese relativ geringe Menge an Hintergrund, die Detektion eines Analyten bei niedrigen Konzentrationen ermöglicht.
Wenn zum Beispiel 3 amol (1 amol = 10^–18 mol) eines Analyten im Assay vorhanden sind, binden 3 amol an Sonde 1 und der Sonde 1:Analyt-Komplex erzeugt ein Signal von 300 Einheiten. Wenn es mit dem Hintergrund kombiniert wird, liegt das detektierte Gesamtsignal bei 600 Einheiten (300 Einheiten an Hintergrund und 300 vom Sonde 1:Analyt-Komplex) was ein zweifaches Signal-Rausch („S/N")-Verhältnis bei dieser Analytkonzentration ergibt; ein zweifaches S/N-Verhältnis oder größer wird vom Durchschnittsfachmann im Allgemeinen als ein positives Signal gewertet. Wenn 3 amol eines Analyten vorhanden sind, binden auch 3 amol jeweils von der Sonde 2 und der Sonde 3 am Analyten. Aufgrund ihrer geringeren spezifischen Aktivität trägt Sonde 2 jedoch nur 0,3 Einheiten zum Signal bei, während Sonde 3 0,0003 Einheiten beiträgt. Daher tragen die Signale von diesen Sonden nicht wesentlich zum von der Sonde 1 bei dieser Analytkonzentration erhaltenen Signal bei.
Wenn bei Verwendung der gleichen Sonden die Konzentration des Analyten auf 1 fmol erhöht wird, bindet die gesamte Sonde 1 an den Analyten, und der Sonde 1:Analyt-Komplex ergibt 10⁵ Einheiten des detektierbaren Markers. Nur 0,1% von 10⁵ Einheiten des Signals von Sonde 1 (100 Einheiten) ergibt sich in Folge des Hintergrunds für diese Sonde. Auch in diesem Assay binden 1 fmol der Sonde 2 und 3 an den Analyten, um Sonde 2:Analyt- und Sonde 3:Analyt-Komplexe zu erzeugen. Da diese Sonden mit einer geringeren spezifischen Aktivität markiert sind, produziert der Marker der Sonde 2 1.000 Signaleinheiten und der Marker der Sonde 3 erzeugt 10 Signaleinheiten bei der Detektion. Das heißt, dass der Marker der Sonde 2 ungefähr 1% zum detektierten Gesamtsignal beiträgt und der Marker der Sonde 3 unterhalb des Hintergrundsignals liegt. Das detektierte Gesamtsignal liegt bei 100.000 + 1.000 + 10 = 101.010 Einheiten wenn 1 fmol des Analyten vorhanden ist.
Wenn zwischen 1 und 100 fmol des Analyten in der zu untersuchenden Probe vorhanden sind, variiert das detektierbare Signal der markierten Sonde 2 im Verhältnis zur Targetkonzentration. Bei diesen Konzentrationen ist die gesamte Sonde 1 an ihren Target-Bereich gebunden, wobei ein Signal erzeugt wird, das zu ihren 100.000 Einheiten an detektierbarem Marker äquivalent ist. Der Marker in den Sonde 2:Analyt-Komplexen wird ebenso detektiert. Zum Beispiel wird bei 100 fmol des Analyten die gesamte erhältliche Sonde 2 gebunden und die Marker der Sonde 2 werden als weitere 100.000 Signaleinheiten detektiert; ebenso werden 100 fmol der Sonde 3 gebunden, womit 1.000 Einheiten an Marker beigesteuert werden. Demzufolge werden 100 fmol des Analyten als 100.000 + 100.000 + 1.000 = 201.000 Signaleinheiten detektiert.
In ähnlicher Weise werden in einem Bereich von 100 fmol bis 10.000 fmol des Analyten die gesamte Sonde 1 und Sonde 2 in der Reaktionsmischung an den Analyten gebunden, wobei für beide 100.000 Einheiten des detektierbaren Signals erzeugt werden. Die Sonde 3 ist verfügbar, um mit bis zu 10.000 fmol des Analyten zu binden, wobei ein Signal von Sonde 3:Analyt-Komplexen erzeugt wird, das proportional zur Menge der markierten Sonde 3 ist, die gebunden ist. Wenn zum Beispiel 10.000 fmol (oder 10 pmol) des Analyten vorhanden sind, tragen Sonde 1, 2 und 3 jeweils 100.000 Einheiten zum detektierbaren Signal bei, womit sich insgesamt 300.000 Einheiten an detektierbarem Signal ergeben.
Die berechneten Beiträge an Signaleinheiten für alle markierten Sonden 1, 2 und 3 und das Gesamtsignal für die unterschiedlichen Mengen des Analyten in einem Assay, wie weiter oben erörtert, werden in Tabelle 1 dargestellt. Aus den in Tabelle 1 dargestellten berechneten Mengen wird ersichtlich, dass die Verwendung von drei unterschiedlichen Sonden den Bereich des Assays über das hinaus erweitert, was bei Verwendung nur einer Sonde erhältlich ist, da das detektierte Signal eine Anhäufung der Beiträge der drei unabhängigen Sonden darstellt. Das würde nicht so sein, wenn die drei Sonde identisch wären oder anderweitig auf den gleichen Target-Bereich des Analyten gerichtet wären; in diesem Fall würde jede Sonde um die Bindung mit jeder anderen Sonde konkurrieren und die Mischung dieser Sonden würde im wesentlichen eine „Mittelwertbildung" der spezifischen Aktivitäten der drei Sonden mit der höheren Abundanz darstellen, wobei die Sonde mit der niedrigen spezifischen Aktivität vorherrscht.
Tabelle 1
Modellsystem 2: Verwendung von unterscheidbaren Markern an Sonden mit der gleichen spezifischen Aktivität
Wie im Modellsystem 1 werden drei Sonden verwendet und jede Sonde ist auf einen bestimmten Bereich des Analyten gerichtet, so dass die Sonden nicht um das Anbinden an den Analyten konkurrieren. In diesem Modellsystem ist jede Sonde mit einem anderen, separat voneinander unterscheidbaren Marker markiert und die Sonden werden bei gleicher spezifischer Aktivität markiert. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass diese Marker vom gleicher oder von unterschiedlicher Art sein können. Zum Beispiel können alle Marker Chemilumineszenzmarker sein, oder alternativ dazu könnte ein Marker ein radioaktiver Marker, einer ein fluoreszierender Marker und einer ein chemilumineszierender Marker sein. Geeignete Detektionssysteme, die für jeden der Marker spezifisch sind, sind dem Durchschnittsfachmann gut bekannt und erfordern nur Routinetests zum Optimieren der Detektion.
Es werden das gleiche Basis-Assay-System und Bereich von Analytkonzentrationen, die detektiert werden sollen, wie im Modellsystem 1 verwendet. Auch die Sonden sind in unterschiedlichen Mengen vorhanden, um mit den für jede Sonde detektierbaren unterschiedlichen Analytkonzentrationsbereichen zu korrelieren. Daher ist für diese Darstellung 1 fmol der Sonde 1 vorhanden, 100 fmol der Sonde 2 vorhanden und 10.000 fmol der Sonde 3 vorhanden. Da jede Sonde bei gleicher spezifischer Aktivität markiert ist (hier willkürlich ausgewählt und liegt bei 10⁸ Einheiten an Marker/pmol an Probe), gibt es 10⁵ Einheiten an detektierbarem Signal von der markierten Sonde 1, 10⁷ Einheiten an detektierbarem Signal von der markierten Sonde 2 und 10⁹ Einheiten an detektierbarem Signal von der markierten Sonde 3 im Reaktionsgemisch.
Für diese Darstellung ist der Hintergrund wiederum willkürlich auf 0,1% des maximalen detektierbaren Signals, das dem Assay inhärent ist, gesetzt worden. Anders als die im Modellsystem 1 beschriebenen, sind die Marker in diesem Modellsystem voneinander unterscheidbar. Das heißt, wenn 1 fmol des Analyten in der Probe vorhanden ist, bindet die gesamte Sonde 1 an den Analyten und ergibt 10⁵ Signaleinheiten von Sonde 1:Analyt-Komplexen; und der Hintergrund für die Sonde 1 ist 100 Signaleinheiten. Bei diesen gleichen Analytkonzentrationen binden ebenfalls 1 fmol der Sonde 2 und 3 an das Target, wobei 10⁵ Signaleinheiten von jedem ihrer Marker erzeugt werden. Da der Marker für jede Sonde unabhängig voneinander detektierbar ist, wird weder Sonde 2 noch 3 detektiert, wenn die Sonde 1 spezifisch detektiert wird und umgekehrt. In gleicher Weise wird der Hintergrund, der durch die Marker 2 und 3 erzeugt wird, im Allgemeinen die Detektion des Markers 1 und umgekehrt aufgrund der spezifischen und unabhängigen verwendeten Detektionsverfahren, nicht beeinflussen.
Bei Analytmengen größer als 1 fmol, ist keine weitere Sonde 1 zum Binden verfügbar, da nur 1 fmol der Sonde 1 in der Reaktion vorhanden ist. Wenn zum Beispiel 100 fmol (0,1 pmol) des Analyten vorhanden sind, ist die gesamte Sonde 1 an den Analyten gebunden und jeweils 100 fmol von Sonde 2 und 3 sind an ihre entsprechenden Target-Bereiche am Analyten gebunden, wobei 10⁵ Signaleinheiten von den Sonde 1:Analyt- und 10⁷ Signaleinheiten von allen Sonde 2:Analyt- und Sonde 3:Analyt-Komplexen erzeugt werden. Der Hintergrund aller Marker, die mit den Sonden 2 und 3 in Verbindung stehen, liegt bei 0,001 × 10⁷ Einheiten oder 10.000 Einheiten. Da die Marker außerdem unabhängig voneinander detektierbar sind interferiert der durch einen Marker beigetragene Hintergrund für gewöhnlich nicht mit der Detektion der anderen.
Bei Analytkonzentrationen von zwischen 100 und 10.000 fmol, werden die Sonden 1 und 2 vollständig am Analyten gebunden, wobei 10⁵ Signaleinheiten von den Sonde 1:Analyt- und 10⁷ Signaleinheiten von den Sonde 2:Analyt-Komplexen, die detektiert worden sind, erzeugt werden. Sonde 3 bindet bis zu 10⁵ fmol (10 pmol) des Analyten; da diese Sonde bei der gleichen spezifischen Aktivität wie die anderen Sonden markiert ist, werden 10⁹ Signaleinheiten von Sonde 3 detektiert. Der durch den Marker der Sonde 3 erzeugte Hintergrund liegt bei 10⁹ × 0,001 oder 10⁶ Signaleinheiten.
Die berechneten Signaleinheiten für jede der markierten Sonden 1, 2 und 3 und das Gesamtsignal für jeden detektierbaren Marker für unterschiedliche Mengen des Analyten in einem Assay, wie weiter oben erörtert, werden in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Wie aus Tabelle 2 zu erkennen ist, wird anders als in der im Modellsystem 1 dargestellten Situation, in der die Marker nicht voneinander unterscheidbar und von unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten waren, in dieser Ausführungsform die gleiche lineare Beziehung zwischen der Menge des Analyten in der Probe und der Menge des detektierten Signals für jede der drei verwendeten Sonden beibehalten. Auch wenn die Assaymethodik des Modellsystems 2 stichhaltig ist, ist es möglich, dass eine Detektionsvorrichtung oder -verfahren nicht die Signale innerhalb aller, in der Tabelle 2 dargestellten Bereiche, messen kann. Wenn zum Beispiel die Detektionsvorrichtungen oder -verfahren für jeden Marker die oberen Signalgrenzen für jeden Marker (d. h. 100.000 Einheiten für Marker 1, 10.000.000 Einheiten für Marker 2 und/oder 1.000.000.000 Einheiten für Marker 3) nicht genau messen, dann wird die Genauigkeit in diesem Ansatz verringert. Es wird verständlich sein, dass das zum Detektieren eines Markers verwendete Verfahren oder Vorrichtung nicht zwangsweise die gleiche Vorrichtung oder Verfahren sein muss, das zur Detektion des anderen Markers verwendet wird.
Wenn die Detektionsverfahren und/oder Vorrichtung das von jedem Marker erzeugte Signal in ihrem „effektiven Detektionsbereich" (d. h., der Bereich der Analytmengen, der von der Messung dieses bestimmten Markers im Assay abhängt) genau messen können und jeder Marker im wesentlichen von jedem anderen Marker unterschieden werden kann, dann hat dieses Assayformat deutliche Vorteile gegenüber dem in Modellsystem 1 dargestellten Format. Da die spezifischen Aktivitäten der Marker im Modellsystem 2 die gleichen sind, besteht zwischen der Menge des Analyten und der Menge des erzeugte Signals im dynamischen Bereich des Assays für alle Sonden die gleiche Beziehung. Daher erlaubt dieses Assayformat die Detektion eines Analyten mit erhöhter Empfindlichkeit verglichen zu der des Modellsystems 1.
Modellsystem 3: Verwendung von unterscheidbaren Markern und Sonden mit unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten
Dieses Modellsystem beschreibt die Detektion eines Analyten über einen weiten Bereich von möglichen Analytmengen oder Konzentrationen durch die Verwendung von mit voneinander unterscheidbaren Markern markierten Sonden, die mit unterschiedlichen Sonden verbunden sind, wobei je Sonde eine andere spezifische Aktivität aufweist. Daher ist dieses Modellsystem ein Hybrid der Bedingungen des Modellsystems 1 und 2, welche die Merkmale im Detail zuvor näher beschrieben haben.
Zur Darstellung von Modellsystem 3 wurden wie in Modellsystem 1 und 2 drei markierte Sonden verwendet, wobei jede für einen unterschiedlichen Target-Bereich des Analyten spezifisch ist. Jede Sonde ist wie zuvor in einer anderen Menge vorhanden (1 fmol der Sonde 1, 100 fmol der Sonde 2 und 10.000 fmol der Sonde 3), was es jeder Sonde ermöglicht, einen spezifischen Bereich des Analyten in einer Probe zu detektieren. Wie im Modellsystem 1 wird jede Sonde im Vergleich zur anderen Sonde bei einer unterschiedlichen spezifischen Aktivität markiert: Sonde 1 weist eine spezifische Aktivität von 10⁸ Signaleinheiten/pmol auf, Sonde 2 weist eine spezifische Aktivität von 10⁶ Signaleinheiten/pmol auf und Sonde 3 weist eine spezifische Aktivität von 10⁴ Signaleinheiten/pmol auf. Als Folge davon entspricht die maximale Menge jeder Sonde im Assay 10⁵ Signaleinheiten. Wie im Modellsystem 2 sind alle Sonden getrennt voneinander unterscheidbar.
Die detektierbaren Signalmengen für jede Sonde in den Assays, die unterschiedliche Menge des Analyten enthalten, wurden, wie weiter oben für das Modellsystem 1 und 2 diskutiert, berechnet. Tabelle 3 zeigt die berechneten Signaleinheiten für alle markierten Sonden 1, 2 und 3 und das Gesamtsignal für alle detektierbaren Marker für unterschiedliche Mengen des Analyten (in pmol) in einem Assay, wie es weiter oben für das Modellsystem 1 und 2 erörtert worden ist.
Tabelle 3
Da jeder Marker von den anderen Markern separat unterscheidbar ist, wird jede Sonde detektiert, ohne durch das Signal der anderen Sonden überlagert zu werden. Da die spezifischen Aktivitäten aller markierten Sonden unterschiedlich sind, ist die Menge des erhaltenen Signals beim Detektieren sehr kleiner Mengen des Analyten gesteigert, während die Menge des erhaltenen Signals beim Detektieren von sehr großen Mengen des Analyten abgeschwächt ist. Dieses Merkmal ist besonders Vorteilhaft wenn das Detektionsverfahren oder -vorrichtung, das zum Detektieren eines oder mehrerer dieser Marker verwendet wird, auf einen bestimmten dynamischen Bereich begrenzt wird. Zum Beispiel ergaben in der derzeit dargestellten Situation alle drei Sonden ein detektierbares Signal im gleichen Bereich von etwa 10³ bis 10⁵ Signaleinheiten. Während das Assay auf diese Weise einen Analyten über sechs Größenordnungen detektiert, benötigt eine Detektionsvorrichtung, die zum Detektieren irgendeines Sonden:Analyt-Komplexes verwendet wird, nur eine Genauigkeit über zwei Größenordnungen.
Die letztere Tatsache hat bei bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung Vorteile. Zum Beispiel können getrennt voneinander unterscheidbare Marker mittels eines einzelnen Instrumentes oder Detektionsverfahrens detektierbar sein. In besonders bevorzugten weiter unten beschriebenen Aspekten der Erfindung werden getrennt voneinander detektierbare Chemilumineszenzmarker verwendet. Spezifische Chemilumineszenzmarker können durch das Messen der Lichtemission im gleichen Wellenlängenbereich über unterschiedliche Zeiträume oder über den gleichen Zeitraum mittels mathematischer Verfahren zum Auflösen der Signale mittels eines einzelnen Luminometers detektiert werden. Zusätzlich sind die Marker bei unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten vorhanden, was den dynamischen Bereich des Luminometers verringert, der zum Detektieren der Analyten über einen weiten Bereich von Konzentrationen benötigt wird. Daher beschränken jegliche inhärente Beschränkungen im dynamischen Bereich des Luminometers nicht die Fähigkeit des Verfahrens, den Analyten über einen größeren Konzentrationsbereich zu detektieren, als es mit einer einzelnen Sonde möglich wäre, da getrennt voneinander unterscheidbare Marker verwendet werden, um diesen gesteigerten Bereich abzudecken, wobei jeder Marker innerhalb des intrinsischen dynamischen Bereichs des Instrumentes individuell detektierbar ist.
Die folgenden Beispiele stellen einige der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung dar.
Beispiel 1
Erweiterter dynamischer Detektionsbereich in Nukleinsäure-Hybridisationsassays
Auch wenn die Verfahren der Erfindung auf kein bestimmtes Format oder die Verwendung einer bestimmten Markerart begrenzt sind, bezieht sich dieses Beispiel auf Nukleinsäure-Hybridisationsassays, die Oligonukleotidsonden verwenden, die mit Chemilumineszenz-Acridiniumester-Markern markiert sind.
Die Fähigkeit zahlreicher Lumineszenz-, Fluoreszenz- und Chemilumineszenzmarker in einer Mischung getrennt voneinander detektierbar zu sein, ist bereits früher detailliert beschrieben worden, z. B. Woodhead et al., US Pat. Nr. 5,656,207 und Nelson et al., US Pat. Nr. 5,658,737. Insbesondere der letzte Verweis beschreibt die Verwendung verschiedener Acridiniumester (AE)-Derivate in einem einzelnen Assay und ihre Fähigkeit in einer Vielzahl von Formaten getrennt voneinander detektierbar zu sein. Diese Formate schließen die Verwendung von chemilumineszierenden AE-Derivaten, die Licht bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, und das separate Detektieren jedes Markers; die Verwendung von AE-Derivaten, die in einer lichtemittierenden Reaktion bei unterschiedlichen Frequenzen reagieren und das separate Detektieren der Marker auf der Basis von Reaktionskinetiken; und das Verwenden von Markern, die bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen reagieren, wie zum Beispiel pH, Temperatur und ähnliches, ein.
1A bis 1C zeigen die Strukturen zahlreicher Acridiniumarylesterverbindungen, an die ein Bindungsrest angebunden ist; diese Acridiniumester („AE")-Verbindungen werden in einer Kurzschriftnomenklatur angegeben als Standard-AE, Naphthyl-AE, o-AE, 1 oder 3-Me-AE, 2,7-diMe-AE, 4,5-diMe-AE, o-diBr-AE, o-diMe-AE, m-diMe-AE, o-MeO-AE, o-McO(cinnamyl)-AE, o-Me-AE, o-F-AE, 1 oder 3-Me-o-F-AE, und 1 oder 3-Me-m-diF-AE (die vollständigen Namen der Verbindungen werden in der kurzen Beschreibung der 1A bis 1C aufgelistet). Es ist verständlich, dass, wenn diese Begriffe hier verwendet werden, sie sich auf die entsprechenden Acridiniumarylester, dargestellt in 1A bis 1C, beziehen. Die Verbindungen 1-Me-AE, 1-Me-o-F-AE, und 1-Me-m-diF-AE liegen in einer Mischung mit ihren 3-Methylisomeren vor; so wie sie in dieser Anmeldung verwendet werden, sollen diese Nomenklaturen so verstanden werden, dass eine Mischung der entsprechenden 1- und 3-Methylderivate gemeint ist. o-MeO(cinnamyl)-AE wird manchmal auch als „o-MeO(c)-AE" beschrieben. Diese Verbindungen, ihre Charakteristika und Zubereitungsverfahren werden im Detail in der Europäischen Pat. Anmeldenr. 0709466 beschrieben. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass diese Begriffe sich auf die Chemilumineszenz-Aacridiniumesterverbindungen selbst beziehen und das die dargestellten Linker an die sie gebunden sind, im Allgemeinen auch mit anderen im Stand der Technik bekannten Linkern, wie zum Beispiel Linker mit einer längeren oder kürzeren Seitenlänge, im Allgemeinen austauschbar sind.
Um darzustellen wie austauschbar die in der vorliegenden Erfindung detektierten Marker sind, wurden drei der oben genannten Marker verwendet: 1-Me-m-diF-AE, 1-Me-AE und o-OMe(c)-AE. Die von diesen Verbindungen emittierten Signale können unabhängig voneinander auf der Basis ihrer Reaktionskinetiken detektiert werden. Wie in 2 dargestellt, emittiert 1-Me-m-diF-AE nach der Initiation einer Chemilumineszenzreaktion Licht extrem schnell; 1-Me-AE weist etwas langsamere Reaktionskinetiken auf, die ihren Peak in der Lichtemission langsamer erreichen und Licht über einen längeren Zeitraum emittieren als das des 1-Me-m-diF-AE; und o-OMe(c)-AE hat die langsamsten Reaktionskinetiken von diesen dreien, wobei das Licht über einen längeren Zeitraum emittiert wird als bei einer der anderen Verbindungen.
2 zeigt eine Darstellung der Lichtemission für jede dieser Verbindungen, die in relativen Lichteinheiten (RLU) gegen die Zeit (in 0,2 sec Intervallen) gemessen worden ist. Die Chemilumineszenzreaktion wurde durch simultanes Reagieren aller markierter Verbindungen mit einem auslösenden Agens (basisches Wasserstoffperoxid) initiiert. 2 zeigt, dass die Mehrheit des von 1-Me-m-diF-AE emittierten Licht in der ersten halben Sekunde der Reaktion erzeugt wird. 1-Me-AE emittiert Licht zwischen 0 und 3 sec, wonach sehr wenig zusätzliches Licht erzeugt wird; während des Zeitraums zwischen 0,5 und 3 sec wird durch die 1-Me-m-diF-AE Emission nur sehr wenig Interferenz erzeugt. o-OMe(cinnamyl)-AE emittiert für mindestens 5 sec nach dem 3 sec Zeitpunkt fortwährend Licht.
Diese Marker werden experimentell durch das Messen des Lichts, das während dreier definierter Zeit-„Fenster", ein Fenster für jeden Marker, emittiert wird. Ein bevorzugter Satz von Fenstern für diese Verbindungen ist: 0,0 bis 0,6 sec für die Detektion von 1-Me-m-diF-AE, 1,0 bis 3,6 sec zur Detektion von 1-Me-AE und 4,0 bis 10 sec zur Detektion von o-OMe(cinnamyl)-AE. Da der zeitliche Verlauf der Reaktion für jede Verbindung außerdem konstant ist, ist es möglich, Licht, das von den anderen Markern in einem Fenster, das für die Messung des Signals eines bestimmten Markers verwendet wird, durch eine sich ständig wiederholende statistische Berechnung vorauszuberechnen und zu subtrahieren. Solch eine statistische Berechnung, wie sie für zwei Marker durchgeführt worden ist, wird von Nelson et al., US Pat. Nr. 5,658,737 bereitgestellt. Der Durchschnittsfachmann kann eine solche Berechnung für die Analysen und Korrekturen am Signal, das von drei oder mehr Markern erhalten wird, verwenden, wie es mittels der berechneten Signaleinheiten, die von individuellen markierten Sonden im obigen Modellsystem 3 bereitgestellt werden, dargestellt wird.
Beispiel 2
Vergleich von vorhergesagten Signalen und experimentell bestimmten Signalen bei der Verwendung voneinander unterscheidbarer Marker
In diesem Beispiel wird dargestellt, das drei AE-Derivate (1-Me-m-diF-AE, 1-Me-AE, und o-OMe(cinnamyl)-AE), die für die Verwendung in einem homogenen Assayverfahren (z. B., wie im US Pat. Nr. 5,283,174 beschrieben) geeignet sind, unter Bedingungen, die jene der Analytdetektion mittels Chemilumineszenz wiederholen, voneinander unterscheidbar sind.
Der 1-Me-m-diF-AE-Marker (Marker 1) wurde bei einer relativ hohen spezifischen Aktivität von 10⁸ RLU/pmol, die bei der Detektion eines Analyten am unteren Ende des Konzentrationsbereiches verwendbar ist, verwendet; der 1-Me-AE-Marker (Marker 2) wurde bei einer spezifischen Aktivität von 10⁶ RLU/pmol verwendet; und der o-OMe-(cinnamyl)-AE-Marker (Marker 3) lag bei einer spezifischen Aktivität von 10⁴ RLU/pmol vor. Andere Details der Marker und des Assayprotokolls werden weiter unten in Tabelle 4 dargestellt. Die derzeitige RLU-Mengen, die für die zweiten und dritten Marker hinzugefügt worden sind, waren etwas größer als 10⁵, um sicher zu stellen, dass 10⁵ RLU des Markers in jedem Lesefenster detektiert wurden. Für jedes Lesefenster wurden die Reaktionskinetiken in 0,2 sec Intervallen gemessen.
Tabelle 4
Die in Tabelle 4 genannte Hydrolyserate ist nur für das in diesem Beispiel dargestellte homogene Assayverfahren wichtig und ist für die allgemeinen Verfahren oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nicht von entscheidender Bedeutung. Tabelle 5 stellt die berechneten Signale für jeden Marker in seinem entsprechenden Lesefenster für unterschiedliche Targetmengen dar, basierend auf der Annahme, dass die Marker vollständig voneinander unterscheidbar sind.
Tabelle 5
Um diese hypothetische Analyse zu verifizieren wurde jeder dieser drei Acridiniumestermarker in den oben genannten Verhältnissen in einer Lösung vermengt, die 30 μl an 10 mM Lithiumsuccinat (pH 5,0) und 0,1% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 100 μl an 100 mM Lithiumsuccinat (pH 5,0), 8,5% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 1,5 mM EDTA, 1,5 mM EGTA und 300 μl an 600 mM Natriumborat (pH 8,5), 1% (v/v) TRITON^® X-100 (Octyl Phenoxy-Polyethoxyethanol) enthält. Diese Lösung wurde in ein Luminometer (LEADER 50) gestellt und nach einer Injektion von 200 μl 0,1% (v/v) H₂O₂ in 1 mM HNO₃ detektiert, gefolgt von einer Injektion von 200 μl an 1,5 N NaOH. Die Lichtemission wurde in 0,2 Sekunden Intervallen nach der Initiation der Chemilumineszenzreaktion gemessen. Die Lesefenster waren die Gleichen wie in Tabelle 4. Tabelle 6 stellt die erhaltenen experimentellen Daten dar.
Tabelle 6
Im Vergleich zeigen die Ergebnisse der Tabelle 6, dass die aktuell erhaltenen Daten gut mit den theoretischen Werten der Tabelle 5 übereinstimmen, wenn die Marker vermengt und in separaten Detektionsfenstern detektiert worden sind. Wie vorhergesagt, ergibt der Marker 1 bis zum Erreichen der Sättigung eine lineare Antwort bei einem Niveau von etwa 10⁵ RLU. Auf gleiche Weise ermöglicht Marker 2 die Detektion bis zu einer theoretischen Targetmenge von 0,1 pmol, da das vom Marker 2 erzeugte Signal auch ein Plateau bei etwa 10⁵ RLU erreichte. Schließlich stieg das vom Marker 3 emittierte Signal bei einem theoretischen Targetniveau von zwischen 0,01 und 0,04 pmol über den Hintergrund an und erhöhte sich proportional zur Menge des Targets zur maximalen theoretischen Targetmenge von 10 pmol.
Die Experimente in diesem Beispiel wurden in der Abwesenheit des Targets und ohne dass alle Marker mit einer Oligonukleotidsonde verbunden waren durchgeführt. Jedoch wird der Durchschnittsfachmann erkennen, dass man mit den vorliegenden Ergebnissen vorausberechnen kann, das sie denen ähnlich sind, die man über die Bereiche von 0,01 fmol bis 10 pmol erhält, wenn alle Marker bei der angegebenen spezifischen Aktivität in einem tatsächlichen Assay des Targetanalyten mit einer Sonde verbunden sind, solange wie die Sonden jeweils auf einen anderen Bereich des Targetanalyten gerichtet sind.
Beispiel 3
Erweitern des dynamischen Bereiches von mehr als einem Analyten
Die vorliegende Erfindung kann in Verbindung mit vier oder mehr separat vorhandener detektierbaren Markern verwendet werden, um den dynamischen Bereich für die Detektion von zwei oder mehreren Analyten in einem Mehrfach-Analyt-Assaysystem zu erweitern. Marker können von jeder Art sein, zum Beispiel Radioaktive, Fluorenszenz-, Chemilumineszenz-, Chromogenische- und Enzym- oder Substrat- gebundene Marker. Beispiele für Mehrfach-Analyt-Assasysteme sind im Detail zuvor beschrieben worden (z. B., US Pat. Nr. 5,656,207 von Woodhead et al. und US Pat. Nr. 5,658,737 von Nelson et al.). Auch wenn diese Dokumente insbesondere Mehrfach-Analyt-Assaysysteme beschreiben, wie die vorherige Diskussion klargemacht hat, kann die vorliegende Erfindung wie vorherzusehen war in einer Vielzahl von bekannter Assaysystemen verwendet werden.
Um in einem Assay die Anwesenheit mehrerer Analyten zu detektieren werden mindestens zwei markierte Sonden, die für unterschiedliche Target-Bereiche eines Analyten spezifisch sind, verwendet, um alle unterschiedlichen Analyten zu detektieren. Der dynamische Bereich des Assays für die Detektion aller Analyten wird durch die Verwendung von mindestens zwei markierten Sonden, die auf unterschiedliche Bereiche jeder dieser Analyten gerichtet sind, erweitert. Wie im Beispiel 2 wird jeder Analyt unter Verwendung mindestens zwei solcher Sonden, die bevorzugt mit voneinander unterscheidbaren Markern markiert sind, detektiert. Bevorzugt werden Sonden, die auf den gleichen Analyten gerichtet sind, bei unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten markiert, wobei die Menge jeder Sonde der oberen Grenze des Bereichs der Analytmenge, welche diese Sonde detektieren soll, entspricht.
In diesem Beispiel werden vier Sonden verwendet (bezeichnet als Sonden 1, 2, 3 und 4), die an zwei unterschiedliche Analyten (Analyt 1 und Analyt 2) binden. Die Sonden 1 und 2 binden spezifisch an Analyt 1 an bestimmten Target-Bereichen. Die Sonde 1 wurde unter Verwendung von Standardverfahren mit einem Fluoreszenzmarker, 5-Carboxyl-Fluoreszein (Anregung bei 492 nm und Emission bei 518 nm) auf eine spezifische Aktivität von 10⁶ relativen Fluoreszenzeinheiten („RFU") pro pmol an Sonde, markiert. Sonde 2 wird mit einem anderen Fluoreszenzmarker, 6-Carboxyrhodamin (Anregung bei 518 nm und Emission bei 543 nm), auf vergleichbare Weise markiert und dann mit der unmarkierten Sonde 2 vermengt, um am Ende eine spezifische Aktivität von 10⁴ RFU/pmol zu erzielen. Sonden 3 und 4 binden spezifisch an Analyt 2 an bestimmte Target-Bereiche. Sonde 3 ist mit einem Fluoreszenzmarker, 5-(und 6-)-Carboxytetramethylrhodamin (Anregung bei 540 nm und Emission bei 565 nm) bei einer spezifischen Aktivität von 10⁶ RFU/pmol, markiert. Sonde 4 ist mit einem Sulforhodamin 101 Säurechlorid („Texas Red^®"; Anregung bei 587 nm und Emission bei 602 nm) markiert und wird dann mit der unmarkierten Sonde 4 vermengt, um am Ende eine spezifische Aktivität von 10⁴ RFU/pmol zu erreichen. Die in diesem Beispiel verwendeten Marker sind basierend auf den unterschiedlichen Wellenlängen ihrer Fluoreszenzemissionen unabhängig voneinander unterscheidbar. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass die anderen Arten von Markern für jeden dieser einfach ersetzt werden könnten, solange wie voneinander unterscheidbare Signale bei der Kombination der markierten Sonden erreicht werden.
In diesem Assay werden die Sonden wie folgt zusammen vermengt:
Die Mischungen werden mit Proben, die unterschiedliche Mengen eines oder beider Analyten (d. h. Analyt 1, Analyt 2 oder Analyt 1 + 2) enthalten, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die das Anbinden der Sonden an ihre entsprechenden Analyt-Target-Bereiche begünstigen. Nach dem Anbinden wird unter Verwendung von Verfahren, die durch den Durchschnittsfachmann einfach bestimmt werden können, ein Schritt zum Unterscheiden der gebundenen von der ungebundenen Sonde durchgeführt (z. B., Waschen). Dann wird das Fluoreszenzsignal aller gebundenen markierten Sonden bei geeigneter Wellenlänge detektiert.
Unter der Annahme des vollständigen Anbindens jedes Analyten und seiner spezifischen Sonde, werden die für alle markierten Sonden detektierbaren Signale in Tabelle 7 für unterschiedliche Mengen des Analyten (pmol) in der Probe dargestellt. Für jede Sonde liegt der Hintergrund bei 0,1% der gesamten RFU, die zur Mischung addiert worden ist (d. h., 10² RFU pro Marker).
Tabelle 7
In diesem Beispiel kann jede Sonde seinen entsprechenden Analyten individuell über drei log der Konzentration detektieren und die Kombination an Sonden, die, wie weiter oben bereits beschrieben, für einen Analyten spezifisch sind, können den Analyten über 5 log der Konzentration detektieren. Darüber hinaus detektieren und quantifizieren, wie durch die RFU in Tabelle 7 gezeigt, die Kombination von vier Sonden beide Analyten gleichzeitig und unabhängig voneinander über einen erweiterten dynamischen Bereich von Konzentrationen. Folglich wird durch diese Art des Assayformates die getrennte Detektion und/oder Quantifikation von zwei oder mehreren Analyten ermöglicht, wobei jeder Analyt über einen breiten Konzentrationsbereich genau gemessen wird.
Auch wenn dieses Beispiel ein Assay beschreibt, in dem alle Sondenmarker Fluoreszenzmarker sind, wird deutlich, dass andere Marker oder Kombinationen dieser Typenarten von Markern ebenso verwendet werden könnten. In einem Beispiel sind die Marker auf den Sonden 1 und 2 5-Carboxyfluoreszein beziehungsweise 6-Carboxyrhodamin und Marker auf den Sonden 3 und 4 sind ³H beziehungsweise ³²P. Nachdem die oben beschriebenen Assayschritte durchgeführt worden sind, werden die Fluoreszenzsignale bei 518 nm und 543 nm gemessen und dann werden die unterschiedlichen radioaktiven Marker mittels einer Vielzahl von bekannten Verfahren detektiert und voneinander unterschieden. In einem anderen Beispiel sind die Marker auf den Sonden 1 und 2 5-Carboxyfluoreszein beziehungsweise 6-Carboxyrhodamin und die Marker auf den Sonden 3 und 4 sind Acridiniumesterderivate, wie zum Beispiel o-F-AE beziehungsweise 2-Me-AE. Nachdem die oben beschriebenen Assayschritte durchgeführt worden sind, werden die Fluoreszenzsignale bei 518 nm und 543 nm gemessen und dann wird die Chemilumineszenz unter Verwendung gut bekannter Verfahren, welche die Signale von den zwei unterschiedlichen Acridiniumestermarkern voneinander unterscheiden, gemessen.
Unter Verwendung unterschiedlicher, voneinander unterscheidbarer Marker, sind die Marker auf den Sonden 1 und 2 in einem anderen Beispiel die alkalische Phosphathase beziehungsweise die Merettichperoxidase und die Marker auf den Sonden 3 und 4 sind 5-(und 6-)-Carboxytetramethylrhodamin beziehungsweise Texas Red^®. Nachdem die oben beschriebenen Assayschritte durchgeführt worden sind, werden geeignete Enzymsubstrate zugegeben und es wird die Reaktion mit den Markern von Analyt-gebundenen Sonden 1 und 2 ermöglicht (z. B., Bereitstellen von p-Nitrophenylphosphat für die alkalische Phosphatase und Messen des löslichen Endproduktes durch Messen der Extinktion bei 405 nm; und Bereitstellen von o-Phenylendiamin für die Meerrettichperoxidase und Messen des löslichen Endproduktes durch Messen der Extinktion bei 450 nm). Nachdem die gebundenen Enzymmarker detektiert worden sind, werden die Fluoreszenzsignale der gebundenen Sonden 3 und 4 bei 565 nm und 602 nm gemessen. Für jedes dieser Beispiele kann der Durchschnittsfachmann einfache Anpassungen der spezifischen Aktivität, die für jede Sonde benötigt wird, um die Detektion der Sonden, wie weiter oben beschrieben und durch die Information in Tabelle 7 demonstriert, zu ermöglichen, bestimmen.
Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass unterschiedliche Kombinationen von Markern (z. B., Radionuklide, Chemilumineszenzmarker, Fluoreszenzmarker), wie weiter oben für Assays beschrieben, die vier markierte Sonden verwenden, in Assays, die zwei markierte Sonden verwenden, einfach verwendet werden könnten. Das heißt, dass man zur Detektion eines einzelnen Analyten über einen erweiterten dynamischen Bereich, das oben beschriebene Assay unter Verwendung jeder Kombination von zwei voneinander unterscheidbar markierten Sonden, die unterschiedliche Targets des Analyten (z. B., Sonden 1 und 2 alleine) spezifisch erkennen, durchführen würde.
Beispiel 4
Darstellung des erweiterten dynamischen Bereichs unter Verwendung unterschiedlicher Oligonukleotidsonden
Dieses Beispiel stellt die Fähigkeit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, einen Analyten über einen breiten Bereich der Analytmenge oder -konzentration spezifisch zu detektieren. Zwei unterschiedliche Sonden, die voneinander unterscheidbare Marker tragen, sind verwendet worden, um einen Analyten in Proben zu detektieren, in denen die Analytkonzentration über einen Bereich von fünf Größenordnungen variiert. Zunächst wurden die individuellen Sonden unabhängig voneinander charakterisiert und dann wurden die Sonden in einem einzelnen Analytdetektionsassay kombiniert.
Ein synthetisches 48 Basen RNA-Oligomer wurde als Targetanalyt verwendet. Zwei unterschiedliche Oligonukleotidsonden, die komplementär zu nicht überlappenden, einzigartigen Bereichen der Target-RNA (Sonde 1 mit 22 Nukleotiden und Sonde 2 mit 18 Nukleotiden) sind, wurden mit unterschiedlichen Chemilumineszenzmarkern markiert. Sande 1 wurde mit einem N-Acridinium-Phenylester mit einer Fluorinsubstitution in der ortho Position des Phenylrings (d. h., o-F-AE) markiert und Sonde 2 wurde mit einem N-Acridiniumphenylester mit einer Methylgruppe in der 2' Position des Acridiniumrings (d. h., 2-Me-AE) markiert. Ein unsubstituierter Acridiniumester mit einem NHS-Linker an der 4 Position des Phenylrestes ist 4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl) Phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylatfluorsulfonat. Beide Sonden 1 und 2 besitzen modifizierte Zuckerreste, wobei die 2' Position des Rings anstatt mit einer -H(Desoxyribose) oder -OH(Ribose) mit einer Methoxygruppe substituiert worden ist, jedoch ist die Verwendung von modifizierten Oligonukleotiden für die Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht kritisch, da sie mit unmodifizierten Oligonukleotiden ebenso gut durchgeführt werden können.
Eine Chemilumineszenzreaktion, die den o-F-AE-Marker verwendet, weist verglichen zu denen des 2-Me-AE-Markers ausreichend schnelle Reaktionskinetiken auf, so dass die Signale beider Verbindungen in Folge der Reaktion, welche die Chemilumineszenz initiiert, voneinander durch Beobachten der sich ergebenden Lichtemission über einen Zeitraum in regulären Intervallen unterschieden werden kann. Die von den beiden Markern erhaltenen entsprechenden Signale können durch Einsetzen einer einfachen sich ständig wiederholenden mathematischen Technik noch präziser quantifiziert werden. Diese Verfahren und repräsentativen Marker sind zuvor bereits im Detail genauer im US Pat. Nr. 5,656,207 von Woodhead et al. und US Pat. Nr. 5,658,737 von Nelson et al. beschrieben worden.
Die Oligonukleotide der Sonden 1 und 2 wurden mit den AE-Markern durch die Verwendung eines an den Phenylring angebrachten Linkerarms, wie in 1A bis 1C dargestellt, verbunden. Der Linker wurde über einen nicht-Nukleotidlinker, der mittels bereits zuvor im Detail in US Pat. Nr. 5,656,744 von Arnold et al. beschriebener Verfahren in die Oligonukleotidkette eingebaut worden ist, mit dem Oligonukleotid verbunden. In diesem Verfahren wird der Linkerarm-Rest, an den der Marker angebunden wird, während der Synthese an einer vorbestimmten Position innerhalb des Oligonukleotids angeordnet. Oligonukleotide wurden mittels gut bekannter Festphasensyntheseverfahren (z. B., wie in Brown & Brown „Modern Machine-Aided Methods of Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" in Oligonucleotides and Analogues, A Practiced Approach (1991) beschrieben) hergestellt. Acridiniumesterderivate können an den Linkerarm der Sonde mit mittels im Stand der Technik gut bekannter Techniken gebunden werden, bevorzugte Verfahren sind jedoch zuvor von Nelson et al., in „Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence" in Non-Isotopic Probe Techniques (Academic Press 1992) und von Arnold et al. in US Pat. Nr. 4,656,744 beschrieben worden.
In einem bevorzugten Verfahren wird ein N-Hydroxysuccinimid („NHS")-Ester des Acridiniums (z. B., 4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl)phenyl-10-methylacridinium 9-carboxylatfluorosulfonat) im Wesentlichen wie von Weeks et al., 1983, in Clin. Chem. 29: 1474–1478 und US Pat. Nr. 5,658,737 von Nelson et al. beschrieben, synthetisiert. Die Reaktion des primären Amins des Linkerarm:Hybridisations-Sonden-Konjugates mit dem ausgewählten NHS-Acridiniumester wird wie folgt durchgeführt. Das, wie oben beschrieben, synthetisierte Oligonukleotid-Hybridisationssonde:Linkerarm-Konjugat wird in einer Trockenzentrifuge (z. B., Savant SPEED VAC^TM) getrocknet und dann in 8 μl 0,125 M HEPES-Puffer (pH 8,0) in 50% (v/v) DMSO gelöst. Dazu werden 2 μl einer 25 mM Lösung des gewünschten NHS-Acridiniumesters zugegeben, vermengt und bei 37°C für 20 min inkubiert. Dann werden 3 μl des 25 mM NHS-Acridiniumesters in DMSO zur Lösung zugegeben, behutsam vermengt und 2 μl vom 0,1 M HEPES-Puffer (pH 8,0) werden zugegeben, vermengt und bei 37°C für weitere 20 min inkubiert. Die Reaktion wird durch behutsames Vermengen mit 5 μl 0,125 M Lysin in 0,1 M HEPES-Puffer (pH 8,0) in DMSO gestoppt.
Das markierte Oligonukleotid wird durch Zugabe von 30 μl eines 3 M Natriumacetatpuffers (pH 5,0), 245 μl Wasser und 5 μl von 40 mg/ml Glycogen, und dann einer Zugabe von 640 μl eisgekühlten 100%-igen Ethanols, Vermengen und Inkubieren auf Trockeneis für 5 bis 10 min, zurückgewonnen. Die präzipitierten markierten Nukleinsäuren werden in einer gekühlten Mikrozentrifuge bei 15.000 rpm unter Verwendung eines Standardrotorkopfes absedimentiert. Der Überstand wird abgesaugt und das Pellet wird in 20 μl 0,1 M Natriumacetat (pH 5,0), das 0,1% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, erneut aufgelöst.
Die Sonden 1 und 2, die, im wesentlichen wie oben beschrieben, mit AE-Markern konjugiert werden, wurden bei unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten verwendet. Die Sonde 1 wurde mit o-F-AE bei einer spezifischen Aktivität von etwa 7 × 10⁷ RLU/pmol markiert. Die Sonde 2 wurde mit 2-Me-AE bei einer spezifischen Aktivität von etwa 1 × 10⁸ RLU/pmol markiert und dann mit der unmarkierten Sonde 2 (wie weiter unten beschrieben) vermengt, um eine niedrigere spezifische Aktivität zu erzielen. Dies führte zu einem etwa 100-fachen Unterschied zwischen den detektierbaren Signalen der Sonde 1 und Sonde 2.
Um die zwei separaten Sonden und Markerkombinationen in einem Assay zu testen, wurden 11 fmol der markierten Sonde 1 mit unterschiedlichen Mengen 0,00, 0,01, 0,02, 0,05, 0,20, 0,50, 2, 5, 20, 50, 200, 500, 2000 und 5000 fmol der Target-RNA hybridisiert. Zur gleichen Zeit wurden 5 fmol der markierten Sonde 2 plus 15 pmol der unmarkierten Sonde 2 in separaten Reaktionsmischungen mit den gleichen Mengen des Targets hybridisiert. Zusätzlich zur Sonde und Target-RNA enthielten alle Hybridisationsreaktionsansätze mit 100 μl 100 mM Lithiumsuccinat (pH 5,0), 8,5% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 1,5 mM EDTA und 1,5 mM EGTA. Die Reaktionsmischungen wurden bei 50°C für 50 min inkubiert und dann wurden 300 μl 150 mM Na₂B₄O₇ (pH 8,6), die 1% (v/v) TRITON X-100 enthält, zu jedem Reaktionsansatz zugegeben und die Mischungen wurden bei 50°C für 11 min inkubiert. Die Reaktionsmischungen wurden dann in ein Luminometer (LEADER 50) gestellt und eine Chemilumineszenzreaktion wurde in jeder Mischung nach der Zugabe von 200 μl an 0,1% (v/v) H₂O₂ und 1 mM HNO₃, gefolgt von einer Injektion von 200 μl 1,5 N NaOH initiiert. Die Chemilumineszenz wurde nach der zweiten Injektion in einem Wellenlängenbereich von 300 bis 650 nm für 2 sec gemessen.
Die Ergebnisse werden unten in Tabelle 8 dargestellt und in einer doppellogarithmischen Skalierung in 3A und 3B graphisch aufgetragen.
Tabelle 8 Untersuchter und detektierter Analyt in individuellen Reaktionsmischungen
Wie durch die Ergebnisse in Tabelle 8 und 3A gezeigt, emittierte der o-F-AE-Marker der Sonde 1 eine erhöhte Menge an Licht mit steigender Menge des Analyten im Reaktionsansatz, wenn er in separaten Reaktionsansätzen untersucht worden ist. Die Antwort war von etwa 0,01 fmol bis etwa 5 fmol des RNA-Analyten linear und ging bei überschreiten der 5 fmol des Analyten im Reaktionsansatz in ein Plateau über. Im Vergleich dazu emittierte der 2-Me-AE-Marker der Sonde 2 mehr Licht, wenn die Menge des im Reaktionsansatz vorhandenen Analyten gesteigert wurde, jedoch war das detektierbare Signal des 2-Me-AE-Markers der Sonde 2 etwa 100-fach niedriger als das des o-F-AE-Markers der Sonde 1. Das heißt, dass das durch die Target-gebundene Sonde 2 emittierte Licht nur detektierbar wurde, wenn mehr Analyt vorhanden war und eine lineare Antwort (siehe 3B) wurde beobachtet, wenn der Analyt in einem Bereich von etwa 20 fmol bis etwa 2.000 bis 5.000 fmol vorhanden war. Von diesen Experimenten wurden Standardgeraden für jeden der zwei Marker, die bei unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten vorlagen, erzeugt.
Als nächstes werden die markierte Sonde 1 und die markierte Sonde 2, wie oben beschrieben, in individuellen Hybridisationsmischungen kombiniert, wobei jede unterschiedliche Menge des RNA-Analyten enthält. In jeder Reaktion war das detektierbare Signal der Sonde 2 etwa 100-fach geringer als das detektierbare Signal der Sonde 1. 11 fmol der o-F-AE markierten Sonde 1 und 5 fmol der 2-Me-AE markierten Sonde 2 wurden mit 15 pmol der unmarkierten Sonde 2 in 100 μl Reaktionsansätzen, die einen Hybridisationspuffer (100 mM Lithiumsuccinat, pH 5,0, 8,5% (w/v) Lithiumlaurylsulfat, 1,5 mM EDTA und 1,5 mM EGTA) und unterschiedliche Mengen des RNA-Targets, wie in Beispiel 4 beschrieben, enthalten, kombiniert. Jede Reaktionsmischung wurde bei 50°C für 50 min inkubiert; dann wurden 300 μl 150 mM Na₂B₄O₇ (pH 8,6), die 1% (v/v) TRITON^® X-100 enthält zu jedem Reaktionsansatz, die für 11 min bei 50°C inkubiert wurden, zugegeben. Dann wurden die Reaktionen in einem Luminometer (LEADER^® 50) platziert und eine Chemilumineszenzreaktion wurde durch Injektion von 200 μl 0,1% (v/v) H₂O₂ und 1 mM HNO₃ gefolgt von 200 μl 1,5 N NaOH in jeden Reaktionsansatz initiiert. Die Chemilumineszenz wurde dann für 2 sec gemessen, wobei das Licht während 40 Millisekunden Intervallen während dieser Zeit gesammelt worden ist.
Das von jedem Marker emittierte Signal wurde wie folgt aus dem Signal herausgelöst, das durch die Mischung der Marker generiert worden ist. Die Rohdaten wurden einer sich ständig wiederholenden mathematischen Berechnung, die im Detail zuvor beschrieben worden ist (siehe Nelson, et al., US Pat. Nr. 5,658,737, in Spalte 22, Linien 37–65) und im Folgenden kurz beschrieben wird, unterzogen, wobei die Summe des Lichts verwendet worden ist, das während zweier Intervallabschnitte innerhalb des Zeitraums emittiert worden ist (Intervalle 1 bis 5 und Intervalle 30 bis 50, abgekürzt als „RLU_1-5" beziehungsweise „RLU_30-50"). Auf die Intervalle wird mittels der Nummer der 40 Millisekunden Intervalle, die der Initiierung der Chemilumineszenzreaktion folgen, Bezug genommen.
Proben die nur eine markierte Sonde enthielten, wurden als Standard für die Datenanalyse verwendet. Für jeden Standard wurden die Verhältnisse zwischen der Summe der RLU-Werte, die im ersten Zeitintervall erhalten worden sind, und die Summe der RLU-Werte, die im zweiten Zeitintervall erhalten worden sind, bestimmt (Σ RLU_30-50/Σ RLU_1-5). Für die Reaktionsmischungen, die beide markierte Sonden enthalten, wurde die Summe der RLU-Werte in den Intervallen 30 bis 50 (Σ RLU_30-50) durch das für den 2-Me-AE Standard erhaltene Ergebnis geteilt. Diese ergab, dass die berechnete Menge der RLU in den Intervallen 1 bis 5 durch die 2-Me-AE-markierte Sonde beigetragen wurde. Diese Menge, abgezogen von der Gesamt-RLU in den Intervallen 1 bis 5, ergibt die Menge an RLU, die in diesen Intervallen durch o-F-AE beigetragen wurde. Die letztere Nummer, wenn sie mit dem Standardverhältnis für die zwei für den o-F-AE erhaltenen Zeiträume multipliziert wird, ergibt die RLU innerhalb des Intervalls 30 bis 50, das durch die o-F-AE- markierte Sonde beigetragen wurde. Diese Figur wird von der gesamten RLU in den Intervallen 30 bis 50 abgezogen, um einen korrigierten Wert für die RLU, die durch 2-Me-AE in diesem Intervall beigetragen worden ist, zu erhalten. Diese Zahl wurde verwendet, um die oben beschriebene Berechnung zu wiederholen bis sich der RLU-Beitrag durch o-F-AE in den Intervallen 30 bis 50 nicht innerhalb der ausgewählten Anzahl von notwendigen Figuren veränderte. Berechnete Mengen der RLU („RLU-Output") für die Sonden 1 und 2 werden in Tabelle 9 dargestellt.
Tabelle 9 Untersuchter und detektierter Analyt in individuellen Reaktionsmischungen
Diese Daten zeigen die Fähigkeit der Verfahren der vorliegenden Erfindung den dynamischen Bereich zur Detektion eines Analyten zu erweitern. Wie in 4 dargestellt, ähnelt die graphische Darstellung der Ergebnisse dieses Experiments genau der Zusammenstellung der Ergebnisse, dargestellt in 3A und 3B. Das hier dargestellte Verfahren, in dem Sonden gegen unterschiedliche Target-Bereiche des gleichen Analyten gerichtet sind, ermöglicht die Detektion und/oder Quantifikation des Analyten über mindestens 6 log der möglichen Target-Konzentrationen in einem Einzelbehälter-Assay. Daher könnte dieses Assayformat verwendet werden, um einen Analyten in einer Probe innerhalb dieses erweiterten Bereichs von Analytkonzentrationen ohne vorherige Kenntnis der Analytkonzentration in der Probe zu detektieren oder zu messen.
4 zeigt ebenso, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Detektion innerhalb des Luminometer-Messbereiches durch Verwendung von unabhängig voneinander detektierbaren Markern bei unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten über mindestens 6 log der Analytkonzentrationen ermöglichen. Auch weitere Erweiterungen des dynamischen Bereiches des Assays sind möglich, zum Beispiel durch Verwendung einer größeren Anzahl von Sonden, die mit unabhängig voneinander detektierbaren Markern verbunden sind aber innerhalb des Luminometer-Messbereiches jedes ausgewählten Instrumentes liegen. Dadurch kann ein Assay kundenspezifisch entworfen werden, um den genauesten Messbereich des Instruments oder des verwendeten Detektionsverfahrens zu verwenden.
Beispiel 5
Erweiterter dynamischer Bereich unter Verwendung unterschiedlicher Sonden, die mit dem gleichen detektierbaren Marker markiert sind
Dieses Beispiel zeigt, dass zwei Sonden, die an unterschiedliche Target-Bereiche des gleichen Analyten spezifisch binden, wenn sie mit dem gleichen detektierbaren Marker jedoch bei unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten markiert wurden, verwendet werden können, um einen erweiterten Bereich von Analytkonzentrationen zu detektieren.
Die in diesem Beispiel verwendeten Sonden sind synthetische DNA-Oligomere mit einem 2-Methoxy-Rückrad und die als Sonde 3 (ein 22-mer) und Sonde 4 (ein 19-mer) bezeichneten Sonden. Beide Sonden enthalten Nukleotidbasensequenzen, die an den gleichen Analyten jedoch an separate nicht-überlappende Target-Bereichen des Analyten spezifisch binden. Der Analyt war ein synthetisches RNA-Oligomer, das aus 48 Basen besteht. Beide Sonden 3 und 4 wurden mit einem Standard-AE, im Wesentlichen wie in Beispiel 4 beschrieben, markiert. Die markierte Sonde 4 wurde mit der unmarkierten Sonde 4 vermengt, um eine geringere spezifische Aktivität relativ zur spezifischen Aktivität der Sonde 3 zu erzielen. Die Sonde mit der höheren spezifischen Aktivität (Sonde 3) wurde verwendet, um den niedrigeren Bereich von Analytkonzentrationen zu detektieren und die Sonde mit der geringeren spezifischen Aktivität (Sonde 4) wurde verwendet, um den höheren Bereich der Analytkonzentrationen zu detektieren.
Für jede Sonde wurden unter Verwendung des RNA-Analyten, der entweder mit Sonde 3 ohne Sonde 4; Sonde 4 ohne Sonde 3 oder einer Kombination von Sonde 3 und Sonde 4 kombiniert wurde, eine Reihe von Hybridisations- und Chemilumineszenz-Detektionsreaktionen durchgeführt, im wesentlichen wie im Beispiel 4 beschrieben. Die Menge des der Reaktion zugegebenen Analyten lag bei: 0,1, 1,0, 10, 100, 1.000, 10.000 und 100.000 fmol/Reaktionsansatz. Die Reaktionsansätze für jede Bedingung wurden dreifach durchgeführt und die gemittelten (Durchschnitt) RLU-Ergebnisse wurden aus den dreifachen Proben berechnet. Röhrchen in dreifacher Ausfertigung, die keinen Analyten enthalten, wurden verwendet, um die Hintergrund-RLU zu bestimmen, die gemittelt wurde und von den gemittelten RLU-Ergebnissen für jeden experimentellen Test abgezogen wurde.
Die Reaktionen wurden im wesentlichen, wie in Beispiel 4 beschreiben, mittels der folgenden Sondenmengen in 100 μl Reaktionsmischungen angesetzt: 50 fmol der markierten Sonde 3 wurden zu den Reaktionen gegeben, die Sonde 3 alleine oder kombiniert mit Sonde 4 enthalten; 50 fmol der markierten Sonde 4 plus 20 pmol der unmarkierten Sonde 4 wurden zu den Reaktionen gegeben, die Sonde 4 alleine oder kombiniert mit Sonde 3 enthalten. Die Hybridisationsreaktionen wurden für 30 min bei 59°C inkubiert und dann wurden 300 μl 150 mM Na₂B₄O₇ (pH 8,7), die 1% Triton^® X-100 enthält, zu jedem Röhrchen zugegeben, das dann für 9 min bei 59°C inkubiert wurde. Dies folgte der Initiierung und Detektion der Chemilumineszenzreaktion, wie es im Wesentlichen in Beispiel 4 beschrieben worden ist. Die Tabelle 10 stellt die Ergebnisse dieser Experimente dar.
Tabelle 10
Die Ergebnisse der Tabelle 10 werden in den 5A bis 5C unter Verwendung eines doppellogarithmisch skalierten Graphen für die detektierte RLU als Funktion des in der Probe vorhandenen Analyten graphisch dargestellt. Bezugnehmend auf 5A, dort werden die mit Sonde 3 alleine, die mit ihrem Target hybridisiert ist, erhaltenen Ergebnisse dargestellt, wobei diese eindeutig eine lineare Antwort über einen etwa drei log-Bereich der Analytkonzentrationen (0,1 bis 100 fmol) zeigt. Bezugnehmend auf 5B, dort werden die mit Sonde 4 alleine, die mit ihrem Target hybridisiert ist, erhaltenen Ergebnisse dargestellt, wobei diese eindeutig eine lineare Antwort über einen etwa drei log-Bereich der Analytkonzentrationen (10 bis 10.000 fmol) zeigt. Bezugnehmend auf 5C, wenn beide Sonden im Hybridisationsreaktionsansatz vorhanden waren, fielen die Datenpunkte auf zwei bestimmte Linien. 5C zeigt, dass zwei Sonde, die das gleiche detektierbare Signal erzeugen und an unterschiedliche Target-Bereiche auf dem gleichen Analyten spezifisch binden, in einer einzelnen Reaktion verwendet werden können, um ein detektierbares Signal zu erzeugen, das mit der Konzentration des in einer Probe über einen Bereich von mindestens 5 Größenordnungen vorhandenen Analyten korreliert werden kann. Daher kann eine Kombination von unterschiedlichen Sonden, die mit dem gleichen Marker aber bei unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten markiert worden sind und in einem Format verwendet werden, wie es in diesem Beispiel dargestellt wurde, die Anwesenheit eines Analyten über einen erweiterten Bereich von Analytkonzentrationen detektieren, als es mit einer der Sonden alleine zu detektieren möglich wäre. Darüber hinaus kann die Kombination der Sonden verwendet werden, um die Menge des in der Probe vorhandenen Analyten über diesen erweiterten Konzentrationsbereich zu quantifizieren.
Die vorausgegangenen Beispiele dienen dazu die vorliegende Erfindung, die durch die folgenden Ansprüche und die legalen Äquivalenten davon definiert werden, darzustellen und nicht zu begrenzen.

Claims

Ein Verfahren zum Detektieren eines Analyten über einen Bereich von Konzentrationen in einer einzelnen Probe, das die Schritte umfasst: Bereitstellen eines Sondenreagenzes, das mindest zwei unterschiedlich markierte Sonden umfasst, wobei jede markierte Sonde einen Target-bindenden Rest und einen detektierbaren Marker umfasst; wobei der Target-bindende Rest jeder markierten Sonde spezifisch an einen Targetbereich bindet, der sich von dem durch eine andere markierte Sonde im Sondenreagenz gebundenen Targetbereich unterscheidet, und wobei jede markierte Sonde in einer Menge vorhanden ist, die ermöglicht, einen Bereich von Analytkonzentrationen zu detektieren, der sich von dem durch eine andere Sonde im Reagenz detektierbaren Bereich von Analytkonzentrationen unterscheidet, wodurch man das Sondenreagenz einen erweiterten Bereich von Analytkonzentrationen, der größer ist als der Bereich von Analytkonzentrationen, der durch eine einzelne markierte Sonde im Sondenreagenz detektierbar ist, detektieren lässt; In-Kontakt-Bringen des Sondenreagenzes mit einer den Analyten enthaltenden Probe in einem einzigen Behälter, wobei das Sondenreagenz eine erste Sonde enthält, die mindestens in einem 10-fachen molaren Überschuss relativ zu einer zweiten Sonde vorhanden ist; Inkubieren der Probe und des Sondenreagenzes unter Bedingungen, die eine spezifische Bindung des Target-bindenden Restes jeder markierten Sonde an ihren Targetbereich am Analyten begünstigt, wodurch ein spezifischer Bindungskomplex gebildet wird, der den Analyten und mindestens eine markierte Sonde umfasst; und Detektieren der Anwesenheit des spezifischen Bindungskomplexes durch Detektieren eines Signals des Markers als Nachweis für die Anwesenheit der mindestens einen Sonde in dem spezifischen Bindungskomplex, wodurch die Anwesenheit des Analyten in der Probe innerhalb des Bereiches von Analytkonzentrationen, der durch die Sonde in dem spezifischen Bindungskomplex detektierbar ist, nachgewiesen wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt zum In-Kontakt-Bringen und Inkubieren in einem einzigen Behälter durchgeführt werden.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt zum Detektieren ein Signal vom detektierbaren Marker, das für die Kinetik einer Reaktion charakteristisch ist, misst.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Schritt zum Bereitstellen ein Sondenreagenz verwendet, in dem die spezifische Aktivität einer markierten Sonde sich von der spezifischen Aktivität einer anderen markierten Sonde im Sondenreagenz unterscheidet.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Schritt zum Bereitstellen ein Sondenreagenz verwendet, wobei mindestens eine markierte Sonde einen detektierbaren Marker aufweist, der ein Ligand ist, der einen signalerzeugenden Bindungspartners spezifisch binden kann.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Schritt zum Bereitstellen ein Sondenreagenz verwendet, wobei mindestens eine markierte Sonde einen detektierbaren Marker aufweist, der ein direkter Marker ist, und der Schritt zum Detektieren ein vom direkten Marker stammendes Signal misst.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Schritt zum Bereitstellen ein Sondenreagenz verwendet, wobei mindestens eine markierte Sonde einen detektierbaren Marker aufweist, der ein fluoreszierender Marker, ein lumineszierender Marker, ein radioaktiver Marker, ein Chromophor, ein Enzym oder ein Enzymsubstrat ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Schritt zum Bereitstellen ein Sondenreagenz verwendet, wobei mindestens eine markierte Sonde einen detektierbaren Marker aufweist, der eine chemilumineszierende Verbindung ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Schritt zum In-Kontakt-Bringen das Sondenreagenz verwendet, wobei die erste markierte Sonde in einem mindestens 100-fachen, 1.000-fachen oder 10.000-fachen molaren Überschuss relativ zur zweiten markierten Sonde vorhanden ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Sondenreagenz die erste markierte Sonde mit einem detektierbaren Marker, der eine erste chemilumineszierende Verbindung ist und die zweite markierte Sonde mit einem detektierbaren Marker, der eine zweite chemilumineszierende Verbindung ist, wobei die erste chemilumineszierende Verbindung und die zweite chemilumineszierende Verbindung getrennt voneinander unterscheidbare Marker sind, umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die erste chemilumineszierende Verbindung aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus üblichen Acridiniumester (AE), Naphthyl-AE, ortho-AE, 1- oder 3-Methyl-AE, 2-Methyl-AE, 2,7-Dimethyl-AE, 4,5-Dimethyl-AE, ortho-Dibrom-AE, ortho-Dimethyl-AE, meta-Dimethyl-AE, ortho-Methoxy-AE, ortho-Methoxy(cinnamyl)-AE, ortho-Methyl-AE, ortho-Fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-ortho-Fluor-AE und 1- oder 3-Methyl-meta-Difluor-AE besteht; und wobei die zweite chemilumineszierende Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus üblichen Acridiniumester (AE), Naphthyl-AE, ortho-AE, 1- oder 3-Methyl-AE, 2-Methyl-AE, 2,7-Dimethyl-AE, 4,5-Dimethyl-AE, ortho-Dibrom-AE, ortho-Dimethyl-AE, meta-Dimethyl-AE, ortho-Methoxy-AE, ortho-Methoxy(cinnamyl)-AE, ortho-Methyl-AE, ortho-Fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-ortho-fluor-AE und 1- oder 3-Methyl-meta-difluoro-AE besteht, mit der Maßgabe, dass die erste chemilumineszierende Verbindung unterschiedlich und unterscheidbar von der zweiten chemilumineszierenden Verbindung ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei die erste chemilumineszierende Verbindung ortho-Fluor-AE ist und die zweite chemilumineszierende Verbindung 2-Methyl-AE ist.
Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Sondenreagenz weiter eine dritte markierte Sonde mit einem getrennt unterscheidbaren Marker umfasst, der eine dritte chemilumineszierende Verbindung ist.
Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei die erste chemilumineszierende Verbindung aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus üblichen Acridiniumester (AE), Naphthyl-AE, ortho-AE, 1- oder 3-Methyl-AE, 2-Methyl-AE, 2,7-Dimethyl-AE, 4,5-Dimethyl-AE, ortho-Dibrom-AE, ortho-Dimethyl-AE, meta-Dimethyl-AE, ortho-Methoxy-AE, ortho-Methoxy(cinnamyl)-AE, ortho-Methyl-AE, ortho-Fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-ortho-fluor-AE und 1- oder 3-Methyl-meta-difluor-AE besteht; wobei die zweite chemilumineszierende Verbindung aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus üblichen Acridiniumester (AE), Naphthyl-AE, ortho-AE, 1- oder 3-Methyl-AE, 2-Methyl-AE, 2,7-Dimethyl-AE, 4,5-Dimethyl-AE, ortho-Dibrom-AE, ortho-Dimethyl-AE, meta-Dimethyl-AE, ortho-Methoxy-AE, ortho-Methoxy(cinnamyl)-AE, ortho-Methyl-AE, ortho-Fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-ortho-fluor-AE und 1- oder 3-Methyl-meta-difluor-AE besteht; und wobei die dritte chemilumineszierende Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus üblichen Acridiniumester (AE), Naphthyl-AE, ortho-AE, 1- oder 3-Methyl-AE, 2-Methyl-AE, 2,7-Dimethyl-AE, 4,5-Dimethyl-AE, ortho-Dibrom-AE, ortho-Dimethyl-AE, meta-Dimethyl-AE, ortho-Methoxy-AE, ortho-Methoxy(cinnamyl)-AE, ortho-Methyl-AE, ortho-Fluor-AE, 1- oder 3-Methyl-ortho-fluor-AE und 1- oder 3-Methyl-meta-difluor-AE besteht, mit der Maßgabe, dass die ersten, zweiten und dritten chemilumineszierenden Verbindungen sich unterscheiden und voneinander unterscheidbar sind.
Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei die erste chemilumineszierende Verbindung 1- oder 3-Methyl-meta-difluor-AE ist, die zweite chemilumineszierende Verbindung 1- oder 3-Methyl-AE ist und die dritte chemilumineszierende Verbindung ortho-Methoxy(cinnamyl)-AE ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Schritt zum In-Kontakt-Bringen einen Analyten beinhaltet, der eine Nukleinsäure, ein Protein, ein Lipid, ein Kohlenhydrat oder eine Verbindung, die eine Kombination davon ist, ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Schritt zum In-Kontakt-Bringen einen Analyten beinhaltet, der eine DNA oder RNA ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der Schritt zum Bereitstellen ein Sondenreagenz verwendet, wobei mindestens eine markierte Sonde eine Nukleinsäure, ein Protein, ein Lipid, ein Kohlenhydrat oder eine Verbindung, die eine Kombination davon ist, ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der Schritt zum Bereitstellen ein Sondenreagenz verwendet, wobei mindestens eine markierte Sonde eine DNA, eine RNA, ein DNA-Analogon, ein RNA-Analogon oder eine Kombination davon umfasst.
Ein Sondenreagenz zur Verwendung in dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, das mindestens zwei unterschiedlich markierte Sonden umfasst, wobei jede markierte Sonde einen Target-bindenden Rest und einen detektierbaren Marker umfasst, wobei der Target-bindende Rest jeder markierten Sonde spezifisch mit einem Targetbereich bindet, der sich von dem durch eine andere markierte Sonde im Sondenreagenz gebundenen Targetbereich unterscheidet, und wobei jede markierte Sonde in einer Menge vorhanden ist, um einen Bereich von Analytkonzentrationen zu detektieren, der sich von dem durch eine andere Sonde im Reagenz detektierbaren Bereich von Analytkonzentrationen unterscheidet, und wobei das Sondenreagenz eine erste Sonde enthält, die mindestens in einem 10-fachen molaren Überschuss relativ zur zweiten Sonde vorhanden ist, wodurch es dem Sondenreagenz ermöglicht wird, den Analyten über einen erweiterten Bereich von Analytkonzentrationen, der größer ist als der Bereich von Analytkonzentrationen, der durch eine einzelne Sonde im Sondenreagenz detektierbar ist, zu detektieren.
Das Sondenreagenz nach Anspruch 20, wobei das Sondenreagenz eine erste markierte Sonde beinhaltet, die in einer Menge vorhanden ist, die sich durch mindestens einen 100-fachen molaren Überschuss oder einen mindestens 1.000-fachen molaren Überschuss oder mindestens einen 10.000-fachen molaren Überschuss relativ zu einer zweiten im Sondenreagenz vorhandenen markierten Sonde unterscheidet.
Das Sondenreagenz nach Anspruch 20 oder 21, wobei jede markierte Sonde von jeder anderen markierten Sonde im Sondenreagenz unterscheidbar ist aufgrund: unterschiedlicher spezifischer Aktivitäten der unterschiedlich markierten Sonden, eines Signals, das eine Folge von getrennt unterscheidbaren Markern auf allen markierten Sonden ist, oder einer Kombination davon.
Das Sondenreagenz nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei jede markierte Sonde verglichen mit einer anderen markierten Sonde im Sondenreagenz eine andere spezifische Aktivität des Markers aufweist.
Das Sondenreagenz nach Anspruch 23, wobei eine markierte Sonde mit einer relativ hohen spezifischen Aktivität in einer molaren Menge vorhanden ist, die niedriger ist als die molare Menge einer markierten Sonde mit einer relativ niedrigen spezifischen Aktivität im Sondenreagenz.
Das Sondenreagenz nach einem der Ansprüche 20 bis 24, wobei jede markierte Sonde ein Nukleinsäureoligonukleotid mit einem Target-bindenden Rest, der eine Basensequenz ist, ist.
Das Sondenreagenz nach einem der Ansprüche 20 bis 25, wobei jede markierte Sonde einen getrennt voneinander detektierbaren Marker aufweist, der ein Acridiniumesterderivat ist.