ES2235329T3 - Procedimiento basado en el uso de bacteriofagos para la deteccion de moleculas biologicas en muestras biologicas. - Google Patents

Procedimiento basado en el uso de bacteriofagos para la deteccion de moleculas biologicas en muestras biologicas.

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ES2235329T3
ES2235329T3 ES98923056T ES98923056T ES2235329T3 ES 2235329 T3 ES2235329 T3 ES 2235329T3 ES 98923056 T ES98923056 T ES 98923056T ES 98923056 T ES98923056 T ES 98923056T ES 2235329 T3 ES2235329 T3 ES 2235329T3
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Abstract

Un procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas, comprendiendo las siguientes operaciones: a) inmovilizar las moléculas de interés sin destruir la habilidad para que estas moléculas interaccionen con las moléculas expuestas en las superficies del fago; b) hacer que una molécula de interés, inmovilizada como se ha descrito anteriormente, se enlace específicamente con al menos uno de los bacteriófagos filamentosos recombinantes, los cuales tienen internamente una molécula de ADN de cadena única cuya secuencia se conoce al menos parcialmente, y exponiendo a las superficies de la cápside al menos una molécula capaz de enlazarse específicamente con al menos una molécula de interés presente en la muestra biológica; c) separar el complejo molécula-bacteriófago obtenido de esta forma en la reacción de mezcla; d) lavar para eliminar los complejos generados por interacción no específica entre la molécula y el bacteriófago; e) añadir los reactivos parallevar la cabo la operación descrita en g) más adelante; f) lisis de proteínas formando la cápside de proteínas de los bacteriófagos seleccionados de esta forma; g) amplificación del ADN obtenido como se explica arriba por la reacción en cadena de al polimerasa (RCP); h) detección del ADN amplificado como se des-cribe anteriormente. viral de los antígenos, partes de éstos o oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su presencia en los fluidos biológicos bajo examen.

Description

Procedimiento basado en el uso de bacteriófagos para la detección de moléculas biológicas en muestras biológicas.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en fuentes biológicas. Esto responde a la necesidad común de muchas áreas de la investigación científica. De hecho, la capacidad para identificar la presencia de moléculas en muestras biológicas, asociadas, por ejemplo, con patologías clínicas, siempre ha representado un objetivo importante de la investigación, en particular en el campo de la medicina.
El campo de la biomedicina es sin ningún género de dudas el principal campo (aunque no el único) en el que este procedimiento se aplica. De hecho, las invenciones referidas a los métodos con este propósito se han propuesto con el objeto de investigar un continuo mayor nivel de sensibilidad en la detección, en particular a nivel de diagnóstico.
Los anticuerpos son los instrumentos bioquímicos más frecuentemente utilizados para detectar la presencia de moléculas específicas en extractos de células o tejidos. Esto es debido a su extrema sensibilidad y alta especificidad a la hora de formar enlaces.
Cuando por estos procedimientos ocurre una interacción con la molécula de interés, ésta se hace resaltar utilizando marcadores enlazados a los anticuerpos, por ejemplo sustancias fluorescentes, proteínas con actividad enzimática o marcadores radiactivos.
Se ha descubierto que la capacidad de detección de estos marcadores aumenta considerablemente con la utilización de los llamados métodos de amplificación de señal. Éstos hacen posible obtener una señal de detección mayor, por ejemplo uniendo el marcador no al anticuerpo utilizado para el reconocimiento específico (anticuerpo primario), sino a un segundo anticuerpo capaz de unirse al primero (anticuerpo secundario). Se han desarrollado varios procedimientos utilizando anticuerpos secundarios, a los que se enlazan por enlace covalente moléculas marcadoras, por ejemplo sustancias fluorescentes como fluoresceína o rodamina, proteínas con actividad enzimática como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rábano, en caso de detección utilizando ferritina o esferas doradas coloidales con el microscopio electrónico.
Alternativamente, los sistemas de amplificación utilizan la alta afinidad enlazante de moléculas como la biotina (una pequeña vitamina soluble en agua) y estreptavidina (una proteína bacteriana), u otras como las lecitinas (proteínas capaces de reconocer y enlazarse a residuos específicos de sacáridos) y moléculas como las glicoproteínas, glicolípidos o proteoglicanos.
Respecto a este tema son posibles unas extremadamente amplias series de variaciones, incluyendo las que permiten la creación de una red de marcadores, capaces de amplificar considerablemente la señal de detección. En cualquier caso, todos estos procedimientos están relacionados con la utilización de anticuerpos como moléculas capaces de identificar específicamente una molécula objetivo, y éstos también tienen un nivel de sensibilidad que se encuentra limitado por la concentración de las moléculas objetivo.
La limitación anterior se ha superado por procedimientos establecidos más recientemente, que se basan en la aplicación de técnicas de RCP (Reacción en Cadena de la Polimerasa) con este objetivo, utilizados aquí en lugar de la detección de enzimas. De hecho, estos procedimientos se basan también en la utilización de anticuerpos monoclónicos contra un ligando específico, que en este caso no se encuentra físicamente asociado a alguna proteína, sino a polinucleótidos con una secuencia conocida.
Esto hace posible el llevar a cabo detecciones subsiguientes por la amplificación de la secuencia de ADN conocida, la cual se logra utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) (V. Ruzicka et al, 1993: T. Sano et al, 1992; H. Zhou et al, 1993).
Este procedimiento, conocido como inmuno RCP, hace virtualmente posible detectar incluso un único enlace de anticuerpo a la molécula objetivo. A pesar de la considerable mejora en la sensitividad, estos métodos presentan una serie de problemas, entre ellos la asociación directa de polinucleótidos y anticuerpos, y el historial resultante debido a la inevitable interferencia del polinucleótido durante el enlace del anticuerpo a la molécula de interés.
Adicionalmente, dado que la especificidad y el rendimiento de la reacción de amplificación dependen de la temperatura a la que los reactivos se mezclan, es posible obtener productos de hibridación no específicos, si el ensamblaje de la RCP ocurre a temperaturas inferiores a las consideradas óptimas para la hibridación de los cebadores.
Actualmente, este problema se ha resuelto por adición de la reacción de amplificación de un reactivo esencial, sólo después de que el sistema haya alcanzado la temperatura que permite la hibridación específica de los cebadores de "inicio caliente". Este procedimiento se logra por la separación mecánica de un reactivo (D.E. Birch et al, 1996) o por la utilización de anticuerpos para bloquear la actividad enzimática del ADN polimerasa (J. Cheng et al, 1996).
Recientemente, se ha desarrollado un procedimiento de RCP llevado a cabo en células, conocido como una RCP in situ (G. J. Nuevo, 1994), en el que la amplificación sigue a una reacción de hibridación in situ. Según este procedimiento la plantilla de ADN y los cebadores se mantienen físicamente separados hasta el momento de la lisis celular. Esto tiene la ventaja de que se evitan las reacciones de hibridación no específica (EP 524808 Hoffmann La Roche Inc.).
Además, hay una serie de patentes, todas relacionadas con nuevos métodos de diagnóstico, que se supone que superan muchos de los problemas típicos de los procedimientos actuales y, consecuentemente, mejoran la amplificación de la respuesta señal. Éstas tienen como tema principal varios procedimientos, como la utilización de la RCP asociada con el descubrimiento de determinadas proteínas (WO9421676); la utilización de enzimas híbridas de ingeniería genética conjugadas con ligandos, por ejemplo epítopes del virus HIV-1 (WO942636); la utilización de epítopes virales generados a partir de ácidos nucleicos combinados con proteínas enlazando al antígeno (WO9406934); la utilización de partes del ADNc viral, por ejemplo tomado de VHC, para expresar un epítope viral conectado a una secuencia de control y a un anticuerpo monoclónico dirigido contra el epítope. En el caso anterior, la región de interés del ADNc permite llevar a cabo controles de referencia cruzada entre la respuesta del anticuerpo y lo que resulta después de la hibridación con el ADN (EP388232).
Por otra parte, hay una patente que trata sobre la construcción de una biblioteca de determinantes antigénicos, obtenidos por la digestión con ADNasa-I del genoma de un virus, por ejemplo HIV, seguido por la expresión de los fragmentos obtenidos por medio de un vector apropiado y la selección subsiguiente de los mencionados productos de expresión por la utilización de los anticuerpos (EP373070).
En este contexto, el valor de la presente invención consiste en tener como asunto principal un procedimiento extremadamente versátil, que se puede utilizar en una amplia gama de diferentes situaciones y propósitos, según los procedimientos que permiten resolver varios problemas presentes en esta técnica.
El procedimiento según la invención no presupone la producción de anticuerpos específicos, sino la utilización de fagos filamentosos recombinantes que se exhiben en la cápside de una molécula capaz de interaccionar con la molécula de interés en la mezcla a examinar.
Esto también permite, cuando un fago se encuentra exhibiendo una molécula adecuada, la detección de la presencia de cualquier tipo de molécula de interés (no simplemente aminoácidos), incluso si la molécula en cuestión se encuentra presente en cantidades infinitesimales, en muestras biológicas de varios orígenes (no sólo en muestras tomadas del cuerpo humano o del cuerpo de animales, sino también de muestras de otros tipos, por ejemplo agua, bebidas o sustancias alimenticias). La combinación de las operaciones que forman el sujeto de la invención también se encuentra articulada para eliminar el riesgo de asociación no específico entre ADN, reactivos y el entorno consecuente, que puede comprometer la claridad de los resultados.
Estas ventajas son una consecuencia del hecho de que el ADN utilizado para detectar por la RCP no se encuentra directamente expuesto a los reactivos, sino que se encuentra dentro de los fagos recombinantes empleados.
La presencia de la cápside proteica envolvente previene que el ADN utilizado para la detección subsecuente interfiera durante la reacción enlazante entre la molécula ligando (la expuesta en la cápside) y la molécula receptora (la de interés en la muestra).
A continuación, después de la interacción entre la molécula ligando y la molécula receptora, se llevan a cabo operaciones adecuadas de lavado para eliminar los fagos que no se han enlazado por interacción específica al receptor. Finalmente, las secuencias de nucleótido del ADN del fago se amplifican añadiendo los reactivos necesarios según el proceso que evita el inconveniente de la falta de especificidad. De hecho, el ADN que va a ser amplificado permanece protegido durante las etapas iniciales por las proteínas de la cápside del fago, que sólo se desnaturalizan en el momento en el que comienza la reacción de polimerización.
Una ventaja adicional deriva del hecho de que el fagómido recombinante básico, utilizado para construir los fagos receptores, lo secreta principalmente la E. Coli como una partícula conteniendo una única cadena de ADN. De hecho, esto se conoce en la técnica como la utilización de la RCP en un modelo de ADN de cadena única y proporciona mejores resultados que el llevado a cabo en un ADN de cadena doble.
La invención se clarificará en más detalle con referencias a las figuras del anexo.
La figura 1 muestra el resultado de la amplificación del ADN de un fago P787, exhibiendo en la superficie de la cápside un péptido capaz de enlazar anticuerpos anti-VHC. La visualización se ha realizado con fluorescencia UV en gel de agarosa conteniendo bromuro de etidio. M es una referencia a los pesos moleculares obtenidos por hidrólisis del ADN plásmido pUC19 con la enzima de restricción Hinf I.
La figura 2 muestra el resultado de la amplificación del ADN de una mezcla de fagos después de su incubación con los sueros C17 y C22 de pacientes cuyo suero contiene anticuerpos anti-VHC. La visualización se ha realizado con fluorescencia UV en gel de agarosa conteniendo bromuro de etidio. PC89 es el fago no recombinante con el que se construyó la biblioteca de fagos, utilizada aquí como control negativo.
La figura 3 muestra el resultado de la amplificación del ADN de la misma mezcla de fagos utilizada en la figura 2, después de incubarla con los sueros N57 y N60 de dos voluntarios, cuyo suero no contiene anticuerpos anti-VHC y los cuales se consideran, por lo tanto, controles negativos. La visualización se ha realizado con fluorescencia UV en gel de agarosa conteniendo bromuro de etidio. P89 es un fago de control negativo descrito anteriormente en el ejemplo 1. M es una referencia a los pesos moleculares obtenidos al hidrolizar el ADN plasmídico pUC19 con la enzima de restricción Hinf I.
El tema principal de la presente invención es un procedimiento para la determinación y medida de la presencia de ciertas moléculas de interés, también llamadas en este contexto moléculas receptoras, sobre la base de su habilidad para que se puedan reconocer específicamente al menos por una molécula determinada, conocida aquí como molécula ligando, que se expone en la cápside del fago.
Es necesario resaltar como en la presente descripción los conceptos de molécula ligando y molécula receptora son estrictamente interdependientes, y estrictamente enlazados al contexto de trabajo específico. Como consecuencia de esto, una molécula expuesta a la superficie de la cápside se define como "ligando" sólo bajo la base de su habilidad para enlazarse específicamente a la molécula que presumiblemente se encuentra en la muestra, la presencia o concentración que se va a medir, que se define por lo tanto como "receptor" y viceversa.
En la presente invención, toda molécula obtenida a partir de fluidos biológicos, superficies de células o tejidos, se considera que es un "receptor" si su presencia se puede identificar por medio de interacción con un "ligando" específico como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, los anticuerpos capaces de reconocer claramente antígenos identificados (tales como antígenos virales, antígenos tumorales o antígenos presentes en tejidos normales), o antígenos a los que no se ha identificado su naturaleza molecular exacta, perteneciendo a la categoría de "ligandos", aunque ahora no se encuentren solos en esa categoría. En este caso, a estos antígenos se les considerará "receptores". Estas definiciones están conectadas, por ejemplo, al caso en el que la presencia y/o concentración de estos antígenos en los fluidos biológicos o en las superficies de las células y tejidos sometidas a examen es una indicación con valor de diagnóstico. De todas formas, según el procedimiento de acuerdo con la presente invención, los antígenos se pueden utilizar como "ligandos" en el caso de que la molécula receptora de interés, la presencia o la concentración que es necesario determinar, estén formadas por anti-
cuerpos.
De la misma forma se puede considerar a los "receptores", si son de interés, incluso receptores específicos presentes en la membrana de las células sencillas o de las células en tejidos, junto con los receptores solubles presentes en fluidos biológicos, que en este caso los detectarán moléculas capaces de enlazarse específicamente con ellos actuando como "ligandos". Obviamente, también se puede invertir la relación cuando las moléculas de interés no se encuentran formadas por receptores de membrana (que en este caso actúan como "ligandos"), excepto para sus ligandos específicos (que en este caso se considerarán "receptores").
Por lo tanto se puede entender que se puede incluir dentro de la categoría de "receptores" a toda molécula cuya presencia en la muestra a examinar sea susceptible de tener un valor de diagnóstico y/o pronóstico (después de haber verificado su asociación con la presencia de una patología específica) o es de interés para cualquier propósito.
Las muchas aplicaciones de este procedimiento son bastante evidentes, particularmente en los campos médico y veterinario, pero también en otros campos como por ejemplo alimentación y medio ambien-
te.
Este procedimiento se ha redactado a continuación de la verificación por parte de los inventores de la posibilidad de utilizar bacteriófagos filamentosos, bien recombinantes o no recombinantes, para detectar la interacción entre un "ligando" y una molécula receptora presente en la muestra, incluso a concentraciones extremadamente bajas, por amplificación de secuencias de nucleótidos específicos presentes en el genoma del fago y asociadas con el ligando, bien de forma física bien de forma genética.
De forma breve, se puede decir que el procedimiento según la invención se puede aplicar constantemente y en él es posible identificar:
A) una molécula receptora o una clase homogénea de "receptores" formando un grupo, la presencia de lo que está relacionado con una cierta patología en fluidos biológicos o en superficies de células o en tejidos o en todos casos tiene un interés considerable para, por ejemplo, propósitos de diagnóstico;
B) un "ligando" o una clase de "ligandos", por ejemplo de tipo polipéptido, cuya estructura les permita estar expuestos en la cápside de los bacteriófagos, manteniendo la habilidad para enlazarse específicamente a la molécula receptora.
El tema principal de la presente invención es por lo tanto un procedimiento basado esencialmente en las siguientes operaciones:
a) inmovilizar las moléculas de interés sin destruir la habilidad para que estas moléculas interaccionen con las moléculas expuestas en las superficies del fago;
b) lograr que una molécula de interés, inmovilizada como se ha descrito anteriormente, se enlace específicamente con al menos uno de los bacteriófagos filamentosos recombinantes, los cuales tienen internamente una molécula de ADN de cadena única cuya secuencia se conoce al menos parcialmente, y exponiendo a las superficies de la cápside al menos una molécula capaz de enlazarse específicamente con al menos una molécula de interés presente en la muestra biológica;
c) separar el complejo molécula-bacteriófago obtenido de esta forma en la reacción de mezcla;
d) lavar para eliminar los complejos generados por interacción no específica entre la molécula y el bacteriófago;
e) añadir los reactivos para llevar la cabo la operación descrita en g) más adelante;
f) lisis de proteínas formando la cápside de proteínas de los bacteriófagos seleccionados de esta forma;
g) amplificación del ADN obtenido como se explica arriba por la reacción en cadena de al polimerasa (RCP);
h) detección del ADN amplificado como se describe anteriormente, por ejemplo utilizando procedimientos convencionales.
Los procedimientos para detectar el ADN amplificado pueden ser por ejemplo electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro la etidio, electroforesis capilar, hibridación para radioactividad específica marcada o sondas luminiscentes.
En particular, la operación indicada en g), que es una amplificación del ADN del fago, se lleva a cabo utilizando técnicas de la RCP, utilizando un par de oligonucleótidos de los que al menos uno es complementario de una secuencia conocida del ADN del fago. Además, se ha encontrado que utilizando un protocolo para la lisis de las proteínas de la cápside del fago a la temperatura a la que ocurre la desnaturalización del ADN, lo cual normalmente cae dentro del rango de 93-96ºC, el contacto entre los cebadores y el modelo de ADN ocurre a la misma temperatura, obteniendo de esta forma un "inicio caliente" de la RCP, con la eliminación virtual consecuente de los productos de reacción no específicos.
Una aplicación importante de este método es cuando las moléculas de interés son anticuerpos.
Otra aplicación específica es cuando la eliminación de las moléculas de interés se lleva a cabo en fase sólida. En este caso, la eliminación se logra por adsorción pasiva y/o por la utilización de anticuerpos específicos para las moléculas en si.
En todo caso, la inmovilización se puede lograr con la utilización de bacterias y de al menos una de las proteínas bacterianas seleccionadas del grupo que comprende proteína A de estafilococos aureus, proteína G de estreptococos del grupo C y otras proteínas bacterianas capaces de enlazarse a las inmunoglobulinas animales.
Otras aplicaciones de interés particular de este procedimiento son aquellas en las que los bacteriófagos utilizados aparecen en las superficies de la cápside viral de los antígenos, autoantígenos (antígenos que se pueden presentar en el animal y que son las fuentes de los fluidos biológicos), alergénicos, receptores de membranas celulares, partes de dichas moléculas o oligopéptidos capaces de imitar su presencia en los fluidos biológicos sometidos a examen, así como en receptores de membranas de células específicas o en péptidos derivados de éstos, o en ligandos del tipo aminoácido cuyo receptor se encuentra presente en los fluidos a probar.
Entre los aspectos fundamentales de este procedimiento se encuentra en primer lugar el hecho de que los instrumentos empleados para la detección son siempre bacteriófagos filamentosos, generalmente del tipo recombinante M13, f1 o fd, los cuales hacen posible la exposición a la cápside de una o más moléculas, preferentemente de tipo aminoácido, que actúan como "ligandos" capaces de interactuar específicamente con el "receptor" que se va a probar. Esto forma un primer elemento de originalidad, teniendo en cuenta que ya no existe la utilización directa de moléculas ligando, sino fagos que contienen "ligandos" apropiados naturalmente seleccionados, sus partes o sus imitaciones.
La presente invención se distingue de otros métodos de detección descritos en el pasado, tales como inmuno-RCP, en que un anticuerpo se enlaza artificialmente a una molécula de polinucleótido con una secuencia conocida utilizada como sonda, en el hecho de que en esta invención la información genética contenida dentro del fago se utiliza para determinar la presencia de una molécula de interés.
Además, la habilidad para utilizar simultáneamente diferentes fagos hace posible detectar simultáneamente diferentes partes de una molécula de interés, o incluso varias moléculas de interés.
De todas formas, la característica principal es, por encima de toda otra consideración, la asociación del "ligando" expuesto en las superficies del fago y del ADN del fago, utilizado por detección de la RCP. Ésta puede estar formada por la información genética codificada para el "ligando", pero también y más generalmente de una secuencia de nucleótidos del genoma del fago.
Como consecuencia de este procedimiento de la invención, también es posible seleccionar las secuencias de nucleótidos asociadas con el "ligando" que se van a utilizar para la detección, de tal forma que aumente la especificidad y disminuya el tiempo de reacción de amplificación. Efectivamente, para conseguir la RCP, la secuencia de los cebadores oligonucleótidos, la duración y la temperatura a la que tiene lugar cada incubación junto con el número de ciclos en cada reacción, se pueden preseleccionar en este momento con el fin de obtener amplificaciones extremadamente rápidas y altamente específi-
cas.
Efectivamente, debido a su naturaleza, la información genética presente dentro del fago y utilizada para la detección es particularmente propensa a su amplificación utilizando procedimientos actuales de RCP, los cuales hacen posible resaltar la presencia de incluso una única molécula de ADN en el tubo de ensayo en el que ocurre la reacción. La sensitividad que se puede obtener utilizando la reacción en cadena de la polimerasa no se puede alcanzar fácilmente utilizando otros métodos de detección actualmente en
uso.
Otra ventaja adicional que resulta de lo anterior se encuentra conectada al hecho de que las sondas del oligonucleótido utilizadas para la amplificación se pueden diseñar para proporcionar una amplificación específica de una secuencia particular presente en el fago, incluso con la presencia del ADN de otros fagos que no lo incluyen. Por ejemplo, es posible diseñar las sondas para que se amplifique solamente el ADN de los fagos que contienen una inserción específica (por ejemplo la que codifica la molécula que actúa como "ligando" cuando se expone en la cápside), incluso con la presencia del ADN de los fagos que no contienen esta inserción o que contienen inserciones con una secuencia diferente. La consecuencia más directa de esto es que es posible que reaccione la molécula receptora (o las moléculas receptoras) sometidas a examen con una mezcla de diferentes fagos y se identifique el enlace con cada tipo de fago, e incluso con la presencia de otros.
Además, el hecho de que el ADN esté contenido dentro de la cápside proteica permite solucionar una de las limitaciones de la especificidad típica de las detecciones de los procedimientos de la RCP. Esta limitación es la necesidad de situar la plantilla de ADN en contacto con las sondas de amplificación a una temperatura relativamente baja, según la secuencia de los dos cebadores. Cuando se alcanza la temperatura para empezar el primer ciclo de amplificación, parte del ADN permanece acomplejado a la sonda y esto resulta en una elongación no específica de la sonda en la plantilla de ADN. Para remediar este problema se han propuesto varios procedimientos (4, 5). El procedimiento de la presente invención, como se ha mencionado anteriormente, permite resolver eficientemente el problema haciendo uso del hecho de que se utilice un ADN natural dentro de una cápside, lo que permite que este ADN esté protegido del contacto con las sondas específicas hasta el momento de la lisis de la cápside. En este sentido, se puede obtener una especificidad extremadamente alta simplemente perfeccionando el procedimiento y utilizando un protocolo de lisis termal, que permite el contacto entre el ADN y la sonda específica sólo a altas
temperaturas.
De este modo, llevando a cabo la realización de forma simple y práctica, es posible obtener lo que técnicamente se conoce como un "inicio caliente" de la RCP.
Hasta este momento se ha proporcionado una descripción general de la presente invención. A partir de ahora se va a proporcionar una descripción más detallada de las formas de realización específicas con los siguientes ejemplos, siempre teniendo presente el proporcionar un mejor entendimiento de los objetos, características, ventajas y procedimientos operativos de la invención. Estos ejemplos son meramente ilustrativos y en ningún caso limitan el alcance de la presente invención, la cual se define en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1 Procedimiento para la detección en el suero de pacientes de la presencia de anticuerpos específicos de los antígenos del virus de hepatitis C humana (VHC)
El siguiente procedimiento se ha utilizado según la invención:
En los pocillos de una placa de policarbonato de 96 pocillos, actualmente utilizada para los procedimientos de RCP (Thermowell-II^{TM} tipo 6509 producido por Costar) se absorbieron varias cantidades de inmunoglobulina goat-anti-IgG humana, específica para la porción Fc. Después de la incubación, la placa se lavó con una disolución reguladora de fosfato salino, y las zonas de absorción de residuos se bloquearon por incubación en una disolución reguladora en la que se suspendió leche desnatada en polvo (como se describe en la documentación al respecto). En los pocillos de la placa se distribuyó lo que se preparó de la siguiente forma: 1) cantidades del suero humano a probar diluido en varios niveles; en este ejemplo se utilizaron los tipos de suero humano C17 y C22 de pacientes infectados con el VHC y que contenían anticuerpos anti-VHC. De individuos sanos se obtuvieron los tipos de suero N57 y N60, en los que no se encontraron anticuerpos anti-VHC. Las cantidades de estos sueros se mezclaron con un fago de tipo no recombinante, que actúa como un transportador no específico. Se añadió también un fago recombinante 2A, que se puede amplificar en la RCP pero que no exhibe el ligando específico en la cápside, en este ejemplo, los péptidos capaces de enlazarse a los anticuerpos anti-VHC humanos; y alternativamente 2B el fago VHC específico P787.
Después de la incubación a 37ºC durante 90 minutos, la placa se vació y se lavó con una disolución reguladora de fosfato para eliminar todos los fagos recombinantes que no se enlazaron específicamente. Después se añadió a cada pocillo, que contenía una disolución reguladora adecuada para la RCP, una mezcla que contenía sondas de ADN específicas para amplificación, el Taq de la polimerasa y dioxinucleótidos trifosfato. La placa se transfirió a una incubadora térmica para que la RCP y el proceso continuaran con los ciclos de reacción que empezaron con el calentamiento a 95ºC durante 5 minutos. Este paso es particularmente importante ya que sólo a esta temperatura ocurre la lisis de las proteínas del fago y consecuentemente también ocurre el contacto de las sondas específicas con el ADN a amplificar. La RCP empieza a altas temperaturas (inicio caliente) y continua con 25 ciclos de 10 segundos a 94ºC y 10 segundos a 72ºC. La reacción termina con 2 minutos de incubación a 72ºC.
El ADN del fago P787 amplificado de esta forma se resalta por electroforesis en gel de agarosa que contiene bromuro de etidio, tal como aparece en el ejemplo específico de la figura 1.
Ejemplo 2 Utilización de una composición de fagos para diagnosticar la presencia de anticuerpos anti-VHC en el suero de pacientes
Para diagnosticar la presencia de anticuerpos anti-VHC en un suero se utilizó una composición con varios fagos específicamente seleccionados, cada uno de ellos conteniendo réplicas de diferentes regiones proteicas del virus de la hepatitis C humana. Debido a que los fagos se pueden distinguir según la secuencia que llevan, pero también y de forma más sencilla por la longitud de su inserción, es posible observar la amplificación de fragmentos de ADN de diferentes longitudes en el gel de agarosa según las dimensiones de la inserción del ADN del fago.
En este ejemplo se muestra como, utilizando una mezcla de fagos, es posible obtener una respuesta en gel de agarosa de la forma que se describe en el ejemplo 1. El ejemplo muestra que una mezcla de fagos es más predecible que la utilización de un único
fago.
Es sorprendente que en un suero sea posible identificar anticuerpos de antígenos diferentes, y que la respuesta de amplificación sea específica. El resultado que aparece en las figuras 2 y 3 consiste en una respuesta que se puede analizar por electroforesis, como se describió anteriormente en el ejemplo
1.
Ejemplo 3 Procedimiento para la detección in vitro de anticuerpos del anti-IL-6 humano
En este ejemplo se describe un procedimiento en el que se inmoviliza el receptor de IL-6 en una placa y los fagos que expresan el IL-6 se utilizan para detectar la presencia de los mismos en medios de cultivo extracelulares.
El código del ADNc humano para el hIL-6 se combinó con el amino terminal final del gen III de un fagómido obtenido de M13, como se describe en la documentación al respecto. El fago hIL-6/M13-pIII recombinante se puede utilizar para detectar la presencia del receptor de la interleuquina-6 humana. Técnicamente se ha proporcionado una descripción de cómo es posible seleccionar un fago que exprese el hIL-6 que es capaz de enlazar in vitro a los anticuerpos hIL-6/R y anti-hIL-6, tal como se describe en la documentación al respecto. Se ha probado que el reconocimiento es posible y más efectivo si se utiliza el procedimiento descrito en la presente
invención.
En un soporte sólido, por ejemplo en una perla de plástico, se fijó 1 \mug de anticuerpos anti-hIL-6 monoclonales en 10 mM de NaCO_{3} a pH 9,2 y se incubó a 4ºC durante la noche. Después de bloquear las perlas en 1 ml de TBS/6% BSA durante 4 horas a 4ºC, éstas se incubaron durante la noche con hIL-6 a 4ºC. Las perlas se lavaron dos veces con 2 ml de TBST y a continuación se incubaron durante 1 hora en 1 ml de TBST/0,1% BSA a 20ºC. A continuación los fagos se extrajeron con 500 \mul de 100 mM de glicina con HCl a pH 2,2 y la extracción se neutralizó con 3M Tris HCl pH 8,9. Los fagos enlazados a los anticuerpos se pudieron detectar por la RCP de la forma que se describe en la invención.
Ejemplo 4 Procedimiento para la detección de la forma soluble del receptor IL-6 humano en un cultivo de células CHO de diseño
Se describe un procedimiento en el que receptor IL-6 humano, expresado en células cancerígenas ováricas diseñadas, se detecta según el procedimiento descrito en la presente invención y es posible cuantificarlo utilizando fagos capaces de expresar el IL-6 o los superantagonistas del IL-6.
Una línea celular CHO (CsRh14) es capaz de secretar una forma soluble del receptor de la interleuquina-6 (ref). Utilizando 100 \mul de tosil activado Dynabeads M450 (unipath) se preparó la forma concentrada, utilizando un concentrador de partículas magnéticas, lavado con 50 mM de borato de sodio a pH 9,5 e incubándolo durante 24 horas a 25ºC en 400 \mul de la misma disolución reguladora, que contiene 15 \mug de anticuerpos anti-hIL-6R\alpha. Después de saturar el paso en TBS/0,1%BSA durante 12 horas a 4ºC, las perlas se incubaron durante 4 horas a 25ºC con 400 \mul de un medio condicionado sin contener suero, obtenido de la línea CsRh14, conteniendo 250 ng de shIL-6R\alpha. Después de lavar las perlas varias veces, a las que se enlazó el shIL-6R\alpha, éstas se incubaron con fagos expresando hIL-6 (en un ratio de 1:4) durante 16 horas a 4ºC. El volumen de reacción se llevó hasta 1 ml añadiendo una cantidad apropiada de TBS/0,1%BSA. Las perlas se lavaron 3 veces con 1 ml de TBST y los fagos se extrajeron en 400 ml de 100 mM de disolución reguladora de citrato a pH 3,2. Después de la neutralización con 3M Tris CHl Ph 8,9, los fagos enlazados se detectaron por amplificación de la RCP, según la naturaleza de la presente
invención.
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Claims (14)

1. Un procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas, comprendiendo las siguientes operaciones:
a) inmovilizar las moléculas de interés sin destruir la habilidad para que estas moléculas interaccionen con las moléculas expuestas en las superficies del fago;
b) hacer que una molécula de interés, inmovilizada como se ha descrito anteriormente, se enlace específicamente con al menos uno de los bacteriófagos filamentosos recombinantes, los cuales tienen internamente una molécula de ADN de cadena única cuya secuencia se conoce al menos parcialmente, y exponiendo a las superficies de la cápside al menos una molécula capaz de enlazarse específicamente con al menos una molécula de interés presente en la muestra biológica;
c) separar el complejo molécula-bacteriófago obtenido de esta forma en la reacción de mezcla;
d) lavar para eliminar los complejos generados por interacción no específica entre la molécula y el bacteriófago;
e) añadir los reactivos para llevar la cabo la operación descrita en g) más adelante;
f) lisis de proteínas formando la cápside de proteínas de los bacteriófagos seleccionados de esta
forma;
g) amplificación del ADN obtenido como se explica arriba por la reacción en cadena de al polimerasa (RCP);
h) detección del ADN amplificado como se describe anteriormente.
2. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según la reivindicación 1, en el que la operación indicada en f) se lleva a cabo a la temperatura en la que la ocurre la desnaturalización del ADN, que forma un paso de la operación siguiente indicada en g), es inmediatamente seguida de lisis de la cápside proteica y ocurre a la misma temperatura, logrando así un "inicio caliente" de la RCP.
3. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según alguna de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que las moléculas de interés son anticuerpos.
4. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según alguna de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las moléculas de interés se inmovilizan en fase
sólida.
5. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según la reivindicación 4, en el que la inmovilización en la fase sólida de las moléculas de interés ocurre por absorción pasiva.
6. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según la reivindicación 4, en el que la inmovilización de las moléculas de interés en la fase sólida ocurre por la utilización de anticuerpos específicos a las moléculas.
7. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según la reivindicación 3, en el que la inmovilización de las moléculas en la fase sólida ocurre por la utilización de bacterias o por la utilización de al menos una de las proteínas bacterianas seleccionadas del grupo que comprende proteína A de estafilococos aureus, proteína G de estreptococos del grupo C y otras proteínas de bacterias capaces de enlazarse a la inmunoglobulina animal.
8. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos aparecen en las superficies de la cápside viral de los antígenos, partes de éstos o oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su presencia en los fluidos biológicos bajo examen.
9. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos aparecen en las superficies de la cápside de los autoantígenos, partes de éstos o oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su presencia en los fluidos biológicos bajo examen.
10. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos aparecen en las superficies de la cápside de los alergenos, partes de éstos u oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su presencia en los fluidos biológicos bajo examen.
11. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos aparecen en las superficies de la cápside de los receptores de membrana celular, partes de los mencionados receptores u oligopéptidos capaces de imitar la actividad biológica de éstos.
12. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos aparecen en las superficies de la cápside de los receptores de membrana celular específica o en los péptidos que derivan de éstos.
13. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos aparecen en las superficies de la cápside de los ligandos con naturaleza de aminoácidos cuyo receptor se supone que está presente en los fluidos a probar.
14. El procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos aparecen en las superficies de la cápside junto con:
a)
antígenos virales, partes de éstos u oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su presencia en los fluidos biológicos bajo examen (según la reivindicación 8),
b)
autoantígenos, partes de éstos u ligopéptidos capaces de imitar los efectos de su presencia en los fluidos biológicos bajo examen (según la reivindicación 9),
c)
alergenos, partes de éstos ú oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su presencia en los fluidos biológicos bajo examen (según la reivindicación 10),
d)
receptores de membrana celular, partes de los mencionados receptores u oligopéptidos capaces de imitar la actividad biológica de éstos (según la reivindicación 11),
e)
receptores de membrana celular específica o péptidos que derivan de éstos (según la reivindicación 12), y/o
f)
ligandos con naturaleza de aminoácidos cuyo receptor se supone que está presente en los fluidos a probar (según la reivindicación 13).
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