CN117025613A - Eb病毒的核酸适配体检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对EB病毒的核酸适配体检测试剂盒，还提供了试剂盒的制备方法和应用。此试剂盒检测时具有操作简单、反应迅速、准确性高和灵敏度高的特点，可结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测装置，就可以实现对于病毒的精确检测。试剂盒灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、有着良好的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种用于检测EB病毒的核酸适配体和试剂盒。
背景技术
EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是疱疹病毒科，嗜淋巴细胞病毒属的一种病毒，是一种DNA病毒。EB病毒具有在体内外专一性地感染人类及某些灵长类B细胞的生物学特性。人类是EB病毒感染的主要宿主，主要通过唾液进行传播，无症状感染主要发生在幼儿时期，据调查显示3～5岁幼儿90%以上曾感染EB病毒，90%以上的成人都有病毒抗体。EB病毒是传染性单核细胞增多症的病原体，此外EB病毒与鼻咽癌、儿童淋巴瘤的发生有密切相关性，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。目前可以通过EB病毒抗体进行病毒检测，主要有针对病毒的衣壳抗原（CA）、早期抗原（EA）和核抗原（EBNA）。
对于EB病毒的样品检测在临床检测以及实验研究中十分重要。现有的技术中对于病毒感染或者病毒蛋白的检测多采用特异性的抗体进行识别，制备比较复杂，步骤比较繁琐，成本较高，在大规模推广中有一定的缺陷。核酸适配体是一段单链核酸（一般大小在20～60个碱基左右），能通过折叠形成特定的三维结构并与相对应的靶分子进行高亲和力、高特异性的结合。核酸适配体可以通过模拟自然进化过程的人工筛选技术-指数富集配体系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）筛选得到，是一种具有识别功能的新型核酸分子。利用SELEX技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性的与靶物质高度亲和的核酸适配体，该技术已经成功的运用于许多靶物质的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。该技术具有库容量大、适应范围广泛、分辨率高、亲和力高，筛选过程相对简便、快速、经济，实用性高等特点。适配体对应靶标物质的高特异性和高亲和性的特点与抗体的功能类似，但是适配子的靶标范围更加的广泛，可以很好地运用于医学检测、诊断和治疗等多个方面。
核酸适配体具有特异性和高亲和力的原因是单链核酸在遇到靶标分子时可以形成例如口袋、发卡、G-四聚体等独特的三维结构，这些结构在结合靶标分子时的原理与抗体特异性识别相应抗原决定簇的原理类似，例如通过氢键、疏水结构、离子键等与靶标分子特异性的结合。基于适配体具有较高特异性地识别病原微生物或者病变细胞的生物学特性，核酸适配体能被广泛的应用于检测技术以及生物传感器的构建，能够实现对于病原体或者疾病的精准诊断。
目前市面上针对EB病毒的检测试剂盒都是抗原检测，以单通道检测为主。而且市售抗原检测试剂盒用的是抗体检测，抗体作为一种蛋白成分，具有不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等缺点。
因此有必要开发一种特异性高、灵敏度高的检测方法。
发明内容
本发明目的是提供一种用于检测EB病毒的核酸适配体和试剂盒，灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以快速检测靶蛋白、适合大规模推广，有着良好的市场前景。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测EB病毒的核酸适配体，所述用于检测EB病毒的核酸适配体的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述用于检测EB病毒的核酸适配体还包括：在所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有荧光物质、纳米发光材料、生物素、地高辛和酶标记中一种。
进一步地，所述荧光物质为FAM荧光基团或Cy5荧光基团；所述纳米发光材料为量子点或上转换纳米颗粒；所述酶标记为辣根过氧化物酶或蔗糖酶。
进一步地，所述用于检测EB病毒的核酸适配体还包括：在所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化的核酸适配体。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测EB病毒的试剂盒，包括所述的核酸适配体。
进一步地，所述用于检测EB病毒的试剂盒还包括：
（A）固定样本溶液的蛋白包被板；
（B）蛋白包被液；
（C）封闭液；
（D）漂洗液；
（E）样本前处理液。
进一步地，所述蛋白包被液的配方为：35mM NaHCO3，15mM Na2CO3，pH 9.3-pH 9.9。
进一步地，所述封闭液的配方为136mM NaCl，2.6mM KCl，2mM KH2PO4，8mMNa2HPO4，0.05% Tween-20，1% BSA，pH 7.1-pH 7.7。
进一步地，所述漂洗液的配方为136mM NaCl，2.6mM KCl，2mM KH2PO4, 8mMNa2HPO4，0.05% Tween-20，pH 7.1-pH 7.7。
进一步地，所述样本前处理液的配方为：150mM NaCl, 1% Triton X-100, 50mMTris, pH7.8-pH8.2。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供一种用于检测EB病毒的核酸适配体和试剂盒，本发明通过SELEX技术筛选到的针对EB病毒靶蛋白抗原表位的核酸适配体具有较高的特异性和亲和力，并且具有无免疫原性、分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒等优点。本发明所用核酸适配体序列为通过SELEX技术筛选所得，具有完全的独创性。
本发明的试剂盒灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以快速检测靶蛋白、适合大规模推广，有着良好的市场前景。 具体地：本发明试剂盒对EB病毒的检测具有较高的灵敏度与特异性，在EB病毒感染病人样本和健康人样本的检测中，EB病毒感染病人的阳性检出率，即灵敏度为96%；健康人群检测的阳性检出率为0%。
本发明试剂盒采用核酸适配体作为检测物，能有效克服不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等问题，它具有分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒、无免疫原性等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明核酸适配体--EB病毒-aptamer核苷酸序列的二级结构图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
本申请以EB病毒靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID NO.2所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得本申请的EB病毒的核酸适配体，再联接上荧光基团，以便观察和识别；最后将所述核酸适配体用于制备检测试剂盒，具体包括：
1、确定待测靶蛋白抗原表位
通过文献查阅与生物信息学分析，本发明人确定了EB病毒靶蛋白抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2、筛选特异性结合的核酸适配体序列
体外合成一个含有45个随机序列的单链DNA文库；以EB病毒靶蛋白抗原表位为筛选条件，采用SELEX技术筛选出具有高特异性、高亲和力的DNA适配体序列，EB病毒的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3、合成带有荧光基团标记的核酸适配体
将筛选得到的核酸适配体序列以共价键的形式在核酸适配体5’端连上荧光基团。检测EB病毒的核酸适配体具有如SEQ ID NO.3所示序列，所带荧光基团为FAM。
4、制备试剂盒
试剂盒包括以下组分：A）固定样本溶液的蛋白包被板 ，B）蛋白包被液，C）封闭液，D)漂洗液，E）带有荧光基团标记的核酸适配体，和F）样本前处理液。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种用于检测EB病毒的核酸适配体和试剂盒进行详细说明。
实施例1、用于检测EB病毒的核酸适配体
1、确定EB病毒靶蛋白抗原表位
根据文献查阅与生物信息学分析，确定适合作为核酸适配体检测靶点的靶蛋白上的具体抗原表位区域。
（1）选择EB病毒RTA蛋白上具有较强免疫原性的区域（第172~356位氨基酸）作为适配体筛选靶蛋白，具有如SEQ ID NO.2所示序列：
VVEHLNRMEKEGLLSSKFKAFCKWVFTYPVLEEMFQTMVSSKTGHLTDDVKDVRALIKTLPRASYSSHAGQRSYVSGVLPACLLSTKSKAVETPILVSGADRMDEELMGNDGGASHTEARYSESGQFHAFTDELESLPSPTMPLKPGAQSADCGDSSSSSSDSGNSDTEQSEREEARAEAPRLRA (SEQ ID NO.2)
（2）根据已确定的氨基酸序列，直接在公司进行核苷酸序列的合成以及原核密码子优化，将合成的基因片段插入原核表达载体pET32a的BamH I /Hind III的酶切位点上。诱导表达出相应用于适配体筛选的的靶蛋白。
2、构建适配体文库与引物设计
（1）通过常规生物技术服务公司的基因合成服务，体外合成含有45个随机序列的单链DNA文库，其核苷酸序列如下：
5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-(N45)- CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’
（2）针对核酸适配体5’端固定序列，设计合成的上游引物P1，具有如SEQ ID NO.3所示序列：5’-TTCAGCACTCCACGCATAGC-3’ (SEQ ID NO.3)
（3）针对核酸适配体3’端固定序列，设计合成的下游引物P2，具有如SEQ ID NO.4所示序列，同时在引物5’端连接有生物素基团，具体为：
5’-biotin-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’ (SEQ ID NO.4)。
3、利用SELEX筛选技术，从文库中筛选得到能有效结合靶蛋白的核酸适配体序列
（1）将10nmol的初始单链DNA随机文库溶解在500μl的PBS溶液中，用92℃的恒温水浴锅水浴5min，之后迅速的插入冰中冰浴10min，之后将经过处理的初始单链DNA随机文库与相应靶蛋白在冰上孵育1h，再加入Ni-NTA Magnetic Agarose Beads，继续孵育1h。孵育完成后，使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤Beads。最后用10ml预冷的PBS重悬Beads，使之充分吹打混匀，之后92℃恒温水浴10min，13000g离心，收集上清，即为第一轮筛选后特异性识别靶蛋白的单链DNA文库。
（2）对筛选后的单链DNA文库进行PCR扩增，以制备次级文库。PCR反应的体系如下：Premix Tap Mix 25μl，筛选后的单链DNA文库8μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，ddH2O12μl，总体积为50μl。按照如下的程序进行PCR循环扩增：95℃变性3min，经过35个循环扩增程序为95℃ 30s，55℃ 30s，72℃30s，最终的延伸为72℃ 10min，最后维持在16℃终止反应。对经过PCR扩增后的文库进行琼脂糖凝胶回收以得到纯净的文库片段。
（3）对扩增得到的次级文库进行进一步的制备。将扩增后的双链DNA文库与100μl链酶亲和素标记的磁珠常温孵育20min，利用双链DNA文库上的生物素与链酶亲和素的亲和作用将双链DNA文库结合到磁珠的表面，之后使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤磁珠。加入终浓度为200mM的NaOH溶液常温反应10min使得双链DNA文库变性变成单链，其中带有生物素标记的一条链会结合在磁珠上，不带生物素标记的那一条链会脱离到上清液中。收集上清液，用脱盐柱除去NaOH，最后加入500μl的PBS，收集到的溶液即为下一轮筛选所需要用到的单链DNA文库。
（4）重复上述的阳性筛选过程、PCR扩增以及次级单链DNA文库的制备过程15次，最后筛选得到的单链DNA文库对于靶蛋白的识别能力最强。将所得到的单链DNA文库进行克隆测序后，最终得到了本发明中所筛选出来的可用于检测EB病毒的核酸适配体，其DNA序列为：EB病毒-aptamer 如SEQ ID NO.1所示：
TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA；
（5）为了能在反应体系内对反应产物进行灵敏检测，给适配体5’端标记上荧光基团（共价键结合的形式，直接在常规生物技术服务公司合成（可参考此文章内容：2002-《荧光标记寡核苷酸探针及其应用》-中国生物工程杂志）），最终的适配体信息如下：EB病毒-aptamer，具有如SEQ ID NO.5所示序列：
5’-FAM-TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA -3’ （SEQ ID NO.5）。
实施例2
采用实施例1筛选出来的用于检测EB病毒的核酸适配体的5’端标记上Cy5荧光基团，（可参考此文章内容：2002-《荧光标记寡核苷酸探针及其应用》-中国生物工程杂志），最终的适配体信息如下：EB病毒-aptamer，具有如SEQ ID NO.6所示序列：
5’-Cy5- TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’ 。
实施例3
采用实施例1筛选出来的用于检测EB病毒的核酸适配体的5’端标记上纳米荧光量子点，得到如SEQ ID NO.7所示序列：
可参考此文章内容：2008-《采用量子点标记的寡核苷酸探针检测ApoEε4等位基因》-华中科技大学学报(医学版)
5’-QD- TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。
实施例4
采用实施例1筛选出来的用于检测EB病毒的核酸适配体的5’端标记上辣根过氧化物酶，得到如SEQ ID NO.8所示序列：
可参考此文章内容：2001-《HRP标记DNA探针的制备及杂交条件探讨》-贵阳医学院学报
5’-HRP- TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。
实施例5
采用实施例1筛选出来的用于检测EB病毒的核酸适配体的5'端位置进行磷酸化，得到如SEQ ID NO.9所示序列：
5’-P- TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA -3’。
实施例6
采用实施例1筛选出来的用于检测EB病毒的核酸适配体的位置进行甲基化。
实施例7
采用实施例1筛选出来的用于检测EB病毒的核酸适配体的5'端位置进行氨基化，得到如SEQ ID NO.10所示序列：
已有较成熟的实行方案，在公司进行适配体合成时就可以进行修饰。
5’-amino- TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATAT ACCCTATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA -3’。
实施例8
采用实施例1筛选出来的用于检测EB病毒的核酸适配体的5'端位置进行巯基化，得到如SEQ ID NO.11所示序列：
已有较成熟的实行方案，在公司进行适配体合成时就可以进行修饰。
5’-SH- TTCAGCACTCCACGCATAGCAGATACGCGAGGGGTCATTTGTATATACCC TATGCCTGGTTACCCCCTATGCGTGCTACCGTGAA -3’。
实施例9、核酸适配体的验证
通过结构预测软件RNA Structure Program来分析预测筛选出来的核酸适配体的二级结构，结果显示该核酸适配体（SEQ ID NO.1）可以形成特殊的茎环结构和发卡结构。EB病毒-aptamer可形成如图1所示的二级结构。
不是本案所述的SEQ ID NO.1的序列难以与EB病毒实现二级结构的语言。
比如TTCAGCACTCCACGCATAGCAAGTCGGAGTTCTGCTTCCAATAGAGTTATGT TATTAACCGCTATCCTATGCGTGCTACCGTGAA。
实施例10
使用ForteBio Octet RED96相互作用分析仪检测核酸适配体与靶蛋白的结合力（可参考此文章内容:2021-《基于生物膜干涉技术检测PDL1抗体与PDL1抗原的亲和力》-生物技术进展），所得结果如下：
表1
。
实施例11
人血白蛋白、免疫血清球蛋白与核酸适配体进行特异性检测（需要给具体的操作试验步骤）
分别采用人血白蛋白、免疫血清球蛋白与核酸适配体进行特异性检测，经过结合实验发现，适配体不与这些蛋白结合。用靶蛋白对适配体进行交叉反应检测，实验结果显示，本发明的核酸适配体只与对应的靶蛋白结合。
仍然是使用实施例10的实验手段，检测不到适配体与人血白蛋白、免疫血清球蛋的结合，对应的结果就像实施例10中“PBS对照”那一组的结果，为“无结合”。
实施例12
需要给具体的操作步骤
取0.2μg适配体，放置于常温血清、水溶液中（是分别放置还是怎样的环境）。放置4周是处于什么样的环境下，4周后用RT-PCR检测，发现放置的核酸适配体结构稳定，没有发生降解。
本实施例是分别放置于常温血清、水溶液中。4周后进行RT-PCR检测（同时检测的对照样品为新鲜的0.2μg适配体、无菌水），如果处理组样品能扩增出完整条带，并且条带亮度与对照组条带亮度一致，则说明处理组中的适配体没有发生降解。任何条件下的长期放置，适配体最终肯定会逐步降解，这需要通过实验来确定不同放置条件下开始降解的时间。
实施例13
此检测需要给完整的试验步骤
用EB病毒感染敏感宿主细胞，感染36h后用胰酶消化细胞，离心得到细胞沉淀并去除上清液，再用PBS重悬。同时设置没有感染的阴性对照组。对细胞进行固定与透化处理，再将对应EB病毒的带有荧光基团标记的核酸适配体分别与感染病毒的细胞悬液以及未感染对照组细胞悬液混合处理1h，通过流式细胞仪分析计算。结果显示感染了EB病毒的细胞样品所对应的核酸适配体标记荧光数值显著升高，说明筛选得到的适配体可用作病毒感染的检测。
固定与透化处理可参考此网页介绍：https://www.novopro.cn/articles/ 201606271111.html#/
这里单独指的是带荧光基团的适配体，分别与后面的病毒感染细胞悬液、未感染细胞悬液进行混合处理
| 检测对象 | 荧光强度倍数 |
| 未感染对照组 | 1 |
| 感染组 | 5.35 |
实施例14
用于检测EB病毒的试剂盒的制备
检测EB病毒的试剂盒的制备：
（A）用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板：使用具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板；
（B）蛋白包被液：配方为35mM NaHCO3，15mM Na2CO3, pH 9.3-pH 9.9，使用双蒸水配置。
（C）封闭液：配方为136mM NaCl, 2.6mM KCl, 2mM KH2PO4, 8mM Na2HPO4, 0.05%Tween-20, 1% BSA, pH 7.1-pH 7.7，使用双蒸水配置。
（D）漂洗液：配方为136mM NaCl, 2.6mM KCl, 2mM KH2PO4, 8mM Na2HPO4, 0.05%Tween-20, pH 7.1-pH 7.7，使用双蒸水配置。
（E）带有荧光基团标记的核酸适配体：带有荧光基团标记的核酸适配体（SEQ IDNO.5）用TE缓冲液溶解并配置到工作浓度（200nM）。
（F）样本前处理液：配方为150mM NaCl, 1% Triton X-100, 50mM Tris, pH7.8-pH8.2。
将上述A、B、C、D、E、F混合即可制备得到检测EB病毒的试剂盒。
实施例15试剂盒的应用
取50份已确认EB病毒阳性的样本与50份已确认无EB病毒的对照样本。取市售某品牌EB病毒抗原检测试剂盒与我们的核酸适配体检测试剂盒同时做平行实验。实验结果如下：
Claims (10)
1.一种检测EB病毒的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述用于检测EB病毒的核酸适配体还包括：在所述核酸适配体的核苷酸序列上结合有荧光物质、纳米发光材料、生物素、地高辛或酶标记中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的核酸适配体，其特征在于，所述荧光物质为FAM荧光基团或Cy5荧光基团；所述纳米发光材料为量子点或上转换纳米颗粒；所述酶标记为辣根过氧化物酶或蔗糖酶。
4.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述用于检测EB病毒的核酸适配体还包括：在所述核酸适配体的核苷酸序列上的任意位置磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化的核酸适配体。
5.一种用于检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的核酸适配体。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，所述用于检测EB病毒的试剂盒还包括：
（A）固定样本溶液的蛋白包被板；
（B）蛋白包被液；
（C）封闭液；
（D）漂洗液；
（E）样本前处理液。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，所述蛋白包被液的配方为：35mM NaHCO3，15mM Na2CO3，pH 9.3-pH 9.9。
8.根据权利要求6所述的一种用于检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，所述封闭液的配方为136mM NaCl，2.6mM KCl，2mM KH2PO4，8mM Na2HPO4，0.05% Tween-20，1% BSA，pH 7.1-pH 7.7；所述漂洗液的配方为136mM NaCl，2.6mM KCl，2mM KH2PO4, 8mM Na2HPO4，0.05%Tween-20，pH 7.1-pH 7.7。
9.根据权利要求6所述的一种用于检测EB病毒的试剂盒，其特征在于，所述样本前处理液的配方为：150mM NaCl, 1% Triton X-100, 50mM Tris, pH7.8-pH8.2。
10.权利要求1-4任一项所述的核酸适配体和/或权利要求5-9任一所述的检测试剂盒在检测感染样本中EB病毒含量中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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