WO2009147864A1 - １細胞レベルでの抗体遺伝子の解析・同定方法 - Google Patents

１細胞レベルでの抗体遺伝子の解析・同定方法 Download PDF

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秋山靖人
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静岡県
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing and identifying antibody genes at the level of one human B cell, a method for producing an antibody derived from one B cell, a method for preparing an antibody gene derived from one B cell, etc. About.
  • An antibody is a protein called immunoglobulin capable of specifically identifying similar substances such as proteins, and is involved in antigen-specific humoral immunity in vivo.
  • the antibody encodes a part of the antibody (variable region), and rearrangement occurs at the DNA level, resulting in a group of B lymphocytes having various antibody gene sequences. Yes. This mechanism of gene diversification through DNA rearrangement can also be seen in the sexual process where organisms try to survive adapting to environmental changes while diversifying their offspring genes. Further, it is known that one type of immunoglobulin encoded by one type of antibody gene is always produced from each B lymphocyte cell.
  • an antibody gene and the like human peripheral blood lymphocytes are isolated, CD11c-specific antibodies and magnetic beads are used to remove CD11c-positive cells, in vitro immunization, and antigen-specific human antibody production response
  • the peripheral blood lymphocyte cells in which the antigen-specific antibody production response was induced were immortalized with Epstein-Barr virus, antigen-specific B cells were isolated, and RNA was extracted from these antigen-specific antibody-producing B cells
  • a method for obtaining an antigen-specific antibody gene wherein cDNA is synthesized from the extracted RNA, and the antibody variable region gene is amplified by PCR using the synthesized cDNA as a template and primers specific to each of VH and VL (For example, refer to Patent Document 1) and a labeled antigen formed by labeling an antigen recognized by a target antibody is used as a tag for producing the antibody.
  • the present inventors conducted a clinical trial of a dendritic cell vaccine treated with an HLA-A2 or A24 peptide cocktail in a case of metastatic melanoma, and an immune response against the cancer-specific antigen peptide was confirmed.
  • An analysis / identification of a melanoma peptide-specific antibody gene at a single cell level using B cells derived from a cancer patient has already been proposed (Japanese Patent Application No. 2007-147525).
  • Japanese Patent Application No. 2007-147525 Japanese Patent Application No. 2007-147525
  • it is essential to increase antibody-producing B cells against a specific antigen such as a cancer-specific peptide to a certain ratio or more by vaccine administration, and a specific cancer patient for whom vaccine therapy is established.
  • a specific antigen such as a cancer-specific peptide
  • An object of the present invention is to provide a technique for comprehensive analysis of antibody genes not only for specimens after vaccine administration but also for B cells derived from all cancer-bearing patients.
  • the object of the present invention is to provide a method for identifying and analyzing an antibody gene in one human B cell, a technique for producing an antibody derived from one identified B cell, and the like.
  • the present inventors analyzed and identified a melanoma peptide-specific antibody gene at the 1-cell level using immortalized B cells prepared from peripheral blood monocytes derived from melanoma patients before vaccine administration. That is, immortalized B cells are stained with GST-labeled melanoma-specific cancer antigen MAGE1, Alexa-labeled anti-GST antibody, and PE-labeled anti-human IgG antibody, and B cells that produce a specific antibody by performing single cell sorting was found to be able to be sorted one cell at a time, and after the extraction of total RNA from one sorted B cell, a practical technique for efficiently cloning a specific antibody gene was established.
  • the inventors consider that it is important to be able to amplify antibody genes even in normal B cells in view of the diversity of antibody induction, and by improving the RT-PCR technique, a more sensitive technique can be achieved.
  • the present invention provides [1] (A) a step of collecting peripheral blood mononuclear cells from peripheral blood obtained from a human; (B) Epstein-Barr virus (EBV) from the obtained peripheral blood mononuclear cells, Producing an immortalized B cell (EBV-B cell) line; (C) a step of labeling EBV-B cells with an antigen labeled with a labeling substance and an antibody capable of recognizing a human antibody labeled with a labeling substance different from the labeling substance; (D) the antigen EBV-B cells that express an antibody recognizing erythrocyte on the cell membrane one step at a time; (E) a step of extracting total RNA from one cell and synthesizing cDNA by a reverse transcription reaction; (F) synthesis PCR reaction using a primer pair specific to human antibody heavy chain region gene, PCR reaction using primer pair specific to human antibody light chain ⁇ region gene, or human antibody light chain ⁇ region (A) a step of amplifying each region gene fragment by
  • the present invention also provides [6] (A) a step of collecting peripheral blood mononuclear cells from peripheral blood obtained from a human; (B) Epstein-Barr virus (EBV) from the obtained peripheral blood mononuclear cells, A step of preparing an immortalized B cell (EBV-B cell) strain; (C) an antigen labeled with a labeling substance and an antibody that is labeled with a labeling substance different from the labeling substance and can recognize a human antibody A step of labeling EBV-B cells; (D) a step of sorting EBV-B cells expressing an antibody recognizing the antigen on a cell membrane one by one; (E) extracting total RNA from one cell A step of synthesizing cDNA by reverse transcription reaction; (F) PCR reaction using the synthesized cDNA as a template and a primer pair specific to human antibody heavy chain region gene, specific to human antibody light chain ⁇ region gene Primer A step of amplifying each region gene fragment by PCR reaction using a PCR reaction or
  • the present invention provides [11] (A) a step of collecting peripheral blood mononuclear cells from peripheral blood obtained from a human; (B) Epstein-Barr virus (EBV) from the obtained peripheral blood mononuclear cells, A step of preparing an immortalized B cell (EBV-B cell) strain; (C) an antigen labeled with a labeling substance and an antibody that is labeled with a labeling substance different from the labeling substance and can recognize a human antibody A step of labeling EBV-B cells; (D) a step of sorting EBV-B cells expressing an antibody recognizing the antigen on a cell membrane one by one; (E) extracting total RNA from one cell A step of synthesizing cDNA by reverse transcription reaction; (F) PCR reaction using the synthesized cDNA as a template and a primer pair specific to human antibody heavy chain region gene, specific to human antibody light chain ⁇ region gene Primer (A), (B), (C) amplifying each region gene fragment by PCR reaction using PCR
  • the antibody gene according to any one of [15] The antibody gene according to [14] above, wherein the [15] cancer-specific antigen peptide or cancer-specific antigen protein is MAGE1, MAGE2, MAGE3, MART1, tyrosinase, or gp100. Relates to a method of preparing the [15] cancer-specific antigen peptide or cancer-specific antigen protein.
  • functional antibody genes at the level of one B cell can be analyzed and identified for human B cells, and antibody genes against specific immune epitopes and tumor antigens can be comprehensively analyzed. Since it can be analyzed and identified, it is very effective for screening of new cancer treatment targets, development of cancer treatment drugs, and tailor-made medical treatment and diagnosis of cancer in the future.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of a method for detecting EBV-B cells expressing an IgG antibody specific for a GST-labeled antigen of the present invention. It is a figure which shows the integration to the donor plasmid for baculovirus preparation containing the GFP-MAGE1 gene sequence used for this invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of single-cell RT-PCR cloning of the present invention. It is a figure which shows the preparation method of the recombinant antibody of this invention. It is a figure which shows the design of the control RNA template for real-time PCR analysis used for this invention. It is a figure which shows the preparation method of the control RNA template for real-time PCR analysis used for this invention.
  • EBV-B cells derived from MEL-022, MEL-023, MEL-SCC004, and MEL-SCC005 cases are shown. It is a figure which shows the result of the flow cytometry analysis of this invention.
  • the analysis results of EBV-B cells derived from MEL-001post, MEL-006post, MEL-018post, and MEL-014 * cases are shown.
  • FIG. 3 shows the results of examining the expression of anti-MAGE-1 antibody in EBV-B cells of the present invention by immunohistological staining. It is a figure which shows the result of the refinement
  • FIG. 3 shows the results of examining the expression level (copy number) of ⁇ -actin gene in EBV-B cells of the present invention by real-time PCR. It is a figure which shows the result of having examined the expression level (copy number) of IgG gene in the EBV-B cell of this invention by real-time PCR.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 71) of an antibody heavy chain gene (# 081215-1) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing the base sequence (SEQ ID NO: 72) of the antibody light chain ⁇ gene (# 081215-1) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 73) of an antibody heavy chain gene (# 081215-5) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 5 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 74) of an antibody light chain ⁇ gene (# 081215-5) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 75) of an antibody heavy chain gene (# 081215-19) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 76) of an antibody light chain ⁇ gene (# 081215-19) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 77) of an antibody heavy chain gene (# 081215-23) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing the base sequence (SEQ ID NO: 78) of the antibody light chain ⁇ gene (# 081215-23) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 7 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 79) of an antibody heavy chain gene (# 090204-15) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 5 is a view showing the base sequence (SEQ ID NO: 80) of the antibody light chain ⁇ gene (# 090204-15) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 81) of an antibody heavy chain gene (# 090219-11) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 82) of an antibody light chain ⁇ gene (# 090219-11) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 83) of an antibody heavy chain gene (# 090225-100) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 84) of an antibody light chain ⁇ gene (# 090225-100) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 85) of an antibody heavy chain gene (# 090225-104) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing a base sequence (SEQ ID NO: 86) of an antibody light chain ⁇ gene (# 090225-104) obtained by the method of the present invention.
  • the following steps (A), (B), (C), (D), (E), (F) and (G) are not particularly limited as long as they are sequentially provided, and the method for producing one B cell antibody of the present invention includes the following steps (A), (B), (C), ( D), (E), (F) and (H) are not particularly limited as long as they are sequentially provided.
  • Methods for preparing one B cell antibody gene of the present invention include the following: The method is not particularly limited as long as it includes the steps (A), (B), (C), (D), (E), and (F) shown in this order.
  • A collecting peripheral blood mononuclear cells from peripheral blood obtained from a human;
  • C a step of labeling B cells with an antigen labeled with a labeling substance and an antibody capable of recognizing a human antibody labeled with a labeling substance different from the labeling substance;
  • D A step of sorting B cells expressing an antibody recognizing the antigen on a cell membrane one by one;
  • E extracting total RNA from one cell and synthesizing cDNA by reverse transcription reaction;
  • F PCR reaction using a synthesized cDNA as a template and a primer reaction specific to a human antibody heavy chain region gene, a PCR reaction using a primer pair specific to a human antibody light chain ⁇ region gene, or a human antibody Amplifying each region gene fragment by a PCR reaction using a primer pair specific to the light chain ⁇ region gene;
  • G analyzing and determining the base sequence of the amplified gene fragment;
  • the method of the present invention may not include the step of producing the immortalized B cell in the above step (B), and in that case, the analysis of the antibody gene of one B cell of the present invention is performed.
  • the identification method is not particularly limited as long as the method includes the following steps (a), (c), (d), (e), (f), and (g).
  • the method for producing an antibody of one B cell of the invention is a method comprising the following steps (a), (c), (d), (e), (f) and (h) in sequence.
  • the method for preparing one B cell antibody gene of the present invention is not particularly limited, and the following steps (a), (c), (d), (e), and (f) ) Are not particularly limited as long as they are sequentially provided.
  • A collecting peripheral blood mononuclear cells from peripheral blood obtained from a human;
  • C Labeling B cells contained in the obtained peripheral blood mononuclear cells with an antigen labeled with a labeling substance and an antibody capable of recognizing a human antibody labeled with a labeling substance different from the labeling substance The step of converting;
  • D a step of sorting B cells expressing an antibody recognizing the antigen on a cell membrane one by one;
  • E extracting total RNA from one cell and synthesizing cDNA by reverse transcription reaction;
  • F PCR reaction using a synthesized cDNA as a template, a PCR reaction using a primer pair specific to the human antibody heavy chain region gene, a PCR reaction using a primer pair specific to the human antibody light chain ⁇ region gene, or a human antibody Amplifying each region gene fragment by a PCR reaction using a primer pair specific to the light chain ⁇ region gene;
  • G a step of analyzing and determining the base sequence of the amplified gene
  • the human to be a peripheral blood collection source is not particularly limited, but cancer patients in a cancer-bearing state can be preferably mentioned.
  • the above cancer cancer patients are not particularly limited as long as they are in a cancer-bearing state, and even if a cancer patient has not been administered a vaccine, an immune response to a specific antigen can be obtained by administering the vaccine. It may be a confirmed cancer patient, and the cancer may be a solid cancer or a blood cancer.
  • solid cancer includes sarcomas and carcinomas, and specifically includes melanoma, fibrosarcoma, mucosal sarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic sarcoma, chordoma, angiosarcoma.
  • Lymphangiosarcoma lymphatic endothelial sarcoma, synovial tumor, mesothelioma, Ewing tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreas Cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell cancer, basal cell cancer, adenocarcinoma, sweat gland cancer, sebaceous gland cancer, papillary cancer, papillary adenocarcinoma, sac adenocarcinoma, bone marrow Cancer, bronchogenic cancer, renal cell cancer, ureteral cancer, liver cancer, bile duct cancer, choriocarcinoma, seminoma, embryonic cancer, Wilms tumor, cervical cancer, intrauterine Membrane cancer, testicular cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, bladder cancer, epithelial cancer, glioma,
  • EBV-B cell Epstein-Barr virus
  • peripheral blood mononuclear cells and EBV are mixed with feeder cells. It is only necessary to culture in the coexistence and immortalize peripheral blood mononuclear cells.
  • anti-CD19 antibody and anti-human IgG antibody which are B lymphocyte markers, a labeled antigen peptide is used to target the specific antigen The presence of the antibody producing EBV-B cell line can also be confirmed.
  • the antigen in the steps (C) and (c) is not particularly limited as long as it is a molecule specifically recognized by an antibody, and examples thereof include peptides or proteins, nucleic acids such as DNA and RNA, and the like. Among them, peptides (cancer-specific peptides) and proteins (cancer-specific proteins) that are specifically highly expressed in cancer cells can be mentioned as good examples. More specifically, MAGE1, Preferred examples include cancer-specific peptides and cancer-specific proteins such as MAGE2, MAGE3, MART1, tyrosinase, and gp100.
  • the antigen may be variously modified as long as it has a function as an antigen.
  • the antigen is a so-called fusion protein in which another peptide or protein part is added in addition to a functional part (epitope) as an antigen.
  • a sugar chain or a fatty chain may be added.
  • Alexa Fluorescent substances such as Fluor 488, green fluorescent protein (GFP), fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), chemiluminescence of luminol, isoluminol, acridinium derivatives, etc. Mention may be made of substances, biotin and magnetic beads.
  • an antigen labeled with a labeling substance, an antibody against the labeling substance, and an antibody labeled with a labeling substance different from the labeling substance and capable of recognizing a human antibody are used.
  • the labeling substance include epitope tags such as glutathione S-transferase (GST), c-Myc, HA, and FLAG.
  • GST glutathione S-transferase
  • c-Myc c-Myc
  • HA hexase
  • FLAG an antibody that specifically recognizes the tag
  • an antibody that specifically recognizes the tag can be used as an antibody against the labeling substance.
  • an antibody labeled with a labeling substance such as the above-described fluorescent substance or chemiluminescent substance can be used.
  • Labeling with these labeling substances can be performed by a conventional method, for example, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, You can refer to New York.
  • an anti-human anti-human IgG antibody can be illustrated suitably.
  • a GST-labeled cancer-specific antigen protein is used as a cancer-specific antigen protein labeled with a labeling substance
  • an Alexa-labeled anti-GST antibody and a human antibody labeled with a different labeling substance are used.
  • labeling is preferably performed under conditions that do not cause the cell membrane-bound antibody of cancer antigen-specific antibody-producing B cells to fall off.
  • an EBV-B cell expressing an antibody recognizing an antigen such as a cancer-specific antigen peptide or a cancer-specific protein on the cell membrane or a non-immortalized primary B cell Sort one cell at a time.
  • an appropriate technique is used according to the type of labeling substance used. For example, when a fluorescent substance is used as the labeling substance, it is preferable to sort cells one by one by flow cytometry (single cell sorter) using fluorescence as an index. Flow cytometry enables efficient and highly accurate cell separation.
  • biotin is employed as the labeling substance, cells can be sorted one by one using a binding reaction with avidin.
  • magnet beads are employed, good separation using magnets is possible.
  • the cells can be sorted one by one using a cell microarray, a micromanipulator, a micromesh filter, or the like.
  • RNA is extracted from one antibody-producing B cell that has been collected one by one, and cDNA is synthesized by a reverse transcription reaction. Isolation of total RNA, isolation and purification of mRNA, and acquisition and cloning of cDNA are all conventional methods (for example, Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor). Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989.).
  • a PCR reaction using a synthesized cDNA as a template and a primer pair specific to the human antibody heavy chain region gene, a primer pair specific to the human antibody light chain ⁇ region gene Each region gene fragment is amplified by a PCR reaction using a PCR reaction or a PCR reaction using a primer pair specific to the human antibody light chain ⁇ region gene.
  • the primer pair specific to human antibody heavy chain region gene, human antibody light chain ⁇ region gene, or human antibody light chain ⁇ region gene is not particularly limited as long as it is a primer pair specific to each region gene sequence.
  • the primer pair specific to the human antibody heavy chain region gene includes one or more of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 27 to 37, and SEQ ID NO: 38.
  • a primer pair specific to the human antibody light chain ⁇ region gene is a base pair represented by SEQ ID NOs: 39 to 61. Mention may be made of the one or more sequences of columns, a primer pair consisting of one or two sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 62 and 63.
  • the base sequence of the amplified gene fragment is analyzed and determined by a conventional method in the above step (G). Examples of the antibody type include IgG, IgA, IgD, IgE, and IgM.
  • An antibody gene derived from one B cell can be prepared by using the gene fragment amplified in the above steps (F) and (f). That is, a human antibody heavy chain gene can be prepared by a PCR reaction using a primer pair specific to the human antibody heavy chain region gene.
  • a human antibody light chain gene is prepared by a PCR reaction using a primer pair specific to the human antibody light chain ⁇ region gene or a PCR reaction using a primer pair specific to the human IgG light chain ⁇ region gene. be able to.
  • the human antibody heavy chain variable region gene fragment can be prepared by PCR reaction using a primer pair specific to the human antibody heavy chain variable region gene fragment.
  • a human light chain can be obtained by PCR reaction using a primer pair specific to the human antibody light chain ⁇ variable region gene fragment or PCR reaction using a primer pair specific to the human IgG light chain ⁇ variable region gene fragment.
  • a chain variable region gene fragment can be prepared. These prepared human antibody genes can be subcloned and amplified. When genomic DNA is used as a template, effective amplification cannot be expected because exons are separated.
  • human antibody heavy chain variable region gene fragment (heavy chain fragment) and human light chain variable region gene fragment (light chain fragment) were amplified by PCR method, and these heavy chain fragment and light chain fragment were respectively obtained by PCR method.
  • ScFv human single chain antibody gene
  • the human antibody heavy chain gene and the human antibody light chain gene which are gene fragments amplified in the step (F) or (f), are expressed using an expression vector
  • Individual B cell-derived antibodies can be produced.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is suitable for the expression of an antibody gene.
  • an adenoviral vector used for transient expression in all cells (other than blood cells) including non-sorted cells ( Science, 252, 431-434, 1991), retroviral vectors used for long-term expression in dividing cells (Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992) and non-pathogenic, non-dividing cells
  • adeno-associated virus vectors (Curr. Top. Microbiol.
  • SV40 virus vectors SV40 virus vectors
  • EB virus vectors SV40 virus vectors
  • papilloma virus vectors can be exemplified.
  • a selection marker gene can be introduced into these viral vectors in order to increase expression efficiency.
  • An antibody gene is introduced into an expression vector by a known method using restriction enzymes and DNA ligase (for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, See Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
  • the above human antibody heavy chain gene and human antibody light chain gene are usually inserted into separate expression vectors, and the host is cotransformed with these two recombinant vectors to express the heavy and light chains in the same cell. It is preferable to make it.
  • the host is not particularly limited as long as it can retain the introduced antibody gene in an expressible state by being transformed with a recombinant vector.
  • Vero cells Hela cells, CHO cells, WI38 Cell, BHK cell, COS-7 cell, MDCK cell and the like.
  • methods for transforming a host with a recombinant vector include the lipofectin method, electroporation method, calcium phosphate method and the like.
  • a monoclonal antibody can be produced from one B cell without using a hybridoma.
  • E. coli can be transformed with a phagemid vector or a phage vector into which the human ScFv fragment is incorporated, and a phage display human single chain antibody can be produced using this transformed E. coli.
  • the method for producing an antibody derived from one B cell of the present invention makes it possible to obtain a large amount of a cancer antigen-specific antibody, which enables tailor-made diagnosis and treatment of individual patients.
  • the antibody gene obtained by the method for preparing an antibody gene derived from one B cell of the present invention can be used advantageously in the case of producing a large amount of cancer antigen-specific antibodies. It can also be used for diagnosis.
  • a partial human antibody obtained by immunizing with a mouse and producing a hybridoma can be obtained as a 100% human antibody in a form actually amplified in the human body. is there.
  • peripheral blood mononuclear cells Twelve peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were collected from peripheral blood from melanoma patients (including the same patient before and after vaccine administration) before and / or after dendritic cell vaccine administration. .
  • the dendritic cell vaccine used for the treatment is HLA-A24-restricted MAGE1 135-143 (the amino acid sequence of MAGE1 135-143 is shown in SEQ ID NO: 64), MAGE2, MAGE3, gp100, and Tyrosinase.
  • Peptides or HLA-A2-restricted MAGE2, MAGE3, gp100, MART1 and Tyrosinase were treated with five types of peptides.
  • EBV-B cell line immortalized B cell line (EBV-transformed) B cell line (hereinafter referred to as EBV-B cell line) was prepared. Specifically, a human fibroblast cell line (MRC-5; ATCC cat. CCL-171) as a feeder was grown to 90% confluency in a 25 cm 2 flask (medium: MEM + 10% FBS), and 30-40 Gy irradiation was carried out. After 24 hours, the PBMC collected in Example 1 was suspended in a medium (IMDM + 20% FBS) so as to be 1 to 2 ⁇ 10 7 cells / 4 ml, and added to the culture MRC-5.
  • MRC-5 human fibroblast cell line
  • IMDM + 20% FBS medium
  • EBV solution EBV strain B95-8, ATCC cat. VR-1492
  • gas phase conditions 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the culture medium 48 hours after the start of the culture, the culture medium was changed every 4 days.
  • EBV-B cells B cells immortalized by EBV (EBV-B cells) were collected, and a total of 12 cases of EBV-B cells (MEL-001post, MEL-006post, MEL-014, MEL-016, MEL-017, MEL-018, MEL-018post, MEL-021, MEL-022, MEL-023, MEL-SCC004, MEL-SCC005) were prepared.
  • MEL-014, MEL-016, MEL-017, MEL-018, MEL-021, MEL-022, MEL-023, MEL-SCC004 and MEL-SCC005 are derived from patients before vaccine administration.
  • MEL-001post, MEL-006post and MEL-018post are derived from patients after vaccine administration.
  • MEL-018 and MEL-018post are EBV-B cells prepared from PBMC before and after vaccine administration (MEL-018post) of the same patient.
  • Alexa Fluor 488-labeled anti-GST polyclonal antibody (hereinafter referred to as Alexa-anti-GST antibody) was obtained from Invitrogen, and PE-labeled anti-human IgG antibody (hereinafter referred to as PE-anti-hIgG) was defined as BD. Purchased from Phaimingen.
  • EBV-B cells were washed with sorter buffer (PBS + 2% FBS + 0.1% NaN3) and then adjusted to 20 ⁇ l / tube.
  • GST or each GST-labeled protein adjusted to 100 ng / 20 ⁇ l with PBS (0.2% BSA) was added to the EBV-B cells, and reacted at 4 ° C. for 30 minutes.
  • 20 ⁇ l (10 ⁇ g / ml) of Alexa-anti-GST antibody was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes, and then 20 ⁇ l of PE-hIgG antibody was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes.
  • the stained EBV-B cells were analyzed with a flow cytometer FAC (FACS-CANTO, BD). In addition, PI staining was performed immediately before measurement for confirmation of living cells.
  • FIG. 8 shows data for MAGE1 before administration (MEL-018Pre) and after 6 administrations of dendritic cell vaccine (MEL-018Post) in MEL-018 cases.
  • MEL-018Pre dendritic cell vaccine
  • FIG. 8A the IgG and IgM fractions of the EBV-B cell line clearly have an increased ratio of IgG antibody positive after the vaccine.
  • FIG. 8B in the staining with GST-MAGE1, the cell population of IgG + / MAGE1 + was increased to 0.14% (0.02% in the case of only the negative control GST). An increase in B cells with an IgG antibody against MAGE1 was detected.
  • 9A to 9C show analysis data for other cancer-specific antigen proteins.
  • GFP-MAGE1 Green fluorescence protein labeled MAGE-1 protein
  • FIG. 2 the gene sequence encoding GFP-MAGE1 was incorporated into a donor plasmid (pFastBac) and prepared as Bacmid DNA in E. coli. This Bacmid DNA was transfected into insect-derived cells Sf9, and the baculovirus produced in the culture supernatant was recovered.
  • High-Five cells were infected with a high-titer baculovirus containing the GFP-MAGE1 gene sequence, and cultured with shaking (72 rpm) at 27 ° C. for 50 to 64 hours.
  • the cultured cells were collected, solubilized by freezing and thawing, and then centrifuged to collect the supernatant.
  • GFP-MAGE1 was purified with a metal chelate affinity gel using His-tag, desalted with a PD-10 column, and then concentrated with an ultrafiltration column.
  • GFP-MAGE1 was stored at 4 ° C. until use.
  • GFP-MAGE1 + / PE-anti-hIgG + EBV-B cells were subjected to single cell sorting for the purpose of sorting one cell at a time.
  • a BD FACSAria TM cell sorter manufactured by BD Science
  • a module for single cell sorting was used.
  • a 100- ⁇ m nozzle was used on a 96-well plate (MicroAmp® Optical 96-well Reaction Plate; Applied Biosystem) under the conditions of sort setup: low, flow rate 5000 events / sec, and Drop delay 25.73.
  • One cell was sorted.
  • Primer base sequence specific to human IgG heavy chain gene is SEQ ID NO: 1-26 (SEQ ID NO: 1-24 is forward primer, SEQ ID NO: 25 and 26 is reverse primer), primer specific to human IgG light chain ⁇ gene
  • the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 27-38 (SEQ ID NO: 27-37 is a forward primer, SEQ ID NO: 38 is a reverse primer), and the primer nucleotide sequence specific for the human IgG light chain ⁇ gene is SEQ ID NO: 39-63 (SEQ ID NO: 39).
  • SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 39
  • To 61 are forward primers, and SEQ ID NOs: 62 and 63 are reverse primers).
  • the size of the gene fragment amplified by each primer mix is about 1400 bp for the human IgG heavy chain gene, about 700 bp for the human IgG light chain ⁇ gene, and about 700 bp for the human IgG light chain ⁇ gene.
  • SuperScript TM III for synthesis CellsDirect cDNA Synthesis System (cat. 18080-300, manufactured by Invitrogen) was used.
  • 10 ⁇ l ResuspensionBuffer 1 ⁇ l of Lysis Enhancer solution was added and treated with a thermal cycler at 75 ° C. for 10 minutes.
  • 5 ⁇ l of DNase I (1 U / ⁇ l) and 1.6 ⁇ l of 10 ⁇ DNase IBuffer were added, mixed by pipetting, and incubated at room temperature for 5 minutes.
  • the plate was lightly centrifuged, 1.2 ⁇ l of 25 mM EDTA was added and incubated at 70 ° C.
  • PCR of cDNA prepared from one cell was performed using cloning primers.
  • 1 ⁇ l of cDNA was dispensed into 4 PCR 0.2 ml tubes (# 1 to # 4) per sample, and 1 ⁇ l of 10 ⁇ PCR bufferII (Mg + ), 1 ⁇ l of 2.5 mM dNTP Mix, 5.9 ⁇ l dH 2 O, 0.1 ⁇ l LA-Taq polymerase (TaKaRa LA-Taq® Hot Start version; manufactured by Takara Bio Inc.), 0.5 ⁇ l forward primer (10 ⁇ M), and 0.5 ⁇ l reverse primer (10 ⁇ M) were added, and a thermal cycler (GeneAmp R PCR) PCR reaction was performed using System9700 (Applied Biosystems).
  • Tube # 1 is the internal standard ⁇ -actin gene
  • tube # 2 is the human IgG heavy chain region gene
  • tube # 3 is the human IgG light chain ⁇ region gene
  • tube # 4 is the human IgG light chain ⁇ region gene PCR reaction Used for. The PCR reaction conditions for each tube are shown below.
  • Tube # 1 94 ° C for 5 minutes, (94 ° C for 15 seconds, 68 ° C for 2 minutes) x 55 cycles, 72 ° C for 5 minutes
  • Tube # 2 and # 3 94 ° C for 5 minutes, (94 ° C for 15 seconds , 68 ° C ⁇ 1 minute) x 55 cycles, 72 ° C ⁇ 5 minutes
  • Tube # 4 94 ° C ⁇ 5 minutes, (94 ° C ⁇ 15 seconds, 60 ° C ⁇ 30 seconds) ⁇ 40 cycles, 72 ° C ⁇ 5 minutes
  • the obtained reaction solution was electrophoresed using a 1.5% agarose gel, and the band was confirmed by ethidium bromide staining.
  • the size of the band of the PCR product amplified by the human IgG region gene region amplification primer set was confirmed, and two samples of each primer set were extracted and purified from the gel.
  • the mixture was placed on a heat block set at 50 ° C. in advance and subjected to Vortex every 2 minutes for a total of 10 minutes. Subsequently, centrifugation was performed at room temperature and 10,000 ⁇ g for 1 minute, and the supernatant was removed. Again, 500 ⁇ l of BufferQX1 was added to the precipitate, mixed with vortex, and centrifuged at room temperature and 10,000 ⁇ g for 1 minute. The supernatant was removed, 500 ⁇ l of BufferPE to which ethanol had been added in advance was added to the precipitate, mixed with vortex, centrifuged at room temperature and 10,000 ⁇ g for 1 minute, and the supernatant was removed.
  • Plasmid DNA was prepared by inserting the PCR fragment into the pCR4-TOPO-TA Plasmid vector. 1 ⁇ l of DNA fragment Salt Solution (TOPO TA Cloning R Kit for Sequencing; Invitrogen Corporation) and 1 ⁇ l of TOPO (R) Vector (TOPO TA Cloning R Kitfor Sequencin (manufactured by Invitrogen) was mixed on ice. After reacting at room temperature for 5 minutes, it was put back on ice and used for transformation. Plasmid DNA was introduced into a DH5 ⁇ competent cell (Competent high DH5 ⁇ ; manufactured by TOYOBO).
  • PCR products (tube # 2: 1.6 Kbp, tube # 3: 0.9 Kbp, tube # 4: 0.9 Kbp) of each PCR reaction solution were confirmed by electrophoresis using a 1.5% agarose gel.
  • a colony in which insertion of a PCR-amplified fragment into the vector was confirmed was selected, and shaking culture was performed overnight at 37 ° C. in 2 ⁇ YT liquid medium containing 3.5 ml of 50 ⁇ g / ml kanamycin.
  • the cultured sample (1.8 ml) was placed in a 2 ml sample tube and centrifuged at 1000 ⁇ g for 10 minutes. Discard the supernatant and 250 ⁇ l of Buffer for the precipitate A1 (NucleoSpin (R) Multi- 8 Plasmid; MACHEREY-NAGEL Inc.) were mixed by vortex added.
  • Buffer A2 250 ⁇ l was added and mixed by inversion, and then placed at room temperature for 5 minutes to lyse the cells.
  • 350 ⁇ l of Buffer A3 was added and mixed by inversion, followed by centrifugation at 4 ° C. and 14000 ⁇ g for 10 minutes.
  • the sequence of the obtained clone was determined by Cycle Sequencing method. In a 96-well plate placed on ice, add the DNA dilution prepared in Example 11 to 3 wells (# 2-1, # 2-2, # 2-3) for tube # 2, and to tubes # 3 and # 4. 6 ⁇ l each was added to 2 wells (# 3-1, # 3-2 and # 4-1, # 4-2).
  • Primers used for each sample were sample # 2-1: M13 reverse primer, sample # 2-2: M13 forward primer, sample # 2-3: HuIGCH-seq001, sample # 3-1: M13 Reverse primer, sample # 3-2: M13 forward primer, sample # 4-1: M13 reverse primer, sample # 4-2: M13 forward primer.
  • MultiScreen TM HV-plate Sephadex G-50 in (MultiScreen R HV-plate MILLIPORE Corp.) wells (Sephadex TM G-50 Superfine; GE Healthcare) and 300 ⁇ l of sterilized water were added and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After sufficient hydration, centrifugation was performed at room temperature and 1100 ⁇ g for 5 minutes, and the effluent was discarded. Multiscreen TM A new 96-well plate (ASSAY PLATE 96 well round bottom; manufactured by IWAKI) was replaced with the HV-plate, the whole reaction solution was applied to each well, and the sample was collected by centrifugation at 1100 ⁇ g for 5 minutes at room temperature.
  • ASSAY PLATE 96 well round bottom manufactured by IWAKI
  • 96-well plate (MicroAmp R Optical) 96-well Reaction Plate (manufactured by Applied Biosystem), and further, 17.2 ⁇ l of sterilized water was added to the original well, and the entire amount was added to the same sample while washing the well.
  • x3130 / Genetic Using Analyzer (manufactured by Applied Biosystem), 6 to 8 clones were read for each sample, and multiple alignment analysis of the obtained sequences was performed. Regarding the bases that differed between the clones, the sequence with the larger number of clones having the base was regarded as the correct sequence, and the base sequence of each sample was determined.
  • EBV-B cell line (1 cell level) derived from melanoma patients of 5 cases (MEL-008, MEL-014, MEL-016, MEL-018Pre, MEL-018Post) ) Succeeded in isolating 12 clones of IgG antibody gene. Of these, 5 clones have been confirmed to express single-chain recombinant antibodies and are currently in the purification stage. *
  • the cultured bacteria were centrifuged (4 ° C., 8000 rpm, 10 minutes), collected, and then disrupted (BugBuster protein extraction reagent 10 ml, Benzonasenuclease 1 ⁇ l; treated at Novagen at 25 ° C. for 30 minutes), and the insoluble fraction was removed by centrifugation ( 4 ° C., 15000 rpm, 30 minutes), and the supernatant (E. coli soluble fraction) was collected.
  • MEL-018 scFv antibody Metal chelate affinity purification using a Ni Sepharose column was performed using the His tag as a label. Next, two-stage purification was performed by anion exchange chromatography (HiTrap QFF column). Furthermore, for the purpose of evaluating the specificity of the finally purified MEL-018 scFv antibody, Western blotting was performed using GST-labeled recombinant MAGE1 protein (543aa, 59.74 kDa) as an antigen. The purified primary antibody (MEL-018 scFv) is diluted 1000 times, reacted for 2 hours, and then secondary antibody (anti-FLAG M2 monoclonal antibody) was diluted 2000 times and reacted for 2 hours. A mouse anti-human MAGE1 monoclonal antibody (Abnova) was used as a control control antibody. A signal was detected by reacting with ECLplus reagent (manufactured by GE Healthcare) for 10 minutes.
  • ECLplus reagent manufactured by GE Healthcare
  • FIG. 12 The result of the above experiment is shown in FIG.
  • FIG. 12 as a result of anion exchange chromatography as the second step, scFv antibodies were recovered at the elution Fr.
  • FIG. 13 as a result of Western blotting, it was confirmed that the scFv antibody specifically recognizes the recombinant MAGE1 protein in the same manner as the mouse antibody (band near 60 Kd).
  • the IgG antibody gene was quantified at the single cell level of immortalized B cells by real-time PCR.
  • a probe (TaqMan) primer is designed to target the conserved region of the Fc segment of an IgG antibody, and mRNA of a partial sequence of the Fc segment is used to create a calibration curve. Synthesized in vitro ( Figures 5-7). Quantitative real-time PCR was performed on normal B cells separated by CD19 microbeads and immortalized B cell lines in the same melanoma case, and ⁇ -actin and IgG gene copy numbers per cell were measured and compared. It was.
  • FIGS. 14 The results of quantification by the above real-time PCR method are shown in FIGS.
  • In vitro synthesized ⁇ -actin and human IgG mRNA were serially diluted and PCR amplification was performed to prepare a standard curve for use in quantifying each copy number (FIG. 14). From this calibration curve, the quantifiable copy number per cell in this real-time PCR system was 100-5,000 copies of ⁇ -actin and 10-250 copies of human IgG.
  • the collected B cells were washed three times with 0.5 ml of phosphate buffered saline (FCS-PBS) containing 2% calf serum and 0.1% sodium azide ( 200-400 ⁇ g, 4 minutes, 4 ° C.), 5 ⁇ 10 5 cells were dispensed into a 1.5 ml tube and adjusted to a volume of 20 ⁇ l using FCS-PBS.
  • 20 ⁇ l of GST-labeled CMVpp65 antigen protein adjusted to 100 ng / 20 ⁇ l was added to each of the dispensed cells and reacted at 4 ° C. for 30 minutes under light shielding.
  • FCS-PBS 400 ⁇ g, 2 min, 4 ° C.
  • FCS-PBS 20 ⁇ l of 10 ⁇ g / ml Alexa488-labeled rabbit anti-GST polyclonal antibody (Invitrogen), and shield at 4 ° C. under light shielding.
  • the reaction was performed for 30 minutes.
  • 5 ⁇ l each of PE-labeled anti-human immunoglobulin antibody (manufactured by BD) and APC-labeled anti-human CD19 antibody were added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes under light shielding, and then 3 times with 0.5 ml FCS-PBS.
  • the suspension was suspended in 0.5 ml of FCS-PBS and transferred to a 5 ml tube for taking up a flow cytometer.
  • the cells were stored on ice and protected from light until the cells were taken up. If necessary, 10 ⁇ l of 10 ⁇ g / ml propidium iodide was added to distinguish dead cells.
  • FACS-aria cells stained with three types of APC-labeled antibody, Alexa488-labeled antibody, and PE-labeled antibody were dispensed into each well of a 96-well plate.
  • B cells from a case in which the serum antibody titer against CMVpp65 was increased were used for staining identification and capture of CVMpp65 antigen-positive B cells using a cell microarray (FIG. 20).
  • B cells were selected by negative selection (AutoMACS; manufactured by Miltenyi) using a combination of anti-CD3, CD14 and CD56 antibodies.
  • B cells were stained by reacting 0.5-1 ⁇ M Fluo-4 reagent at 37 ° C. for 40 minutes. B cells stained with Fluo-4 were added onto the microchip and allowed to stand for 15 minutes so that each cell entered each well.
  • Alexa555-labeled rabbit anti-GST polyclonal antibody was added and reacted at 4 ° C. for 15 minutes.
  • Alexa 555 and Fluo-4 image data were acquired using a high-sensitivity scanner (SC @ Scanner, manufactured by SC World).
  • GST-labeled CMVpp65 antigen protein was added and reacted at 4 ° C for 15 minutes
  • Alexa555-labeled rabbit anti-GST polyclonal antibody was added again and reacted at 4 ° C for 15 minutes.
  • image data of Alexa 555 and Fluo-4 were acquired.
  • the obtained image data was analyzed using analysis-dedicated software (TIC-ChipAnalysis, manufactured by ESC World), and B cells stained with CMVpp65 antigen (Alexa555) / Fluo-4 were identified.
  • One cell was sorted into a PCR tube using an automatic 1-cell capture device (Cell Porter mini; manufactured by Sugino Machine).
  • An automatic 1-cell capture device Cell Porter mini; manufactured by Sugino Machine.
  • FIG. Among the 240,000 CD19 + B lymphocytes on the cell chip, 20 CMVpp65 (Alexa555) + / Fluo-4 + cells were confirmed, of which 5 cells showed an increase in intracellular calcium due to the addition of antigen. It was a piece. A total of 67 cells were captured per cell for RT-PCR.
  • single cell RT-PCR cloning was performed (FIGS. 22 and 25).
  • single-cell RT-PCR cloning was performed by improving the following four points as compared with Example 5 described above (FIG. 22).
  • 1. Yeast transfer as carrier in each well of 96-well plate or 0.2ml tube for PCR 5 ⁇ l of sterilized water containing RNA was added to receive the sorted viable cells.
  • 2. The cells were ruptured by osmotic pressure at the moment when the cells touched the sterilized water, and the contents were released. Therefore, it was considered that treatment for cell lysis was unnecessary, and DNase treatment and cell lysis treatment were omitted. 3.
  • IGH-PCR was performed using 6 ⁇ l of the synthesized cDNA solution.
  • the PCR reaction could only be brought into the PCR reaction under the conditions of 1 ⁇ l / total PCR reaction solution 30 ⁇ l, it is expected that the detection sensitivity will be higher than before in this system (6 ⁇ l / total PCR reaction solution 12 ⁇ l). did it. 4).
  • the nested PCR method was adopted. For both 1 st -PCR and 2 nd -PCR, Ex-taq HotStart ver was used, and in 1 st -PCR, primers corresponding to each repatova were the same as those in Example 5.
  • Reverse transcription reaction directly targeting a single cell was performed as follows. 96-well plates (MicroAmp R Optical 96- well Reaction Plate, manufactured by Applied Biosystem Co.), or the PCR for 0.2ml tubes, was added Yeast Transfer RNA is carrier (Ambion Inc.) and RNaseOUT TM (Invitrogen Corp.) 5 ⁇ l of sterilized water was added, and the sorted cells were collected one by one using FACS or Cell porter mini. The 96-well plate or 0.2 ml PCR tube that received the cells was lightly centrifuged and placed on ice.
  • Each well contained 10 ⁇ PCR buffer II (0.80 ⁇ l), 25 mM MgCl 2 (0.48 ⁇ l) 0.1 M DTT (0.40 ⁇ l), 40 U. / ⁇ l RNaseOUT TM (0.16 ⁇ l), 50 mM Oligo (dT) 20 (Invitrogen) (0.16 ⁇ l), 10 mM dNTPmix (0.16 ⁇ l), and dH 2 O (0.84 ⁇ l) were added, and a thermal cycler (GeneAmp R PCR) was added. System9700 (Applied Biosystems) was used for 90 seconds at 70 ° C.
  • a 96-well plate or 0.2 ml PCR tube was quickly transferred onto ice and allowed to stand for 2 minutes. Centrifuge the 96-well plate or 0.2 ml PCR tube lightly and put it back on ice again.
  • RNaseOUT TM 40 U / ⁇ l
  • 0.05 ⁇ l SuperScript TM III RT 200 U / ⁇ l; Invitrogen
  • 0.40 ⁇ l and 1.35 ⁇ l of dH 2 O was added to each well and mixed by pipetting.
  • the 96-well plate was lightly centrifuged and then treated with a thermal cycler at 50 ° C. for 50 minutes and at 70 ° C. for 10 minutes to synthesize DNA.
  • PCR buffer II (0.20 ⁇ l), MgCl 2 (0.12 ⁇ l), RNase H (0.30 ⁇ l; manufactured by Invitrogen) and dH 2 O (1.38 ⁇ l) were added and mixed well, and the mixture was mixed at 37 ° C. for 15 minutes. And treated at 70 ° C. for 10 minutes to prepare 12 ⁇ l of cDNA solution.
  • a 0.2 ml tube for PCR was set on the thermal cycler, and the reaction was performed with a program of (95 ° C. for 15 seconds, 68 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute) ⁇ 50 cycles, 72 ° C. for 5 minutes.
  • MinElutecolumn MinElute TM ReactionCleanupKit; manufactured by QIAGEN
  • 2 ml collectiontube MinElute TM ReactionCleanupKit; manufactured by QIAGEN
  • 750 ⁇ l of BufferPE MinElute TM ReactionCleanupKit; manufactured by QIAGEN
  • the column was returned to the collection tube again and centrifuged at room temperature and 22000 ⁇ g for 1 minute.
  • the drop on the column tub was removed with a micropipette and the column was set in a new 1.5 ml sample tube.
  • 10 ⁇ l of Buffer EB MinElute TM ReactionCleanupKit; manufactured by QIAGEN was added and left at room temperature for 1 minute, and then centrifuged at room temperature at 10,000 ⁇ g for 1 minute to recover the purified DNA fragment.
  • the # 1 tube contains HuIGKV_1 to 11mix and HuIGKC_1 (SEQ ID NOs: 27 to 38), which are light chain ⁇ region amplification primers
  • the # 2 tube contains HuIGLV_1 to 23mix and HuIGLC_1 to 2mix (sequence) for light chain ⁇ region amplification. Numbers 39-64) were used.
  • a 0.2 ml tube for PCR was set in the thermal cycler, and the reaction was carried out with a program of 95 ° C. for 5 minutes (95 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 1 minute, 72 ° C.
  • PCR amplification was confirmed by the same method as in Example 11, and DNA fragments were purified for samples in which amplification was confirmed by combining IGH and IGK / L derived from the same clone.
  • FIG. 23 shows the result of comparison of the amplification efficiency of the PCR method for the antibody gene derived from one cell before and after the technical improvement shown in FIG.
  • the cells are B cells derived from MEL-SCC007, which are CMVpp65 + / IgG + cells that have been single cell sorted by FACSAria.
  • amplification was not confirmed in any of the 7 cells used, but in the new method shown in Example 10, the IGH antibody gene was successfully amplified in 10 cells out of 12, An improvement in efficiency was confirmed.
  • the antibody light chain region gene was also amplified from the same cDNA (FIG. 25).
  • Cells in which both the antibody heavy chain region gene (IGH) and antibody light chain region gene (IGL) were amplified in the same B cell were selected and used in the following experiments.
  • M13 reverse primer was used for sample # 1
  • M13 forward primer was used for sample # 2.
  • a 0.2 ml tube for PCR was set in the thermal cycler, and the reaction was carried out with a program of 95 ° C. for 1 minute (95 ° C. for 10 seconds, 50 ° C. for 5 seconds, 68 ° C. for 4 minutes) ⁇ 24 cycles.
  • Sephadex G-50 manufactured by GE Healthcare
  • 300 ⁇ l of sterilized water were added to the wells of MultiScreen TM HV-plate (manufactured by MILLIPORE) and allowed to stand at room temperature for 2 minutes.
  • the effluent was discarded by centrifugation at room temperature at 1100 ⁇ g for 5 minutes.
  • a new 96-well Assay plate (manufactured by IWAKI) was replaced with the Multiscreen TM HV-plate, and the whole sample was applied to each well and centrifuged at room temperature at 1100 ⁇ g for 5 minutes to collect the sample.
  • the purified sample was transferred to a 96-well plate for the entire sequencer. Further, 17.2 ⁇ l of sterilized water was added to the original well, and the entire amount was transferred to a 96-well plate while washing the well, and the sequence was determined using a DNA sequencer (x3130 / Genetic Analyzer; manufactured by Applied Biosystem).
  • White colonies were selected and inoculated into 3.5 ml of 2 ⁇ YT / Km liquid medium and cultured overnight at 37 ° C. with shaking. After culturing, 1.8 ml of the culture solution was placed in a 2 ml sample tube and centrifuged at 1000 ⁇ g for 10 minutes. The supernatant was discarded, BufferA1 of 250 ⁇ l against precipitation; a (NucleoSpin R Multi-8 Plasmid MACHEREY -NAGEL Inc.) was added and mixed by vortex.
  • Buffer A2 NucleoSpin R Multi-8 Plasmid (manufactured by MACHEREY-NAGEL) was added, mixed by inversion, and allowed to stand for 5 minutes at room temperature to lyse the cells.
  • Buffer A3 NucleoSpin R Multi-8 Plasmid (manufactured by MACHEREY-NAGEL) was added, and the mixture was then inverted and centrifuged at 4 ° C., 14000 ⁇ g for 10 minutes.
  • the membrane was washed by aspiration for a minute to allow the solution to permeate. Further, 900 ml of Buffer A4 was added, and the membrane was washed again by sucking at 400 mbar for 1 minute to permeate the solution. After drying the membrane, the NucleoSipn R MN Tube Strips (NucleoSpin R Multi-8 Plasmid; manufactured by MACHEREY-NAGEL, 120 ⁇ l of BufferAE (NucleoSpin R Multi-8) Plasmid (manufactured by MACHEREY-NAGEL) was added and allowed to stand for 1 minute, and aspirated at 400 mbar for 1 minute to recover plasmid DNA.
  • a 96-well plate was set on the thermal cycler, and the reaction was carried out with a program of 94 ° C for 1 minute (94 ° C for 10 seconds, 50 ° C for 5 seconds, 68 ° C for 4 minutes) x 25 cycles.
  • the Sephadex is added to the wells of the MultiScreen TM HV-plate.
  • G-50 was added, 300 ⁇ l of sterilized water was added and left at room temperature for 2 hours. When fully hydrated, the effluent was discarded by centrifugation at room temperature, 1100 ⁇ g for 5 minutes.
  • a new 96-well assay plate was replaced with the Multiscreen TM HV-plate, and the entire amount of the PCR reaction solution was applied to each well, followed by centrifugation at room temperature at 1100 ⁇ g for 5 minutes to collect a sample.
  • the purified sample was transferred to a 96-well plate for the whole volume sequencer, and then 17.2 ⁇ l of sterilized water was added to the original well, and the whole volume was transferred to the 96-well plate while washing the well.
  • Sequence analysis is x3130 / Genetic Performed with Analyzer. Read 6 to 8 clones for each sample, and obtain multiples of the resulting sequences. Alignment analysis was performed, and the base sequence of each sample was determined by assuming that the base having a difference between clones was the correct sequence when there were more clones having the base.

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Abstract

本発明の課題は、ヒト由来の、１個のＢ細胞における抗体遺伝子を同定・解析する方法や、同定された１個のＢ細胞由来の抗体を製造する技術等を提供することにある。本発明者らは、メラノーマ患者由来の末梢血単球から作製した不死化Ｂ細胞や、末梢血単球に含まれるプライマリーＢ細胞を用いて、１細胞レベルでのメラノーマ抗原特異的な抗体遺伝子について解析・同定を行った。すなわち、ＧＳＴ標識メラノーマ特異的がん抗原ＭＡＧＥ１、Alexa標識抗ＧＳＴ抗体、及びＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体によりＢ細胞を染色し、シングルセルソーティングを行うことにより、特定の抗体を産生するＢ細胞を１細胞ずつ分取しできることを見い出し、さらに、分取した１個のＢ細胞から全ＲＮＡを抽出後、特異的な抗体遺伝子を効率的にクローニングする実用化技術を確立し、本発明を完成するに至った。

Description

１細胞レベルでの抗体遺伝子の解析・同定方法
　本発明は、ヒトのＢ細胞１細胞レベルでの抗体遺伝子の解析・同定方法や、１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法や、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法等に関する。
　人間などの高等脊椎動物の体には、体外から侵入する細菌・ウイルスなどの病原体や、危険物質、がん細胞などの異物から生命を守るために獲得免疫系が存在する。抗体はタンパク質等の相互に類似した物質を特異的に識別できる免疫グロブリンというタンパク質であり、生体内では抗原特異的液性免疫に関与している。抗体は、無数の異物を認識するために、抗体の一部（可変領域）をコードする遺伝子では、ＤＮＡレベルでの再編成が起き、多様な抗体遺伝子配列を持つＢリンパ球の集団が生じている。このＤＮＡ再編成を通じた遺伝子多様化の仕組みは、生物が子孫の遺伝子を多様化しつつ、環境変動に適応して生き残ろうとする性の過程にも見られる。また、それぞれのＢリンパ球細胞１個からは必ず一種類の抗体遺伝子がコードする一種類の免疫グロブリンが産生されることが知られている。
　従来、抗体遺伝子を取得する方法等としては、ヒト末梢血リンパ球を分離後、ＣＤ１１ｃ特異的抗体及びマグネチックビーズを用いＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去し、体外免疫を行い、抗原特異的ヒト抗体産生応答を誘導し、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞を、エプスタインバールウィルスにより不死化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、この抗原特異的抗体産生Ｂ細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨ及びＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子の増幅を行う抗原特異的抗体遺伝子の取得方法（例えば、特許文献１参照）や、目的の抗体が認識する抗原を標識化してなる標識化抗原を、前記抗体を産生するターゲット細胞を含む細胞集団に接触させ、前記標識化抗原を前記ターゲット細胞に結合させ、得られる標識化ターゲット細胞を分離し、分離した標識化ターゲット細胞を用いて、それが保有する抗体遺伝子を調製し、調製した抗体遺伝子を、発現ベクターを用いて発現させる抗体作製方法（例えば、特許文献２参照）などが知られている。
特開２００４－１２１２３７号公報 特開２００６－１８０７０８号公報
　近年、がんや自己免疫疾患という病態での免疫細胞の異常クローンが注目されているが、免疫のダイナミックな順応メカニズムを考えれば、個々の細胞の機能的性格が異なることは容易に想像できる。免疫応答の観点からしてもＴ細胞受容体や抗体遺伝子の変異も最初は１個の細胞から始まる現象であり、免疫細胞の機能研究においては、１細胞レベルでの研究はもはや避けては通れない時代である。特に、がんという病態下での個々の免疫細胞の動態については、未だ詳細な検討はなされておらず、新しい治療を考える上で重要な研究課題となりうる。本発明者らは、転移性メラノーマの症例を対象にＨＬＡ－Ａ２又はＡ２４ペプチドカクテルにて処理をした樹状細胞ワクチンの臨床試験を実施し、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者由来のＢ細胞を用いて、１細胞レベルでのメラノーマペプチド特異的な抗体遺伝子について解析・同定を既に提案している（特願２００７－１４７５２５）。しかし、この方法は、ワクチン投与によりがん特異的ペプチドなどの特定の抗原に対する抗体産生Ｂ細胞を一定の割合以上に増加させることが必須であり、ワクチン療法の確立されている特定のがん患者を対象としたものであった。
　本発明の課題は、ワクチン投与後の検体のみならず、全ての担がん患者由来のＢ細胞を対象とした網羅的な抗体遺伝子の解析のための技術を提供することであり、より具体的には、ヒトの１個のＢ細胞における抗体遺伝子を同定・解析する方法や、同定された１個のＢ細胞由来の抗体を製造する技術等を提供することにある。
　本発明者らは、ワクチン投与前のメラノーマ患者由来の末梢血単球から作製した不死化Ｂ細胞を用いて、１細胞レベルでのメラノーマペプチド特異的な抗体遺伝子について解析・同定を行った。すなわち、ＧＳＴ標識メラノーマ特異的がん抗原ＭＡＧＥ１、Ａｌｅｘａ標識抗ＧＳＴ抗体、及びＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体により不死化Ｂ細胞を染色し、シングルセルソーティングを行うことにより、特定の抗体を産生するＢ細胞を１細胞ずつ分取できることを見い出し、分取した１個のＢ細胞から全ＲＮＡを抽出後、特異的な抗体遺伝子を効率的にクローニングする実用化技術を確立した。さらに、発明者らは、抗体誘導の多様性を考えると通常のＢ細胞でも抗体遺伝子を増幅可能にすることが肝要であると考え、ＲＴ－ＰＣＲ技術の改良を行うことによりさらに高感度の技術を開発し、不死化していないＢ細胞を用いた１個のＢ細胞から抗体遺伝子を効率的にクローニングする実用化技術を確立し、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は、［１］（Ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）得られた末梢血単核球からエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ－Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、ＥＢＶ－Ｂ細胞を標識化する工程；（Ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＥＢＶ－Ｂ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法や、［２］（ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（ｃ）得られた末梢血単核球に含まれるＢ細胞を、標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより標識化する工程；（ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；の（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法や、［３］ヒトが、担がん患者であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載の解析・同定方法や、［４］抗原が、がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクであることを特徴とする上記［１］～［３］のいずれかに記載の解析・同定方法や、［５］がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクが、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ１、tyrosinase、又はｇｐ１００であることを特徴とする上記［４］記載の解析・同定方法に関する。
　また本発明は、［６］（Ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）得られた末梢血単核球からエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ－Ｂ細胞）株を作製する工程；（Ｃ）標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、ＥＢＶ－Ｂ細胞を標識化する工程；（Ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＥＢＶ－Ｂ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法や、［７］（ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（ｃ）得られた末梢血単核球に含まれるＢ細胞を、標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより標識化する工程；（ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；（ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；以下の（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法や、［８］ヒトが、担がん患者であることを特徴とする上記［６］又は［７］記載の抗体を製造する方法や、［９］抗原が、がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクであることを特徴とする上記［６］～［８］のいずれかに記載の抗体を製造する方法や、［１０］がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクが、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ１、tyrosinase、又はｇｐ１００であることを特徴とする上記［９］記載の抗体を製造する方法に関する。
さらに本発明は、［１１］（Ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（Ｂ）得られた末梢血単核球からエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ－Ｂ細胞）株を作製する工程；（Ｃ）標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、ＥＢＶ－Ｂ細胞を標識化する工程；（Ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＥＢＶ－Ｂ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法や、［１２］（ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；（ｃ）得られた末梢血単核球に含まれるＢ細胞を、標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより標識化する工程；（ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；（ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；（ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；の（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法や、［１３］ヒトが、担がん患者であることを特徴とする上記［１１］又は［１２］記載の抗体遺伝子を調製する方法や、［１４］抗原が、がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクであることを特徴とする上記［１１］～［１３］のいずれかに記載の抗体遺伝子を調製する方法や、［１５］がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクが、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ１、tyrosinase、又はｇｐ１００であることを特徴とする上記［１４］記載の抗体遺伝子を調製する方法に関する。
　本発明によると、ヒトのＢ細胞を対象として、１個のＢ細胞レベルでの機能的な抗体遺伝子を解析・同定することができ、特異的な免疫エピトープや腫瘍抗原に対する抗体遺伝子を網羅的に解析・同定することが可能となるため、新たながん治療のターゲットのスクリーニングや、がん治療薬の開発、さらに、今後のがんのテーラーメイド医療や診断に非常に有効である。
本発明のＧＳＴ標識抗原に特異的なＩｇＧ抗体を発現するＥＢＶ－Ｂ細胞の検出法の概略を示す図である。 本発明に用いた、ＧＦＰ－ＭＡＧＥ１遺伝子配列を含むバキュロウイルス作製用のドナープラスミドへの組込みを示す図である。 本発明の、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲクローニングの概略を示す図である。 本発明の、組換え抗体の調製方法を示す図である。 本発明に用いた、リアルタイムＰＣＲ解析用コントロールＲＮＡテンプレートの設計を示す図である。 本発明に用いた、リアルタイムＰＣＲ解析用コントロールＲＮＡテンプレートの作製方法を示す図である。 本発明に用いた、リアルタイムＰＣＲ用キット（TaqMan Gene ExpressionCell-to-Ct kit）の実験手順を示す図である。 本発明の、フローサイトメトリー解析の結果を示す図である。MEL-018症例における投与前（MEL-018Pre）及び樹状細胞ワクチン６回投与後（MEL-018Post）の患者由来ＥＢＶ－Ｂ細胞の解析結果を示している。 本発明の、フローサイトメトリー解析の結果を示す図である。MEL-016、MEL-017、MEL-018、MEL-021症例由来ＥＢＶ－Ｂ細胞の解析結果を示している。 本発明の、フローサイトメトリー解析の結果を示す図である。MEL-022、MEL-023、MEL-SCC004、MEL-SCC005症例由来ＥＢＶ－Ｂ細胞の解析結果を示している。 本発明の、フローサイトメトリー解析の結果を示す図である。MEL-001post、MEL-006post、MEL-018post、MEL-014*症例由来ＥＢＶ－Ｂ細胞の解析結果を示している。 本発明のＥＢＶ－Ｂ細胞の抗ＭＡＧＥ－１抗体の発現を、免疫組織染色により調べた結果を示す図である。 本発明のｓｃＦ抗体の精製（金属キレートアフィニティー精製）の結果を示す図である。 本発明のｓｃＦ抗体の精製（陰イオン交換精製）の結果を示す図である。 本発明のｓｃＦ抗体のウエスタンブロットにより解析した結果を示す図である。 本発明のＥＢＶ－Ｂ細胞における遺伝子の発現量を検討するためのリアルタイムＰＣＲの、検量線を示す図である。 本発明のＥＢＶ－Ｂ細胞におけるβ－アクチン遺伝子の発現量（コピー数）をリアルタイムＰＣＲにより検討した結果示す図である。 本発明のＥＢＶ－Ｂ細胞におけるＩｇＧ遺伝子の発現量（コピー数）をリアルタイムＰＣＲにより検討した結果示す図である。 ヒト血清中の抗ＣＭＶ－ｐｐ６５抗体の抗体価を測定した結果を示す図である。 ＧＳＴ標識ＣＭＶｐｐ６５抗原タンパク質、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ＧＳＴ抗体、及び、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてＢ細胞の染色を行った結果を示す図である。 ＣＭＶ－ｐｐ６５タンパク質を用いてＢ細胞の染色を行った結果を示す図である。 細胞マイクロアレイを用いたＣＶＭｐｐ６５抗原陽性Ｂ細胞の染色同定と捕獲を行った結果を示す図である。 ＣＭＶ－ｐｐ６５陽性ウェルでカルシウムイオン流入を検出した結果を示す図である。 本発明のＩｇＧ遺伝子クローニングのための単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ法の手順を示す図である。 本発明のＩｇＧ遺伝子クローニングのための単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ法の効率を比較した結果を示す図である。 本発明のＩｇＧ遺伝子クローニングのための単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ法の手順を示す図である。 本発明のＩｇＧ遺伝子クローニングのための単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ法の結果を示す図である 本発明のＩｇＧ遺伝子クローニングのための単一細胞ＲＴ－ＰＣＲ法によりクローニングに成功したＢ細胞の数を示す図である。 本発明の方法によりクローニングに成功した抗体遺伝子のレパトワ解析の結果を示す図である。 本発明に用いた２ｎｄＰＣＲ用のプライマー配列（配列番号６５～７０）を示した図である。 本発明の方法により得られた抗体重鎖遺伝子（＃０８１２１５－１）の塩基配列（配列番号７１）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体軽鎖κ遺伝子（＃０８１２１５－１）の塩基配列（配列番号７２）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体重鎖遺伝子（＃０８１２１５－５）の塩基配列（配列番号７３）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体軽鎖κ遺伝子（＃０８１２１５－５）の塩基配列（配列番号７４）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体重鎖遺伝子（＃０８１２１５－１９）の塩基配列（配列番号７５）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体軽鎖κ遺伝子（＃０８１２１５－１９）の塩基配列（配列番号７６）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体重鎖遺伝子（＃０８１２１５－２３）の塩基配列（配列番号７７）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体軽鎖λ遺伝子（＃０８１２１５－２３）の塩基配列（配列番号７８）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体重鎖遺伝子（＃０９０２０４－１５）の塩基配列（配列番号７９）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体軽鎖κ遺伝子（＃０９０２０４－１５）の塩基配列（配列番号８０）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体重鎖遺伝子（＃０９０２１９－１１）の塩基配列（配列番号８１）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体軽鎖λ遺伝子（＃０９０２１９－１１）の塩基配列（配列番号８２）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体重鎖遺伝子（＃０９０２２５－１００）の塩基配列（配列番号８３）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体軽鎖κ遺伝子（＃０９０２２５－１００）の塩基配列（配列番号８４）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体重鎖遺伝子（＃０９０２２５－１０４）の塩基配列（配列番号８５）を示す図である。 本発明の方法により得られた抗体軽鎖κ遺伝子（＃０９０２２５－１０４）の塩基配列（配列番号８６）を示す図である。
　本発明の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法としては、以下に示す工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）を順次備えた方法であれば特に制限されるものではなく、本発明の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法としては、以下に示す工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）を順次備えた方法であれば特に制限されるものではなく、本発明の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法としては、以下に示す工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）を順次備えた方法であれば特に制限されるものではない。
（Ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、Ｂ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
　また、本発明の方法としては、上記の工程（Ｂ）の不死化Ｂ細胞を作製する工程を含まないものであってもよく、その場合、本発明の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法としては、以下に示す工程（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）を順次備えた方法であれば特に制限されるものではなく、本発明の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法としては、以下に示す工程（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）を順次備えた方法であれば特に制限されるものではなく、本発明の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法としては、以下に示す工程（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、及び（ｆ）を順次備えた方法であれば特に制限されるものではない。
（ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
（ｃ）得られた末梢血単核球に含まれるＢ細胞を、標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより標識化する工程；
（ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
（ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；
　上記工程（Ａ）及び（ａ）において、末梢血の採取源となるヒトは、特に制限されるものではないが、担がん状態のがん患者を好適に挙げることができる。上記がん癌患者としては、担がん状態にある患者であれば特に制限されるものではなく、ワクチン投与を行っていないがん患者であっても、ワクチン投与により特定の抗原に対する免疫応答が確認されているがん患者であってもよく、上記がんとしては、固形がんであっても、血液がんであってもよい。ここで固形がんとは、肉腫および癌腫を含むものであり、具体的には、メラノーマ（黒色腫）、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃がん、食道がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢腺がん、骨髄がん、気管支原性がん、腎細胞がん、尿管がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頚がん、子宮内膜がん、精巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、骨髄芽種、頭蓋咽頭がん、喉頭がん、舌がん、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、腹膜播腫、奇形腫、神経芽細胞腫、髄芽腫および網膜芽細胞腫等が挙げられ、また、上記血液がんとは、骨髄腫およびリンパ腫が含まれるものであり、具体的には、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Hodgkin病、非Hodgkinリンパ腫、成人T細胞白血病リンパ腫、多発性骨髄腫等が挙げることができる。
　上記工程（Ｂ）における末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ－Ｂ細胞）株を作製するには、末梢血単核球とＥＢＶをフィーダー細胞の共存下で培養し、末梢血単核球を不死化すればよく、Ｂリンパ球マーカーである抗ＣＤ１９抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体に加えて、標識化抗原ペプチドを用いて、目的とする抗原特異的抗体産生ＥＢＶ－Ｂ細胞株の存在を確認することもできる。
　上記工程（Ｃ）及び（ｃ）における抗原とは、抗体により特異的に認識される分子であれば特に制限されるものではなく、ペプチドないしはタンパクや、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸等を例として挙げることができ、なかでも、がん細胞において特異的に高発現するペプチド（がん特異的ペプチド）やタンパク（がん特異的タンパク）を好例として挙げることができ、より具体的には、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ１、tyrosinase、ｇｐ１００等のがん特異的ペプチドやがん特異的タンパクを好適に例示することができる。上記抗原は、抗原としての機能を備える限り様々な修飾がなされていてもよく、例えば、抗原としての機能部分（エピトープ）に加えて他のペプチドないしはタンパク部分を付加した、いわゆる融合タンパクであっても、糖鎖や脂肪鎖などを付加したものであってもよい。また、上記工程（Ｃ）における標識物質としては、Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ ４８８、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などの蛍光物質、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム誘導体などの化学発光物質、ビオチン、マグネットビーズを挙げることができる。さらに、上記工程（Ｃ）は、標識物質により標識された抗原、前記標識物質に対する抗体、及び前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、ＥＢＶ－Ｂ細胞を標識化する工程であってもよく、この場合の標識物質としては、例えば、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ－Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧ等のエピトープタグを挙げることができ、これらのエピトープタグを特異的に認識する抗体を、標識物質に対する抗体として用いることができる。また、上記エピトープタグを特異的に認識する抗体は、上述の蛍光物質や化学発光物質等の標識物質により標識したものを用いることができる。これらの標識物質による標識化は常法で行うことができ、例えばMolecular Cloning, Third Edition,ColdSpringHarborLaboratory Press,
New Yorkを参照することができる。また、工程（Ｃ）におけるヒト抗体を認識しうる抗体としては、抗ヒト抗ヒトＩｇＧ抗体を好適に例示することができる。例えば、工程（Ｃ）において、標識物質により標識されたがん特異的抗原タンパクとして、ＧＳＴ標識がん特異的抗原タンパクを用い、Alexa標識抗ＧＳＴ抗体、及び異なる標識物質により標識されたヒト抗体を認識しうる抗体として、ＰＥ標識抗ヒト抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる場合など、がん抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の細胞膜結合型抗体が脱落しない条件で標識化を行うことが好ましい。
　上記工程（Ｄ）及び（ｄ）において、がん特異的抗原ペプチドやがん特異的タンパクなどの抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＥＢＶ－Ｂ細胞や不死化していないプライマリーＢ細胞を、１細胞ずつ分取する。Ｂ細胞を１細胞ずつ分取するには、使用した標識物質の種類に応じて適切な手法が用いられる。例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合には、蛍光を指標としたフローサイトメトリー（シングルセルソーター）によって、１細胞ずつ分取することが好ましい。フローサイトメトリーによれば効率的かつ高精度の細胞分離が可能となる。また、標識物質としてビオチンを採用した場合においてもアビジンとの結合反応を利用して１細胞ずつ分取することができる。マグネットビーズを採用した場合にも同様に、磁石を用いた良好な分離が可能である。さらに、細胞マイクロアレイや、マイクロマニピュレーターや、マイクロメッシュフィルター等を用いて１細胞ずつ分取することもできる。
　上記工程（Ｅ）及び（ｅ）においては、１細胞ずつ分取した１個の抗体産生Ｂ細胞から、全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法（例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.参照）に従って実施することができる。
　上記工程（Ｆ）及び（ｆ）においては、合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する。ヒト抗体重鎖領域遺伝子、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては、それぞれの領域遺伝子配列に特異的なプライマー対であれば特に制限されないが、例えば、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号１～２４に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号２５又は２６に示される塩基配列とからなるプライマー対を挙げることができ、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号２７～３７に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号３８に示される塩基配列とからなるプライマー対を挙げることができ、また、ヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号３９～６１に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号６２及び６３に示される塩基配列の１種又は２種の配列とからなるプライマー対を挙げることができる。増幅された遺伝子断片の塩基配列が、上記工程（Ｇ）において常法により解析・決定される。抗体のタイプとしては、ＩｇＧの他、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭを挙げることができる。
　上記工程（Ｆ）及び（ｆ）で増幅された遺伝子断片を用いて、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製することができる。すなわち、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体重鎖遺伝子を調製することができる。また、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒトＩｇＧ軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体軽鎖遺伝子を調製することができる。さらに、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片を調製することができる。また、ヒト抗体軽鎖κ可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒトＩｇＧ軽鎖λ可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト軽鎖可変部領域遺伝子断片を調製することができる。これら調製されたヒト抗体遺伝子をサブクローニングして増幅させることもできる。なお、ゲノムＤＮＡを鋳型にする場合、エクソンが離れているためいるため効果的な増幅が期待できない。
　また、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片（重鎖断片）及びヒト軽鎖可変部領域遺伝子断片（軽鎖断片）をＰＣＲ法により増幅し、これら重鎖断片と軽鎖断片をＰＣＲ法によりそれぞれ重鎖断片－重鎖リンカー配列－制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列－軽鎖リンカー配列－軽鎖断片を含む軽鎖複合断片として増幅し、重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させ、ライゲーション産物を制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化した後、重鎖断片－リンカー配列－軽鎖断片からなるヒト一本鎖抗体遺伝子（ＳｃＦｖ）断片としてＰＣＲ法により増幅する本発明者らによる方法（特願２００７－９２９６８）を用いると、ヒトＳｃＦｖ断片を大量かつ効率よく製造することができる。
　上記工程（Ｈ）及び（ｈ）において、工程（Ｆ）又は（ｆ）において増幅された遺伝子断片である、ヒト抗体重鎖遺伝子やヒト抗体軽鎖遺伝子を、発現ベクターを用いて発現させ、１個のＢ細胞由来の抗体を製造することができる。発現ベクターとしては、抗体遺伝子の発現に適したものであれば特に限定されず、例えば、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology,158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）の他、ＳＶ４０ウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクターを挙げることができる。これらのウイルスベクターには、発現効率を高めるためにプロモータ配列、エンハンサー配列などの制御配列の他、選択マーカー遺伝子を導入しておくこともできる。発現ベクターへの抗体遺伝子の導入は、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる)により行うことができる。
　上記ヒト抗体重鎖遺伝子やヒト抗体軽鎖遺伝子は、通常、それぞれ別の発現ベクターに挿入され、これら２つの組換えベクターで宿主を共形質転換し、同一細胞内で重鎖及び軽鎖を発現させることが好ましい。上記宿主としては、組換えベクターで形質転換されることにより、導入された抗体遺伝子を発現可能な状態に保有できるものであれば特に制限されず、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＣＫ細胞等を挙げることができる。組換えベクターにより宿主を形質転換する方法としては、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を例示することができる。このようにして、ハイブリドーマを用いることなく、１個のＢ細胞から、モノクローナル抗体を製造することができる。また、上記ヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたファージミドベクター又はファージベクターにより大腸菌を形質転換し、この形質転換大腸菌を用いてファージディスプレイヒト一本鎖抗体を作製することもできる。
　本発明の１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子の解析・同定方法によって、がん患者の抗体遺伝子を解析・同定することにより、患者個人の体内で産生されているがん抗原特異的抗体の種類の全体像に関する情報を得ることができる。また、本発明の１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法によって、がん抗原特異的抗体を大量に得ることができ、テイラーメイド的な患者個人の診断や治療が可能となる。また、本発明の１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法によって得られる抗体遺伝子は、がん抗原特異的抗体を大量に製造する場合に有利に用いられる他、テイラーメイド的な患者個人の診断にも利用することができる。特に、従来マウスで免疫してハイブリドーマを作製して得られていた部分的なヒトの抗体を、実際にヒトの体内で増幅した形で、１００％ヒトの抗体として獲ることができるという大きな利点がある。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［末梢血単核球の採取と不死化Ｂ細胞株の作製］
　樹状細胞ワクチン投与前及び／又は投与後のメラノーマ患者（ワクチン投与前後の同一患者を含む）由来の末梢血から、１２例分の末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell;ＰＢＭＣ)を採取した。なお、治療に使用された樹状細胞ワクチンは、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性ＭＡＧＥ１１３５－１４３（ＭＡＧＥ１１３５－１４３のアミノ酸配列は配列番号６４に示す）、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ｇｐ１００、及びTyrosinaseの５種類のペプチド、又はＨＬＡ－Ａ２拘束性ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１及びTyrosinaseの５種類のペプチドで処理されたものである。
［不死化Ｂ細胞株の作製］
　エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、採取したＰＢＭＣから不死化Ｂ細胞株（EBV-transformed
B cell line；以下ＥＢＶ－Ｂ細胞株という）を作製した。具体的には、フィーダーであるヒト繊維芽細胞株（ＭＲＣ－５；ＡＴＣＣ　ｃａｔ．ＣＣＬ－１７１）を、２５ｃｍ２フラスコにて９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙまで増殖させ（培地：ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、３０－４０Ｇｙのirradiationを実施した。２４時間後、実施例１で採取したＰＢＭＣを１～２×１０７ｃｅｌｌｓ／４ｍｌとなるように培地（ＩＭＤＭ＋２０％ＦＢＳ）に懸濁し、上記の培養ＭＲＣ－５に加えた。その後、１ｍｌのＥＢＶ溶液（ＥＢＶ strain Ｂ９５－８、ＡＴＣＣ　ｃａｔ．ＶＲ－１４９２）を２５ｍｌフラスコに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の気相条件下で培養した。培養開始から４８時間後に培地を交換した後、４日ごとに培地交換を行った。３～４週間後に、Ｂ細胞の増殖を確認し、ＥＢＶにより不死化したＢ細胞（ＥＢＶ－Ｂ細胞）を回収し、全部で１２症例分のＥＢＶ－Ｂ細胞（MEL-001post, MEL-006post, MEL-014, MEL-016, MEL-017, MEL-018,
MEL-018post, MEL-021, MEL-022, MEL-023, MEL-SCC004, MEL-SCC005）を作製した。作製した１２株のうち、MEL-014、MEL-016、MEL-017、MEL-018、MEL-021、MEL-022、MEL-023、MEL-SCC004及びMEL-SCC005はワクチン投与前の患者由来であり、MEL-001post、MEL-006post及
びMEL-018postはワクチン投与後の患者由来である。また、MEL-018及びMEL-018postは、同一患者のワクチン投与前（MEL-018）とワクチン投与後（MEL-018post）のＰＢＭＣから作製されたＥＢＶ－Ｂ細胞である。
［ＥＢ－Ｂ細胞の染色とフローサイトメトリーによる解析］
　ＧＳＴ標識メラノーマ関連組換えタンパク、Alexa Fluor 488標識抗ＧＳＴ抗体、及びＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗によるＥＢ－Ｂ細胞の染色ならびにフローサイトメトリーによる解析を行った。この実験の概略を図１に示す。６種のＧＳＴ標識メラノーマ関連組換えタンパクのうち、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ１及びTyrosinaseはAbnoba社より、ｇｐ１００はAbcam社よりそれぞれ購入した。陰性コントロールであるＧＳＴタンパクは大腸菌にて合成した。また、Alexa Fluor 488標識抗ＧＳＴポリクローナル抗体（以下Alexa－抗ＧＳＴ抗体という）はInvitrogen社より、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（以下ＰＥ－抗ｈＩｇＧという）はBD
Phaimingen社よりそれぞれ購入した。
　染色は以下の手順で行った。まず、ＥＢＶ－Ｂ細胞をsorter buffer (ＰＢＳ＋２％　ＦＢＳ＋０．１％　ＮａＮ３)により洗浄した後、２０μｌ/tubeとなるよう調整した。このＥＢＶ－Ｂ細胞に、ＰＢＳ（０．２％ＢＳＡ）にて１００ｎｇ/２０μｌに調整したＧＳＴ又は各ＧＳＴ標識タンパクを添加し、４℃で３０分間反応させた。次に、Alexa－抗ＧＳＴ抗体を２０μｌ（１０μｇ/ｍｌ)添加し、４℃で３０分間反応させた後、ＰＥ－ｈＩｇＧ抗体を２０μｌ添加、４℃で３０ 分間反応させた。染色後のＥＢＶ－Ｂ細胞を、フローサイトメーター (FACS-CANTO, BD)により解析した。また、生細胞確認のため計測直前にＰＩ染色を実施した。
　フローサイトメトリーの解析結果を図８及び図９に示す。図８に、MEL-018症例における投与前（MEL-018Pre）及び樹状細胞ワクチン６回投与後（MEL-018Post）の、ＭＡＧＥ１に対するデータを示す。図８Ａからも分かるように、ＥＢＶ－Ｂ細胞株のＩｇＧ、ＩｇＭの分画は、明らかにワクチン後にＩｇＧ抗体陽性の比率が増加している。また、図８Ｂに示すように、ＧＳＴ－ＭＡＧＥ１による染色では、ＩｇＧ＋／ＭＡＧＥ１＋の細胞集団が０．１４％に増加しており（陰性コントロールのＧＳＴのみの場合０．０２％）、明らかにＭＡＧＥ１に対するＩｇＧ抗体をもつＢ細胞の増加が検出された。図９Ａ～９Ｃに、そのほかのがん特異的抗原タンパクに対する解析データを示す。各種メラノーマ抗原タンパク（ＧＳＴ融合）による染色では、ＭＡＧＥ１に対するＩｇＧ抗体の陽性症例は、５／１２例（０．０３～０．１４％）であった。またｇｐ１００に対するＩｇＭ、ＩｇＧ抗体が全症例で検出された（ｇｐ１００＋／ＩｇＧ＋;０．０６～３．６％）。興味深いことに樹状細胞ワクチン投与後のMEL-018Postでは、tyrosinaseに対するＩｇＭ、ＩｇＧ抗体がともに検出された。
［ＥＢＶ－Ｂ細胞の免疫組織染色］
　Green fluorescence protein (ＧＦＰ)標識ＭＡＧＥ－１タンパク（以下、ＧＦＰ－ＭＡＧＥ１という）を合成し、ＥＢＶ－Ｂ細胞の免疫組織染色を行った。ＧＦＰ－ＭＡＧＥ１はバキュロウイルスの生産系を用いて作成した。図２に示すように、ＧＦＰ－ＭＡＧＥ１をコードする遺伝子配列をドナープラスミド（pFastBac）に組み込み、大腸菌内でBacmid ＤＮＡとして調整した。このBacmidＤＮＡを、昆虫由来細胞Ｓｆ９にトランスフェクションし、培養上清中に産生されたバキュロウイルスを回収した。次に、ＧＦＰ－ＭＡＧＥ１遺伝子配列を含む高力価のバキュロウイルスをHigh-Five細胞に感染させ、２７℃で５０～６４時間の振とう培養（７２ｒｐｍ）を行った。培養後の細胞を回収し、凍結融解により細胞を可溶化した後、遠心分離し上清を回収した。回収した上清から、His-tagを利用した金属キレートアフィニティーゲルによりＧＦＰ－ＭＡＧＥ１を精製し、ＰＤ－１０カラムにて脱塩後、限外ろ過カラムを用いてタンパクを濃縮した。ＧＦＰ－ＭＡＧＥ１は使用時まで４℃保存した。実験に使用する際には、保存したＧＦＰ－ＭＡＧＥ１(４ｍｇ／ｍｌ)に、使用時等量の２－メルカプトエタノール（２０ｍＭ）を添加して４℃で一晩反応させ、その後、sorter bufferにて１００μｇ／ｍｌに調整した（終濃度２０μｇ／ｍｌ、４℃で１時間反応)。このＧＦＰ－ＭＡＧＥ１を用いて、実施例１で作製したＥＢＶ－Ｂ細胞の免疫組織染色を行い、蛍光顕微鏡にてＧＦＰ－ＭＡＧＥ１の結合した細胞の検出を行った。MEL-018Pre由来のＥＢＶ－Ｂ細胞を染色した結果、細胞体全体が淡く染色されたが、染色された細胞の割合は、かなり少数(IgG+Ｂ細胞のうち約２％）であった。また、図１０に示すように、強拡大（×２００）した場合、小斑状に陽性に染色された、抗ＭＡＧＥ１抗体を発現する思われるＢ細胞が確認された。
［ＥＢＶ－Ｂ細胞の単一細胞ソーティング］
　ＧＦＰ－ＭＡＧＥ１＋/ＰＥ－抗ｈＩｇＧ＋のＥＢＶ－Ｂ細胞を、１細胞ずつ分取する目的で、単一細胞（シングルセル）ソーティングを行った。ソーティングは、シングルセルソーティング用モジュールを装着したＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭセルソーター（BD Science社製）を用いた。ソーティングには、１００μｍのノズルを用い、sort setup: low , flow rate 5000 events/sec, Drop delay 25.73の条件で、９６ウェルプレート（MicroAmp(R) Optical 96-ウェル Reaction Plate；Applied Biosystem社製）に１細胞ずつ分取した。
［単一細胞ＲＴ－ＰＣＲクローニング］
　実施例４により１細胞ずつ分取したＥＢＶ－Ｂ細胞の、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲクローニングを行った。クローニングの実験概要は図３に示す。また、クローニング様のプライマーとして、ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子、ヒトＩｇＧ軽鎖κ遺伝子、又はヒトＩｇＧ軽鎖λ遺伝子の各領域に特異的なＰＣＲ用プライマーを設計した。ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子に特異的なプライマー塩基配列を配列番号１～２６（配列番号１～２４がフォワードプライマー、配列番号２５及び２６がリバースプライマー）に、ヒトＩｇＧ軽鎖κ遺伝子に特異的なプライマー塩基配列を配列番号２７～３８（配列番号２７～３７がフォワードプライマー、配列番号３８がリバースプライマー）に、ヒトＩｇＧ軽鎖λ遺伝子に特異的なプライマー塩基配列を配列番号３９～６３（配列番号３９～６１がフォワードプライマー、配列番号６２及び６３がリバースプライマー）にそれぞれ示す。また、各プライマーミックスにより増幅される遺伝子断片の大きさは、ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子が約１４００ｂｐ、ヒトＩｇＧ軽鎖κ遺伝子が約７００ｂｐ、ヒトＩｇＧ軽鎖λ遺伝子が約７００ｂｐである。
　まず、分取された１細胞からのＲＮＡ抽出及び逆転写反応によるｃＤＮＡの合成を行った。合成には、SuperScriptTMIII
CellsDirect cDNASynthesisSystem(ｃａｔ．１８０８０－３００、Invitrogen社製)を用いた。１０μｌのResuspensionBuffer
及び１μｌのLysis Enhancer solutionを加え、サーマルサイクラーを用いて７５℃で１０分間処理した。続いて、５μｌのＤＮａｓｅＩ（１Ｕ／μｌ）及び１．６μｌの１０ｘＤＮａｓｅＩＢｕｆｆｅｒを加え、ピペッティングにより混和し、室温で５分間インキュベートした。プレートを軽く遠心し、１．２μｌの２５ｍＭ ＥＤＴＡを加え、サーマルサイクラーを用いて７０℃で５分間インキュベートした。その後、プレートを軽く遠心し、氷上で、各ウェルに２μｌの５０ｍＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０及び１μｌの１０ｍＭ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘを加えた。ピペッティングによる混和の後、サーマルサイクラーを用いて７０℃で５分間処理し、氷上で２分間インキュベートした。プレートを軽く遠心し、再び氷上で、６μｌの５ｘＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ（４０Ｕ／μｌ）、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭIII ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）、及び１μｌの０．１Ｍ
ＤＴＴを加え、ピペッティングにより混和した。プレートを軽く遠心し、サーマルサイクラーを用いて５０℃で５０分間、８５℃で５分間インキュベートし、ｃＤＮＡを合成した。
　次に、クローニング用プライマーを用いて、１細胞から調製したｃＤＮＡのＰＣＲを行った。ｃＤＮＡを、１サンプルにつき４本のＰＣＲ用０．２ｍｌチューブ(＃１～＃４)に１μｌずつ分注し、各チューブに、１μｌの１０ｘＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒII（Ｍｇ＋）、１μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、５．９μｌのｄＨ２Ｏ、０．１μｌのＬＡ－Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa LA-Taq(R) Hot Start
version；タカラバイオ社製）、０．５μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、及び０．５μｌのリバースプライマー（１０μＭ）を加え、サーマルサイクラー（GeneAmpR PCR
System9700；Applied Biosystems社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。チューブ＃１は内部標準であるβ－アクチン遺伝子、チューブ＃２はヒトＩｇＧ重鎖領域遺伝子、チューブ＃３はヒトＩｇＧ軽鎖κ領域遺伝子、チューブ＃４はヒトＩｇＧ軽鎖λ領域遺伝子のＰＣＲ反応に用いた。
　各チューブのＰＣＲ反応条件を以下に示す。
　チューブ＃１：９４℃・５分間、（９４℃・１５秒、６８℃・２分間）ｘ５５サイクル、７２℃・５分間
　チューブ＃２及び＃３：９４℃・５分間、（９４℃・１５秒、６８℃・１分間）ｘ５５サイクル、７２℃・５分間
　チューブ＃４：９４℃・５分間、（９４℃・１５秒、６０℃・３０秒）ｘ４０サイクル、７２℃・５分間
　ＰＣＲ反応後、得られた反応液を、１．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチヂウムブロマイド染色によりバンドを確認した。ヒトＩｇＧ領域遺伝子領域増幅用プライマーセットにより増幅されたＰＣＲ産物のバンドの大きさを確認し、各プライマーセットにつき２サンプルずつ、ＤＮＡをゲルから抽出精製した。具体的には、メスでＰＣＲ反応チューブ＃２、＃３、及び＃４の増幅バンド部分のゲルを切り出し、１．５ｍｌサンプルチューブに移し、切り出したゲルを秤量した。１ｍｇ＝１μｌと換算し、３倍量のＢｕｆｆｅｒＱＸ１及び１７．２μｌのＱＩＡＥＸIIＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎを加えた。Vortexにてよく混和してから、予め５０℃に設定しておいたヒートブロック上に置き、２分ごとにVortexにかけ、合計１０分間処理した。次いで、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を取り除いた。再度、沈殿に５００μｌのＢｕｆｆｅｒＱＸ１を加えた後、vortexにて混和し、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行った。上清を取り除き、予めエタノールを加えておいた５００μｌのＢｕｆｆｅｒＰＥを沈殿に加えてからvortexにて混和し、室温・１００００×ｇで１分間遠心後、上清を取り除いた。再度、１００００×ｇを沈殿に加えてからvortexにて混和し、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を取り除いた。サンプルチューブをクリーンベンチ内で蓋を開けたまま１５分間置き、沈殿を乾燥させた。沈殿に２０μｌのＢｕｆｆｅｒＰＥ（MinEluteTM Reaction
Cleanup Kit；QIAGEN社製)を加えてvortexにて混和し、室温に５分間置いた。室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を別の１．５ｍｌサンプルチューブに回収し、沈殿に再び２０μｌのＢｕｆｆｅｒＰＥを加えた。Vortexにて混和した後、室温に５分間置き、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、先に回収した上清に加えた。
　計４０μｌの回収液に対して、３００μｌのＢｕｆｆｅｒＥＲＣ（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGE社製)を加え、vortexにて混和した。混和溶液が黄色であることを確認し、２ｍｌcollection tube（MinEluteTM
Reaction Cleanup Kit；QIAGE社製）にセットしたMinElute column（MinEluteTM
Reaction Cleanup Kit；QIAGE社製)の中に全量をアプライし、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行った。流出液を廃棄してから、カラムを再びcollection
tubeに戻し、予めエタノールを加えておい７５０μｌのＢｕｆｆｅｒＰＥを加え、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行った。流出液を廃棄してから、カラムを再度collection
tubeに戻し、室温・２２０００×ｇで１分間遠心を行った。カラムの淵についている液滴をマイクロピペットで取り除き、カラムを新しい１．５ｍｌサンプルチューブにセットした。１０μｌのＢｕｆｆｅｒ ＥＢ（MinEluteTM Reaction
Cleanup Kit；QIAGEN社製）を加え、室温で１分間静置した後、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、精製されたＤＮＡ断片を回収した。
　ＰＣＲ断片を、pCR4-TOPO-TA Plasmid vectorに挿入することによりプラスミドＤＮＡを作製した。ＤＮＡ断片１μｌのSalt Solution ( TOPO TA CloningRKit
for Sequencing；Invitrogen社製）及び１μｌのＴＯＰＯ(R)Ｖｅｃｔｏｒ( TOPO TA CloningRKitfor
Sequencin；Invitrogen社製）を氷上で混和した。室温で５分間反応させた後、再び氷上に戻しTransformationに使用した。プラスミドＤＮＡを、ＤＨ５αコンピテントセル（Competent high DH5α；TOYOBO社製)に導入した。融解したＤＨ５αコンピテントセル２０μｌに、プラスミドＤＮＡを２μｌずつ加え、チップの先で穏やかに混和した。氷上に３０分間置いた後、ヒートブロックを用いて４２℃で３０秒間処理をした。再び、氷上に２分間置き冷却した後、２５０μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間振盪培養を行った。振盪培養を行っている間に、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ固形培地に０．１Ｍ ＩＰＴＧ（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；SIGMA社製）及び０．１ＭＸ－Ｇａｌ（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl
β-D-galactopyranoside；SIGMA社製）を５０μｌずつ塗付した。作製した固形培地に培養したサンプル１００μｌを播き、３７℃で一晩培養した。固定培地にコロニーが出現していることを確認した後、４℃に５時間静置した。白いコロニーをマークしてからチップの先を使って軽くつつき、５０μｌの滅菌水の入った９６ウェルプレートに入れて軽くゆすいだ。サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間処理をした後に、軽く遠心を行い、２μｌを新しいプレートのウェルに入れた。続いて、１μｌの１０ｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒII（Ｍｇ＋）、０．８μｌの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ、６．１１μｌのｄＨ２Ｏ、０．０５μｌのＬＡ－Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa LA-Taq(R) Hot Start
version；タカラバイオ社製）、０．０２μｌの１００μＭ
Ｍ１３フォワードプライマー、及び０．０２μｌの１００μＭ Ｍ１３リバースプライマーを加え、プレートを軽く遠心した。サーマルサイクラーGeneAmp(R) PCRSystem9700を用いて、９４℃で１分間の熱変性の後、９４℃で１０秒、５０℃で１０秒、及び６８℃で２分間の反応を３５サイクル繰り返す反応条件でのＰＣＲ反応を行った。１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動により、各ＰＣＲ反応液のＰＣＲ産物（チューブ＃２：１．６Ｋｂｐ、チューブ＃３：０．９Ｋｂｐ、チューブ＃４：０．９Ｋｂｐ）を確認した。
　ベクターへのＰＣＲ増幅断片の挿入が確認されたコロニーを選び、３．５ｍｌの５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地中で、３７℃で一晩振盪培養を行った。培養したサンプル１．８ｍｌを２ｍｌサンプルチューブに入れ、１０００×ｇで１０分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿に対して２５０μｌのＢｕｆｆｅｒ
Ａ１（NucleoSpin(R)Multi-8 Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）を加えvortexして混和した。続いて、２５０μｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ２を加え転倒混和してから室温で５分間置き、細胞を溶解させた。３５０μｌのＢｕｆｆｅｒ
Ａ３を加え転倒混和し、４℃・１４０００×ｇで１０分間遠心をした。上清をNucleoVac vacuum manifoldにセットしたNucleoSipn(R)
Plasmid Binding Stripsに移した。４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液をsilica
membraneを透過させ、ＤＮＡを結合させた。６００ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＷを加え４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させた後、９００ｍｌのＢｕｆｆｅｒ
Ａ４を加えて、４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させ、silica membraneを洗浄した。再度、９００ｍｌのＢｕｆｆｅｒ
Ａ４を加えて、４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させ、silica membraneを洗浄した。６００ｍｂａｒで１５分間吸引し、silica membraneを乾燥させた。NucleoVac vcuum
manifoldに回収用のNucleoSipnR MN Tube Stripsを付け替え、membraneに１２０μｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＥを加え１分間置き、４００ｍｂａｒで１分間吸引してプラスミドＤＮＡを回収した。回収したプラスミドＤＮＡ液３μｌに、１μｌの１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ、５μｌのｄＨ２Ｏ、及び１μｌのＥｃｏＲＩ（TOYOBO社製）加え、３７℃で１時間処理した。１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動により、酵素反応液中のＤＮＡ消化断片（チューブ＃２：１．４Ｋｂｐ、チューブ＃３：０．７Ｋｂｐ、チューブ＃４：０．７Ｋｂｐ）を確認し、各プラスミドサンプルについて吸光度を測定してＤＮＡ濃度を算出し、１００μｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ希釈液を調製した。
　得られたクローンの配列を、Cycle Sequencing法により決定した。氷上に置いた９６ウェルプレートに実施例１１で調製したＤＮＡ希釈液をチューブ＃２については３ウェル（＃２－１、＃２－２、＃２－３）に、チューブ＃３及び＃４については２ウェル（＃３－１、＃３－２及び＃４－１、＃４－２）にそれぞれ６μｌずつ加えた。続いて、各ウェルに、３μｌの５×Sequencing Buffer （BigDyeRTerminator
v3.1Cycle Sequencing Kit；Applied Biosystem社製)、２μｌのBigDyeR Terminator
Pre mix（BigDyeRTerminatorv3.1 Cycle
Sequencing Kit；Applied Biosystem社製)、８μｌのｄＨ２Ｏ、１μｌの３．２μＭ プライマーを加え、軽く遠心した。
　各サンプルに用いたプライマーは、サンプル＃２－１：Ｍ１３ リバースプライマー、サンプル＃２－２：Ｍ１３ フォワードプライマー、サンプル＃２－３：ＨｕＩＧＣＨ－ｓｅｑ００１、サンプル＃３－１：Ｍ１３
リバースプライマー、サンプル＃３－２：Ｍ１３ フォワードプライマー、サンプル＃４－１：Ｍ１３ リバースプライマー、サンプル＃４－２：Ｍ１３ フォワードプライマーである。サーマルサイクラーGeneAmpR PCR System9700を用いて、９４℃で１分間の熱変性の後、９４℃で１０秒、５０℃で５秒、及び６８℃で４分間の反応を２５サイクル繰り返す反応条件でのＰＣＲ反応を行った。反応が終わるまでに、MultiScreenTMHV-plate（MultiScreenRHV-plate；MILLIPORE社製）のウェルにSephadex G-50（SephadexTMG-50 Superfine；GE
Healthcare社製)、及び滅菌水３００μｌを加え、室温で２時間静置した。十分に水和させた後、室温・１１００×ｇで５分間遠心して、流出液を廃棄した。MultiscreenTM
HV-plateに新しい９６ウェルプレート（ASSAY PLATE 96 well round bottom；IWAKI社製）を付け替え、反応液全量を各ウェルにアプライし、室温、１１００×ｇで５分間遠心してサンプルを回収した。
　精製されたサンプルを全量シークエンサー用の９６ウェルプレート（MicroAmpROptical
96- well Reaction Plate；Applied Biosystem社製）に移し、さらに元のウェルに滅菌水１７．２μｌを加え、ウェルを洗いながら全量を同一のサンプルに加えた。x3130/Genetic
Analyzer（Applied Biosystem社製)を用いて、各サンプルに付いて６～８クローンずつ配列を読み、得られた配列のMultiple alignment解析を行った。クローン間で差があった塩基については、その塩基を有するクローンが多いほうを正しい配列であるとし、各サンプルの塩基配列を決定した。
　上記のクローニングの結果、表１に示すように、５症例（MEL-008、MEL-014、MEL-016、MEL-018Pre、MEL-018Post）のメラノーマ患者由来のＥＢＶ－Ｂ細胞株（１細胞レベル）よりＩｇＧ抗体遺伝子１２クローンを単離することに成功した。そのうち５クローンについて、一本鎖組み換え抗体の発現を確認しており、現在精製段階にある。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［一本鎖組換え抗体ｓｃＦｖタンパクの発現／精製と機能解析］
　MEL-018scFvの発現：実施例５でクローニングされたＩｇＧ遺伝子のうち、＃００８（MEL018Pre）の遺伝子配列を用い、ＩｇＨ鎖およびＩｇＬ鎖の可変領域の遺伝子ＶＨ、ＶＬを一本鎖抗体遺伝子発現用プラスミド（pOZ1、ｐＵＣ１１９由来自作ベクター）に組み込んでMEL-018 scFv（一本鎖組換え抗体）を大腸菌にて発現させた (図４)。抗体遺伝子のＣ末端には、FLAG
tagとHis tagを連結させ、flagはタンパクの検出に、His tagは精製にそれぞれ利用した。大腸菌の培養法を以下に具体的に記載する。２ｘＹＴ培地（アンピシリン）、３７℃，２５０ｒｐｍ，一晩全培養を行い、２ｘＹＴ培地（アンピシリン）、３７℃，２５０ｒｐｍ，４時間本培養を行った。その後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加して発現誘導を行い、さらに２０時間培養した。培養の菌を遠心し（４℃,８０００ｒｐｍ, １０分間）集菌した後、細胞破砕し（BugBuster protein extraction reagent１０ｍｌ、Benzonasenuclease１μｌ；Novagen社にて２５℃、３０分処理）、不溶性画分の遠心除去（４℃、１５０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、上清（大腸菌可溶性画分）を採取した。
　MEL-018 ｓｃＦｖ抗体の精製：His tagを標識に、Ni Sepharoseカラムを用いた金属キレートアフィニティー精製を行った。次に、陰イオン交換クロマトグラフィー（HiTrap QFFカラム）により２段階の精製を実施した。さらに、最終的に精製したMEL-018ｓｃＦｖ抗体の特異性を評価する目的で、ＧＳＴ標識組換えＭＡＧＥ１タンパク（５４３ａａ，５９．７４ｋＤａ）を抗原としてウエスタンブロッティングを行った。精製後の１次抗体（MEL-018 scFv）を１０００倍希釈し、２時間反応させた後、２次抗体（anti-FLAG
M2モノクローナル抗体）を２０００倍希釈し、２時間反応させた。対照コントロール抗体として、マウス抗ヒトＭＡＧＥ１モノクローナル抗体（Abnova社）を使用した。ECLplus試薬（GE Healthcare社製）にて１０分間反応させ、シグナルを検出した。
　以上の実験の結果を図１１に示す。MEL-018ｓｃＦｖ抗体を含む可溶性画分の金属キレートアフィニテイー精製の結果を示す。溶出Fr.２～４に３０ｋｄサイズの抗体タンパクの回収が確認された。また、図１２に示すように、第２段階として陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した結果、溶出Fr.６～９ にｓｃＦｖ抗体が回収された。さらに、図１３に示すように、ウエスタンブロッティングの結果、ｓｃＦｖ抗体はマウス抗体と同様に組換えＭＡＧＥ１タンパクを特異的に認識することが確認できた（６０Ｋｄ付近のバンド)。
［ＥＢＶ－Ｂ細胞の１細胞レベルでのＩｇＧ抗体遺伝子の定量］
　リアルタイムＰＣＲ法により、不死化Ｂ細胞の１細胞レベルでのＩｇＧ抗体遺伝子の定量を行った。ＩｇＧ抗体のＦｃセグメントの保存領域を標的にプローブ(TaqMan)プライマーを設計し、検量線作成用にＦｃセグメントの部分配列のｍＲＮＡをin
vitroにて合成した（図５～７）。同一メラノーマ症例においてＣＤ１９マイクロビーズで分離した通常のＢ細胞と不死化したＢ細胞株それぞれにつき定量リアルタイムＰＣＲ法を実施し、１細胞あたりのβ－アクチンとＩｇＧ遺伝子コピー数を測定し、比較を行った。
　以上のリアルタイムＰＣＲ法による定量の結果を図１４～１６に示す。In vitro合成したβ－アクチンおよびヒトＩｇＧ ｍＲＮＡを段階希釈し、ＰＣＲ増幅を行うことによりそれぞれのコピー数定量に使用する検量線を作成した（図１４）。この検量線から、このリアルタイムＰＣＲ系における、１細胞あたりの定量可能なコピー数は、β－アクチンが１００～５，０００コピーおよびヒトＩｇＧが、１０～２５０コピーであった。メラノーマ患者由来のＥＢ－Ｂ細胞６株を用いて、リアルタイムＰＣＲ解析を行った結果、β－アクチン遺伝子コピー数は、不死化Ｂ細胞では平均１１０．７コピー/cellであり、通常の
Ｂ細胞では増幅されなかったが、１０細胞からの増幅データから換算すると１０コピー前後と推測された（図１５）。一方、ＥＢ－Ｂ細胞のＩｇＧ抗体遺伝子のコピー数は、平均２６５．７コピー/cellであるのに対し、通常のＢ細胞では増幅・検出されなかった。このため同様に1０細胞のデータから換算すると、通常のＢ細胞では平均２３．７個/cellと推測された。以上の結果よりＥＢ－Ｂ細胞におけるＩｇＧ抗体遺伝子のコピー数は、通常のＢ細胞の１０倍以上に増幅されていることが確認された（図１６）。
［不死化していないＢ細胞を用いた１細胞レベルの抗体遺伝子解析］
　がん患者及び健常人から血清を採取し、血清中の抗ＣＭＶｐｐ６５抗原特異的ＩｇＧ抗体価を測定した。結果を図１７に示す。最も抗体価の高かったMEL-SCC007由来のＢ細胞を以降の抗体遺伝子同定に使用した。
　続いて、ＧＳＴ標識ＣＭＶｐｐ６５抗原タンパク質、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ＧＳＴ抗体、及び、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてＢ細胞の染色を行った（図１８）。具体的には、まず、回収したＢ細胞を０．５ｍｌの２％子牛血清及び０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＦＣＳ－ＰＢＳ）を用いて３回洗浄し（２００～４００ｘｇ、４分、４℃）、１．５ｍｌのチューブに５ｘ１０５個の細胞を分注しＦＣＳ－ＰＢＳを用いて２０μｌ容量に合わせた。分注された細胞に１００ｎｇ／２０μｌに調整されたＧＳＴ標識ＣＭＶｐｐ６５抗原タンパク質を２０μｌずつ加え、遮光下、４℃で３０分反応させた。０．５ｍｌのＦＣＳ－ＰＢＳを用いて３回洗浄し（４００ｘｇ、２分、４℃）、１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ４８８標識ウサギ抗ＧＳＴポリクローナル抗体（インビトロジェン社製）を２０μｌ加え、遮光下、４℃で３０分反応させた。次に、ＰＥ標識抗ヒトイムノグロブリン抗体（ＢＤ社製）、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ１９抗体を５μｌずつ加え遮光下、４℃でさらに３０分反応させ、０．５ｍｌのＦＣＳ－ＰＢＳを用いて３回洗浄した後（４００ｘｇ、２分、４℃）、０．５ｍｌのＦＣＳ－ＰＢＳに浮遊させ、フローサイトメーター取込み用の５ｍｌチューブに移した。細胞を取り込むまでの間は氷上、遮光下で保存した。また、必要に応じて、死細胞を区別するために１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを１０μｌ加えた。ＦＡＣＳ－ａｒｉａを用いてＡＰＣ標識抗体、Ａｌｅｘａ４８８標識抗体、及びＰＥ標識抗体の三種類で染まった細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに１細胞ずつ分注した。このようにして、ＣＭＶ抗原／ＩｇＧ抗体の両方に染色されたＢ細胞は、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞全体の０．０４％であり、ＦＡＣＳ－ａｒｉａを用いて単一細胞ソーティングを行った。結果を図１９に示す。ＣＭＶｐｐ６５抗原タンパク１００ｎｇ／１０７細胞で染色した場合、ＣＭＶｐｐ６５＋／ＩｇＧ＋細胞の比率は、０．０４％（ＧＳＴタンパクのみの場合は、０．０１％）であった。ＲＴ－ＰＣＲ用に１細胞ごとに捕獲した細胞は、全部で５７個であった。
［細胞マイクロアレイを用いたＢ細胞の染色同定と捕獲］
　実施例８と同様に、ＣＭＶｐｐ６５に対する血清抗体価の上昇している症例のＢ細胞を使用し、細胞マイクロアレイを用いたＣＶＭｐｐ６５抗原陽性Ｂ細胞の染色同定と捕獲を行った（図２０）。抗ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ５６抗体の組み合わせによるnegative selection（AutoMACS；Miltenyi社製）によりＢ細胞を選別した。０．５～１μＭのＦｌｕｏ－４試薬を３７℃で４０分反応させＢ細胞を染色した。Ｆｌｕｏ－４にて染色されたＢ細胞をマイクロチップ上に添加して１５分間放置し、１細胞ごと各ウェルに入るようにした。バックグラウンド染色を行なうためにＡｌｅｘａ５５５標識ウサギ抗ＧＳＴポリクローナル抗体を添加して４℃で１５分間反応させた。Ａｌｅｘａ５５５とＦｌｕｏ－４の画像データを高感度スキャナー（SC@Scanner、エスシーワールド社製）を用いて取得した。ＧＳＴ標識ＣＭＶｐｐ６５抗原タンパク質を添加し、４℃で１５分間反応させ、再度Ａｌｅｘａ５５５標識ウサギ抗ＧＳＴポリクローナル抗体を添加し、４℃で１５分間反応させた。ここで、Ａｌｅｘａ５５５とＦｌｕｏ－４の画像データを取得した。得られた画像データから解析専用ソフトウェア（TIC-ChipAnalysis、エスシーワールド社製）を用いて解析し、ＣＭＶｐｐ６５抗原（Ａｌｅｘａ５５５）／Ｆｌｕｏ－４でともに染色されたＢ細胞を同定した。自動１細胞捕獲装置（Cell Porter mini；スギノマシン社製）を用いてＰＣＲチューブ内に１細胞ずつ分取した。代表的な結果を図２１に示す。細胞チップ上の２４万個のＣＤ１９＋Ｂリンパ球の中でＣＭＶｐｐ６５（Ａｌｅｘａ５５５）＋／Ｆｌｕｏ－４＋細胞は２０個確認され、そのうち抗原の添加により細胞内カルシウムの増加が見られた細胞が５個であった。ＲＴ－ＰＣＲ用に１細胞ごとに捕獲した細胞は全部で６７個であった。
［単一細胞ＲＴ－ＰＣＲクローニング］
　次に、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲクローニングを行った（図２２、２５）。ここでは、上述の実施例５と比較して以下の４点を改良して単一細胞ＲＴ－ＰＣＲクローニングを行った（図２２）。
１．９６ウェルプレートの各ウェル又はＰＣＲ用０．２ｍｌチューブに、キャリアーとしてYeast transfer
RNAを含む５μｌの滅菌水を加え、分取した生細胞を受けるようにした。
２．細胞が滅菌水に触れた瞬間に浸透圧によって細胞が破裂し、内容物が放出されるので細胞溶解の処理は不要であると考え、ＤＮａｓｅ処理及び細胞溶解処理を省略した。
３．合成したｃＤＮＡ液６μｌを使ってＩＧＨ－ＰＣＲを行った。実施例５の方法では、１μｌ／トータルＰＣＲ反応液３０μｌの条件でしかＰＣＲ反応に持ち込めなかったので、今回の系（６μｌ／トータルＰＣＲ反応液１２μｌ）ではこれまでより検出感度が高くなることが期待できた。
４．特異性・増幅効率を改善するためにＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を採用した。１ｓｔ－ＰＣＲ，２ｎｄ－ＰＣＲ共にEx-taq HotStart verを利用し、１ｓｔ－ＰＣＲでは各レパトワに対応するプライマーは、実施例５と同様のものを用いた。
　単一細胞を直接ターゲットとした逆転写反応は以下のように行った。９６ウェルプレート（MicroAmpＲ Optical 96-ウェル Reaction Plate、Applied Biosystem社製)、或いはＰＣＲ用０．２ｍｌチューブに、キャリアーであるYeast Transfer RNA（Ambion社製)とRNaseOUTTM（Invitrogen社製）を添加した滅菌水５μｌを入れておき、ＦＡＣＳ或いはCell porter miniを用いてsortした細胞を１細胞ずつ分取した。細胞を受けた９６ウェルプレート或いは０．２ｍｌＰＣＲチューブを軽く遠心して氷上におき、各ウェルに、１０ｘＰＣＲｂｕｆｆｅｒII（０．８０μｌ）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（０．４８μｌ）０．１Ｍ ＤＴＴ（０．４０μｌ）、４０Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ（０．１６μｌ）、５０ｍＭ
Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（Invitrogen社製）（０.１６μｌ）、１０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ(０．１６μｌ)、及び、ｄＨ２Ｏ（０．８４μｌ）を加え、サーマルサイクラー（GeneAmpR PCR
System9700；Applied Biosystems社製）を用いて７０℃で９０秒間処理した。熱処理後は、速やかに９６ウェルプレート、或いは０．２ｍｌ　ＰＣＲｔｕｂｅを氷上に移し、２分間静置した。９６ウェルプレート、或いは０．２ｍｌ　ＰＣＲチューブを軽く遠心してから再び氷上に戻し、ＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ（４０Ｕ／μｌ）、０．０５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭIII ＲＴ（２００Ｕ／μｌ；Invitrogen社製）、０．４０μｌ及び１．３５μｌのｄＨ２Ｏを各ウェルに加えてピペッティングで混和した。９６ウェルプレートを軽く遠心してから、サーマルサイクラーを用いて５０℃で５０分間、７０℃で１０分間処理し、ＤＮＡを合成した。さらに、１０ｘＰＣＲｂｕｆｆｅｒＩＩ（０．２０μｌ）、ＭｇＣｌ２（０．１２μｌ）、ＲＮａｓｅＨ（０．３０μｌ；Invitrogen社製）、及び、ｄＨ２Ｏ（１．３８μｌ）を加えてよく混合し、３７℃で１５分間、７０℃で１０分間処理をし、１２μｌ のｃＤＮＡ液を調製した。
［ヒト抗体重鎖領域遺伝子（ＩＧＨ）の１ｓｔＰＣＲ］
　合成したｃＤＮＡ液を鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子（ＩＧＨ）の１ｓｔＰＣＲを以下のように行った。ＰＣＲ用０．２ｍｌチューブを用意し氷上に置き、実施例９で調製したｃＤＮＡ液を６μｌずつ各ＰＣＲ用０．２ｍｌチューブに入れた。続いて、１０ｘＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒＩＩ（２．０μｌ）、２．５ｍＭ ｄＮＴＰＭｉｘ（２．０μｌ）、ｄＨ２Ｏ（１３．８μｌ）、Ex-TaqHotStartversion（０．２μｌ；タカラバイオ社製）、１０μＭフォワードプライマーｍｉｘ［ＨｕＩＧＨＶ＿１～２４］（１．０μｌ）、１０μＭリバースプライマーｍｉｘ［ＨｕＩＧＨＣ＿１～２］（１．０μｌ）を加え、軽く遠心した。ここで使用したヒトＩｇＧ重鎖遺伝子に特異的なプライマーの塩基配列は配列番号１～２６にそれぞれ示される。サーマルサイクラー（GeneAmpR PCR System9700）にＰＣＲ用０．２ｍｌチューブをセットし、（９５℃・１５秒間、６８℃・１分間、７２℃・２分間）ｘ３０サイクル、７２℃・５分間のプログラムで反応を行った。
［ヒト抗体重鎖領域遺伝子（ＩＧＨ）の２ｎｄＰＣＲ］
　上記の１ｓｔＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を鋳型として、さらに２ｎｄＰＣＲを行った。ＰＣＲ用０．２ｍｌチューブを氷上に置き、１ｓｔＰＣＲの反応産物を０．５μｌずつ加えた。続いて、１０ｘＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒＩＩ（２．０μｌ）、２．５ｍＭ
ｄＮＴＰＭｉｘ（２．０μｌ）、ｄＨ２Ｏ（１３．８μｌ）、Ex-TaqHot Start version（０．２μｌ）、１０μＭフォワードプライマーｍｉｘ［Ｍ１３－ＨｕＶＨ＿２０１～２０６］（１．０μｌ）、及び、１０μＭリバースプライマー［Ｍ１３－ＨｕＣＨ＿４０１］（１．０μｌ）を加えて軽く遠心した。上記のプライマー（Ｍ１３－ＨｕＶＨ＿２０１～２０６及びＭ１３－ＨｕＣＨ＿４０１）の塩基配列は図２８及び配列番号６５～７０にそれぞれ示す。サーマルサイクラーにＰＣＲ用０．２ｍｌチューブをセットし、（９５℃・１５秒間、６８℃・１分間、７２℃・１分間）ｘ５０サイクル、７２℃・５分間のプログラムで反応を行った。
［ＰＣＲ産物からのＤＮＡ抽出］
　以上のようにして得られた２ｎｄＰＣＲ反応液を電気泳動により分画して目的のＰＣＲ断片の精製を行った。２ｎｄＰＣＲ反応液を１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ってバンドを分離し、電気泳動後にエチヂウムブロマイド染色したゲルについて、増幅をＵＶで確認した後に増幅バンド部分のゲルを切り出し、１．５ｍｌサンプルチューブに移した。ＩＧＨの増幅が確認出来たクローンについては、以下の実施例１１に示すヒト抗体軽鎖κ及びλ領域遺伝子のＰＣＲ増幅を行い、ヒト抗体重鎖領域とヒト抗体軽鎖κ又はλ領域遺伝子の両方の増幅が確認できたサンプルのＰＣＲ増幅バンドについて精製した。具体的には、切り出したゲルを秤量して１ｍｇ＝１μｌと換算し、ゲルの３倍量に当たるＢｕｆｆｅｒＱＸ１（QIAEXIIRGelExtractionKit；ＱＩＡＧＥＮ社製）とQIAEXIISuspension（MinEluteTMReactionCleanupKit；ＱＩＡＧＥＮ社製）１７．２μｌを加え、Ｖｏｒｔｅｘを用いてよく混和した。予め５０℃に設定しておいたヒートブロック上に置き、２分ごとにＶｏｒｔｅｘにかけ、合計１０分間処理してゲルを完全に溶解させた。溶液が黄色であることを確認し、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を取り除いた。再度、沈殿にＢｕｆｆｅｒＱＸ１を５００μｌ加えてからｖｏｒｔｅｘにて混和し、室温、１００００×ｇで１分間遠心を行った。上清を取り除いた後、５００μｌのＢｕｆｆｅｒＰＥ（QIAEXIIRGelExtractionKit；ＱＩＡＧＥＮ社製）を加え、ｖｏｒｔｅｘにて混和した。室温、１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を取り除き、再度、ＢｕｆｆｅｒＰＥ５００μｌを沈殿に加えてからｖｏｒｔｅｘにて混和し、室温、１００００×ｇで１分間遠心を行った。上清を取り除いた後、サンプルチューブをクリーンベンチ内で蓋を開けたまま１５分間置き、沈殿を乾燥させた。沈殿にＢｕｆｆｅｒＥＢ（MinEluteTMReactionCleanupKit；ＱＩＡＧＥＮ社製）２０μｌを加えてｖｏｒｔｅｘにて混和し、室温に５分間置いた。室温、１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を別の１．５ｍｌサンプルチューブに回収し、沈殿に再びＢｕｆｆｅｒＥＢ２０μｌを加えた。Ｖｏｒｔｅｘにて混和した後室温に５分間置き、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を同じチューブに回収した。計４０μｌの回収液に対して、ＢｕｆｆｅｒＥＲＣ（MinEluteTMReactionCleanupKit；ＱＩＡＧＥＮ社製）３００μｌを加えＶｏｒｔｅｘにて混和した。２ｍｌｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｔｕｂｅ（MinEluteTMReactionCleanupKit；ＱＩＡＧＥＮ社製）にセットしたＭｉｎＥｌｕｔｅｃｏｌｕｍｎ（MinEluteTMReactionCleanupKit；ＱＩＡＧＥＮ社製）の中に全量をアプライし、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行った。流出液を廃棄してから、カラムを再びcollection
tubeに戻し、予めエタノールを加えておいたＢｕｆｆｅｒＰＥ（MinEluteTMReactionCleanupKit；ＱＩＡＧＥＮ社製）７５０μｌを加え、室温、１００００×ｇで１分間遠心を行った。流出液を廃棄してから、カラムを再度collection tubeに戻し、室温・２２０００×ｇで１分間遠心を行った。カラムの淵についている液滴をマイクロピペットで取り除き、カラムを新しい１．５ｍｌサンプルチューブにセットした。ＢｕｆｆｅｒＥＢ（MinEluteTMReactionCleanupKit；ＱＩＡＧＥＮ社製））１０μｌを加え１分間室温に置いてから、室温、１００００×ｇで１分間遠心を行い、精製されたＤＮＡ断片を回収した。
　［ヒト抗体軽鎖κ及びλ領域遺伝子のＰＣＲ増幅実験］
　ＰＣＲ用０．２ｍｌチューブを、１サンプルにつき２本（＃１、＃２）用意し氷上に置き、実施例１０で調製したｃＤＮＡ液を１μｌずつ各ＰＣＲ用０．２ｍｌチューブに入れた。続いて、１０ｘＰＣＲｂｕｆｆｅｒＩＩ（Ｍｇ＋）（１μｌ）、２．５ｍＭ ｄＮＴＰＭｉｘ（１μｌ）、ｄＨ２Ｏ（５．９μｌ）、LA-TaqHotStartversion（TaKaRa LA-TaqR Hot Start version；タカラバイオ社製）（０．１μｌ）、１０μＭフォワードプライマー（０．５μｌ）、及び１０μＭリバースプライマー（０．５μｌ）を加え、軽く遠心した。＃１チューブには軽鎖κ領域増幅用プライマーであるＨｕＩＧＫＶ＿１～１１ｍｉｘ及びＨｕＩＧＫＣ＿１（配列番号２７～３８）を、＃２チューブには軽鎖λ領域増幅用であるＨｕＩＧＬＶ＿１～２３ｍｉｘ及びＨｕＩＧＬＣ＿１～２ｍｉｘ（配列番号３９～６４）を使用した。サーマルサイクラーにＰＣＲ用０．２ｍｌチューブをセットし、９５℃・５分間、（９５℃・３０秒間、６８℃・１分間、７２℃・５分間）ｘ５５サイクルのプログラムで反応を行った。ＰＣＲ終了後、実施例１１と同様の方法で、ＰＣＲ増幅を確認し、同一のクローン由来のＩＧＨとＩＧＫ／Ｌがセットで増幅が確認できたサンプルについてＤＮＡ断片の精製を行った。
　以上のようなｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ法を行うことにより、Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ　ＲＴ－ＰＣＲ法の感度の増加することが明らかとなった。図２２に示す技術改良を行なう前後での１細胞由来の抗体遺伝子のＰＣＲ法の増幅効率を比較した結果を図２３に示す。細胞はＭＥＬ－ＳＣＣ００７由来のＢ細胞であり、ＦＡＣＳＡｒｉａによりsingle cell sortingされたＣＭＶｐｐ６５＋／ＩｇＧ＋細胞である。改良前の方法では、用いた７個の細胞のいずれにおいても増幅は確認されなかったが、実施例１０に示す新法では１２個中１０個の細胞でＩＧＨ抗体遺伝子の増幅に成功しており、効率の改善が確認された。さらに、ＩＧＨの増幅に成功した細胞については、同一のｃＤＮＡより抗体軽鎖領域遺伝子の増幅をあわせて行った（図２５）。同一のＢ細胞で抗体重鎖領域遺伝子（ＩＧＨ）及び抗体軽鎖領域遺伝子（ＩＧＬ）の両方の遺伝子が増幅された細胞を選択し、以下の実験に用いた。
［ＩＧＨレパトワの確認］
　続いて、得られたヒト抗体重鎖遺伝子（ＩＧＨ）ＤＮＡ断片の塩基配列をPCR-Direct Sequence法により確認し、クローニングサンプルを選択した。具体的には、実施例１１で精製したＩＧＨ２ｎｄＰＣＲ断片を、氷上に置いた９６ウェルプレートの２のウェル（＃１、＃２）にそれぞれ２μｌずつ加えた。さらに、5×SequencingBuffer（３μｌ）、BigDyeRTerminatorPremix（BigDyeRTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit；Applied Biosystem社製）（２μｌ）、ｄＨ２Ｏ（１２μｌ）、及び、３．２μＭプライマー（１μｌ）を加え軽く遠心した。サンプル＃１にはＭ１３リバースプライマーを、サンプル＃２にはＭ１３フォワードプライマーを使用した。サーマルサイクラーにＰＣＲ用０．２ｍｌチューブをセットし、９５℃・１分間、（９５℃・１０秒間、５０℃・５秒間、６８℃・４分間）ｘ２４サイクルのプログラムで反応を行った。反応が終わるまでに、MultiScreenTMHV-plate（MILLIPORE社製）のウェルにSephadex G-50（GE Healthcare社製）と滅菌水３００μｌを加え、室温で２間静置した。十分に水和させた後に、室温、１１００×ｇで５分間遠心して流出液を廃棄した。MultiscreenTMHV-plateに新しい９６ウェル Assay plate（IWAKI社製）を付け替え、先に反応させたサンプルを各ウェルに全量アプライし、室温、１１００×ｇで５分間遠心してサンプルを回収した。精製されたサンプルを全量シークエンサー用の９６ウェルプレートに移した。さらに元のウェルに滅菌水17.2μｌを加え、ウェルを洗いながら全量を９６ウェルプレートに移し、ＤＮＡシークエンサー（x3130/Genetic Analyzer；Applied Biosystem社製）を用いて配列を決定した。配列を決定した後にV-QUEST（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/）を利用して登録されているレパトワとのアラインメント解析を行い、クローンのＩＧＨレパトワ及びＣＤＲ－３配列を決定した。以上のようにして決定されたＩＧＨレパトワ及びＣＤＲ－３配列の情報を基にして、重複するＩＧＨレパトワとＣＤＲ－３配列を持つクローンを除外し、残りのクローンから以下に示す方法でクローニングを行った。
［クローニング］
　まず、TOPOR TA PCRクローニングキット・シークエンシング用（Invitrogen社製）を使用してPCR断片とpCR4.0-TA Plasmid vectorを連結させた。具体的には、５００μｌサンプルチューブを氷上に置き、実施例１０で得られたＤＮＡ断片４μｌと１μｌのSalt Solution、1μｌのPlasmid vectorを加えてピペッティングにより混和した。室温で５分間反応させ、再び氷上に戻しトランスフォーメーションに使用した。DH5α Competent cell（TOYOBO社製）を氷上で融解し、２０μｌずつ別のサンプルチューブに分注した。ここに、上記のPlasmid vector反応液を２μｌずつ加え、チップの先で穏やかに混和した。氷上に３０分間置いた後、ヒートブロックを用いて４２℃で３０秒間処理をした。氷上に２分間置き冷却した後、２５０μｌのSOC mediumを加え、３７℃で１時間振盪培養を行った。培養したサンプル１００μｌを、０．１Ｍ ＩＰＴＧ（SIGMA社製）及び０．１Ｍ Ｘ－Ｇａｌ（SIGMA社製）を５０μｌずつ塗付した２ｘＹＴ／Ｋｍプレートにまき、３７℃でオーバーナイト培養した。
　白色コロニーを選択して３．５ｍｌの２ｘＹＴ／Ｋｍ液体培地に植菌し、３７℃でオーバーナイト振盪培養を行った。培養後の培養液１．８ｍｌを２ｍｌサンプルチューブに入れ、１０００×ｇで１０分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿に対して２５０μｌのＢｕｆｆｅｒＡ１（NucleoSpinR Multi-8 Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）を加え、ｖｏｒｔｅｘにて混和した。さらに、２５０μｌのＢｕｆｆｅｒＡ２（NucleoSpinR Multi-8
Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）を加え、転倒混和してから室温で５分間置き、細胞を溶解させた。３５０μｌのＢｕｆｆｅｒＡ３（NucleoSpinR Multi-8
Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）を加えて後転倒混和し、４℃、１４０００×ｇで１０分間遠心をした。上清を回収し、NucleoVac vacuum manifoldにセットしたNucleoSipnR
Plasmid Binding Strips（NucleoSpinR Multi-8
Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）に移した。４００ｍｂａｒで１分間吸引して、silica membraneにＤＮＡを結合させた。６００ｍｌのＢｕｆｆｅｒＡＷ（NucleoSpinR
Multi-8 Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）を加え４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させた後、９００ｍｌのＢｕｆｆｅｒＡ４（NucleoSpinR Multi-8 Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）を加えて４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させてmembraneを洗浄した。さらに、９００ｍｌのＢｕｆｆｅｒＡ４を加えて、４００ｍｂａｒで1分間吸引して溶液を透過させることにより再度membraneを洗浄した。membraneを乾燥させた後、Vcuum manifoldに回収用のNucleoSipnR MN Tube Strips（NucleoSpinR
Multi-8 Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）を付け替え、１２０μｌのＢｕｆｆｅｒＡＥ（NucleoSpinR Multi-8
Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）を加え１分間静置し、４００ｍｂａｒで１分間吸引してプラスミドＤＮＡを回収した。回収したプラスミドＤＮＡ溶液3μｌに対して、１０×Ｈバッファー（１μｌ）、ｄＨ２Ｏ（５μｌ）、及び、1μｌのＥｃｏＲＩ（TOYOBO社製）を加え、３７℃で１時間処理した。この制限酵素反応液を１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動により分画し、インサート（ＩＧＨ：０．５ｋｂｐ、ＩＧＫ／Ｌ：０．７ｋｂｐ）が確認されたクローンをシークエンス解析を行うサンプルとして選択した。各サンプルは吸光度を測定してＤＮＡ濃度を算出し、１００ｎｇ／μｌ プラスミドＤＮＡ溶液を調製した。
［プラスミドＤＮＡの配列決定］
　Cycle Sequencing法によりPlasmid
DNAの塩基配列を決定した。具体的には、調製したプラスミドＤＮＡ希釈液を、氷上に置いた９６ウェルプレートにＩＧＨについては３ウェル（＃１．＃２．＃３）に、ＩＧＫ／Ｌについては２ウェル（＃４．＃５）にそれぞれ６μｌずつ加えた。続いて、5 x Sequencing Buffer（３μｌ）、BigDyeR Terminator Pre mix（２μｌ）、ｄＨ２Ｏ（８μｌ）、３．２μＭプライマー（１μｌ）を加えて軽く遠心した。３．２μＭプライマーとサンプル＃の組み合わせは以下の通りである。
＃１：Ｔ７ｐプライマー
＃２：ＨｕＩＧＣＨ－ｓｅｑ００１プライマー
＃３：Ｔ３ｐプライマー
＃４：Ｍ１３リバースプライマー
＃５：Ｍ１３フォワードプライマー
　サーマルサイクラーに９６ウェルプレートをセットし、９４℃・１分間（９４℃・１０秒間、５０℃・５秒間、６８℃・４分間）ｘ２５サイクルのプログラムで反応を行った。反応が終わるまでに、MultiScreenTMHV-plateのウェルにSephadex
G-50を入れ、滅菌水３００μｌを加え、室温で２時間置いた。十分に水和させたら、室温、１１００×ｇで５分間遠心して流出液を廃棄した。MultiscreenTMHV-plateに新しい９６ウェルアッセイプレートを付け替え、ＰＣＲ反応液を各ウェルに全量アプライし、室温、１１００×ｇで５分間遠心してサンプルを回収した。精製されたサンプルを全量シークエンサー用の９６ウェルプレートに移し、さらに元のウェルに滅菌水１７．２μｌを加え、ウェルを洗いながら全量を９６ウェルプレートに移した。配列の解析はx3130/Genetic
Analyzerにより行った。各サンプルに付いて６～８クローンずつ配列を読み、得られた配列のMultiple
alignment解析を行い、クローン間で差があった塩基については、その塩基を有するクローンが多いほうを正しい配列であるとし、各サンプルの塩基配列を決定した。
　以上の実験の結果、単一細胞ソーティング法にて捕獲した５７個の細胞中ＩＧＨ／Ｌの両方の抗体遺伝子のクローニングに成功した細胞が８個であった（図２６）。また、細胞マイクロアレイを使用した場合、捕獲した６７個の細胞のうち成功例は２個であった。単一細胞ソーティング法にて成功例が多かった理由としてＢ細胞の染色行程においてＩｇＧ陽性細胞の選別を行なっていたためと考えられた。
　ＣＭＶｐｐ６５抗原特異的ＩｇＧ抗体遺伝子のレパトワ、ＣＤＲ３、及び、全長の配列解析の結果を図２７、３０～４４に示す。ＩＧＨ／Ｌの両方の抗体遺伝子のクローニングに成功した合計１０クローンのうち機能的な配列が確認されたものは８クローンであった。６個は単一細胞ソーティング法由来であり、２個は細胞マイクロアレイ由来のＢ細胞であった。使用されたレパトワの解析では、ＩＧＨおよびＩＧＬともにすべて異なる種類のfamilyが使用されていた（図２７）。クローニングされた各ｃＤＮＡのＩＧＨおよびＩＧＬの配列の全長は、図２９－４４及び配列番号７１～８６に示す。

Claims (15)

  1. 以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法。
    （Ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
    （Ｂ）得られた末梢血単核球からエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ－Ｂ細胞）株を作製する工程；
    （Ｃ）標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、ＥＢＶ－Ｂ細胞を標識化する工程；
    （Ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＥＢＶ－Ｂ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
    （Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
    （Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
    （Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
  2. 以下の（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子の解析・同定方法。
    （ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
    （ｃ）得られた末梢血単核球に含まれるＢ細胞を、標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより標識化する工程；
    （ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
    （ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
    （ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
    （ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
  3. ヒトが、担がん患者であることを特徴とする請求項１又は２記載の解析・同定方法。
  4. 抗原が、がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクであることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の解析・同定方法。
  5. がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクが、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ１、tyrosinase、又はｇｐ１００であることを特徴とする請求項４記載の解析・同定方法。
  6. 以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法。
    （Ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
    （Ｂ）得られた末梢血単核球からエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ－Ｂ細胞）株を作製する工程；
    （Ｃ）標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、ＥＢＶ－Ｂ細胞を標識化する工程；
    （Ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＥＢＶ－Ｂ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
    （Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
    （Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
    （Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程； 
  7. 以下の（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体を製造する方法。
    （ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
    （ｃ）得られた末梢血単核球に含まれるＢ細胞を、標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより標識化する工程；
    （ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
    （ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
    （ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
    （ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程； 
  8. ヒトが、担がん患者であることを特徴とする請求項６又は７記載の抗体を製造する方法。
  9. 抗原が、がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクであることを特徴とする請求項６～８のいずれかに記載の抗体を製造する方法。
  10. がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクが、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ１、tyrosinase、又はｇｐ１００であることを特徴とする請求項９記載の抗体を製造する方法。
  11. 以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法。
    （Ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
    （Ｂ）得られた末梢血単核球からエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ－Ｂ細胞）株を作製する工程；
    （Ｃ）標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、ＥＢＶ－Ｂ細胞を標識化する工程；
    （Ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＥＢＶ－Ｂ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
    （Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
    （Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
  12. 以下の（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、ヒト由来の１個のＢ細胞の抗体遺伝子を調製する方法。
    （ａ）ヒトから得られる末梢血より末梢血単核球を採取する工程；
    （ｃ）得られた末梢血単核球に含まれるＢ細胞を、標識物質により標識された抗原と、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより標識化する工程；
    （ｄ）前記抗原を認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
    （ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
    （ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
  13. ヒトが、担がん患者であることを特徴とする請求項１１又は１２記載の抗体遺伝子を調製する方法。
  14. 抗原が、がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクであることを特徴とする請求項１１～１３のいずれかに記載の抗体遺伝子を調製する方法。
  15. がん特異的抗原ペプチド又はがん特異的抗原タンパクが、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＲＴ１、tyrosinase、又はｇｐ１００であることを特徴とする請求項１４記載の抗体遺伝子を調製する方法。
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