JP2004121237A - 体外免疫末梢血リンパ球を用いた抗原特異的抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】 末梢血リンパ球を体外免疫することによる抗体産生応答の誘導方法や、迅速かつ効率よく任意の抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体を作製する方法や、従来のファージディスプレイ法、特に未感作ヒト末梢血リンパ球を用いたファージディスプレイ法と比較して高効率かつ短期間に抗原特異的抗体遺伝子を取得する方法を提供すること。
【解決手段】　ヒト末梢血リンパ球を分離後、ＣＤ１１ｃ特異的抗体およびマグネチックビーズを用いＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去し、体外免疫を行い、抗原特異的ヒト抗体産生応答を誘導し、体外免疫後のリンパ球をファージディスプレイ法に供し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体可変領域遺伝子を取得し、得られたヒトモノクローナル抗体可変領域遺伝子を、動物細胞発現ベクターに挿入し、異種タンパク質高発現ホスト細胞株に導入し発現させることで、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を大量に生産する。

Description

　本発明は、末梢血リンパ球を体外免疫することによる抗体産生応答の誘導方法や、かかる誘導方法を利用した、抗原特異的抗体産生Ｂ細胞又はハイブリドーマの調製・作製方法、抗原特異的抗体遺伝子の取得方法、抗原特異的抗体の製造方法に関する。

　免疫系において重要な働きをしている抗体を産生するリンパ球には寿命があり、無限には増殖できない。ハイブリドーマ作製法はガン細胞との細胞融合により、リンパ球の有限寿命を克服する技術である。抗体はタンパク質等の相互に類似した物質を特異的に識別できるタンパク質であり、生体内では抗原特異的液性免疫に関与している。かかる抗体の中でも、ヒト型モノクローナル抗体は人体に投与しても有害な免疫反応を引き起こさないため、ガンやアレルギー等の診断・治療のための高分子医薬として期待されている。従来のヒトモノクローナル抗体作製技術としては、１）マウスを用い作製したマウスモノクローナル抗体のキメラ化（定常領域のヒト化）やヒト化（ＣＤＲ以外はすべてヒト化）、２）ヒト染色体を導入したマウスを用いたヒト型抗体の産生、３）未感作ヒト末梢血リンパ球を用いたファージディスプレイ法などが広く知られている。１）では、ヒト疾患治療への応用のためには、マウス由来の抗原性を完全に消失させる必要があるが、それは非常に困難で、また膨大な費用と時間のかかる作業となる。２）では、得られる抗体は基本的にヒト抗体ではあるが、マウスで作製されることによる新たな抗原性の獲得の可能性などの問題がある。３）では比較的容易に抗体が得られるものの、その効率が低く、膨大な数のスクリーニングを行う必要性が生じるなどの問題がある。また、得られた抗体遺伝子を動物細胞に導入し、大量生産するために、これまで多くの場合ＣＨＯ細胞が用いられてきたが、その発現量は非常に低いものであった。

　本発明者らは融合効率の高い親細胞株を開発し、従来困難とされていたヒト−ヒトハイブリドーマを多数作製することに成功し、ガン細胞を特異的に認識するヒト型モノクローナル抗体を用いたガン関連抗原の探索や遺伝子工学及び細胞工学的手法を用いた抗体機能の改変を行ってきた。また、ヒトに対する人為的免疫感作は困難なことから、試験管内で免疫感作を行い、任意の抗原に対する特異的ヒト型モノクローナル抗体を作製する効率的な体外免疫法を開発し、コメアレルゲン特異的なヒト型モノクローナル抗体を作製した。例えば、免疫細胞、特にNK細胞とマクロファージに選択的にアポトーシスを誘導するため、遅延型過敏症（リュウマチなど）の薬剤になりうると期待されている生理活性物質であるＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル（ＬＬＭＥ）の存在下において末梢血リンパ球をインビトロで抗原感作して体外免疫を行うと、末梢血リンパ球細胞に抗原特異的抗体の産生応答を誘導することができること（非特許文献１参照）や、溶解性抗原を用いたインビトロでの免疫化は、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、インターロイキン２及びインターロイキン４を添加することによって効果的に生じること（非特許文献２参照）や、ＣＨＯ細胞から誘導された異種タンパク質高発現ホスト細胞株Ras clone I（非特許文献３参照）について報告している。
E. Lindner-Olsson et al.「Animal Cell technology: From Target to Market」Kluwer Academic Publisher, 2001, p.171-174 Cytotechnology 31, 131-139, 1999 Cytotechnology 35, 9-16, 2001

　本発明の課題は、末梢血リンパ球を体外免疫することによる抗体産生応答の誘導方法や、迅速かつ効率よく任意の抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体を作製する方法や、従来のファージディスプレイ法、特に未感作ヒト末梢血リンパ球を用いたファージディスプレイ法と比較して高効率かつ短期間に抗原特異的抗体遺伝子を取得する方法を提供することにある。

　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル（ＬＬＭＥ）の標的細胞が、末梢血リンパ球中のナチュラルキラー細胞（ＣＤ５６陽性）、ＣＤ８陽性細胞、ＣＤ１１ｃ陽性細胞であることを明かにし、その中で、ＣＤ１１ｃ陽性細胞が体外免疫を抑制することを明らかにした。また、このＣＤ１１ｃ陽性細胞を抗ＣＤ１１ｃ陽性抗体の結合したマグネチックビーズ等の薬剤で除去するか、あるいは抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いたセルソーティング法などで除去することで、ＬＬＭＥ未処理時での体外免疫の効率およびインビトロにおける抗原感作に対する免疫応答能が、ＬＬＭＥ処理時に比較しても飛躍的に増大することを見い出した。さらに、このＣＤ１１ｃ陽性細胞は、体外免疫時の抗原感作（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ムラミルジペプチドおよび抗原存在下での培養）により、ＣＤ１１ｃ陽性細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４処理することによって誘導される未熟樹状細胞と同等の細胞に分化し、免疫応答・体外免疫を抑制していることを明かにし、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去したリンパ球を用いた体外免疫時に、ＩＬ−１０を共存させることで、さらなる体外免疫の高効率化が可能となることを見い出した。また、上記改良型体外免疫法と、従来から抗体遺伝子取得技術として知られるファージディスプレイ法を組み合わせることで、高効率的に、そして短期間でモノクローナル抗体の取得を可能とし、得られた抗原特異的抗体可変領域遺伝子を、動物細胞発現ベクターに挿入後、異種タンパク質高発現ホスト細胞株として樹立したRas clone I細胞に導入することで、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を大量生産しうることを見い出した。

　本発明者らは、以上の知見に基づいて、ヒト末梢血リンパ球を分離後、ＣＤ１１ｃ特異的抗体およびマグネチックビーズを用いＣＤ１１陽性細胞を除去し、常法により体外免疫を行い、抗原特異的ヒト抗体産生応答を誘導し、体外免疫後のリンパ球をファージディスプレイ法に供し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体可変領域遺伝子の取得を行い、得られた抗原特異的ヒトモノクローナル抗体可変領域遺伝子を、動物細胞発現ベクターに挿入し、異種タンパク質高発現ホスト細胞株（Ras clone I）に導入し発現させることで、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を大量に生産可能であると見い出し、本発明を完成するに至った。

　すなわち本発明は、マクロファージ及び単球を除去した末梢血リンパ球細胞を、インビトロで抗原感作することにより体外免疫し、末梢血リンパ球細胞に抗原特異的抗体の産生応答を誘導することを特徴とする抗体産生応答の誘導方法（請求項１）や、マクロファージ及び単球を除去した末梢血リンパ球細胞が、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去した末梢血リンパ球細胞であることを特徴とする請求項１記載の抗体産生応答の誘導方法（請求項２）や、末梢血リンパ球細胞が、ヒト由来の末梢血リンパ球細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗体産生応答の誘導方法（請求項３）や、抗原特異的抗体がヒト型抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法（請求項４）や、インビトロでの抗原感作を、インターロイキン１０の存在下で行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法（請求項５）や、感作抗原として、ペプチド抗原を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法（請求項６）や、感作抗原として、ペプチド抗原とキーホールリンペットヘモシアニンとの複合体を用い行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法（請求項７）や、ペプチド抗原が、未感作外来抗原由来であることを特徴とする請求項６又は７記載の抗体産生応答の誘導方法（請求項８）や、ペプチド抗原が、感作外来抗原由来であることを特徴とする請求項６又は７記載の抗体産生応答の誘導方法（請求項９）や、ペプチド抗原が、自己抗原由来であることを特徴とする請求項６又は７記載の抗体産生応答の誘導方法（請求項１０）に関する。

　また本発明は、請求項１〜１０のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞を、エプスタインバールウィルスにより不死化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離することを特徴とする抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の調製方法（請求項１１）や、請求項１１記載の調製方法により得られる抗原特異的抗体産生Ｂ細胞を培養することを特徴とする抗原特異的抗体の製造方法（請求項１２）や、請求項１１記載の調製方法により得られる抗原特異的抗体産生Ｂ細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子の増幅を行うことを特徴とする抗原特異的抗体遺伝子の取得方法（請求項１３）や、請求項１〜１０のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞を、ミエローマ細胞と細胞融合することを特徴とする抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法（請求項１４）や、請求項１〜１０のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞を、エプスタインバールウィルスにより不死化し、単離した抗原特異的Ｂ細胞をミエローマ細胞と細胞融合することを特徴とする抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法（請求項１５）や、請求項１４又は１５記載の作製方法により得られる抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを培養することを特徴とする抗原特異的抗体の製造方法（請求項１６）や、請求項１４又は１５記載の作製方法により得られる抗原特異的抗体産生ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子の増幅を行うことを特徴とする抗原特異的抗体遺伝子の取得方法（請求項１７）や、体外免疫法により抗原特異的抗体産生応答を誘導した末梢血リンパ球細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子の増幅し、得られたＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を合成リンカーで結合することを特徴とする抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）遺伝子の取得方法（請求項１８）や、請求項１〜１０のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子を増幅し、得られたＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を合成リンカーで結合することを特徴とする抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）遺伝子の取得方法（請求項１９）や、請求項１８若しくは１９記載の取得方法により得られる抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）遺伝子をファージミドベクターにクローニングすることを特徴とする抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）の作製方法（請求項２０）に関する。

　さらに本発明は、請求項１３若しくは１７記載の取得方法により得られる抗原特異的抗体遺伝子、又は請求項１８又は１９記載の取得方法により得られる抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞が産生する抗原特異的抗体を採取することを特徴とする抗原特異的抗体の製造方法（請求項２１）や、発現ベクターとして動物細胞発現ベクターを、宿主細胞として動物細胞を用いることを特徴とする請求項２１記載の抗原特異的抗体の製造方法（請求項２２）や、動物細胞が、異種タンパク質高発現ホスト細胞株であることを特徴とする請求項２２記載の抗原特異的抗体の製造方法（請求項２３）や、異種タンパク質高発現ホスト細胞株がRas clone Iであることを特徴とする請求項２３記載の抗原特異的抗体の製造方法（請求項２４）や、ヒト化抗体であることを特徴とする請求項２１〜２４のいずれか記載の抗原特異的抗体の製造方法（請求項２５）や、ＩｇＧ型又はＩｇＥ型であることを特徴とする請求項２１〜２５のいずれか記載の抗原特異的抗体の製造方法（請求項２６）や、ｓｃＦｖであることを特徴とする請求項２１〜２６のいずれか記載の抗原特異的抗体の製造方法（請求項２７）に関する。

　本発明によると、末梢血リンパ球を体外免疫することにより抗体産生応答を誘導することができ、また、迅速かつ効率よく任意の抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体を作製することができ、従来のファージディスプレイ法、特に未感作ヒト末梢血リンパ球を用いたファージディスプレイ法と比較して高効率かつ短期間に抗原特異的抗体遺伝子を取得することができる。

　本発明の抗体産生応答の誘導方法としては、マクロファージ及び単球を除去した末梢血リンパ球細胞を、インビトロで抗原感作することにより体外免疫し、末梢血リンパ球細胞に抗原特異的抗体の産生応答を誘導する方法であれば特に制限されるものではなく、末梢血リンパ球細胞に抗原特異的抗体の産生応答が誘導されたかどうか、すなわち、マクロファージ及び単球を除去した末梢血リンパ球細胞中のＢ細胞の抗原特異的抗体産生応答が増強されたかどうかは、例えば、ペルオキシターゼ標識抗ヒトＩｇＭ抗体やＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により確認することができる。

　マクロファージ及び単球を除去した末梢血リンパ球細胞の調製方法としては、例えばヒトから採血した全血から常法により分画した末梢血リンパ球細胞から、マクロファージ及び単球を物理的に取り除くことができる方法であれば特に制限されないが、マクロファージ、単球、樹状細胞に発現するＣＤ１１ｃに対する標識化抗体（ＰＥ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体の結合したマグネチックビーズなど）やマクロファージ、単球に発現するＣＤ１４に対する標識化抗体（ＰＥ標識抗ＣＤ１４抗体の結合したマグネチックビーズなど）を用いる方法を具体的に例示することができる。

　また、インビトロでの抗原感作に際しては、ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−１０，ムラミルジペプチド等のサイトカインやアジュバントの存在下、コメアレルゲン，ダニ抽出物，ハウスダスト，スギ花粉，カゼイン，オボアルブミン，ウイルスタンパク，細菌細胞膜成分，腫瘍抗原，各種ペプチド抗原と、マクロファージ及び単球を除去した末梢血リンパ球細胞とを、３７℃、５％ＣＯ₂条件下でインキュベーションすることが好ましい。上記ＩＬ−２濃度としては１〜１００Ｕ／ｍｌが、ＩＬ−４濃度としては１〜１００ｎｇ／ｍｌが、ＩＬ−１０濃度としては２〜２００ｎｇ／ｍｌが、ムラミルジペプチド濃度としては１〜１００μｇ／ｍｌが好ましく、抗原の濃度としては抗原の種類にもよるが１〜１００μｇ／ｍｌが好ましい。上記ペプチド抗原としては、微生物毒素由来のペプチド等の未感作外来抗原（ヒトがこれまでに接触したことがないと考えられる外来抗原、）由来のもの、食物抗原由来のペプチド等の感作外来抗原（ヒトが持ち合わせてはいないが、日々取り入れている外来抗原）由来のもの、ヒトサイトカイン由来のペプチド等の自己抗原（ヒトが持ち合わせている抗原）由来のものを例示することができる。また、感作抗原としてペプチド抗原を用いる場合、抗原性を増強するために、ペプチド抗原をキーホールリンペットヘモシアニン等の抗原性増強物質との複合体として用いることができる。

　本発明の抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の調製方法としては、上記本発明の抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞とエプスタインバールウィルス（ＥＢＶ）とを培養し、末梢血リンパ球細胞をＥＢＶにより不死化し、目的の抗原に対する抗体活性をＥＬＩＳＡ法でスクリーニングすることにより抗原特異的Ｂ細胞を単離する方法であれば特に制限されず、また、本発明の抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法としては、上記本発明の抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞をミエローマ細胞と常法により細胞融合する方法や、上記本発明の抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞をＥＢＶにより不死化し、単離した抗原特異的Ｂ細胞をミエローマ細胞と常法により細胞融合する方法を例示することができる。上記ミエローマ細胞として、マウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株を好適に例示することができる。

　本発明の抗原特異的抗体の製造方法としては、上記本発明の抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の調製方法により得られる抗原特異的抗体産生Ｂ細胞をＢ細胞培養用培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下培養し、培地から抗原特異的抗体、好ましくは抗原特異的モノクローナル抗体を採取する方法を挙げることができる。また、本発明の抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法により得られるハイブリドーマを用いる本発明の抗原特異的抗体の製造方法としては、前記抗原特異的抗体産生ハイブリドーマをハイブリドーマ培養用培地で３７℃、５％ＣＯ₂条件下培養し、培地から抗原特異的モノクローナル抗体を採取する方法を挙げることができる。上記Ｂ細胞培養用培地やハイブリドーマ培養用培地としては、ＩＭＤＭ／Ｆ１２，ＩＭＤＭ／Ｆ１２／ｌ−１５，ＲＰＭＩ１６４０，ＤＭＥ／Ｆ１２等を挙げることができる。

　本発明の抗原特異的抗体遺伝子の取得方法としては、上記本発明の抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の調製方法により得られる抗原特異的抗体産生Ｂ細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により抗体可変領域遺伝子の増幅を行う方法や、上記本発明の抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法により得られるハイブリドーマからＲＴ−ＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子の増幅を行う方法を挙げることができる。ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーは、多様な抗原特異的抗体遺伝子が得られるように、多種類用いることが好ましい。

　本発明の抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）遺伝子の取得方法としては、体外免疫法により抗原特異的抗体産生応答を誘導した末梢血リンパ球細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子を増幅し、得られたＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を合成リンカーで結合する方法であれば特に制限されるものでなく、上記体外免疫法により抗原特異的抗体産生応答を誘導した末梢血リンパ球細胞としては、前記本発明の抗体産生応答の誘導方法により得られる末梢血リンパ球細胞や、インビトロでＬＬＭＥにより前処理を行った末梢血リンパ球細胞を具体的に例示することができる。また、ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーは、多様な抗原特異的抗体遺伝子が得られるように、多種類用いることが好ましい。

　本発明の抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）の作製方法としては、上記ｓｃＦＶ遺伝子の取得方法により得られるｓｃＦＶ遺伝子をファージミドベクターにクローニングする方法であれば特に制限されるものではないが、かかるファージ抗体を濃縮するために、実施例記載のようなパンニングを複数回繰り返すことが好ましい。また、上記ファージミドベクターとしては、環状一本鎖ＤＮＡファージＭ１３系ベクターを好適に例示することができる。

　本発明の抗原特異的抗体の製造方法としては、前記本発明の抗原特異的抗体遺伝子の取得方法により得られる抗原特異的抗体遺伝子、又は前記本発明のｓｃＦＶ遺伝子の取得方法により得られるｓｃＦＶ遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞が産生する抗原特異的抗体を採取する方法であれば特に制限されるものではなく、発現ベクターとしては、上記抗原特異的抗体を宿主細胞内で発現させることができるベクターであればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来するベクター、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができるが、動物細胞発現ベクターが好ましい。これら発現ベクターは、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。

　また、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができるが、動物細胞が好ましく、中でもRas clone I等の異種タンパク質高発現ホスト細胞株が特に好ましい。そして、本発明の抗原特異的抗体は、異なる抗原エピトープを特異的に認識する二機能性抗体であってもよいが、ＩｇＧ型又はＩｇＥ型等のヒト化抗体やｓｃＦｖであることが好ましい。

　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［材料及び方法］

体外免疫法による抗原特異的ヒト抗体産生の誘導法
（ヒト末梢血リンパ球の分離）
　ヘパリン入り真空採血管を用いて健常人から採血し、等量のＰＢＳで希釈し、よく混和した。あらかじめ５０ｍｌ遠心管にリンパ球分離液（Lymphocyte separation medium：ＬＳＭ）を１５ｍｌずつ分注し、その上に希釈した血液２５ｍｌをＬＳＭと血液の境界面を乱さないように静かに重層した。続いて、室温にて４００×ｇで３０分間遠心した。ＬＳＭと血漿の境界に白い帯状に浮遊する末梢血単核球層を、パスツールピペットを用いて、血清でコーティングした５０ｍｌ遠心管に回収した。回収した単核球懸濁液の３倍以上のＥＲＤＦ培地を加え、よく混和し、２００×ｇで５分間遠心した。得られた細胞のペレットをＥＲＤＦ培地に再懸濁し、２００×ｇで５分間遠心した。この洗浄操作を血小板の混入がなくなるまで２〜３回繰り返した。

（Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル処理）
　１×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度になるように末梢血単核球をＥＲＤＦ培地に懸濁した後、終濃度が０．２５ｍＭになるようにＬ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル（ＬＬＭＥ）を添加し、時折攪拌しながら室温で２０分間処理した。処理した細胞をＥＲＤＦ培地で３回洗浄し、ＬＬＭＥを除去した後、体外免疫に用いた。

（ＣＤ１１ｃ陽性細胞の分離）
　単球の分離にはＰＥ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体(IMMUNOTECH社製)およびMACS Anti-PEマイクロビーズ(Miltenyi Biotec社製)を用い、分離にはMiltenyi Biotec社製のＭＳ陽性カラムを使用した。また、Separation Buffer（ＳＢ）として２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを脱気し、冷却後使用した。次いで、細胞数が５×１０⁵ｃｅｌｌｓになるように調整し、細胞を１００μｌの５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。ＰＥ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体試薬２μｌを加え、よく懸濁した後、２〜８℃で１０分間反応させた。ＰＢＳ１ｍｌを加え８００×ｇで５分間遠心した後、上清を完全に吸引除去した。次に、全細胞数１×１０⁷ｃｅｌｌｓに対し８０μｌの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した後、２０μｌのMACS Anti-PEマイクロビーズを加え、６〜１２℃で１５分間反応させた。反応終了後、１ｍｌのＳＢを加えよく混和した後、３，０００×ｇで１分間遠心した。上清を完全に除去した後、５００μｌのＳＢを加え、細胞液中にできるだけ気泡が入らないように注意しながら、細胞を温和にほぐした。次に、ＭＡＣＳにカラムとチューブをセットした後、ＳＢを流しカラムに充填させ、ネガティブフラクション回収用チューブをセットした後、サンプルをカラムにアプライした。その後５００μｌのＳＢで３回洗浄し、通過してきたネガティブフラクションであるＣＤ１１ｃ陰性細胞を回収した。また、カラムをマグネットから外し、ＳＢを注入してプランジャーで押し出すことにより、カラムに保持されているポジティブフラクションであるＣＤ１１ｃ陽性細胞を溶出した。なお、抗体のキャッピングを防ぐために、必ず脱気した冷たい緩衝液を使用し、細胞も冷却した状態で取り扱った。緩衝液やマイクロビーズの量は、標識細胞数が１×１０⁷ｃｅｌｌｓ以下の場合は上記条件のままで行い、それを超える場合は比例計算にて算出した量を使用した。

（抗原感作）
　抗原感作は、末梢血単核球を１穴あたり０．５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように２４穴プレートに播種し、ＩＬ−２（１，１０，５０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４（１，１０，５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＭＤＰ（１０μｇ／ｍｌ）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ）および抗原としてコメアレルゲン(１０μｇ／ｍｌ)を添加した培地で７日間培養することで行った。なお、すべての培養には３７℃、５％ＣＯ₂条件下、１０％非働化ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むＥＲＤＦ培地を用いた。コメアレルゲンは、市販米より松田らの方法（Agric. Biol. Chem., 52: 1465 (1988), Agric. Biol.Chem., 55: 509 (1991)）により調製した。

（感作ペプチド抗原）
　感作抗原として、可溶性抗原の全長タンパク質体及びより汎用性の広いペプチド体を感作抗原として用いて、体外免疫による抗原特異的抗体産生応答の誘導の可能性について検証した。可溶性抗原の全長タンパク質体として、１０μｇ／ｍｌのコレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ；List Biological Laboratories, Inc.）、１０μｇ／ｍｌの上記コメアレルゲン（ＲＡ）、及び１μｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα；Pepro Tech EC. LTD.）を用いた。ペプチド抗原としては、１０μｇ／ｍｌのコレラトキシンＢサブユニット由来のペプチドＣＴＢｐｅｐ（ＣＳＱＫＫＡＩＥＲＭＫＤＴＬＲ；配列番号１）、１０μｇ／ｍｌのコメアレルゲン由来のペプチドＲＡｐｅｐ（ＣＶＧＲＡＳＡＡＤＥＱ；配列番号２）、０．１μｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子α由来のペプチドＴＮＦαｐｅｐ（ＣＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡ；配列番号３）を用いた。また、１０μｇ／ｍｌのＣＴＢｐｅｐとキーホルリンペットヘモシアニンとの複合体ＣＴＢｐｅｐ−ＫＬＨ、１０μｇ／ｍｌのＲＡｐｅｐとキーホルリンペットヘモシアニンとの複合体ＲＡｐｅｐ−ＫＬＨ、１μｇ／ｍｌのＴＮＦαｐｅｐとキーホルリンペットヘモシアニンとの複合体ＴＮＦαｐｅｐ−ＫＬＨを用いた。上記ペプチド抗原及びペプチド抗原−キーホールリンペットヘモシアニン複合体は、いずれもSigma Genosys Japan Co.Ltd.から購入した。抗原感作は、末梢血単核球を１穴あたり０．５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように２４穴プレートに播種し、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４（１ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＭＤＰ（１０μｇ／ｍｌ）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ）および上記ペプチド抗原等を添加した培地で７日間培養することで行った。すべての培養には３７℃、５％ＣＯ₂条件下、１０％非働化ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンを含むＥＲＤＦ培地を用いた。なお、抗原未感作のものをコントロールとした。

（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）
　抗体産生量は、酵素免疫測定法あるいは抗ヒトＩｇＧ抗体、検出抗体としてはペルオキシターゼ標識抗ヒトＩｇＭ抗体あるいは、ＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて行った。まず、９６穴イムノプレートに５０ｍＭ炭酸緩衝液で１，０００倍希釈した抗ヒトＩｇＭ抗体あるいは抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μｌずつ分注し、４℃で一晩静置することによって一次抗体をイムノプレートに吸着させた。その後、非吸着の一次抗体を除くために、ＴＰＢＳ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ)で３回洗浄した。次に、サンプルの非特異的吸着を防ぐために１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ(１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ)を各穴に３００μｌずつ添加し、３７℃で２時間静置することによりブロッキングを行った。さらに、ＴＰＢＳで３回洗浄後、適宜希釈した各サンプルを１００μｌずつ添加し、３７℃で１時間静置した。サンプルを取り除き、ＴＰＢＳで３回洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２，０００倍希釈したＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＭ抗体あるいは抗ヒトＩｇＧ抗体を各穴に１００μｌずつ添加し、３７℃で１時間静置した。その後、ＴＰＢＳで３回洗浄し、基質０．３ｍｇ／ｍｌ、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩、及び０．０６％ Ｈ₂Ｏ₂を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ４．０)を各穴に１００μｌずつ添加し、３７℃で発色させ、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。スタンダードにはヒトＩｇＭあるいはヒトＩｇＧを用い、検量線(０〜１００ｎｇ／ｍｌ)を作製することによってサンプルの抗体濃度を測定した。なお、ＩｇＥ抗体の検出には、一次抗体として１，０００倍希釈した抗ヒトＩｇＥ抗体、検出抗体（二次抗体）としては２，０００倍希釈したビオチン標識抗ヒトＩｇＥ抗体および２，０００倍希釈したＰＯＤ標識ストレプトアビジンを用い、発色液にはＡＢＴＳを使用した。

抗原特異的Ｂ細胞株の単離
（Eptein-Barr virus（ＥＢＶ）によるＢ細胞の不死化）
　ＥＢＶ溶液はマーモセットのリンパ球由来のＢ９５−８細胞を１０％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地中で７日間培養した培養上清を用いた。２４穴培養プレート中で体外免疫したリンパ球を滅菌した２ｍｌエッペンドルフチューブにとり、遠心後、培養液を捨て、細胞ペレットにした。これに１ｍｌウイルス溶液を加えて細胞をほぐした後、１５分毎にチューブを軽く振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。その後、４ｍｌの２０％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地と混合し、９６穴プレートに２００μｌずつ分注した後、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で培養した。培養開始後は３〜４日毎に培養上清の半量を新鮮な培養液と交換しながら培養を続けると、２〜３週間後には、ＥＢＶ感染Ｂリンパ芽球による細胞塊が観察されるようになる。培養液の色が１日で黄変するようになったら、培養上清を一部採取し、目的の抗原に対する抗体活性をＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。目的抗原に対して陽性の反応性を示す抗体を含む穴の細胞は、細胞数の増加に伴って２４穴培養プレート、６０ｍｍディッシュ、９０ｍｍディッシュへと順次スケールアップし、細胞株として樹立した。

（ミエローマとの細胞融合によるハイブリドーマの作製）
　親細胞としてはマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株ＲＦ−Ｓ１細胞を用いた。ＲＦ−Ｓ１細胞の培養には１０〜１５％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地を用い、細胞を剥離する際には０．３５％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳを用いた。親細胞株ＲＦ−Ｓ１とＥＢＶ不死化Ｂ細胞株の細胞数が１：２で、かつ、親細胞株の細胞数が０．５〜２×１０⁷個となるようにそれぞれ調整したものを混合し、遠心した後、培養上清を完全に除去した。次に、遠心管の底を軽くたたくことにより、ペレットを遠心管の底部壁面に広げた。予め３７℃に保温しておいた５０％ポリエチレングリコール溶液１ｍｌを、遠心管を手のひらで暖めながら１分間かけてゆっくりと添加した。これを１分間手のひらで保温した後、３７℃に保温しておいたＥＲＤＦ培地を１ｍｌ添加し、さらに、３０秒ごとに１ｍｌずつ、合計９ｍｌのＥＲＤＦ培地を添加した。添加終了後、１，２００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを３７℃に保温しておいた１５％ ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地に、親細胞の細胞数にして２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液を、９６穴プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ₂条件下で一晩培養し、翌日、２倍濃度のＨＡＴ−Ｕ培地を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。ＲＦ−Ｓ１と融合しなかったＥＢＶ不死化Ｂ細胞はウアバインの影響で死滅するため、融合した細胞のみが選択される。その後、３−４日毎に半量ずつ新鮮なＨＡＴ培地に交換し、２−３週間後、ハイブリドーマが出現してきたら、培地をＨＡＴ培地からＨＴ培地に切り替えた。ハイブリドーマが各穴の８０％程度に増殖した時点で、スクリーニングを行った。

ファージディスプレイ法による抗原特異的抗体可変領域遺伝子の取得
（全ＲＮＡの抽出）
　体外免疫を行って８日間培養した細胞を回収し、SIGMA社製Genelute Mammalian Total RNA Kitを用いてＲＮＡ抽出を行った。

（ｃＤＮＡの合成）
　ＲＮＡ１〜５μｇ分にオリゴｄＴ１μｌ(０．５μｇ)、およびＤＥＰＣ水を加え１４μｌにし、７０℃で５分間インキュベートした。次に氷上に５分間置き、５×ＲＴバッファー５μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス１．２５μｌ、ＤＥＰＣ水４．２５μｌ、逆転写酵素０．５μｌを加えてよく混和し、４０℃で１０分間、５５℃で５０分間、７０℃で１５分間反応させてｃＤＮＡを合成した。

（ＰＣＲによる抗体可変領域遺伝子の増幅）
　合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨおよびＶＬ(κおよびλ)のそれぞれに特異的なプライマーを用いて抗体可変領域遺伝子の増幅を行った。滅菌蒸留水で１０倍希釈したｃＤＮＡ５μｌに対し、ＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子の各ファミリーについてフォワード側、リバース側の２種類のプライマー(５ｐｍｏｌ／μｌ)をそれぞれ５μｌずつ、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅを４μｌ、滅菌蒸留水を２５．７５μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを０．２５μｌずつ順次加えて混和し、サーマルサイクラーにセットした。９４℃３分間変性反応後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間の反応を１０サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の反応を１０サイクル、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で２分間の反応を１５サイクルおこない、反応終了後は１５℃に保温するように設定した。反応終了後、２％アガロースゲルにアプライし、３０分の電気泳動の後エチジウムブロマイドを用いて染色し、デザインナイフで目的のバンドを切り出して、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて精製した。なお、ＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子各ファミリーの増幅に用いた可変領域増幅用プライマーの塩基配列（配列番号４〜１９）を表１に示す。

（ＳｃＦｖ ＤＮＡの作製）
　前述の方法により得られたＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子それぞれ１μｌずつに対し、１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅを４μｌ、滅菌蒸留水を３６．７５μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを０．２５μｌずつ加えて混和し、サーマルサイクラーにセットし、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間の反応を７サイクル行って、ＶＨ遺伝子、ＶＬ遺伝子をフレキシブルなリンカーＤＮＡでつないで一本鎖にしたＳｃＦｖ ＤＮＡを作製した。そこへＶＨのリバース側プライマー、ＶＬのフォワード側プライマーを１μｌ(５ｐｍｏｌ／μｌ)ずつ加え、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間の反応を２５サイクル行って、ＳｃＦｖ ＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物は電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kitによって精製した。

（制限酵素処理）
　調製したＳｃＦｖ ＤＮＡは、両末端にSfiI及びNotIの制限酵素処理サイトを有することから、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅへのクローニングに際して、ＳｃＦｖ ＤＮＡおよびベクターの両方についてSfiI及びNotIで制限酵素処理した。反応終了後、２％アガロースゲルで電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kitにより精製した。

（ライゲーション、トランスフォーム）
　ＳｃＦｖ ＤＮＡ１０μｌに対してベクターＤＮＡ １μｌ、DNA Ligation Kit I (ver.2)（TaKaRa社製）を１１μｌ加え、１６℃で１時間インキュベートし、反応液をコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞１ｍｌに加え、氷上に４５分間置き、４２℃のウォーターバスで２分間インキュベートし、氷中で急冷した後３７℃で１時間インキュベートして、その反応液１００μｌをＳＯＢＡＧ ｐｌａｔｅにスプレッドして３０℃で２０〜２４時間インキュベートした。

（ファージ抗体ライブラリーの取得）
　ＳＯＢＡＧ ｐｌａｔｅに得たコロニーを２×ＹＴ培地で洗浄して剥離し、アンピシリン、グルコースを加えて３７℃で１時間振盪培養し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを加えて３７℃で１時間振盪培養し、１，０００×ｇで１０分間遠心し、ペレットを２×ＹＴ−ＡＫ培地でサスペンドし、３７℃で一晩振盪培養した。これを１，０００×ｇで２０分間遠心してファージ抗体を含む上清を回収し、ＰＥＧ−ＮａＣｌを加えて混和し、氷上に３０〜６０分間置いた後１０，０００×ｇで２０分間遠心してファージを沈殿させ、ペレットを２×ＹＴ培地で溶解し、ファージ抗体ライブラリーを得た。

（パニング）
　抗原１０μｇを含むＰＢＳをＴ−ｆｌａｓｋに加えて室温で２時間インキュベートして抗原を吸着させ、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％スキムミルクを含むＰＢＳ（blocking buffer）を加えて室温１時間ブロッキングを行った。ファージ抗体ライブラリーにblocking bufferを加えて室温１５分間インキュベートし、この反応液をブロッキングの終了したＴ−ｆｌａｓｋに加えて３７℃で２時間反応させた。反応後のＴ−ｆｌａｓｋをＰＢＳで２０回、０．１％ ＴＰＢＳで２０回洗浄し、そこへ対数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞を加えて３７℃で１時間振盪培養した。アンピシリン、グルコース、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを加えてさらに３７℃で１時間振盪培養し、１，０００×ｇで１０分間遠心してペレットを２×ＹＴ−ＡＫ培地でサスペンドし、３７℃で一晩振盪培養した。これを１，０００×ｇで２０分間遠心してファージ抗体を含む上清を回収し、ＰＥＧ−ＮａＣｌを加えてよく混和し、氷上に３０〜６０分間置いたあと１０，０００×ｇで２０分間遠心してファージを沈殿させ、ペレットを２×ＹＴ培地で溶解して抗原特異的ファージ抗体ライブラリーを得た。この一連のパニングの操作を３〜５回繰り返し、抗原特異的ファージ抗体が十分に濃縮されたところで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ細胞の再感染をおこなった。

（Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ細胞の再感染）
　パニング後、抗原特異的ファージ抗体が結合しているＴ−ｆｌａｓｋに、対数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ細胞を加えて３７℃で１時間インキュベートして再感染を行った。この反応液をＳＯＢＡＧ ｐｌａｔｅにスプレッドし、３０℃で一晩インキュベートした。生えてきたコロニーをピックアップして、２×ＹＴ−ＡＧ培地が入った９６ ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに一つずつ入れ、３０℃で一晩振盪培養した。これをＭａｓｔｅｒ Ｐｌａｔｅとする。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを含む２×ＹＴ−ＡＧ培地が入った９６ ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅをあらたに用意し、Ｍａｓｔｅｒ Ｐｌａｔｅ培養液の一部をそこへ分注した。３７℃で２時間振盪培養した後、１，５００×ｇで２０分間遠心して上清を廃棄し、２×ＹＴ−ＡＫ培地を加えて３７℃で一晩振盪培養した。これを１，５００×ｇで２０分間遠心し、モノクローナルなファージ抗体を含む上清を回収した。

（ＥＬＩＳＡによるスクリーニング）
　抗原を１μｇ／ｍｌになるように５０ｍＭ炭酸緩衝液で希釈し、９６ｗｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅに１００μｌずつ分注し、４℃で一晩静置することによって抗原を吸着させた。非吸着の抗原を除くためにＴＰＢＳで３回洗浄した。次に１％ ＢＳＡを含むＰＢＳを３００μｌずつ分注し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。さらにＴＰＢＳで３回洗浄後、ＰＢＳを２０μｌずつ分注し、各サンプル(ファージ抗体)を８０μｌずつ分注し、３７℃で２時間反応させた。ＴＰＢＳで３回洗浄後、ＨＲＰ標識抗Ｍ１３ファージ抗体を１％ ＢＳＡを含むＰＢＳで２０００倍希釈したものを１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間反応させた。その後ＴＰＢＳで３回洗浄し、ＡＢＴＳを含む発色液を１００μｌずつ分注し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。発色が確認されたサンプル、すなわち抗原に特異的なファージ抗体を含むサンプルについて、以降の操作を行った。

（抗原特異的可変領域遺伝子の取得）
　ＥＬＩＳＡで発色が確認されたファージ抗体を対数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞に感染させ、ＳＯＢＡＧ ｐｌａｔｅにスプレッドし、コロニーをピックアップしてアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、QIAprep Spin Miniprep Kitを用いてプラスミド抽出を行った。このプラスミドを鋳型としてＶＨとＶＬを増幅するＰＣＲを行い、ＶＨはｐＳｅｃＴａｇ２Ａ、ＶＬはｐＩＲＥＳ−ｂｌｅｏに組み換え、動物細胞へのトランスフェクションをおこなった。ＰＣＲに用いたｓｃＦＶからの可変領域遺伝子取得用のプライマー（配列番号２０〜２５）を表２に示す。また、ＰＣＲの反応条件は、はじめにＶＨ、ＶＬ遺伝子を増幅したときと同じ条件でおこなった。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルにて電気泳動後、キットで精製した。

（抗体Ｈ鎖定常領域遺伝子の調製）
　ハイブリドーマ(ＢＥ２)より、前述の方法にて全ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの作製を行い、ＰＣＲにてヒトＩｇＧ定常領域遺伝子を増幅し、電気泳動、ゲル抽出によって精製した。用いた定常領域増幅用プライマー（配列番号２６、２７）を表３に示す。調製したＤＮＡを、XhoI及びXbaIで制限酵素処理し、ｐＧＥＭに組み込んでシークエンスを確認した、ｐＣＭＶ−Ｐに組み込んで大腸菌で増やし、ApaIおよびHindIIIで制限酵素処理してｐＳｅｃＴａｇ２Ａに組み込み、大腸菌で増やしてプラスミドを抽出、精製してベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＩｇＧｃを作製した。

（Ｈ鎖可変領域遺伝子の組換え）
　調製したＶＨ遺伝子をSfiIおよびNotIで制限酵素処理して、作製したベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＩｇＧｃに組み込み、大腸菌で増やしてプラスミドを抽出、精製して抗体Ｈ鎖遺伝子を含むベクター溶液を調製した。

（抗体Ｌ鎖遺伝子の調製）
　調製したＶＬ遺伝子とＣＬ遺伝子をlinker ligation PCRにて結合して増幅し、抗体Ｌ鎖遺伝子を調製した。用いたプライマー（配列番号２８〜３１）を表４に示す。

（抗体Ｌ鎖遺伝子の組換え）
　調製した抗体Ｌ鎖遺伝子をNotI及びEcoRIで制限酵素処理し、ｐＩＲＥＳ−ｂｌｅｏに組み込んで大腸菌で増やし、プラスミドを抽出、精製して抗体L鎖遺伝子を含むベクター溶液を調製した。

（抗体遺伝子のトランスフェクション）
　作製した抗体Ｌ鎖遺伝子を含むベクターおよび抗体Ｈ鎖遺伝子を含むベクターを、ｒａｓ ｃｌｏｎｅ Ｉ細胞に同時にトランスフェクションし、トランスフェクションはリポフェクトアミン法でおこなった。限界希釈で単クローン化して培養し、ＥＬＩＳＡにて抗体産生を確認し、ヒトＩｇＧ産生細胞を獲得した。

［結果］

体外免疫法において誘導される免疫応答の解析結果
（末梢血リンパ球におけるポピュレーションの変化）
　体外免疫法においては、血液から分離したリンパ球をそのまま用いて抗原感作を行っても抗体産生は誘導されないが、ＬＬＭＥで前処理を行った後に抗原感作を行うと抗体産生が誘導される。そこでまず、ＬＬＭＥ処理前後における、末梢血リンパ球におけるポピュレーションの変化をフローサイトメトリー法により比較したところ、単球画分の細胞が消失し、また、リンパ球画分については、ＮＫ細胞が消失すると同時に、ＣＤ８陽性細胞が減少し、さらにＣＤ４陽性細胞の増加が観察された。そこで、これらの細胞が抗体産生に及ぼす影響について検討した。

（リンパ球画分や単球画分が抗体産生に及ぼす影響）
　まず、リンパ球画分について検討した。ＭＡＣＳｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを用いてＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞、そしてＮＫ細胞はＣＤ５６を用いて除去し、これらのリンパ球を用いて抗体感作を行った。その結果、何れにおいても、抗体産生は全く誘導されなかった。一方、ＣＤ１１ｃを用いて単球を除去した後、抗原感作を行ったところ、ＬＬＭＥ処理リンパ球と同等の抗体産生が誘導されることが明らかとなった。

（クラスター形成の経時的変化）
　次に、抗原添加後のクラスター形成の変化を経時的に観察した。まず、未処理リンパ球では培養初期から、培養プレート全体に小さなクラスターが点在するが、ＬＬＭＥ処理リンパ球ではそのようなクラスター形成は観察されなかった。その後も未処理区ではクラスターは殆ど大きくならず、点在したままであったが、ＬＬＭＥ処理区では培養中期になってようやく、培養後期には肉眼で観察できるほどの大きなクラスターを形成するようになった。また、抗体産生を誘導できなかったＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ５６陽性細胞を除去したリンパ球では、未処理リンパ球と同様のクラスター形成の変化を示したのに対し、抗体産生が誘導されたＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去したリンパ球においては、ＬＬＭＥ処理リンパ球と同様のクラスター形成の変化が観察されました。このクラスターはＣＤ４陽性細胞およびＣＤ１９陽性細胞から構成されていたことから、単球はヘルパーＴ細胞とＢ細胞の相互作用の阻害を通じて抗体産生を抑制しているものと推察された。

（細胞形態の経時的変化）
　さらに細胞の形態変化についても観察したところ、未処理リンパ球においては抗原感作により形態の変化した細胞が観察されるようになるが、ＬＬＭＥ処理リンパ球およびＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去したリンパ球においては、かかる形態の変化した細胞は観察されなかった。

（単球を添加したＬＬＭＥ処理リンパ球からの抗体産生）
　一方、ＬＬＭＥ処理リンパ球にＣＤ１１ｃ陽性細胞を添加した後、抗原感作を行うと、ＬＬＭＥ処理リンパ球からの抗体産生は完全に阻害されることが明らかとなり、またこのとき、ＬＬＭＥ処理リンパ球中には見られなかった形態の変化した細胞がＣＤ１１ｃ陽性細胞を添加したＬＬＭＥ処理リンパ球中には観察されるようになったことから、この形態が変化した細胞はＣＤ１１ｃ陽性細胞、つまり単球由来の細胞であることが推察された。そこで次に、単球画分の細胞の表現型について検討を行った。この細胞は予想通り、単球マーカーであるＣＤ１４を発現しており、また、多くの樹状細胞に発現が認められるＣＤ１１ｃやＭＨＣクラスII分子なども発現していた。同時に、この細胞群は抗原提示細胞の機能発現に重要な接着分子のうちＣＤ８０の発現は見られなかったが、ＣＤ８６、ＣＤ５４、ＣＤ４０といった分子は発現しており、さらに、樹状細胞の活性化マーカーであるＣＤ８３やＣＤ５８を発現していたことから、この細胞は抗原提示能を有する細胞群であることが推察された。

（ＣＤ４の発現）
　また、単球は低発現ながらもＣＤ４を発現していることが知られていることから、この細胞のＣＤ４発現についても調べた。未処理のリンパ球ではＣＤ４発現細胞の中には低発現のものと高発現のものが存在していたが、このうち低発現のものはＬＬＭＥ処理により消失する細胞で、このＣＤ４低発現細胞というのが単球画分の細胞であることが明らかとなった。前述のように、ＣＤ４陽性細胞を除去しても抗体産生の誘導はできなかったが、単球もＣＤ４を発現しているとすると、ビーズによりＣＤ４陽性細胞を除去した場合、単球画分の細胞も同時に除去され、抗体産生が誘導されるようになるのではないかとも考えられるが、ビーズを用いてＣＤ４陽性細胞を除去した場合、確かに単球画分の細胞も一部除去されてはいるものの、完全に除去されるわけではなく、むしろ多くの細胞が除去されないまま残っていた。したがって、ここに残っている単球の作用により抗体産生が阻害されていたものと考えられた。

（抗原感作後の単球の表現型）
　一方、抗原感作による単球画分細胞上の表面抗原発現の変化についても調べた結果、ＭＨＣクラスII分子およびＣＤ８６分子の発現は、抗原感作前後において変化は見られなかったが、抗原感作前には発現が見られなかったＣＤ８０の発現が抗原感作により誘導されていたことから、単球の分化が進んでいることが予想された。しかし、活性化マーカーであるＣＤ８３の発現は低下していたことから、この細胞は未熟な状態あるいは不活性化状態であることが推察された。

　以上のことから、未処理リンパ球においては、ＣＤ１１ｃ陽性細胞である単球画分の細胞によりクラスターの形成、すなわちＴ−Ｂ間相互作用が阻害され、その結果、Ｂ細胞からの抗体産生が抑制されていることが明らかとなった。体外免疫条件下で分化したこの単球画分の細胞は抗原提示細胞様の表現型を示し、また未熟な状態であることから未熟樹状細胞の一種ではないかと推察された。これまで、ＬＬＭＥの効果はＮＫ細胞やＣＤ８発現細胞であるＣＴＬなど、細胞障害活性を有する細胞群を除去することによるもので、また、それらの直接的作用というよりはむしろ、抗体産生反応に有利なサイトカイン環境を整えるという間接的作用であると考えられていたが、ＬＬＭＥ処理の効果は単球を除去することであり、それがインビトロにおいて抗体産生を誘導するために必須の条件であることが明らかとなった。また、樹状細胞の前駆細胞でもある単球が末梢血リンパ球における免疫応答を負に制御する決定的因子であるということは、生体内における末梢血リンパ球の機能や意義を探る上でも非常に重要な結果であると考えられる。

体外免疫末梢血リンパ球を用いた抗原特異的抗体の製造
（ＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去したヒト末梢血リンパ球からの抗体産生の誘導）
　これまでに知られているヒト末梢血リンパ球の体外免疫による抗原特異的抗体産生応答の誘導には、抑制性細胞群を除去するためのＬＬＭＥという試薬を利用してきた。ＬＬＭＥのターゲット細胞を同定していく過程で、ＬＬＭＥのターゲット細胞の一つであるＣＤ１１ｃ陽性細胞が、ヒト末梢血リンパ球の免疫応答を抑制している可能性が考えられた。そこで、ＬＬＭＥ処理をしていない末梢血リンパ球から、マグネチックビーズ法によりＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去し、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去した細胞を用いて体外免疫を行った。その結果、ＬＬＭＥ処理を行うことにより、ヒト末梢血リンパ球からの抗体産生応答を誘導することが可能となったが、ＬＬＭＥ処理をしない末梢血リンパ球でも、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去することで、ＬＬＭＥ処理した末梢血リンパ球と同等の抗体産生応答を誘導することが可能となった（図１）。このことからＬＬＭＥのターゲットはＣＤ１１ｃ陽性細胞であり、ＬＬＭＥ処理により、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去することで初めて抗体産生応答が誘導されること、またＬＬＭＥ処理なしでも、ＣＤ１１ｃ陽性細胞のみを除去するだけでも、抗体産生応答を誘導可能であることが明らかとなった。

（ＣＤ１１ｃ陽性細胞による末梢血リンパ球の抗体産生応答の抑制）
　上記結果から、ＣＤ１１ｃ陽性細胞群が、ヒト末梢血リンパ球の免疫応答を抑制している可能性が考えられた。そこで、実際にＣＤ１１ｃ陽性細胞の免疫応答抑制能を評価した。その結果、ＬＬＭＥ処理により抗体産生応答を誘導することが可能となったヒト末梢血リンパ球に、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を添加することで、抗体産生応答が抑制されることが明らかとなった（図２）。このことから、ＣＤ１１ｃ陽性細胞がヒト末梢血リンパ球中で、抗体産生応答を抑制し、その細胞の除去により抗体産生応答を誘導しうることが明らかとなった。

（ＩＬ−１０による体外免疫における抗体産生応答の増強）
　図３に示すように、ＬＬＭＥ処理したヒト末梢血リンパ球の体外免疫時にＩＬ−１０を共存させておくことで、抗原特異的抗体産生応答が増強されることが明らかとなっている。そこで、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去することで、体外免疫による抗原特異的ヒト抗体産生応答を誘導した場合においても同様に、ＩＬ−１０による体外免疫における抗体産生応答を増強しうるかどうかを調べた。その結果、ＩＬ−１０を添加することで、抗体産生応答の増強が可能である。

（感作ペプチド抗原）
　感作抗原として可溶性抗原の全長タンパク質体に加えて、ペプチドを用いた体外免疫において誘導される免疫応答を解析した（図４）。その結果、非感作外来抗原（コレラトキシンＢサブユニット）、感作外来抗原（コメアレルゲン）、感作自己抗原（腫瘍壊死因子α）由来ペプチド及びそれらペプチドとキーホールリンペットヘモシアニン複合体を感作抗原として用いた体外免疫により、抗原特異的抗体産生応答を誘導できることが明らかとなった。このことから、取り扱いに危険が伴う病原性タンパク質や抗体作製の困難なサイトカイン類、末梢血リンパ球が感作後不応答状態を誘導され抗体作製が困難なアレルゲンタンパク質等に対する抗体も、それらに対応するペプチドを作製し、体外免疫における感作抗原として用いることで、それらの抗原に特異的な抗体が作製可能であることが明らかとなった。

（ファージディスプレイ法による抗原特異的ヒト抗体遺伝子の取得）
　これまでファージディスプレイ法によるヒト抗体遺伝子取得には、抗原により感作を受けていない末梢血リンパ球を用いるのが一般的であった。本実験では、体外免疫により抗原感作を行い、抗原特異的抗体産生応答を誘導したヒト末梢血リンパ球を用い、ファージディスプレイ法により抗原特異的抗体遺伝子を取得することを試みた。その結果、抗原感作を行っていない未感作リンパ球を用いたファージディスプレイ法では、抗原特異性の見られたクローンが、１４４クローン中２クローンであったのに対し、体外免疫により抗原感作を行い、抗原特異的抗体産生応答を誘導したリンパ球を用いファージディスプレイ法を行ったものでは、抗原特性を示すクローンは６クローンに増大し、またその反応性も大幅に増強されていることが明らかとなった（図５）。以上の結果から、未感作リンパ球を用いた場合では非常に低かった抗原特異的抗体遺伝子の取得効率が、体外免疫による抗原感作により、飛躍的に増大し、またそれに伴い抗原特異性の高いクローンの取得が可能であることが明らかとなった。さらに、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去したリンパ球にＩＬ−１０を加えることにより得られる、抗体産生応答を増強したリンパ球を用いることで、さらなる効率化と抗原特異性の増強が可能である。

（抗原特異的ヒト抗体の大量生産）
　上記ファージディスプレイ法により取得した抗原特異的抗体遺伝子より、重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を調製し、別途調製した定常領域遺伝子と遺伝子工学的に連結し、さらに動物細胞発現用ベクターに組み込んだ（図６）。得られたベクターを、異種タンパク質高発現ホスト細胞株（ｒａｓ ｃｌｏｎｅ Ｉ）に導入することで、抗原特異的ヒト抗体の大量生産が可能となる。

ＣＤ１１ｃ陽性細胞（ＣＤ１１ｃ＋細胞）の除去による未処理末梢血リンパ球からの抗体（ＩｇＭ）産生誘導の結果を示す図である。 ＣＤ１１ｃ陽性細胞がＬＬＭＥ処理を行った末梢血リンパ球の体外免疫による抗体（ＩｇＭ）産生を抑制することを示す図である。 体外免疫時に添加するＩＬ−１０が抗体（ＩｇＭ）産生を増強することを示す図である。 ペプチドを感作抗原として用いた体外免疫において誘導される免疫応答の解析結果を示す図である。 組換えファージクローンのダニ抗原に対する反応性を示す図である。 本発明の抗原特異的抗体発現ベクターの構築を説明する図である。

Claims (27)

1. マクロファージ及び単球を除去した末梢血リンパ球細胞を、インビトロで抗原感作することにより体外免疫し、末梢血リンパ球細胞に抗原特異的抗体の産生応答を誘導することを特徴とする抗体産生応答の誘導方法。
2. マクロファージ及び単球を除去した末梢血リンパ球細胞が、ＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去した末梢血リンパ球細胞であることを特徴とする請求項１記載の抗体産生応答の誘導方法。
3. 末梢血リンパ球細胞が、ヒト由来の末梢血リンパ球細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗体産生応答の誘導方法。
4. 抗原特異的抗体がヒト型抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法。
5. インビトロでの抗原感作を、インターロイキン１０の存在下で行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法。
6. 感作抗原として、ペプチド抗原を用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法。
7. 感作抗原として、ペプチド抗原とキーホールリンペットヘモシアニンとの複合体を用い行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法。
8. ペプチド抗原が、未感作外来抗原由来であることを特徴とする請求項６又は７記載の抗体産生応答の誘導方法。
9. ペプチド抗原が、感作外来抗原由来であることを特徴とする請求項６又は７記載の抗体産生応答の誘導方法。
10. ペプチド抗原が、自己抗原由来であることを特徴とする請求項６又は７記載の抗体産生応答の誘導方法。
11. 請求項１〜１０のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞を、エプスタインバールウィルスにより不死化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離することを特徴とする抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の調製方法。
12. 請求項１１記載の調製方法により得られる抗原特異的抗体産生Ｂ細胞を培養することを特徴とする抗原特異的抗体の製造方法。
13. 請求項１１記載の調製方法により得られる抗原特異的抗体産生Ｂ細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子の増幅を行うことを特徴とする抗原特異的抗体遺伝子の取得方法。
14. 請求項１〜１０のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞を、ミエローマ細胞と細胞融合することを特徴とする抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法。
15. 請求項１〜１０のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞を、エプスタインバールウィルスにより不死化し、単離した抗原特異的Ｂ細胞をミエローマ細胞と細胞融合することを特徴とする抗原特異的抗体産生ハイブリドーマの作製方法。
16. 請求項１４又は１５記載の作製方法により得られる抗原特異的抗体産生ハイブリドーマを培養することを特徴とする抗原特異的抗体の製造方法。
17. 請求項１４又は１５記載の作製方法により得られる抗原特異的抗体産生ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子の増幅を行うことを特徴とする抗原特異的抗体遺伝子の取得方法。
18. 体外免疫法により抗原特異的抗体産生応答を誘導した末梢血リンパ球細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子の増幅し、得られたＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を合成リンカーで結合することを特徴とする抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）遺伝子の取得方法。
19. 請求項１〜１０のいずれか記載の抗体産生応答の誘導方法により、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨおよびＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子を増幅し、得られたＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を合成リンカーで結合することを特徴とする抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）遺伝子の取得方法。
20. 請求項１８若しくは１９記載の取得方法により得られる抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）遺伝子をファージミドベクターにクローニングすることを特徴とする抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）の作製方法。
21. 請求項１３若しくは１７記載の取得方法により得られる抗原特異的抗体遺伝子、又は請求項１８又は１９記載の取得方法により得られる抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞に導入し、該宿主細胞が産生する抗原特異的抗体を採取することを特徴とする抗原特異的抗体の製造方法。
22. 発現ベクターとして動物細胞発現ベクターを、宿主細胞として動物細胞を用いることを特徴とする請求項２１記載の抗原特異的抗体の製造方法。
23. 動物細胞が、異種タンパク質高発現ホスト細胞株であることを特徴とする請求項２２記載の抗原特異的抗体の製造方法。
24. 異種タンパク質高発現ホスト細胞株がRas clone Iであることを特徴とする請求項２３記載の抗原特異的抗体の製造方法。
25. ヒト化抗体であることを特徴とする請求項２１〜２４のいずれか記載の抗原特異的抗体の製造方法。
26. ＩｇＧ型又はＩｇＥ型であることを特徴とする請求項２１〜２５のいずれか記載の抗原特異的抗体の製造方法。
27. ｓｃＦｖであることを特徴とする請求項２１〜２６のいずれか記載の抗原特異的抗体の製造方法。

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