CN104165999A - 基于邻位触击效应的均相化学发光免疫分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于邻位触击效应的均相化学发光免疫分析方法。该方法的检测溶液包括DNA1-抗体1偶联物、DNA2-抗体2偶联物、辅助DNA3、辅助DNA4、分子信标DNA5和限制性内切酶。目标蛋白质存在时，DNA1-抗体1与DNA2-抗体2形成夹心免疫复合物，使得分别与DNA1、DNA2杂交的DNA3、DNA4相互靠近，形成邻位触击复合物，与DNA5杂交打开其发卡结构，染料Cy5远离猝灭剂产生化学发光。复合物与DNA5形成的双链还能被内切酶识别，将DNA5剪切后打开新的DNA5，如此循环可在位放大发光，实现对目标蛋白质的高灵敏定量分析。该发明实现了蛋白质快速、一步化检测，操作简单、普适性高。
Description
一、技术领域
本发明为一种基于邻位触击效应的均相化学发光免疫分析方法。利用免疫反应诱导核酸杂交，产生邻位触击效应，生成与发卡式分子信标开关互补的序列，打开分子信标，同时引入内切酶循环策略，产生游离的化学发光染料，在位放大化学发光信号，实现对目标蛋白质的简单、快速、高灵敏测定。
二、背景技术
蛋白质标志物的测定在癌症的研究和诊断中扮演着重要的角色，其床旁检测可以直接用作早期筛选、监测治疗和复发诊断，意义重大。酶联免疫分析法为最常见的免疫检测方法之一，虽然其已推广应用，但由于需要专业人员操作、步骤复杂、所需时间长、试剂消耗多、工作量大、成本昂贵，不适于床旁检测。所以发展简单、快速、准确的免疫分析方法，是床旁检测一直以来所追求的目标。
邻位触击免疫分析是近年来发展起来的一种新型免疫分析方法，其基本分析原理为：用两个或多个连有单链核苷酸的抗体检测目标抗原，一旦抗体与目标抗原结合，抗体连接的单链核苷酸就会被充分拉近，进行杂交反应生成双链DNA，进一步作为模板进行实时PCR放大检测，其后根据DNA的含量间接求得待测抗原的含量。邻位触击效应因采用双识别机制，大大降低了交叉反应，特异性高。此外，与其它免疫分析方法相比，可一步完成检测，无需清洗、分离。但已建立的邻位触击免疫分析方法主要采用实时PCR检测，大大限制了应用。DNA检测的放大手段很多，不必局限于PCR检测，本发明将发卡式分子信标和化学发光检测技术与邻位触击效应结合，设计了一种新的检测方法。这里，化学发光检测技术是以化学反应过程中产生的光为信号进行检测的方法。该方法敏感性高、简便、快速、重复性好，无放射性污染，在常规临床分析和临床研究中都有广泛的应用。
三、发明内容
本发明的内容是：结合邻位触击效应和化学发光检测技术，通过设计发卡式分子信标开关，引入内切酶循环放大策略，提出一种简单、快速、灵敏的一步式均相化学发光免疫分析方法。
本发明通过以下技术方案来实现：
本发明涉及一种基于邻位触击效应的均相化学发光免疫分析方法，如图1所示。其原理在于该方法的检测溶液包含DNA1-抗体1偶联物、DNA2-抗体2偶联物、辅助DNA3、辅助DNA4、分子信标DNA5和限制性内切酶。在目标蛋白质存在时，DNA1-抗体1偶联物与DNA2-抗体2偶联物通过夹心免疫反应形成免疫复合物，同时DNA1与辅助DNA3、DNA2与辅助DNA4互补杂交，使辅助DNA3与辅助DNA4相互靠近，产生邻位触击效应，形成邻位触击复合物，该复合物具有与分子信标DNA5互补的序列，因而与分子信标DNA5杂交，打开其发卡结构。邻位触击复合物与DNA5形成的双链结构能被限制性内切酶识别，将DNA5剪切成超短链DNA，并从复合物上脱落，产生游离的化学发光染料(Cy5)，而该复合物可与另一DNA5进行杂交，打开其发卡结构，并通过限制性内切酶进行第二轮剪切，如此循环，可产生大量游离Cy5。在检测溶液中加入化学发光底物，可获得灵敏的Cy5化学发光信号，实现对目标蛋白质的高灵敏定量分析。
DNA1含有40个碱基，5’端修饰巯基，通过偶联剂琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯，与抗体1上的氨基共价结合，形成DNA1-抗体1偶联物。DNA2含有40个碱基，3’端修饰巯基，通过偶联剂琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯，与抗体2上的氨基共价结合，形成DNA2-抗体2偶联物。
辅助DNA3含有51个碱基，从3’端开始的1-20碱基位点与DNA1的5’端开始的21-40碱基位点的碱基完全互补，从3’端开始的33-40碱基位点与辅助DNA4的5’端开始的33-40碱基位点的碱基完全互补，如图2所示。
辅助DNA4含有49个碱基，从5’端开始的1-20碱基位点与DNA2的3’端开始的21-40碱基位点的碱基完全互补，如图2所示。
分子信标DNA5为发卡结构，含有24个碱基，3’端修饰猝灭剂(BHQ)，5’端修饰Cy5；从5’端开始的6-12及14-20碱基位点的碱基序列都为CCTCAGC，可被限制性内切酶Nt.BbvCI识别，从而剪切其形成的双链；从3’端开始的1-4碱基位点与从5’端开始的1-4碱基位点的碱基完全互补，形成发卡结构，如图3所示。DNA5从5’端开始的4-12碱基位点与辅助DNA4的3’端开始的1-9碱基位点的碱基完全互补，从3’端开始的4-12碱基位点与辅助DNA3的5’端开始的1-9碱基位点的碱基完全互补，如图2所示。
上述发卡型分子信标DNA5上的Cy5与BHQ非常接近，化学发光底物激发Cy5产生的光会立即被BHQ猝灭。
上述检测溶液与含有待测目标蛋白质的样品溶液混合，在37℃恒温箱进行反应后产生大量游离的Cy5，加入化学发光底物过氧化氢和双(2，4，6-三氯苯基)草酰酯的混合物后，与游离的Cy5产生化学发光信号。
上述免疫分析方法的检测步骤如下：
①将样品溶液和检测溶液混合，并在37℃条件下温育30分钟；
②加入化学发光底物，通过化学发光检测仪进行光信号采集；
③从标准曲线求出样品中蛋白质的浓度。
上述步骤①中的样品溶液与检测溶液的体积可以分别是1μL和29μL。
本发明与现有技术相比，具有以下特点：
本发明结合邻位触击效应和化学发光检测技术，通过设计发卡式分子信标，同时引入内切酶循环放大策略，提出一种简单、快速、灵敏的一步式均相化学发光免疫分析方法。相比于现有的免疫分析方法，具有以下特点：
(1)本方法为均相免疫分析方法，可通过样品与检测溶液的直接混合完成蛋白质的一步式检测，无需固体生物识别载体，操作简单，成本低廉，同时大大缩短了分析时间，可在30分钟内完成单个样品的测定。
(2)结合邻位触击效应和化学发光分子信标，通过免疫反应直接诱发分子信标释放信号，无需洗涤及分离纯化步骤。
(3)结合限制性内切酶循环策略，在位进行信号放大，提高检测灵敏度，使其更适于低丰度蛋白质的检测。
(4)利用化学发光检测技术进行分析，不需要外加光源，设备简单。
四、附图说明
图1.基于邻位触击效应的均相化学发光免疫分析方法示意图
图2.邻位触击效应诱导分子信标DNA5打开示意图
图3.分子信标DNA5的结构示意图
五、具体实施方式
实施例1：结合附图1，说明基于邻位触击效应的均相化学发光免疫分析方法对目标蛋白质(癌胚抗原)的检测
(1)配制检测溶液：将DNA1-抗体1偶联物、DNA2-抗体2偶联物、辅助DNA3、辅助DNA4、分子信标DNA5和限制性内切酶混合，使它们的最终浓度分别为0.01mg/mL、0.01mg/mL、80nM、80nM、1μM和70U/mL。
(2)将1μL不同浓度的标准溶液或者含有目标蛋白质(癌胚抗原)的待测溶液与29μL检测溶液混合，37℃条件下温育30分钟。
(3)在温育后的溶液中加入20μL化学发光底物，并立即检测该溶液的化学发光信号，检测参数：增益2，电压950V。根据记录的化学发光值，获得目标蛋白质检测的工作曲线和待测溶液中目标蛋白质的浓度。
Claims (5)
1.本发明涉及一种基于邻位触击效应的均相化学发光免疫分析方法。其特征在于该方法的检测溶液包含DNA1-抗体1偶联物、DNA2-抗体2偶联物、辅助DNA3、辅助DNA4、分子信标DNA5和限制性内切酶。在目标蛋白质存在时，DNA1-抗体1偶联物与DNA2-抗体2偶联物通过夹心免疫反应形成免疫复合物，同时DNA1与辅助DNA3、DNA2与辅助DNA4互补杂交，使辅助DNA3与辅助DNA4相互靠近，产生邻位触击效应，形成邻位触击复合物，该复合物具有与分子信标DNA5互补的序列，因而与分子信标DNA5杂交，打开其发卡结构。邻位触击复合物与DNA5形成的双链结构能被限制性内切酶识别，将DNA5剪切成超短链DNA，并从复合物上脱落，产生游离的化学发光染料(Cy5)，而该复合物可与另一DNA5进行杂交，打开其发卡结构，并通过限制性内切酶进行第二轮剪切，如此循环，可产生大量游离Cy5。在检测溶液中加入化学发光底物，可获得灵敏的Cy5化学发光信号，实现对目标蛋白质的高灵敏定量分析。
2.根据权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的辅助DNA3含有51个碱基，从3’端开始的1-20碱基位点与DNA1的5’端开始的21-40碱基位点完全碱基互补；辅助DNA4含有49个碱基，从5’端开始的1-20碱基位点与DNA2的3’端开始的21-40碱基位点完全碱基互补。
3.根据权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的辅助DNA3从3’端开始的33-40碱基位点与辅助DNA4的5’端开始的33-40碱基位点完全碱基互补；分子信标DNA5含有24个碱基，3’端修饰猝灭剂BHQ，5’端修饰Cy5。DNA5从3’端开始的1-4碱基位点与从5’端开始的1-4碱基位点完全互补，形成发卡结构。
4.根据权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的分子信标DNA5从5’端开始的4-12碱基位点与辅助DNA4的3’端开始的1-9碱基位点完全碱基互补；从3’端开始的4-12碱基位点与辅助DNA3的5’端开始的1-9碱基位点完全碱基互补；而且5’端开始的6-12及14-20碱基位点的碱基序列均为可被限制性内切酶识别的CCTCAGC。
5.根据权利要求1所述的免疫分析方法，其特征在于所述的检测溶液与含有待测目标蛋白质的样品溶液混合，在37℃下温育30分钟后，加入化学发光底物，用化学发光检测仪进行光信号采集，从标准曲线求出样品中蛋白质的浓度。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20180807 Termination date: 20200507 |
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