CN110850103B

CN110850103B - 一种基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白a的试剂盒

Info

Publication number: CN110850103B
Application number: CN201911274526.8A
Authority: CN
Inventors: 曹丹
Original assignee: Nanjing Puguang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Puguang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2039-12-12
Also published as: CN110850103A

Abstract

本发明公开了一种基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其中，所述试剂盒包括DNA1‑fSAA抗原偶联物、DNA2‑fSAA抗体偶联物、标记吖啶酯(AE)的DNA3和氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)。利用本发明的试剂盒进行检测，其操作简单、结果准确、耗时短、精密度高，并且能够定量检测；样本无需稀释，不存在HOOK效应。

Description

一种基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A 的试剂盒

技术领域

本发明涉及化学发光免疫分析法技术领域，特别是涉及一种基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒。

背景技术

血清淀粉样蛋白A(SAA)是一种主要的急性时相蛋白，除了在人体中存在，还发现在其他物种中，包括犬、猫和马等。由于猫CRP未表现出急性期蛋白的作用，与疾病程度不相关，猫SAA(fSAA)成为猫系统炎症敏感标志物的首选。炎症发生一开始SAA浓度显著上升，炎症消退时快速下降，能够实现早期诊断，判断感染程度。因此对猫SAA(fSAA)的研究具有重要的意义。

国内外有部分实验室研发出猫SAA(fSAA)的检测方法，例如酶联免疫吸附实验法，免疫比浊法，荧光免疫层析法等。ELISA由于其检测方法耗时耗力，所以该方法只适合实验室研究，不适合用于临床诊断。免疫比浊法受临床样本干扰因素影响大，结果不准确。荧光免疫层析法属于半定量检测，结果准确度不高。迫切需要精准、快速和定量的猫SAA(fSAA)检测产品，化学发光法是最好的选择，尤其是均相化学发光法。

由此可见，上述现有的猫SAA(fSAA)在检测方法与使用上，显然仍存在有不便与缺陷，而亟待加以进一步改进。为了解决猫SAA的检测方法中存在的问题，相关厂商莫不费尽心思来谋求解决之道，但长久以来一直未见适用的设计被发展完成，而一般方又没有适切的方法能够解决上述问题，此显然是相关业者急欲解决的问题。

有鉴于上述现有的猫SAA的检测方法中存在的缺陷，本发明人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以期创设一种新的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，能够改进一般现有的检测方法，使其更具有实用性。经过不断的研究、设计，并经反复试作及改进后，终于创设出确具实用价值的本发明。

发明内容

本发明的主要目的在于，克服现有的检测方法中存在的缺陷，而提供一种新的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，所要解决的技术问题是使其检测结果精准、快速并且能够定量，从而更加适于实用，且具有产业上的利用价值。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

依据本发明提出的一种基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其中，所述试剂盒包括DNA1-fSAA抗原偶联物、DNA2-fSAA抗体偶联物、标记吖啶酯(AE)的DNA3和氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)。

前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其中，所述DNA1-fSAA抗原偶联物的浓度为1～5nM；所述DNA2-fSAA抗体偶联物的浓度为5～20nM；所述标记吖啶酯(AE)的DNA3的浓度为0.05～0.2μM；以及所述氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)的浓度为20μg/ml。

前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其中，所述DNA1-fSAA抗原偶联物的浓度为2.5nM；所述DNA2-fSAA抗体偶联物的浓度为10nM；所述标记吖啶酯(AE)的DNA3的浓度为0.1μM。

前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其中，所述DNA1含有54个碱基，3’端修饰NH2C7，通过偶联剂二(磺基琥珀)辛二酸(BS3)与fSAA抗原上的氨基共价结合，形成DNA1-fSAA抗原偶联物。

前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其中，所述DNA2含有52个碱基，5’端修饰NH2C6，通过偶联剂BS3与fSAA抗体上的氨基共价结合，形成DNA2-fSAA抗体偶联物。

前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其中，所述DNA3含有21个碱基，5’端修饰吖啶酯衍生物(AE)；所述DNA3从5’端开始的3-10与所述DNA2从3’端开始的3-10碱基位点的碱基互补；所述DNA3从3’端开始的5-12与所述DNA1从5’端开始的3-10碱基位点的碱基互补。

前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其中，所述DNA1与所述DNA2有7个碱基互补。

前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其中，所述DNA3分别有8个碱基与所述DNA1、所述DNA2互补。

前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其中，所述DNA1的序列(5’-3’)如下：ACGCTGAGTTATCAACGACTTTTTTTATCACATCAGGCTCTAGCGTATGCTATTG-NH2C7；

所述DNA2序列(5’-3’)如下：NH2C6-TACGTCCAGAACTTTACCAAACCACACCCTTTTTTTGTCGTTGGCTGAGATTC；

所述DNA3序列(5’-3’)如下：AE-NH2C6-CGATCTCAGCAACTCAGCAGCG。

本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。

依据本发明提出的一种应用如上所述的试剂盒检测猫血清淀粉样蛋白A的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(1)将不同浓度的校准溶液或者含有fSAA全血样本与试剂盒中的检测液按照体积比为1:10的量混合，混合液置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃下温育5min；

(2)在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s，根据记录的化学发光值(RLU)，获得fSAA的校准曲线和待测样本中fSAA的浓度。

借由上述技术方案，本发明(名称)至少具有下列优点：本发明的试剂盒操作简单，可以全血上样，在5分钟左右出检测报告，大大缩短了临床检验标本周转时间(TAT)，适合兽医急诊检测需求。使用本发明的试剂盒在基于均相化学发光免疫竞争法的基础上检测猫血清淀粉样蛋白A，能够实现样品的定量检测，其结果准确，精密度高，耗时短。本发明的样品在进行检测时，无需稀释，不存在HOOK效应。

综上所述，本发明特殊的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，能够有效解决现有技术中检测猫血清淀粉样蛋白A的方法中存在的检测结果准确度不高、灵敏度不够的问题。其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类方法中未见有类似的设计公开发表或使用而确属创新，其不论在方法上或功能上皆有较大的改进，在技术上有较大的进步，并产生了好用及实用的效果，且较现有技术具有增进的多项功效，从而更加适于实用，而具有产业的广泛利用价值，诚为一新颖、进步、实用的新设计。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

本发明的具体方法及组成由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1示出了本发明基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒检测猫血清淀粉样蛋白A的原理图；

图2示出了本发明中DNA3和DNA1、DNA2互补配对图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒其具体实施方式、方法、步骤、结构、特征及其功效，详细说明如后。

如本文所述，本发明的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，其包括DNA1-fSAA抗原偶联物、DNA2-fSAA抗体偶联物、标记吖啶酯(AE)的DNA3和氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)。

其中，DNA1含有54个碱基，3’端修饰NH2C7，通过偶联剂二(磺基琥珀)辛二酸(BS3)与fSAA抗原上的氨基共价结合，形成DNA1-fSAA抗原偶联物；DNA2含有52个碱基，5’端修饰NH2C6，通过偶联剂BS3与fSAA抗体上的氨基共价结合，形成DNA2-fSAA抗体偶联物；DNA3含有21个碱基，5’端修饰吖啶酯衍生物(AE)；DNA3从5’端开始的3-10与DNA2从3’端开始的3-10碱基位点的碱基互补；DNA3从3’端开始的5-12与DNA1从5’端开始的3-10碱基位点的碱基互补。DNA1与DNA2有7个碱基互补；DNA3分别有8个碱基与DNA1、DNA2互补。抗氧化剂(AOD)包括但不限于大麻二酚、维生素C、维生素E、茶多酚、谷胱甘肽等。氧化石墨烯偶联AOD：氧化石墨烯上的羧基通过氧化亚砜缩合剂与AOD上羟基结合；氧化石墨烯上的羧基通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化与AOD上氨基结合。

具体而言，DNA1的序列(5’-3’)如下：ACGCTGAGTTATCAACGACTTTTTTTATCACATCAGGCTCTAGCGTATGCTATTG-NH2C7；DNA2序列(5’-3’)如下：NH2C6-TACGTCCAGAACTTTACCAAACCACACCCTTTTTTTGTCGTTGGCTGAGATTC；DNA3序列(5’-3’)如下：AE-NH2C6-CGATCTCAGCAACTCAGCAGCG。

具体的检测方法如下：

1、将全血//血清/血浆/其它样本和检测试剂混合，并在37℃条件下温育5-10分钟；

2、加入化学发光底物，通过化学发光检测仪中PMT检测模块进行光信号采集；

3、仪器自动调用标准曲线，从而报出样品中物质的浓度。

实施例1

配置检测试剂：将DNA1-fSAA抗原偶联物、DNA2-fSAA抗体偶联物、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为1nM、5nM、0.05μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、5、10、20、50、100、200mg/L)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得fSAA的校准曲线和待测样本中fSAA的浓度。具体结果见表1。

实施例2

配置检测试剂：将DNA1-fSAA抗原偶联物、DNA2-fSAA抗体偶联物、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为5nM、10nM、0.1μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、5、10、20、50、100、200mg/L)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得fSAA的校准曲线和待测样本中fSAA的浓度。具体结果见表1。

实施例3

配置检测试剂：将DNA1-fSAA抗原偶联物、DNA2-fSAA抗体偶联物、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为2.5nM、10nM、0.1μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、5、10、20、50、100、200mg/L)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得fSAA的校准曲线和待测样本中fSAA的浓度。具体结果见表1。

实施例4

配置检测试剂：将DNA1-fSAA抗原偶联物、DNA2-fSAA抗体偶联物、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为5nM、20nM、0.2μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、5、10、20、50、100、200mg/L)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得fSAA的校准曲线和待测样本中fSAA的浓度。具体结果见表1。

表1.不同试剂盒检测液浓度下，不同浓度的标准溶液所得到的RLU(发光值)及信号抑制率数据比较。

基于表1的数据可知，利用本发明的试剂盒并结合均相化学发光免疫竞争法技术，即：在同一检测液的情况下，随着检测样品溶液的浓度的增加，RLU(发光值)呈下降趋势，信号抑制率呈上升趋势；在同一检测样品溶液浓度的情况下，检测液中各物质浓度分别为2.5nM、10nM、0.1μM和20μg/ml的情况下，RLU(发光值)和信号抑制率数据最优。

综上所述，本发明的试剂盒操作简单，可以全血上样，在5分钟左右出检测报告，大大缩短了临床检验标本周转时间(TAT)，适合兽医急诊检测需求。使用本发明的试剂盒在基于均相化学发光免疫竞争法的基础上检测猫血清淀粉样蛋白A，能够实现样品的定量检测，其结果准确，精密度高，耗时短。本发明的样品在进行检测时，无需稀释，不存在HOOK效应。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A（fSAA）的试剂盒，其中，所述试剂盒包括DNA1-fSAA抗原偶联物、DNA2-fSAA抗体偶联物、标记吖啶酯（AE）的DNA3和氧化石墨烯（GO）结合抗氧化剂（AOD）；

所述DNA1的序列（5’-3’）如下：ACＧＣＴＧＡＧＴＴＡＴＣＡＡCＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＡＣＡＴＣＡＧＧＣＴＣＴＡＧＣＧＴＡＴＧＣＴＡＴＴＧ-NH2C7；

所述DNA2序列（5’-3’）如下：NH2C6-ＴＡＣＧＴＣＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＣＣＡＡＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＣGＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴTC；

所述DNA3序列（5’-3’）如下：AE-NH2C6-CGＡＴＣＴＣＡＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧ。

2.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A（fSAA）的试剂盒，其中，所述DNA1-fSAA抗原偶联物的浓度为1～5nM；所述DNA2-fSAA抗体偶联物的浓度为5～20nM；所述标记吖啶酯（AE）的DNA3的浓度为0.05～0.2μM；以及所述氧化石墨烯（GO）结合抗氧化剂（AOD）的浓度为20μg/ml。

3.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A（fSAA）的试剂盒，其中，所述DNA1-fSAA抗原偶联物的浓度为2.5nM；所述DNA2-fSAA抗体偶联物的浓度为10nM；所述标记吖啶酯（AE）的DNA3的浓度为0.1μM。

4.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A（fSAA）的试剂盒，其中，所述DNA1 3’端修饰NH2C7，通过偶联剂二（磺基琥珀）辛二酸（BS3）与fSAA抗原上的氨基共价结合，形成DNA1-fSAA抗原偶联物。

5.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A（fSAA）的试剂盒，其中，所述DNA2 5’端修饰NH2C6，通过偶联剂BS3与fSAA抗体上的氨基共价结合，形成DNA2- fSAA抗体偶联物。

6.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A（fSAA）的试剂盒，其中，所述DNA3 5’端修饰吖啶酯衍生物（AE）；所述DNA3从5’端开始的3-10与所述DNA2从3’端开始的3-10碱基位点的碱基互补；所述DNA3从3’端开始的5-12与所述DNA1从5’端开始的3-10碱基位点的碱基互补。

7.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A（fSAA）的试剂盒，其中，所述DNA1与所述DNA2有7个碱基互补。

8.根据权利要求1所述的基于均相化学发光免疫竞争法检测猫血清淀粉样蛋白A（fSAA）的试剂盒，其中，所述DNA3分别有8个碱基与所述DNA1、所述DNA2互补。

9.一种应用权利要求1-8中任一项所述的试剂盒检测猫血清淀粉样蛋白A（fSAA）的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

（1）将不同浓度的校准溶液或者含有fSAA全血样本与试剂盒中的检测液按照体积比为1:10的量混合，混合液置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃下温育5min；

（2）在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管（PMT）检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s，根据记录的化学发光值（RLU），获得fSAA的校准曲线和待测样本中fSAA的浓度。