CN105675590A - 一种检测内切酶的电化学发光生物传感器及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测内切酶的电化学发光生物传感器及其制备与应用，包括以下步骤：S01.对玻碳电极进行预处理；S02.采用循环伏安法制备金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极；S03.分别制备浓度为1～10μM的Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA信标，和浓度为1～10μM的二茂铁标记的C-DNA信标；S04.将所述步骤S02所得到金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极浸入含有巯基修饰的A-DNA中培育3～6h，然后依次浸入步骤S03所得Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA信标和二茂铁标记的C-DNA信标20～40min。可以用来检测内切酶EcoRI和ApaI。本发明的传感器具有良好的稳定性、重现、对内切酶EcoRI和ApaI具有很高的特异性，不易收到检测样品中其他物质的干扰；灵敏度极强；而且检测时操作简单方便快速，对抗菌抗病毒药物的研发有一定的帮助。

Description

一种检测内切酶的电化学发光生物传感器及其制备与应用
技术领域
本发明涉及分析化学与电化学发光传感器分析领域，具体涉及一种基于金纳米-石墨烯复合材料的检测内切酶的电化学发光生物传感器及其制备方法与应用。
背景技术
内切酶，是一类主要存在原核生物中的核酸。它作为分子剪刀闻名，并用于在特定的位置来剪切磷酸酯键。内切酶已经被广泛用于PCR实验、基因谱、医药化学、催化放大技术等。内切酶在原核生物中起到保护生物内在的基因抵抗外来基因的作用。因此内切酶被认为是在新的抗菌、抗病毒药物的发现领域中重要的目标物质。
目前对内切酶检测的研究的方法包括高效液相发、荧光共振转移、基于金纳米颗粒的比色法等等。虽然这些方法能够很准确的检测内切酶，但是他们都存在一些缺点比如需要复杂的设备，复杂的处理过程，昂贵的价格等等。
电化学发光（ECL）综合了电化学和化学发光的优点即低背景、容易控制和检测，最近已经在生物传感器领域内得到了很好的发展。尤其是基于猝灭或者是增强三联吡啶钌（Ru(bpy)3 2+）/三正丙胺（TPrA）的电化学发光的强度，已经被很好的研究了。
已经有很多方法用来制备石墨烯，在这些方法中化学还原氧化石墨烯（GO）是最方便的方法。这中方法可以得到大量的石墨烯片。然而由于无论是在溶液中还在干粉的石墨烯都很溶液团聚，这个现象大大阻碍了石墨烯的实际应用。在石墨烯片层结构中引入纳米金属，最开始是为了分开单层的石墨烯。然而现在，人们已经认识到在石墨烯上沉积金属纳米颗粒也可能生成新的催化材料、磁性材料、导电材料等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测内切酶的电化学发光生物传感器及其制备与应用一解决目前对内切酶的检测设备和处理过程复杂、价格昂贵等问题。
一种检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
S01.对玻碳电极进行预处理；
S02.采用循环伏安法制备金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极；
S03.分别制备浓度为1～10 μM的 Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA信标，和浓度为1～10 μM的二茂铁标记的C-DNA信标；
S04.将所述步骤S02所得到金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极浸入含有巯基修饰的A-DNA中培育3～6 h，然后依次浸入步骤S03所得Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA信标和二茂铁标记的C-DNA信标20～40min，即得到检测内切酶的电化学发光生物传感器。
用于检测内切酶EcoRI时各DNA序列分别为：巯基修饰的A-DNA序列为5’-SH-(CH2)6-GGGGTTGGGGAAGGGTACGAGG AATTCCGGGTTGGG-3’；所述Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA序列为5’-NH2-(CH2)6-CCCTTCCCCAACCCC-3’；所述二茂铁标记的C-DNA序列为5’-CCCAACCCGG AATTCCT-(CH2)6-NH2-3’。其中A-DNA序列中的GGGGTTGGGGAAGGG和B-DNA互补配对；A-DNA序列中的AGGAATTCCGGGTTGGG-3’ 和C-DNA互补配对，A-DNA序列中的GG AATTCC和 C-DNA序列中的GG AATTCC是内切酶的识别序列。
用于检测内切酶ApaI时各DNA序列分别为：巯基修饰的A-DNA序列为5’-SH-(CH2)6-GGGGTTGGGGAAGGGTACGAG GATCCGGGTTGGG-3’；所述Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA序列为5’-NH2-(CH2)6-CCCTTCCCCAACCCC-3’；所述二茂铁标记的C-DNA序列为5’-CCCAACCCG GATCCT-(CH2)6-NH2-3’。其中A-DNA序列中的GGGGTTGGGGAAGGG和B-DNA互补配对；A-DNA序列中的AGGATCCGGGTTGGG-3’ 和C-DNA互补配对，A-DNA序列中的G GATCC和 C-DNA序列中的G GATCC是内切酶的识别序列。
还可以用其他内切酶的识别序列替换A-DNA和C-DNA中相应内切酶识别序列位置，从而用于检测其他的内切酶。
金纳米-石墨烯复合材料，即有石墨烯所用良好的性质，独特的结构使其具有优异的电学、热学、力学以及化学性质，而且在和金纳米的相互作用下，这些性质有明显的增强。而且金纳米能够提供巯基修饰的DNA分子修饰的位点。在本发明中，电极表面的金纳米和巯基修饰的A-DNA通过Au-S化学键的结合可以有效的固定DNA信标。Ru(bpy)3 2+是一种稳定的、发光效率非常高的发光剂，由于其分子量和分子空间体积较酶等标记小很多，且不影响核酸的特异性和杂交活性，使得Ru(bpy)3 2+在分子水平上对核酸进行标记而成为可能。再加上Ru(bpy)3 2+可在电化学发光反应中进行再生循环反应，使得一个标记物在每一个检测周期中会产生相当数量的光子，因而分析灵敏度很高。在本发明的方法中，利用Ru(bpy)3 2+标记B-DNA不仅不会影响DNA的配对互补，而且还能增强检测反应的灵敏度。二茂铁是一种具有芳香族性质的有机过渡金属化合物，当二茂铁存在时，其通过电子转移使Ru(bpy)3 2+从激发态失活回到基态，无法产生磷光，因此二茂铁可以作为Ru(bpy)3 2+的发光猝灭剂。
通过本发明方法制备的电化学发光生物传感器，由于Ru(bpy)3 2+标记在B-DNA上，二茂铁标记在C-DNA上，A-DNA、B-DNA和C-DNA能够互补形成双链结构，因此二茂铁对Ru(bpy)3 2+发光剂的猝灭得以实现，使得制备的生物传感器处于“光信号关闭”状态。当将该生物传感器浸入内切酶检测液中一定时间后，内切酶会在识别序列处剪断双链结构从而释放二茂铁分子，导致猝灭减弱，该生物传感器转化为“光信号开启”状态，从而实现对内切酶的特异性检测。
Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA溶液的浓度为1～10 μM，二茂铁标记C-DNA溶液的浓度为1～10 μM。如果浓度太低，在电极表面修饰的B-DNA和C-DNA就会太少，当定量检测时信号变化就不大；浓度太大，在电极表面修饰的B-DNA和C-DNA太多增大了空间位阻，内切酶反而不容易进入到体系使信号变化不大。
步骤S01所述对玻碳电极进行预处理方法为：将玻碳电极用α-A12O3抛光粉抛光；洗涤，分别在去离子水和乙醇中超声10 min。
进一步的，所述金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极的制备方法为：采用浓度为0.5～1mgmL-1的氧化石墨烯和20～60mM氯金酸，在-1.5～0.5V的范围内通过循环伏安法金纳米-石墨烯沉积到玻碳电极表面，扫描速度10mVs-1。
进一步的，步骤S03所述Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA的信标的制备方法如下：
S11.将Ru(bpy)2Cl2、碳酸氢钠和2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸混合均匀，加入乙醇-水溶液中加热回流后冷却过滤制备Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2；
S12.将N,N′-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌混合后加入DMF溶液使其充分溶解后加入步骤S11所得Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2中合成Ru(bpy)2(dcbpy)NHS；
S13.将步骤S12所得Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记B-DNA；
S14.将步骤S13所得Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记的B-DNA溶解于pH为7.4的PBS溶液中，即得到所述Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA信标。
进一步的，步骤S03所述二茂铁标记的C-DNA信标的的制备方法如下：
S21.用1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）活化二茂铁甲酸的羧基；
S22.用步骤S21所得活化二茂铁甲酸修饰C-DNA得到二茂铁修饰的C-DNA；
S23.将步骤S22所得二茂铁修饰的C-DNA溶解于pH为7.4的PBS溶液中得到所述的二茂铁标记C-DNA溶液。
进一步的，所述氧化石墨是根据改进的Hummers理论由鳞片石墨制备。
一种上述制备方法得到的检测内切酶的电化学发光生物传感器。
一种检测内切酶的电化学发光生物传感器的应用，包括用于检测内切酶EcoRI和内切酶ApaI。在存在EcoRI或ApaI时，由于EcoRI或ApaI能够特异性的在特定的位置切断DNA分子，从而释放二茂铁分子，Ru(bpy)3 2+电化学发光信号得以恢复。通过电化学发光信号的猝灭和恢复，以及显示强度，可以实现对样品中内切酶EcoRI和ApaI特异性检测。
内切酶的检测方法主要包括以下步骤：
S31.将所述电化学发光生物传感器浸入到待测内切酶溶液中30～50 min，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极；
S32.将所述电化学发光生物传感器作为工作电极在三电极系统中，以0.05～0.1 M三正丙胺溶液作为检测溶液进行电化学及电化学发光检测。
检测内切酶的电化学发光生物传感器对内切酶EcoRI的检出限为5.6×10-5 U mL-1。
与现有技术相比，本发明的方法制备的检测内切酶的电化学发光生物传感器具有如下优点：1）具有良好的稳定性、重现、对内切酶具有很高的特异性，不易收到检测样品中其他物质的干扰；2）利用内切酶对DNA序列特异性的识别以及猝灭剂、发光剂之间高效的应激反应，极大地增加了本发明传感器的灵敏度；3）操作简单方便，能够快速准确检测样品中的EcoRI或ApaI的含量。本发明的电化学发光生物传感器在检测生物、水样中EcoRI或ApaI的含量方面体现出良好的发展前景，内切酶主要存在原核生物中，因此对抗菌抗病毒药物的研发有一定的帮助。
附图说明
图1为发明的电化学发光生物传感器用于检测内切酶的实验原理图；
图2为发明的玻碳电极在不同阶段的在5 mM铁氰化钾/亚铁氰化钾中的循环伏安图；
图3为发明的玻碳电极在不同阶段的电化学阻抗；
图4为发明的生物传感器在的发光强度与培育时间的关系曲线；
图5为发明的生物传感器在不同修饰阶段的电化学发光信号；
图6为发明的生物传感器检测不同浓度内切酶EcoRI的电化学发光信号时，电化学发光强度与内切酶EcoRI浓度的标准曲线图；
图7为发明的生物传感器检测内切酶EcoRI的发光信号一个月前后的变化；
图8为本发明的生物传感器抗干扰性的侧视图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
一种检测内切酶EcoRI的电化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）玻碳电极预处理：玻碳电极经0.05μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，并分别在去离子水和乙醇中超声10 min。采用三电极系统检测，工作电极为玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在0.5 M硫酸中，设置电压为-0.2～1.6 V，对玻碳电极进行循环伏安扫描，检测完毕后，用去离子水冲洗电极，吹干电极表面，备用。
（2）金纳米-石墨烯修饰玻碳电极的制备：在0.5 mgmL-1 氧化石墨（GO）和20mM的氯金酸混合中采用循环伏安法在-1.5V～0.5V，扫描速度10 mVs-1，扫描10圈，金纳米-石墨烯沉积到玻碳电极表面。其中氧化石墨是根据改进的Hummers理论由鳞片石墨制备。
（3）Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA（Ru-B-DNA）溶液的制备:
① Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2的合成：称取0.16 g即0.328 mM的 Ru(bpy)2Cl2、0.16 g碳酸氢钠和0.12 g即0.492 mM 的2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸均匀混合，加入10 mL体积比为4:1的乙醇-水溶液后加热回流4h；回流反应完成后，冰浴冷却7h，冷却过程中，采用1 M盐酸溶液调节反应液pH至4.4以促进反应产生橘红色的结晶沉淀析出；将充分结晶后的反应液进行过滤，得到的结晶用甲醇再次溶解后进行过滤以除去不溶杂质，得到透亮的橘红色滤液；将14 mL的六氟磷酸钠（NaPF6）（2 g）溶液加入到橘红色滤液中，冰浴冷却7h，保证产物能够完全沉淀析出；采用微孔膜过滤所得的沉淀物，并对其进行真空干燥，最终得到的红色粉末状固体即为Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2。
②Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的合成：将0.46 g即2.22 mM的 N,N′-二环己基碳二亚胺（DCC）和0.238 g即2.08 mM N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）搅拌混合，在冰浴条件下加入3 mL DMF溶液使其充分溶解；将溶解液搅拌加入到1 ml含有0.38 g Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2的DMF溶液中，继续常温条件下搅拌5h以最终制备得到具有活性羧基官能团Ru(bpy)2(dcbpy)NHS DMF溶液；取少量产物溶液加入到0.10 M的PBS溶液中进行紫外光谱表征，根据其在279 nm和453 nm处出现特征峰及前期实验工作，换算估计浓度为6.02 × 10-4 M。
③单链B-DNA钌配合物标记： Ru(bpy)2(dcbpy)NHS可以被直接用来标记5’端胺基化的B-DNA（其核苷酸序列为B-DNA: 5’-NH2-(CH2)6-TAC ATG TGG TTG GTG TGG TTG G-3’）。首先，取200μL溶解Ru(bpy)2(dcbpy)NHS的PBS溶液，加入至含有200μL B-DNA溶液（1OD）的5 mL的离心管中，恒温25℃条件下避光低速震荡12h；震荡完成后，将100 μL3 M的醋酸钠溶液和2mL冰无水乙醇加入至反应体系终止反应，在-20℃条件下静置12h；静置完成后，反应混合物在12000 r/min转速下低温离心30 min，小心去除上清液，再用70%的冰无水乙醇漂洗沉淀物2次，每次漂洗完后离心10 min，最终洗去未被DNA结合的Ru(bpy)2(dcbpy)NHS；冷冻干燥后的反应沉淀物即为三联吡啶钌标记后的电化学发光信标Ru-B-DNA。取1.018μg Ru-B-DNA重新溶解于200 μL PBS溶液中，配制成浓度为1μM的Ru(bpy)3 2+标记适配体溶液，进行紫外光谱表征，验证DNA的标记修饰效果，并于-20 ℃条件下保存备用。
（4）二茂铁修饰的C-DNA信标（Fc-C-DNA）
称取20mg咪唑加入到200μL的浓度为1mol/L 的二茂铁甲酸的乙醇溶液中。咪唑完全溶解后，用稀盐酸调节pH到7.0。紧接着将100μL浓度为0.1 mol/L的EDC溶液加入到体系中，搅拌30min。再加入200 μL C-DNA溶液（1 OD），在室温下震荡12h。再加入100 μL 3 mol/L的醋酸钠和1ml的乙醇，冷冻10h。然后离心冷冻干燥得到二茂铁修饰的C-DNA（Fc-C-DNA），然后取1.12μg 的Fc-C-DNA溶于200μL PBS溶液中配置成浓度为1μM 的二茂铁标记的C-DNA溶液，进行紫外光谱表征证明DNA的标记修饰效果，并于-20℃条件下保存备用。
（5）生物传感器的构建：
①把修饰有金纳米-石墨烯复合材料的玻碳电极浸入到20 μL的含有巯基修饰的A-DNA（SH-A-DNA）溶液3 h。
②然后再把修饰有金纳米-石墨烯/SH-A-DNA的玻碳电极浸泡在含有20 μL 1 μM 的Ru-B-DNA中培育20 min。
③再把上述电极浸泡在含有20 μL 1 μM的Fc-C-DNA中培育20 min。
将上面制备方法得到的检测内切酶的电化学发光生物传感器用于检测内切酶EcoRI。
本实施例为了研究本发明的修饰玻碳电极生物传感器检测内切酶EcoRI的电极反应性质、机理和电极过程动力学等参数。预处理后的玻碳电极在进行修饰前，采用三电极系统循环伏安法进行检测。
检测方法主要包括以下步骤：
（1）即将工作电极为预处理后的玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极的三电极系统，在0.5 M 硫酸中，对玻碳电极进行循环伏安扫描，其中设置电压为-0.2～1.6 V，检测完毕后，用去离子水冲洗玻碳电极，吹干玻碳电极表面，备用。
（2）将所述内切酶的电化学发光生物传感器浸入到待测内切酶EcoRI溶液中30 min，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极
（3）将制备完成的修饰玻碳电极放入0.05 M三正丙胺溶液中进行循环伏安扫描，其中电压范围是0.2～1.25 V，扫描速率是50 mV·s-1，光电倍增管高压设置为-800 V。
实施例2
一种检测内切酶EcoRI的电化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）玻碳电极预处理：玻碳电极经0.3μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，并分别在去离子水和乙醇中超声10 min。采用三电极系统检测，工作电极为玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在0.5 M硫酸中，设置电压为-0.2～1.6 V，对玻碳电极进行循环伏安扫描，检测完毕后，用去离子水冲洗电极，吹干电极表面，备用。
（2）金纳米-石墨烯修饰玻碳电极的制备：在1 mg mL-1 氧化石墨和60 mM的氯金酸混合中采用循环伏安法在-1.5 V～0.5 V，扫描速度10 mV s-1，扫描10圈。其中氧化石墨是根据改进的Hummers理论由鳞片石墨制备。
（3）Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA（Ru-B-DNA）溶液的制备: Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA的制备过程同实施例1，取10.01 μg Ru-B-DNA重新溶解于200 μL PBS溶液中，配制成浓度为10μM的Ru(bpy)3 2+标记B-DNA溶液，进行紫外光谱表征，验证DNA的标记修饰效果，并于-20℃条件下保存备用。
（4）二茂铁修饰的C-DNA信标（Fc-C-DNA）：二茂铁标记的C-DNA的制备过程同实施例1，取11.2μg的Fc-C-DNA重新溶解与200 μL PBS溶液中，配制成浓度为10μM的二茂铁标记C-DNA溶液，进行紫外光谱表征，验证DNA的标记修饰效果，并于-20℃条件下保存备用。
（5）生物传感器的构建
①把修饰有金纳米-石墨烯复合材料的玻碳电极浸入到20 μL的含有巯基修饰的A-DNA（SH-A-DNA）溶液6 h。
②然后再把修饰有金纳米-石墨烯/SH-A-DNA的玻碳电极浸泡在含有20 μL 10 μM 的Ru-B-DNA中培育40 min。
③再把上述电极浸泡在含有20 μL 10 μM的Fc-C-DNA中培育40 min。
将上面的制备方法得到的检测内切酶的电化学发光生物传感器用于检测内切酶EcoRI。
本实施例为了研究本发明的修饰玻碳电极生物传感器检测内切酶EcoRI的电极反应性质、机理和电极过程动力学等参数。预处理后的玻碳电极在进行修饰前，采用三电极系统循环伏安法进行检测。
检测方法主要包括以下步骤：
（1）即将工作电极为预处理后的玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极的三电极系统，在0.5 M 硫酸中，对玻碳电极进行循环伏安扫描，其中设置电压为-0.2～1.6 V，检测完毕后，用去离子水冲洗玻碳电极，吹干玻碳电极表面，备用。
（2）将所述内切酶的电化学发光生物传感器浸入到待测内切酶EcoRI溶液中50 min，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极。
（3）将制备完成的修饰玻碳电极放入0.1 M三正丙胺溶液中进行循环伏安扫描，其中电压范围是0.2～1.25 V，扫描速率是100 mV·s-1，光电倍增管高压设置为-1000 V。
实施例3
一种检测内切酶ApaI的电化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）玻碳电极预处理：玻碳电极经0.3μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，并分别在去离子水和乙醇中超声10 min。采用三电极系统检测，工作电极为玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在0.5 M硫酸中，设置电压为-0.2～1.6 V，对玻碳电极进行循环伏安扫描，检测完毕后，用去离子水冲洗电极，吹干电极表面，备用。
（2）金纳米-石墨烯修饰玻碳电极的制备：在1 mg mL-1 氧化石墨和60 mM的氯金酸混合中采用循环伏安法在-1.5 V～0.5 V，扫描速度10 mV s-1，扫描10圈。其中氧化石墨是根据改进的Hummers理论由鳞片石墨制备。
（3）Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA（Ru-B-DNA）溶液的制备: Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA的制备过程同实施例1，取0.921 μg Ru-B-DNA重新溶解于200 μL PBS溶液中，配制成浓度为1μM的Ru(bpy)3 2+标记B-DNA溶液，进行紫外光谱表征，验证DNA的标记修饰效果，并于-20℃条件下保存备用。
（4）二茂铁修饰的C-DNA信标（Fc-C-DNA）：二茂铁标记的C-DNA的制备过程同实施例1，取1.08μg的Fc-C-DNA重新溶解与200 μL PBS溶液中，配制成浓度为1μM的二茂铁标记C-DNA溶液，进行紫外光谱表征，验证DNA的标记修饰效果，并于-20℃条件下保存备用。
（5）生物传感器的构建
①把修饰有金纳米-石墨烯复合材料的玻碳电极浸入到20 μL的含有巯基修饰的A-DNA（SH-A-DNA）溶液3 h。
②然后再把修饰有金纳米-石墨烯/SH-A-DNA的玻碳电极浸泡在含有20 μL 1 μM 的Ru-B-DNA中培育20 min。
③再把上述电极浸泡在含有20 μL 1 μM的Fc-C-DNA中培育20 min。
将上面的制备方法得到的检测内切酶的电化学发光生物传感器用于检测内切酶ApaI。
本实施例为了研究本发明的修饰玻碳电极生物传感器检测内切酶ApaI的电极反应性质、机理和电极过程动力学等参数。预处理后的玻碳电极在进行修饰前，采用三电极系统循环伏安法进行检测。
检测方法主要包括以下步骤：
（1）即将工作电极为预处理后的玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极的三电极系统，在0.5 M 硫酸中，对玻碳电极进行循环伏安扫描，其中设置电压为-0.2～1.6 V，检测完毕后，用去离子水冲洗玻碳电极，吹干玻碳电极表面，备用。
（2）将所述内切酶的电化学发光生物传感器浸入到待测内切酶ApaI溶液中30 min，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极。
（3）将制备完成的修饰玻碳电极放入0.1 M三正丙胺溶液中进行循环伏安扫描，其中电压范围是0.2～1.25 V，扫描速率是50 mV·s-1，光电倍增管高压设置为-800 V。
实施例4
一种检测内切酶ApaI的电化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）玻碳电极预处理：玻碳电极经0.3μm的α-A12O3抛光粉抛光后，用去离子水冲洗干净，并分别在去离子水和乙醇中超声10 min。采用三电极系统检测，工作电极为玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，在0.5 M硫酸中，设置电压为-0.2～1.6 V，对玻碳电极进行循环伏安扫描，检测完毕后，用去离子水冲洗电极，吹干电极表面，备用。
（2）金纳米-石墨烯修饰玻碳电极的制备：在1 mg mL-1 氧化石墨和60 mM的氯金酸混合中采用循环伏安法在-1.5 V～0.5 V，扫描速度10 mV s-1，扫描10圈。其中氧化石墨是根据改进的Hummers理论由鳞片石墨制备。
（3）Ru(bpy)3 2+标记的E-DNA（Ru-B-DNA）溶液的制备: Ru(bpy)3 2+标记的E-DNA的制备过程同实施例1，取9.21 μg Ru-E-DNA重新溶解于200 μL PBS溶液中，配制成浓度为10μM的Ru(bpy)3 2+标记E-DNA溶液，进行紫外光谱表征，验证DNA的标记修饰效果，并于-20℃条件下保存备用。
（4）二茂铁修饰的F-DNA信标（Fc-F-DNA）：二茂铁标记的F-DNA的制备过程同实施例1，取10.8μg的Fc-F-DNA重新溶解与200 μL PBS溶液中，配制成浓度为10μM的二茂铁标记F-DNA溶液，进行紫外光谱表征，验证DNA的标记修饰效果，并于-20℃条件下保存备用。
（5）生物传感器的构建
①把修饰有金纳米-石墨烯复合材料的玻碳电极浸入到20 μL的含有巯基修饰的D-DNA（SH-D-DNA）溶液6 h。
②然后再把修饰有金纳米-石墨烯/SH-D-DNA的玻碳电极浸泡在含有20 μL 10 μM 的Ru-E-DNA中培育40 min。
③再把上述电极浸泡在含有20 μL 10 μM的Fc-C-DNA中培育40 min。
将上面的制备方法得到的检测内切酶的电化学发光生物传感器用于检测内切酶ApaI。
本实施例为了研究本发明的修饰玻碳电极生物传感器检测内切酶ApaI的电极反应性质、机理和电极过程动力学等参数。预处理后的玻碳电极在进行修饰前，采用三电极系统循环伏安法进行检测。
检测方法主要包括以下步骤：
（1）即将工作电极为预处理后的玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极的三电极系统，在0.5 M 硫酸中，对玻碳电极进行循环伏安扫描，其中设置电压为-0.2～1.6 V，检测完毕后，用去离子水冲洗玻碳电极，吹干玻碳电极表面，备用。
（2）将所述内切酶的电化学发光生物传感器浸入到待测内切酶ApaI溶液中50 min，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极。
（3）将制备完成的修饰玻碳电极放入0.1 M三正丙胺溶液中进行循环伏安扫描，其中电压范围是0.2～1.25 V，扫描速率是100 mV·s-1，光电倍增管高压设置为-1000 V。
实施例1-4的检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法巧妙利用了金纳米-石墨烯复合材料、二茂铁、Ru(bpy)3 2+、内切酶以及DNA分子各物质之间的相互作用关系，设计出一种能够用于检测内切酶含量的电化学发光生物传感器，其检测内切酶的原理图如图1所示。首先在玻碳电极表面同时沉积石墨烯和金纳米（GNPs）得到金纳米-石墨烯复合材料修饰的玻碳电极。然后在电极上连接上巯基修饰的A-DNA（SH-A-DNA），接着Ru(bpy)3 2+修饰的B-DNA（Ru-B-DNA）和二茂铁修饰C-DNA（Fc-C-DNA）通过DNA的互补作用分别引入到带电极表面。从而实现二茂铁对Ru(bpy)3 2+电化学发光信号的猝灭；在存在EcoRI时，由于EcoRI能够特异性的在特定的位置切断DNA分子，从而释放二茂铁分子，Ru(bpy)3 2+电化学发光信号得以恢复。通过电化学发光信号的猝灭和恢复，以及显示强度，可以实现对样品中内切酶EcoRI特异性检测。
将按照实施例1-2的制备方法得到的检测内切酶的电化学发光生物传感器进行如下性能检测。
1、玻碳电极在不同阶段的在5 mM铁氰化钾/亚铁氰化钾中的循环伏安。
实验采用循环伏安法对实施例1和实施例2制备的生物传感界面进行表征分析，扫描范围-0.2V~0.6V，扫描速度50mV s-1。不同制备阶段的传感界面在铁氰化钾测试体系中的循环伏安图如图2所示。从图中可以看出，曲线a是裸电极的循环伏安图，曲线b是修饰上金纳米-石墨烯复合材料后的循环伏安图，曲线c是修饰SH-A-DNA后的，曲线d是修饰Ru-B-DNA的循环伏安图，曲线e是修饰Fc-C-DNA的循环伏安图。从中我们可以看出曲线修饰金纳米-石墨烯复合材料后电极的电流增强，说明金纳米-石墨烯复合材料的却可以增强电极的电化学性能，起到促进电子传递效率的作用，随着DNA分子的引入电流逐渐减小，这是因为生物分子对电子传导的阻碍作用。
2、电化学阻抗检测
实验采用电化学阻抗谱测试对制备的生物传感界面进行表征分析，在开路电位下，0.1 Hz至100 kHz频率范围内，震荡电压为5 mV条件下，不同制备阶段的传感界面在铁氰化钾测试体系中的奈奎斯特图谱如图3所示。曲线a为空白电极，在高频区，空白玻碳电极呈现出很小的弧度，其奈奎斯特曲线表现为几乎为直线，这说明在[Fe(CN)6] 3 − /4 −体系中，裸电极的阻抗很小；曲线b是修饰上金纳米-石墨烯复合材料后，可以发现电极的阻抗有明显的减小。这进一步说明了金纳米-石墨烯复合材料可以提高电子的传导效率，改善电极的性能。曲线c、d、e分别是SH-A-DNA、Ru-B-DNA和Fc-C-DNA修饰后的阻抗图。阻抗逐渐增大，这也是由于生物分子对电子传导的阻碍作用。
3、培育时间对电化学发光强度的影响
对传感器在内切酶EcoRI样品中培育时间对传感器发光强度的影响进行研究。由图4可以看出，培育时间达到30min时，即能够实现电极传感器对内切酶EcoRI的最佳检测。
4、生物传感器在不同修饰阶段的电化学发光信号
为了研究所构建的传感器的稳定性，对电极的不同修饰阶段的发光信号也进行的测试。如图5所示，曲线a、b、c、d分别是SH-A-DNA、Ru-B-DNA、Fc-C-DNA和经内切酶EcoRI处理后电极在0.1 M的三正丙胺溶液中的发光情况。从图5中可以看出当Ru-B-DNA修饰到电极上后，电极的发光强度有一个很明显的增强，这是由于Ru-B-DNA上修饰有发光信标Ru(bpy)3 2+。当Fc-C-DNA修饰电极后，电极又有一个明显的减弱，这是由于Fc-C-DNA上修饰有可以猝灭Ru(bpy)3 2+的二茂铁分子。再经内切酶EcoRI处理后发光信号又有一个恢复。而且从图5的插图可以看出持续的循环伏安扫描，电极都能得到稳定的电化学发光信号。这说明固定在电极表面的分子都能够稳定的存在，没有出现脱落的现象。
5、检测不同浓度内切酶EcoRI
检测本发明的生物传感器在不同浓度内切酶EcoRI中的电化学发光信号，绘制电化学发光强度与EcoRI浓度的标准曲线图，具体的检测步骤如下：
（1）将传感器分别浸入待检测不同浓度的EcoRI溶液中，即EcoRI浓度序列分别为10-4 , 10-3, 10-2, 10-1, 1, 10, 20 U mL-1，培育30min时间后，用磷酸盐缓冲溶液清洗电极。
（2）将修饰玻碳电极作为工作电极，在在电化学工作站上使用0.1 M三正丙胺溶液作为检测液进行电化学发光检测。循环伏安扫描电压范围是0.2～1.25 V，扫描速率是100 mV·s-1，光电倍增管高压设置为-800 V。
在优化的实验条件下，将实验制备的传感器进行一系列浓度的EcoRI标准溶液测试，建立响应信号差I ECL与凝血酶浓度的关系曲线。如图6及插图所示，在10-4 U mL-1～20 U mL-1浓度范围内，传感器的电化学光强信号随着EcoRI溶液浓度的增大而增强，不同的测试浓度对应的发光强度具有良好的线性关系，线性回归方程为I ECL=1109.42 lgCEcoRI + 4914.10，线性相关系数为0.9987。同时，本实验制备的传感器的检出限为5.6×10-5 U mL-1（3次平行测定的空白样品的响应信号强度加上3倍的标准偏差后的信号作为其最低可信检出信号，3 δ方法）。
6、传感器稳定性测试
如图7所示为传感器对EcoRI的检测，a为一个月前的电化学发光信号，b为一个月的发光信号，从图中可以看出一个月内电化学信号仍然有原来的96%。所以所构建的传感器具有良好的稳定性。
7、选择性的测试
为了探究传感器对其他内切酶的抗干扰性，我们对其他几种内切酶EcoRV、 PstI、 NotI、 RsaI 、NcoI也进行了平行干扰实验。在图8中可以看出，传感器对EcoRI有强烈的信号响应（约2700个单位），对其他干扰物质几乎没有信号响应（约200-500个单位）。实验结果表明本实验制备的传感器具有良好的抗干扰性能，具有良好的内切酶EcoRI识别特异性。
将按照实施例3-4的制备方法得到的检测内切酶的电化学发光生物传感器性能检测结果跟实施例1-2的相似。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说， 其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 汕头大学
<120> 一种检测内切酶的电化学发光生物传感器及其制备与应用
<130> 2015
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggggttgggg aagggtacga ggaattccgg gttggg 36
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccttcccca acccc 15
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccaacccgg aattcct 17
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggggttgggg aagggtacga ggatccgggt tggg 34
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cccttcccca acccc 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccaacccgg atcct 15

Claims (10)

1.一种检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01.对玻碳电极进行预处理；
S02.采用循环伏安法制备金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极；
S03.分别制备浓度为1～10 μM的 Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA信标，和浓度为1～10 μM的二茂铁标记的C-DNA信标；
S04.将所述步骤S02所得到金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极浸入含有巯基修饰的A-DNA中培育3～6 h，然后依次浸入步骤S03所得Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA信标和二茂铁标记的C-DNA信标20～40min，即得到检测内切酶的电化学发光生物传感器。
2.根据权利要求1所述检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述巯基修饰的A-DNA序列为5’-SH-(CH2)6-GGGGTTGGGGAAGGGTACGAGG AATTCCGGGTTGGG-3’；所述Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA序列为5’-NH2-(CH2)6-CCCTTCCCCAACCCC-3’；所述二茂铁标记的C-DNA序列为5’-CCCAACCCGG AATTCCT-(CH2)6-NH2-3’。
3.根据权利要求1所述检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述巯基修饰的A-DNA序列为5’-SH-(CH2)6-GGGGTTGGGGAAGGGTACGAG GATCCGGGTTGGG-3’；所述Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA序列为5’-NH2-(CH2)6-CCCTTCCCCAACCCC-3’；所述二茂铁标记的C-DNA序列为5’-CCCAACCCG GATCCT-(CH2)6-NH2-3’。
4.根据权利要求2或3所述检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述金纳米-石墨烯修饰的玻碳电极的制备方法为：采用浓度为0.5～1mgmL-1的氧化石墨烯和20～60mM氯金酸，在-1.5～0.5V的范围内通过循环伏安法将金纳米-石墨烯沉积到玻碳电极表面，扫描速度10mVs-1。
5.根据权利要求2或3所述检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S03所述Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA的信标的制备方法如下：
S11.将Ru(bpy)2Cl2、碳酸氢钠和2,2’-联吡啶-4,4’-二羧酸混合均匀，加入乙醇-水溶液中加热回流后冷却过滤制备Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2；
S12.将N,N′-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌混合后加入DMF溶液使其充分溶解后加入步骤S11所得Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2中合成Ru(bpy)2(dcbpy)NHS；
S13.将步骤S12所得Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记B-DNA；
S14.将步骤S13所得Ru(bpy)2(dcbpy)NHS标记的B-DNA溶解于pH为7.4的PBS溶液中，即得到所述Ru(bpy)3 2+标记的B-DNA信标。
6.根据权利要求2或3所述检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S03所述二茂铁标记的C-DNA信标的的制备方法如下：
S21.用1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐活化二茂铁甲酸的羧基；
S22.用步骤S21所得活化二茂铁甲酸修饰C-DNA得到二茂铁修饰的C-DNA；
S23.将步骤S22所得二茂铁修饰的C-DNA溶解于pH为7.4的PBS溶液中得到所述的二茂铁标记C-DNA溶液。
7.根据权利要求4所述检测内切酶的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述氧化石墨是根据改进的Hummers理论由鳞片石墨制备。
8.根据权利要求1所述制备方法得到的检测内切酶的电化学发光生物传感器。
9.根据权利要求8所述检测内切酶的电化学发光生物传感器的应用，其特征在于，包括用于检测内切酶EcoRI和内切酶ApaI。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述内切酶的检测主要包括以下步骤：
S31.将所述电化学发光生物传感器浸入到待测内切酶溶液中30～50 min，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极；
S32.将所述电化学发光生物传感器作为工作电极在三电极系统中，以0.05～0.1 M三正丙胺溶液作为检测溶液进行电化学及电化学发光检测。
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