CN112964768A - 一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法，选用MPL‑E型电致化学发光分析系统和三电极系统，对Ru(bpy)3 2+和Ru(bpy)3 2+‑Bst DNA聚合酶体系进行检测。在使用石墨烯分散液用量为3μL修饰的玻碳电极、PH值为7.5、过硫酸钾浓度为0.1mol/L的环境下检测最优。本发明操作简单、重现性好、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及Bst DNA聚合酶，尤指一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法。
背景技术
Bst DNA聚合酶是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶的一部分，具有5’-3’DNA聚合酶活性，但不具有5’-3’外切核酸酶活性。与其他DNA聚合酶相比Bst DNA聚合酶具有较强的热稳定性、链置换活性及聚合酶活性。电致化学发光也称电化学发光，是通过电化学的方法在电极表面产生一些特殊的物质，这些物质之间或与体系中其它组分之间通过电子传递形成激发态，由激发态返回到基态产生发光现象，是电化学与化学发光方法的结合。在用电化学与化学发光方法测定Bst DNA聚合酶时，操作过程较复杂，且系统反应慢灵敏度低，需要一种高灵敏、高选择、快速的Bst DNA聚合酶测定新方法。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种电致化学发光分析系统测定Bst DNA聚合酶的方法。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案在于：一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法，选用MPL-E型电致化学发光分析系统和三电极系统，对Ru(bpy)3 2+和Ru(bpy)3 2+-Bst DNA聚合酶体系进行检测。
进一步，三电极系统包括：工作电极、对电极和参比电极。
进一步，工作电极为在裸电极表面涂覆修饰液的玻碳电极。
进一步，裸电极的预处理方法为，依次用0.3μm和0.5μm的氧化铝粉末抛光成镜面，用超纯水和乙醇交替清洗，用N2吹干，作为待修饰的裸电极。
进一步，修饰液的制作方法为，称取1mg多石墨烯均匀分散于1.0mL含有0.05％Nafion的乙醇溶液中。
进一步，玻碳电极的制作方法，量取3μL的0.5mg/mL的修饰液，滴涂于处理好的裸电极表面进行修饰，并晾干。
进一步，乙醇溶液包括乙醇和超纯水且比例为1:4。
进一步，对电极为铂丝电极。
进一步，参比电极为饱和氯化银电极。
本发明的有益效果为：
Ru(bpy)3 2+的优点为，在形成激发态时，光子的发射使Ru(bpy)3 2+在电极表面附近的基态再生，使单个Ru(bpy)3 2+分子可参与多个电致化学反应，增加了系统的灵敏度，同时降低了检测限。
石墨烯具有高表面积、超高电子迁移率和优异的导热性。具有优异的生物相容性，可以直接分散在水溶液中而无需改性，能够建立一种操作简单、灵敏度高、准确性好的BstDNA聚合酶的测定。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为裸电极和玻碳电极对电极强度影响的关系图；
图2为电极强度与石墨烯分散液用量之间关系图；
图3为电极强度与PH值之间关系图；
图4为电极强度与硫酸钾浓度之间关系图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例一
以铂丝电极为对电极，饱和氯化银电极为参比电极。
依次用0.3μm和0.5μm的氧化铝粉末在麂皮上抛光成镜面，按照超纯水和乙醇交替超声清洗各15s，使用电化学工作站循环伏安法检测，当其电位差在0.064-0.080V范围内则代表抛光完成，用N2吹干，作为待修饰的裸电极。
将待修饰裸电极的工作电极、对电极和参比电极插入含有1.0×10-6mol/LRu(bpy)3 2+-Bst DNA聚合酶、0.1mol/L过硫酸押和0.1mol/L KCl的、pH为7.5磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0V，脉冲时间为10s，终止电位为-2V，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为600V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号。将此实施例1作为对比例。
实施例二
石墨烯的制备过程：在20ml浓硫酸中加入5g五氧化二磷和5g过硫酸钾，超声30min，溶解后将混合溶液倒入100mL圆底烧瓶中，并加入5g石墨粉，80℃恒温水浴10h，得到蓝黑色混合物。自然冷却至室温后，用超纯水洗涤至中性得到氧化石墨烯。将氧化石墨烯加入水合阱和去离子水的混合溶液，反应釜中230℃反应10h。冷却至室温后，用去离子水和乙醇各洗涤3次，真空干燥12h得到还原后的石墨烯。
待修饰裸电极制作过程：依次用0.3μm和0.5μm的氧化铝粉末在麂皮上抛光成镜面，按照超纯水和乙醇交替超声清洗各15s，使用电化学工作站循环伏安法检测，当其电位差在0.064-0.080V范围内则代表抛光完成，用N2吹干，作为待修饰裸电极。
玻碳电极的制备过程：称取1.0mg石墨烯分散于1.0mL含有0.O5％Nafion的乙醇溶液中，通过超声波清洗器超声分散30min，使其均匀悬浮。最后，用移液枪量取3μL石墨烯分散液修饰裸电极，在室温下晾干。
以铂丝电极为对电极，饱和氯化银电极为参比电极，玻碳电极为工作电极。
将工作电极、对电极和参比电极插入含有1.0×10-6mol/L Ru(bpy)3 2+-Bst DNA聚合酶、0.1mol/L过硫酸押和0.1mol/L KCl的0.1mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为OV，脉冲时间为10s，终止电位为-2V，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为600V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到如图1，在其他条件相同的情况下，修饰过后的电极相比未修饰的电极强度增加，降低了检测限，增加了系统的灵敏度、准确性。
实施例三
石墨烯的制备过程：在20ml浓硫酸中加入5g五氧化二磷和5g过硫酸钾，超声30min，溶解后将混合溶液倒入100mL圆底烧瓶中，并加入5g石墨粉，80℃恒温水浴10h，得到蓝黑色混合物。自然冷却至室温后，用超纯水洗涤至中性得到氧化石墨烯。将氧化石墨烯加入水合阱和去离子水的混合溶液，反应釜中230℃反应10h。冷却至室温后，用去离子水和乙醇各洗涤3次，真空干燥12h得到还原后的石墨烯。
待修饰裸电极制作过程：依次用0.3μm和0.5μm的氧化铝粉末在麂皮上抛光成镜面，按照超纯水和乙醇交替超声清洗各15s，使用电化学工作站循环伏安法检测，当其电位差在0.064-0.080V范围内则代表抛光完成，用N2吹干，作为待修饰裸电极。
玻碳电极的制备过程：称取1.0mg石墨烯分散于1.0mL含有0.O5％Nafion的乙醇溶液中，通过超声波清洗器超声分散30min，使其均匀悬浮。最后，用移液枪量取3μL石墨烯分散液修饰裸电极，在室温下晾干。
以铂丝电极为对电极，饱和氯化银电极为参比电极，玻碳电极为工作电极。将工作电极、对电极和参比电极插入含有1.0×10-6mol/L Ru(bpy)3 2+-Bst DNA聚合酶、0.1mol/L过硫酸押和0.1mol/L KCl的0.1mol/L、pH7.5磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为OV，脉冲时间为10s，终止电位为-2V，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为600V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。
玻碳电极的制备过程时，用移液枪分别量取1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL石墨烯分散液分别修饰不同的修饰裸电极，检测工作电极表面的电极强度，如图2所示，在1-3μL范围内随着石墨烯分散液量的增加，工作电极表面强度增加，在石墨烯分散液的量为3μL时，电极强度达到最大值，在3-6μL范围内随着石墨烯分散液量的增加，工作电极表面强度降低，得到最佳的石墨烯分散液的量为3μL，此时系统的灵敏度和准确性最高，便于检测。
实施例四
石墨烯的制备过程：在20ml浓硫酸中加入5g五氧化二磷和5g过硫酸钾，超声30min，溶解后将混合溶液倒入100mL圆底烧瓶中，并加入5g石墨粉，80℃恒温水浴10h，得到蓝黑色混合物。自然冷却至室温后，用超纯水洗涤至中性得到氧化石墨烯。将氧化石墨烯加入水合阱和去离子水的混合溶液，反应釜中230℃反应10h。冷却至室温后，用去离子水和乙醇各洗涤3次，真空干燥12h得到还原后的石墨烯。
待修饰裸电极制作过程：依次用0.3μm和0.5μm的氧化铝粉末在麂皮上抛光成镜面，按照超纯水和乙醇交替超声清洗各15s，使用电化学工作站循环伏安法检测，当其电位差在0.064-0.080V范围内则代表抛光完成，用N2吹干，作为待修饰裸电极。
玻碳电极的制备过程：称取1.0mg石墨烯分散于1.0mL含有0.O5％Nafion的乙醇溶液中，通过超声波清洗器超声分散30min，使其均匀悬浮。最后，用移液枪量取3μL石墨烯分散液修饰裸电极，在室温下晾干。最后，用移液枪量取3μL石墨烯分散液修饰裸电极，在室温下晾干。
以铂丝电极为对电极，饱和氯化银电极为参比电极，玻碳电极为工作电极。将工作电极、对电极和参比电极插入含有1.0×10-6mol/L Ru(bpy)3 2+-Bst DNA聚合酶、0.1mol/L过硫酸押和0.1mol/L KCl的0.1mol/L、磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为OV，脉冲时间为10s，终止电位为-2V，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为600V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。
分别在PH值为6.5、7、7.5、8、8.5的磷酸盐缓冲溶液环境下检测电极表面的电极强度，如图3所示，PH值在6.5-7.5范围内，随着PH值增大，工作电极表面强度增加，在PH值为7.5时，电极表面强度达到最大值，PH值在7.5-8.5范围内，随着PH值增大，工作电极表面强度降低，得到最优PH值为7.5，此时系统的灵敏度和准确性最高，便于检测。
实施例五
石墨烯的制备过程：在20ml浓硫酸中加入5g五氧化二磷和5g过硫酸钾，超声30min，溶解后将混合溶液倒入100mL圆底烧瓶中，并加入5g石墨粉，80℃恒温水浴10h，得到蓝黑色混合物。自然冷却至室温后，用超纯水洗涤至中性得到氧化石墨烯。将氧化石墨烯加入水合阱和去离子水的混合溶液，反应釜中230℃反应10h。冷却至室温后，用去离子水和乙醇各洗涤3次，真空干燥12h得到还原后的石墨烯。
待修饰裸电极制作过程：依次用0.3μm和0.5μm的氧化铝粉末在麂皮上抛光成镜面，按照超纯水和乙醇交替超声清洗各15s，使用电化学工作站循环伏安法检测，当其电位差在0.064-0.080V范围内则代表抛光完成，用N2吹干，作为待修饰裸电极。
玻碳电极的制备过程：称取1.0mg石墨烯分散于1.0mL含有0.O5％Nafion的乙醇溶液中，通过超声波清洗器超声分散30min，使其均匀悬浮。最后，用移液枪量取3μL石墨烯分散液修饰裸电极，在室温下晾干。最后，用移液枪量取3μL石墨烯分散液修饰裸电极，在室温下晾干。
以铂丝电极为对电极，饱和氯化银电极为参比电极，玻碳电极为工作电极。将工作电极、对电极和参比电极插入含有1.0×10-6mol/L Ru(bpy)3 2+-Bst DNA聚合酶、0.1mol/LKCl的0.1mol/L、pH为7.5磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为OV，脉冲时间为10s，终止电位为-2V，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为600V，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。
分别在过硫酸钾浓度为0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14mol/L的条件下检测电极强度，如图4所示，过硫酸钾浓度在0.04-0.1mol/L的范围下，随着过硫酸钾浓度值增大，工作电极表面强度增大，过硫酸钾浓度在0.04-0.1mol/L的范围下，随着过硫酸钾浓度值增大，工作电极表面强度基本保持不变，得到最优过硫酸钾浓度为0.1mol/L，此时系统的灵敏度和准确性最高，便于检测。
与对比例相比，将修饰液修饰过的玻碳电极作为工作电极、以铂丝电极为对电极和饱和氯化银电极为参比电极插入含有1.0×10-6mol/L Ru(bpy)32+-Bst DNA聚合酶、0.1mol/L过硫酸押和0.1mol/L KCl的0.1mol/L、pH为7.5磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为OV，脉冲时间为10s，终止电位为-2V，脉冲时间为1s，光电倍增管高压设置为600V的反映环境下。工作电极表面强度最大，降低了检测限，增加了系统的灵敏度、准确性。
以上说明内容仅为本发明较佳实施例，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (9)
1.一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法，其特征在于，选用MPL-E型电致化学发光分析系统和三电极系统，对Ru(bpy)3 2+和Ru(bpy)3 2+-Bst DNA聚合酶体系进行检测。
2.如权利要求1所述的一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法，其特征在于，三电极系统包括：工作电极、对电极和参比电极。
3.如权利要求2所述的一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法，其特征在于，工作电极为在裸电极表面涂覆修饰液的玻碳电极。
4.如权利要求3所述的一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法，其特征在于，裸电极的预处理方法为，依次用0.3μm和0.5μm的氧化铝粉末抛光成镜面，用超纯水和乙醇交替清洗，用N2吹干，作为待修饰的裸电极。
5.如权利要求4所述的一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法，其特征在于，修饰液的制作方法为，称取1mg石墨烯均匀分散于1.0mL含有0.05％Nafion的乙醇溶液中。
6.如权利要求5所述的一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法，其特征在于，玻碳电极的制作方法，量取3μL的0.5mg/mL的修饰液，滴涂于处理好的裸电极表面进行修饰，并晾干。
7.如权利要求5所述的一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法，其特征在于，乙醇溶液包括乙醇和超纯水且比例为1:4。
8.如权利要求2所述的一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法，其特征在于，对电极为铂丝电极。
9.如权利要求2所述的一种Bst DNA聚合酶电致化学发光测定方法，其特征在于，参比电极为饱和氯化银电极。
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