CN216738348U - 适用于等温扩增技术的核酸多联检装置 - Google Patents

Abstract

适用于等温扩增技术的核酸多联检装置，包括盒体，盒体顶端的左侧设有加样凹槽，加样凹槽内设有加样垫，加样垫的中部设有加样孔，加样孔的底端与多个第一微流控毛细通道的进液口相通，每个第一微流控毛细通道的出液口分别与一个反应池的进液口相通，反应池的进液口位于反应池的左端，每个反应池右端设有出液口，每个反应池的出液口分别与一个第二微流控毛细通道的进液口相连，每个第二微流控毛细通道的出液口分别与一个试纸条安放槽的左端相连。其目的在于提供一种可同时检测同一份样本中四种不同的病原体核酸，且整个检测过程进行得非常快，检测的准确率高，可控性强的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置。

Description

适用于等温扩增技术的核酸多联检装置

技术领域

本实用新型涉及一种适用于等温扩增技术的核酸多联检装置。

背景技术

重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase ploymerase amplication，RPA)是在重组酶聚合酶的介导下模拟生物体内DNA复制的过程，被称为可以替代聚合酶链反应(PCR)的核酸检测技术。其扩增原理是：重组酶与引物结合形成复合物后，寻找匹配的DNA同源序列，紧密结合发生重组，在单链DNA结合蛋白的作用下，模板DNA开始解链，引物与模板DNA配对，在链置换DNA聚合酶的作用下复制延伸，对目的片段进行指数级扩增(Forgetetal.,2012)。 RPA与PCR不同，整个过程仅需要在37℃～42℃等温条件下反应10～20分钟即可得到扩增产物，不需要高温变性和退火的过程，甚至在常温下亦可进行。整个反应简单、快速、高效。对于RPA与侧向流动免疫层析技术相结合(recombinase polymerase amplication-lateral flowdipstick，RPA-LFD),可以在水浴锅(或电热水器)或者直接用人体温度进行加热，将温度控制在37℃～42℃之间，随后可直接通过侧向流动层析试纸条读取实验结果。

微流控芯片技术是将传统的生化分析集成到一块几平方厘米甚至更小的芯片上，在芯片内的微纳尺度通道以及微腔室中完成检测分析。更适合与单核苷酸分子检测方法联合使用，实现高灵敏度，低试剂量的检测。在微流控芯片的相关操控中，通常会用到注射器或气泵电泵等设备驱动试剂在芯片中流动，这就使得芯片操作复杂，且需要配备相应的仪器才能够实现功能。现有的微流控芯片技术无法做到不需其他设备且仅在37℃～42℃等温条件下同时快速检测同一份样本中四种不同的病原体核酸。

实用新型内容

本实用新型的目的在于提供一种可同时检测同一份样本中四种不同的病原体核酸，且整个检测过程进行得非常快，检测的准确率高，可控性强，可实现高灵敏度，低试剂量的检测的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置。

本实用新型的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置，包括盒体，盒体顶端的左侧设有加样凹槽，加样凹槽内设有加样垫，加样垫的中部设有加样孔，加样孔的底端与多个第一微流控毛细通道的进液口相通，多个第一微流控毛细通道在盒体的内部向右延伸，每个第一微流控毛细通道的出液口分别与一个反应池的进液口相通，反应池的进液口位于反应池的左端，每个反应池右端设有出液口，每个反应池的出液口分别与一个第二微流控毛细通道的进液口相连，多个第二微流控毛细通道在盒体的内部向右延伸，每个第二微流控毛细通道的出液口分别与一个试纸条安放槽的左端相连，每个试纸条安放槽分别沿着左右水平方向设置；

所述盒体的顶端设有盒盖，盒盖上与加样垫的位置上下相对处设有通孔，盒盖上与每个胶体金试纸条的位置上下相对处分别设有观察窗口，每个观察窗口处分别设有透明材料制成的盖板。

优选的，所述通孔为顶端直径大、底端直径小的圆台孔。

优选的，所述第二微流控毛细通道、胶体金试纸条和观察窗口的数量同为3个或4个或 5个或6个。

优选的，所述盒盖顶部的左侧设有曲面凸起。

优选的，每个所述试纸条安放槽内设有胶体金试纸条，胶体金试纸条上自左向右分别间隔开地设有结合线、检测线和质控线。

优选的，所述盒盖顶部的右侧设有凸起平台，所述观察窗口设置在凸起平台上，盒盖卡装在盒体的顶端。

本实用新型的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置在使用时，可将每个试纸条安放槽内放入胶体金试纸条，胶体金试纸条上自左向右分别间隔开地设有结合线、检测线和质控线，然后将80μL提取的病毒核酸样本与160μL胶体金试纸条缓冲液(4XSSC，2％BSA、0.05％ Tween-20，pH7.0及等温扩增反应液)混合，将混合液滴加到加样区即可，等温反应10～20 分钟后，可用肉眼进行结果判定，并及时进行拍照记录。因此，本实用新型的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置具有可同时检测同一份样本中四种不同的病原体核酸，且整个检测过程进行得非常快，裸眼便可观察，即使是非专业人员也可以直接分析结果，检测的准确率高，可控性强，可实现高灵敏度，低试剂量的检测的特点。非常适用于现场快速检测，尤其在经济条件差资源缺乏的区域，具有更好的应用前景。

下面结合附图对本实用新型适用于等温扩增技术的核酸多联检装置作进一步说明。

附图说明

图1为本实用新型适用于等温扩增技术的核酸多联检装置的主视图；

图2为图1的俯视图；

图3为本实用新型适用于等温扩增技术的核酸多联检装置的盒体部分的主视图；

图4为图3的俯视图；

图5为本实用新型适用于等温扩增技术的核酸多联检装置的盒体部分的主视剖面图。

具体实施方式

本实用新型的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置，参见图1、图2、图3、图4和图 5，包括盒体8，盒体8顶端的左侧设有加样凹槽10，加样凹槽10内设有加样垫2，加样垫2的中部设有加样孔1，加样孔1的底端与多个第一微流控毛细通道9的进液口相通，多个第一微流控毛细通道9在盒体8的内部向右延伸，每个第一微流控毛细通道9的出液口分别与一个反应池3的进液口相通，反应池3的进液口位于反应池3的左端，每个反应池3右端设有出液口，每个反应池3的出液口分别与一个第二微流控毛细通道16的进液口相连，多个第二微流控毛细通道16在盒体8的内部向右延伸，每个第二微流控毛细通道16的出液口分别与一个试纸条安放槽的左端相连，每个试纸条安放槽分别沿着左右水平方向设置。

所述盒体8的顶端设有盒盖15，盒盖15上与加样垫2的位置上下相对处设有通孔14，盒盖15上与每个胶体金试纸条4的位置上下相对处分别设有观察窗口13，每个观察窗口13 处分别设有透明材料制成的盖板。

作为本实用新型的进一步改进，上述通孔14为顶端直径大、底端直径小的圆台孔。

作为本实用新型的进一步改进，上述第二微流控毛细通道16、胶体金试纸条4和观察窗口13的数量同为3个或4个或5个或6个。

作为本实用新型的进一步改进，上述盒盖15顶部的左侧设有曲面凸起11。

作为本实用新型的进一步改进，上述每个所述试纸条安放槽内设有胶体金试纸条4，胶体金试纸条4上自左向右分别间隔开地设有结合线5、检测线6和质控线7。

作为本实用新型的进一步改进，上述盒盖15顶部的右侧设有凸起平台12，所述观察窗口13设置在凸起平台12上，盒盖15卡装在盒体8的顶端。

微流控芯片快速即时检测(POCT)技术是近十年发展起来的快速检测技术。由于微流控技术拥有样本流动控制、芯片封闭、管道微小、可控性强等特点，使得微流控芯片POCT检测技术的检测灵敏度和检测重复性相比于层析POCT检测技术均有不同程度提升，因此微流控芯片POCT检测技术越来越受到市场的青睐，其微流控技术也为本核酸多联检装置所采用。

本实用新型的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置包括盒体8和盒盖15、所述盒体8 和盒盖15的边缘处均为有一定幅度的弯折边缘，所述盒体和盒盖15相互卡接形成一个封闭的盒式结构，每个胶体金试纸条4的PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线7和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线6。

本实用新型检测步骤如下：

将80μL提取的病毒核酸样本与160μL胶体金试纸条缓冲液(4XSSC，2％BSA、0.05％Tween-20，pH7.0及等温扩增反应液)混合，将混合液滴加到加样区即可，等温反应10～20分钟后，可用肉眼进行结果判定，并及时进行拍照记录。

原理及结果判读：重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术主要原理是利用三种酶：T4噬菌体重组酶uvsX和辅助因子uvsY、DNA聚合酶(Recombinase)、单链结合蛋白 (Single-Strained-Bindingprotein，SSB)。RPA进行核酸扩增的过程如下：首先重组酶蛋白与引物结合形成蛋白-DNA复合体，该复合体能够在模板上寻找与其完全互补的序列，一旦引物定位，能够与之匹配的同源序列就会发生紧密结合，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，从而启动DNA1链的合成，在此过程中链的置换促进了聚合酶对DNA的进一步延伸，从而形成对目的基因的指数级扩增，同时单链结合蛋白与被置换的DNA单链结合，防止被替换以保证反应的正常进行，由于可以根据不同的目标核酸序列设计不同的引物，所以本装置可同时检测同一份样本中四种不同的病原体核酸。由于这三种酶混合后在常温条件下也有活性，且整个过程进行得非常快，故RPA反应在恒温37℃～42℃下孵育10～20min即可完成扩增，大量实验数据表明，本实用新型技术扩增迅速，10min左右就可检出扩增产物。

RPA-LFD技术是基于对引物和探针的特异性标记，使得含有生物素(Biotin)标记的扩增产物与含有羧基荧光素(FAM)标记的特异性探针发生杂交反应。反应所需的特异性探针5’端进行地高辛抗原标记，3’端标记聚合酶延伸封闭集团C3-spacer，中间含有一个四氢呋喃脱碱基位点(tetrahydrofuranabasic-sitemimic，THF)，当进行RPA反应时，THF位点可以被大肠杆菌核酸外切酶nfo识别切割并形成自由羟基端，同时与探针相对应的引物5’端进行生物素标记，此时形成的扩增产物为5’端含有地高辛，3’端含有生物素的复合物。将经RPA扩增后的产物用于核酸试纸条检测，基于抗原抗体免疫反应，含有地高辛-生物素双标记扩增子与胶体金标记的鼠抗地高辛抗体结合形成复合物(复合物1)，当复合物1随液流前行至检测线6时，复合物1与检测线6上的链霉亲和素饱和结合，检测线6出现色带；其他未被捕获的探针和胶体金标记的抗地高辛抗体形成的不含生物素的复合物(复合物2)继续随液流方向前行，当扩散至被标记有羊抗地高辛抗体的质控线7时被捕获显色，即质控线 7出现色带，则该检测结果为阳性(+)；如果样本中没有目标病毒，则扩增产物不含有5’端含有地高辛，3’端含有生物素的复合物，随液流前行至检测线6时不会与检测线6上的链霉亲和素结合，检测线6不显色；而5’端含有地高辛的探针会和胶体金标记的鼠抗地高辛抗体形成复合物，当扩散至质控线7时会被羊抗地高辛抗体捕获显色，即该检测结果为阴性(-)；除以上两种情况，若出现质控线7不出现条带，则说明试纸条失效，即检测结果无效。

上面所述的实施例仅仅是对本实用新型的优选实施方式进行描述，并非对本实用新型的范围进行限定，在不脱离本实用新型设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本实用新型技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本实用新型的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.适用于等温扩增技术的核酸多联检装置，其特征在于：包括盒体(8)，盒体(8)顶端的左侧设有加样凹槽(10)，加样凹槽(10)内设有加样垫(2)，加样垫(2)的中部设有加样孔(1)，加样孔(1)的底端与多个第一微流控毛细通道(9)的进液口相通，每个第一微流控毛细通道(9)的出液口分别与一个反应池(3)的进液口相通，反应池(3)的进液口位于反应池(3)的左端，每个反应池(3)右端设有出液口，每个反应池(3)的出液口分别与一个第二微流控毛细通道(16)的进液口相连，每个第二微流控毛细通道(16)的出液口分别与一个试纸条安放槽的左端相连，每个试纸条安放槽分别沿着左右水平方向设置；

所述盒体(8)的顶端设有盒盖(15)，盒盖(15)上与加样垫(2)的位置上下相对处设有通孔(14)，盒盖(15)上与每个胶体金试纸条(4)的位置上下相对处分别设有观察窗口(13)，每个观察窗口(13)处分别设有透明材料制成的盖板。

2.根据权利要求1所述的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置，其特征在于：所述通孔(14)为顶端直径大、底端直径小的圆台孔。

3.根据权利要求2所述的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置，其特征在于：所述第二微流控毛细通道(16)、胶体金试纸条(4)和观察窗口(13)的数量同为3个或4个或5个或6个。

4.根据权利要求3所述的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置，其特征在于：所述盒盖(15)顶部的左侧设有曲面凸起(11)。

5.根据权利要求1至4中任何一项所述的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置，其特征在于：每个所述试纸条安放槽内设有胶体金试纸条(4)，胶体金试纸条(4)上自左向右分别间隔开地设有结合线(5)、检测线(6)和质控线(7)。

6.根据权利要求5所述的适用于等温扩增技术的核酸多联检装置，其特征在于：所述盒盖(15)顶部的右侧设有凸起平台(12)，所述观察窗口(13)设置在凸起平台(12)上，盒盖(15)卡装在盒体(8)的顶部。

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