CN111793629B - 铜绿假单胞菌外毒素a的核酸适配体eta01及其应用 - Google Patents

铜绿假单胞菌外毒素a的核酸适配体eta01及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01及其应用，该核酸适配体ETA01的序列包括：5'‑TGCAACTCCAACTAACCATGTGTTCAT CTGAGGGTGGTCTTCGCA‑3'。本发明的核酸适配体ETA01能高亲和力、高特异性地与铜绿假单胞菌外毒素A结合，以核酸适配体ETA01作为铜绿假单胞菌外毒素A的识别元件，建立铜绿假单胞菌外毒素A的检测方法、制备检测试剂、研制外毒素A拮抗药物，可用于铜绿假单胞菌感染的诊断、治疗以及铜绿假单胞菌外毒素A生物学功能研究等应用领域，具有方法简便、快速、特性好等优点。

Description

铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01及其应用。
背景技术
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的革兰氏阴性杆状细菌，在各种环境条件下具有最佳适应性。铜绿假单胞菌虽为专性需氧菌，也可以通过硝酸盐或其他电子受体进行厌氧呼吸。因此，铜绿假单胞菌在土壤、水或污水以及人类、动物或植物宿主中广泛存在，并在全世界广泛传播。健康人被铜绿假单胞菌感染是非常罕见的，但作为一种机会致病菌，它经常在免疫功能低下的囊性纤维化、烧伤或艾滋病患者中寄生。感染范围从内膜炎、心内膜炎、脑膜炎和败血症到慢性肺部感染。由于铜绿假单胞菌天然对不同抗生素或化疗药物耐药，其根除困难且死亡率高。
铜绿假单胞菌通过多种毒力因子附着在组织表面，破坏组织进行扩散和营养供应，提高其存活率。铜绿假单胞菌的外毒素A（Exotoxin A，ETA）是临床大多数铜绿假单胞菌产生的胞外酶。它是一种单链多肽，分子量66 kDA，含有A和B片段，分别介导酶促和细胞结合功能，属于单-ADP-核糖转移酶家族。外毒素A催化烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸的二磷酸腺苷-核糖基向延伸因子2的转移，导致后者失活并抑制蛋白质的生物合成。外毒素A是一种强效细胞毒素，对多种动物都是致命的，包括灵长类动物等。外毒素A是铜绿假单胞菌感染时在体内产生的，它通过抑制蛋白质合成、直接影响细胞病变和干扰宿主细胞免疫功能而引起疾病。检测外毒素A可作为铜绿假单胞菌感染诊断和病情检测的指标，拮抗外毒素A的毒性作用可为耐药性铜绿假单胞菌的治疗提供帮助。
目前，国内外针对铜绿假单胞菌外毒素A的检测研究大多数采用的是分子生物学技术，其中以PCR、荧光实时定量PCR等的运用较多。虽然直接检测铜绿假单胞菌外毒素A更加方便、快捷，但由于抗体特异性问题，只有极少数的免疫学技术应用于这方面。
核酸适配体（Aptamer）是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA）。通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX），从核酸分子随机文库中筛选得到的寡核苷酸片段。核酸适配体与靶标的结合具有高亲和力、高特异性等特点。作为核酸类分子，核酸适配体可直接合成并进行各种化学修饰，具有成本低、制备快等优点。将核酸适配体作为靶标的识别元件，已应用于各种靶标的快速、准确检测。已有研究将核酸适配体作为铜绿假单胞菌的识别元件，建立了可检测铜绿假单胞菌菌体的传感器、荧光杂交等新方法（Mikrochim Acta。2018，185：377）。如能利用核酸适配体的优势，建立快速、准确的铜绿假单胞菌外毒素A的检测方法，将具有广阔的临床和基础研究价值。
本发明提出一种特异识别铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01。ETA01是以大肠杆菌表达的铜绿假单胞菌外毒素A为靶标，通过SELEX技术从核酸分子随机文库中体外人工筛选并经序列优化后获得。核酸适配体ETA01能够特异识别铜绿假单胞菌外毒素A，而不结合其他铜绿假单胞菌毒素。目前尚未见以铜绿假单胞菌外毒素A为靶标筛选核酸适配体并应用的报道。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种核酸适配体ETA01，其能够特异性识别铜绿假单胞菌的外毒素A。
具体技术方案如下：
一种铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01，其序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。其中，所述SEQ ID NO.1如下所示：
5'-TGCAACTCCAACTAACCATGTGTTCATCTGAGGGTGGTCTTCGCA-3'（SEQ ID NO.1）。
在其中一些实施例中，在25℃，100mM Na+，1mM Mg2+的条件下，所述核酸适配体ETA01的空间结构如下：
Figure 754051DEST_PATH_IMAGE001
。
在其中一些实施例中，对所述核酸适配体ETA01的5’端或3’端进行化学基团修饰，包括但不限于FITC基团、生物素。
本发明的另一目的是提供一种上述的核酸适配体ETA01在建立检测铜绿假单胞菌外毒素A的方法学中的应用。
本发明的另一目的是提供一种上述的核酸适配体ETA01在制备检测铜绿假单胞菌外毒素A的检测试剂盒中的应用。
本发明的另一目的是提供一种上述的核酸适配体ETA01在制备检测铜绿假单胞菌外毒素A的分子探针的应用。
本发明的另一目的是提供一种上述的核酸适配体ETA01在制备拮抗铜绿假单胞菌外毒素A的药物中的应用。
本发明的另一目的是提供一种上述的核酸适配体ETA01在制备检测铜绿假单胞菌的检测试剂盒、分子探针或药物中的应用。
本发明的另一目的是提供一种上述的核酸适配体ETA01在非疾病诊断和治疗目的的检测铜绿假单胞菌或铜绿假单胞菌外毒素A中的应用。
本发明的再一目的是提供一种检测试剂盒，其包括上述的核酸适配体ETA01。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的核酸适配体ETA01可以高亲和力、高特异性地识别铜绿假单胞菌外毒素A，对其他铜绿假单胞菌外毒素不具有识别功能，在临床医学，以及研究铜绿假单胞菌外毒素A的生物学功能等领域中均具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。
本发明的核酸适配体ETA01相比蛋白类抗体更加稳定，可直接体外合成和标记，不需要二抗，操作简单、迅速。
本发明的核酸适配体ETA01较抗体的制备成本低，周期短，且重现性好。
附图说明
图1为比色法生物传感器检测铜绿假单胞菌外毒素A的原理图。
图2为比色法生物传感器检测铜绿假单胞菌外毒素A的结果。
图3为凝胶迁移阻滞实验检测铜绿假单胞菌外毒素A的结果。
图4为酶联适配体吸附法检测铜绿假单胞菌外毒素A的原理图。
图5为酶联适配体吸附法检测铜绿假单胞菌外毒素A的结果。
图6为核酸适配体ETA01的饱和结合曲线。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明的核酸适配体ETA01是经本发明的发明人利用大肠杆菌表达的铜绿假单胞菌外毒素A为靶标，通过SELEX技术从核酸分子随机文库中体外人工筛选并经序列优化后获得。该ETA01的长度为45个碱基，序列如下：
5'-TGCAACTCCAACTAACCATGTGTTCATCTGAGGGTGGTCTTCGCA-3'（SEQ ID NO:1）。
所述的铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01，根据mfold平台分析结果，在25℃，100mM Na+，1mM Mg2+的条件下，其空间结构如下：
Figure 39539DEST_PATH_IMAGE002
。
实例一：以核酸适配体ETA01为识别元件，采用比色法生物传感器检测铜绿假单胞菌外毒素A
(1) 合成核酸适配体ETA01（上海生工公司合成），序列为：5'-GAGCGGCACGAACCAGTAAAGTCTTCCCGACCGC-3'。
(2) 将核酸适配体ETA01溶解于合适体积的选择缓冲液中（50mM Tris-HCl，100mMNaCl，1mM MgCl2，5mM KCl，pH 7.4）；然后经热激活处理。热激活处理的方法为：95℃变性5min后，立即置于冰水浴中10min，随后置于室温10min。
(3) 经热激活处理后的核酸适配体ETA01（终浓度为2μM）分别与铜绿假单胞菌的外毒素A（ETA）、胞外酶S（ExoS）、胞外酶T（ExoT）、胞外酶Y（ExoY）、胞外酶U（ExoU）中的一种或多少种混合，包括“ETA”（终浓度为1μM）、“+ETA+ExoS+ExoT+ExoY+ExoU”（终浓度分别为1μM）、“-ETA+ExoS+ExoT+ExoY+ExoU”（终浓度分别为1μM），按照100μL/孔的量添加到96孔板中，室温放置30min。所述ETA、ExoS、ExoT、ExoY、ExoU，均由福州市长乐区宝爱冬医学技术有限公司利用大肠杆菌克隆表达并纯化，纯度均>95%。以上体系设置3个复孔和空白对照。
(4) 在步骤(3)的96孔板中加入体积为50μL直径为15nm的金纳米颗粒（AuNPs）溶液，混匀，室温放置5min。
(5) 在步骤(4)的96孔板中加入体积为50μL浓度为300 mM的氯化钠溶液，混匀，室温放置15min。
(6) 利用分光光度计检测96孔板反应体系在520nm处的吸收值。
如图1所示，检测铜绿假单胞菌外毒素A的比色法生物传感器的原理为：当检测物中有铜绿假单胞菌ETA存在时，反应体系中的ETA与核酸适配体ETA01结合，使AuNPs处于游离状态，当加入高浓度的氯化钠溶液后，AuNPs发生聚集；当检测物中无ETA存在时，反应体系中的ETA01与AuNPs非特异性结合，使AuNPs处于结合状态，当加入高浓度的氯化钠溶液后，AuNPs不发生聚集。AuNPs的聚集程度可通过检测反应体系在520nm的吸光值反应。
如图2所示，与空白对照组相比，待检测物含有铜绿假单胞菌外毒素A 的“ETA”组和“+ETA+ExoS+ExoT+ExoY+ExoU”组在520nm的吸光值显著降低，而不含有铜绿假单胞菌外毒素A 的“-ETA+ExoS+ExoT+ExoY+ExoU”组的吸光值未降低，证明以核酸适配体ETA01作为识别元件，利用比色法生物传感器可特异性的检出铜绿假单胞菌外毒素A。
实施例二以核酸适配体ETA01为识别元件，采用凝胶迁移阻滞实验检测铜绿假单胞菌ETA
(1)合成ETA01序列，在其5'端标记荧光基团FITC（上海生工公司合成），序列为：5'-TGCAACTCCAACTAACCATGTGTTCATCTGAGGGTGGTCTTCGCA-3'。
(2)将FITC标记的核酸适配体ETA01溶解于合适体积的选择缓冲液中（50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM MgCl2，5mM KCl，pH 7.4）；然后经热激活处理。热激活处理的方法为：95℃变性5min后，立即置于冰水浴中10min，随后置于室温10min。
(3)将经热激活处理后的FITC标记的ETA01分别与两种包含ETA和不包含ETA的铜绿假单胞菌外毒素混合物在暗盒中室温孵育1h，外毒素混合物分别为按照等摩尔比混合准备的“+ETA+ExoS+ExoT+ExoY+ExoU”和“-ETA+ExoS+ExoT+ExoY+ExoU”。所述ETA、ExoS、ExoT、ExoY、ExoU，均由福州市长乐区宝爱冬医学技术有限公司利用大肠杆菌克隆表达并纯化，纯度均>95%。
(4)核酸适配体ETA01与毒素混合物的共同孵育体系加入10×上样缓冲液，12％PAGE胶电泳分离。
(5)在荧光凝胶成像系统中观察，并拍照。
如图3所示，经PAGE电泳分离后，FITC标记的核酸适配体ETA01能与含有ETA的铜绿假单胞菌外毒素混合物“+ETA+ExoS+ExoT+ExoY+ExoU”结合，即ETA01核酸电泳条带发生迁移阻滞；而与不含有ETA的铜绿假单胞菌外毒素混合物“-ETA+ExoS+ExoT+ExoY+ExoU”不结合，即ETA01核酸电泳条带不发生迁移阻滞，证明以荧光基团（FITC）标记的核酸适配体ETA01作为识别元件，利用凝胶迁移阻滞实验可特异性的检出铜绿假单胞菌外毒素A，且核酸适配体ETA01与ETA结合的亲和力高、特异性好。
实施例三：以生物素标记的核酸适配体ETA01为识别元件，采用酶联适配体吸附法检测铜绿假单胞菌ETA
(1)合成核酸适配体ETA01序列，在其5'端标记生物素（上海生工公司合成），序列为：5'-TGCAACTCCAACTAACCATGTGTTCATCTGAGGGTGGTCTTCGCA-3'。
(2) 将大肠杆菌表达的铜绿假单胞菌ETA、ExoS、ExoT、ExoY、ExoU溶于pH 9.6的碳酸盐缓冲液中，摩尔浓度为100mM，按照100μL/孔的量加入到酶联条中，4℃在湿盒中包被过夜。
(3)弃包被液，每孔加入100μL含1％酪蛋白的马来酸封闭液，室温封闭1h。
(4)将生物素标记的ETA01溶解于合适体积的选择缓冲液中（50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM MgCl2，5mM KCl，pH 7.4），然后经热激活处理。热激活处理的方法为：95℃变性5min后，立即置于冰水浴中10min，随后置于室温10min。
(5)将经热激活处理后的生物素标记ETA01按照100μL/孔的量加入酶联条中，使核酸序列与包被的蛋白在37℃共同孵育2h。设置3个复孔和空白对照。
(6)弃去孔内液体，每孔用300μL的磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗涤，重复洗涤3次，最后一次洗涤后要把孔内液体完全甩干。
(7)每孔加入100μL按照1:100用磷酸盐缓冲液（pH7.4）稀释的HRP酶标记的链霉亲和素，室温孵育40min，弃去孔内液体，洗板5次，方法同上。
(8)每孔加入100μL TMB显色液（购自北京天根生化科技有限公司），37℃避光显色，当有明显颜色变化时，加10μL终止液，酶联仪检测反应体系在450nm的吸收值。
如图4所示，检测铜绿假单胞菌外毒素A的酶联适配体吸附法的原理为：当包被检测物中存在铜绿假单胞菌ETA时，反应体系中加入的生物素标记的ETA01与包被在酶联条中ETA结合，进一步HRP标记的链霉亲和素与生物素结合，并催化TMB底物显色。
如图5所示，与空白对照组相比，ETA组在450nm的吸收值显著升高，而ExoS、ExoT、ExoY、ExoU组未见显著升高，证明以生物素标记的核酸适配体ETA01作为识别元件，利用酶联适配体吸附法可特异性的检出铜绿假单胞菌ETA。
实例四：核酸适配体ETA01与铜绿假单胞菌ETA结合的解离常数（KD值）的测定
(1)铜绿假单胞菌ETA与羧基磁珠偶联：所述羧基磁珠及其偶联试剂购自美国Bangs Laboratories公司。ETA与磁珠偶联操作参照制造商提供的说明书。将偶联ETA后的磁珠（ETA磁珠）分散于磷酸盐缓冲液（pH7.4）中，4℃保存。
(2) 取不同浓度的FITC标记核酸适配体ETA01溶液分别与上述ETA磁珠混合，在暗盒中室温孵育1h。
(3) 用0.1％PBST洗涤经步骤(2)的上述磁珠3遍，与上述ETA磁珠结合的核酸适配体ETA01，用200μL选择缓冲液100℃煮沸5min洗脱。
(4) 实验获得并计算不同浓度核酸适配体ETA01溶液与ETA磁珠的荧光结合率，计算荧光结合率＝（初始荧光强度-洗脱荧光强度）/初始荧光强度×100％，用计算值初步代表核酸适配体ETA01与靶分子的结合率。
(5) 利用荧光结合率的计算值，绘制核酸适配体ETA01结合ETA的饱和结合曲线，通过非线性回归分析计算核酸适配体ETA01结合ETA的解离常数。
如图6所示，核酸适配体ETA01的饱和结合曲线，经计算核酸适配体ETA01的解离常数为4.896nM，表明核酸适配体ETA01与铜绿假单胞菌ETA结合的结合能力强，解离常数在纳摩尔级别。
总之，核酸适配体ETA01能够特异识别铜绿假单胞菌外毒素A，以核酸适配体ETA01作为识别元件，能利用比色法生物传感器、凝胶迁移阻滞实验、酶联适配体吸附法检测铜绿假单胞菌ETA。因此，利用该核酸适配体ETA01在开发各种铜绿假单胞菌外毒素A检测方法方面，具有广泛应用潜力和价值。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 福州市长乐区宝爱冬医学技术有限公司
<120> 铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tgcaactcca actaaccatg tgttcatctg agggtggtct tcgca 45

Claims (7)

1.一种铜绿假单胞菌外毒素A的核酸适配体ETA01，其特征在于，其序列包括如SEQ IDNO.1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体ETA01，其特征在于，在25℃，100mM Na+，1mM Mg2+的条件下，所述核酸适配体ETA01的空间结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
3.根据权利要求1或2所述的核酸适配体ETA01，其特征在于，对所述核酸适配体ETA01的5’端或3’端进行化学基团修饰。
4.权利要求1~3任一项所述的核酸适配体ETA01在制备检测铜绿假单胞菌外毒素A的检测试剂盒中的应用。
5.权利要求1~3任一项所述的核酸适配体ETA01在制备检测铜绿假单胞菌外毒素A的分子探针中的应用。
6.权利要求1~3任一项所述的核酸适配体ETA01在非疾病诊断和治疗目的的检测铜绿假单胞菌或铜绿假单胞菌外毒素A中的应用。
7.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的核酸适配体ETA01。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753789A (zh) * 2018-05-25 2018-11-06 中国海洋大学 核酸适配体的筛选方法及特异性结合铜绿假单胞菌的核酸适配体

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753789A (zh) * 2018-05-25 2018-11-06 中国海洋大学 核酸适配体的筛选方法及特异性结合铜绿假单胞菌的核酸适配体

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Detection of methods for Pseudomonas aeruginosa:history and future perspective;Tang，Y.J.等;《ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY》;20171108;第7卷;第51789-51800页 *
Selection of Single-Stranded DNA Molecular Recognition Elements against Exotoxin A Using a Novel Decoy-SELEX Method and Sensitive Detection of Exotoxin A in Human Serum;HONG，K.L.等;《BioMed Research International》;20151231;第2015卷;摘要，图4，表2 *
铜绿假单胞菌表面脂多糖适配体的筛选及其抑制巨噬细胞极化的研究;孙颖 等;《中华微生物学和免疫学杂志》;20181231;第38卷(第5期);摘要 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115011604A (zh) * 2022-07-26 2022-09-06 长沙医学院 铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白PilA的适配体PilA-1及用途
CN115011604B (zh) * 2022-07-26 2023-10-27 长沙医学院 铜绿假单胞菌IV型菌毛蛋白PilA的适配体PilA-1及用途

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