CN112322625B - 一种特异性识别牛、羊妊娠相关糖蛋白的广谱型核酸适配体及其应用 - Google Patents

一种特异性识别牛、羊妊娠相关糖蛋白的广谱型核酸适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种特异性结合牛、羊妊娠相关糖蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体序列包括SEQ ID No.1序列或SEQ IDNo.2序列所示的DNA片段中任一种。本发明的核酸适配体还可以是各种同源性较高的类似序列或由本发明序列得到的衍生物。本发明还提供了核酸适配体的应用。本发明的核酸适配体是以磁珠为固相载体，通过切换‑SELEX技术筛选获得的，可同时结合牛、羊妊娠相关糖蛋白（PAG），可用于PAG蛋白的检测、分离纯化及牛、羊早孕快速诊断。

Description

一种特异性识别牛、羊妊娠相关糖蛋白的广谱型核酸适配体 及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种特异性识别牛、羊妊娠相关糖蛋白的核酸适配体衍生物，尤其涉及该核酸适配体在妊娠相关糖蛋白（PAG）检测和家畜早期妊娠诊断中的应用。
背景技术
在牛、羊养殖中，母畜繁殖力是决定养殖经济效益的关键。若能在配种后对母畜准确及时早期妊娠诊断，对未孕母羊及时采取复配措施，不仅有利于缩短空胎时间，提高母畜的繁殖效率，也有助于进行分群饲养管理，降低饲养成本。因此，早期妊娠技术对提高母畜繁殖效率和养殖经济利益具有重要意义。
妊娠相关糖蛋白（pregnancy-associated glycoproteins, PAG）是偶蹄动物胎盘滋养层细胞合成和分泌的一类糖蛋白，对维持妊娠发挥着重要作用。在胚胎附植后进入母体血液，常作为一种标志物用于家畜早期妊娠诊断（Zoli 等 1992；Friedrich 等，2010；Reese 等，2018）。
近年来，基于免疫分析技术检测血液或乳样中PAG已成为家畜早期妊娠的一种主流方法（Dufour 等2017；Kaya 等2016；Commun 等2016），可对怀孕3-4周的母畜进行早期妊娠诊断，诊断准确率达到90%以上（Rovani等2016；Chaves等2017；Ricci 等2015；张春刚等2015；Karen 等2015）。目前商品化的PAG-ELISA检测试剂盒已应用于生产，但该类试剂盒价格颇高，限制了其在国内大规模推广使用。因此，基于PAG的国产检测成品亟待开发。
近些年，核酸适配体（Aptamer）作为新型识别分子逐渐成为研究热点。与传统的抗体相比，适配体具有适应范围广，高亲和力和高特异性；不受免疫条件和免疫原性限制；制备简单，可体外人工合成；变性与复性可逆，稳定性高；易于改造、标记和保存等优点。因此，核酸适配体作为一种理想的分子探针在分析检测领域得到了广泛应用。目前，还未见到同时识别牛、羊PAG的核酸适配体的文献报道。
发明内容
要解决的技术问题：针对现有PAG检测产品价格过高等问题，本发明提出了一种特异性识别牛、羊妊娠相关糖蛋白的广谱型核酸适配体及其应用，本发明对牛、羊PAG蛋白具有高的亲和力，作为识别分子应用于家畜早孕检测，可大大降低检测成本。
技术方案：一种特异性识别牛、羊妊娠相关糖蛋白的广谱型核酸适配体，所述核酸适配体序列为包括以下SEQ IDNo .1序列所示的DNA片段或SEQ IDNo .2序列所示的DNA片段或从其中截取的任一片段，其中，
SEQ IDNo .1序列：5’X-ATCATCATTCAGCGTAGGGTTTGGCACTGGGCCTGG-Y-3’，其中ATCATCATTCAGCGTAGGGTTTGGCACTGGGCCTGG为核心序列1；
SEQ IDNo .2序列：5’X-GGGTGCTCAATGGGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAAA-Y-3’，其中GGGTGCTCAATGGGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAAA为核心序列2；
所述序列中X、Y各自独立地为A、T、C、G中的至少一个碱基，所述X为：CTACGGTGCCTTGAAGTGAC，所述Y为：CATAGCAGGTCACTTCCAGG。
优选的，所述核酸适配体序列可被修饰，所述修饰包括氨基化、羧基化、巯基化、同位素化磷酸化、甲基化。
优选的，所述核酸适配体序列上可连接荧光标记物、放射性物质、生物素、链霉亲和素、地高辛、纳米发光材料或酶。
优选的，所述核酸适配体序列还包括以下序列中的任意一种：
（1）与SEQ ID No .1或SEQ ID No .2所示DNA序列具有60％以上同源性，且能够特异性结合牛、羊妊娠相关糖蛋白的DNA序列。
（2）SEQ IDNo .1或SEQ IDNo .2所示核苷酸序列在两端完全或部分截去X、Y的序列。
（3）与SEQ IDNo .1或SEQ IDNo .2所示序列在两端完全或部分截去X、Y的序列具有60％以上同源性，且能够特异性结合牛、羊妊娠相关糖蛋白的核酸序列。
（4）截取核心序列1或核心序列2所示DNA序列中的一段，且能够特异性结合牛、羊妊娠相关糖蛋白的DNA序列。
一种特异性识别牛、羊妊娠相关糖蛋白的广谱型核酸适配体衍生物，所述核酸适配体衍生物包括：
（1）将SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示核酸适配体序列任意一条缺失、增加或替换一个或多个碱基，得到与该核酸适配体相同功能的核酸适配体衍生物；
（2）将SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示核酸适配体序列任意一条的分子骨架进行修饰，得到与该核酸适配体相同功能的核酸适配体衍生物；
上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在检测和制备PAG的应用。
上述核酸适配体或核酸适配体衍生物在家畜早期妊娠诊断产品中的应用。
有益效果：本发明具有以下有益效果：
（1）利用切换-指数级富集配体系统进化技术（Toggle-SELEX），以磁珠为固相载体，依次以牛PAG9（bPAG9）和羊PAG7（ovPAG7）为靶蛋白进行多轮筛选，获得两条高亲和力的广谱型核酸适配体，可选择性识别牛、羊PAG家族蛋白，解离常数为12.8-24.1 nM；
（2）本发明获得的核酸适配体具有良好的亲和力和特异性，可人工合成，生产成本低、易于化学修饰；
（3）可将本发明的适配体制备成分子探针、检测试剂等，用于PAG蛋白的检测、分离纯化及家畜早孕诊断，与传统的抗体相比，大大降低生产成本和检测成本。
附图说明：
图1为每轮筛选获得的ssDNA文库与ovPAG7和bPAG9蛋白结合能力分析图。
图2为每轮筛选获得的ssDNA富集文库的琼脂糖电泳图，奇数轮为针对ovPAG7的富集文库，偶数轮为bPAG9的富集文库。
图3为通过长短链法制备的带有荧光标记的单链DNA目的条带。
图4为本发明提供的核酸适配体与靶标PAG蛋白的饱和结合曲线图，其中，图a、b为SEQIDNo .1所示的核心序列1与ovPAG7和bPAG9蛋白的结合曲线图，图c、d为SEQIDNo .2所示的核心序列2与ovPAG7和bPAG9蛋白的结合曲线图。
图5为本发明提供的核酸适配体优选实施例的二级结构图，其中，a为SEQ IDNo .1所示的核心序列1的二级结构图，图b为SEQ IDNo .2所示的核心序列2的二级结构图。
图6为SEQ IDNo .1 和SEQ IDNo .2所示核心序列1和核心序列2的特异性实验结果。
图7为实施例4中双适配体夹心法比色检测妊娠母畜血清的结果图。+：阳性对照，-：阴性对照，1、3：怀孕母羊血清，2：未孕母羊血清，4、5：为怀孕奶牛血清。
图8为实施例4中妊娠母羊和奶牛的B超验证结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对发明进一步阐述，以便本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定而不用来限制本发明的范围。
下述实施例中羊妊娠相关糖蛋白7（ovPAG7）、牛妊娠相关糖蛋白6、9（bPAG6、bPAG9）由本实验室自制，其他所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到；以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：PAG广谱型核酸适配体的筛选
1. 合成随机单链DNA(ssDNA)文库和引物：
随机单链DNA(ssDNA)文库：
5’- CTACGGTGCCTTGAAGTGAC-N36-CATAGCAGGTCACTTCCAGG-3’，其中，N36 代表36个随机核苷酸，该文库由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
上游引物： 5’-FAM- CTACGGTGCCTTGAAGTGAC-3’，
下游引物： 5’- 20A-spacer18-CCTGGAAGTGACCTGCTATG-3’，
其中，下游引物中，20A表示由20个腺苷酸（A）组成的polyA尾，Spacer 18表示18原子的六乙二醇间臂，上述引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
将随机单链DNA文库、5’端引物和3’端引物分别用结合缓冲溶液（BB：NaCl 136.89mM，KCl 2.68 mM，Na2HPO4 8.09 mM，KH2PH4 1.47 mM，CaCl2 0.9 mM，MgCl·6H2O 0.49 mM；PH 7 .4）溶解，于-20℃保存备用。
2. 磁珠-PAG蛋白（MB-PAG）偶联
取羧基化的磁珠50 μL，BB缓冲液洗涤，取0.1 M NHS+0.4 M EDC混合溶液（v/v，1:1）50 μL加入到磁珠中，震荡反应20 min；活化完毕，磁分离，BB缓冲液洗涤，加入NaAC（10mM, pH 5.0）和PAG蛋白（ovPAG7或bPAG9，1 mg/mL），震荡反应60 min；偶联结束，磁分离，BB缓冲液洗涤后，加入100 μL的乙醇胺（1.0 M, pH8.5)，震荡反应20 min；磁分离，BB缓冲液洗涤，磁珠重悬于BB缓冲液，4℃保存备用。磁珠-牛血清白蛋白（MB-BSA）的偶联同以上方法。MB-ovPAG7和MB-bPAG9作为正筛靶标，MB-BSA作为反筛靶标。
3. 筛选
3.1 孵育与分离：用BB缓冲液溶解1OD随机单链DNA文库，使其浓度为5 μM，PCR仪中95℃变性10 min，冰水浴5 min，瞬离，室温备用；取变性好的200 μL文库加入到MB-BSA磁珠中，震荡孵育60 min；磁分离，上清加入到MB-ovPAG7，震荡孵育60 min，磁分离，弃上清，加入PBB缓冲液，沸水煮10 min，磁分离，收集上清；
3.2 PCR扩增：将步骤3.1中获得的文库加入到2 mL PCR mix，混匀，分装成每管100 μL，进行PCR扩增。PCR扩增程序：95℃ 1 min，95℃ 1 min 、60℃ 1 min、72℃ 1 min、25个循环，72℃ 5 min，25℃ 1 min；
3.3 PCR产物浓缩：收集PCR扩增产物，加约5倍体积的正丁醇，涡旋混匀，7500 rpm离心5~10 min，弃上相正丁醇，下层为扩增的dsDNA产物；
3.4长短链法制备单链DNA：取5 mL聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）混合液、40 μL 10%APS、10 μL TEMED，混匀，快速加入制胶板中，插入梳子，室温放置约20 min，使其凝固，将其放入电泳槽，加入1×TBE电泳液。将浓缩的PCR产物加入等体积的2×TBE/尿素变性缓冲液，PCR仪中 95℃变性10 min，然后将其加入到PAGE胶的上样孔中，300 V电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使带有PolyA的单链DNA与FAM标记的单链DNA分开（图1）。取下PAGE胶，于紫外灯下用干净的刀片切下带荧光的条带，装入0.5 mL碎胶离心管，放入2 mL离心管中，14000rpm离心1 min，弃碎胶离心管，加入BB缓冲液，沸水煮10 min，上清转移至15 mL离心管中，依照步骤3.3浓缩单链DNA。然后装入至3KD的透析袋，在BB缓冲液中4℃透析过夜。次日，NanoDrop-2000c超微量分光光度计测定核酸浓度。获得的ssDNA作为次级文库与第二靶标蛋白MB-bPAG9以相同的方法进行下一轮筛选。
4. 多轮筛选
将上述步骤3.4中得到的ssDNA作为文库进行下一个循环，以此类推重复8个循环即16轮筛选，ovPAG7为奇数轮，bPAG9为偶数轮，为提高适配体的特异性和稳定性，从第4个循环在筛选文库中加入10%的胎牛血清。筛选过程中用 Thermo Scientific™ Varioskan™ Flash多功能酶标仪检测每轮ssDNA富集文库对靶标蛋白ovPAG7和bPAG9的结合能力。
5.每轮ssDNA文库与靶蛋白的结合力测定
将每一轮获得的FAM标记的ssDNA文库用BB缓冲液稀释至浓度为0.5 μM，90℃变性10 min，冰水浴5 min，然后分别与MB-ovPAG7或MB-bPAG9孵育60min，磁分离，用BB缓冲液清洗2次，200 μL BB重新悬浮磁珠，使用Thermo Scientific™ Varioskan™ Flash多功能酶标仪（λEx=492nm，λEm=518nm）检测每轮ssDNA文库与靶标的结合情况。结果如图2所示，当荧光值不再增加时，表示适配体已得到富集，停止筛选。然后，将每轮ssDNA文库进行3%琼脂糖电泳，Bio-Rad凝胶成像仪检测，结果如图3所示，在76 bp处有单一的每轮ssDNA电泳条带。以上结果表明，适配体筛选成功。
6. 克隆与测序
将末轮筛选得到的ssDNA富集库用无修饰的引物扩增，PCR 产物经纯化后用pGEM-T 载体（Takara Biotech. Co., Ltd）克隆，并转化到E.Coli DH5α中。随机挑选40个阳性克隆送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成测序，对测序成功的适配体序列采用GLUSTALX 软件对其进行同源性分析，将其分为4个家族。基于最低自由能原则，从每个家族中选出1条序列为代表，将两端固定引物序列截去，并在5’端标记FAM基团，送往上海生工合成。采用步骤5测定与ovPAG7和bPAG9的结合能力，挑选出亲和力高的适配体序列进一步测定其解离常数和特异性。
实施例2、解离常数（K d）测定及二级结构预测
选择实施例1中两条结合能力高的核酸适配体，分别用BB缓冲液配制成一系列梯度浓度（0、100、 200 、400、800、1600、3200、6400 nM）的适配体溶液；按步骤4依次分析每条核酸适配体与ovPAG7和bPAG9的结合情况，利用GraphPad Prism 7.0 软件拟合结合曲线，计算各核酸适配体的解离常数（K d 值）。图4为SEQ IDNo .1和SEQ IDNo .2所示的核心序列分别与靶标蛋白的饱和结合曲线，两条适配体与ovPAG7和bPAG9均具有高的亲和力，解离常数为12.8-24.1 nM。采用在线Mfold 对SEQ IDNo .1和SEQ IDNo .2所示的核心序列进行二级结构预测分析，结果如图5所示，具有典型的茎环结构。
实施例3：核酸适配体的特异性分析
将SEQ IDNo .1和SEQ IDNo .2所示的核心序列送往上海生工合成，并在5’端标记biotin基团。ovPAG7、bPAG6、bPAG9、BSA、OVA等蛋白用10 mM PBS稀释至3 μg/mL，然后包被于96-孔酶标板，4℃包被过夜。然后用200 μL PBST（10 mM PBS, 0.05% Tween-20，pH 7.0）洗涤酶标板3次，加入200 μL封闭液（1% BSA）封闭2 h，PBST洗涤3次。加入100 μL 的biotin-适配体（100 nM），温育20 min，PBST洗涤3次，拍干。每孔加入100 μL 的SA-HRP（0.5U/mL），PBST洗涤3-5次，拍干后加入100 μL TMB底物显色液，反应5-7 min。最后加入100 μL终止液终止反应，采用酶标仪在450 nm（OD450nm）处测其吸光值。检测结果见图6，SEQ IDNo.1和SEQ IDNo .2所示的核心序列与牛、羊PAG蛋白有较高的结合能力，吸光值为0.278~0.331，而BSA、OVA及空白对照组的OD450nm值均小于0.07。说明筛选的适配体对BSA、OVA等无交叉反应。
实施例4：双适配体夹心法比色检测家畜血清中PAG
将SEQ IDNo .1和SEQ IDNo .2所示的核心序列用于家畜早期妊娠诊断。分别选择配种后 21 d和28 d的绵羊和奶牛，静脉采集血液，室温下放置约1-2 h，血清自动析出，收集血清。将血清样品用BB缓冲液稀释2倍，采用双适配体夹心原理检测血清样品，以ovPAG7和bPAG9蛋白为阳性对照，以未怀孕家畜血清作为阴性对照。检测步骤如下：取包被有链霉亲和素的酶标板数条，每孔加200 μL PBST洗涤液（10mM PBS，pH7.4，0.05% Tween-20），洗涤3-5次。加入200 μL的封闭液（1% BSA），室温孵育2 h，PBST洗涤3-5次，拍干。加入100 μL生物素标记核心序列1（100 nM），室温孵育20 min，PBST洗涤，拍干；加入100 μL绵羊或奶牛的血清样品， 37℃孵育20 min，PBST洗涤，拍板；然后加入100 μL核心序列2（100 nM），37℃孵育20 min，PBST洗涤，拍板；加入100 μL SA-HRP（0.05 U/mL）溶液，室温反应15 min，PBS洗涤，拍干；每孔加入100 μL TMB显色液，避光显色5-7 min，加入100 μL 终止液（2.0 MH2SO4）。通过目测孔内溶液颜色变化以判定母畜是否怀孕，样品孔中颜色等同或接近阳性对照的判定为阳性，即怀孕，样品反应孔颜色比阴性对照孔浅或相同、或无色，则判定为未孕。图7为家畜血清样品检测结果图。将判定为怀孕和未孕的母畜在配种后第30~45 d采用B超法进行验证，其判定结果与B超检测结果一致。
以上实施例仅为本发明的具体实施方式，但并不能理解为对本发明专利范围的限制。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 长江师范学院
<120> 一种特异性识别牛、羊妊娠相关糖蛋白的广谱型核酸适配体及其应用
<130> 2020.11.11
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 1
atcatcattc agcgtagggt ttggcactgg gcctgg 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 2
gggtgctcaa tgggggtctg ctcgggattg cggaaa 36
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 3
ctacggtgcc ttgaagtgac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 4
catagcaggt cacttccagg 20

Claims (5)

1.一种特异性识别牛、羊妊娠相关糖蛋白的广谱型核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为以下SEQ IDNo .2序列所示的DNA片段，
SEQ IDNo .2序列：5’X-GGGTGCTCAATGGGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAAA-Y-3’，其中GGGTGCTCAATGGGGGTCTGCTCGGGATTGCGGAAA为核心序列2；
所述X为：CTACGGTGCCTTGAAGTGAC，所述Y为：CATAGCAGGTCACTTCCAGG。
2.根据权利要求1所述的一种特异性识别牛、羊妊娠相关糖蛋白的广谱型核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列可被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、羧基化、巯基化、同位素化。
3.根据权利要求1所述的一种特异性识别牛、羊妊娠相关糖蛋白的广谱型核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体序列上可连接荧光标记物、放射性物质、生物素、链霉亲和素、地高辛、纳米发光材料、酶。
4.如权利要求1-3任一项所述核酸适配体在制备分离富集和分析检测牛、羊妊娠相关糖蛋白的应用。
5.如权利要求1-3任一项所述核酸适配体在制备牛、羊早期妊娠诊断产品中的应用。
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