CN110699241A - 一种自动化消毒效果快速评价装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自动化消毒效果快速评价装置，工作台上的两侧分别设有第一支撑架和第二支撑架，第一支撑架和第二支撑架上部之间设有横梁，横梁上设有自动移液装置，自动移液装置沿横梁左右滑动，第一支撑架和第二支撑架的中部设有滑轨，检测通道内设有与滑轨配合的移动滑块，检测通道通过移动滑块沿滑轨左右移动，自动移液装置位于检测通道的上方，磁吸附装置和恒温装置位于检测通道下方，磁吸附装置和恒温装置分别与控制电机连接，控制电机固定于台面上，滑轨与荧光检测装置的样品台相接。其优点在于：与它将细菌洗脱、富集、染色和检测整合在一起，简化了人工操作，只需要加入样本，在1.5小时内可以完成检测，显著缩短了消毒检测周期。
Description
技术领域
本发明属于一种消毒领域应用的装置，具体涉及一种自动化消毒效果快速评价装置及方法，主要应用于活/死菌的富集检测。
背景技术
消毒是预防和控制病原微生物传(感)染的必要措施，如果消毒不彻底，很可能导致极为严重的后果，因此消毒效果评价具有重要意义。通过对消毒过程使用生物指示菌进行消毒效果评价是现阶段最有效、最可靠的验证方法。根据卫生部颁布的《GB15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准》规定要求，消毒后，生物指示菌的杀灭率≥99.9％时方可判断为消毒合格。
传统的消毒效果评价方法是基于微生物可培养性的平板培养计数法，这种方法耗时长，往往需要24-48小时，甚至更久，无法实现快速判读，不适用于即现场检测，而且在实际检测中人工操作易引入污染，影响检测结果准确性。荧光标记检测法是常见的实验室活/死菌区分检测方法，在消毒灭菌评价的应用中需要对暴露后的生物指示剂进行洗脱、富集、分离、检测等操作，但是过程设计实验操作较复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种自动化消毒效果快速评价装置及方法，它能够简化人工操作步骤，实现消毒效果评价的自动化。
本发明的技术方案如下：一种自动化消毒效果快速评价装置，它包括自动移液装置，检测通道，磁吸附装置，恒温装置、荧光检测装置、控制电机、工作台、第一支撑架和第二支撑架，所述的工作台上的两侧分别设有第一支撑架和第二支撑架，第一支撑架和第二支撑架上部之间设有横梁，横梁上设有自动移液装置，自动移液装置沿横梁左右滑动，第一支撑架和第二支撑架的中部设有滑轨，检测通道内设有与滑轨配合的移动滑块，检测通道通过移动滑块沿滑轨左右移动，检测通道用于放置以每个评价检测为单位的单个检测封装试剂检测卡，自动移液装置位于检测通道的上方，磁吸附装置和恒温装置位于检测通道下方，磁吸附装置和恒温装置分别与控制电机连接，控制电机固定于台面上，滑轨与荧光检测装置的样品台相接。
所述的检测封装试剂检测卡为板状部件，依次设置有第一样本孔，第二样本孔，第一试剂槽，第二试剂槽，第三试剂槽和检测区。
所述的磁吸附装置位于检测封装试剂检测卡的第一样本孔的下方。
所述的恒温装置位于检测封装试剂检测卡的第二样本孔的下方。
所述的荧光检测装置用于检测染色后的细菌样本。
所述的荧光检测装置包括沿光路依次设置的光源、滤光片、焦平面、物镜、滤光片、聚焦镜和相机；其中，光源为LED光源，中心波长475nm，功率大于1w；滤光片为带通滤光片，450-490nm透射率大于80％，500-650nm透射率小于0.01％；物镜数值孔径大于0.2；滤光片为长波通滤光片，400-500nm透过率小于0.01％，520-650nm透过率大于80％；聚焦镜焦距大于50mm，相机为彩色面阵相机，分辨率大于300万像素，相机位于聚焦镜的后焦面处。
一种消毒效果快速评价检测方法，包括如下步骤，
步骤一：载菌片制备
将直径1cm的灭菌不锈钢片平放于灭菌平皿内，每个载体滴注定量指示菌悬液，载体回收菌量5×105～5×106cfu/片，涂匀，放置37℃环境下烘干；
步骤二：将载菌不锈钢片在VHP消毒设备中暴露60分钟(实际应用中可根据实际情况确定暴露时间，如一个消毒运行周期)，消毒处理结束后取出不锈钢菌片；
步骤三：加样
将经过消毒的载菌不锈钢片加入到装有洗脱液的器皿中，获得细菌样本，
步骤四：富集分离指示微生物
吸取50uL氨基磁珠加入步骤三的器皿中，将其在37℃环境下温浴1小时，每15min吹打混匀一次，温浴结束后吸取1mL混合液加入另一个器皿中，同时移除恒温；
步骤五：对步骤四中的器皿进行磁吸附，静置吸附5min，后移除上清液900uL至步骤三所述的器皿中，留下富集后的细菌磁珠混合样本，移除磁吸附；
步骤六：双重荧光标记活/死菌
吸取3.5μL检测试剂2加入步骤四所述的另一个器皿中，然后吸取3μL检测试剂1加入步骤四所述的另一个器皿中，混匀，室温下避光孵育15min；
步骤七：由步骤四中所述的器皿中吸取步骤六中得到的样本4.5μL加入检测区16，通过荧光检测装置获得荧光信号；
步骤八：通过数据处理得到活/死菌含量、散点图及杀灭率；
步骤九：由步骤八中结果判断消毒是否合格。
所述的步骤三中，所述的洗脱液为含0.1％硫代硫酸钠、1％蛋白胨、0.1％吐温-80、0.03mol/L PBS，pH<7.0。
所述的步骤四中氨基磁珠为300nm粒径，四氧化三铁磁珠，携带氨基基团，氨基磁珠带正电，细菌细胞表面电荷为负，两者可通过静电作用结合，在消毒效果验证中对样本中细菌进行非特异性富集。
所述骤六中，所述的检测试剂1为SYTO-9，检测试剂2为PI。
本发明的有益效果在于：与现有人工操作进行检测相比，本发明将细菌洗脱、富集、染色和检测整合在一台设备中，大大简化了人工操作，操作者只需要加入样本，在1.5小时内可以完成检测，显著缩短了消毒检测周期。在实际消毒效果评价应用中该装置通过计算检测样本中被标记的活菌、死菌的荧光点数得到指示菌杀灭率；使用简便，检测快捷，结果准确，灵敏度高，为消毒效果的自动化评价提供了支持。
附图说明
图1为本发明所提供的一种自动化消毒效果快速评价装置结构示意图；
图2为单个检测封装试剂检测卡示意图；
图3为自动移液装置及磁吸附装置相对检测卡的操作路径示意图；
图4为荧光检测装置光路系统结构示意图；
图5为消毒前后样本荧光检测结果示例，图中(a)为未经消毒灭菌样本的荧光检测绿色特征值；(b)为未经消毒灭菌样本的荧光检测红色特征值；(c)为VHP消毒30分钟样本的荧光检测绿色特征值；(d)为VHP消毒30分钟样本的荧光检测红色特征值。
图中：1自动移液装置，2检测通道，3磁吸附装置，4恒温装置，5荧光检测装置，6控制电机，7工作台，8第一支撑架，9第二支撑架，10检测封装试剂检测卡，11第一样本孔，12第二样本孔，13第一试剂槽，14第二试剂槽，15第三试剂槽，16检测区，21光源，22滤光片，23焦平面，24物镜，25滤光片，26聚焦镜，27相机。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明。
如图1所示，一种自动化消毒效果快速评价装置结构示意图包括自动移液装置1，检测通道2，磁吸附装置3，恒温装置4、荧光检测装置5，控制电机6，工作台7，第一支撑架8和第二支撑架9，其中，工作台7上的两侧固定有第一支撑架8和第二支撑架9，第一支撑架8和第二支撑架9上部之间设置有横梁，横梁上设置有自动移液装置1，自动移液装置1可沿横梁左右滑动，第一支撑架8和第二支撑架9的中部设置有滑轨，检测通道2内设置有与滑轨配合的移动滑块，检测通道2通过移动滑块沿滑轨左右移动，检测通道2用于放置以每个评价检测为单位的单个检测封装试剂检测卡10，如图2所示，检测封装试剂检测卡10为板状部件，其上依次设置有第一样本孔11，第二样本孔12，第一试剂槽13，第二试剂槽14，第三试剂槽15和检测区16，自动移液装置1位于检测通道2的上方，以便进行移液操作，磁吸附装置3和恒温装置4位于整个装置左下方分别对应检测封装试剂检测卡10的第一样本孔11和第二样本孔12，荧光检测装置5位于装置右部，其中样品台及以下的光路构成部分(具体包括光源21，滤光片22和焦平面23)固定于工作台7上，物镜24及以上的光路构成部分(具体包括物镜24、滤光片25、聚焦镜26和相机27)与第一支撑架8相接，物镜24距离样品台10.6mm；磁吸附装置3和恒温装置4分别与控制电机6连接，控制电机6固定于台面7上，检测通道2位于装置左中部，其滑轨与荧光检测装置5的样品台相接，以便控制检测卡准确到达荧光检测区域。
如图3所示，恒温装置4用于提供磁珠吸附细菌过程需要的温度，恒温装置可变动地放置在检测封装试剂检测卡10下方，通过电机控制可上下方向运动；在本发明的实施例中用于检测过程需要37℃恒温环境时，通过控制电机6将恒温装置4上升至适当位置，向该试管提供37℃恒温环境，温浴结束后，将温浴后的液体移出，以便对检测液体进行下一步操作，再通过控制电机6将恒温装置4恢复至原位，使其离开试管。
磁吸附装置3用于提供磁珠富集细菌需要的磁场，磁吸附装置3在上下方向可变动地放置在检测封装试剂检测卡10下方，当对检测液中的细菌进行富集需要磁场环境时，通过控制电机6将磁吸附装置3放置于反应试管下方，待一段时间后将试管中的上清液移出至空试管，然后再通过控制电机6将磁吸附装置3下降至一定高度，使其离开试管，以便下一步染色操作。
如图2所示，检测封装试剂检测卡在本发明的实施例中第一样本孔11内放置一个空试管，第二样本孔12内放置有常规试剂，第一试剂槽13装有氨基磁珠悬液，第二试剂槽14和第三试剂槽15为两个装有检测试剂的避光试管，试剂卡常规存储于4℃条件下。
其中，检测通道2内置移动滑块可沿滑轨左右移动，当样本前处理完毕加入检测区，需要进行荧光检测时检测卡可移动至荧光检测装置检测台，其余时刻均保持在初始位置。
荧光检测装置5用于检测染色后的细菌样本。主要是通过检测被测染色样本经激发后发射出的不同波长的荧光，实现对活菌和死菌的准确、快速计数。
如图4所示为荧光检测装置光路系统结构图。荧光检测装置检测样本的荧光信号，得到样本活菌与死菌的比例，即消毒处理对指示微生物的杀灭率(结果以数值百分比和散点图两种方式呈现，直观反映杀灭率)，依据该结果可对消毒效果进行准确评价。
如图4所示，荧光检测装置5包括沿光路依次设置的光源21，滤光片22，焦平面23，物镜24，滤光片25，聚焦镜26和相机27。其中，光源21为LED光源，中心波长475nm，功率大于1w；滤光片22为带通滤光片，450-490nm透射率大于80％，500-650nm透射率小于0.01％；物镜24数值孔径大于0.2，物镜距离样品台10.6mm；滤光片25为长波通滤光片，400-500nm透过率小于0.01％，520-650nm透过率大于80％；聚焦镜26焦距大于50mm，相机27为彩色面阵相机，分辨率大于300万像素，相机27位于聚焦镜26的后焦面处。
当检测封装试剂检测卡10放置于检测通道2后，通过控制电机6控制实现精确运动，即可控制自动移液装置进行移液操作，移液装置为单通道单机械臂装备附带单道分液器，在检测程序的控制下可以对相应试管进行移液操作，最终完成细菌的洗脱、富集、分离、染色和检测一体化。
该评价检测装置通过数据通信模块实现各个装置与上位机控制程序间的数据传输，最终直接得到样本活菌与死菌的比例，依据此数值可对消毒效果进行准确评价。另外，本自动化消毒效果评价检测装置通过上位机程序控制各模块运行并以具体数值和散点图的形式直观显示检测结果以便操作者查看，为下一步工作提供快速、准确的参考。
本发明提供的一种消毒效果快速评价检测方法，用于快速评价VHP消毒效果，包括如下步骤：
步骤一：载菌片制备
将直径1cm的灭菌不锈钢片平放于灭菌平皿内，每个载体滴注定量菌悬液，载体回收菌量5×105～5×106cfu/片，涂匀，放置37℃环境下烘干，本实施例中放置在培养箱烘干；
步骤二：将载菌不锈钢片在VHP消毒设备中暴露60分钟(实际应用中可根据实际情况确定暴露时间，如一个消毒运行周期)，消毒处理结束后取出不锈钢菌片；
步骤三：加样
将经过消毒的载菌不锈钢片加入到装有洗脱液的器皿中，本实施例中选择检测卡提供的装有950uL洗脱液的第二样品孔12中，吹打至少80次，获得细菌样本，其中，洗脱液为含0.1％硫代硫酸钠、1％蛋白胨、0.1％吐温-80、0.03mol/L PBS，pH<7.0；将经过消毒的载菌不锈钢片加入到上述，吹打80次，获得细菌样本；
步骤四：富集分离指示微生物
在装有磁珠的试剂槽中吸取50uL氨基磁珠加入步骤三的器皿中，将其在37℃环境下温浴1小时，每15min吹打混匀一次，温浴结束后吸取1mL混合液加入另一个器皿中，同时移除恒温；
本实施例中选择在装有磁珠的第一试剂槽13中吸取50uL氨基磁珠加入第二样品孔12中，将其在37℃恒温装置中温浴1小时，每15min吹打混匀一次，温浴结束后吸取1mL混合液加入第一样本孔11中，同时移除恒温装置；
其中，氨基磁珠为300nm粒径，四氧化三铁磁珠，携带氨基基团，氨基磁珠带正电，细菌细胞表面电荷为负，两者可通过静电作用结合，在消毒效果验证中对样本中细菌进行非特异性富集，因此直接选用粒径100-300nm的氨基磁珠即可达到高效的细菌富集效果；
步骤五：对步骤四中的器皿进行磁吸附，静置吸附5min，后移除上清液900uL至步骤三所述的器皿中，留下富集后的细菌磁珠混合样本，移除磁吸附；
本实施例中选择将磁吸附装置放置在第一样本孔11下方，静置吸附5min，后移除上清液900uL至第二样本孔12中，留下富集后的细菌磁珠混合样本，移除磁吸附装置；
步骤六：双重荧光标记活/死菌
吸取3.5μL检测试剂2加入步骤四所述的另一个器皿中，然后吸取3μL检测试剂1加入步骤四所述的另一个器皿中，混匀，室温下避光孵育15min；其中，检测试剂1为SYTO-9，检测试剂2为PI；
本实施例中选择由第二试剂槽14中吸取3.5μL检测试剂2加入第一样本孔11中，然后由第三试剂槽15中吸取3μL检测试剂1加入第一样本孔11，混匀，室温下避光孵育15min；其中，检测试剂1为SYTO-9，检测试剂2为PI；
步骤七：由步骤四中所述的器皿中吸取步骤六中得到的样本4.5μL加入检测区16，通过荧光检测装置获得荧光信号；
本实施例中通过由第一样本孔11中吸取步骤六中得到的样本4.5μL加入检测区16，通过荧光检测装置获得荧光信号；
步骤八：通过数据处理得到活/死菌含量、散点图及杀灭率，如图5所示为消毒前后样本荧光检测结果示例，可以看出，样本的荧光检测结果有明显区别，具体体现在绿色特征值和红色特征值的比例；
步骤九：由步骤八中结果判断消毒是否合格。
本发明将细菌洗脱、富集、染色和检测整合在一台设备中，大大简化了人工操作，操作者只需要加入样本，在1.5小时内可以完成检测，显著缩短了消毒检测周期。同时，该装置使用以每个检测为单位封装试剂的检测卡，可同时提供检测过程中需要的洗脱、富集、检测试剂及检测区，集样本预处理与荧光检测于一体，而且有效避免了人工操作中可能对试剂造成的污染。
上述说明描述了本发明在消毒效果快速评价中的具体实施例，本发明还可用于其他活/死菌区分检测的场合。
Claims (10)
1.一种自动化消毒效果快速评价装置，其特征在于：它包括自动移液装置(1)，检测通道(2)，磁吸附装置(3)，恒温装置(4)、荧光检测装置(5)、控制电机(6)、工作台(7)、第一支撑架(8)和第二支撑架(9)，所述的工作台(7)上的两侧分别设有第一支撑架(8)和第二支撑架(9)，第一支撑架(8)和第二支撑架(9)上部之间设有横梁，横梁上设有自动移液装置(1)，自动移液装置(1)沿横梁左右滑动，第一支撑架(8)和第二支撑架(9)的中部设有滑轨，检测通道(2)内设有与滑轨配合的移动滑块，检测通道(2)通过移动滑块沿滑轨左右移动，检测通道(2)用于放置以每个评价检测为单位的单个检测封装试剂检测卡(10)，自动移液装置(1)位于检测通道(2)的上方，磁吸附装置(3)和恒温装置(4)位于检测通道(2)下方，磁吸附装置(3)和恒温装置(4)分别与控制电机(6)连接，控制电机(6)固定于台面(7)上，滑轨与荧光检测装置(5)的样品台相接。
2.如权利要求1所述的一种自动化消毒效果快速评价装置，其特征在于：所述的检测封装试剂检测卡(10)为板状部件，依次设置有第一样本孔(11)，第二样本孔(12)，第一试剂槽(13)，第二试剂槽(14)，第三试剂槽(15)和检测区(16)。
3.如权利要求2所述的一种自动化消毒效果快速评价装置，其特征在于：所述的磁吸附装置(3)位于检测封装试剂检测卡(10)的第一样本孔(11)的下方。
4.如权利要求2所述的一种自动化消毒效果快速评价装置，其特征在于：所述的恒温装置(4)位于检测封装试剂检测卡(10)的第二样本孔(12)的下方。
5.如权利要求1所述的一种自动化消毒效果快速评价装置，其特征在于：所述的荧光检测装置(5)用于检测染色后的细菌样本。
6.如权利要求5所述的一种自动化消毒效果快速评价装置，其特征在于：所述的荧光检测装置(5)包括沿光路依次设置的光源(21)、滤光片(22)、焦平面(23)、物镜(24)、滤光片(25)、聚焦镜(26)和相机(27)；其中，光源(21)为LED光源，中心波长475nm，功率大于1w；滤光片(22)为带通滤光片，450-490nm透射率大于80％，500-650nm透射率小于0.01％；物镜(24)数值孔径大于0.2；滤光片(25)为长波通滤光片，400-500nm透过率小于0.01％，520-650nm透过率大于80％；聚焦镜(26)焦距大于50mm，相机(27)为彩色面阵相机，分辨率大于300万像素，相机(27)位于聚焦镜(26)的后焦面处。
7.一种消毒效果快速评价检测方法，其特征在于：包括如下步骤，
步骤一：载菌片制备
将直径1cm的灭菌不锈钢片平放于灭菌平皿内，每个载体滴注定量指示菌悬液，载体回收菌量5×105～5×106cfu/片，涂匀，放置37℃环境下烘干；
步骤二：将载菌不锈钢片在VHP消毒设备中暴露60分钟(实际应用中可根据实际情况确定暴露时间，如一个消毒运行周期)，消毒处理结束后取出不锈钢菌片；
步骤三：加样
将经过消毒的载菌不锈钢片加入到装有洗脱液的器皿中，获得细菌样本，
步骤四：富集分离指示微生物
吸取50uL氨基磁珠加入步骤三的器皿中，将其在37℃环境下温浴1小时，每15min吹打混匀一次，温浴结束后吸取1mL混合液加入另一个器皿中，同时移除恒温；
步骤五：对步骤四中的器皿进行磁吸附，静置吸附5min，后移除上清液900uL至步骤三所述的器皿中，留下富集后的细菌磁珠混合样本，移除磁吸附；
步骤六：双重荧光标记活/死菌
吸取3.5μL检测试剂2加入步骤四所述的另一个器皿中，然后吸取3μL检测试剂1加入步骤四所述的另一个器皿中，混匀，室温下避光孵育15min；
步骤七：由步骤四中所述的器皿中吸取步骤六中得到的样本4.5μL加入检测区16，通过荧光检测装置获得荧光信号；
步骤八：通过数据处理得到活/死菌含量、散点图及杀灭率；
步骤九：由步骤八中结果判断消毒是否合格。
8.如权利要求7所述的一种消毒效果快速评价检测方法，其特征在于：所述的步骤三中，所述的洗脱液为含0.1％硫代硫酸钠、1％蛋白胨、0.1％吐温-80、0.03mol/L PBS，pH<7.0。
9.如权利要求7所述的一种消毒效果快速评价检测方法，其特征在于：所述的步骤四中氨基磁珠为300nm粒径，四氧化三铁磁珠，携带氨基基团，氨基磁珠带正电，细菌细胞表面电荷为负，两者可通过静电作用结合，在消毒效果验证中对样本中细菌进行非特异性富集。
10.如权利要求7所述的一种消毒效果快速评价检测方法，其特征在于：所述骤六中，所述的检测试剂1为SYTO-9，检测试剂2为PI。
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