CN113834808A - 用于检测大肠杆菌o157:h7的三维光子晶体微球及其检测平台和非标记检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球及其检测平台和非标记检测方法，所述三维光子晶体微球为表面进行氨基基团修饰和羧基基团修饰的微球，并通过微球上的活泼酯与适配体形成酰胺键将能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体固定于微球表面。本发明还搭建了检测平台，以智能手机和金相显微镜作为成像和图像采集工具，三维光子晶体微球作为捕获工具。本发明利用检测平台实现对大肠杆菌O157:H7的定性和定量分析，并且本发明的检测方法快速简便，检测成本低，特异型好，对大肠杆菌O157:H7的线性检测范围宽，样品量少，满足快速即时检测实际样品中大肠杆菌O157:H7的需求。
Description
技术领域
本发明属于分析检测，具体涉及一种用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球及其检测平台和非标记检测方法。
背景技术
肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhage Escherichia coli,EHEC)是大肠杆菌的一个亚型，最常见的致病菌之一，包括O157、O111、O26等血清型，大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7，E.coli O157:H7)是EHEC中最典型的一种血清型。大肠杆菌O157:H7属于条件致病菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染，其毒性极强且感染剂量极低，50～100个细菌即可引发感染，感染剂量甚至低至5个细菌，致死率2％～10％。被大肠杆菌O157:H7感染后的典型病例一般表现为突然发生的腹部绞痛和非血性腹泻，超过70％的病人数天后发展成出血性腹泻，无粪质，不发热或仅有轻度发热，血白细胞计数增多，30％～60％的病人有呕吐现象；30％的病人有低度发热症状；3％～5％的病人能够发展更加严重的疾病如出血性结肠炎(haemorrhagiccolitis,HC)，并发溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome,HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura,TTP)等，导致急性肾衰竭而死亡。大肠杆菌O157:H7因其感染剂量低、传染途径广、致病性和致死率高，目前己成为全球性的公共卫生问题，因此世界各国对大肠杆菌O157:H7的检测开展了大量的研究，其检测方法包括：传统分离鉴定法、免疫学检测法、分子生物学检测法、代谢学检测法等。但是这些常规检测方法均存在一些缺点，比如：操作繁琐且费时费力、仪器昂贵、检测成本高、对操作人员的专业要求很高，难以应用于现场检测和大量样品的检测。因此建立一种快速准确、操作简便、成本低的检测方法，对大肠杆菌O157:H7进行即时有效的监控是十分必要的。
发明内容
发明目的：针对现有常规检测技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球，该光子晶体微球具有大小可控、粒径均一、比表面积大、独特的光学结构色、探针修饰后能够特异性识别并捕获大肠杆菌O157:H7等优点，有效解决了现有技术中大肠杆菌O157:H7检测操作难，检测方法繁琐，时间长，灵敏度低等问题。
本发明还提供一种用于检测大肠杆菌O157:H7的检测平台及其检测方法。本发明的检测方法是基于光子晶体微球结合智能手机在线检测食品中的大肠杆菌O157:H7的方法，该方法可以直接利用三维光子晶体微球结构色结合智能手机和数字图像分析技术对大肠杆菌O157:H7进行无标记的定性和定量检测，无需特殊的示踪标记物，大大降低成本，并且能够有效地解决现有常规检测方法操作繁琐且费时费力、仪器昂贵、检测成本高、对操作人员的专业要求很高，难以应用于现场检测和大量样品的检测的技术难题。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种用于检测大肠杆菌O157:H7 的三维光子晶体微球，所述三维光子晶体微球为表面进行氨基基团修饰和羧基基团修饰的微球，并通过微球上的活泼酯与适配体形成酰胺键将能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体固定于微球表面。
其中，所述能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体为 5’-NH2-C6-TGGTCGTGGTGAGGTGCGTGTATGGGTGGTGGATGAGTGTGTGG C-3’。
本发明所述的三维光子晶体微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)三维光子晶体微球的制备；
(2)三维光子晶体微球表面的化学修饰：采用双氧水与浓硫酸的混合液处理步骤(1)制备的光子晶体微球，再用3-氨丙基三乙氧基硅烷对微球表面进行氨基基团的修饰，然后利用琥珀酸对微球表面进行羧基基团的修饰；
(3)氨基化核酸适配体的固定：通过NHS和EDC的作用活化光子晶体微球表面游离的羧基形成活泼酯，然后利用活泼酯与适配体的5’端氨基反应形成酰胺键，从而将特异性识别大肠杆菌O157:H7的适配体固定于经过步骤(2)表面修饰的微球表面。
其中，其中，步骤(1)制备光子晶体微球时，二氧化硅纳米乳液的配方为 A液(氨水11.5mL、双蒸水23mL、无水乙醇15mL)，B液(正硅酸乙酯4.9mL、无水乙醇45.1mL)，制备光子晶体微球所需微流注射泵的参数为：油相8mL/h，乳相5mL/h，其中A液和B液合成乳液后，利用微流注射泵进行组装合成。乳液作为乳相，甲基硅油作为油相。。
本发明所述用于检测大肠杆菌O157:H7的检测平台，所述检测平台包括所述的三维光子晶体微球、智能手机和金相显微镜，所述智能手机和金相显微镜相连接作为成像、图像采集工具和Image J图像处理软件，所述探针修饰的三维光子晶体微球作为捕获工具，通过手机和金相显微镜对捕获大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球捕进行图像采集，所述Image J图像处理软处理获得图像的灰度值。
其中，所述金相显微镜采用明场光源模式，其自带的卤素灯提供光源，利用三轴手机支架将智能手机连接，手机支架具有xyz三轴调节的功能，能够让手机稳定的固定于显微镜上，避免手持的不稳定性因素。
作为优选，所述金相显微镜为采用明场光源模式，物镜放大倍数为40倍，显微镜支架为星特朗三轴手机支架，4800万像素智能手机型号，其相机参数设置专业相机模式，其中测光方式为中央重点测光、相机感光度125、快门60、曝光补偿为自动、手动对焦、自动白平衡、其他参数为自动。
本发明所述用于检测大肠杆菌O157:H7的非标记检测方法，包括如下步骤：
将所述的三维光子晶体微球暴露在大肠杆菌O157:H7菌液环境中，进行反应，识别并捕获大肠杆菌O157:H7于三维光子晶体微球表面，反应结束后淸洗除去未结合的大肠杆菌O157:H7，使用智能手机和金相显微镜对捕获大肠杆菌 O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，利用Image J数字图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算。
其中，所述识别并捕获大肠杆菌O157:H7于三维光子晶体微球表面，使得光子晶体微球的透光性、反射率发生改变，进而导致整个体系的颜色发生变化。
其中，所述Image J图像处理软件对光子晶体微球的结构色进行定量分析，建立颜色和菌液浓度的线性关系，其中采用平均灰度值作为颜色指标进行定量。
进一步地，将利用偶联适配体后的光子晶体微球选择性识别并捕获样品中的大肠杆菌O157:H7，经过清洗后，测定该微球的平均灰度值，建立平均灰度值和菌液浓度的线性关系，采用标准曲线法进行大肠杆菌O157:H7的定量分析。
本发明所述的光子晶体微球在选择性识别并捕获食品中的大肠杆菌 O157:H7中的应用。
本发明的光子晶体微球在制备选择性识别并捕获食品中的大肠杆菌 O157:H7试剂盒中的应用。
本发明所述的检测平台在定性和定量检测食品中的大肠杆菌O157:H7中的应用。
本发明所述的检测平台在构建定性和定量检测食品中的大肠杆菌O157:H7 系统中的应用。
本发明的光子晶体微球是可以偶联有大肠杆菌O157:H7特异性适配体的三维光子晶体微球，能够特异性的识别并捕获大肠杆菌O157:H7，这使得光子晶体微球的透光性、反射率等发生改变，进而导致整个体系的颜色发生变化，因此可以直接利用三维光子晶体微球结构色结合智能手机和数字图像分析技术对实际样品中的大肠杆菌O157:H7进行无标记的定性和定量检测，本发明的方法原理图如图1所示。同时建立以智能手机结合数字图像分析技术相结合的检测平台，首先利用“智能手机+金相显微镜”作为图像采集工具，其中金相显微镜提供放大倍数，其自带的卤素灯则提供光源，然后利用三轴手机支架将两者连接，作为本发明的成像和图像采集工具。最后，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的结构色进行定量分析，从而建立颜色和菌液浓度的线性关系，从而实现对大肠杆菌O157:H7的定性和定量分析，其中采用平均灰度值作为颜色指标进行定量。
本发明以三维光子晶体微球为载体，在微球表面修饰核酸适配体用于特异性识别大肠杆菌O157:H7，结合智能手机和数字图像分析技术，测定捕获有不同浓度大肠杆菌O157:H7而引起结构色变化的光子晶体微球的平均灰度值，建立平均灰度值和菌液浓度的线性关系，从而实现对大肠杆菌O157:H7进行定性和定量分析。该检测方法快速简便，检测成本低，特异型好，对大肠杆菌O157:H7 的线性检测范围为106-109CFU/mL，样品量仅需10μL，克服了现有检测技术存在的缺点，满足快速即时检测实际样品中大肠杆菌O157:H7的需求。
本发明基于光子晶体微球结合智能手机在线检测大肠杆菌O157:H7的方法，所述检测方法以三维二氧化硅光子晶体微球为基底，利用共价键结合的方式将经过筛选的特异性氨基化适配体偶联到微球表面，形成具有比表面积大、三维大孔径的结构单元，该微球具有独特的光学结构色、能够特异性地识别并捕获大肠杆菌O157:H7，利用功能化的三维光子晶体微球识别并捕获样品中大肠杆菌 O157:H7于表面，不同浓度的大肠杆菌O157:H7样品因捕获量不同，使得光子晶体微球的透光性、反射率等发生改变，进而导致整个体系的颜色发生变化，通过建立的智能手机结合数字图像分析检测平台，首先利用“智能手机+金相显微镜”对捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，然后利用 Image J图像处理软件对捕获有不同浓度大肠杆菌O157:H7的光子晶体的结构色进行定量分析，建立平均灰度值和不同浓度菌液的梯度线性关系，从而实现对大肠杆菌O157:H7的定性和定量分析。该检测分析方法对大肠杆菌O157:H7的线性检测范围为106-109CFU/mL，并且本发明方法结合以下优势：1、智能手机具有便携、高清像素、便利的数据存储、可搭载智能化APP等优点。2、光子晶体微球具有比表面积大和独特的光学结构色等优点，增加富集效率高通量富集等优点，无需特殊的示踪标记物，降低检测成本，实现无标记的快速检测。3、适配体具有易储存、稳定和成本低的优点。4、采用灰度值对颜色变量数值化，避免以RGB等颜色空间的多变量干扰。5、样品量(待检测样品)仅需10μL，试剂成本低。6、检测时间仅需要1h，简便快速。因此，有效克服了现有检测技术存在的缺点，具有快速、设备成本低等优势。
设计原理：本发明的适配体修饰微球可以特异性捕获细菌，构建的检测平台通过捕获细菌后，改变微球的反射光学信号来定性、定量检测细菌，整个过程简单，快速，特异性好，检测灵敏好，而且，和样品的前处理集成，一次完成样品的前处理和检测。普通的检测细菌方法需要样品的前处理，细菌培养2-3天时间，生化鉴定等过程复杂，PCR方法也需要细菌的DNA提取，扩增，电泳等繁琐程序。
本发明的光子晶体微球表面具有大的内表面，可以固定较多的探针分子，提高细菌的富集，微球表面结构均一，稳定性好，检测成本低(从图4光子晶体微球电镜图的表征可以看出本发明中的光子晶体微球具有更大的比表面积，内部结构排列有序，因此可以固定更多的探针分子)；此外与以往的微球基检测不同的是，我们利用微球的结构色灰度值的变化来检测信号的。
目前，常用的图像采集工具有数码相机、扫描仪、Web摄像头、手机、平板电脑等，相比于CCD相机和扫描仪，采用智能手机具有便携、高清像素、便利的数据存储、可搭载智能化APP等优点，作为便携式成像和图像采集工具，功能强大且性价比高。本发明将智能手机架在显微镜上拍照采集图像固定焦距，以便数据的重现性好，而普通数码相机也可以固定焦距，但是其体积大，不好固定。本发明通过手机拍摄显微镜中物镜呈现的图像，再把手机连接电脑用Image J图像处理软件分析拍摄的图像，可以使用手机通过网络(在线传输)或者数据线连接，将图片发到电脑上进行处理数据。
本发明搭建的检测平台，采用平均灰度值对捕获有不同大肠杆菌O157:H7 的光子晶体，其自身的结构色的变化进行定量，无需特殊的示踪标记物，降低检测成本，可以实现无标记的快速检测，大大降低检测成本。
本发明采用的光子晶体微球为200μm左右，成本只有不到0.1元，相比于试纸条、基因芯片、ELISA等二维平面载体，具有球体自身的比表面积大的特性，因此也有更多的结合位点，从而在检测过程中大大增加富集效率，比如本研究所优化的实验条件，检测时间仅需50min。
目前颜色空间有很多，本发明选择平均灰度值作为颜色定量的依据，因为相比于使用RGB值，使用灰度值建立关系模型时，变量只有一个，那就是图像的亮度，结果更稳定更准确。本发明利用Image J图像处理软件直接对图像进行计算，灰度值(Mean gray value)为该区域灰度值总和/该区域面积。而使用RGB 值建立关系模型时，有R、G、B三个变量，变量太多，给建模带来了很大的难度，而使用灰度值建立关系模型时，变量只有一个，那就是图像的亮度，亮度是影响灰度图的唯一因素，亮度越高，灰度越浅，越接近于白色；亮度越低，灰度越深，越接近于黑色。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)制备的三维光子晶体微球具有比表面积大和独特的光学结构色等优点，增加富集效率，利用结构色定量，无需特殊的示踪标记物，降低检测成本，可以实现无标记的快速检测。
(2)构建了一种全新的大肠杆菌O157:H7检测平台，其中智能手机和金相作为成像和图像采集工具，智能手机具有便携、高清像素、便利的数据存储、可搭载智能化APP等优点，相比于扫描仪、CCD相机等性价比高，解决了现有技术难以在线、快速检测的问题。
(3)本发明构建的适配体具有易储存、稳定、特异性高和成本低的优点，还可以通过改变适配体序列检测其他食源性致病菌。
(4)采用平均灰度值对颜色变量数值化，避免以RGB等颜色空间的多变量干扰。
(5)本发明的检测方法快速简便，检测成本低，特异型好，对大肠杆菌 O157:H7的线性检测范围为106-109CFU/mL，样品量仅需10μL，克服了现有检测技术存在的缺点，满足快速即时检测实际样品中大肠杆菌O157:H7的需求。
附图说明
图1为本发明基于光子晶体微球结合智能手机在线检测食品中的大肠杆菌 O157:H7的检测示意图；
图2为实验室自制的三维光子晶体微球组装平台，其中1为甲基硅油，2为单分散二氧化硅乳液；
图3为三维光子晶体微球修饰羧基的原理图；
图4为三维光子晶体微球的表征，其中a为金相显微镜20倍下观察到的7 种不同颜色的光子晶体微球；b、c、d为扫描电镜下观察到的微观结构；
图5为搭建的“智能手机+金相显微镜”检测设备；
图6为三维光子晶体微球捕获105-109CFU/mL大肠杆菌O157:H7后的扫描电镜图；
图7为核酸适配体浓度优化图；
图8为七种不同光子晶体微球的选择；
图9为捕获大肠杆菌O157:H7的时间优化图；
图10为捕获大肠杆菌O157:H7的温度优化图；
图11为大肠杆菌O157:H7菌液浓度与平均灰度值的关系；
图12为大肠杆菌O157:H7的检测标准曲线图；
图13为特异性分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行说明。
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实验用菌株
大肠杆菌O157:H7适配体：通过由上海生工生物工程有限公司Sangon BiotechCo，Ltd(Shanghai)合成，该核酸适配体的一端功能化修饰氨基，序列如下(SEQ ID NO.1)：
5’-NH2-C6-TGGTCGTGGTGAGGTGCGTGTATGGGTGGTGGATGAGTGTG TGGC-3’。
PBS缓冲液：称取KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O 1.44g，NaCl 8g，KCl 0.2g，加入800mL双蒸水充分混匀并调节pH至7.4，定容至1000mL，灭菌后待使用。
Tris-HCl缓冲液：称取Tris 121.1g，加入800mL双蒸水充分混匀并用浓盐酸调节pH至7.4，定容至1000mL，灭菌后待使用。
结合缓冲液：称取NaCl5.8 g，KCl 0.37g，MgCl2 0.2g，加至50mL浓度为 50mmol/L，pH为7.4的Tris-HCl缓冲液中，加入800mL双蒸水充分混匀并调节pH至7.4，定容至1000mL，灭菌后待使用。
1×TE缓冲液：量取10mL浓度为1mol/L，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液和 2mL浓度为0.5mol/L，pH为8.0的EDTA溶液混合，加入800mL纯净水充分混匀并调节pH至7.4，定容至1000mL，灭菌后待使用。
大肠杆菌O157:H7的培养及不同浓度标准菌液的制备：实验之前首先将超净工作台紫外消毒灭菌20min，以便后续的无菌操作环境。利用接种环蘸取一点保存于甘油中并冻存在-80℃的大肠杆菌O157:H7的菌种(CICC 21530)的原液，在经过高温高压灭菌的TSA固体培养基平板上进行平板划线活化，置于37℃培养箱，在有氧条件下倒置培养24h待其长出菌落，在无菌环境中用牙签挑取单菌落于3mL液体TSB培养基放置37℃摇床中震荡培养18h(180rpm)进行一次增菌，再吸取1mL菌液转接于100mL TSB培养基中在37℃摇床中震荡培养18h(180rpm)进行二次增菌，得到的菌液浓度为109CFU/mL，该浓度由平板菌落计数法所得。将二次增菌得到的菌液，用PBS缓冲液离心清洗3-4遍，除去TSB培养基，并用PBS溶液悬浮，得到大肠杆菌O157:H7的109CFU/mL的菌液，检测之前用结合缓冲液离心清洗3遍，并用结合缓冲溶液重悬。向预先灭菌的离心管装入结合缓冲液，对原始浓度为109CFU/mL的菌液进行依次梯度稀释，得到浓度为109CFU/mL、108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105 CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、10CFU/mL的菌液，于4℃保存备用。
实施例1
(1)制备光子晶体微球
根据改进的
法制备了单分散二氧化硅纳米颗粒乳液(改进的配方见表 1)(按文献Werner
Arthur Fink,Ernst Bohn.Controlled growth of monodispersesilica spheres in the micron size range.Journal of Colloid and InterfaceScience，1968：P 62-69)。将得到的乳液通过微流控自组装平台(原理图见图2)，采用“油包水”的原理制备蛋白石光子晶体微球(微流控自组装平台和蛋白石光子晶体微球制备按文献：Journal of Chromatography A. 2020,1626,461379)，本发明制备光子晶体微球所需微流注射泵的参数为：油相(甲基硅油)8mL/h，乳相5mL/h。；所得微球在60℃烘箱中加热48h进行自组装并初步固化；先后用正己烷和乙醇洗涤微球，直至液体中无油状物，常温下晾干；最后将微球放于瓷坩埚中，于700℃条件下烧制3h，即获得所需要的三维光子晶体微球载体材料(粒径200μm左右)。
表1
其中，表1中的方案3为最优选的配方。
(2)光子晶体微球表面的修饰(流程图见图3)
微球表面羟基化：配制食人鱼试剂(质量分数98％浓硫酸/质量分数30％双氧水＝7/3(V/V))进行微球的羟基化修饰(10uL/球)：将冷却后的食人鱼试剂倒入装光子晶体微球的离心管中，用封口膜将离心管封口，于脱色摇床上室温震荡反应6h(140rpm)。反应结束后使用蒸馏水反复清洗3-4遍，将多余的蒸馏水吸去，放于100℃烘箱烘3h或者至于60℃烘箱过夜，将微球表面水分烘干后，收集羟基化的微球备用。
微球表面氨基的修饰：将已修饰好羟基的100颗大小均一、结构完整的光子晶体微球于离心管中，按10μL/球加入配制的质量分数2％APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)的甲苯溶液，用封口膜密封置于60℃摇床中，以180rp/min震荡反应6h。反应结束后沉淀数分钟，吸去多余的APTES甲苯溶液，依次用甲苯、无水乙醇、双蒸水清洗3-4遍，置于60℃烘箱中烘干水分，得到表面氨基化的微球。
微球表面羧基的修饰：已修饰好氨基的100颗大小均一、结构完整的光子晶体微球于离心管中，按10μL/球加入配制的琥珀酸溶液(100mg琥珀酸溶于4.7mLDMSO和300μL0.1mol/L碳酸氢钠，现配现用，进行羧基修饰，10μL/球)，用封口膜密封置于脱色摇床中，以180rp/min常温震荡反应2h。反应结束后沉淀数分钟，吸去多余的琥珀酸溶液，依次用DMSO(二甲基亚砜)和双蒸水清洗 3-4遍，置于60℃烘箱中烘干水分，得到表面羧基化的微球，室温下干燥保存备用。
(3)制备大肠杆菌O157:H7核酸适配体修饰的三维光子晶体微球
将羧基化的微球置于含有氨基化适配体溶液(600nmol/L)的离心管中(5μL/ 球)，同时加入NHS(终浓度10mg/mL)和EDC(终浓度15mg/mL)以活化羧基，4℃条件下于摇床中反应过夜(180rpm)，形成以微球为载体的捕获探针，吸去多余的适配体溶液，反应结束后依次用结合缓冲液和PBS淸洗微球2-3遍，吸去多余的缓冲液，得到带有大肠杆菌O157:H7核酸适配体的光子晶体微球。
实施例2
基于智能手机结合数字图像分析技术检测平台的构建。
为了保证每次实验时，图像背景光强的一致性。首先选择在密闭黑暗的环境中进行实验的测试，以排除外界光照不稳定的影响，然后利用显微镜支架将智能手机固定，以防止智能手机因抖动导致的聚焦不稳定，最后将显微镜光强、智能手机相机的焦距、光圈等参数固定，具体如下：
金相显微镜为广州市明美光电技术有限公司MJ33，其中自带的卤素灯为 12V50W，采用明场光源模式，物镜放大倍数为40倍。
显微镜支架为星特朗三轴手机支架。
智能手机型号为荣耀V20。主要性能：相机像素为4800万像素，相机参数设置专业相机模式，其中测光方式为中央重点测光、相机感光度125、快门60、曝光补偿为自动、手动对焦、自动白平衡、其他参数为自动)。
最终搭建的智能手机检测平台如图5所示。采样时手机固定在手机支架上面，镜头对准目镜，将目镜中的图像完整拍摄即可，采集完整的显微镜图像且保证每次采集条件一样即可。
实施例3
基于实施例1中制备的光子晶体微球和实施例2中搭建的智能手机检测平台建立样品中大肠杆菌O157:H7的检测方法。
涉及大肠杆菌O157:H7的实验，操作均在超净工作台中进行，实验废弃物先进行高温高压灭菌处理，再进行分类回收。
一、实验条件的优化
1、氨基化适配体浓度优化：为了使光子晶体微球表面结合的适配体的量达到最大，提高检测效率，对适配体浓度进行研究。将氨基化适配体用结合缓冲液稀释成100nM、200nM、300nM、600nM、900nM，分别与微球(5μL/球)于 4℃条件下反应过夜，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，吸去多余的缓冲液，得到带有大肠杆菌O157:H7核酸适配体的光子晶体微球。之后与10-109CFU/mL大肠杆菌O157:H7，于37℃条件下反应1h(10μL/球)，用结合缓冲液清洗微球2-3 遍，以除去未结合的大肠杆菌O157:H7，检测之前吸掉多余缓冲液，置于金相显微镜的载玻片上。使用“智能手机+金相显微镜”图像采集平台，对捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7的光子晶体微球进行图像采集(参数设定按实施例2)，手机采集的图像通过网络传输到电脑上，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，对比每组的平均灰度值的差异，OriginPro8.5.1数据处理软件处理数据。其中通过Image J图像处理软件进行处理，平均灰度值(Mean gray value)＝该区域灰度值的总和(Total grayvalue)/该区域面积(Area)。
由图7可知，随着氨基化适配体浓度的增加，氨基化适配体浓度为600nM 的时候，灰度值和菌液浓度的关系更加的明显，数据重复性最好，由此可以推断出，此时修饰有氨基化适配体的光子晶体微球捕获效率达到饱和。所以选取 600nM作为氨基化适配体的最佳浓度进行之后的实验。
2、不同颜色的光子晶体微球的选择：本发明利用光子晶体自身结构色对大肠杆菌O157:H7进行无标记定性和定量，因此光子晶体结构色对不同浓度大肠杆菌O157:H7检测的灵敏度影响较大，不同配方制作的光子晶体颜色不同，因此选择了实施例1中3种不同配方的光子晶体微球及方案3的乳液分别隔了1 个月、2个月、3个月制作的3种不同光子晶体微球和玻璃球(购买于Sigma公司212-300μm)共7种球进行对比。步骤如下：将优化的最佳浓度的氨基化适配体分别与微球(5μL/球)于4℃条件下反应过夜，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，吸去多余的结合缓冲液，得到带有大肠杆菌O157:H7核酸适配体的光子晶体微球，后与108CFU/mL大肠杆菌O157:H7，于37℃条件下1h(10μL/球)，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，检测之前吸掉多余缓冲液，置于金相显微镜的载玻片上。使用“智能手机+金相显微镜”图像采集平台，对捕获不同浓度大肠杆菌 O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，手机采集的图像通过网络传输到电脑上，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算， OriginPro8.5.1数据处理软件处理数据。
由图8可以看出表1配置乳液的方案中，方案3中空白组和108CFU/mL的 大肠杆菌O157:H7的灰度值相差最大，且误差最小，说明其灵敏度最高，结合 图8可知，方案3制作的光子晶体微球结构色最亮，颜色更加鲜明，对结构色有 一个很好的响应，且圆度和大小也是最好的，因此选择方案3制作的光子晶体微 球进行后续试验。
3、氨基化适配体与大肠杆菌O157:H7孵育时间优化：为了提高本发明检测大肠杆菌O157:H7的效率，因此对修饰有氨基化适配体的光子晶体微球和大肠杆菌O157:H7的捕获时间进行优化。将优化的最佳浓度的氨基化适配体分别与优化的光子晶体微球于4℃条件下反应过夜，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，吸去多余的缓冲液，得到带有大肠杆菌O157:H7核酸适配体的光子晶体微球，后与108CFU/mL大肠杆菌O157:H7(10μL/球)，于37℃条件下反应5min、10min、 20min、30min、40min、50min、60min，用结合清洗微球2-3遍，检测之前吸掉多余缓冲液，置于金相显微镜的载玻片上。使用“智能手机+金相显微镜”图像采集平台，对捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，手机采集的图像通过网络传输到电脑上，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，OriginPro8.5.1数据处理软件处理数据。
由图9可知，随着氨基化适配体和大肠杆菌O157:H7孵育时间的增长，平均灰度值先降低后趋于平衡，当孵育时间处于30-50min之间时，随着时间增长，平均灰度值降低趋势明显，当时间超过50min，孵育时间对平均灰度值的影响逐渐变小，说明氨基化适配体对大肠杆菌O157:H7的捕获已经达到饱和状态，考虑到快速检测的需求，降低检测时间，因此选取50min作为氨基化适配体和大肠杆菌O157:H7的最佳孵育时间进行之后的实验。
4、氨基化适配体与大肠杆菌O157:H7结合温度优化：为了提高本发明检测大肠杆菌O157:H7的效率，因此对修饰有氨基化适配体的光子晶体微球和大肠杆菌O157:H7的捕获温度进行优化。将优化的最佳浓度的氨基化适配体分别与的光子晶体微球于4℃条件下反应过夜，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，检测之前吸掉多余的缓冲液，得到带有大肠杆菌O157:H7核酸适配体的光子晶体微球，后与108CFU/mL大肠杆菌O157:H7(10μL/球)，于20℃、30℃、37℃、40℃、 45℃、50℃条件下1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，检测之前吸掉多余缓冲液。使用“智能手机+金相显微镜”图像采集平台，对捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7 的光子晶体微球进行图像采集，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，OriginPro8.5.1数据处理软件处理数据。
由图10可知，随着氨基化适配体和大肠杆菌O157:H7孵育温度的增家，平均灰度值先降低后趋于升高，当孵育温度处于20-40℃之间时，随着时间增长，平均灰度值降低趋势明显，当孵育温度超过40℃，灰度值逐渐升高，说明氨基化适配体对大肠杆菌O157:H7的捕获效率逐渐降低，这可能是因为温度在 45-50℃时，大肠杆菌O157:H7的活性逐渐降低，与氨基化适配体的结合效率降低，因此选取40℃作为氨基化适配体和大肠杆菌O157:H7的最佳孵育温度进行之后的实验。
二、检测大肠杆菌O157:H7标准曲线的建立
检测方法：根据上述所有优化的条件，将羧基化的微球以10μL/球的量加入 NHS(10mg/mL)和EDC(15mg/mL)于脱色摇床中以180rpm常温震荡1h，以活化羧基，反应结束后用BB缓冲液冲洗3次，以除去多余的NHS和EDC，然后以5μL/球加入氨基化适配体于4℃摇床中以180rpm反应过夜，形成以微球为载体的捕获探针，反应结束后依次用结合缓冲液清洗微球2-3遍，吸去多余的缓冲液，得到带有大肠杆菌O157:H7核酸适配体的光子晶体微球。
将上述偶联捕获探针的微球平均分为10组，以10μL/球分别加入不同浓度的大肠杆菌O157:H7(101-109CFU/mL)，于40℃摇床中以180rpm震荡孵育 50min，以结合缓冲液作为空白对照，反应结束后用PBS清洗微球2-3遍，以除去未结合的微生物，检测之前吸掉多余的缓冲液，置于金相显微镜的载玻片上，使用“智能手机+金相显微镜”图像采集平台，对捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7 的光子晶体微球进行图像采集，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，最后利用origin数据处理软件建立灰度值和不同浓度菌的梯度线性关系，详见图11和图12，其中微球捕获105-109CFU/mL大肠杆菌O157:H7 后的扫描电镜图如图6所示。
特异性分析：其他条件不变，将大肠杆菌O157:H7换成相同浓度(108 CFU/mL)的普通大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌按上述步骤进行此方法的特异性研究。结果见图13，从图13可以看出，本发明的检测方法具有良好的特异性。
三、回收率的测定：
模拟污染肉类样品的制备：从超市购买新鲜猪肉肉糜，经过辐照杀菌处理，置于无菌塑料带密封，冻存于-20℃备用。取25g加入225mL PBS缓冲液于拍打式均质机中均质，制成猪肉匀浆，以10000r/min离心3min，除去大颗粒沉淀杂质，取上清液为待检样品。取1mL生理盐水重悬的对数期大肠杆菌O157:H7 接种到稀释猪肉样品中，混匀，以制备分别含大肠杆菌O157:H7浓度为0，106， 107，108CFU/mL的人工模拟污染猪肉样品。然后置于4℃下放置30min，用BB 缓冲液洗3次，即为待检样品。
模拟污染牛奶样品的制备：从超市购买新鲜纯牛奶，取10mL在10℃条件下离心10min(8000rpm)以去除脂肪层，得到的溶液用PBS按体积比1:10稀释，得到待加标溶液。取1mL生理盐水重悬的对数期大肠杆菌O157:H7接种到稀释牛奶样品中，混匀，以制备分别含大肠杆菌O157:H7浓度为0，106，107， 108CFU/mL的人工模拟污染牛奶样品。将牛奶样品于5000r/min下离心2次，每次10min，沉淀用25mL 1×BB buffer缓冲液重悬，即为待检样品。
模拟污染纯净水样品的制备：从超市购买纯净水，得到待加标溶液，取1mL 生理盐水重悬的对数期大肠杆菌O157:H7接种到纯净水中，混匀，以制备分别含大肠杆菌O157:H7浓度为0，106，107，108CFU/mL的人工模拟污染纯净水样品。将纯净水样品于5000r/min下离心2次，每次10min，沉淀用25mL 1×BB buffer缓冲液重悬，即为待检样品。
通过在上述不同的样品中分别添加不同浓度的大肠杆菌O157:H7进行模拟污染，按照步骤二制作标准曲线时的步骤进行本法的加标回收测定，并计算回收率。回收率＝(样品回收检测值-空白回收检测值)/标准品检测值×100％，计算回收率，结果如表2，待检测的样品回收率在73.27-101.20％之间，证明了该方法的准确性和可靠性。
而采用平板计数法回收率的测定进行对比，样品前处理同上所述，利用平板计数法进行回收率的测定，结果如表3。对通过对比，本发明法检测猪肉和牛奶中的大肠杆菌O157:H7所得回收率与平板计数法相似，本方法具有可靠性。所以，在回收率相似的情况下，第一本发明的方法可靠，第二，检测时间短，传统的平板计数法检测周期较长，大约8h～4d，本发明建立的方法仅需50min，因此传统的平板计数法不能满足临床对感染性疾病早期诊断和及时、有效治疗的需求。操作繁琐且费时费力，对操作人员的专业要求很高，重复性较差、结果误差较大，难以应用于现场检测和大量样品的检测。
表2
表3
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球及其检测平台和非标记检测
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggtcgtggt gaggtgcgtg tatgggtggt ggatgagtgt gtggc 45
Claims (10)
1.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球，其特征在于，所述三维光子晶体微球为表面进行氨基基团修饰和羧基基团修饰的微球，并通过微球上的活泼酯与适配体形成酰胺键将能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体固定于微球表面。
2.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球，其特征在于，所述能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体优选为5’-NH2-C6-TGGTCGTGGTGAGGTGCGTGTATGGGTGGTGGATGAGTGTGTGGC-3’。
3.一种权利要求1所述的三维光子晶体微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)三维光子晶体微球的制备；
(2)三维光子晶体微球表面的化学修饰：采用双氧水与浓硫酸的混合液处理步骤(1)制备的光子晶体微球，再用3-氨丙基三乙氧基硅烷对微球表面进行氨基基团的修饰，然后利用琥珀酸对微球表面进行羧基基团的修饰；
(3)氨基化核酸适配体的固定：通过NHS和EDC的作用活化光子晶体微球表面游离的羧基形成活泼酯，然后利用活泼酯与适配体的5’端氨基反应形成酰胺键，从而将特异性识别大肠杆菌O157:H7的适配体固定于经过步骤(2)表面修饰的微球表面。
4.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的检测平台，其特征在于，所述检测平台包括权利要求1所述的三维光子晶体微球、智能手机、金相显微镜和Image J图像处理软件，所述智能手机和金相显微镜相连接作为成像和图像采集工具，所述三维光子晶体微球作为捕获工具，通过手机和金相显微镜对捕获大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球捕进行图像采集，所述Image J图像处理软处理获得图像的灰度值。
5.根据权利要求4所述的检测平台，其特征在于，所述金相显微镜采用明场光源模式，其自带的卤素灯提供光源，利用三轴手机支架将智能手机连接。
6.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的非标记检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的三维光子晶体微球暴露在大肠杆菌O157:H7菌液环境中，进行反应，识别并捕获大肠杆菌O157:H7于三维光子晶体微球表面，反应结束后淸洗除去未结合的大肠杆菌O157:H7，使用智能手机和金相显微镜对捕获大肠杆菌O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，利用Image J数字图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算。
7.根据权利要求6所述的非标记检测方法，其特征在于，所述识别并捕获大肠杆菌O157:H7于三维光子晶体微球表面，使得光子晶体微球的透光性、反射率发生改变，进而导致整个体系的颜色发生变化。
8.根据权利要求6所述的非标记检测方法，其特征在于，所述Image J图像处理软件对光子晶体微球的结构色进行定量分析，建立颜色和菌液浓度的线性关系，其中采用平均灰度值作为颜色指标进行定量。
9.一种权利要求1所述的光子晶体微球在选择性识别并捕获食品中的大肠杆菌O157:H7中的应用。
10.一种权利要求4所述的检测平台在定性和定量检测食品中的大肠杆菌O157:H7中的应用。
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