CN113912123B - 基于磁性二硫化钼催化和光热效应的鼠伤寒沙门氏菌多模试纸条及其检测方法和应用 - Google Patents

基于磁性二硫化钼催化和光热效应的鼠伤寒沙门氏菌多模试纸条及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于磁性二硫化钼催化和光热效应的鼠伤寒沙门氏菌多模试纸条及其检测方法和应用，属于生物检测技术领域。本发明利用磁性二硫化钼复合材料的磁性实现目标物的分离富集，提高检测灵敏度；利用磁性二硫化钼复合材料作为标记材料，通过裸眼实现对目标待测物的定性检测；通过MoS2的催化和光热性能提高检测信号实现目标待测物的高灵敏检测。因此基于MoS2纳米材料自身优异的催化和光热转换性能构建检测探针，实现目标待测物的快速、灵敏、准确检测是提高试纸条检测性能的有效途径，因此具有良好的实际应用价值。

Description

基于磁性二硫化钼催化和光热效应的鼠伤寒沙门氏菌多模试 纸条及其检测方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于磁性二硫化钼催化和光热效应的鼠伤寒沙门氏菌多模试纸条及其检测方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
食品安全问题在全球范围内得到了越来越多的重视，危害食品安全的主要因素之一是由食源性致病菌引起的食源性疾病，而鼠伤寒沙门氏菌是引起食源性疾病的主要病原菌之一。鼠伤寒沙门氏菌广泛存在于环境当中且拥有较高的致病率与致死率，严重威胁了人类的身体健康。因此，建立快速、灵敏的针对食品中存在的沙门氏菌的检测方法是保障食品安全的有效手段。目前对于鼠伤寒沙门氏菌的检测方法主要分为传统检测方法和各类新型检测方法等。传统平板方法是通过对样品中沙门氏菌的增菌与培养，然后进行检测，从而达到准确检测鼠伤寒沙门氏菌的目的。但传统检测方法的操作不仅繁琐复杂，而且耗时较长，不能满足现场快速检测的需求。新型检测方法中的分子生物学方法、仪器分析方法等准确性较高但对仪器设备具有较高的依赖性。与前述方法相比，免疫试纸条快速检测方法拥有简便、快速、成本低廉的优点，因此成为目前应用范围最广泛的食品危害物的检测方法之一。免疫试纸条检测方法通过对实验结果进行目测来完成对目标物的定性分析，但灵敏性和准确度有待提高。因此利用试纸条的新型标记材料的颜色和自身性能的信号放大实现目标待测物的灵敏、定量检测成为目前研究的热点。
目前试纸条的标记材料主要有酶促反应材料、染色标记材料、荧光和磁性纳米材料等。酶促反应可以通过标记酶的催化显色性能判断实验结果，但酶促反应受到成本和生物酶分子稳定性的限制，其稳定性有待提高；染色标记材料(胶体金、胶乳微球等)通过材料显色的有无或强弱进行定性检测，但其灵敏性、稳定性和重复性有待提高；荧光或磁性纳米材料(量子点、超顺磁粒子等)借助仪器可实现对目标物的定量分析，但荧光或磁性纳米材料价格昂贵，水溶性，生物相容性较差以及需要借助大型仪器进行检测等方面限制了其发展和应用。因此，寻找价格低廉，有良好的水溶性和生物相容性，具有颜色和催化性能以及可通过简便仪器提高检测灵敏度的标记材料成为目前的研究趋势。
二硫化钼(MoS2)是一种类石墨烯结构的具有半导体性质的二维层状过渡族金属硫化物，拥有类过氧化物酶的特性，相对比于生物活性酶具有价格低廉、容易获得、水溶性好、生物相容性高、性质稳定、可抵抗蛋白酶的降解等优势。MoS2利用其表面的负电荷通过静电吸附作用连接抗体等大分子识别材料，但其连接量和连接的稳定性不高。目前已报道的在检测中使用的光热转换材料有胶体金、石墨烯和Fe3O4等，而MoS2拥有比石墨烯和胶体金更加优良的光热转换性能，且已初步应用于光热诊断、光热成像和肿瘤治疗等领域，但发明人发现，将二硫化钼的光热转换性质应用于危害物的检测方向的报道仍然较少。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种基于磁性二硫化钼催化和光热效应的鼠伤寒沙门氏菌多模试纸条及其检测方法和应用。本发明针对MoS2纳米材料通过静电吸附连接抗体的量较少且稳定性差的问题制备磁性二硫化钼纳米复合材料并对其表面进行修饰，同时使其便于富集鼠伤寒沙门氏菌。对制得的磁性复合材料进行修饰，提高材料与蛋白结合的能力，并通过与底物静电结合提高材料的催化性能。利用磁性二硫化钼复合材料的磁性实现目标物的分离富集，提高检测灵敏度；利用磁性二硫化钼复合材料作为标记材料，通过裸眼实现对目标待测物的定性检测；通过MoS2的催化和光热性能提高检测信号实现目标待测物的高灵敏检测。因此基于MoS2纳米材料自身优异的催化和光热转换性能构建检测探针，实现目标待测物的快速、灵敏、准确检测是提高试纸条检测性能的有效途径。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种磁性二硫化钼纳米复合材料，所述复合材料为MoS2@Fe3O4纳米复合材料，同时所述MoS2@Fe3O4纳米复合材料还修饰有L-半胱氨酸。本发明的磁性二硫化钼纳米复合材料不仅拥有类过氧化物酶活性，同时还具有良好的光热转换性能，从而便于后续对鼠伤寒沙门氏菌的检测。
本发明的第二个方面，提供上述磁性二硫化钼纳米复合材料的制备方法，所述制备方法包括：
S1、将FeCl3溶液和FeSO4溶液混合并充入惰性气体，在高温下超声处理得溶液I；
S2、将MoS2悬浮液与柠檬酸钠溶液混合，高温超声处理得溶液II；
S3、将步骤S1制得的溶液I加入溶液II中并充入惰性气体，在高温下超声处理，同时向上述混合溶液中加入碱液，然后在高温条件下继续超声处理。
本发明的第三个方面，提供上述磁性二硫化钼纳米复合材料作为检测探针的应用。
本发明的第四个方面，提供一种检测探针，所述检测探针包含上述磁性二硫化钼纳米复合材料。
本发明的第五个方面，提供一种鼠伤寒沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包含多模试纸条，还包含上述磁性二硫化钼纳米复合材料或检测探针。
其中，所述多模试纸条由硝酸纤维素膜制成。
更具体的，所述试纸条，其制备方法包括：向活化后的硝酸纤维素膜上加入鼠伤寒沙门氏菌抗体进行结合，然后使用牛血清白蛋白(BSA)封闭。
本发明的第六个方面，提供上述磁性二硫化钼纳米复合材料、检测探针和/或鼠伤寒沙门氏菌检测试剂盒在检测鼠伤寒沙门氏菌中的应用。
本发明的第七个方面，提供一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，所述方法包括：
S1、向上述磁性二硫化钼纳米复合材料或检测探针中加入鼠伤寒沙门氏菌抗体，然后加入BSA封闭；
S2、将待测样品加入步骤S1制得溶液混合孵育，然后再经磁分离，复溶后加入多模试纸条。
所述检测方法还包括：基于目测法和/或光热法对鼠伤寒沙门氏菌进行检测。
所述待测样品可以是任何易感染鼠伤寒沙门氏菌的样品，如食品，包括但不限于自来水、牛奶和葡萄汁。
需要说明的是，上述虽然以鼠伤寒沙门氏菌为例介绍了本申请技术方案，但是基于本申请的发明构思，对本申请技术方案所作出的修改、等同替换、改进等，如替换待测物，用于检测其他病原菌、癌细胞，大分子物质如过敏原、癌胚抗原等，或小分子物质如农兽药残留等，又比如识别材料的常规替换，将抗体替换为适配体，或者组装原理的改变，如依据双抗夹心原理对细胞或大分子检测，替换为依据竞争原理对小分子检测等等，均应包含在本发明的保护范围之内。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
(1)上述技术方案制备了均一、稳定的新型试纸条标记材料二硫化钼四氧化三铁(MoS2@Fe3O4纳米复合材料)，利用了MoS2复合材料赋予了检测探针优良的催化和光热性能，同时MoS2表面链接的Fe3O4赋予了检测探针磁性，使其可以通过磁分离技术迅速从水体中进行富集并可以对目标待测物进行浓缩，进一步提高了检测的灵敏度。
(2)上述技术方案利用MoS2磁性复合材料作为试纸条检测方法的标记材料构建检测探针，利用探针的过氧化物酶催化活性代替了传统生物大分子酶，进行酶促反应，大大提高了酶的稳定性，降低了检测成本，同时提高了试纸条裸眼定性检测的灵敏度。
(3)上述技术方案建立了基于纳米MoS2磁性材料的优异光热转换性能的试纸条快速检测方法，依据纳米二硫化钼磁性复合材料与免疫试纸条结合后测定其光热并建立温度增加值与病原菌浓度的标准曲线来实现对待测物的快速、灵敏、半定量检测，其检测灵敏度较视觉检测限可提高约1个数量级。其整个检测时间约为30min，明显低于约3h的酶联免疫的检测过程，因此具有良好的实际应用价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中复合材料的磁性、动态光散射和zeta电位，其中，A为复合材料的磁性、动态光散射图，B为复合材料的zeta电位图。
图2为本发明实施例中复合材料的酶动力学相关优化图，其中，A为不同时间，B为不同pH，C为H2O2的体积，D为TMB浓度，E为回归曲线。
图3为本发明实施例中不同L-cys浓度修饰下复合材料的吸光度值。
图4为本发明实施例中复合材料的光热转换效率。
图5为本发明实施例中复合材料及试纸条组装的条件优化相关图，其中，A为MoS2@Fe3O4复合材料pH的优化，B为MoS2@Fe3O4复合材料封闭液浓度的优化，C为MoS2@Fe3O4材料连接抗体浓度的优化，D为膜封闭液浓度的优化，E为膜包被抗体浓度的优化。
图6为本发明实施例中激光照射时长对温度变化影响。
图7为本发明实施例中激光照射功率对温度变化影响。
图8为本发明实施例中不同稀释浓度样品的光热性探究。
图9为本发明实施例中MoS2@Fe3O4试纸条的灵敏度测定图。
图10为本发明实施例中稳定性检测结果图。
图11为本发明实施例中特异性检测结果图。
图12为本发明实施例中重复性检测结果图。
图13为本发明实施例中实际样品检测结果图。
图14为本发明实施例中磁富集能力检测结果图。
图15为本发明基于磁性二硫化钼催化和光热效应的多模试纸条检测鼠伤寒沙门氏菌流程图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种磁性二硫化钼纳米复合材料，所述复合材料为MoS2@Fe3O4纳米复合材料，同时所述MoS2@Fe3O4纳米复合材料还修饰有L-半胱氨酸。本发明的磁性二硫化钼纳米复合材料不仅拥有类过氧化物酶活性，同时还具有良好的光热转换性能，从而便于后续对鼠伤寒沙门氏菌的检测。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述磁性二硫化钼纳米复合材料的制备方法，所述制备方法包括：
S1、将FeCl3溶液和FeSO4溶液混合并充入惰性气体，在高温下超声处理得溶液I；
S2、将MoS2悬浮液与柠檬酸钠溶液混合，高温超声处理得溶液II；
S3、将步骤S1制得的溶液I加入溶液II中并充入惰性气体，在高温下超声处理，同时向上述混合溶液中加入碱液，然后在高温条件下继续超声处理。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S1中，FeCl3溶液的浓度控制为0.05～0.2mol/L，优选为0.1mol/L；所述FeSO4溶液的浓度控制为0.01～0.1mol/L，优选为0.05mol/L；
所述高温超声处理具体为：在70～90℃下超声处理1-60min，优选为在80℃条件下超声处理30min。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，MoS2悬浮液的浓度控制为1～2mg/mL，优选为1.6mg/mL；
所述柠檬酸钠的浓度控制为0.05～0.2mol/L，优选为0.1mol/L；
所述高温超声处理具体为：在70～90℃下超声处理1-30min，优选为在80℃条件下超声处理10min。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S3中，在高温下超声处理具体为：在70～90℃下超声处理1-30min，优选为在80℃条件下超声处理10min。
在高温条件下继续超声处理具体为：在70～90℃下超声处理1-3h，优选为在80℃条件下超声处理1.5h。
本发明的又一具体实施方式中，所述方法还包括将步骤S3获得的溶液进行磁吸附处理获得所述磁性二硫化钼纳米复合材料；更进一步优选的，向获得的磁性二硫化钼纳米复合材料中加入L-半胱氨酸从而对复合材料进行表面修饰。
本发明的又一具体实施方式中，所述L-半胱氨酸的浓度控制为不大于64mg/mL，如0.1mg/mL、1mg/mL、4mg/mL、8mg/mL、16mg/mL和64mg/mL，经研究发现，MoS2@Fe3O4纳米复合材料经过浓度为4mg/mL的L-半胱氨酸修饰后吸光度值最高，说明材料与浓度为4mg/mL的L-半胱氨酸修饰得到的复合材料催化能力较好。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述磁性二硫化钼纳米复合材料作为检测探针的应用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测探针，所述检测探针包含上述磁性二硫化钼纳米复合材料。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种鼠伤寒沙门氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包含多模试纸条，还包含上述磁性二硫化钼纳米复合材料或检测探针。
其中，所述多模试纸条由硝酸纤维素膜制成。
更具体的，所述试纸条，其制备方法包括：向活化后的硝酸纤维素膜上加入鼠伤寒沙门氏菌抗体进行结合，然后使用牛血清白蛋白(BSA)封闭。
所述活化方法包括：将硝酸纤维素膜置于超纯水中进行活化处理。
其中，所述鼠伤寒沙门氏菌抗体浓度控制为100～700μg/mL，如100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL和700μg/mL，经研究发现，上述制备的MoS2@Fe3O4纳米材料在500μg/mL抗体的条件下在硝酸纤维素膜表面的颜色不再变深且温度上升趋于平缓，故500μg/mL为硝酸纤维素膜的最优抗体浓度。
所述BSA溶液浓度控制为1～8％，如1％、2％、4％、6％和8％，经研究发现，上述制备的MoS2@Fe3O4纳米材料在6％BSA的条件下在硝酸纤维素膜表面的颜色不再变浅且温度上下降趋于平缓，故6％为硝酸纤维素膜的最优封闭液浓度。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述磁性二硫化钼纳米复合材料、检测探针和/或鼠伤寒沙门氏菌检测试剂盒在检测鼠伤寒沙门氏菌中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，所述方法包括：
S1、向上述磁性二硫化钼纳米复合材料或检测探针中加入鼠伤寒沙门氏菌抗体，然后加入BSA封闭；
S2、将待测样品加入步骤S1制得溶液混合孵育，然后再经磁分离，复溶后加入多模试纸条。
其中，所述步骤S1中，鼠伤寒沙门氏菌抗体浓度控制为1～100μg/mL，如1μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和100μg/mL，经研究发现，制备的MoS2@Fe3O4纳米材料在75μg/mL抗体的条件下在硝酸纤维素膜表面的颜色不再变深且温度上升趋于平缓，故75μg/mL为材料的最优抗体浓度。
所述BSA溶液浓度控制为1～10％，如1％、2％、4％、6％、8％和10％，经研究发现，上述制备的MoS2@Fe3O4纳米材料在8％BSA的条件下在硝酸纤维素膜表面的颜色不再变浅且温度下降趋于平缓，故8％为材料的最优封闭液浓度。
所述步骤S2中，复溶采用PBS缓冲溶液，其pH控制为5～9，如pH为5、6、7、8、9，经研究发现，上述制备的MoS2@Fe3O4纳米材料在pH为6的条件下在硝酸纤维素膜表面的颜色最深且温度变化最大，故pH 6为材料复溶的最优pH。
所述检测方法还包括：基于目测法和/或光热法对鼠伤寒沙门氏菌进行检测。
其中，所述目测法具体包括：将步骤S2获得的试纸条加入显色液中，肉眼观察试纸条显色结果。
其中，所述显色液为含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和H2O2的溶液。
本发明的又一具体实施方式中，所述显色液，其配制方法如下：pH为4.5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，取3940μL的pH为4.5的缓冲液，40μL 2％的TMB溶液和8μL 30％H2O2混合即得。在此条件下，上述MoS2@Fe3O4催化性能最佳。
所述基于光热法具体包括：对步骤S2获得的试纸条进行激光照射并利用热像仪测定温度变化，依据磁性二硫化钼复合材料与多模试纸条结合后测定其光热并建立温度增加值与病原菌浓度的标准曲线来实现对待测物的快速、灵敏、半定量检测。
其中，所述激光照射中激光控制为红外光，在一个优选的实施方案中，激光波长控制为808nm。
激光照射时间为不大于300s，进一步不大于60s，经研究发现，当激光照射时长在0s到60s范围内，温度急剧升高，且在60s左右基本升至最高点，照射60s后温度虽有升高但波动范围很小，逐渐趋于稳定，故60s为最佳照射时长。
激光照射功率控制为1～4W，如1.5W、2.0W、2.5W、3.0W和3.5W，随着激光照射功率的增加，样品温度逐渐升高，且在照射功率1.5W到3W区间，温度升高很明显，但当照射功率为3.5W时，相比3W温度升高的差值较小。因此，3W为激光照射最佳功率。
所述待测样品可以是任何易感染鼠伤寒沙门氏菌的样品，如食品，包括但不限于自来水、牛奶和葡萄汁。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
(1)MoS2@Fe3O4复合材料的制备
配制浓度为0.1mol/L的FeCl3溶液，浓度为0.05mol/L的FeSO4溶液，浓度为7mol/L的NaOH溶液，浓度为0.1mol/mL的柠檬酸钠溶液，并将MoS2稀释至1.6mg/mL。将FeCl3溶液和FeSO4溶液等体积混合并充入氮气，在80℃下超声30min。1mL MoS2悬浮液与100μL柠檬酸钠溶液混合，在80℃下超声10min。在MoS2与柠檬酸钠混合溶液中加入250μL FeCl3和FeSO4混合溶液并不断充入氮气，并在80℃下超声10min。向上述混合溶液中逐滴滴加200μL 7mol/LNaOH溶液，并不断充入氮气，并在80℃下超声1.5h。超声结束后等待溶液冷却至室温，用磁力架对溶液进行磁吸附，去除上清液并用超纯水复溶。再次磁吸附分离后分别用无水乙醇和超纯水复溶清洗，最后用超纯水复溶至1mL。
(2)MoS2@Fe3O4复合材料的表面修饰
取200μL 1.6mg/mL的MoS2@Fe3O4纳米复合材料样品，用超纯水稀释为0.8mg/mL，并加入等体积的4mg/mL的L-半胱氨酸(Cys)溶液，避光下于调速混合器上震荡6-12小时进行修饰处理，利用磁分离去除上清液中多余的L-cys并用超纯水进行清洗2遍，最后用pH为7.5的磷酸缓冲溶液复溶至原体积。
(3)MoS2@Fe3O4复合材料的表征
如图1A可知，制得的材料具有良好的磁性，并且MoS2@Fe3O4复合材料的水合粒径比MoS2的水合粒径平均扩大了40nm。如图1B可知，MoS2@Fe3O4复合材料的zeta电位的绝对值比MoS2扩大了14mV，代表着MoS2与Fe3O4的成功结合。
(4)MoS2@Fe3O4复合材料的催化性能探究
利用MoS2@Fe3O4拥有的类过氧化物酶活性，可以催化H2O2氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)发生反应，生成有色偶氮化合物，该化合物在625nm波长处有吸收峰，利用酶标仪测定该化合物在625nm波长处的吸光度值的高低，可以代表化合物产生的含量，进而代表复合材料催化能力的强弱。首先制备复合材料催化的反应体系，并对反应条件进行优化。配制pH为4.5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，取3940μL的pH为4.5的缓冲液，40μL 2％的TMB溶液和8μL30％H2O2混合，配成显色液。根据材料：显色液＝1:5的比例将材料与显色液混合均匀，然后置于37℃恒温培养箱中反应15min。反应结束用酶标仪在625nm波长下测定吸光度值。
对催化体系的各项条件进行优化，以获得最优的反应条件，并在此条件下计算催化反应的米氏常数Km值，Km值为酶促反应达最大速度一半时的底物浓度，根据Km值的大小可以判断酶的催化性能的强弱。图2是催化体系中四个催化条件的优化结果，优化的反应时间为15min，pH为4.5，H2O2体积为8μL，TMB浓度为2％。根据TMB浓度与吸光度值的对应关系绘制了双倒数曲线，如图2E所示，并计算了回归曲线，算得Km值约为5.15×10-3mol/L。
L-cys与TMB带相反电荷能相互吸引，使复合材料结合更多的TMB，从而可以提高材料的催化性能，但是当L-cys的浓度过高时，会堵塞MoS2的催化作用，降低催化性能。在二硫化钼的催化作用下，H2O2可将TMB氧化生成有色偶氮化合物，因此通过酶标仪检测该化合物含量从而比较出复合材料催化性能的高低。调整酶标仪波长为625nm，检测各个样品的吸光度。如图3所示，MoS2@Fe3O4纳米复合材料经过浓度为4mg/mL L-cys修饰后吸光度值最高，说明材料与浓度为4mg/mL的L-cys修饰得到的复合材料催化能力较好，尤其与未修饰的材料相比催化性能有显著提高。
(5)MoS2@Fe3O4复合材料的光热转换性能
光热转换效率是衡量一种光热材料光热转换能力的标志。结果如图4所示，MoS2@Fe3O4纳米复合材料的光热转换效率为30.55％，介于MoS2和Fe3O4之间。而连有L-cys的MoS2@Fe3O4纳米复合材料的光热转换效率与单独的MoS2@Fe3O4纳米复合材料相比变化不大，证明连接的L-cys不会影响MoS2@Fe3O4纳米复合材料的光热转换效率。相对比于MoS2，制备的MoS2@Fe3O4纳米复合材料牺牲了一部分光热转换性能而换来良好的磁性，可以通过磁性实现对样液中鼠伤寒沙门氏菌的富集，提高检测灵敏性。
(6)MoS2@Fe3O4检测探针制备及试纸条组装的优化
①MoS2@Fe3O4检测探针制备pH的优化
分别配制pH为5、6、7、8、9的PBS缓冲溶液，2μL连接L-cys的MoS2@Fe3O4纳米复合材料被磁分离后被pH为5、6、7、8、9的PBS缓冲溶液复溶。向每组溶液中分别加入1μL 50μg/mL的鼠伤寒沙门氏菌抗体，室温震荡30min。再向每组溶液中分别加入3μL 8％BSA溶液，室温震荡1.5h进行封闭处理。取5张(1cm2左右)硝酸纤维素膜放入超纯水中10min活化，干燥后在硝酸纤维素膜中心滴加0.5μL 500μg/mL的鼠伤寒沙门氏菌抗体，37℃结合30min。再将5张连有抗体的硝酸纤维素膜浸泡至8％BSA溶液中震荡1.5h进行封闭处理，结束后用超纯水清洗。液体培养基中的细菌悬液在6000g的条件下离心，用超纯水清洗1次，并用超纯水复溶至原体积。不同pH的MoS2@Fe3O4混合液与6μL细菌悬液混合，室温震荡30min，再经磁分离后被超纯水复溶至2μL，然后再分别滴加至硝酸纤维素膜中央，在37℃下放置10min后用超纯水冲洗，晾干后观察颜色，并被激光照射，用热像仪记录硝酸纤维素膜上的温度变化，每组的实际温度变化减去空白组温度变化的差值作为每组由结合的MoS2@Fe3O4复合材料造成的温度变化。同时制备pH为6且不与细菌结合的一组作为空白对照。结果如图5A所示，制备的MoS2@Fe3O4纳米材料在pH为6的条件下在硝酸纤维素膜表面的颜色最深且温度变化最大，故pH6为材料的最优pH。
②MoS2@Fe3O4复合材料封闭液浓度的优化
取六组2μL连接L-cys的MoS2@Fe3O4纳米复合材料，向每组溶液中分别加入1μL 50μg/mL的鼠伤寒沙门氏菌抗体，室温震荡30min。再向每组溶液中分别加入3μL超纯水、2％、4％、6％、8％和10％BSA溶液，室温震荡1.5h进行封闭处理，超纯水组作为空白对照。取六张(1cm2左右)硝酸纤维素膜放入超纯水中10min活化，干燥后在硝酸纤维素膜中心滴加0.5μL500μg/mL的鼠伤寒沙门氏菌抗体，37℃结合30min。再将连有抗体的硝酸纤维素膜浸泡至8％BSA溶液中震荡1.5h进行封闭处理，结束后用超纯水清洗。液体培养基中的细菌悬液在6000g的条件下被离心，用超纯水清洗1次，并用超纯水复溶至原体积。各组MoS2@Fe3O4混合液与6μL细菌悬液混合，室温震荡30min，再经磁分离后被超纯水复溶至2μL，然后再分别滴加至硝酸纤维素膜中央，在37℃下放置10min后用超纯水冲洗，晾干后观察颜色，并被激光照射，用热像仪记录硝酸纤维素膜上的温度变化，每组的实际温度变化减去空白组温度变化的差值作为每组由结合的MoS2@Fe3O4复合材料造成的温度变化。结果如图5B所示，制备的MoS2@Fe3O4纳米材料在8％BSA的条件下在硝酸纤维素膜表面的颜色不再变浅且温度下降趋于平缓，故8％为材料的最优封闭液浓度。
③MoS2@Fe3O4材料连接抗体浓度的优化
取五组2μL连接L-cys的MoS2@Fe3O4纳米复合材料，向每组溶液中分别加入1μL超纯水、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和100μg/mL的鼠伤寒沙门氏菌抗体，室温震荡30min，超纯水组作为空白对照。再向每组溶液中分别加入3μL 8％BSA溶液，室温震荡1.5h进行封闭处理。取五张(1cm2左右)硝酸纤维素膜放入超纯水中10min活化，干燥后在硝酸纤维素膜中心滴加0.5μL 500μg/mL的鼠伤寒沙门氏菌抗体，37℃结合30min。再将连有抗体的硝酸纤维素膜浸泡至8％BSA溶液中震荡1.5h进行封闭处理，结束后用超纯水清洗。液体培养基中的细菌悬液在6000g的条件下离心，用超纯水清洗1次，并用超纯水复溶至原体积。各组MoS2@Fe3O4混合液与6μL细菌悬液混合，室温震荡30min，再经磁分离后被超纯水复溶至2μL，然后再分别滴加至硝酸纤维素膜中央，在37℃下放置10min后用超纯水冲洗，晾干后观察颜色，并被激光照射，用热像仪记录硝酸纤维素膜上的温度变化，每组的实际温度变化减去空白组温度变化的差值作为每组由结合的MoS2@Fe3O4复合材料造成的温度变化。结果如图5C所示，制备的MoS2@Fe3O4纳米材料在75μg/mL抗体的条件下在硝酸纤维素膜表面的颜色不再变深且温度上升趋于平缓，故75μg/mL为材料的最优抗体浓度。
④膜封闭液浓度的优化
取六组2μL连接L-cys的MoS2@Fe3O4纳米复合材料，向每组溶液中分别加入1μL 75μg/mL的鼠伤寒沙门氏菌抗体，室温震荡30min。再向每组溶液中分别加入3μL 8％BSA溶液，室温震荡1.5h进行封闭处理。取六张(1cm2左右)硝酸纤维素膜放入超纯水中10min活化，干燥后在硝酸纤维素膜中心滴加0.5μL 500μg/mL的鼠伤寒沙门氏菌抗体，37℃结合30min。再将连有抗体的硝酸纤维素膜分别浸泡至超纯水、1％、2％、4％、6％和8％BSA溶液中震荡1.5h进行封闭处理，超纯水组作为空白对照，结束后用超纯水清洗。液体培养基中的细菌悬液在6000g的条件下被离心，用超纯水清洗1次，并用超纯水复溶至原体积。各组MoS2@Fe3O4混合液与6μL细菌悬液混合，室温震荡30min，再经磁分离后被超纯水复溶至2μL，然后再分别滴加至六组硝酸纤维素膜中央，在37℃下放置10min后用超纯水冲洗，晾干后观察颜色，并被激光照射，用热像仪记录硝酸纤维素膜上的温度变化，每组的实际温度变化减去空白组温度变化的差值作为每组由结合的MoS2@Fe3O4复合材料造成的温度变化。结果如图5D所示，制备的MoS2@Fe3O4纳米材料在6％BSA的条件下在硝酸纤维素膜表面的颜色不再变浅且温度下降趋于平缓，故6％为硝酸纤维素膜的最优封闭液浓度。
⑤膜抗体浓度的优化
取六组2μL连接L-cys的MoS2@Fe3O4纳米复合材料，向每组溶液中分别加入1μL 75μg/mL的鼠伤寒沙门氏菌抗体，室温震荡30min。再向每组溶液中分别加入3μL 8％BSA溶液，室温震荡1.5h进行封闭处理。取六张(1cm2左右)硝酸纤维素膜放入超纯水中10min活化，干燥后在硝酸纤维素膜中心分别滴加0.5μL超纯水、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL和700μg/mL的鼠伤寒沙门氏菌抗体，37℃结合30min。再将连有抗体的硝酸纤维素膜浸泡至8％BSA溶液中震荡1.5h进行封闭处理，结束后用超纯水清洗。液体培养基中的细菌悬液在6000g的条件下被离心，用超纯水清洗1次，并用超纯水复溶至原体积。各组MoS2@Fe3O4混合液与6μL细菌悬液混合，室温震荡30min，再经磁分离后被超纯水复溶至2μL，然后再分别滴加至硝酸纤维素膜中央，在37℃下放置10min后用超纯水冲洗，晾干后观察颜色，并被激光照射，用热像仪记录硝酸纤维素膜上的温度变化，每组的实际温度变化减去空白组温度变化的差值作为每组由结合的MoS2@Fe3O4复合材料造成的温度变化。结果如图5E所示，制备的MoS2@Fe3O4纳米材料在500μg/mL抗体的条件下在硝酸纤维素膜表面的颜色不再变深且温度上升趋于平缓，故500μg/mL为硝酸纤维素膜的最优抗体浓度。
⑥MoS2@Fe3O4复合材料的光热性能的优化
(A)最佳激光照射时长的优化
实验前对红外传感器、808nm红色激光灯进行检查，然后按照操作要求将设备依次组装调整照射器的角度，使其照射出来的激光在NC膜的中心区域，其中激光灯需要提前进行预热。准备大小为1cm2的硝酸纤维素膜，用移液枪向其滴加5μL 0.8mg/mL的MoS2@Fe3O4纳米复合材料。在铁架台底座垫上吸水垫，再将NC膜放置吸水垫上，在实验过程中，注意保证激光照射距离和传感器高度不变，冷却至室温后即可开始实验。测定0s～5min照射区域的温度变化，前10s每2s记录温度，10～30s区间，每5s记录温度，在30～90s区间，每10s记录温度，在90～210s区间，每20s记录温度，在210～300s区间，每30s记录温度。三次重复实验，注意每次开始实验前，应等试纸条冷却至室温后再进行实验。实验结束后，求出三次实验温差的平均值，对数据进行处理，用Origin软件作图分析数据，选出最佳的照射时长。
如图6所示，随着激光照射从0s到300s，样品的温度一直在升高，且随着照射时长的延长，温度升高趋于缓慢。当激光照射时长在0s到60s范围内，温度急剧升高，且在60s左右基本升至最高点，照射60s后温度虽有升高但波动范围很小，逐渐趋于稳定，故60s为最佳照射时长。
(B)最佳激光照射功率的优化
激光强度的强弱随着激光器功率的不同也有所不同，不同强度的激光会影响照射样品的升温情况，因此以激光照射样品的功率为变量进行探究，对照射功率进行优化。同上一步一样，准备好干燥后的滴加有复合材料的NC膜，使用上一步激光照射时长优化结果60s作为该实验的照射时长，设计激光照射功率的梯度为：1.5W、2.0W、2.5W、3.0W、3.5W，探究在不同激光照射功率下样品的升温，进行三次重复实验。实验结束后，求出相同射功率下的三次温差的平均值，对数据进行处理，用Origin软件作图分析数据，选出最佳的照射功率。
如图7所示，随着激光照射功率的增加，样品温度逐渐升高，且在照射功率1.5W到3W区间，温度升高很明显，但当照射功率为3.5W时，相比3W温度升高的差值较小。因此，3W为激光照射最佳功率。
(C)不同样品浓度的光热性能的探究
使用上一步激光照射功率优化结果得到的最佳照射功率3w作为该实验的照射功率，照射时长为60s。通过实验室前期实验可知样品浓度不同，照射结果也不同，因此设计4mg/mL的MoS2@Fe3O4纳米复合材料的稀释倍数梯度为：4倍、16倍、64倍、256倍、1024倍，探究在相同照射时长、相同照射功率下，不同样品随浓度变化的温升规律。准备六个大小为1cm2的硝酸纤维素膜，其中一张不加材料，加相同体积超纯水为空白对照，用移液枪依次向其他五张膜上滴加5μL稀释不同倍数的材料，三次重复实验。计算出同一浓度下三次温差的平均值，对数据进行处理，用Origin软件作图分析实验数据。
如图8所示，随着稀释倍数的增加，升高的温度逐渐下降，当样品浓度被稀释256倍时肉眼已经看不到颜色，但是样品稀释1024倍被激光照射后，用仪器仍能检测出温度升高，说明采用光热检测比肉眼视觉检测限提高了16倍。
(7)利用试纸条对沙门氏菌进行检测
①沙门氏菌的培养
在超净工作台中，将斜面培养基中鼠伤寒沙门氏菌菌落用灭菌的接种环挑取至液体LB培养基中，37℃振荡培养12h。
②沙门氏菌菌液的处理
从LB培养基中取出1mL原始菌液，6000g离心5min，弃去上清液；加入1mL PBS溶液清洗，离心，弃去上清液；再用超纯水对沙门氏菌清洗离心两遍，弃去上清液，用超纯水复容至1mL，原始浓度经过平板计数法计数约为108CFU/mL。
③视觉检测限的测定
对原始菌液进行浓度梯度稀释至106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL。取各浓度的沙门氏菌稀释液6μL和超纯水6μL(空白对照组)，分别与6μL封闭好的复合材料混合，混合均匀后放置于37℃恒温培养箱中结合10min。对沙门氏菌与材料的混合溶液和空白对照组进行磁分离，弃去清液，加超纯水复溶至2μL。将与沙门氏菌结合的检测探针和空白对照组分别滴加在组装好的试纸条点样区，在37℃恒温培养箱中放置10min。然后清洗1～2次，晾干后备用。
通过测定一系列不同浓度的沙门氏菌稀释液，以探究分析方法的灵敏度。结果如图9所示，随着沙门氏菌浓度的上升，试纸条颜色在逐渐加深，并得出视觉检测限为102CFU/mL。
④利用光热效应对检测限进行定量分析方法
将实验所需装置组装好后，用波长为808nm、功率为3W的激光照射点样区60s，用热像仪测量并记录试纸条点样处的温度，计算照射前后的温度差值ΔT。以沙门氏菌数量的对数值与温度变化值ΔT建立工作曲线，得出线性回归方程，并通过信噪比，确定试纸条检测鼠伤寒沙门氏菌的最低检测限。
根据之前测的空白对照组结果和回归曲线可得，沙门氏菌的最低检测限在101CFU/mL。标准曲线线性回归方程如图9所示。
⑤基于MoS2@Fe3O4纳米复合材料的催化性能实现沙门氏菌的灵敏检测
将经过裸眼观察后的试纸条浸入显色液中，37℃避光保存15min后观察试纸条显色结果，肉眼刚能清晰观察到蓝色的为视觉检测限。结果如图9所示，催化后的视觉检测限为101CFU/mL。
(7)对试纸条的性能进行检测
①稳定性检测
在已经活化好的硝酸纤维素膜上滴加0.5μL 500μg/mL的抗体溶液，37℃避光保存30min。再把硝酸纤维素膜浸泡入6％的BSA溶液进行封闭，37℃避光保存1.5h，封闭完后清洗干净。取5张膜分别在4℃冰箱中湿润保存0、3、7、14、30天后进行下一步的操作。再取4张膜分别在37℃恒温培养箱中保存0、1、2、3天后进行下一步操作。
将沙门氏菌悬液与封闭好的免疫MoS2@Fe3O4纳米复合材料混合，混合均匀后放置于37℃恒温培养箱中恒温结合30min，同时取一组与超纯水混合，作为空白对照。对沙门氏菌与材料的混合溶液和空白对照组进行磁分离，弃去清液，加超纯水复溶，滴加至上述储存不同时间的试纸条上，观察试纸条显色结果，并经过激光照射，计算温度变化值，即可检测试纸条的稳定性。
结果如图10所示，制备的试纸条经过长时间的保存后都保持均一的状态，因此证明所制备的试纸条具有良好的稳定性。
②特异性检测
以食品中常污染的食源性致病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌和肠炎沙门氏菌来验证检测方法的特异性。将经过离心清洗的鼠伤寒沙门氏菌(106CFU/mL)、大肠杆菌(106CFU/mL)、金黄色葡萄球菌(106CFU/mL)、李斯特菌(106CFU/mL)和肠炎沙门氏菌(106CFU/mL)与制备好的免疫MoS2@Fe3O4纳米复合材料混合，37℃培养箱中结合30min后磁分离，弃上清并用超纯水复溶，滴加至组装后的试纸条上，37℃培养箱中结合10min，清洗并晾干，观察试纸条显色结果，并经过激光照射，计算温度变化值，即可得出试纸条的特异性情况。
结果如图11所示，在硝酸纤维素膜表面仅有鼠伤寒沙门氏菌拥有比较深的颜色，其他菌对应的膜表面几乎没有颜色，且仅有鼠伤寒沙门氏菌组的温度变化明显。结果证明所制备的试纸条具有良好的特异性。
③重复性检测
按照组装方法组装试纸条5个，按照最优条件制备免疫MoS2@Fe3O4纳米复合材料，以鼠伤寒沙门氏菌(106CFU/mL)为目标待测物进行组内重复性检验。结果如图12所示，视觉检测结果和光热检测结果均没有明显的差别，结果证明所制备的试纸条具有良好的重复性。
④实际样品检测
为了验证检测方法在实际样品中的检测效果，选择了三种易被污染鼠伤寒沙门氏菌的实际样品：自来水、牛奶、葡萄汁，并分别在其中添加不同浓度的沙门氏菌，通过计算细菌的添加回收率来验证检测方法在实际样品中的检测效果。
分别取1mL浓度为102CFU/mL、104CFU/mL、106CFU/mL的沙门氏菌悬液，经6000g离心后分别用自来水、牛奶和葡萄汁复溶至1mL，并各自取6μL与等体积的MoS2@Fe3O4免疫复合物混合，37℃结合30min。结束后经磁分离并被超纯水复溶至2μL。滴加在组装好的试纸条表面，37℃结合10min后清洗晾干，肉眼观察并被激光照射，计算各组的温度变化值。
结果如图13所示，制备的试纸条在低中高三种不同浓度(102CFU/mL、104CFU/mL、106CFU/mL)细菌的实际样品中均能成功的检测出鼠伤寒沙门氏菌，证明方法应用于实际样品检测的可行性和良好的适用性。
⑤磁富集能力检测
MoS2@Fe3O4纳米复合材料含有Fe3O4，因此拥有良好的磁性，可在磁场的作用下被吸引聚集，因此可以实现MoS2@Fe3O4纳米复合材料在样液中的快速分离以及实现对鼠伤寒沙门氏菌的富集。为了检验检测方法的磁富集能力，选择在视觉检测限(102CFU/mL)处对待测的细菌悬液进行体积的倍数扩大，以验证检测方法在更高倍体积的待测溶液中对鼠伤寒沙门氏菌的富集能力。结果如图14所示，随着细菌悬液体积倍数的扩大，检测效率在逐渐降低，当细菌悬液体积扩大10倍后，仍可以在硝酸纤维素膜表面看到颜色，同时温度变化也比较明显，证明本检测方法可以利用磁富集能力将检测限降低约一个数量级，体现了检测方法拥有良好的磁富集能力。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，所述方法包括：
S1、向磁性二硫化钼纳米复合材料或检测探针中加入鼠伤寒沙门氏菌抗体，然后加入BSA封闭；
S2、将待测样品加入步骤S1制得溶液混合孵育，然后再经磁分离，复溶后加入多模试纸条；所述检测方法还包括：基于目测法和光热法对鼠伤寒沙门氏菌进行检测；
所述步骤S1中，鼠伤寒沙门氏菌抗体浓度控制为1~100 µg/mL；
所述BSA溶液浓度控制为1~10%；
所述步骤S2中，复溶采用PBS缓冲溶液，其pH控制为5~9；
所述目测法具体包括：将步骤S2获得的试纸条加入显色液中，肉眼观察试纸条显色结果；
所述显色液为含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺和H2O2的溶液；
所述基于光热法具体包括：对步骤S2获得的试纸条进行激光照射并利用热像仪测定温度变化；
所述激光照射中激光控制为红外光；
所述磁性二硫化钼纳米复合材料为MoS2@Fe3O4纳米复合材料，所述MoS2@Fe3O4纳米复合材料还修饰有L-半胱氨酸；
所述L-半胱氨酸的浓度控制为4 mg/mL;
所述磁性二硫化钼纳米复合材料的制备方法包括：
（1）将FeCl3溶液和FeSO4溶液混合并充入惰性气体，在高温下超声处理得溶液I；(2)将MoS2悬浮液与柠檬酸钠溶液混合，高温超声处理得溶液II；(3)将溶液I加入溶液II中并充入惰性气体，在高温下超声处理，同时向上述混合溶液中加入碱液，然后在高温条件下继续超声处理；将获得的溶液进行磁吸附处理获得MoS2@Fe3O4纳米复合材料，再加入L-半胱氨酸进行表面修饰，获得所述磁性二硫化钼纳米复合材料；
所述步骤（1）中，所述FeCl3溶液的浓度控制为0.05~0.2 mol/L，所述FeSO4溶液的浓度控制为0.01~0.1 mol/L；所述高温超声处理具体为：在70~90℃下超声处理1~60 min；
所述步骤（2）中，所述MoS2悬浮液的浓度控制为1~2 mg/mL；所述柠檬酸钠的浓度控制为0.05~0.2 mol/L；所述高温超声处理具体为：在70~90℃下超声处理1~30 min；
所述步骤（3）中，所述充入惰性气体后高温超声处理具体为：在70~90℃下超声处理1~30 min；在高温条件下继续超声处理具体为：在70~90℃下超声处理1~3 h；
所述检测探针包含上述磁性二硫化钼纳米复合材料；
所述多模试纸条由硝酸纤维素膜制成；
所述多模试纸条的制备方法包括：向活化后的硝酸纤维素膜上加入浓度为100~700 µg/mL鼠伤寒沙门氏菌抗体进行结合，然后使用溶液浓度为1~8%的BSA封闭；
所述活化方法包括：将硝酸纤维素膜置于超纯水中进行活化处理。
2.如权利要求1所述的一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，所述步骤S1中，鼠伤寒沙门氏菌抗体浓度控制为75 µg/mL；
所述BSA溶液浓度控制为8%；
所述步骤S2中，复溶采用PBS缓冲溶液，其pH为6。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述激光波长控制为808 nm；激光照射时间为不大于60 s；所述激光照射功率控制为1~4 W。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述激光照射时间为60 s；所述激光照射功率控制为3 W。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述FeCl3溶液的浓度控制为0.1 mol/L；所述FeSO4溶液的浓度控制为0.05 mol/L；所述高温超声处理具体为：在80℃条件下超声处理30 min；
所述步骤（2）中，所述MoS2悬浮液的浓度控制为1.6 mg/mL；所述柠檬酸钠的浓度控制为0.1 mol/L；所述高温超声处理具体为：在80℃条件下超声处理10 min；
所述步骤（3）中，所述充入惰性气体后在高温下超声处理具体为：在80℃条件下超声处理10 min；在高温条件下继续超声处理具体为：在80℃条件下超声处理1.5 h。
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