CN113419060B

CN113419060B - PB@Au纳米复合材料、试纸条及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113419060B
Application number: CN202110978222.0A
Authority: CN
Inventors: 杜淑媛; 卢璋; 张鸿雁; 杨增琳; 曹瑞迪; 张飘然; 高卢翔; 刘文秀
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2021-08-25
Filing date: 2021-08-25
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-08-25
Also published as: CN113419060A

Abstract

本发明属于试剂检测领域，具体涉及一种PB@Au纳米复合材料、试纸条及其制备方法与应用。所述PB@Au纳米复合材料由PB纳米颗粒和Au纳米颗粒组成，Au纳米颗粒负载于PB纳米颗粒的表面上。本发明以PB@Au纳米复合材料作为检测信号的报告者和放大者，综合PB和Au纳米颗粒的光热和催化性能，提高检测的灵敏度和准确性。本发明通过直接视觉检测、光热检测和催化显色检测的多模式检测的相互验证，提高检测的准确性，建立一种灵敏、准确的病原体免疫渗滤试纸条定量检测方法。

Description

PB@Au纳米复合材料、试纸条及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于试剂检测领域，具体涉及一种PB@Au纳米复合材料、试纸条及其制备方法与应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

病原体是疾病的主要原因之一，威胁着食品安全和人体健康。目前病原体的快速检测方法主要包括聚合酶链式反应（PCR）、传感器、酶联免疫吸附检测（ELISA）和环介导等温扩增反应（LAMP）。与耗时费力的传统平板培养方法相比，快速检测方法虽然缩短了检测时间，但仍存在检测条件严格、灵敏度与准确性低等缺点。因此，需要建立一种灵敏、准确、便捷的检测方法来预防和控制病原体的暴发。

免疫层析试纸条分析法（ICT）包括侧流免疫分析法（LFIAs）和渗滤免疫分析法（DFIAs），具有简单、快速、方便等优点，适合食品污染的实时和现场筛查。然而，ICT的应用受到其低灵敏度和准确性的限制。为了提高ICT的灵敏度，采用了具有催化和光热性能的新型标记纳米材料来产生信号放大；为了提高ICT的准确性，多模式检测被用于验证检测结果。然而，这些纳米材料仍面临着制备时间长、合成工艺复杂、成本高等缺点，限制了其进一步的应用。因此，寻找一种性能优良、易于合成的新型纳米材料来产生和放大检测信号是十分必要的。

普鲁士蓝（PB）是一种蓝色染料，具有良好的生物相容性、低成本、易合成等优点，已被广泛用作药物载体、光热治疗剂和医学成像剂。此外，普鲁士蓝具有优异的催化性能，已广泛应用于生物/化学传感的研究，如在水溶液中检测过氧化氢、葡萄糖和L-乳酸。利用PB的类过氧化物酶活性，将其应用于侧流免疫试纸条中，提高了检测灵敏度，但存在单一颜色梯度缺乏视觉冲击力和颜色标准的问题，同时无法实现目标物定量，难以对病原体进行灵敏、准确的检测。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供一种PB@Au纳米复合材料、试纸条及其制备方法与应用，以PB@Au纳米复合材料作为检测信号的报告者和放大者，综合PB和Au纳米粒子的光热和催化性能，提高检测的灵敏度和准确度。本发明利用PB和催化产物的颜色叠加，在提高检测灵敏度的同时产生色系变化指示结果，催化显色产生的颜色叠加程度能更清楚地显示病原体的感染剂量，从而达到及时防控的目的。本发明还通过直接视觉检测、光热检测和催化显色检测进行多模式检测的相互验证，进一步提高检测结果的准确性，建立一种灵敏、准确的病原体免疫渗滤试纸条定量检测方法。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种PB@Au纳米复合材料，该复合材料由PB纳米颗粒和Au纳米颗粒组成，Au纳米颗粒负载于PB纳米颗粒的表面上。

本发明第二方面提供一种上述PB@Au纳米复合材料的制备方法，具体为：

将PB纳米颗粒溶液与HAuCl₄溶液混合，然后在沸腾条件下添加柠檬酸三钠溶液，在PB纳米颗粒的表面负载由柠檬酸三钠还原氯金酸而形成的Au纳米颗粒。

本发明第三方面提供一种上述PB@Au纳米复合材料作为标记材料在病原体检测产品中的应用。

本发明第四方面提供一种检测病原体的试纸条，所述试纸条以PB@Au纳米复合材料作为标记材料。

本发明第五方面提供一种上述试纸条的制备方法，具体包括：

制备免疫-PB@Au复合物；将病原体抗体与PB@Au一起孵育，使PB@Au纳米复合材料和病原体抗体结合，得到免疫-PB@Au复合物；

构建免疫渗滤试纸条；将病原体抗体滴加于硝酸纤维素膜（NCM）上，使NCM成功包被上病原体抗体，得到病原体抗体包被的试纸条。

本发明第六方面提供一种上述试纸条在检测病原体中的应用；

应用方法为：将含有病原体的样品溶液与免疫-PB@Au复合物混合，然后将混合物滴到试纸条的病原体抗体包被区进行孵育，通过特异性识别形成抗体-病原体-抗体复合物。

本发明第七方面提供一种采用上述试纸条检测病原体的方法，检测的方法包括但不限于：直接视觉检测、光热检测、催化显色检测中的一种或多种的结合。

本发明的一个或多个实施方式至少具有以下有益效果：

（1）本发明借助普鲁士蓝@金纳米粒子（PB@Au）为标记材料，开发了一种低成本、快速、灵敏且准确的病原体检测方法，基于纳米材料固有的颜色、出色的催化和光热性能实现对目标物的检测。此外，病原体的爆发风险量可以通过催化颜色叠加更直观地展示出来。

（2）本发明通过视觉检测、光热检测和催化显色检测的多模式检测提高了方法的准确性，并表现出良好的重复性、可接受的特异性和稳定性。包括样品准备在内，整个检测过程可在30分钟内完成。该方法还成功应用于实际样品中病原体的检测，证明了其具有良好的实用性。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：检测鼠伤寒沙门氏菌的方案。（A）制备免疫-PB@Au复合物；（B）免疫渗滤试纸条的构建；（C）双抗夹心免疫分析原理；（D）鼠伤寒沙门氏菌的多模式检测，包括直接视觉检测、光热检测和催化显色检测。

图2：（A）PB，PB@Au 1，PB@Au 2，PB@Au 3，PB@Au 4和PB@Au 5的照片和紫外可见吸收光谱；（B）不同纳米材料在相同照射条件下的ΔT；（C）在相同的催化条件下经催化显色后，PB、PB@Au 1、PB@Au 2、PB@Au 3、PB@Au 4和PB@Au 5对应的照片和紫外可见吸收光谱；（D）用H₂SO₄（4 moL·L⁻¹）终止催化显色反应后，不同纳米材料在460 nm处的吸光度值。

图3： PB（A）和PB@Au纳米复合物（B）的TEM图像；（C）PB和PB@Au纳米复合材料的紫外可见吸收光谱；（D）PB、PB@Au和免疫-PB@Au复合物的Zeta电位；（E）PB、PB@Au和免疫-PB@Au复合物的水动力学直径；（F）PB的XPS全谱；（G）PB@Au的XPS全谱；（H）PB@Au中的Au元素的XPS窄谱。

图4：（A）PB和PB@Au的光热转换效率；（B）PB@Au热循环性能曲线；（C）照射前后PB@Au的紫外可见吸收光谱图；（D）不同稀释比的PB@Au的照片，稀释比和ΔT的标准曲线。

图5：（A）PB@Au、PB@Au+DAB、PB@Au+DAB+H₂O₂的紫外可见吸收光谱；优化（B）PBS的pH、（C）H₂O₂的体积（30%）、（D）催化反应时间和（E）DAB的浓度；（F）PB@Au纳米复合材料类过氧化酶活性的双倒数曲线。

图6：优化PB@Au的（A）照射时间和（B）激光功率。

图7：优化试纸条组装条件的照片和光热图像。（A）NCM上BSA溶液的浓度；（B）免疫-PB@Au复合物上BSA溶液的浓度；（C）免疫-PB@Au复合物的构建pH值；（D）PB@Au上连接的抗体数量。

图8：（A）直接视觉检测和催化显色检测的灵敏度评估；（B）ΔT和鼠伤寒沙门氏菌数量之间的S形曲线，内部插图为所建立的检测方法的线性范围；（C）特异性评估；（D）通过检测牛奶、自来水和酱油等食品中添加的鼠伤寒沙门氏菌来进行实际应用评估。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中，利用PB的催化性能提高检测灵敏度，存在单一颜色梯度缺乏视觉冲击力和颜色标准的问题，同时无法实现目标物定量，难以对病原体进行灵敏、准确的检测。

为了解决如上的技术问题，本发明第一方面提供一种PB@Au纳米复合材料，其特征在于：该复合材料由PB纳米颗粒（PB NPs）和Au纳米颗粒（Au NPs）组成，Au纳米颗粒负载于PB纳米颗粒的表面上。

将PB NPs溶液与HAuCl₄溶液混合，然后在沸腾条件下添加柠檬酸三钠溶液，在PBNPs的表面负载由柠檬酸三钠还原氯金酸而形成的Au NPs。

本发明将PB NPs与Au NPs复合，原因在于：纳米材料与金纳米粒子的复合有利于抗体的直接连接，因此，制备PB@Au纳米复合材料能够在进一步提高催化性能的同时提高稳定性和抗体连接率，并在试纸上实现催化颜色叠加，提高检测灵敏度。而且，金纳米粒子具有优异的光热效应，有助于建立快速检测方法，且检测信号得到放大。

柠檬酸三钠的作用主要为还原作用，将HAuCl₄溶液中的Au³⁺还原为Au NPs，并负载于PB NPs表面，使得Au NPs与PB NPs共同发挥良好的光热和催化性能，提高检测的灵敏度和准确性。

进一步的，所述PB NPs溶液的浓度为0.5-1.5 mg·mL^-1，优选为0.5-1 mg·mL^-1；所述HAuCl₄溶液的浓度为0.01-0.02% w/v；

进一步的，所述PB NPs溶液与HAuCl₄溶液的体积比为0.5:4-16；

为了使得柠檬酸三钠能够均匀地将Au NPs还原于PB NPs表面，PB NPs溶液与HAuCl₄溶液混合后加热至沸腾3-5分钟再添加柠檬酸三钠。

进一步的，所述柠檬酸三钠的浓度为0.5-1.5% w/v，优选为1-1.2% w/v；柠檬酸三钠与PB NPs溶液的体积比为500：85-340；

为了使得柠檬酸三钠的还原效果发挥的更加充分，本发明在添加柠檬酸三钠后，持续煮沸3-5分钟，然后冷却、离心，即得PB@Au纳米复合材料。

进一步的，所述离心为：在4-5℃下11000 g离心30-40分钟。

所述病原体不做特殊限定，包括人体中常见的致病菌和食物中常见的致病菌，例如肉毒杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌等。

进一步的，所述试纸条为包被病原体抗体的NCM膜。

构建免疫渗滤试纸条；将病原体抗体滴加于NCM上，使NCM成功包被上病原体抗体，得到病原体抗体包被的试纸条。

其中，制备免疫-PB@Au复合物的过程中，将病原体抗体滴入PB@Au水溶液，在室温下孵育使PB@Au纳米复合材料和病原体抗体结合，然后，添加BSA并继续孵育以封闭多余位点，最后通过离心得到免疫-PB@Au复合物；

构建免疫渗滤试纸条的过程中，将病原体抗体滴加于NCM上，使NCM成功包被上病原体抗体，再将BSA滴在NCM上，以封闭多余的活性位点，最后清洗得到病原体抗体包被的试纸条。

应用方法具体为：

将含有病原体的样品溶液与免疫-PB@Au复合物混合，然后将混合物滴到试纸条的病原体抗体包被区进行孵育，通过特异性识别形成抗体-病原体-抗体复合物。

本发明第七方面提供一种采用上述的试纸条检测病原体的方法，检测的方法包括但不限于：直接视觉检测、光热检测、催化显色检测中的一种或多种的结合。

通过多模式检测的相互验证，有助于提高实验结果的准确性：

直接视觉检测，能够获得免疫-PB@Au复合物固有的蓝色，用于病原体的分析。

光热检测，PB@Au的ΔT用于根据标准曲线计算病原体的数量。

催化显色检测，通过PB@Au的类过氧化酶活性，催化显色底物DAB，产生由PB@Au和oxDAB之间的颜色叠加得到的多重颜色，提高检测灵敏度。

当所述病原体为鼠伤寒沙门氏菌时，直接视觉检测的检测限为10² CFU·mL⁻¹，光热检测的检测限为10¹CFU·mL⁻¹，催化显色后，当鼠伤寒沙门氏菌数量为10¹ CFU·mL⁻¹时出现颜色，表现出高于直接视觉检测的灵敏度，蓝绿色PB@Au和棕黄色oxDAB的颜色叠加可以形成多重颜色，在10⁵ CFU·mL⁻¹以下，免疫渗滤试纸条呈现红色系，在10⁵ CFU·mL⁻¹以上则变成蓝色系。光热检测限与催化显色检测限一致，可实现鼠伤寒沙门氏菌的定量和灵敏测定。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

本实施例提供一种检测鼠伤寒沙门氏菌的试纸条，具体制备方法为：

（1）PB@Au纳米复合材料的制备

PB NPs溶液（1 mg·mL^-1, 0.5 mL）与HAuCl₄溶液（0.01% w/v、4、6、8、12、16 mL）混合，加热并保持沸腾3分钟。然后，柠檬酸三钠溶液（1% w/v、分别为85、127.5、170、255、340μL）被快速添加到混合溶液中，并持续煮沸3分钟。在PB NPs的表面形成由柠檬酸三钠还原氯金酸而形成的Au NPs。冷却后，溶液在4℃下11000 g离心30分钟，沉淀用超纯水重新溶解到所需的浓度。为了获得具有最佳催化和光热特性的PB@Au纳米复合材料，优化了HAuCl₄的量。

（2）免疫-PB@Au复合物的制备

将鼠伤寒沙门氏菌抗体（6μL，0.2 mg·mL^-1）缓慢滴入PB@Au水溶液（25 μL，pH6.0）。在室温下孵育60分钟可以确保PB@Au纳米复合材料和抗体的成功结合。然后，添加BSA（25 μL，8% w/v）并继续孵育60分钟以封闭多余位点。最后，将免疫-PB@Au复合物于10000 g离心处理6分钟，沉淀用超纯水重新溶解到所需的浓度。

（3）免疫渗滤试纸条的构建

1平方厘米的NCM浸泡在超纯水中5分钟，然后在37℃下干燥对膜进行活化。将抗体（1 μL，0.4 mg·mL^-1）滴在NCM上，37℃下反应30分钟，以成功包被鼠伤寒沙门氏菌抗体。将BSA（20 μL，4% w/v）滴在NCM上，37℃保持30分钟，以封闭多余的活性位点。最后，用超纯水清洗NCM，然后在使用前放置在4℃。

实施例2

实施例1中所制备的试纸条在检测鼠伤寒沙门氏菌中的应用：

（1）细菌培养和样品制备

挑取单菌落于液体培养基中37℃过夜培养，通过平板计数法得出细菌的数量。菌悬液在6000 g离心5分钟，以减少基质的干扰，细菌沉淀用PBS清洗，并重悬到所需的浓度。在实际样品检测中，1 mL的无菌自来水、牛奶和酱油分别加入不同数量的鼠伤寒沙门氏菌（10³、10⁵、10⁷ CFU·mL⁻¹），在37℃放置10分钟。6000 g离心5分钟后，沉淀被收集，用PBS清洗并重悬。所有含有细菌的溶液和材料在丢弃前在高压灭菌锅（121℃，20分钟）中灭菌。

（2）鼠伤寒沙门氏菌多模式检测程序

1）直接视觉检测

将免疫-PB@Au复合物与鼠伤寒沙门氏菌（1：1 v/v）混合，放置在37℃下10分钟。然后，在抗体包被区上滴加2 μL的上述混合物，在37℃孵育10分钟。最后，用超纯水清洗NCM，干燥后观察抗体包被区形成的颜色。不含鼠伤寒沙门氏菌的样本被设定为阴性对照。

2）光热检测

使用激光照射NCM上的免疫-PB@Au复合物（2 W、100 s、808 nm）。标准曲线是根据如下公式计算的ΔT和鼠伤寒沙门氏菌数量确定的。

ΔT=ΔT₁−ΔT₀

ΔT是温度升高。ΔT₁和ΔT₀分别是实验组和空白组照射前后的温度升高。从ΔT₁中减去ΔT₀，以消除NCM上非特异性吸附的影响。

3）催化显色检测

DAB（2 mg）溶解在PBS（3 mL，pH 6.5，0.01 moL·L⁻¹）作为显色底物，使用时添加H₂O₂（2.5 μL，30%）。然后，将3 μL催化体系滴到每个抗体包被区，在37℃下孵育10分钟。根据PB@Au和oxDAB之间的颜色叠加，直接观察催化显色结果。

检测结果：

（1）原理

构建基于PB@Au纳米复合材料的光热效应和催化颜色叠加的试纸条，旨在实现对鼠伤寒沙门氏菌灵敏和准确的检测。PB@Au纳米复合材料被选为放大检测信号的抗体标记材料，检测原理和步骤如图1所示。首先，通过柠檬酸三钠还原HAuCl₄在PB上形成Au NPs，以制备PB@Au纳米复合材料。然后，在PB@Au上固定鼠伤寒沙门氏菌抗体，以构建免疫-PB@Au复合物（图1A）。活化后的NCM包被上鼠伤寒沙门氏菌抗体，然后使用BSA封闭，最终构建免疫渗滤试纸条（图1B）。图1C显示鼠伤寒沙门氏菌检测的双抗夹心免疫测定原理。含有鼠伤寒沙门氏菌的样品溶液与免疫-PB@Au复合物混合孵育，然后将混合物滴到NCM的抗体包被区，通过特异性识别形成抗体-细菌-抗体复合物。图1D是针对鼠伤寒沙门氏菌的多模式检测。对于直接视觉检测，获得免疫-PB@Au复合物固有的蓝色，用于鼠伤寒沙门氏菌的分析。对于光热检测，获得PB@Au的ΔT用于根据标准曲线计算鼠伤寒沙门氏菌的数量。对于催化显色检测，通过PB@Au的类过氧化酶活性，催化显色底物DAB，产生由PB@Au和oxDAB之间的颜色叠加得到的多重颜色，提高检测灵敏度和指示鼠伤寒沙门氏菌爆发数量。通过多模式检测的相互验证，提高了实验结果的准确性。

（2）纳米复合材料的选择

由于Fe²⁺和Fe³⁺之间的强电荷转移，PB NPs在近红外（650-900 nm）的第一个窗口区域具有出色的光吸收和光热转换特性。PB NPs溶液（1 mg·mL^-1，0.5 mL）与HAuCl₄溶液（0.01% w/v，4，6，8，12，16 mL）混合，即PB@Au 1-5。对PB@Au1-5的光吸收和光热转换特性进行了表征和比较。随着HAuCl₄的增加，溶液的颜色从深蓝色变化到浅蓝色，然后到浅黄色。在紫外可见吸收光谱（图2A）中观察到PB NPs的最大吸收峰约720 nm，这是PB NPs的特征峰。与PB NPs相比，连接Au NPs后，PB@Au的最大吸收峰值明显下降。然而，由于长时间高温加热导致PB NPs热解使最大吸收峰值的位置发生蓝移。PB@Au 4和PB@Au 5没有明显的吸收峰值，因为溶液主要包括HAuCl₄。

在相同的照射条件下，对PB和不同PB@Au的光热转换特性进行表征。结果如图2B所示，随着HAuCl₄的增加，ΔT首先增加，然后减少，表明一定量的金纳米粒子可以发挥协同作用，提高光热效应。在一系列纳米材料中，PB@Au 2具有最佳的光热转换特性。

PB和不同PB@Au的催化特性用照片和紫外可见吸收光谱进行表征（图2C）。在相同的催化条件下，H₂O₂存在时，DAB作为显色底物，H₂SO₄终止后溶液的颜色从棕红色变化到棕黄色，再到浅黄色（4 moL·L⁻¹）。紫外可见吸收光谱（图2C）显示，所有溶液在催化显色后都在460 nm处有最大吸收峰，PB@Au 2的吸光度值是最大的（如图2D所示），这表明它产生的oxDAB最多。由于Au和PB NPs之间表面积增大和协同效应，PB@Au 2的类过氧化物酶活性增强，所以它被选中用于后续的实验。

（3）PB、PB@Au和免疫-PB@Au复合物的表征

1）形态和结构表征

PB@Au具有极好的光热和催化性能，随着PB和Au复合比的变化，纳米复合材料的结构和性能也随之变化。用TEM表征PB和PB@Au纳米复合材料的形态和大小。在图3A中，PB的形态是大约200 nm大小的圆角纳米长方体。图3B显示，PB@Au纳米复合材料已成功制备，PB表面均匀负载上直径约15 nm的球形Au NPs。

用紫外可见吸收光谱、Zeta电位和动态光散射表征PB@Au和免疫-PB@Au复合物。在图3C中，免疫-PB@Au复合物与PB@Au相比，最大吸收峰红移，是因为PB@Au表面成功捕获抗体。PB、PB@Au和免疫-PB@Au复合物的Zeta电位的绝对值超过30 mV，这表明这些纳米材料具有良好的稳定性，可以在液态溶液中均匀分布（图3D）。PB NPs的平均Zeta电位为-33.4 mV，这表明其表面存在负电荷。PB@Au的zeta电位为-38.3 mV，这是由于负电荷增加，Au NPs表面吸附大量柠檬酸根离子而带负电荷。免疫-PB@Au复合物的Zeta电位绝对值为33.0 mV，低于PB@Au的，因为当体系的pH值低于抗体的等电点时，抗体带正电荷。在图3E中，PB NPs的水动力学尺寸为266.6 nm，为了在PB NPs表面形成 Au NPs而经过长时间高温加热后，PB@Au的大小降至106.7 nm。因成功修饰上抗体，免疫-PB@Au复合物的大小增加到379.8 nm。

用XPS表征PB和PB@Au的元素。与图3F相比，在C、N和Fe元素峰的基础上出现Au的元素峰（图3G）。图3H是Au 4f的XPS窄谱，峰值位置为87.7 eV和84.0 eV分别对应Au 4f_5/2和Au4f_7/2的结合能，这也表明PB@Au上的Au是单体形式，与TEM的结果一致。以上所有结果都证明了PB@Au纳米复合材料制备成功。

2）PB@Au光热和催化性能的表征

光热转换性质：

光热转化效率（η）是直接反映纳米材料光热效应的重要指标。以超纯水为对照，测试PB和PB@Au的光热转换效率。PB和PB@Au的η值计算公式如下：

其中η是PB和PB@Au的光热转换效率：A是照射面积：ΔT_max是PB和PB@Au溶液在最大稳定状态下的温度变化；Qs是相同照射条件下超纯水的最大光吸收相关稳态温度：I是辐照电流：A_λ是808 nm波长处的吸光度值。

PB和PB@Au的吸光度值为3.350和0.610，根据方程计算得（图4A），PB和PB@Au的η值为18.79%和30.77%。PB@Au的η值高于PB，一个原因是Au NPs和PB NPs的协同效应，另一个是PB@Au具有更高的比表面积，因此其光热效应得到增强。

光热稳定性：

光热稳定性在纳米材料的实际应用中起着关键作用。据报道，重复照射引起的熔化效应会改变纳米材料的形态和光热转换性能，不利于实际应用。监测了PB@Au在4个开/关照射周期中的热循环性能，以表征PB@Au的光热稳定性。当PB@Au溶液被照射100 s（808 nm，2 W）时，激光被关闭，然后自然冷却到室温后再次照射。照射过程重复4次。在激光照射过程中，每10 s记录一次PB@Au溶液的温度。从图4B中可以看出，每个周期的最高温度基本相同。

在功率为2 W时照射100 s后，选择紫外可见吸收光谱进一步验证PB@Au的光热稳定性。观察到谱图中仅有微小变化，没有发生峰的移动，证明了PB@Au（图4C）令人满意的光热稳定性。由于PB结构稳定性高，PB@Au具有良好的光热稳定性，允许在光热分析方法中重复使用PB@Au。

浓度与光热效应的关系：

PB@Au分别被稀释为0、1、2、3和4倍。在同样的条件下，稀释比越大，ΔT越小。获得ΔT与PB@Au浓度的关系，R²为0.99827（图4D）。结果表明，PB@Au的浓度是直接影响光热效应的重要因素之一。

酶动力学分析：

酶动力学分析用于监测PB@Au纳米复合材料的类过氧化酶活性。如图5A所示，在PB@Au、H₂O₂和DAB同时存在的情况下，用H₂SO₄终止后，在460 nm处出现最大吸收峰，这是oxDAB的特征吸收峰。PB@Au纳米复合材料的催化特性由460 nm处的吸光度值决定。

100 μL催化反应体系（由DAB、H₂O₂和PBS组成）被添加到20 μL的PB@Au纳米复合材料中，然后在37℃下孵育。分析PB@Au纳米复合材料的类过氧化酶活性，设置PBS的pH从6.0到7.4，H₂O₂的体积（30%）从1.0到3.0 μL，反应时间从5到25分钟。在图5B-D中，最佳催化条件如下：pH 6.5，2.5 μL H₂O₂（30%）反应时间为10分钟。在最佳条件下，通过改变催化系统中的DAB（图5E），实现稳态动力学分析。结果表明，由PB@Au纳米复合材料催化的反应遵循了典型的Michaelis-Menten机制（图5F）。最大初始速度（V_max）和米氏常数（K_m）是以吸光度值的倒数为纵坐标计算的，分别为5.09 ×10^-6 M·s⁻¹和6.821 mM。

（4）光热效应条件的优化

PB@Au的光热效应主要受照射时间、激光功率的影响。

EP管中的PB@Au（200 μL）用激光（808 nm，2 W）照射不同时间（1-300 s）。用热像仪记录PB@Au产生的ΔT。结果表明，ΔT在100 s之前明显增加，之后就趋于稳定（图6A）。因此，选择100 s作为最佳照射时间，可以满足快速检测的要求。

EP管中的PB@Au（200 μL）用不同功率（1.0-3.0 W）的激光（808 nm）照射100 s。根据图6B，ΔT在2 W之前有规律地增加，但随后增长缓慢。因此，2 W被设置为最佳激光功率。

（5）免疫渗滤试纸条构建条件的优化

1）NCM上封闭BSA溶液浓度优化

非特异性吸附引起的背景噪声会在光热检测和催化显色检测中被放大。在包被上抗体后，用不同浓度的BSA溶液（0、1%、2%、4%和8% w/v）封闭NCM上未结合抗体的位点。然后，封闭后的NCM与BSA封闭的免疫PB@Au复合材料（8%）孵育。结果在图7A中显示，在添加4% BSA时，抗体包被区的颜色不可见，同时NCM的ΔT最低。因此，4% BSA是封闭NCM的最佳浓度。

2）免疫-PB@Au复合物的BSA封闭溶液优化

提前用BSA溶液（4%）封闭NCM。准备不同浓度的BSA溶液（分别为0、1%、2%、4%和8%w/v）封闭免疫PB@Au复合材料结合抗体后的剩余位点。结果在图7B中显示，当加了8%的BSA溶液时，抗体包被区无颜色，此时的ΔT是所有这些浓度中最低的。因此，8%的BSA被选为封闭免疫PB@Au复合材料上剩余活性位点的最佳浓度。

3）优化免疫-PB@Au复合材料构建的pH值

通过疏水相互作用和静电吸附将PB@Au与抗体结合成功制备免疫-PB@Au复合物。结合pH条件不仅影响抗体和PB@Au之间的相互作用，而且影响免疫-PB@Au复合物的稳定性。HCl（0.01 M）或NaOH（0.01 M）添加到PB@Au中，调节pH值从5.0到7.0。结果如图7C所示，随着pH值从5.0增加到6.0，NCM抗体包被区形成的颜色逐渐变深。抗体包被区形成的颜色在6.5时变得不明显，因为在中性或弱碱性溶液中，PB的稳定性较差。同样，6.0的ΔT在所有pH值中是最高的。因此，免疫PB@Au复合材料的最佳构建pH值为6.0。

4）优化固定在PB@Au上的抗体数量

抗体的数量影响了免疫-PB@Au复合物的性能。准备了不同浓度的抗体溶液（0、1、2、3、4、6、8 μL、0.2 mg·mL⁻¹）。结果如图7D显示，随着抗体数量的增加，NCM上抗体包被区形成的颜色逐渐明显。当抗体体积为6 μL时，NCM上抗体包被区形成的颜色清晰且较深。ΔT随抗体数量增加而上升的趋势与视觉检测的一致。考虑到实验成本，我们选择了6 μL作为在PB@Au上结合的抗体量。

（6）性能分析

1）灵敏度评估

在最佳条件下探索了所建立方法的灵敏度，通过检测经过标准平板计数法验证数量的鼠伤寒沙门氏菌来获得检测限。在图8A中，直接视觉检测的检测限为10² CFU·mL⁻¹，低于该浓度时不可见。

利用PB@Au的光热效应，定量检测一系列浓度的鼠伤寒沙门氏菌（10⁰-10⁷ CFU·mL⁻¹）。在图8B中，ΔT和鼠伤寒沙门氏菌数量之间的关系呈现一个S形曲线。此外，在10¹-10⁵CFU·mL⁻¹之间存在良好的线性关系，R²为0.9719，线性方程为y=1.4833x+0.6833。根据标准曲线计算得，鼠伤寒沙门氏菌光热检测的检测限为10¹ CFU·mL⁻¹。

PB@Au具有显著的类过氧化酶活性，可在H₂O₂存在的情况下催化DAB产生棕黄色oxDAB。催化显色后，当鼠伤寒沙门氏菌数量为10¹ CFU·mL⁻¹时出现颜色（图8A）；因此，与直接视觉检测相比，灵敏度成功得到了提高。蓝绿色PB@Au和棕黄色oxDAB的颜色叠加可以形成多重颜色。随着细菌数量的增加，NCM上截留了更多的PB@Au，导致颜色梯度从浅红色到棕红色，然后到蓝灰色。在10⁵ CFU·mL⁻¹以下，免疫渗滤试纸条呈现红色系，在10⁵ CFU·mL⁻¹以上则变成蓝色系，而10⁵ CFU·mL⁻¹恰好是鼠伤寒沙门氏菌引起的食源性疾病的感染剂量。因此，它为预防和控制鼠伤寒沙门氏菌污染提供了基础。通过光热检测和催化显色检测相互验证结果的准确性，实现该检测方法的实际应用。

2）特异性评估

单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7和肠炎沙门氏菌是食品中的三种常见病原体，被选为非靶标菌（10⁷ CFU·mL⁻¹），以超纯水为空白对照，鼠伤寒沙门氏菌为靶标菌（10⁶CFU·mL⁻¹）。从图8C中的照片中可以看出，只有添加鼠伤寒沙门氏菌的免疫渗滤试纸条有蓝色，空白对照也没有颜色。添加鼠伤寒沙门氏菌的试纸条的ΔT高于其他添加非靶标菌的，这强烈地显示了方法的特异性。

3）重复性和稳定性评估

可接受的重复性对于试纸条的应用至关重要。通过使用相同和不同批次的试纸条对鼠伤寒沙门氏菌（10⁴ CFU·mL⁻¹）进行测试，分析组内和组间变异性，组内和组间变异系数分别为2.9%和4.4%，表明该方法的重复性符合快速检测方法的要求。

储存稳定性主要取决于NCM上的鼠伤寒沙门氏菌抗体的活性。包被抗体并用BSA封闭的试纸条在37℃恒温恒湿培养箱放置3天，然后取出用于检测鼠伤寒沙门氏菌（10⁷CFU·mL⁻¹）。与原始试纸条相比，储存3天的试纸条的ΔT降低幅度很小，仅为8.65%，这表明抗体基本上保持原始活性，说明试纸条可以在4℃稳定地储存至少6个月。上述结果表明，包被在NCM上的抗体在长期储存中仍具有良好的生物活性和稳定性。

4）实际应用评估和其他免疫评估的比较

选取3种易被鼠伤寒沙门氏菌污染的食品，自来水、牛奶和酱油，以评估所建方法的可行性和实际应用性。所有样品经过灭菌（121℃，20分钟）灭活其他干扰细菌。围绕鼠伤寒沙门氏菌感染剂量设定3个添加浓度，分别是10³，10⁵和10⁷ CFU·mL⁻¹。图8D的结果显示，可接受的回收率从83.59%到109.60%不等。牛奶和酱油样品对应的回收率高于自来水的回收率，这是由于样品中蛋白质、脂肪和其他分子干扰检测信号造成的。结果表明，该方法可成功应用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。

在表1中，我们比较了基于不同纳米材料的免疫检测方法的七个方面，包括纳米材料、检测时间、基质、线性范围、检测限、多模式检测和仪器。本项目建立的方法相对简单快捷，灵敏度好，不需要大型仪器。此外，所建立的方法采用直接视觉检测、光热检测和催化显色检测，以提高检测结果的准确性。通过PB@Au与oxDAB的颜色叠加形成多重颜色，提高了检测灵敏度和准确性。虽然在这些方法中，检测限不是最低的，但它可以满足鼠伤寒沙门氏菌感染剂量的检测要求（10⁵ CFU·mL^-1）。最后，该方法成功应用到实际样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。

表1. 基于不同纳米材料的检测鼠伤寒沙门氏菌的免疫检测方法的分析性能比较

纳米材料

检测时间

基质

线性范围 (CFU·mL-1)

检测限(CFU·mL-1)

多模式检测

仪器

金纳米粒子

3小时

磷酸盐缓冲液和牛奶

103-108

103

否

酶标仪

磁性纳米粒子

1.5小时

磷酸盐缓冲液和饮用水

300-103

300

否

温度传感器

磁性纳米粒子

1.5小时

纯培养基和鸡肉

101-105

1.6×101

否

智能手机APP

MoS2@Au纳米复合材料

25分钟

磷酸盐缓冲液，自来水，牛奶和葡萄汁

102-107

102

是

热像仪

SiO2@MnO2纳米复合材料

45分钟

纯培养基和牛奶

1.9×101-1.9×105, 2.1×101-2.1×105

19, 21

否

电化学工作站

MoS2

30分钟

磷酸盐缓冲液，自来水和牛奶

102-107

102

是

热像仪

金纳米粒子

10分钟

磷酸盐吐温缓冲液和牛奶

1.25×105-2×106

1.25×105,1.25×106

否

无

PB@Au纳米复合材料

30分钟

磷酸盐缓冲液，自来水，牛奶和酱油

101-105

101

是

热像仪

从上述实施例可以得出，本发明提供了一种基于PB@Au光热效应和催化特性的新型多模式试纸条检测方法，能够灵敏且准确地检测鼠伤寒沙门氏菌。光热检测和催化显色检测的灵敏度（10¹ CFU·mL⁻¹）比直接视觉检测提高一个数量级（10² CFU·mL⁻¹），并且方便的催化颜色叠加检测有助于及时预防和控制鼠伤寒沙门氏菌的爆发。通过直接视觉检测、光热检测和催化显色检测，可以相互验证检测结果的准确性。本发明评估了方法的特异性、可重复性、稳定性和适用性，结果表明，基质对检测效率几乎没有影响。因此，这一方法有潜力通过替换特异性抗体来检测其他病原体。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测病原体的方法，其特征在于：采用试纸条进行检测，检测的方法为：采用直接视觉检测、光热检测、催化显色检测方法进行多模式结合检测；

所述试纸条的制备方法包括：

构建免疫渗滤试纸条；将病原体抗体滴加于NCM上，使NCM成功包被上病原体抗体，得到病原体抗体包被的试纸条；

所述直接视觉检测的方法为：

将免疫-PB@Au复合物与含有病原体的样品混合，放置在37℃下10分钟；然后，在抗体包被区上滴加上述混合物，在37℃孵育10分钟；最后，用超纯水清洗NCM，干燥后观察抗体包被区形成的颜色；

所述光热检测的方法为：

使用激光照射NCM上的免疫-PB@Au复合物，检测温度变化；

所述催化显色检测的方法为：

将2mg DAB溶解在PBS中作为显色底物，使用时添加H₂O₂，形成催化体系；然后，将催化体系滴到每个抗体包被区，在37℃下孵育10分钟；根据PB@Au和oxDAB之间的颜色叠加，直接观察催化显色结果。

2.如权利要求1所述的检测病原体的方法，其特征在于：所述PB@Au纳米复合材料的制备方法为：将PB纳米颗粒溶液与HAuCl₄溶液混合，然后在沸腾条件下添加柠檬酸三钠溶液，在PB纳米颗粒的表面负载由柠檬酸三钠还原氯金酸而形成的Au纳米颗粒。

3.如权利要求2所述的检测病原体的方法，其特征在于：所述PB纳米颗粒溶液的浓度为0.5-1.5mg·mL^-1，所述HAuCl₄溶液的浓度为0.01-0.02％w/v。

4.如权利要求2所述的检测病原体的方法，其特征在于：所述PB纳米颗粒溶液与HAuCl₄溶液的体积比为0.5:4-16。

5.如权利要求2所述的检测病原体的方法，其特征在于：所述PB纳米颗粒溶液与HAuCl₄溶液混合后加热至沸腾3-5分钟再添加柠檬酸三钠；

所述柠檬酸三钠的浓度为0.5-1.5％w/v；柠檬酸三钠与PB纳米颗粒溶液的体积比为500：85-340；

添加柠檬酸三钠后，持续煮沸3-5分钟，然后冷却、离心，即得PB@Au纳米复合材料。

6.如权利要求1所述的检测病原体的方法，其特征在于：直接视觉检测的方法中，免疫-PB@Au复合物与鼠伤寒沙门氏菌以1:1的体积比混合。

7.如权利要求1所述的检测病原体的方法，其特征在于：所述光热检测的方法中，激光的参数为：2W、100s、808nm。

8.如权利要求1所述的检测病原体的方法，其特征在于：所述催化显色检测的方法中，PBS的添加量为3mL，pH为6.5，浓度为0.01moL·L^-1。