CN113670798B - 一种微生物的检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物的检测方法及其应用，所述方法包括以下步骤：将纳米金溶液、NaCl溶液与待测样品进行颜色反应，通过检测反应液的吸光度和色度差来检测微生物活性或对微生物细胞进行计数。本发明方案无需任何纳米金标记过程、稳定性好、成本低，操作简单，不需要专业培训即可完成整个检测过程，响应速度快，整个检测过程在10min内即可完成；且无需使用大型仪器，即可实现信号的获取、处理、计算和结果输出，可用于现场实时检测微生物。

Description

一种微生物的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和快速检测领域，具体涉及一种微生物的检测方法及其应用。

背景技术

细菌感染是指致病菌侵入人体引起的急性全身性感染，可导致肺炎、痢疾、结核病等严重疾病，对人体健康和财产安全造成了严重危害。致病性微生物如大肠杆菌、金黄葡萄球菌和沙门氏菌等是造成人体细菌感染重要原因。早期快速测定微生物是治疗和控制细菌感染的必要前提。

目前，常用的微生物检测方法包括平板计数法、分子生物法和荧光检测法等。平板培养法作为“金标准”已经被广泛用于微生物分析，该方法包括琼脂平板的涂布、培养和菌落计数等步骤，操作十分复杂，通常需要24-72小时才能获得检测结果。分子生物学法利用核酸探针识别作用和聚合酶反应的信号扩增作用进行微生物的检测，虽然具有较高的灵敏度和准确性，然而检测过程十分复杂，需要熟练的专业人员以及实验室环境才能完成检测。荧光染色法通过采用有机或无机的荧光染料对微生物细胞进行荧光染色而实现对微生物检测，对于定性分析，操作较为简单、能快速获取检测结果，然而对于定量检测则需要使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜和流式细胞仪等昂贵的大型仪器，不适于偏远地区和基层单位的广泛推广使用。因此，开发快速、简单、经济的微生物检测方法具有重要意义。

目前微生物纳米金检测技术主要针对菌体细胞、胞内核酸、蛋白分子而进行，存在以下不足之处：(1)以胞内核酸和蛋白为目标分析物进行检测时需要复杂的样品制备过程；(2)需要使用抗体、核酸和酶等对纳米金进行标记，过程繁琐、耗时耗力；(3)纳米金探针保存条件较为苛刻，容易失活、稳定性差。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种微生物检测方法，能够快速准确的检测微生物的活性及浓度，成本低，无须使用大型仪器。

本发明还提出一种具有上述检测方法的应用。

根据本发明的一个方面，提出了一种微生物的检测方法，所述方法包括以下步骤：将纳米金溶液、NaCl溶液与待测样品进行颜色反应，通过检测反应液的吸光度或色度差来检测微生物活性或对微生物细胞进行计数。

在本发明的一些实施方式中，所述待测样品中包括大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌中的一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米金的制备方法包括如下步骤：将氯化金溶液与柠檬酸钠溶液进行反应，即得所述纳米金。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米金的制备包括如下步骤：将氯化金溶液加热至沸腾后迅速加入0.5～3％的柠檬酸钠溶液，再保持沸腾20～40min，直至溶液变成酒红色，即得纳米金溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米金的制备包括如下步骤：将100ml的0.01％氯化金溶液加热至溶液沸腾后迅速加入4mL 1％的柠檬酸钠溶液，再保持沸腾30min，直至溶液变成酒红色。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米金溶液中纳米金的粒径为1～100nm。

在本发明的一些实施方式中，所述待测样品与纳米金溶液的体积比为1～3：1。

在本发明的一些实施方式中，所述待测样品与纳米金溶液的体积比为1：1。

在本发明的一些实施方式中，所述NaCl溶液的浓度为1～3mol/L。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米金溶液的浓度为1～5nmol/L

在本发明的一些实施方式中，所述NaCl溶液与纳米金溶液的体积比为1：(2～10)，优选地，所述NaCl溶液与纳米金溶液的体积比为1：5。

在本发明的一些实施方式中，所述检测反应液的吸光度采用比色法。

在本发明的一些实施方式中，所述检测反应液的色度差采用基于图片灰度值的微生物检测法。

在本发明的一些实施方式中，所述比色法包括以下步骤：将检测反应液进行紫外光谱扫描。

在本发明的一些实施方式中，所述基于图片灰度值的微生物检测法包括以下步骤：根据检测反应液的图片的灰度值，对微生物细胞进行计数。

在本发明的一些实施方式中，所述基于图片灰度值的微生物检测法还包括建立灰度值与微生物浓度对数值之间的线性关系，在微生物浓度7.8×10⁶～5×10⁸CFU/mL范围内有较好的线性关系，线性回归方程为Y＝-3.11X+99.64，R²＝0.984。

根据本发明的第二方面，提出了上述方法的应用，所述应用为在制备微生物检测试剂盒中的应用。

一种微生物检测试剂盒，所述试剂盒包括纳米金溶液与浓度为1～3mol/L的NaCl溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在检测微生物死活状态中的应用。

根据本发明的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案通过将纳米金溶液、NaCl溶液与待测样品中的微生物进行颜色反应，通过检测反应液的吸光度和色度差来检测微生物活性及对微生物细胞进行计数。本发明方案无需任何纳米金标记过程、稳定性好、成本低，操作简单，不需要专业培训即可完成整个检测过程，响应速度快，整个检测过程在10min内即可完成；且无需使用大型仪器，通过常用的智能手机和应用程序即可实现信号的获取、处理、计算和结果输出，可用于现场实时检测微生物。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例2中纳米金分别与活菌、死菌和超纯水反应后的显色结果图；

图2为本发明实施例2中的纳米金分别与活菌、死菌和超纯水的反应后的溶液的紫外可见光光谱图；

图3为本发明实施例2中纳米金分别与不同比例的死/活菌(1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)菌液反应后的吸光值A532与菌活性关系图；

图4为本发明实施例3中的不同体积比的菌液与纳米金反应后的溶液的紫外可见光光谱图，其中1为菌液与纳米金的体积比为1：5时反应后的溶液的紫外可见光光谱图；2为菌液与纳米金的体积比为3：5时反应后的溶液的紫外可见光光谱图；3为菌液与纳米金的体积比为5：5时反应后的溶液的紫外可见光光谱图；4为菌液与纳米金的体积比为7：5时反应后的溶液的紫外可见光光谱图；5为菌液与纳米金的体积比为9：5时反应后的溶液的紫外可见光光谱图；

图5为本发明实施例3中的不同显色时间下菌液与纳米金反应后的溶液的紫外吸收值对比图；

图6为本发明实施例4中的微生物与纳米金反应后的紫外吸光值与微生物浓度关系的回归曲线图；

图7为本发明实施例5中的不同微生物与纳米金反应后的紫外吸收值对比图；

图8为本发明实施例6中的显色图的RGB信号值与微生物浓度关系图；

图9为本发明实施例6中的灰度值与菌浓度对数值的线性回归曲线图；

图10为本发明实施例6中的基于图片灰度值的微生物检测的原理图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

纳米金溶液的制备：100mL0.01％氯化金溶液加入到250mL圆底烧瓶中，升温加热至沸腾后迅速加入4mL 1％的柠檬酸钠溶液，再保持沸腾30min，直至溶液变成酒红色，表明制备的纳米金粒子粒径较好，撤去热源，冷却至室温后，4℃避光保存备用。根据消光系数和测量的吸光值计算得到纳米金溶液的浓度为1.7nmol/L。

实施例1

基于纳米金的微生物检测方法，具体包括以下步骤：

(1)将待测的500μL微生物悬浮液与500μL纳米金快速混合后，加入100μL的浓度为1mol/L的NaCl溶液，室温(18～27℃)显色反应30s，使得显色反应充分进行；

(2)向光程为1cm的微量比色皿加入1mL超纯水，将比色皿放置到UV-2600紫外-可见光分光光度计(岛津企业管理(中国)有限公司，中国)，在分光光度计操作软件UV Probe上选择光谱测量模式，选择波长为400-800nm，进行基线扫描；

(3)将步骤(1)得到的显色后的菌/纳米金混合液转移至光程为1cm的微量比色皿，将比色皿放置到紫外-可见光分光光度计扫描400-800nm处的吸光值。

实施例2

基于纳米金的微生物活性检测，具体包括以下步骤：

(1)菌液的制备：将大肠杆菌以1％接种量接种于100mlLB培养基中，37℃，恒温摇床转数为180rpm的条件下培养16-18h。取出培养菌液，以5000g离心10min，收集沉淀，以超纯水洗涤3遍后，用超纯水将沉淀的微生物细胞重新悬浮。用紫外-可见光分光光度计将菌悬液调至600nm处光密度值(OD600)为1。取50mlOD600值为1的菌悬液置于100℃的水浴锅中加热30min进行灭活，置于室温冷却。制备的菌悬液均置于4℃保存待用。

(2)将大肠杆菌的活菌与灭活后的菌悬液，分别以500μL：500μL体积比加入纳米金溶液混合后，加入100μL浓度为1mol/L的氯化钠溶液，快速混合显色30s，采用UV-2600扫描其在400-800nm处的光谱图(如图2所示)，空白对照组与实验组的区别仅在于将菌悬液替换为超纯水。

(3)将500μL菌悬液(菌悬液中死/活菌比例分别为1:9、3:7、5:5、7:3、9:1)分别与500μL纳米金溶液反应后，混合后，加入100μL浓度为1mol/L的氯化钠溶液，快速混合显色30s，采用UV-2600分别检测不同反应液在532nm的吸光值，绘制吸光值A532与菌活性关系图(如图3所示)。

实验结果如图1-2所示，从图中可以看出，超纯水与纳米金反应后溶液呈显浅灰色，其在532纳米处有弱的吸收峰。大肠杆菌活菌、与灭活后的菌悬液与纳米金探针反应后的溶液均呈红色，灭活后的大肠杆菌在532nm处有强的吸收峰；活菌在532nm吸收减弱，在630nm附近吸收增强。超纯水空白对照没有明显的显色信号，而活菌和灭活的大肠杆菌均有强的显色信号。检测不同活性菌液的结果如图3所示，从图中可以看出，吸光值A532与菌活性关系呈线性相关，采用实施例1的方法对含死/活菌比例分别为4:1和8:5的大肠杆菌的水溶液进行检测，检测结果采用吸光值A532与菌活性关系的线性结果进行计算，其结果表明本申请方案可以准确用于检测微生物的死活状态，从而检测微生物的活性。

实施例3

纳米金比色检测微生物的工作条件优化

为了获得最佳的检测效果，本实施例采用紫外光谱分析法对影响检测性能的菌液/纳米金体积比、NaCl的添加量和显色时间作进一步的优化。

本发明的检测方法利用菌悬液与纳米金进行显色反应，反应过程受菌液/纳米金体积比例的影响。以浓度为1×10⁹CFU/mL的E.coli作为模式致病菌，设置了菌液/纳米金为1：5、3：5、5：5、7：5、9：5共5个体积比例，菌液与纳米金的总体积为1ml，考察体积比对显色反应响应信号的影响。结果如图4所示，从图中可以看出，随着过菌液/纳米金体积比从1：5增加到5：5，显色信号(532nm处吸收值)快速增强。当比例从5：5增加到9：5时，显色信号基本保持不变。可见菌液/纳米金体积比为5：5时，响应信号最大，是最佳的菌液/纳米金体积比。

为评估NaCl浓度对本方法检测效果的影响，取50、75、100、125、150μL的NaCl，分别加入500μL E.coil灭活菌液及500μLAuNPs溶胶，进行显色反应。以紫外可见光分光光度计监测不同不同NaCl体积下响应信号(A532值)的变化情况。结果显示：A532值分别为1.08、1.04、1.01、0.96、0.92，随着NaCl体积的增加而变小；空白对照的A532值在50-100μLNaCl时逐渐降低(0.311、0.278、0.179)，在125-150μLNaCl时逐渐升高(0.184、0.276)。在NaCl体积为100μL时响应信号最高而背景值最低，因此最佳NaCl体积为100μL。

为评估显色反应持续时间对本方法检测效果的影响，以1×10⁹CFU/mL的E.coli作为模式致病菌，菌液/纳米金体积的比例为5：5，显色反应时间分别为30、60、90、120、150、180、210、240、270和300s，评估不同显色时间对响应信号的影响。结果如图5所示，从图中可以看出，从显色时间30s开始，显色即有强的显色信号，并且至少保持300s不变化。

实施例4光谱法的线性范围分析

以1×10⁹CFU/mL的大肠杆菌(E.coli)作为模式致病菌，取7个1.5mL离心管，各加入500μL超纯水，然后在第一个离心管中加入500μL死菌菌液，混合摇匀后取500μL混合液加入第二个离心管中，以此类推，最后一个离心管吸掉500μL混合液，保证整个体系体积各为500μL，使得菌液稀释倍数为2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍。在7个管中各加入500μLAuNPs溶液及100μLNaCl。观察体系颜色变化并取1mL样品加入到比色皿中进行紫外光谱扫描，每个体系样品做3组平行样，取平均值。以测量的532纳米处吸光值为横坐标，菌悬液的百分比活性为纵坐标，绘制曲线图，进行回归分析。

结果如图6所示，从图中可以看出，其回归方程为y＝0.924x+0.274，R²＝0.981，线性检测范围为7.8×10⁶～5×10⁸CFU/mL。

实施例5通用性检测

检验方法的通用性是衡量检测体系性能的重要指标。按照实施例5确定的最优方案，对浓度5×10⁸CFU/mL的购自宁波明舟生物科技有限公司的金黄葡萄球菌(S.aureus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)进行分析，检测方案如实施例4所示。

结果如图7所示，从图中可以看出，金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌均能产生显著的显色信号，说明本发明的纳米金显色方法可以用于不同微生物的检测，具有普遍适用性性。

实施例6基于图片灰度值的微生物检测

(1)将500μL待测的微生物悬浮液与500μL的纳米金快速混合，加入100μL的浓度为1mol/L的NaCl，室温(18～27℃)30-240s，使得显色反应充分进行。

(2)将步骤(1)的纳米金/微生物显色液放置于照相装置中，装置结构为11cm×11cm×15cm(长×宽×高)。在灯箱的上表面有尺寸为1.5cm×1.5cm小孔，用于手机摄像头拍照，拍摄过程打开手机自带LED灯作为光源。

(3)利用智能手机(小米X6)拍摄记录样品图片，照相过程参数如下：自动白平衡，曝光时间1/263，光圈值f/1.75，焦距为4.07mm，未使用闪光灯。对每个样品连续拍摄3次，预处理数据计算3张图片的平均值。

(4)利用手机网络将图片传输至网络存储器，利用存储于网络存储器的算法代码提取图片RGB数值(如图8所示)，根据公式Gray＝R*0.299+G*0.587+B*0.114换算出灰度值，建立灰度值与微生物浓度对数值之间的线性关系。结果如图9所示，在浓度7.8×10⁶～5×10⁸CFU/mL范围内有较好的线性关系，线性回归方程为Y＝-3.11X+99.64，R²＝0.984。该方法线性范围与光谱法一致，能够满足定量检测要求。基于智能手机的微生物检测的原理如图10所示。

测试例

加标样品的分析

在自来水、无菌的矿泉水和湖水中分别加入灭活的E.coli菌液中，使得得到的加标样品OD值分别为0.3、0.5、0.7。检测方法同实施例6一致，每个试样重复检测3次，计算加标回收率。实验结果如表1所示，从表中可以看出，样品回收率在61.8％-93％之间，标准偏差小于2％，说明本方法具有良好的抗干扰能力，可用实际的样品的检测。

表1

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (3)

1.一种微生物的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将纳米金溶液、NaCl溶液与待测样品进行颜色反应，通过检测反应液的吸光度或色度差来检测微生物活性或对微生物进行计数；所述待测样品与纳米金溶液的体积比为1:1；所述NaCl溶液的浓度为1mol/L；所述NaCl溶液与纳米金溶液的体积比为1：5；所述NaCl溶液的体积为100 µL；所述检测反应液的色度差采用基于图片灰度值的微生物检测法；所述基于图片灰度值的微生物检测法包括以下步骤：根据检测反应液的图片的灰度值，对微生物细胞进行计数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测反应液的吸光度采用比色法。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述比色法包括以下步骤：将所述反应液进行紫外光谱扫描。