CN115266693A - 一种纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌o157:h7的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米金银染色‑三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括如下步骤：以三维光子晶体微球为载体，在微球表面修饰核酸适配体用于特异性识别大肠杆菌O157:H7，制备纳米金，将能够特异性识别O157:H7的巯基化核酸适配体固定于纳米金表面，将纳米金探针标记到O157:H7表面，形成复合物，利用银染色法将信号放大。本发明以三维光子晶体微球作为捕获载体，纳米金探针作为示踪物，通过检测平台实现O157:H7的定性和定量分析，并且检测方法具有快速，操作简便，成本低，灵敏度低，特异性高，对O157:H7的线性检测范围宽，成本低，能够满足快速即时检测实际样品中O157:H7的需求。
Description
技术领域
本发明属于分析检测，具体涉及一种纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法。
背景技术
大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7，E.coli O157:H7)是常见的一种食源性病原菌，是肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhage Escherichia coli,EHEC)中最具代表性的血清型，为革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，无芽孢。大肠杆菌O157:H7属于条件致病菌，主要通过粪口传播，接触被污染的水源、食物都可能被感染，被摄入的大肠杆菌O157:H7利用周身的鞭毛粘附在宿主细胞表面，入侵宿主，逃避免疫反应，侵入宿主机体肠腔后，繁殖成微菌落并定植在盲肠、结肠粘膜上并分泌志贺样毒素(SLT)，造成粘附与脱落损伤，其毒性极强且感染剂量极低，最低10个活菌即能导致感染，其潜伏期1-3d，患者常出现肠绞痛、低烧、血便以及呕吐，严重者出现出血性结肠炎(haemorrhagic colitis,HC)，并发溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome,HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura,TTP)等，未及时诊断可能危及生命。
大肠杆菌O157:H7因其感染剂量低、传染途径广、致病性和致死率高，目前己成为全球性的公共卫生问题，因此世界各国对大肠杆菌O157:H7的检测开展了大量的研究，基于传统的生化培养法非常耗时耗力，无法适合现阶段突发性食品安全事件，基于分子生物学检测法的聚合酶链式反应特异性差，无法将活菌和死菌分开，对操作人员要求较高。因此开发一种快速准确、操作简便、成本低的检测方法，对大肠杆菌O157:H7进行即时有效的监测是十分必要的。
在申请人前期研究中心直接利用光子晶体微球结构色结合智能手机实现了对大肠杆菌O17:H7的定量检测，具有快速简便、成本低等优点，但是该方法存在检测限较高、灵敏度一般，均需要提高。
发明内容
发明目的：针对现有常规检测技术存在的问题，本发明提供了一种纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法，本发明利用三维光子晶体微球和纳米金示踪探针两者的结合对于大肠杆菌O157:H7进行检测，有效地解决了对大肠杆菌O157:H7的传统检测方法中操作繁琐，检测效率低，成本高，灵敏度差等问题。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法，包括如下步骤：
(1)将表面含能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体的三维光子晶体微球，利用BSA进行封闭，暴露在大肠杆菌O157:H7菌液环境中进行反应，三维光子晶体微球能够识别并捕获大肠杆菌于其表面；
(2)步骤(1)反应结束后清洗微球去除物理吸附于微球表面的大肠杆菌O157:H7，然后将微球暴露在表面含能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的巯基化核酸适配体的纳米金探针环境中进行反应，反应结束后清洗探针去除物理吸附于微球表面的纳米金探针，通过夹心法将纳米金探针标记到大肠杆菌O157:H7表面，形成“三明治”结构的三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物；
(3)向复合物中加入银染液反应，运用银增强显色将反应信号放大，产生肉眼可见的颜色变化，对银染后的三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物进行图像采集，对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，从而实现可视化检测。
作为优选，所述检测大肠杆菌方法中识别并捕获大肠杆菌O157:H7于三维光子晶体微球表面，以纳米金探针作为示踪物对大肠杆菌O17:H7进行标记，然后利用银增强显色将反应信号放大，产生肉眼可见的颜色变化，从而实现可视化检测。
作为优选，所述检测大肠杆菌方法中通过夹心法将纳米金探针标记到大肠杆菌O157:H7表面，形成“三明治”结构的三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物。
其中，步骤(1)所述三维光子晶体微球为表面进行氨基基团修饰和羧基基团修饰的微球，并通过微球上的活泼酯与适配体形成酰胺键将能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体固定于微球表面。
进一步地，所述能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体Aptamer1的序列(SEQ ID NO.1)：5’-NH2-C6-TGGTCGTGGTGAGGTGCGTGTATGGGTGGTGGATGAGTGTGTGGC-3’。
其中，步骤(2)所述纳米金探针为通过柠檬酸还原法制备的纳米金，并通过金硫键将将能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的巯基化核酸适配体固定于纳米金表面。
进一步地，所述能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的巯基化核酸适配体Aptamer2的序列(SEQ ID NO.2)：
5’-SH-C6-TGGTCGTGGTGAGGTGCGTGTATGGGTGGTGGATGAGTGTGTGGC-3’。
作为优选，步骤(3)中利用使用智能手机和金相显微镜对三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物进行图像采集，利用Image J数字图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，从而实现可视化检测。
本发明所述的三维光子晶体微球结合纳米金银染色检测大肠杆菌方法在在选择性识别、捕获和检测食品中的大肠杆菌O157:H7中的应用。
本发明所述的三维光子晶体微球结合纳米金银染色检测大肠杆菌方法在在选择性识别、捕获和检测环境中的大肠杆菌O157:H7中的应用。
本发明所述的检测方法可以定性和定量检测食品和环境中的大肠杆菌O157:H7系统中的应用。
本发明中提供了用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球和纳米金示踪探针：该光子晶体微球具有大小均一、粒径可控、比表面积大、易于表面修饰，通过化学方式将核酸适配体修饰在微球表面，能够特异性识别并捕获大肠杆菌O157:H7等优点；该纳米金示踪探针具有体积小，识别效率高，成本低，能够特异性识别大肠杆菌O157:H7，通过银增强显色将反应信号放大，产生肉眼可见的颜色变化等优点。两者结合有效地解决了对大肠杆菌O157:H7的传统检测方法中操作繁琐，检测效率低，成本高，灵敏度差等问题。本发明的检测方法是基于光子晶体微球结合纳米金银染色法，利用智能手机在线检测食品中的大肠杆菌O157:H7，该方法可以利用三维光子晶体微球结合纳米金银染色法对大肠杆菌O157:H7进行定性和定量检测，线性范围宽、灵敏度和特异性高，并且能够有效地解决现有常规检测方法操作繁琐且费时费力、仪器昂贵、检测成本高、对操作人员的专业要求高，难以应用于现场检测和大量样品的检测的技术难题。
本发明以前期工作所搭建的智能手机和金相显微镜作为成像和图像采集工具(CN113834808 A)，三维光子晶体微球作为捕获载体，纳米金探针作为示踪物。本发明利用所建立的检测平台能够实现对大肠杆菌O157:H7的定性和定量分析，并且本发明的检测方法具有快速，操作简便，成本低，灵敏度低，特异性高，对大肠杆菌O157:H7的线性检测范围宽，成本低，能够满足快速即时检测实际样品中大肠杆菌O157:H7的需求。
本发明的光子晶体微球是可以偶联大肠杆菌O157:H7特异性适配体的三维光子晶体微球，能够特异性的识别并捕获大肠杆菌O157:H7，纳米金探针是偶联大肠杆菌O157:H7特异性适配体的15nm左右的纳米金，能够特异性的识别大肠杆菌O157:H7，利用银增强显色后，能够使整个体系产生不同的颜色变化，然后通过智能手机和数字图像分析技术对实际样品中的大肠杆菌O157:H7进行定性和定量检测，建立颜色和菌液浓度的线性关系，其中采用平均灰度值作为颜色指标进行定量。本发明的方法原理图如图1所示。
本发明以三维光子晶体微球为载体，在微球表面修饰核酸适配体用于特异性识别大肠杆菌O157:H7，通过夹心法将纳米金探针标记到大肠杆菌O157:H7表面，形成“三明治”结构的三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物，由于捕获有不同浓度大肠杆菌O157:H7，从而标记的纳米金的数量不同，通过银增强显色后,会产生肉眼可见的不同颜色差异，结合智能手机和数字图像分析技术，测定光子晶体微球的平均灰度值，建立平均灰度值和菌液浓度的线性关系，从而实现对大肠杆菌O157:H7进行定性和定量分析。该检测方法具有快速简便、成本低、特异性好、灵敏度高等优点，对大肠杆菌O157:H7的线性检测范围宽为102-108CFU/mL，并且检测限低，灵敏度高，样品量仅需10μL，克服了现有检测技术存在的缺点，能够满足快速即时检测实际样品中大肠杆菌O157:H7的需求。
本发明基于光子晶体微球结合纳米金银染色在线检测大肠杆菌O157:H7的方法，以三维二氧化硅光子晶体微球为基底，利用共价键结合的方式将经过筛选的特异性氨基化适配体偶联到微球表面，形成具有比表面积大、三维大孔径的结构单元，该微球具有独特的光学结构色、能够特异性地识别并捕获大肠杆菌O157:H7，利用功能化的三维光子晶体微球识别并捕获样品中大肠杆菌O157:H7于表面，通过夹心法将纳米金探针标记到大肠杆菌O157:H7表面，形成“三明治”结构的三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物，由于捕获有不同浓度大肠杆菌O157:H7，从而标记的纳米金的数量不同，通过银增强显色后,会产生肉眼可见的不同颜色差异，结合智能手机和数字图像分析技术，测定光子晶体微球的平均灰度值，建立平均灰度值和菌液浓度的线性关系，从而实现对大肠杆菌O157:H7进行定性和定量分析。该检测分析方法对大肠杆菌O157:H7的线性检测范围为102-108CFU/mL，并且本发明方法结合以下优势：1、智能手机具有便携、高清像素、便利的数据存储、可搭载智能化APP等优点。2、光子晶体微球具有比表面积大、独特的光学结构色、体积小、成本低，增加富集效率等优点。3、适配体具有易储存、稳定和成本低的优点。4、纳米金探针具有稳定、特异性好、识别富集效率高，结合银增强显色效果肉眼可见，能够有效地提高检测的灵敏度等优点。5、采用平均灰度值对颜色变量数值化，能够避免人肉眼识别的差异性，实现准确定量，避免以RGB等其他颜色空间的多变量干扰。6、检测样品量仅需10μL，试剂成本低。检测时间仅需要80min，简便快速。7、检测方法和设备操作简便，不需要专业人员操作。因此，有效克服了现有检测技术存在的缺点，具有快速、设备成本低等优势。
设计原理：本发明的适配体修饰微球可以特异性识别并捕获细菌，纳米金探针能够通过夹心法标记到细菌表面，形成“三明治”结构的三维光子晶体微球-Aptamer1-细菌-Aptamer2-AuNPs复合物，通过银增强显色后，会产生肉眼可见的不同颜色差异，结合智能手机和数字图像分析技术对细菌进行定性和定量分析。整个过程简单，快速，特异性好，检测灵敏度高，一次完成样品的前处理和检测。传统的检测细菌方法需要复杂的样品前处理，细菌培养2-3天时间，生化鉴定等过程复杂，PCR方法也需要细菌的DNA提取、扩增、电泳等繁琐程序。
本发明的光子晶体微球表面具有大的比表面积，可以固定较多的探针分子，从而提高细菌的富集，微球表面结构均一，稳定性好，制备成本低(从图3光子晶体微球扫描电镜图的表征可以看出本发明中的光子晶体微球内部结构排列有序，比表面积大，因此可以固定更多的探针分子，增加富集捕获效率)。
本发明利用智能手机+金相显微镜作为图像采集工具，利用基于数字图像分析技术的Image J图像处理软件作为本发明的图像分析工具，相比于数码相机、扫描仪、Web摄像头、手机、平板电脑等，具有高清像素、便利的数据存储、成本低、可搭载智能化APP等优点，功能强大且性价比高。
本发明采用平均灰度值对捕获有不同大肠杆菌O157:H7的光子晶体，利用夹心法标记纳米金探针到大肠杆菌O157:H7的表面，形成“三明治”结构的三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物，通过银增强显色后,会产生肉眼可见的不同颜色差异，结合智能手机和数字图像分析技术对大肠杆菌O157:H7进行定性和定量分析。
本发明采用的三维光子晶体微球的尺寸为200μm左右，成本大约0.1元，相比于免疫试纸条、基因芯片、ELISA等传统检测载体，具有比表面积大，有更多的结合位点，从而在检测过程中大大增加富集效率，比如本发明所需检测时间仅需80min，本发明由于实验步骤增加了，时间就增加了，但是信号值提高了，灵敏度显著提高了。
本发明选择平均灰度值(Mean gray value)作为颜色定量的依据，相比于使用RGB值建立关系模型时，有R、G、B三个变量，使用灰度值建立关系模型时，变量只有一个，那就是图像的亮度，亮度是影响灰度图的唯一因素，亮度越高，灰度越浅，越接近于白色；亮度越低，灰度越深，越接近于黑色。本发明利用Image J图像处理软件直接对图像进行计算，平均灰度值为该区域灰度值总和/该区域面积。本发明采用金银染色，以三维光子晶体微球为载体，在微球表面修饰核酸适配体用于特异性识别大肠杆菌O157:H7，利用柠檬酸还原法制备15nm左右的纳米金，通过金硫键将能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的巯基化核酸适配体固定于纳米金表面形成纳米金探针，利用夹心法将纳米金探针标记到大肠杆菌O157:H7表面，形成“三明治”结构的三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物，该复合物有效提高检测信号，从而提高检测灵敏度，由于捕获有不同浓度大肠杆菌O157:H7，从而标记的纳米金的数量不同，通过银增强显色后，产生肉眼可见的颜色变化，利用使用智能手机和金相显微镜对捕获大肠杆菌O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，利用Image J数字图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，从而实现可视化检测，本发明通过标记纳米金探针，然后通过银染步骤将检测信号放大，使得本发明灵敏度更高，灰度值变化更加明显，响应信号更宽，本发明线性范围为102-108CFU/mL。本发明还具有以下优势：1、采用智能手机作为成像工具，具有便携、高清像素、便利的数据存储等优点。2、利用光子晶体微球作为液相芯片载体，具有比表面积大、易于表面修饰等优点，能够增加富集检测效率。3、本法采用自制的纳米金探针标记，具有制备简单，适配体不需要特殊的荧光标记分子，避免荧光本身存在的猝灭和不稳定缺陷造成的实验误差，降低实验成本。4、采用灰度值对颜色变量数值化，避免以RGB等颜色空间的多变量干扰。5、结合免疫金银染法具有检测时间短，线性范围宽、灵敏度和特异性高的优点。能够有效地解决现有常规检测方法操作繁琐、费时费力、仪器昂贵和对操作人员的专业要求高等缺点，难以应用于现场检测和大量样品的检测的技术难题。
有益效果：与现有常规检测技术相比，本发明具有如下优点：
(1)制备的三维光子晶体微球，具有体积小、比表面积大、大小结构均一、易于表面修饰等优点，大大增加检测富集效率，降低试剂用量成本。
(2)本发明构建的适配体-NanoAu具有易储存、稳定、特异性高和成本低的优点，还可以通过改变适配体序列检测其他食源性致病菌。
(3)制备的纳米金探针，具有特异性好，体积小，富集检测效率高等优点，能够催化银染液中的单质银在纳米金周围形成银层，使得银层呈几何倍增大，使得整个体系达到肉眼可见的变化，大大增加了检测灵敏度。
(4)采用平均灰度值对颜色变量数值化，避免以RGB等颜色空间的多变量干扰。
(5)本发明的检测方法简便快速，成本低，特异性好，灵敏度高，对大肠杆菌O157:H7的线性检测范围宽，为102-108CFU/mL，检测样品量仅需10μL，检测成本低，无需专业人员操作，克服了现有检测技术存在的缺点，满足快速即时检测实际样品中大肠杆菌O157:H7的需求，有效提高了检测的灵敏度，降低了检测限。
附图说明
图1为本发明基于光子晶体微球结合纳米金银染色在线检测食品中的大肠杆菌O157:H7的检测示意图；
图2为实验室自制的三维光子晶体微球组装平台，其中1为甲基硅油，2为单分散二氧化硅乳液；
图3为三维光子晶体微球的在扫描电镜不同放大倍数下的微观结构图；
图4为三维光子晶体微球捕获108CFU/mL大肠杆菌O157:H7后，形成的“三明治”结构的三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物的扫描电镜图；
图5为纳米金及纳米金探针的透射电镜图，其中a-d为柠檬酸还原法制备的15nm的纳米金的透射电镜图，e-h为纳米金修饰巯基化适配体形成纳米金探针后的透射电镜图；
图6为封闭BSA和不封闭BSA的对比图；
图7为Aptamer2的浓度优化图；
图8为纳米金探针识别捕获大肠杆菌O157:H7的时间优化图；
图9为纳米金探针识别捕获大肠杆菌O157:H7的温度优化图；
图10为银增强显色时银染液的时间优化图；
图11为非特异性吸附验证试验；
图12为大肠杆菌O157:H7菌液浓度与平均灰度值的关系；
图13为大肠杆菌O157:H7的检测标准曲线图；
图14为本方法的特异性分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行说明。
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实验用菌株
大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)，CICC 21530，中国工业微生物菌种保藏中心。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，CCTCC AB 91093，中国典型培养物保藏中心。
普通大肠杆菌(Escherichia coli)和荧光假单胞菌(Pseudomonas)均有南京师范大学提供。
大肠杆菌O157:H7适配体：通过由上海生工生物工程有限公司Sangon BiotechCo，Ltd(Shanghai)合成，核酸适配体的一端功能化修饰氨基和巯基，序列如下：
Aptamer1：5’-NH2-C6-TGGTCGTGGTGAGGTGCGTGTATGGGTGGTGGATGAGTGTGTGGC-3’。
Aptamer2：5’-SH-C6-TGGTCGTGGTGAGGTGCGTGTATGGGTGGTGGATGAGTGTGTGGC-3’。
PBS缓冲液：称取KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O 1.44g，NaCl 8g，KCl 0.2g，加入800mL双蒸水充分混匀并调节pH至7.4，定容至1000mL，灭菌后待使用。
PB缓冲液(0.2mol/L，pH7.4)：称取Na2HPO4 7.16g，NaH2PO4·2H2O 3.12g，分别溶于100mL超纯水中配成0.2mol/L Na2HPO4溶液和0.2mol/L NaH2PO4溶液。取19mL0.2mol/LNa2HPO4溶液和81mL0.2mol/L NaH2PO4溶液，即为0.2mol/L PB缓冲液，灭菌后待使用。
0.02mol/L PB缓冲液(pH7.4)：20mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4。
Tris-HCl缓冲液：称取Tris 121.1g，加入800mL双蒸水充分混匀并用浓盐酸调节pH至7.4，定容至1000mL，灭菌后待使用。
结合缓冲液：称取NaCl5.8 g，KCl 0.37g，MgCl2 0.2g，加至50mL浓度为50mmol/L，pH为7.4的Tris-HCl缓冲液中，加入800mL双蒸水充分混匀并调节pH至7.4，定容至1000mL，灭菌后待使用。
1×TE缓冲液：量取10mL浓度为1mol/L，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液和2mL浓度为0.5mol/L，pH为8.0的EDTA溶液混合，加入800mL纯净水充分混匀并调节pH至7.4，定容至1000mL，灭菌后待使用。
银染液的配制：取0.2mL柠檬酸缓冲液(1.275g柠檬酸和1.175g柠檬酸钠溶于5mL超纯水中)和0.3mL还原剂(0.17g对苯二酚溶于3mL超纯水中)于2mL离心管中，置于37℃避光反应30min，再加入1.2mL超纯水混合均匀。使用前加入0.3mL硝酸银溶液(0.1g硝酸银溶于15mL超纯水中)，以上溶液均为现用现配。
大肠杆菌O157:H7的培养及不同浓度标准菌液的制备：实验之前首先用紫外将超净工作台消毒灭菌20min，以便后续的无菌操作环境。利用接种环蘸取一点保存于甘油中并冻存在-80℃的大肠杆菌O157:H7的菌种(CICC 21530)的原液，在经过高温高压灭菌的TSA固体培养基平板上进行平板划线活化，置于37℃培养箱，在有氧条件下倒置培养24h待其长出菌落，在无菌环境中用牙签挑取单菌落于3mL液体TSB培养基放置37℃摇床中震荡培养18h(180rpm)进行一次增菌，再吸取1mL菌液转接于100mL TSB培养基中在37℃摇床中震荡培养18h(180rpm)进行二次增菌，得到的菌液浓度为109CFU/mL，该浓度由平板菌落计数法所得。将二次增菌得到的菌液，用PBS缓冲液离心清洗3-4遍，除去TSB培养基，并用PBS溶液悬浮，得到大肠杆菌O157:H7的109CFU/mL的菌液，检测之前用结合缓冲液离心清洗3遍，并用结合缓冲溶液重悬。向预先灭菌的离心管装入结合缓冲液，对原始浓度为109CFU/mL的菌液进行依次梯度稀释，得到浓度为109CFU/mL、108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、10CFU/mL的菌液，于4℃保存备用。
实施例1
(1)制备光子晶体微球
根据改进的
法制备了单分散二氧化硅纳米颗粒乳液(改进的配方见表1)(按文献Werner
Arthur Fink,Ernst Bohn.Controlled growth of monodispersesilica spheres in the micron size range.Journal of Colloid and InterfaceScience，1968：P 62-69)。将得到的乳液通过微流控自组装平台(原理图见图2)，采用“油包水”的原理制备蛋白石光子晶体微球(微流控自组装平台和蛋白石光子晶体微球制备按文献：Journal of Chromatography A.2020,1626,461379)，本发明制备光子晶体微球所需微流注射泵的参数为：油相(甲基硅油)8mL/h，乳相5mL/h。；所得微球在60℃烘箱中加热48h进行自组装并初步固化；先后用正己烷和乙醇洗涤微球，直至液体中无油状物，常温下晾干；最后将微球放于瓷坩埚中，于700℃条件下烧制3h，即获得所需要的三维光子晶体微球载体材料(粒径200μm左右)。
表1
(2)光子晶体微球表面的修饰(流程图见图1)
微球表面羟基化：配制食人鱼试剂(质量分数98％浓硫酸/质量分数30％双氧水＝7/3(V/V))进行微球的羟基化修饰(10uL/球)：将冷却后的食人鱼试剂倒入装光子晶体微球的离心管中，用封口膜将离心管封口，于脱色摇床上室温震荡反应6h(140rpm)。反应结束后使用蒸馏水反复清洗3-4遍，将多余的蒸馏水吸去，放于100℃烘箱烘3h或者至于60℃烘箱过夜，将微球表面水分烘干后，收集羟基化的微球备用。
微球表面氨基的修饰：将已修饰好羟基的100颗大小均一、结构完整的光子晶体微球于离心管中，按10μL/球加入配制的质量分数2％APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)的甲苯溶液，用封口膜密封置于60℃摇床中，以180rp/min震荡反应6h。反应结束后沉淀数分钟，吸去多余的APTES甲苯溶液，依次用甲苯、无水乙醇、双蒸水清洗3-4遍，置于60℃烘箱中烘干水分，得到表面氨基化的微球。
微球表面羧基的修饰：已修饰好氨基的100颗大小均一、结构完整的光子晶体微球于离心管中，按10μL/球加入配制的琥珀酸溶液(100mg琥珀酸溶于4.7mLDMSO和300μL0.1mol/L碳酸氢钠，现配现用，进行羧基修饰，10μL/球)，用封口膜密封置于脱色摇床中，以180rp/min常温震荡反应2h。反应结束后沉淀数分钟，吸去多余的琥珀酸溶液，依次用DMSO(二甲基亚砜)和双蒸水清洗3-4遍，置于60℃烘箱中烘干水分，得到表面羧基化的微球，室温下干燥保存备用。
(3)制备大肠杆菌O157:H7核酸适配体修饰的三维光子晶体微球
将羧基化的微球置于含有氨基化适配体(Aptamer1)溶液(600nmol/L)的离心管中(5μL/球)，同时加入NHS(终浓度10mg/mL)和EDC(终浓度15mg/mL)以活化羧基，4℃条件下于摇床中反应过夜(180rpm)，形成以微球为载体的捕获探针，吸去多余的适配体溶液，反应结束后依次用结合缓冲液和PBS淸洗微球2-3遍，吸去多余的缓冲液，得到带有大肠杆菌O157:H7核酸适配体的光子晶体微球。以3μL/球的量，加入1％BSA于37℃反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍。
实施例2
(1)制备纳米金：首先将制备纳米金所需要的玻璃器皿用大量自来水冲洗，烘干后用王水(体积比为3:1的37％浓盐酸和98％浓硝酸)浸泡3h，蒸馏水洗涤3次，再用超纯水洗涤3次，放入烘箱烘干待用，然后将50mL 0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾后，一次加入2mL1％的柠檬酸三钠溶液，继续加热至溶液颜色变为紫红色，最后变为透亮的酒红色时，停止加热。冷却至室温后将所得纳米金溶液转入棕色容量瓶中，加入超纯水定容至50mL，4℃避光保存。利用透射电镜进行表征：如图5(a)、(b)、(c)、(d)为透射电镜不同放大倍数下，制备的纳米金，从图中可以明显看出，制备的纳米金粒径大小均一、大多数为圆形，表明纳米金已成功制备。
(2)纳米金-巯基适配体探针的制备：用移液枪吸取上述步骤(1)制备的纳米金溶液1mL于1.5mL的离心管中，于4℃12000r/min离心30分钟，去除500μL上清液，加入适配体Aptamer2，使其终浓度为2μmol/L，在体系中加入0.1mol/L的PB缓冲液(pH7.4)，使缓冲液的终浓度达到0.01mol/L，将混合溶液在37℃下孵育12h。加入5μL 1％十二烷基磺酸钠(1％SDS)，然后梯度缓慢加入1mol/L的NaCl溶液，使其终浓度达到0.3mol/L，于37℃振荡孵育24h后，以12000r/min离心25min，去除上清液后，向离心后的红色沉淀中加入适量的含0.1mol/L NaCl的0.01mol/L PB(pH7.4)缓冲液，再次以相同条件离心，离心结束后去除上清液，加入含0.1mol/L NaCl的0.01mol/L PB(pH7.4)缓冲液进行重悬，得到巯基化适配体2-纳米金复合溶液，即为纳米金探针，于4℃避光保存。利用透射电镜进行表征：如图5(e)、(f)、(g)、(h)为透射电镜不同放大倍数下，制备的纳米金探针，从图中可以明显看出，制备的纳米金粒径大小均一、单分散性好，纳米金表面有一层明显的疏水圈，表明纳米金探针已成功制备。
实施例3
基于实施例1中制备的光子晶体微球和实施例2中制备的纳米金探针建立样品中大肠杆菌O157:H7的检测方法。
涉及大肠杆菌O157:H7的实验均在超净工作台中进行无菌操作，实验中产生的废弃物需先进行高温高压灭菌处理，再进行分类回收。
一、实验条件的优化
1、封闭和不封闭BSA的优化对比：为了避免光子晶体微球表面会物理吸附大肠杆菌O157:H7或纳米金探针，造成检测信号不准确，因此对封闭和不封闭BSA进行对比优化。将实施例1中步骤(3)中600nM Aptamer1(5μL/球)与微球于4℃条件下反应过夜，用结合缓冲液清洗微球2-3遍。将球分为两组，一组以3μL/球封闭1％BSA，一组不封闭BSA于37℃反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍。将上述两组微球分别与0、102、104、106、108CFU/mL大肠杆菌O157:H7(10μL/球)反应，于37℃条件下反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，以除去未结合的大肠杆菌O157:H7，以10μL/球的量加入含浓度为2μmol/L Aptamer2的纳米金探针于37℃条件下反应1h，用含0.2mol/L NaCl的0.02mol/L PB清洗微球2-3遍，得到光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-纳米金的三明治结构的复合物，加入10μL/球银染液室温反应2min，用蒸馏水冲洗干净，将复合物置于金相显微镜的载玻片上。使用“智能手机+金相显微镜”图像采集平台，对捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7的复合物进行图像采集，手机采集的图像通过网络传输到电脑上，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，对比每组的平均灰度值的差异，OriginPro8.5.1数据处理软件处理数据。其中通过Image J图像处理软件进行处理，平均灰度值(Mean gray value)＝该区域灰度值的总和(Total gray value)/该区域面积(Area)。其中，“智能手机+金相显微镜”图像采集平台的构建和检测参考中国专利(CN 113834808 A)。
由图6可知，封闭BSA后的灰度差值比不封闭BSA后的灰度差值大，因为不封闭BSA会造成纳米金探针的物理吸附，使得每个梯度之间的差值小，梯度差异不明显，因此选择封闭BSA进行后续实验。
2、Aptamer2的浓度：本发明利用纳米金探针作为建立方法的示踪和信号放大源，因此纳米金探针所含有的Aptamer2的浓度对大肠杆菌O157:H7检测的灵敏度影响较大，根据实施例2方法制备5种浓度(0.25、0.5、1、2、4μmol/L)Aptamer2的纳米金探针溶液。将600nM Aptamer1(5μL/球)与微球(实施例1的步骤3)于4℃条件下反应过夜，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，加入1％BSA于37℃反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍。将上述微球分别与103CFU/mL大肠杆菌O157:H7(10μL/球)反应，于37℃条件下反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，以除去未结合的大肠杆菌O157:H7，以10μL/球的量分别加入制备的5种浓度Aptamer2的纳米金探针于37℃条件下反应1h，用含0.2mol/L NaCl的0.02mol/L的PB清洗微球2-3遍，得到光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-纳米金的三明治结构的复合物，加入10μL/球银染液温室反应2min，用蒸馏水冲洗干净，将光子晶体微球置于金相显微镜的载玻片上。使用“智能手机+金相显微镜”图像采集平台，对捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，手机采集的图像通过网络传输到电脑上，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，OriginPro8.5.1数据处理软件处理数据。
由图7可以看出Aptamer2浓度为2μmol/L时灰度值达到最低，随着浓度增加至4μmol/L时灰度值变化不大，此时Aptamer2浓度为最佳浓度，因此选择用实例2制备的浓度为2μmol/L Aptamer2的纳米金探针进行后续试验。
3、纳米金探针识别捕获大肠杆菌O157:H7的时间优化：为了提高本发明检测大肠杆菌O157:H7的效率，因此对修饰有巯基化适配体的纳米金探针和大肠杆菌O157:H7的识别捕获时间进行优化。将600nM Aptamer1(5μL/球)与微球(实施例1的步骤3)于4℃条件下反应过夜，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，加入1％BSA于37℃反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍。将上述微球分别与108CFU/mL大肠杆菌O157:H7(10μL/球)反应，于37℃条件下反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，以除去未结合的大肠杆菌O157:H7，以10μL/球的量分别加入制备2μmol/L Aptamer2的纳米金探针溶液(实施例2)于37℃条件下反应5、10、20、30、40、50、60min，用0.2mol/L NaCl的0.02mol/L的PB 2-3遍，得到光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-纳米金的三明治结构的复合物，加入10μL/球银染液室温反应2min，用蒸馏水冲洗干净，将光子晶体微球置于金相显微镜的载玻片上。使用“智能手机+金相显微镜”图像采集平台，对捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，手机采集的图像通过网络传输到电脑上，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，OriginPro8.5.1数据处理软件处理数据。
由图8可知，随着纳米金探针和大肠杆菌O157:H7孵育时间的增长，平均灰度值先降低后趋于平衡，当孵育时间处于30-60min之间时，随着时间增长，平均灰度值降低趋势明显，当时间超过30min，孵育时间对平均灰度值的影响逐渐变小，说明纳米金对大肠杆菌O157:H7的识别捕获已经达到饱和状态，考虑到快速检测的需求，降低检测时间，因此选取30min作为纳米金探针和大肠杆菌O157:H7的最佳孵育时间进行之后的实验。
4、纳米金探针与大肠杆菌O157:H7结合温度优化：为了提高本发明检测大肠杆菌O157:H7的效率，因此对修饰有巯基化适配体的纳米金探针和大肠杆菌O157:H7的捕获温度进行优化。将600nM Aptamer1(5μL/球)与微球(实施例1的步骤3)于4℃条件下反应过夜，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，以3μL/球加入1％BSA于37℃反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍。将上述微球分别与103CFU/mL大肠杆菌O157:H7(10μL/球)反应，于37℃条件下反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，以除去未结合的大肠杆菌O157:H7，以10μL/球的量分别加入制备的含2μmol/L Aptamer2的纳米金探针溶液(实施例2)于25℃、37℃、40℃、45℃条件下反应30min，用含0.2mol/L NaCl的0.02mol/L的PB 2-3遍，得到光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-纳米金的三明治结构的复合物，加入10μL/球银染液室温反应2min，用蒸馏水冲洗干净，将光子晶体微球置于金相显微镜的载玻片上。使用“智能手机+金相显微镜”图像采集平台，对捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，OriginPro8.5.1数据处理软件处理数据。
由图9可知，随着纳米金探针和大肠杆菌O157:H7孵育温度的增加，平均灰度值先降低后趋于升高，当孵育温度处于25-40℃之间时，随着时间增长，平均灰度值降低趋势明显，当孵育温度超过40℃，灰度值逐渐升高，说明纳米金探针对大肠杆菌O157:H7的捕获效率逐渐降低，这可能是因为温度在40-45℃时，大肠杆菌O157:H7的活性逐渐降低，与纳米金探针的结合效率降低，因此选取40℃作为氨基化适配体和大肠杆菌O157:H7的最佳孵育温度进行后续的实验。
5、银增强显色时银染液的时间优化(图10)：为了提高本发明检测大肠杆菌O157:H7的效率，因此对修饰有巯基化适配体的纳米金探针和大肠杆菌O157:H7的捕获温度进行优化。将600nM Aptamer1(5μL/球)与微球(实施例1的步骤3)于4℃条件下反应过夜，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，以3μL/球加入1％BSA于37℃反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍。将上述微球分成三组分别与104、105、106CFU/mL大肠杆菌O157:H7(10μL/球)反应，于37℃条件下反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍，以除去未结合的大肠杆菌O157:H7，以10μL/球的量加入制备的含2μmol/L Aptamer2的纳米金探针溶液(实施例2)于40℃条件下反应30min，用含0.2mol/L NaCl的0.02mol/L的PB清洗2-3遍备用，形成“光子晶体微球+大肠杆菌O157:H7+纳米金探针”的复合物。将上述三组复合物，分别分成五组共15组，以10μL/球银染液室温反应，分别银染30、60、120、240、480s，用蒸馏水冲洗干净，将光子晶体微球置于金相显微镜的载玻片上。使用“智能手机+金相显微镜”图像采集平台，对捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，OriginPro8.5.1数据处理软件处理数据。
由图11可知，随着银染时间的增加，两组均未发生明显的平均灰度值的变化，因此可以确定在本研究中只有纳米金探针可以催化银染液变成单质银沉积在其表面，形成几何倍增大银壳，从而达到肉眼可见的效果。同时，本实施例证明即没有菌的条件下，纳米金探针无法吸附到光子晶体微球表面，进而可以推出本方法银染增强效果是在纳米金存在下才能发生，在不加纳米金探针条件下，光子晶体微球捕获大肠杆菌O157:H7以后，无法催化体系中的银离子，进而无法产生肉眼可见的颜色变化。因此可以推出银染增强效果来源于纳米金示踪探针催化导致，而非源于光子晶体微球和菌。
实施例4
检测大肠杆菌O157:H7标准曲线的建立
检测方法：根据上述所有优化的条件，将羧基化的微球(实施例1的步骤3)以10μL/球的量加入NHS(终浓度10mg/mL)和EDC(终浓度15mg/mL)于脱色摇床中以180rpm常温震荡1h，以活化羧基，反应结束后用结合缓冲液冲洗3次，以除去多余的NHS和EDC，然后以5μL/球加入600nM氨基化适配体于4℃摇床中以180rpm反应过夜，形成以微球为载体的捕获探针，反应结束后依次用结合缓冲液清洗微球2-3遍，吸去多余的缓冲液，得到带有大肠杆菌O157:H7核酸适配体的光子晶体微球，以3μL/球加入1％BSA于37℃反应1h，用结合缓冲液清洗微球2-3遍。
将上述偶联捕获探针的微球平均分为10组，以10μL/球分别加入不同浓度的大肠杆菌O157:H7(101-109CFU/mL)，于40℃摇床中以180rpm震荡孵育50min，以结合缓冲液作为空白对照，反应结束后用PBS清洗微球2-3遍，以除去未结合的微生物，检测之前吸掉多余的缓冲液，以10μL/球的量分别加入制备含2μmol/L Aptamer2的纳米金探针(实施例2)于37℃条件下反应30min，用含0.2mol/L NaCl的0.02mol/L的PB清洗2-3遍，得到光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-纳米金的三明治结构的复合物，利用扫描电镜对形成的三明治结构的复合物进行表征，已验证形成了复合物，然后以10μL/球加入银染液反应120s，用蒸馏水冲洗干净，将光子晶体微球置于金相显微镜的载玻片上。使用“智能手机+金相显微镜”图像采集平台，对捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，手机采集的图像通过网络传输到电脑上，利用Image J图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，OriginPro8.5.1数据处理软件处理数据。
如图12所示的大肠杆菌O157:H7菌液浓度与平均灰度值的关系，在大肠杆菌O157:H7浓度为0-2log(CFU/mL)时，平均灰度值几乎没有变化，随着大肠杆菌O157:H7浓度的增加，在大肠杆菌O157:H7浓度为2-9log(CFU/mL)时平均灰度值逐渐下降，即光子晶体微球的颜色变暗，这个范围内，随大肠杆菌O157:H7浓度变化，平均灰度值变化最为敏感。从图13可以看出，大肠杆菌O157:H7的线性检测范围为2-8log(CFU/mL)，线性方程为Y＝-7.25422x+175.33971R2＝0.9917，检测限为1.83log(CFU/mL)，同时从图4扫描电镜图的对比看出，形成了三明治结构的复合物，符合本方法的预期，并证明了本方法的准确性。
特异性分析：其他条件不变，将大肠杆菌O157:H7换成相同浓度(104CFU/mL)的普通大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌按上述步骤进行此方法的特异性研究。结果见图14，从图14可以看出，本发明的检测方法具有良好的特异性。
三、回收率的测定：
模拟污染肉类样品的制备：从超市购买新鲜猪肉肉糜，经过辐照杀菌处理，置于无菌塑料带密封，冻存于-20℃备用。取25g加入225mL PBS缓冲液于拍打式均质机中均质，制成猪肉匀浆，以10000r/min离心3min，除去大颗粒沉淀杂质，取上清液为待检样品。取1mL生理盐水重悬的对数期大肠杆菌O157:H7接种到稀释猪肉样品中，混匀，以制备分别含大肠杆菌O157:H7浓度为0，104，105，106CFU/mL的人工模拟污染猪肉样品。然后置于4℃下放置5min，即为待检样品。
模拟污染牛奶样品的制备：从超市购买新鲜纯牛奶，取10mL在10℃条件下离心10min(8000rpm)以去除脂肪层，得到的溶液用PBS按体积比1:10稀释，得到待加标溶液。取1mL生理盐水重悬的对数期大肠杆菌O157:H7接种到稀释牛奶样品中，混匀，以制备分别含大肠杆菌O157:H7浓度为0，104，105，106CFU/mL的人工模拟污染牛奶样品。将牛奶样品于5000r/min下离心2次，每次10min，沉淀用25mL 1×BB buffer缓冲液重悬，即为待检样品。
模拟污染纯净水样品的制备：从超市购买纯净水，得到待加标溶液，取1mL生理盐水重悬的对数期大肠杆菌O157:H7接种到纯净水中，混匀，以制备分别含大肠杆菌O157:H7浓度为0，104，105，106CFU/mL的人工模拟污染纯净水样品。将纯净水样品于5000r/min下离心2次，每次10min，沉淀用25mL 1×BB buffer缓冲液重悬，即为待检样品。
通过在上述不同的样品中分别添加不同浓度的大肠杆菌O157:H7进行模拟污染，按照上述制作标准曲线时的步骤进行本法的加标回收测定，并计算回收率。回收率＝(样品回收检测值-空白回收检测值)/标准品检测值×100％，计算回收率，结果如表2，待检测的样品回收率在73.44-119.68％之间，证明了该方法的准确性和可靠性。
而采用平板计数法回收率的测定进行对比，样品前处理同上所述，利用平板计数法进行回收率的测定，结果如表3。对通过对比，本发明法检测猪肉和牛奶中的大肠杆菌O157:H7所得回收率与平板计数法相似，本方法具有可靠性。所以，在回收率相似的情况下，第一本发明的方法可靠，第二，检测时间短，传统的平板计数法检测周期较长，大约8h～4d，本发明建立的方法仅需80min，因此传统的平板计数法不能满足临床对感染性疾病早期诊断和及时、有效治疗的需求。操作繁琐且费时费力，对操作人员的专业要求很高，重复性较差、结果误差较大，难以应用于现场检测和大量样品的检测。与CN 113834808 A相比，本方法检测灵敏度更高，在低浓度104、105、106CFU/mL时也有更好的实际样品加标回收率。
表2
表3
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggtcgtggt gaggtgcgtg tatgggtggt ggatgagtgt gtggc 45
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtcgtggt gaggtgcgtg tatgggtggt ggatgagtgt gtggc 45
Claims (10)
1.一种纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将表面含能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体的三维光子晶体微球，进行封闭，暴露在大肠杆菌O157:H7菌液环境中进行反应，三维光子晶体微球能够识别并捕获大肠杆菌于其表面；
(2)步骤(1)反应结束后清洗微球，然后将微球暴露在表面含能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的巯基化核酸适配体的纳米金探针环境中进行反应，反应结束后清洗探针，纳米金探针标记到大肠杆菌O157:H7表面，形成三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物；
(3)向复合物中加入银染液反应，对银染后的三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物进行图像采集，对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，从而实现可视化检测。
2.根据权利要求1所述的一种纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，所述检测大肠杆菌方法中识别并捕获大肠杆菌O157:H7于三维光子晶体微球表面，以纳米金探针作为示踪物对大肠杆菌O17:H7进行标记，然后利用银增强显色将反应信号放大，产生肉眼可见的颜色变化，从而实现可视化检测。
3.根据权利要求1所述的纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，所述检测大肠杆菌方法中通过夹心法将纳米金探针标记到大肠杆菌O157:H7表面，形成“三明治”结构的三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物。
4.根据权利要求1所述的纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，步骤(1)所述三维光子晶体微球为表面进行氨基基团修饰和羧基基团修饰的微球，并通过微球上的活泼酯与适配体形成酰胺键将能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体固定于微球表面。
5.根据权利要求4所述的纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，所述能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体Aptamer1的序列优选为：5’-NH2-C6-TGGTCGTGGTGAGGTGCGTGTATGGGTGGTGGATGAGTGTGTGGC-3’。
6.根据权利要求1所述的纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，步骤(2)所述纳米金探针为通过柠檬酸还原法制备的纳米金，并通过金硫键将将能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的巯基化核酸适配体固定于纳米金表面。
7.根据权利要求6所述的纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，所述能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的巯基化核酸适配体Aptamer2的序列为：
5’-SH-C6-TGGTCGTGGTGAGGTGCGTGTATGGGTGGTGGATGAGTGTGTGGC-3’。
8.根据权利要求1所述的纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，步骤(3)中利用使用智能手机和金相显微镜对三维光子晶体微球-Aptamer1-大肠杆菌O157:H7-Aptamer2-AuNPs复合物进行图像采集，利用Image J数字图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算，从而实现可视化检测。
9.一种权利要求1所述的纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法在选择性识别、捕获和检测食品中的大肠杆菌O157:H7中的应用。
10.一种权利要求1所述的纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌O157:H7的方法在选择性识别、捕获和检测环境中的大肠杆菌O157:H7中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210559617.1A CN115266693A (zh) | 2022-05-20 | 2022-05-20 | 一种纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌o157:h7的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210559617.1A CN115266693A (zh) | 2022-05-20 | 2022-05-20 | 一种纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌o157:h7的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115266693A true CN115266693A (zh) | 2022-11-01 |
Family
ID=83759004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210559617.1A Pending CN115266693A (zh) | 2022-05-20 | 2022-05-20 | 一种纳米金银染色-三维光子晶体微球芯片检测大肠杆菌o157:h7的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115266693A (zh) |
-
2022
- 2022-05-20 CN CN202210559617.1A patent/CN115266693A/zh active Pending
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