CN110018303A - 一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法 - Google Patents

一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，以食源性致病菌为研究对象，建立了一种可特异性识别某种食源性致病菌的定量检测体系。合成构建体系所需的纳米材料：纳米材料包括磁性捕捉探针、MOFs纳米酶、SERS增强剂，构建定量检测体系。按顺序向食源性致病菌悬液中依次加入磁性捕捉探针、特异性适配体和MOFs纳米酶，最后同时添加反应底物和过氧化氢，根据MOFs纳米酶的催化活性与其表面吸附的适配体之间的关系，建立了致病菌含量与催化产物的光学信号之间的定量关系，从而实现对食源性致病菌高灵敏度的特异性检测，本发明构建的特异性定量检测体系可以通过更换适配体的种类可检测不同的食源性致病菌。

Description

一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法
技术领域
本发明属于纳米酶和食源性致病菌检测技术领域，尤其涉及基于MOFs纳米酶的类过氧化物酶活性和表面吸附作用，利用加入适配体特异性识别，通过比色法定性检测食源性致病菌，通过对催化产物的定量检测实现定量检测食源性致病菌的检测方法。
背景技术
食源性致病菌主要有鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7、单増李斯特氏菌和布鲁氏菌等，可通过食用被污染的肉制品、蛋制品、水产制品、乳制品、果蔬和水源等引起恶心、呕吐、腹泻、腹痛、痉挛等消化道症状，严重者甚至死亡。因此，控制和检测食源性致病菌的对保障食品安全，维护人民健康至关重要。
传统食源性致病菌的检测方法主要包括：生物学方法、PCR方法、酶联免疫吸附法三大类。生物学方法通过多次选择性培养、进行耐受性检验、观察其菌落特征等进行鉴定，这种方法具有检测成本低、准确性高等优点，但是其步骤繁琐、耗时长；PCR方法即聚合酶链式反应法，其经过对细菌RNA或DNA的扩增、纯化、测序、匹配四个步骤达到特异性识别某种细菌的目的，该方法准确度高，但前期处理过程复杂、对操作人员要求高、设备昂贵；酶联免疫吸附法将抗原或抗体固定，之后加入待测物，再加入酶标抗原或是抗体、催化底物，利用催化产物的颜色进行检测，虽然该方法检测速度快，但抗体的制备复杂且易失活、结果可靠性低。因此，有必要开发快速、准确、廉价的细菌检测方法。
表面增强拉曼散射(surface enhancement Raman scattering,SERS)属于拉曼散射的发展与延伸，其利用金、银等贵金属纳米颗粒作为SERS基底，通过化学增强和物理增强机理增强待分析物的拉曼信号，可用于检测单分子层甚至亚单分子层的物质。具有操作简便、检测速度快、灵敏度高等优点。目前，SERS已经成功地应用于食品检测、环境分析、生物医学、材料化学等领域。当然，目前也有大量的文献报道了利用SERS检测细菌，其中对多种细菌的定性检测主要是通过与化学计量学结合，而对某种细菌的特异性检测主要是依靠连接了抗体的磁性探针捕捉细菌和修饰了抗体与信号分子的贵金属增强剂作为信号探针。前人报道的SERS方法虽能达到快速检测细菌，但仍存在纳米探针合成复杂费时且重复性低、抗体或生物酶价格昂贵且容易失活、部分细菌信号较弱使得检测限较高等问题。
基于以上问题，我们考虑到相比于抗体，适配体价格低廉、易制备。相比生物酶，从制备角度讲，纳米酶易于制备、成本低、稳定性高。从应用角度讲，纳米酶的大比表面积和丰富的表面化学性质使得其易于化学修饰和连接各种生物分子，并且它的催化活性与其尺寸、形貌、组分、表面修饰密切相关，这些性质使得纳米酶的催化活性易于调控，便于构建生物探针和传感器。于是我们构建了一种依赖于适配体及纳米酶的信号放大体系，并通过对催化底物的定量检测实现特异性定量检测食源性致病菌。该方法所用的纳米材料无需表面修饰、容易合成、重复性高、所用的材料及试剂价格低廉，结合SERS高灵敏度的优点降低了检测限。通过更换适配体便能实现更换检测对象，普适性强。
发明内容
本发明根据现有技术中存在的问题，提出了一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，本方法可特异性定量检测某种食源性致病菌，其成本低、灵敏度高、可靠性强、检测速度快，可用于多种食源性致病菌的分析检测，适用于食品安全、环境检测、血液分析等技术邻域。
本发明所采用的技术方案如下：
一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，以食源性致病菌为研究对象，建立了一种可特异性识别某种食源性致病菌的定量检测体系，
合成构建体系所需的纳米材料：纳米材料包括磁性捕捉探针、MOFs纳米酶、SERS增强剂，所述磁性捕捉探针带有与待测致病菌相反的电荷，可与待测致病菌通过静电吸附结合富集细菌；所述MOFs纳米酶具有类过氧化物酶活性和表面吸附功能，MOFs纳米酶的活性可被表面吸附的适配体抑制，使得适配体的添加量会影响纳米酶的活性；
优化磁性捕捉探针、适配体和MOFs纳米酶添加量；
构建定量检测体系：按顺序向食源性致病菌悬液中依次加入磁性捕捉探针、特异性适配体和MOFs纳米酶，最后同时添加反应底物和过氧化氢，根据MOFs纳米酶的催化活性与其表面吸附的适配体之间的关系，建立了致病菌含量与催化产物的光学信号之间的定量关系，从而实现对食源性致病菌高灵敏度的特异性检测；
进一步，所述特异性检测的方法为：
当催化反应结束后，利用反应底物在类过氧化物酶的催化下产生颜色的变化，再采用分光光度法对细菌进行定量检测；所述反应底物可以选用在类过氧化物酶的催化下可以发生颜色变化的物质，如无色孔雀石绿、无色结晶紫、四甲基联苯胺或邻苯二胺等。
进一步，所述特异性检测的方法为：
当催化反应结束后，再加入SERS增强剂，建立催化产物的SERS信号与目标食源性致病菌的浓度之间的线性关系，实现通过SERS信号对食源性致病菌的定量检测；所述反应底物可以选用在类过氧化物酶的催化下可以发生颜色变化的物质，如无色孔雀石绿或无色结晶紫。
进一步，所述磁性捕捉探针的添加量的优化方法为：
将菌悬液离心去掉上清液，用pH 7-7.2的缓冲液清洗以消除培养基的影响，取1ml菌悬液若干，向菌悬液中分别加入相同浓度不同体积(0，10，20，30，40，50，60，70μl)的捕捉探针，混合后，磁分离取上清液，在600nm测吸光度，当添加某体积量的捕捉探针时，OD600值趋于稳定，则该体积选为最优的捕捉探针加入量。
进一步，所述MOFs纳米酶的添加量的优化方法为：将pH 7-7.2的缓冲液加入一定量的H2O2和反应底物后，加入相同浓度不同体积的纳米酶(0，10，20，30，40，50，60μl)孵化后测SERS信号，用催化底物的特征峰进行定量，选择特征峰对应的SERS强度最高的MOFs纳米酶添加量为最优加入量。
进一步，所述适配体的添加量的优化方法为：在pH 7-7.2缓冲液中，加入一定量的纳米酶和不同体积的适配体(10，30，50，60，70，90，110)孵化，再加入缓冲液、H2O2和反应底物，孵化之后测体系上清液的SERS信号，当适配体的添加量等于或超过某一体积时，反应后体系的SERS信号都较低，且趋于平稳，故选该体积为最优的适配体添加量。
进一步，所述磁性捕捉探针的制备方法：通过一步水热法合成的表面修饰有氨基，带正电荷的磁性纳米探针，可富集革兰氏阴性菌；通过一步水热法合成的表面含有羧基，带负电荷的磁性纳米探针，可富集革兰氏阳性菌。
本发明的有益效果：
本发明所用的磁性捕捉探针从材料制备角度讲，其具有合成方法简单、可重复性强、成本低等优点。从应用角度讲，其普适性强，一种带负(正)电荷的磁性探针可用来富集捕获多种革兰氏阳(阴)性菌，且其性质稳定，便于存放。
本发明所用的MOFs纳米酶，从制备角度讲，其具有合成方法简单、所用试剂廉价、制备时间短等优点。从应用角度讲，其催化能力强、性质稳定、对环境的耐受性强、便于存放和使用。
本发明对所用的SERS增强剂没有特殊要求，不管是简单的还是复杂的SERS增强剂、不管是固态的还是液态的SERS增强剂都可应用于本发明，体现了本发明的强大的兼容性。
本发明结合了纳米酶和SERS这两种信号放大手段，使得该方法可灵敏地检测各种食源性致病菌。
本发明利用适配体进行特异性识别，与抗体识别相比，检测费用更低、检测准确度更高(使用抗体存在由于其失活而导致的假阴性结果)。
本发明与前人的研究相比，构建的检测体系是一种开放式平台，其只需要更换适配体便能达到更换检测对象的目的，具有极高的应用价值。
附图说明
图1所构建体系对细菌的检测流程图；
图2：图2A为不同浓度金黄色葡萄球菌在所构建体系中对应的SERS光谱图，图2B为不同浓度金黄色葡萄球菌在所构建体系中对应的紫外可见吸光度值及实物图，图2C为1618cm-1拉曼位移处建立的标准曲线图，图2D为620nm处的吸光度值建立的标准曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
为了进一步验证本发明提出的特异性定量检测方法可用来对食品中食源性致病进行检测，以鸡肉为研究对象，以金黄色葡萄球菌为检测对象，通过加标回收法进行验证，具体操作步骤如下：
步骤1，合成构建体系所需的纳米材料：
A、磁性捕捉探针的制备：由于金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌，故需合成带负电荷的磁性捕捉探针，具体过程如下：称取3.4gFeCl3·6H2O、6g乙酸钠，加入100ml乙二醇搅拌使其混匀，加入1g柠檬酸三钠二水，超声30分钟使其溶解，之后将混合液导入聚乙烯四氟高压反应釜，在200℃反应10小时，冷却到室温后用乙醇和纯水清洗数次，然后在60℃下真空干燥12小时。
若需合成带正电荷的磁性捕捉探针，则磁性捕捉探针是氨基化的，则可通过以下方法制备：取适量的FeCl3·6H2O、无水醋酸钠和1,6-己二胺加入适量乙二醇中，加热至50℃下搅拌形成均匀的胶体溶液。将反应溶液转移聚四氟乙烯内衬的反应釜中，高温反应数小时。取出后自然冷却至室温，再用乙醇、水洗涤数次。干燥后得到氨基化的磁性纳米颗粒固体粉末储存备用。
B、本事实例中，MOFs纳米酶采用Fe-MIL-88纳米酶，其制备方法如下：取0.115g(0.692mmol)对苯二甲酸和0.187g(0.692mmol)FeCl3·6H2O在30ml二甲基甲酰胺(DMF)中溶解，加入3.45mmol乙酸到该混合溶液中。油浴120℃反应4小时。之后冷却到室温，用水、DMF、乙醇清晰数次，最后分散到15ml水中，最后配成水溶液备用。
C、SERS增强剂采用金纳米棒，其制备方法如下：种子液的合成：10ml(0.1M)的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和250μl(0.01M)氯金酸(HAuCl4)混合后，加入0.6ml(0.01M)冷却的硼氢化钠剧烈搅拌，随着硼氢化钠的加入，溶液的颜色从浅黄色变成浅棕色，随后将该溶液在室温静置2小时，使得种子生长成功。金纳米棒的生长：在50ml(0.1M)的CTAB中加入2ml(0.01M)HAuCl4、0.1ml(0.01M)硝酸银(AgNO3)、0.32ml(0.1M)抗坏血酸、0.8ml(1.0M)盐酸(HCl)以及96μL的种子液，搅拌均匀后，在27℃静置6小时。当溶液的颜色从无色透明变成墨蓝色，证明金纳米棒合成成功。最后，制备成功的金纳米棒在12000rpm离心10分钟，弃去上层清液，再加水摇匀，然后按上述步骤离心清洗3次，最后将金纳米棒分散在5ml的纯水中备用。
同时需要准备金黄色葡萄球菌适配体、反应底物和过氧化氢，在本实施例中，反应底物采用无色孔雀石绿，其本身为白色，被类过氧化物酶催化后则变成的孔雀石绿(MG)，为蓝绿色。
步骤2，优化捕捉探针的添加量、金黄色葡萄球菌适配体的添加量和Fe-MIL-88纳米酶添加量，具体方法如下：
捕捉探针的添加量是通过以下方法优化。通过平板计数得到浓度大概为106cfu/ml的菌悬液，离心去掉上清液，再PBS缓冲液清洗2次，以消除培养基的影响，用PBS配成(106cfu/ml)的菌悬液。取1ml菌悬液，加入相同浓度不同体积(0，10，20，30，40，50，60，70μl)的捕捉探针，混合30秒到1分钟，磁分离取上清液，再加入1ml的PBS缓冲液，在600nm测吸光度，根据上清液的OD值，发现50μl时，OD600值就已经趋于稳定了，故选取50μl为最适的捕捉探针加入量。
金黄色葡萄球菌适配体的添加量是通过以下方法优化，在50μl的pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，加入50μl的纳米酶和不同体积的适配体(10，30，50，60，70，90，110μl)37℃孵化1小时，再加入Tris-HCl缓冲液、H2O2、无色孔雀石绿，37℃孵化1小时，之后测体系上清液的SERS信号。结果表明当适配体的添加量等于或超过90μl时，反应后体系的SERS信号都较低，且趋于平稳，故选90μl适配体添加量。
Fe-MIL-88纳米酶添加量是通过以下方法优化。500μl的pH7.0的Tris-HCl缓冲液加入定量的H2O2、无色孔雀石绿后，加入相同浓度不同体积的纳米酶(0，10，20，30，40，50，60μl)37℃孵化1小时后测SERS信号。结果表明当纳米酶为50μl时，在1168cm-1位移处信号强度最高，故纳米酶的添加量为50μl。
步骤3，构建定量检测体系：
如图1、2，1ml不同梯度金的黄色葡萄球菌悬液加入50μl(10mg/ml)捕捉探针，混合30秒到1分钟，磁分离弃掉上清液，加入90μl的适配体悬液(溶解在pH7.2的PBS缓冲液中，5mM)摇匀后37℃孵化1小时，磁分离取上清液，在加入上清液中加入50μl的纳米酶，37℃孵化1小时，加入500μl的pH7.0的Tris-HCl缓冲液(50mM)，7μl H2O2(100mM)，50μl隐性孔雀石绿(25mM)37℃孵化1小时，测体系的上清液的吸光值，催化前，无色孔雀石绿620nm无吸收峰，催化后620nm有显著的吸收峰，故620nm的吸光度值可作为一种食源性致病菌的定量检测方式，实现目标食源性致病菌含量的检测。
还可以在测体系的上清液中加入SERS增强剂，测体系的上清液的SERS信号，通过建立催化产物的SERS信号与目标食源性致病菌的浓度之间的线性关系，实现通过SERS信号对食源性致病菌的定量检测
以鸡肉为例的实际样品的检测：称取25g新鲜的鸡胸脯肉，在无菌操作台切碎后，装在无菌袋中，两面各用紫外灯照射1小时灭菌，之后加入225ml高压灭菌后的蛋白胨水溶液，均质5min，过滤除去液体表面的泡沫以及大颗粒悬浮物，添加浓度分别为1×102cfu/ml-1×105cfu/ml的金黄色葡萄球菌。捕捉探针富集菌体后通过磁分离用pH7.0的Tris-HCl缓冲液清洗菌体3次，洗去杂质干扰，弃掉上清液，在底部沉淀中加入的适配体悬液，纳米酶，催化底物等，用本发明设计的方法检测食物中的金黄色葡萄球菌，并与所添加的浓度做对比。
表1：实际鸡肉样本中金黄色葡萄球菌的加标回收结果
本发明所提出的一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测方法，在体系构建成功后，因为选择在类过氧化物酶催化下会发生颜色变化的底物，因此可通过肉眼观察颜色进行定性判断是否具有目标食源性致病菌。当待测物中有目标食源性致病菌时，该食源性致病菌会与其适配体结合，使得磁分离后上清液中适配体数量较少，从而导致纳米酶催化活性较高，催化后体系颜色变化大。当待测物中没有目标食源性致病菌时，适配体不会被结合，磁分离后上清液中适配体数量较多，导致纳米酶催化活性较低，催化后体系颜色变化小。
因为zeta电位检测表明革兰氏阳性菌带正电荷，而革兰氏阴性菌带负电荷，故可通过正负电荷吸附的方式使磁性材料富集细菌。该结合方式相比于的抗原抗体的特异性结合，对环境耐受性强、稳定性高、应用范围广、价格低。
综上，本发明提出一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测方法，属于纳米酶和食源性致病菌检测的技术领域，其试验的结果表明本发明提供的方法特异性强、灵敏度高、可靠性强、稳定性强，可作为食品、环境等快速、有效、低成本的检测手段。
以上实施例仅用于说明本发明的设计思想和特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，本发明的保护范围不限于上述实施例。所以，凡依据本发明所揭示的原理、设计思路所作的等同变化或修饰，均在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，其特征在于，以食源性致病菌为研究对象，建立了一种可特异性识别某种食源性致病菌的定量检测体系；
合成构建体系所需的纳米材料：纳米材料包括磁性捕捉探针、MOFs纳米酶、SERS增强剂，所述磁性捕捉探针带有与待测致病菌相反的电荷，可与待测致病菌通过静电吸附结合富集细菌；所述MOFs纳米酶具有类过氧化物酶活性和表面吸附功能，MOFs纳米酶的活性可被表面吸附的适配体抑制，使得适配体的添加量会影响纳米酶的活性；
优化磁性捕捉探针、适配体和MOFs纳米酶的添加量；
构建定量检测体系：按顺序向食源性致病菌悬液中依次加入磁性捕捉探针、特异性适配体和MOFs纳米酶，最后同时添加反应底物和过氧化氢，根据MOFs纳米酶的催化活性与其表面吸附的适配体之间的关系，建立了致病菌含量与催化产物的光学信号之间的定量关系，从而实现对食源性致病菌高灵敏度的特异性检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，其特征在于，所述特异性检测的方法为：当催化反应结束后，利用反应底物在类过氧化物酶的催化下产生颜色的变化，再采用分光光度法对食源性致病菌进行定量检测。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，其特征在于，当催化反应结束后，再加入SERS增强剂，建立催化产物的SERS信号与目标食源性致病菌的浓度之间的线性关系，实现通过SERS信号对食源性致病菌的定量检测。
4.根据权利要求2所述的一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，其特征在于，所述反应底物选用无色孔雀石绿、无色结晶紫、四甲基联苯胺或邻苯二胺。
5.根据权利要求3所述的一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，其特征在于，所述反应底物选用无色孔雀石绿或无色结晶紫。
6.根据权利要求1所述的一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，其特征在于，所述磁性捕捉探针的添加量的优化方法为：
将菌悬液离心去掉上清液，用pH 7-7.2的缓冲液清洗以消除培养基的影响，取1ml菌悬液若干，向菌悬液中分别加入相同浓度不同体积的捕捉探针，混合后，磁分离取上清液，在600nm测吸光度，当添加某体积量的捕捉探针时，若OD600值趋于稳定，则该体积选为最优的捕捉探针加入量。
7.根据权利要求1所述的一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，其特征在于，所述MOFs纳米酶的添加量的优化方法为：将pH 7-7.2的缓冲液加入一定量的H2O2和反应底物后，加入相同浓度不同体积的纳米酶孵化后测SERS信号，用催化底物的特征峰进行定量，选择特征峰对应的SERS强度最高的MOFs纳米酶添加量为最优添加量。
8.根据权利要求1所述的一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，其特征在于，所述适配体的添加量的优化方法为：在pH 7-7.2缓冲液中，加入一定量的纳米酶和不同体积的适配体孵化，再加入缓冲液、H2O2和反应底物，孵化之后测体系上清液的SERS信号，当适配体的添加量等于或超过某一体积时，反应后体系的SERS信号都较低，且趋于平稳，选该体积为最优的适配体添加量。
9.根据权利要求1或6所述的一种基于纳米酶催化的食源性致病菌定量检测体系构造方法，其特征在于，所述磁性捕捉探针的制备方法：通过一步水热法合成的表面修饰有氨基，带正电荷的磁性纳米探针，可富集革兰氏阴性菌；通过一步水热法合成的表面含有羧基，带负电荷的磁性纳米探针，可富集革兰氏阳性菌。
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