CN116908441A - 一种基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents
一种基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116908441A CN116908441A CN202310921712.6A CN202310921712A CN116908441A CN 116908441 A CN116908441 A CN 116908441A CN 202310921712 A CN202310921712 A CN 202310921712A CN 116908441 A CN116908441 A CN 116908441A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- coli
- test strip
- lateral flow
- flow chromatography
- chromatography test
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 70
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 39
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000000956 alloy Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 9
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 7
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims description 6
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 claims description 4
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 3
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 101100406806 Aromatoleum evansii padE gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 241001333951 Escherichia coli O157 Species 0.000 claims 1
- 241001640034 Heteropterys Species 0.000 abstract description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 7
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- RADLTTWFPYPHIV-UHFFFAOYSA-N (2-sulfanylphenyl)boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=CC=C1S RADLTTWFPYPHIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 244000037364 Cinnamomum aromaticum Species 0.000 description 1
- 235000014489 Cinnamomum aromaticum Nutrition 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001646719 Escherichia coli O157:H7 Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.[Cu+2].[O-]S([O-])(=O)=O JZCCFEFSEZPSOG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 244000078673 foodborn pathogen Species 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002707 nanocrystalline material Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于Cu2‑xSe的侧流层析试纸条并用于检测水体中E.coli O157:H7。以Cu2‑xSe纳米晶体作为信号标签，其作为等离子体材料带正电荷，可以与E.coli O157:H7通过静电吸附作用有效结合，并被测试线上的特异性抗体捕获。在测试区滴加TMB和H2O2混合物，TMB被催化氧化成蓝色的oxTMB，产生蓝色条带，实现可视化比色信号。通过手机拍照记录T线的RGB信号，并利用手机的颜色信号转换器软件，绘制细菌浓度与D[B/(R+G+B)]值之间的标准曲线。该方法可实现环境水体中的E.coli O157:H7的现场快速检测，实现了低成本、简单、免标记、快速、便携检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种侧流层析试纸条及其应用，具体是一种基于Cu2-xSe的智能可读免标记侧流层析试纸条及其制备方法，以及该侧流层析试纸条用于检测E. coli O157:H7的方法。
背景技术
大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）O157:H7是一种具有严重公共危害的食源性病原体，发展快速、便携的检测方法来识别病原体尤为重要。传统的细菌诊断方法主要包括菌落培养和基因分型等，耗时长且不适用于便携现场检测E. coli O157:H7。侧流免疫测定法（lateral flow immunoassay，LFIA）是一种便携、廉价、用户友好的生物传感技术，广泛用于病原体的快速检测，通过肉眼粗略读取测定结果实现现场定性检测。目前，智能手机已广泛用于数据记录和信号处理，具有较高的准确性。由于智能手机的普及和使用的灵活性，加上LFIA技术的低成本，基于智能手机结合LFIA技术构建的即时检测（POCT）平台用于实时定量检测E. coli O157:H7极具潜力和应用前景。
LFIA技术采用的主要策略是使用双抗体夹心型免疫分析方法。传统的LFIA通常用金纳米颗粒（AuNP）作为信号载体标记二抗（信标抗体），但灵敏度较低。信标抗体依赖于复杂的制备过程，需要与抗体交联，制备成本高，且易受环境影响不利于保存，无法保证检测信号的稳定性。目前，一些纳米材料能够通过范德华力、静电吸附、疏水和氢键相互作用等方式附着在细菌上，能与细菌有效结合，同时兼具良好的纳米酶催化活性。使用这些无需标记抗体的纳米材料作为信号标签既能识别细菌，又能作为信号来源，避免了复杂的抗体修饰过程，降低制备成本，可有效提高检测的灵敏度和稳定性有望作为性能优异的纳米抗体。
在已经公开的检测E. coli O157:H7的相关专利中CN 114113592 A一种基于巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒的侧流层析试纸及其检测方法，该方法制备了一种巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒，通过共价键捕获细菌，解决了非捕获抗体依赖的LFIA方法中结果重现性低以及检测限较高的问题。然而巯基苯硼酸功能化金纳米颗粒需要严格的储存条件，否则将影响该检测方法的稳定性。
CN 110988349 A一种捕获探针、大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法及其应用。通过制备一种具有光热特性的Fe3O4/CuS纳米颗粒，用于双通道侧流免疫分析法检测E. coli O157:H7，虽然获得了较高的灵敏度，成本较低，但光热检测过程易受环境温度影响。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种基于Cu2-xSe的智能可读免标记侧流层析试纸条及其制备方法，以及该侧流层析试纸条用于检测E. coli O157:H7的方法。本发明制备的Cu2-xSe具有纳米抗体特性，无需标记抗体即可识别细菌，又能作为比色信号来源。将此材料应用于侧流层析试纸技术与智能手机结合有利于现场即时检测E. coli O157:H7。
本发明采用如下技术方案：
一种基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备Cu2-xSe纳米晶体材料；
（2）制备Cu2-xSe-E. coli O157:H7复合物；
（3）制备侧流层析试纸条。
进一步地，步骤（1）所述制备Cu2-xSe纳米晶体材料，具体包括如下步骤：
（1.1）将浓度为30 mmol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和4~5 mL水添加到圆底烧瓶中，在剧烈搅拌下，依次加入浓度为0.2 mol/L的二氧化硒（SeO2）与浓度为0.2 mol/L 的抗坏血酸（AA），反应1~10 min后，再分别添加浓度为0.4 mol/L 的五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）与浓度为0.2 mol/L 的抗坏血酸，然后将所得混合物置于30 ℃下搅拌1~2h，获得墨绿色溶液，其中，CTAB和SeO2的物质的量之比为2.4:1；SeO2和AA的物质的量之比为1:6；CuSO4·5H2O和AA的物质的量之比为1:4；
（1.2）将获得的墨绿色溶液，透析纯化20~24 h，以去除小分子，并通过离心除去大颗粒，得到Cu2-xSe纳米晶体材料，并储存在4 ℃冰箱中待用。
进一步地，步骤（2）所述制备Cu2-xSe-E. coli O157:H7复合物，具体包括如下步骤：
取单菌落加入培养基培养后，取适量培养后菌液，用无菌水洗涤2~3次，细菌沉淀用Tris-HCl缓冲液分散得到大肠杆菌原液，大肠杆菌原液逐级稀释为不同浓度的大肠杆菌标准溶液，吸取Cu2-xSe纳米晶体材料加入不同浓度的大肠杆菌标准溶液，混匀孵育后得到了Cu2-xSe-E. coli O157:H7复合物。
进一步地，步骤（3）所述制备侧流层析试纸条，具体包括如下步骤：
样品垫用处理液处理，在37 ℃下干燥6~12 h；
大肠杆菌O157:H7单抗通过简易划膜器具手动包被在硝酸纤维素膜上，形成测试（T）线，用封闭液封闭，然后在37 ℃下干燥6~12 h，吸收垫无需处理，直接使用；
将样品垫、硝酸纤维素膜（NC）和吸收垫依次粘贴到聚氯乙烯（PVC）底板上，组装成侧流层析试纸条。
本发明的另一目的是：将制备的Cu2-xSe的侧流层析试纸条用于检测饮用水中E. coli O157:H7，检测方法包括如下步骤：
将制得的试纸条浸入Cu2-xSe-E. coli O157:H7复合物样品液中，免疫层析反应，样品液通过毛细管效应驱使样品溶液沿样品垫和NC膜进入吸收垫，待测细菌与NC膜上包被的E. coli O157:H7单抗进行特异性识别，Cu2-xSe聚集于检测线；
将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺 （TMB）和H2O2混合液滴加到测试区催化显色，出现蓝色条带，滴加水以结束催化反应，并通过移动设备拍摄图像进行定性分析；
通过手机APP颜色信号转换器，读取实验图像的RGB值进行分析，通过分别计算取样点的R、G和B的平均值，得到不同细菌浓度下的D[B/(R+G+B)]值，绘制细菌浓度与D[B/(R+G+B)]值之间的标准曲线；
根据标准曲线，测定环境水样中细菌浓度，实现定量检测。
进一步地，检测方法中，TMB和H2O2的体积比为4:6。
本发明方法，首先合成Cu2-xSe纳米晶体作为信号标签，并构建了一种基于Cu2-xSe的免标记侧流层析平台，通过智能可读比色法快速检测E. coli O157:H7。Cu2-xSe具有优异的类过氧化物酶样催化活性，作为等离子体材料带正电荷，可以与E. coli O157:H7通过静电吸附作用有效结合，并被测试（T）线上的特异性抗体捕获。在测试区滴加TMB和H2O2混合物，T线上的Cu2-xSe-E. coli复合物可催化无色的TMB氧化成蓝色的oxTMB，产生蓝色条带，实现信号放大。通过智能手机拍照记录T线的RGB信号，并通过智能手机的颜色信号转换器软件，可以快速进行数据分析，绘制细菌浓度与D[B/(R+G+B)]值之间的标准曲线，实现了简单、免标记、快速、便携检测E. coli O157:H7。
本发明制备的侧流层析试纸条，免去了复杂的抗体标记过程，只用一抗包被在硝酸纤维素膜上，而不是传统的双抗体夹心免疫测定方法，不仅成本更低廉，更易保存，而且简单、快速、便携，易于推广使用。集合Cu2-xSe的纳米抗体特性，本发明具有良好的特异性和稳定性，将侧流层析试纸的比色信号与智能手机结合，为环境监测领域中实现即时检测细菌提供了新思路。
附图说明
图1为实施例制备的侧流免疫层析试纸条检测的灵敏度实验结果图；
其中，图 1 (A) 是不同浓度E. coli O157:H7的Cu2-xSe-LFIA的照片；
图 1 (B)为测试线的D[B/(R+G+B)]值与E. coli O157:H7浓度的关系；
图 1 (C) 为D[B/(R+G+B)]值与E. coli O157:H7浓度的线性关系；
图2为实施例制备的侧流免疫层析试纸条检测的特异性实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例1
一种基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备Cu2-xSe纳米晶体材料：
将1600 μL，浓度为30 mmol/L CTAB和4.8 mL水添加到圆底烧瓶中，在剧烈搅拌下，依次加入100 μL，浓度为0.2 mol/L的SeO2与600 μL，浓度为0.2 mol/L 的AA，反应10min后，再分别添加100 μL，浓度为0.4 mol/L 的CuSO4·5H2O与800 μL，浓度为0.2 mol/L的AA，将所得混合物置于30 ℃下，剧烈搅拌1.5 h，获得墨绿色溶液；
将获得的墨绿色溶液，装入10 KD透析袋纯化24 h，以去除小分子，并在6000 rpm转速下，离心除去大颗粒，得到Cu2-xSe纳米晶体材料，并储存在4 ℃冰箱中待用。
（2）制备Cu2-xSe-E. coli O157:H7复合物：
将购买的菌种通过平板划线法接种在LB琼脂培养基上，在37 ℃下培养16 h，刮取1~3个培养得到的单菌落于10 mL LB肉汤中，在37 ℃下培养16 h；
取适量菌液，在5000 rpm下离心5 min收集细菌沉淀，用无菌水洗涤三次沉淀，并用Tris-HCl（10 mmol/L, pH 7.4）缓冲液重新分散细菌，并将细菌浓度调节成合适浓度，浓度为2.08×108 CFU/mL；
将Cu2-xSe用Tris-HCl（10 mmol/L, pH 7.4）缓冲液稀释50倍，再将细菌悬浮液用Tris-HCl（10 mmol/L, pH 7.4）缓冲液逐级稀释至1.04×108、4.16×107、2.08×107、1.04×107、4.16×106、2.08×106、1.04×106和4.16× 105 CFU/ mL的浓度；
取50 μL各浓度梯度的细菌悬浮液与150 μL Cu2-xSe，混合孵育40 min后得到Cu2- xSe-E. coli O157:H7复合物。
（3）制备侧流层析试纸条；
样品垫的制备是将玻璃纤维素膜剪裁成长16 mm宽4 mm的规格，用样品垫处理液处理30 min，在37 ℃下干燥过夜，所述样品垫处理液为含1 % FBS和0.1 % tween-20的PBS（10 mmol/L, pH 7.4）缓冲液；
硝酸纤维素膜的制备是将其剪裁成长12.5 mm宽4 mm的规格，将大肠杆菌O157:H7单抗（0.8 mg/mL）通过简易划膜器具手动包被在硝酸纤维素膜上，形成测试（T）线，用封闭液封闭30 min，然后在37 ℃下干燥过夜，所述封闭液为含1 % FBS的PBS（10 mmol/L, pH7.4）缓冲液；
吸收垫的制备是将吸水纸剪裁成长35.5 mm宽4 mm的规格，即得吸水垫；
试纸条的组装是先将硝酸纤维素膜粘贴于聚氯乙烯（PVC）底板上，然后样品垫压硝酸纤维素膜2 mm，吸水垫压硝酸纤维素膜2 mm依次粘贴于聚氯乙烯底板上，并切割成4mm宽的条状，置于4 ℃下密封保存备用。
实施例2
参照图1，采用实施例1制备的侧流层析试纸条检测E. coli O157:H7的灵敏度；
检测过程：将试纸条浸入Cu2-xSe-E. coli O157:H7复合物样品溶液中，免疫层析反应30 min，将20 mmol/LTMB和25 % H2O2混合液滴加到测试区催化显色10 min，滴加水以结束催化反应，并通过移动设备拍摄图像记录实验结果。上述细菌悬浮液用Tris-HCl缓冲液代替作为对照组，其他步骤不变。其中TMB和H2O2的体积比为4:6。
定性检测步骤：当试纸条的测试线显示出蓝色条带时，判为阳性，表明待测样品中的E. coli O157:H7的浓度高于或等于1.04×106 CFU/mL。当试纸条的测试线不显示颜色时，判为阴性，表明待测样品中的E. coli O157:H7低于1.04×106 CFU/mL。
定量检测步骤：通过手机APP（颜色信号转换器）读取实验图像的RGB值进行分析，通过分别计算取样点的R、G和B的平均值，得到各浓度梯度的细菌悬浮液下的B/(R+G+B)值，E. coli O157:H7浓度在4.16×105 ~ 4.16×107 CFU/mL范围内，D[B/(R+G+B)]与E. coli O157:H7浓度存在线性关系，线性方程为y = 4.84214×10-9x - 0.00166（R2 = 0.9771, n= 3）（x表示E. coli O157:H7浓度，单位为CFU/mL；y是不同浓度E. coli O157:H7的D[B/(R+G+B)]值），检测限（LOD）值为2.65×105 CFU/mL（3s/K, 其中s由10个空白对照测得的B/R+G+B的标准偏差；K是线性方程的斜率）。根据标准曲线，实现对E. coli O157:H7定量检测。
实施例中肉眼观察到的不同浓度E. coli O157:H7的试纸条条带，如图1（A） 所示；测试线的D[B/(R+G+B)]值与E. coli O157:H7浓度的关系，如图1（B） 所示；以及不同浓度E. coli O157:H7与D[B/(R+G+B)]值的线性关系，如图1（C） 所示；从图1得知，E. coli O157:H7的目视比色法灵敏度为1.04×106 CFU/mL。用智能手机读取信号可获得D[B/(R+G+B)]与E. coli O157:H7浓度的线性关系，线性范围为4.16×105 ~ 4.16×107CFU/mL，根据标准曲线，实现对E. coli O157:H7定量检测。
实施例3
采用实施例1制备的侧流层析试纸条检测E. coli O157:H7的特异性；
将Cu2-xSe用Tris-HCl（10 mmol/L, pH 7.4）缓冲液稀释50倍，再将细菌悬浮液逐级稀释使终浓度为2.08×107 CFU/mL。取50 μL细菌悬浮液与150 μL Cu2-xSe，混匀孵育40min。将试纸条浸入Cu2-xSe-E. coli O157:H7复合物样品溶液中，免疫层析反应30 min，将20 mmol/LTMB和25 % H2O2混合液滴加到测试区催化显色10 min，滴加水以结束催化反应。并通过移动设备拍摄图像记录实验结果。上述菌液分别用金黄色葡萄球菌（S. aure）（2.08×107 CFU/mL）和Tris-HCl缓冲液代替，其他步骤不变。其中TMB和H2O2的体积比为4:6。
参照图2，实施例1中当溶液中加入了2.08×107 CFU/mL E. coli O157:H7时，试纸条的测试线处出现蓝色条带，而当加入S. aure时，试纸条测试线处不显示颜色，与空白对照组（Tris-HCl缓冲液）几乎一致。说明其它细菌在实际应用中对本发明的影响可忽略不计。
实施例4
采用实施例1制备的侧流层析试纸条检测水样中E. coli O157:H7的实际应用；
实施例选用桂林漓江水、桂林杉湖水作为模拟样品进行检测。具体操作步骤为，使用0.22 μm过滤器过滤除去采集的水样中的杂质后，加入细菌悬浮液并逐级稀释制备4.16×107、1.04×107、2.08×106 CFU/mL的模拟样品，作为阳性样本。不加菌液，用处理后的水样作为阴性样本。
将Cu2-xSe用Tris-HCl（10 mmol/L, pH 7.4）缓冲液稀释50倍，取50 μL样本溶液与150 μL Cu2-xSe，混匀孵育40 min。将试纸条浸入样品溶液中，免疫层析反应30 min，将20mmol/LTMB和25 % H2O2混合液滴加到测试区催化显色10 min，滴加水以结束催化反应。并通过移动设备拍摄图像记录实验结果。其中TMB和H2O2的体积比为4:6。
如表1所示：漓江水和杉湖水中加标回收率分别为87.2 % ~ 109.1 %和84.5 % ~104.0 %，相对标准偏差范围分别为6.74 % ~ 8.79 %和2.92 % ~ 10.1 %。
表1 侧流免疫层析试纸条检测环境水样中E. coli O157:H7的回收率（n=3）
。
从表1可以看出，两种环境水样模拟样品中，对E. coli O157:H7的检测效果大致相同，表明本发明侧流免疫层析试纸条在环境水样检测的可行性和适用性。
Claims (6)
1.一种基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备Cu2-xSe纳米晶体材料，具体包括如下步骤：
（1.1）将浓度为30 mmol/L 的CTAB和4~5 mL水添加到圆底烧瓶中，在剧烈搅拌下，依次加入浓度为0.2 mol/L 的SeO2与浓度为0.2 mol/L的AA，反应1~10 min后，再分别添加浓度为0.4 mol/L 的CuSO4·5H2O与浓度为0.2 mol/L的AA，然后将所得混合物置于30 ℃下搅拌1~2 h，获得墨绿色溶液；
（1.2）将获得的墨绿色溶液，透析纯化20~24 h，以去除小分子，并通过离心除去大颗粒，得到Cu2-xSe纳米晶体材料，并储存在4 ℃冰箱中待用；
（2）制备Cu2-xSe-E. coli O157:H7复合物，具体包括如下步骤：
取单菌落加入培养基培养后，取适量培养后菌液，用无菌水洗涤2~3次，细菌沉淀用Tris-HCl缓冲液分散得到大肠杆菌原液，大肠杆菌原液逐级稀释为不同浓度的大肠杆菌标准溶液，吸取Cu2-xSe纳米晶体材料加入不同浓度的大肠杆菌标准溶液，混匀孵育后得到了Cu2-xSe-E. coli O157:H7复合物；
（3）制备侧流层析试纸条，具体包括如下步骤：
样品垫用处理液处理，在37 ℃下干燥6~12 h；
大肠杆菌O157:H7单抗通过简易划膜器具手动包被在硝酸纤维素膜上，形成测试线，用封闭液封闭，然后在37 ℃下干燥6~12 h，吸收垫无需处理，直接使用；
将样品垫、NC膜和吸收垫依次粘贴到聚氯乙烯底板上，组装成侧流层析试纸条。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1.1）中，CTAB和SeO2的物质的量之比为2.4:1；SeO2和AA的物质的量之比为1:6；CuSO4·5H2O和AA的物质的量之比为1:4。
3.根据权利要求1-2任一项所述制备方法制备的基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条。
4.权利要求3所述的基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条的应用，其特征在于，将制备的Cu2- xSe的侧流层析试纸条用于检测饮用水中E. coli O157:H7。
5.根据权利要求4所述的基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条的应用，其特征在于，所述检测饮用水中E. coli O157:H7，检测方法包括如下步骤：
将制得的试纸条浸入Cu2-xSe-E. coli O157:H7复合物样品液中，免疫层析反应，样品液通过毛细管效应驱使样品溶液沿样品垫和NC膜进入吸收垫，待测细菌与NC膜上包被的E. coli O157:H7单抗进行特异性识别，Cu2-xSe聚集于检测线；
将TMB和H2O2混合液滴加到测试区催化显色，出现蓝色条带，滴加水以结束催化反应，并通过移动设备拍摄图像进行定性分析；
通过手机APP颜色信号转换器，读取实验图像的RGB值进行分析，通过分别计算取样点的R、G和B的平均值，得到不同细菌浓度下的D[B/(R+G+B)]值，绘制细菌浓度与D[B/(R+G+B)]值之间的标准曲线；
根据标准曲线，测定环境水样中细菌浓度，实现定量检测。
6.根据权利要求5所述的基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条的应用，其特征在于，检测方法中，TMB和H2O2的体积比为4:6。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310921712.6A CN116908441A (zh) | 2023-07-26 | 2023-07-26 | 一种基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310921712.6A CN116908441A (zh) | 2023-07-26 | 2023-07-26 | 一种基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116908441A true CN116908441A (zh) | 2023-10-20 |
Family
ID=88360028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310921712.6A Pending CN116908441A (zh) | 2023-07-26 | 2023-07-26 | 一种基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116908441A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116351439A (zh) * | 2023-04-01 | 2023-06-30 | 辽宁大学 | 纳米酶复合材料及基于纳米酶水凝胶便携式传感平台及其在检测重金属离子中的应用 |
-
2023
- 2023-07-26 CN CN202310921712.6A patent/CN116908441A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116351439A (zh) * | 2023-04-01 | 2023-06-30 | 辽宁大学 | 纳米酶复合材料及基于纳米酶水凝胶便携式传感平台及其在检测重金属离子中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | “Three-in-one” multifunctional nanohybrids with colorimetric magnetic catalytic activities to enhance immunochromatographic diagnosis | |
| Wang et al. | A universal signal-on electrochemical assay for rapid on-site quantitation of vibrio parahaemolyticus using aptamer modified magnetic metal–organic framework and phenylboronic acid-ferrocene co-immobilized nanolabel | |
| Fei et al. | A sandwich electrochemical immunoassay for Salmonella pullorum and Salmonella gallinarum based on a AuNPs/SiO 2/Fe 3 O 4 adsorbing antibody and 4 channel screen printed carbon electrode electrodeposited gold nanoparticles | |
| CN112964763B (zh) | 电活性物质修饰mof复合材料的电化学免疫传感器及其制备与应用 | |
| Tian et al. | Copper deposition-induced efficient signal amplification for ultrasensitive lateral flow immunoassay | |
| CN116908441A (zh) | 一种基于Cu2-xSe的侧流层析试纸条及其制备方法和应用 | |
| CN109613244B (zh) | 一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法及应用 | |
| CN114113585B (zh) | 一种双信号探针、检测大肠杆菌的试纸条及应用 | |
| Kozitsina et al. | A new enzyme-free electrochemical immunoassay for Escherichia coli detection using magnetic nanoparticles | |
| CN110133252A (zh) | 用于检测癌胚抗原的试剂盒和检测方法及其应用 | |
| CN108918853B (zh) | 一种Pd@Ag@CeO2标记的免疫传感器的制备方法及应用 | |
| CN111504909B (zh) | 一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器、制备方法及其应用 | |
| CN109444240B (zh) | 一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器及基于该传感器所建立的电化学免疫传感方法和应用 | |
| Chen et al. | Joint-detection of Salmonella typhimurium and Escherichia coli O157: H7 by an immersible amplification dip-stick immunoassay | |
| Liu et al. | Multi-functional MnO 2-doped Fe 3 O 4 nanoparticles as an artificial enzyme for the colorimetric detection of bacteria | |
| CN105891473B (zh) | 基于金标银染信号放大技术的食源性致病菌免疫传感器的制备方法及其应用 | |
| Yang et al. | Portable intelligent paper-based sensors for rapid colorimetric and smartphone-assisted analysis of hydrogen peroxide for food, environmental and medical detection applications | |
| CN110470840B (zh) | 一种检测副溶血性弧菌的方法 | |
| CN110702662B (zh) | 基于标签表面增强拉曼散射检测细菌的方法 | |
| Shang et al. | An immunomagnetic separation and bifunctional Au nanoparticle probe-based multiamplification electrochemical strategy | |
| CN114280046B (zh) | 检测微生物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法 | |
| CN108132287B (zh) | 一种基于聚吡咯纳米片复合材料的电流型免疫传感器的制备方法及应用 | |
| CN105527428A (zh) | 一种快速检测大肠杆菌o157：h7的方法 | |
| CN115060893A (zh) | 三维均相填充型磁性-贵金属复合纳米酶、其新冠抗原免疫层析试纸及应用 | |
| Yao et al. | An intelligent readable and capture-antibody-independent lateral flow immunoassay based on Cu 2− x Se nanocrystals for point-of-care detection of Escherichia coli O157: H7 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |