CN111504909B - 一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器、制备方法及其应用 - Google Patents

一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器、制备方法及其应用，属于光电化学生物传感器技术领域，本发明采用Au/CsxWO3异质薄膜作为基底材料，壳聚糖固定甲胎蛋白抗体，在进行检测时，利用抗体‑抗原特异性结合，使得光电流强度相应降低，实现无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的构建。本发明合成的Au/CsxWO3异质薄膜具有优异的光电化学性能，能够提高材料的导电性，同时具有高稳定性的优点，能够减小背景噪声，增强传感器的灵敏度；该光电化学生物传感器制备简单，操作方便，实现了对甲胎蛋白的快速、灵敏、选择、特异检测，具有临床应用前景。

Description

一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器、制备方法 及其应用
技术领域
本发明属于光电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器、制备方法及其应用。
背景技术
甲胎蛋白是肝细胞癌中最常见的血清蛋白，作为一种特殊的肿瘤标志物之一，广泛应用于肝细胞癌的筛查、诊断、治疗、预后和肝移植。肝细胞癌作为一种致死率极高的癌症，严重威胁着人类的健康，因此，对于甲胎蛋白的早期诊断很重要。常见的检测甲胎蛋白的方法有电化学检测、荧光检测、放射免疫法、表面等离子体共振检测等，上述方法背景噪声大、检测时间长、成本高等缺点。
光电化学检测同时兼具光学和电化学检测的优势，能够实现肿瘤标志物的低浓度、高灵敏度的快速精确检测，并且成本低，仪器简单；实现了激发信号和检测信号的分离，降低了背景噪声。目前大多数的氧化物半导体已经应用到了光电化学生物传感器的构建中，发现新的光敏材料尤为重要。
发明内容
为了克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种成本低、灵敏度高、特异性好的无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器、制备方法及其应用，所制备的传感器可用于甲胎蛋白的快速、灵敏检测。本发明采用Au/CsxWO3异质薄膜作为基底材料，壳聚糖固定甲胎蛋白抗体，在进行检测时，利用抗体-抗原特异性结合，使得光电流强度相应降低，实现无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的构建。
本发明通过如下技术方案实现：
一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下：
步骤一：Au/CsxWO3异质薄膜的制备；
(1)用NaOH溶液清洗MMA溶液,溶液体积比为4：1，反复清洗2-4次，使上层MMA溶液澄清，然后取15mL上层澄清液、150mL水和磁力搅拌子放到三颈烧瓶中，90℃油浴，10-20rpm搅拌，后加入90mg过硫酸钾,反应60-120min，反应完全后得到白色PMMA溶液；
(2)将FTO工作电极切割成2.5cm×0.9cm大小，浸泡在体积比为1:3的过氧化氢/浓硫酸混合溶液中，后用去离子水清洗，再依次用丙酮、乙醇、丙酮、去离子水分别清洗30-60min，然后将清洗好的FTO工作电极插入步骤(1)得到的PMMA溶液中，在30-35℃的烘箱中放置16-24h，然后在120-140℃的烘箱中退火40-60min，得到PMMA模板；
(3)利用毛细张力，将10-15μL的1.25mol/L的HAuCl4溶液渗入到步骤(2)得到的PMMA模板的空隙中，室温下晾干，然后放入400-600℃管式炉中保持3-5h待温度降至室温后得到FTO/Au电极；
(4)将0.2mmol氯化钨、0.12mmol氯化铯、0.6-1.5mmol油胺、19-31mmol油酸和磁力搅拌子放入三颈烧瓶中，270-300℃磁力搅拌加热2-2.5h，整个过程在氮气环境下进行，然后得到深蓝色溶液，用0.5mL甲苯和1mL丙酮清洗两次，4000-8000rpm离心10-20min，得到CsxWO3纳米晶；
(5)将步骤(4)中得到的CsxWO3纳米晶溶于1-4mL甲苯溶液中，取上述溶液25μL修饰到步骤(3)得到的电极表面，50-70℃退火1-1.5h，去离子水冲洗，室温晾干，得到Au/CsxWO3异质薄膜修饰的FTO工作电极；
步骤二：无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的制备；
(a)在步骤一得到的Au/CsxWO3异质薄膜修饰的FTO工作电极表面修饰10-15μL、0.05wt％的壳聚糖，室温下晾干，反应20-30min后分别用NaOH溶液和去离子水冲洗，自然晾干，然后再将20-25μL、5％的GLD水溶液滴加到上述的电极上，活化壳聚糖，室温环境下20-30min，用去离子水冲洗，4℃冰箱中保存晾干；
(b)在步骤(a)中得到的电极表面修饰25μL、40-50μg/mL的甲胎蛋白抗体，放到4℃冰箱中孵育12h后用洗涤缓冲液冲洗，4℃冰箱中保存晾干；
(c)在步骤(b)中得到的电极表面修饰20-25μL的1％牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，在37℃的环境下反应30-40min后用洗涤缓冲溶液冲洗，4℃冰箱中保存晾干，得到无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器。所述的洗涤缓冲溶液为PH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
本发明的另一目的在于提供一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器在检测甲胎蛋白方面的应用，具体包括如下步骤：
(Ⅰ)标准溶液配置：配置一组包括空白样在内的不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液；
(Ⅱ)工作电极修饰：将所制备的无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器作为工作电极，将步骤(Ⅰ)中配置的不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液分别滴涂到工作电极表面，进行抗体-抗原的特异性结合，在37℃下孵育1h，然后小心地用洗涤缓冲溶液冲洗，除去没结合的抗原，得到待测的修饰电极；
(Ⅲ)工作曲线绘制：以饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，步骤(Ⅱ)得到的待测修饰电极作为工作电极，构成三电极系统，在磷酸盐(PBS)缓冲溶液中进行测试；利用i-t测试分析，设置电压为0.4-1.0V，运行时间100-500s，测试光源为500W的氙灯；检测不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液产生的光电流强度，绘制i-t工作曲线；不用浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液的光电流强度为I，I与甲胎蛋白抗原标准溶液浓度c的对数之间呈线性关系，绘制I-log c工作曲线；
(Ⅳ)人血清中甲胎蛋白抗原的检测：在人标准血清样品中加入一定浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液，以未加入甲胎蛋白抗原的血清作为空白样，按照步骤(Ⅱ)和(Ⅲ)中的方法进行检测，根据响应光电流强度I，测定样品中甲胎蛋白的回收率；
所述的洗涤缓冲溶液为PH 7.2的磷酸盐缓冲溶液，PBS缓冲溶液为PH6.0-8.0的含0.02-0.1M抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。
与现有技术相比，本发明的优点如下：
(1)本发明合成的Au/CsxWO3异质薄膜具有优异的光电化学性能，能够提高材料的导电性，同时具有高稳定性的优点，能够减小背景噪声，增强传感器的灵敏度；
(2)本发明所述的光电化学生物传感器制备简单，操作方便，实现了对甲胎蛋白的快速、灵敏、选择、特异检测，具有临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1提供的Au/CsxWO3异质薄膜的横截面结构示意图；
图2为实施例1中制备的PMMA的形貌扫描电镜图；
从图中可以看出PMMA球的尺寸大小，比例尺为1μm，图中的规则球尺寸参数为0.3μm。
图3为实施例1制备的FTO/Au电极表面相貌的扫描电镜图；
从图中可以看出整个金膜缜密，对于下一步的修饰，以及电极的导电性能具有优良的改善；
图4为实施例1制备的Au/CsxWO3异质薄膜电极表面相貌的扫描电镜图；
从图中可以看出整个电极表面的纳米粒比较均匀，同时整体缜密，能够增大比表面积，吸附更多的生物标志物，提高生物传感器的灵敏度；
图5为本发明提供的光电化学生物传感器每步修饰的电化学阻抗谱图；
图中(a)FTO、(b)FTO/Au、(c)FTO/Au/CsxWO3、(d)FTO/Au/CsxWO3/CS、(e)FTO/Au/CsxWO3/CS/Ab、(f)FTO/Au/CsxWO3/CS/Ab/BSA、(g)FTO/Au/CsxWO3/CS/Ab/BSA/AFP，说明该生物传感器上的材料都修饰成功，该传感器制备成功；
图6为PBS溶液中检测甲胎蛋白的光电流响应线性关系图；
该图是检测光电流响应和甲胎蛋白的浓度的对数呈现的线性关系，检测范围是0.01ng/mL-500ng/mL，检测限低至7pg/mL，证明本发明的传感器具有较宽的检测范围和良好的灵敏度。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施1制备无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的制备方法
步骤一：Au/CsxWO3异质薄膜的制备：
(1)取200mL的15mg/mL的NaOH清洗50mL MMA，反复清洗3次，然后取15mL上层澄清液、150mL水和磁力搅拌子放到三颈烧瓶中，90℃油浴，15rpm搅拌，一段时间后加入90mg过硫酸钾,反应90min，反应完全后得到白色PMMA溶液；
(2)将FTO工作电极切割成2.5cm×0.9cm大小，浸泡在体积比为1:3的过氧化氢/浓硫酸混合溶液中，一段时间后用去离子水清洗，再依次用丙酮、乙醇、丙酮、去离子水分别清洗30min，然后将清洗好的FTO工作电极插入步骤(1)得到的PMMA溶液中，在32℃的烘箱中放置20h，然后在120℃的烘箱中退火40min，得到PMMA模板，PMMA球的形貌如附图2所示；
(3)利用毛细张力，将10μL的1.25mol/L的HAuCl4溶液渗入到步骤(2)得到的PMMA模板的空隙中，室温下晾干，然后放入500℃管式炉中保持3h，待温度降至室温后得到FTO/Au电极，电极的表面形貌如附图3所示；
(4)将0.2mmol氯化钨、0.12mmol氯化铯、0.6mmol油胺、19mmol油酸和磁力搅拌子放入50mL三颈烧瓶中，300℃磁力搅拌加热2h，整个过程在氮气环境下进行，然后得到深蓝色溶液，用0.5mL甲苯和1mL丙酮清洗两次，4000rpm离心10min，得到CsxWO3纳米晶；
(5)将步骤(4)中得到的CsxWO3纳米晶溶于1mL甲苯溶液中，取上述溶25μL修饰到步骤(3)得到的电极表面，60℃退火1h，去离子水冲洗，室温晾干，得到Au/CsxWO3异质薄膜膜修饰的FTO工作电极，该电极的横截面结构示意图如图1所示，形貌表征的扫描电镜如图4所示；
步骤二：无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的制备：
(a)在步骤一得到的Au/CsxWO3异质薄膜修饰的FTO工作电极表面修饰10μL、0.05wt％的壳聚糖，室温下晾干，反应30min后分别用NaOH溶液和去离子水冲洗，自然晾干，然后再将20μL、5％的GLD水溶液滴加到上述的电极上，活化壳聚糖，室温环境下30min，用去离子水冲洗，4℃冰箱中保存晾干；
(b)在步骤(a)中得到的电极表面修饰25μL、50μg/mL的甲胎蛋白抗体，放到4℃冰箱中孵育12h后用洗涤缓冲液冲洗，4℃冰箱中保存晾干；
(c)在步骤(b)中得到的电极表面修饰20μL的1％(质量-体积百分比浓度)牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，在37℃的环境下反应30min后用洗涤缓冲溶液冲洗，4℃冰箱中保存晾干，得到无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器。
实施2制备无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的制备方法
步骤一：Au/CsxWO3异质薄膜的制备：
(1)取200mL的15mg/mL的NaOH清洗50mL MMA，反复清洗4次，然后取15mL上层澄清液、150mL水和磁力搅拌子放到三颈烧瓶中，90℃油浴，20rpm搅拌，一段时间后加入90mg过硫酸钾,反应60min，反应完全后得到白色PMMA溶液；
(2)将FTO工作电极切割成2.5cm×0.9cm大小，浸泡在体积比为1:3的过氧化氢/浓硫酸混合溶液中，一段时间后用去离子水清洗，再依次用丙酮、乙醇、丙酮、去离子水分别清洗40min，然后将清洗好的FTO工作电极插入步骤(1)得到的PMMA溶液中，在35℃的烘箱中放置24h，然后在120℃的烘箱中退火60min，得到PMMA模板，PMMA球的形貌如附图2所示；
(3)利用毛细张力，将15μL的1.25mol/L的HAuCl4溶液渗入到步骤(2)得到的PMMA模板的空隙中，室温下晾干，然后放入500℃管式炉中保持4h，待温度降至室温后得到FTO/Au电极，电极的表面形貌如附图3所示；
(4)将0.2mmol氯化钨、0.12mmol氯化铯、1mmol油胺、30mmol油酸和磁力搅拌子放入50mL三颈烧瓶中，300℃磁力搅拌加热2h，整个过程在氮气环境下进行，然后得到深蓝色溶液，用0.5mL甲苯和1mL丙酮清洗两次，4000rpm离心10min，得到CsxWO3纳米晶；
(5)将步骤(4)中得到的CsxWO3纳米晶溶于4mL甲苯溶液中，取上述溶25μL修饰到步骤(3)得到的电极表面，70℃退火1.5h，去离子水冲洗，室温晾干，得到Au/CsxWO3异质薄膜膜修饰的FTO工作电极；
步骤二：无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的制备：
(a)在步骤一得到的Au/CsxWO3异质薄膜修饰的FTO工作电极表面修饰15μL、0.05wt％的壳聚糖，室温下晾干，反应20min后分别用NaOH溶液和去离子水冲洗，自然晾干，然后再将25μL、5％的GLD水溶液滴加到上述的电极上，活化壳聚糖，室温环境下20min，用去离子水冲洗，4℃冰箱中保存晾干；
(b)在步骤(a)中得到的电极表面修饰25μL、40μg/mL的甲胎蛋白抗体，放到4℃冰箱中孵育12h后用洗涤缓冲液冲洗，4℃冰箱中保存晾干；
(c)在步骤(b)中得到的电极表面修饰25μL的1％(质量-体积百分比浓度)牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，在37℃的环境下反应40min后用洗涤缓冲溶液冲洗，4℃冰箱中保存晾干，得到无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器。
实施例3所制备的无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的应用，包括如下应用步骤：
(Ⅰ)标准溶液配置：配置一组包括空白样在内的不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液；
(Ⅱ)工作电极修饰：将所制备的无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器作为工作电极，将步骤(Ⅰ)中配置的不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液分别滴涂到工作电极表面，进行抗体-抗原的特异性结合，在37℃下孵育1h，然后小心地用洗涤缓冲溶液冲洗，除去没结合的抗原，得到待测的修饰电极；
(Ⅲ)工作曲线绘制：以饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，步骤(Ⅱ)得到的待测修饰电极作为工作电极，构成三电极系统，在磷酸盐(PBS)缓冲溶液中进行测试；利用i-t测试分析，设置电压为0.6V，运行时间100s，测试光源为500W的氙灯；检测不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液产生的光电流强度，绘制i-t工作曲线；不用浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液的光电流强度为I，I与甲胎蛋白抗原标准溶液浓度c的对数之间呈线性关系，绘制I-log c工作曲线；图6为检测光电流响应和甲胎蛋白的浓度的对数呈现的线性关系，检测范围是0.01ng/mL-500ng/mL，检测限低至7pg/mL，证明本发明的传感器具有较宽的检测范围和良好的灵敏度。
(Ⅳ)人血清中甲胎蛋白抗原的检测：在人标准血清样品中加入一定浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液，以未加入甲胎蛋白抗原的血清作为空白样，按照步骤(Ⅱ)和(Ⅲ)中的方法进行检测，根据响应光电流强度I，测定样品中甲胎蛋白的回收率，数据附表1；
所述的洗涤缓冲溶液为PH 7.2的磷酸盐缓冲溶液，PBS缓冲溶液为PH 7.4的含0.06M抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。
表1为人血清中的甲胎蛋白的检测结果
Figure BDA0002424487650000071
从表中我们看出RSD值低于6％，分析回收率的范围在97-104％，这说明这种无标记的无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器检测AFP是具有高灵敏度和精确性。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (6)

1.一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤一：Au/CsxWO3异质薄膜的制备；
(1)用NaOH溶液清洗MMA溶液,反复清洗2-4次，使上层MMA溶液澄清，然后取15mL上层澄清液、150mL水和磁力搅拌子放到三颈烧瓶中，90℃油浴，10-20rpm搅拌，后加入90mg过硫酸钾,反应60-120min，反应完全后得到白色PMMA溶液；
(2)将FTO工作电极切割成2.5cm×0.9cm大小，浸泡在过氧化氢/浓硫酸混合溶液中，后用去离子水清洗，再依次用丙酮、乙醇、丙酮、去离子水分别清洗30-60min，然后将清洗好的FTO工作电极插入步骤(1)得到的PMMA溶液中，在30-35℃的烘箱中放置16-24h，然后在120-140℃的烘箱中退火40-60min，得到PMMA模板；
(3)利用毛细张力，将10-15μL的1.25mol/L的HAuCl4溶液渗入到步骤(2)得到的PMMA模板的空隙中，室温下晾干，然后放入400-600℃管式炉中保持3-5h待温度降至室温后得到FTO/Au电极；
(4)将0.2mmol氯化钨、0.12mmol氯化铯、0.6-1.5mmol油胺、19-31mmol油酸和磁力搅拌子放入三颈烧瓶中，270-300℃磁力搅拌加热2-2.5h，整个过程在氮气环境下进行，然后得到深蓝色溶液，用0.5mL甲苯和1mL丙酮清洗两次，4000-8000rpm离心10-20min，得到CsxWO3纳米晶；
(5)将步骤(4)中得到的CsxWO3纳米晶溶于1-4mL甲苯溶液中，取上述溶液25μL修饰到步骤(3)得到的电极表面，50-70℃退火1-1.5h，去离子水冲洗，室温晾干，得到Au/CsxWO3异质薄膜修饰的FTO工作电极；
步骤二：无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的制备；
(a)在步骤一得到的Au/CsxWO3异质薄膜修饰的FTO工作电极表面修饰10-15μL、0.05wt％的壳聚糖，室温下晾干，反应20-30min后分别用NaOH溶液和去离子水冲洗，自然晾干，然后再将20-25μL、5％的GLD水溶液滴加到上述的电极上，活化壳聚糖，室温环境下20-30min，用去离子水冲洗，4℃冰箱中保存晾干；
(b)在步骤(a)中得到的电极表面修饰25μL、40-50μg/mL的甲胎蛋白抗体，放到4℃冰箱中孵育12h后用洗涤缓冲液冲洗，4℃冰箱中保存晾干；
(c)在步骤(b)中得到的电极表面修饰20-25μL的1％牛血清蛋白溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，在37℃的环境下反应30-40min后用洗涤缓冲溶液冲洗，4℃冰箱中保存晾干，得到无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器。
2.如权利要求1所述的一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的制备方法，所述NaOH溶液与MMA溶液的体积比为4：1，所述过氧化氢与浓硫酸的体积比为1:3。
3.如权利要求1所述的一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器的制备方法，所述的洗涤缓冲溶液为PH为7.2的磷酸盐缓冲溶液。
4.一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器，其特征在于，由权利要求1-3任一项制备得到。
5.一种如权利要求4所述的无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器在检测甲胎蛋白方面的应用，具体包括如下步骤：
(Ⅰ)标准溶液配置：配置一组包括空白样在内的不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液；
(Ⅱ)工作电极修饰：将无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器作为工作电极，将步骤(Ⅰ)中配置的不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液分别滴涂到工作电极表面，进行抗体-抗原的特异性结合，在37℃下孵育1h，然后用洗涤缓冲溶液冲洗，除去没结合的抗原，得到待测的修饰电极；
(Ⅲ)工作曲线绘制：以饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，步骤(Ⅱ)得到的待测修饰电极作为工作电极，构成三电极系统，在磷酸盐缓冲溶液中进行测试；利用i-t测试分析，设置电压为0.4-1.0V，运行时间100-500s，测试光源为500W的氙灯；检测不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液产生的光电流强度，绘制i-t工作曲线；不同浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液的光电流强度为I，I与甲胎蛋白抗原标准溶液浓度c的对数之间呈线性关系，绘制I-log c工作曲线；
(Ⅳ)人血清中甲胎蛋白抗原的检测：在人标准血清样品中加入一定浓度的甲胎蛋白抗原标准溶液，以未加入甲胎蛋白抗原的血清作为空白样，按照步骤(Ⅱ)和(Ⅲ)中的方法进行检测，根据响应光电流强度I，测定样品中甲胎蛋白的回收率。
6.如权利要求5所述的一种无标记检测甲胎蛋白的光电化学生物传感器在检测甲胎蛋白方面的应用，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液为PH 6.0-8.0的含0.02-0.1M抗坏血酸的磷酸盐缓冲溶液。
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