CN109856300A

CN109856300A - 一种二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法

Info

Publication number: CN109856300A
Application number: CN201811394782.6A
Authority: CN
Inventors: 王汉杰; 崔梅慧; 常津; 杨旻晔; 李姗姗; 魏春阳; 于成壮
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2019-06-07

Abstract

本发明提供一种二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法，具体涉及两部分内容1)粒径均一的二氧化硅纳米颗粒的制备；2)将1)所得的粒径均一的二氧化硅纳米颗粒配成一定浓度的溶液，作为內液；二甲基硅油为外液。通过调节注射泵的流速来控制通过对冲式毛细管微液滴装置的传输液量，进而控释生成的二氧化硅光子晶体微球的大小。该方法制备得到的二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球相对于传统的反蛋白石光子晶体薄膜而言具有诸多优势：借助于对冲式毛细管微液滴装置简化了制备流程，且反蛋白石光子晶体微球具有完美的对称结构，其反射峰无角度依赖性，可实现对待检物的裸眼检测。

Description

一种二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法

技术领域

本发明涉及生物监测领域，尤其是一种二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法。

背景技术

食品毒素是真菌产生的次级代谢产物，由于其具有痕量、毒性强、种类繁多以及多种毒素共存于同一食品等特点，给实际检测带来很大困难。目前，食品中真菌毒素的检测方法有气相色谱质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)以及酶联免疫吸附法(ELISA)等，这些方法虽然可对检测物进行定性定量分析，但样品前处理复杂、操作繁琐、需要昂贵的实验仪器等限制的存在，无法满足现场快速筛查的要求。因此在食品毒素检测过程中，本领域技术人员一直在寻找一种快速、准确、灵敏、通量的检测方法。基于二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的液相芯片检测系统是一种具有上述潜能的全新解决方法。

基于二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的液相芯片检测系统是指利用光子晶体与食品毒素结合后本身的结构色变化，实现对食品毒素的定性定量检测。传统的stober合成硅球的方法，很难保证合成的二氧化硅纳米颗粒有均一的粒径，因此也就很难保证二氧化硅纳米颗粒能组装成光子晶体模板，另外由于反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备过程繁琐，也就限制了反蛋白石光子晶体微球在检测领域的大规模应用。

同传统检测方法，如GC-MS、HPLC、ELISA相比，基于二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的液相芯片检测系统在食品毒素的检测中还处于辅助和次要地位，究其原因主要是存在以下缺陷，1)检测速度虽然大幅度提高，但检测的准确度、灵敏度相比于传统方法仍存在一定差距；2)粒径均一的二氧化硅纳米颗粒及可视化二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法比较繁琐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法，基于对冲式毛细管微液滴技术进行制备，步骤如下：

1)以正硅酸四乙酯、乙醇、氨水、双蒸水为原料制备出粒径均一的二氧化硅纳米颗粒；

2)利用对冲式毛细管微液滴发生装置，以二氧化硅颗粒水溶液为内相，以二甲基硅油为外相，通过控制注射泵的流速，制备得到粒径均一的二氧化硅液滴，收集到的二氧化硅液滴经过烘干、煅烧、孵育、刻蚀之后，制备得到二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体。

制备得到的二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球结构稳定、粒径均一，具有明显的结构色等优点。

上述二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法，具体制备步骤如下：

1)粒径均一的二氧化硅纳米颗粒的合成：

(1)按照体积比无水乙醇：正硅酸四乙酯＝(3-9)：(47-41)将原料加入到反应烧杯中，然后用保鲜膜将烧杯口封住，防止乙醇挥发；将上述溶液超声处理20分钟，使正硅酸四乙酯充分分散于无水乙醇中；

(2)按照体积比氨水：无水乙醇＝(3-9)：(15-30)将原料加入到反应烧杯中，与步骤(1)溶液体积比为4:5，最后用双蒸水补加至40mL并用保鲜膜将烧杯口封住，防止氨水、乙醇挥发。在磁力搅拌的条件下，使该溶液充分均匀混合；

(3)利用注射泵将步骤(1)溶液以1000-4000uL/min的流速注入到在磁力搅拌条件下的步骤(2)溶液中，搅拌速度300rpm/min，将混合液在室温条件下反应12-24h；

(4)混合液中的正硅酸四乙酯经过水解、缩合反应之后，形成形貌稳定、粒径均一的二氧化硅纳米颗粒，用无水乙醇洗涤硅球三到五次，除去反应液中未反应的杂质(氨水、乙醇等)，将离心得到的二氧化硅纳米颗粒用双蒸水重悬后，真空干燥处理后即得到粒径均一的二氧化硅纳米颗粒；

2)可视化二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体的制备：

(1)用拉制仪将长为10cm、外径为1.5mm、内径为0.9mm的圆形玻璃管从中间部位拉制成具有锥形开口的两段玻璃管，用断针仪切割其中一段玻璃管的锥形开口，开口内径50-90um；另一段玻璃管用20000目的砂纸将锥形开口打磨成内径为450-480um；

(2)将长为5cm、内径为1.5mm的方形玻璃管用亚克力胶粘在载玻片上，紫外灯下固化三十秒，方形玻璃管与载玻片完全粘合；

(3)将两段圆形玻璃管分别插入到方形玻璃管两端，此时插入的圆形玻璃管外壁刚好和方形玻璃管内壁相切，在倒置显微镜下，慢慢推动两段圆形玻璃管，变推边观察，直至两段圆形玻璃管锥形段相距400-500um；

(4)在锥形尖端开口小的一侧放置一个注射器针头，用环氧树脂固定针头，并将两端的接口密封，在自然光条件下固化一小时，即得到对冲式毛细管微液滴芯片；

(5)将冷冻干燥的二氧化硅纳米颗粒配成10ng/mL的水溶液，超声使二氧化硅纳米颗粒完全分散在水中，作为內液；二甲基硅油作为外液。注射泵和对冲式毛细管微液滴芯片之间用PE管连接，调节注射泵的流速1000-4000uL/min来控制通过对冲式毛细管微液滴芯片的传输液量，从而控释生成的二氧化硅微球的大小；

(6)将用聚四氟乙烯培养皿收集到的液滴静置于72℃的烘箱中24h，二氧化硅液滴从乳白色变为透明，并呈现出一定的颜色；为确保液滴中的水分完全蒸发，24h之后将烘箱温度升高至95℃并保持1h；得到的微球用正己烷清洗三次后，将微球转移到坩埚中，烘箱中320℃煅烧四小时，即得到二氧化硅光子晶体模板；

(7)将得到的二氧化硅光子晶体模板浸泡在丙烯酰胺水凝胶溶液中，该浸泡过程必须充分，填充了水凝胶的微球用60-80W的紫外光照射15-20s，紫外灯照射的时间不易过长，当看到水凝胶成胶后需要立即停止照射，否则会引起水凝胶性质的改变；

(8)聚合后的水凝胶微球浸泡于浓度为1％的氢氟酸溶液中，刻蚀去掉二氧化硅纳米颗粒模板，即可得到反蛋白石结构丙烯酰胺水凝胶光子晶体，该反蛋白石结构丙烯酰胺水凝胶光子晶体具有鲜艳的结构色。

本发明结构有如下有益效果：

上述二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法，操作简单，适用性强，成本低，二氧化硅纳米颗粒形貌稳定、粒径均一，而二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球不但具有稳定的形貌、均一的粒径，而且具有可视化的结构色。

相对于传统反蛋白石结构光子晶体薄膜而言，将这种可视化二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球应用于检测领域，尤其是食品毒素检测领域，具有诸多优势：

本文创新性的改进stober法合成二氧化硅纳米颗粒的方法，通过分次投料，调整投料比例，合成的同一批次的二氧化硅纳米颗粒有均匀的粒径分布，且通过调整投料比例能够合成不同粒径大小的二氧化硅纳米颗粒。

简化对冲式玻璃微流控装置的制作过程，借助于后续搭建的微流控平台，能够实现对二氧化硅单分散模板液滴的批量化制备。

可视化二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球克服了传统反蛋白石结构光子晶体薄膜的角度依赖性，由于其性质稳定，可以作为待检物的编码信号存在，实现对待检物的通量化检测。

为光子晶体液相芯片在检测领域的进一步应用提供了新思路。

附图说明

图1：传统stober法合成的二氧化硅纳米颗粒的投射电子显微镜照片(形貌分析)；

图2：按照实施例2创新性的改进stober法合成的粒径为210nm的二氧化硅纳米颗粒的投射电子显微镜照片(形貌分析)；

图3：按照实施例3创新性的改进stober法合成的粒径为240nm的二氧化硅纳米颗粒的投射电子显微镜照片(形貌分析)；

图4：按照实施例4创新性的改进stober法合成的粒径为300nm的二氧化硅纳米颗粒的投射电子显微镜照片(形貌分析)；

图5：对冲式玻璃管微液滴芯片生成二氧化硅微液滴的示意图；

图6：微液滴收集装置的接触角测试；

图7：对冲式玻璃微流控装置实物图；

图8、9：搭建的微流控平台具体实物宏观图与细节图；

图10：生成的二氧化硅光子晶体模板的扫描电子显微镜宏观图与细节图。

具体实施方式

为进一步说明本发明，现通过具体实施实例对本发明进行详细阐述。

实施例1

传统stober法合成二氧化硅纳米颗粒的制备步骤如下：

参考文献Controlled growth of monodisperse silia sphere in the micronsize range.按文献提供的方法合成粒径为300nm的二氧化硅纳米颗粒，具体步骤为：

在二百五十毫升的反应锥形瓶内加入四毫升戊酯、四毫升氢氧化铵、五十毫升饱和醇氨溶液(乙醇和氨水的混合溶液)，用橡胶塞密封瓶口，磁力搅拌条件下加入二毫升正硅酸四乙酯，反应十小时。用无水乙醇洗涤硅球三到五次，除去反应液中未反应的氨水、乙醇等杂质，将离心得到的二氧化硅纳米颗粒用双蒸水重悬后，真空干燥处理理论上即得到粒径为300nm的二氧化硅单分散纳米颗粒，投射电子显微镜显示，合成的二氧化硅纳米颗粒粒径并不均一，不能满足制备反蛋白石二氧化硅水凝胶光子晶体模板的要求。(如图1所示)。

实施例2

一种二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法，制备步骤如下：

1)粒径均一的二氧化硅纳米颗粒的合成：

(1)分别取45mL无水乙醇、5mL正硅酸四乙酯，将上述两种物质加入到反应烧杯中，然后用保鲜膜将烧杯口封住，防止乙醇挥发。将上述溶液超声处理20分钟，使正硅酸四乙酯充分分散于无水乙醇中；

(2)分别取5mL氨水、20mL无水乙醇，将上述两种物质加入到反应烧杯中，另加15mL双蒸水，用保鲜膜将烧杯口封住，防止氨水、乙醇挥发。在磁力搅拌的条件下。使该溶液充分均匀混合；

(3)利用注射泵将步骤(1)溶液以3000uL/min的流速注入到在磁力搅拌条件下的步骤(2)溶液中，搅拌速度300rpm/min，将混合液在室温条件下反应24h；

(4)混合液中的正硅酸四乙酯经过水解、缩合反应之后，形成形貌稳定、粒径为210nm的单分散二氧化硅纳米颗粒，用无水乙醇洗涤硅球三到五次，除去反应液中未反应的氨水、乙醇等杂质，将离心得到的二氧化硅纳米颗粒用双蒸水重悬后，真空干燥处理即得到粒径为210nm的二氧化硅单分散纳米颗粒(如图2所示)。

2)对冲式玻璃微流控装置的制作、微流控平台的搭建以及可视化二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体的制备

(3)将两段圆形玻璃管分别插入到方形玻璃管两端，此时插入的圆形玻璃管外壁刚好和方形玻璃管内壁相切，在倒置显微镜下，慢慢推动两段圆形玻璃管，边推边观察，直至两段圆形玻璃管锥形段相距400-500um；

(4)在锥形尖端开口小的一侧放置一个注射器针头，用环氧树脂固定针头，并将两端的接口密封，在自然光条件下固化一小时，即得到对冲式玻璃微流控装置(如图5、7所示)；

(5)将冷冻干燥的二氧化硅纳米颗粒配成10ng/mL的水溶液，超声使二氧化硅纳米颗粒完全分散在水中，作为內液，注射泵的流速为40uL/min；二甲基硅油作为外液，注射泵的流速为800uL/min。注射泵和对冲式毛细管微液滴芯片之间用PE管连接，即搭建微流控平台(如图8、9所示)生成的液滴用聚四氟乙烯培养皿收集，此时生成的二氧化硅微液滴模板粒径500um(如图10所示)；

(6)将用聚四氟乙烯培养皿(水滴角测试，如图6所示)收集到的液滴静置于72℃的烘箱中24h，使二氧化硅液滴从乳白色变为透明，并呈现出一定的颜色。为确保液滴中的水分完全蒸发，24h之后将烘箱温度升高至95℃并保持1h。得到的微球用正己烷清洗三次后，将微球转移到坩埚中，并在烘箱中320℃煅烧四小时，即得到二氧化硅光子晶体模板；

(8)聚合后的水凝胶微球浸泡于浓度为1％的氢氟酸溶液中，刻蚀去掉二氧化硅纳米颗粒模板，即可得到反蛋白石结构丙烯酰胺水凝胶光子晶体。该反蛋白石结构丙烯酰胺水凝胶光子晶体具有鲜艳的蓝色。

实施例3

1)粒径均一的二氧化硅纳米颗粒的合成：

(1)分别取43mL无水乙醇、7mL正硅酸四乙酯，将上述两种物质加入到反应烧杯中，然后用保鲜膜将烧杯口封住，防止乙醇挥发。将上述溶液超声处理20分钟，使正硅酸四乙酯充分分散于无水乙醇中；

(2)分别取7mL氨水、8mL无水乙醇，将上述两种物质加入到反应烧杯中，另加15mL双蒸水，用保鲜膜将烧杯口封住，防止氨水、乙醇挥发。在磁力搅拌的条件下。使该溶液充分均匀混合；

(4)混合液中的正硅酸四乙酯经过水解、缩合反应之后，形成形貌稳定、粒径为240nm的单分散二氧化硅纳米颗粒，用无水乙醇洗涤硅球三到五次，除去反应液中未反应的氨水、乙醇等杂质，将离心得到的二氧化硅纳米颗粒用双蒸水重悬后，真空干燥处理即得到粒径为240nm的二氧化硅单分散纳米颗粒(如图3所示)。图3中，合成的粒径均一的二氧化硅纳米颗粒，透射电子显微镜测试结果显示，同批次制备的二氧化硅纳米颗粒粒径分布为300nm，粒度分布均匀，制备的二氧化硅单分散模板液滴粒径分布为500um，粒度分布均匀。接着对二氧化硅单分散模板液滴进行烘干、煅烧、孵育、刻蚀，生成的二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球能够保持原有的形貌，并有明显的结构色。

(7)将得到的二氧化硅光子晶体模板浸泡在丙烯酰胺水凝胶溶液中，该浸泡过程必须充分，填充了水凝胶的微球用60-80W的紫外光照射15-20s，紫外灯照射的时间不易过长，当看到水凝胶成后需要立即停止照射，否则会引起水凝胶性质的改变；

(8)聚合后的水凝胶微球浸泡于浓度为1％的氢氟酸溶液中，刻蚀去掉二氧化硅纳米颗粒模板，即可得到反蛋白石结构丙烯酰胺水凝胶光子晶体。该反蛋白石结构丙烯酰胺水凝胶光子晶体具有鲜艳的绿色。

实施例4

1)粒径均一的二氧化硅纳米颗粒的合成：

(1)分别取41mL无水乙醇、9mL正硅酸四乙酯，将上述两种物质加入到反应烧杯中，然后用保鲜膜将烧杯口封住，防止乙醇挥发。将上述溶液超声处理20分钟，使正硅酸四乙酯充分分散于无水乙醇中；

(2)分别取7mL氨水、3mL无水乙醇，将上述两种物质加入到反应烧杯中，另加20mL双蒸水，用保鲜膜将烧杯口封住，防止氨水、乙醇挥发。在磁力搅拌的条件下。使该溶液充分均匀混合；

(4)混合液中的正硅酸四乙酯经过水解、缩合反应之后，形成形貌稳定、粒径为240nm的单分散二氧化硅纳米颗粒，用无水乙醇洗涤硅球三到五次，除去反应液中未反应的氨水、乙醇等杂质，将离心得到的二氧化硅纳米颗粒用双蒸水重悬后，真空干燥处理即得到粒径为300nm的二氧化硅单分散纳米颗粒。

(8)聚合后的水凝胶微球浸泡于浓度为1％的氢氟酸溶液中，刻蚀去掉二氧化硅纳米颗粒模板，即可得到反蛋白石结构丙烯酰胺水凝胶光子晶体。该反蛋白石结构丙烯酰胺水凝胶光子晶体具有鲜艳的红色。

形态观察、粒径及其分布测定：

取二氧化硅样品溶液经离心后，取出沉淀物，加无水乙醇少量使分散均匀，滴于碳支持膜上制样，在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察按到二氧化硅纳米颗粒呈均匀规则的球形粒子，且通过调整投料比、注射泵的流速可以控制合成的二氧化硅纳米颗粒的粒径。

取烘干后的二氧化硅微液滴模板样品经过清洗后，滴在载玻片上，在倒置显微镜下观察其形貌状态并拍照。显微镜下观察按到二氧化硅纳米颗粒呈均匀规则的球形粒子，并显示出一定的结构色。

上述实施例1-3所得产物二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球为现有物质，目前主要是作为一种响应性载体运用在检测领域，有化学响应二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球、生物响应二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球、溶剂响应二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球、物理响应二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球以及分子印迹二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球。首先创新性的改进传统的stober合成二氧化硅纳米颗粒的方法，制备了粒径均一的二氧化硅纳米颗粒；其次通过制备的简易装置——对冲式玻璃微流控装置进而搭建起制备二氧化硅微液滴模板的微流控平台，简化了制备二氧化硅反蛋白石光子晶体微球的流程，并且制备的二氧化硅反蛋白石光子晶体具有较好的机械强度，可以同时充当编码信号和检测信号。

本发明同传统二氧化硅反蛋白石光子晶体薄膜相比具有如下优势：

经实验验证：可视化二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球可以实现批量生产，产率高。2mL的10ng/mL二氧化硅纳米颗粒水溶液,可制备大量光子晶体微球模板，而利用二氧化硅纳米颗粒的自组装仅可制备两片光子晶体薄膜模板，产率极低。得到的光子晶体微球模板用正己烷清洗三次后，经过在烘箱中320℃煅烧四小时，得到二氧化硅光子晶体模板结构致密，有一定得机械强度，而光子晶体薄膜，借助二氧化硅纳米颗粒之间的静电作用形成光子带隙，由于二氧化硅纳米颗粒之间的静电作用微弱，因此形成的光子晶体薄膜模板结构松散，稳定性差。最终形成的直径在200-500um反蛋白石水凝胶光子晶体微球，具有较大的比表面积，相对于反蛋白石水凝胶光子晶体薄膜而言有利于基团的表面功能化修饰。有反蛋白石水凝胶光子晶体微球本身的光子带隙及本身的球形结构所决定，其本身的结构色没有角度依赖性，色彩稳定，相对于传统反蛋白石结构光子晶体薄膜更有利于在检测领域的应用。

这种可视化的二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球在检测领域，尤其是在食品毒素检测方面的创新性应用原理如下：1)二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球作为编码信号定性检测毒素种类，由于该微球具有可视化的颜色表征(红、绿、蓝)，在实际检测中具有背景低、信噪比大和光学性质稳定的特点，可有效提高液相芯片检测系统的生化分析准确性与灵敏度，并可实现对毒素的通量化检测；2)利用二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球上二抗结合的藻红蛋白对毒素进行定量检测，结合自制的便携设备和智能手机对其进行图片采集，利用预先编程并安装在手机中的应用程序对图片进行分析，从而得到相关真菌毒素种类和含量的结果。该方法也为其他领域如环境监察、疾病标志物的检测等提供了科学依据。

制备得到的粒径均一的二氧化硅纳米颗粒及可视化二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的主要性能指标包括:a)粒径210nm、240nm、300nm的二氧化硅纳米颗粒，粒径可根据制剂的组成成分，注射泵流速等进行调节；b)二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球粒径均一，形貌稳定且具有可视化的结构色，粒径大小可根据注射泵流速，圆形玻璃管锥形尖端开口大小等进行调节；c)可视化二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球性质稳定，可以在酸碱环境中，保持结构的稳定；d)整个制备过程简单快捷，制备周期短，产率高，适合大批量生产。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法，其特征在于：基于对冲式毛细管微液滴技术进行制备，步骤如下：

2.根据权利要求1所述的二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体微球的制备方法，其特征在于：具体制备步骤如下：

1)粒径均一的二氧化硅纳米颗粒的合成：

(2)按照体积比氨水：无水乙醇＝(3-9)：(15-30)将原料加入到反应烧杯中，与步骤(1)溶液体积比为4:5，最后用双蒸水补加至40mL并用保鲜膜将烧杯口封住，防止氨水、乙醇挥发。在磁力搅拌的条件下，使该溶液充分混合均匀；

(4)混合液中的正硅酸四乙酯经过水解、缩合反应之后，形成形貌稳定、粒径均一的二氧化硅纳米颗粒，用无水乙醇洗涤硅球三到五次，除去反应液中未反应的杂质(氨水、乙醇等)，将离心得到的二氧化硅纳米颗粒用双蒸水重悬，真空干燥处理后即得到粒径均一的二氧化硅纳米颗粒；

2)可视化二氧化硅反蛋白石水凝胶光子晶体的制备：

(3)将两段圆形玻璃管分别插入到方形玻璃管两端，此时插入的圆形玻璃管外壁刚好和方形玻璃管内壁相切，在倒置显微镜下，慢慢推动两段圆形玻璃管，边推动边观察，直至两段圆形玻璃管锥形段相距400-500um；