CN108408731A - 一种纳米粒子表面活性剂的快速的合成方法及其应用 - Google Patents

一种纳米粒子表面活性剂的快速的合成方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及到一种纳米粒子表面活性剂的快速合成方法。该方法利用全氟硅烷与正硅酸酯在碱性条件下共水解，直接合成了一种氟基的二氧化硅纳米粒子表面活性剂。该方法具有简单，快速，可重复性高等优点。解决了之前表面活性剂的合成步骤繁琐，可重性低的问题。本发明同样涉及基于这种纳米粒子表面活性剂的应用，基于此种表面活性剂构建的微反应器可广泛的应用于医疗诊断，生物、化学检测分析，材料合成等领域，尤其应用于单分子检测领域。

Description

一种纳米粒子表面活性剂的快速的合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种纳米粒子的表面活性剂的快速合成方法，应用于医疗诊断，生物、化学检测分析，材料合成等领域，尤其应用于单分子检测领域。
背景技术
微液滴技术具有体积小，通量高，所需样品量小，尺寸均一，易操控等优点而被广泛应用医疗诊断，生物、化学检测分析，材料合成等领域。液滴的稳定与无交叉污染是微液滴技术的基本前提，而这两个因素与表面活性剂的种类密切相关。传统用于液滴稳定的表面活性剂一般都是分子型表面活性剂，主要分为以下几种：一、硅油型表面活性剂，2005年，第一次报导用硅油型表面活性剂做乳化PCR，但是硅油型表面活性剂与常用的PDMS材料不兼容，只能限制于玻璃芯片；二、烃油型表面活性剂，这种表面活性剂解决了于PDMS兼容的问题，但是对于液滴内容物复杂的体系，液滴内容物中的疏水物质往往会扩散到连续相中，容易导致液滴与液滴之间的交叉污染，因此也限制了此种表面活性剂的应用。三、氟油型表面活性剂，氟油由于具有既不亲水也不亲油的双疏特性，可以很好的防止液滴内容物通过溶解在氟油中扩散，并且与PDMS材料有很好的兼容性，因此是目前微流控体系应用最广的一种连续相，但是目前能够被广泛使用的表面活性剂的种类非常稀缺，并且难合成，价格昂贵。另外，尽管氟油可以很好的起到隔绝作用，但是由于分子形式表面活性剂的存在，仍然会导致液滴与液滴之间交叉污染。目前现有仪器一般对液滴采用终点检测的方法，易出现假阳性信号。因此采用氟油型的分子表面活性剂依然有较大的缺陷。
基于目前的表面活性剂合成步骤复杂，价格昂贵，批次间差异大，以及液滴稳定性不足，液滴之间存在交叉污染等缺点，需要有一种一步法合成纳米粒子表面活性剂的简单方法。
发明内容
本发明第一目的针对现有的表面活性剂存在合成复杂，批次间差异大，价格昂贵等缺点，提供一种简单、批次间差异小的纳米粒子表面活性剂合成方法。
本发明第二目的利用此种方法的合成的表面活性剂稳定的液滴实现在医疗诊断，生物、化学检测分析，材料合成等领域的应用，尤其在单分子检测领域的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种简单、批次间差异小的纳米粒子表面活性剂方法，包括：
1)将全氟硅烷试剂，正硅酸酯，醇，水混合，其中全氟硅烷试剂与正硅酸酯可以在碱性，中性或酸性的条件下可以发生共水解，然后缩聚成为二氧化硅纳米粒子表面活性剂，调整反应物的比例，可以调整纳米粒子的大小以及纳米粒子在油水界面的接触角。
其中，在本发明中全氟硅烷试剂，正硅酸酯，醇，水的体积比范围为0.1-5：1-10：20-100：0.5-10；
在本发明中，水解优选在碱性条件下进行。所述的碱性条件可加入碱性物质产生。碱性条件优选为加入氨水。全氟硅烷试剂，正硅酸酯，醇，水、氨水的体积比范围为0.1-5：1-10：20-100：0.5-10；0.5-10。其中，所述的氨水的浓度范围可以为1％-浓氨水，优选为25％浓氨水。
在一实施例中，全氟硅烷试剂，正硅酸酯，醇，水的最优选体积比为1：4：50：2。
2)将分散在水相中的纳米粒子通过离心去掉上清，然后加入氟油，超声，重新分散在氟油中，得到分散在氟油中纳米粒子表面活性剂。
所述的全氟硅烷试剂包括：全氟烷基三乙氧基硅烷，全氟烷基三氯硅烷，全氟烷基单氯硅烷。
所述的正硅酸酯包括：正硅酸甲酯，正硅酸乙酯，正硅酸丙酯，正硅酸丁酯。
所述的醇包括：C1-C10的醇类。
所述的氟油包括：HFE-7100、HFE-7200、HFE-7500、HFE-71DA、HFE-71DE、HFE-72DA、HFE-72DE、HFE-71IPA、FC-3251、FC-3252、FC-3255、FC-3275、FC-3280、FC-3283、FC-3284、FC-40、FC-41、FC-43、FC-5311、FC-5312、FC-5320、FC-6003、FC-6064、FC-6047、FC-70、FC-72、FC-726、FC-75、FC-77、FC-770、FC-8270、FC-84、FC-87、GH135。
在另外的实施例中，本发明水解在中性和酸性条件下也可以反应。酸性条件可加入酸性物质产生，例如，可添加有机酸或无机酸等方式；中性条件可不加入其它物质产生。
pH值可以为3-11，更优选为5-10，最优为6-9。
本发明解决其技术问题所采用的另一方案是：
基于此类方法合成的纳米粒子表面活性剂用于液滴生成及微反应器构建，包括：
1、液滴生成
1)振荡法
将离散相与上述方法制备的连续相混合，在外力的作用下对离散相与连续相进行振荡，纳米子会吸附在油水界面处，降低油水界面的表面能，生成稳定的液滴。
2)基于微流控装置生成法
将离散相与上述方法制备的连续相装载在微流控装置上，在外力驱动下，水相被乳化成为大小均一稳定的液滴。其液滴尺寸可通过调整外力大小以及液滴生成结构进行调整。
所述的微流控装置包括：T字形或十字型等流体聚焦的液滴生成芯片，阶梯状液滴生成芯片，毛细管末端微震动液滴生成装置，毛细管阵列装置。
2、基于液滴生成技术，构建微反应器，包括：
将反应物分散在离散相中，利用上述方法制备微液滴，然后将微液滴置入所需要的反应条件。
离散相包括：纯水或水溶液。
本发明与背景技术相比具有的优点有：
1、无需后续修饰，一步法直接合成纳米粒子表面活性剂。本方法具有简单快速，高重复性等优点。
2、批次间差异小，所用原料易得，价格实惠。
3、基于此种表面活性剂生成的液滴稳定，无交叉污染，适用于高保真的分析。
4、此方法可进一步应用于医疗诊断，生物、化学检测分析，材料合成等领域，尤其在单分子检测领域。
附图说明
图1为基于一步法合成纳米粒子表面活性剂及其乳化的流程图。首先，如图1.a合成纳米粒子表面活性剂，然后将其重新分散在氟油中，其表面有氟链和硅羟基组成。然后与水相混合，在外力作用下，水相被氟油分散成小液滴，然后纳米粒子会吸附在油水界面，乳化成稳定的微液滴，如图1.b。
图2扫描电镜下基于一步法合成纳米粒子表面活性剂的纳米粒子形貌。
图3为基于一步法合成的纳米粒子表面活性所乳化得液滴，其在扫面电镜下的表面形貌。从图中可以看出，其纳米颗粒直径在100nm左右。
图4为用于液滴生成的芯片结构示意图。芯片结构包括上密封层、下密封层和通道层。上密封层包括油相入口，水相入口，液滴收集出口，通道层包括：通道，液滴生成区。1、相进样口，2、上密封层，3、液滴收集出口，4、油相进样口，5、通道，6、通道层，7、液滴生成区，8、液滴，9、下密封层。
图5为基于图4的液滴生成芯片所生成的液滴。其标尺为300μm，
图6为基于图5的液滴进行的液滴直径统计图，其液滴直径为105μm左右，变异系数为2.2％
图7为基于表面活性剂稳定的液滴其保真性的测试，其中图7.a为纳米粒子表面活性剂所稳定的两种含有不同试卤灵荧光染料浓度的液滴。(i)，(ii)，(iii)，分别为室温孵育0h，2h，24h，从图中可以看出，两种液滴的荧光强度基本没有变化，表明液滴于液滴之间的物质发生交换，证明纳米粒子所稳定的液滴具有高真性。图7.b为另外一种常见的用于液滴生成的分子型表面活性剂EA，其所稳定的两种液滴于7.a相同。(i)，(ii)，(iii)，分别为孵育0h，2h，24h，从图中可以看出，两种液滴的荧光强度随着时间发生明显的改变，高荧光强度的液滴其荧光强度逐渐减弱，低荧光强度的液滴其荧光逐渐增强，最终趋于一致。表明此种分子型的表面活性剂不能很好的阻止液滴于液滴之间的物质交换，不具有好的保真性。
图8为基于一步法合成的纳米粒子表面活性剂用于单分子核酸检测示意图。首先将PCR反应液接入于图4芯片的水相入口，将目标链分散在微液滴中，经过PCR循环后，通过荧光显微镜读取其荧光信号，然后进行绝对定量统计分析。
图9为经过PCR循环之后的荧光信号图，其标尺为500μm。
图10为经过PCR循环后，实际的数字化信号值与理论的数字化信号值的对比图。
具体实施方式
在本发明的较佳实例中，纳米粒子的大小为100nm,纳米粒子表面活性剂浓度为2-5％，液滴直径为50-150μm。
实施例1
基于一步法合成纳米粒子表面活性剂用于乳化
其流程参见图1，具体步骤如下。
1、纳米粒子表面活性剂合成
将全氟癸基三乙氧基硅烷与正硅酸乙酯试剂加入乙醇，水，氨水混合液中，其投入比例为体积比：1：4：50：2：1。剧烈搅拌，过夜反应，即可得到二氧化硅纳米粒子表面活性剂。其纳米粒子形貌参见图2。
2、将二氧化硅纳米粒子表面活性剂重悬在FC-40氟油中
1)将纳米粒子悬浮液置入离心管中，然后放入离心机7500rpm高速离心10min，将纳米粒子聚沉到底部，弃掉上清。
2)加入FC-40氟油到离心管中，然后放入超声清洗机中进行超声分散，使纳米粒子重新分散在氟油中，再重新放入离心机中10000rpm，高速离心20min，使纳米粒子聚沉到底部，弃去上清。
3)重复步骤3)三次。最后一次超声后，保留上清。即可得到分散在氟油中的二氧化硅纳米粒子表面活性剂。
3、乳化
将水与含有二氧化硅纳米粒子表面活性剂的氟油混合后，放至斡旋搅拌器中进行振荡，纳米粒子表面活性剂自组装在油水界面，即可产生油包水的乳化液滴。其组装结构参照图3。
实施例2
利用液滴生成芯片生成尺寸均一液滴
液滴生成芯片参照图片4所示，芯片结构包括上密封层、下密封层和通道层。上密封层包括油相入口，水相入口，液滴收集出口，通道层包括：通道，液滴生成区。
液滴生成具体步骤如下：用1ml的注射器吸入含有纳米粒子表面活性剂的油相，通过聚四氟乙烯管与芯片的油相入口连接，用微量注射泵进行流体的驱动；水相与油相步骤一致，只是将油相换成水相，与水相入口相连接。调整微量注射泵的驱动力，将油相与水相的流速调至合适的比例即可得大小均一的液滴，其液滴大小的变异系数可控制在2.5％以内，其液滴特征与均一性统计参照图5，图6。
实施例3
基于一步法合成纳米粒子表面活性剂稳定的液滴的保真性验证
其具体步骤如下：
1、利用纳米粒子表面活性剂稳定的液滴
1)将试卤灵染料分散在1x的PBS缓冲液中，配制两种浓度为12μM和3.5μM的试卤灵溶液。
2)液滴生成，其步骤如实施例2所述，将水相分别换成两种不同浓度的试卤灵溶液。
3)液滴生成完毕后，将两种液滴等比例混合，在室温下进行孵育。
用荧光显微镜观察孵育0h,2h,24h的荧光信号结果，然后对液滴的荧光值进行统计分析。液滴的荧光信号及荧光值统计参照图7.a
2、利用传统表面活性剂EA稳定的液滴
操作步骤如实施例3中1所述，将纳米粒子表面活性剂换成传统表面活性剂EA。液滴的荧光信号及荧光值统计参照图7.b。
实施例4
基于一步法合成纳米粒子表面活性剂稳定的液滴进行单分子核酸检测
其流程参照图8，具体步骤如下：
1)液滴生成，其步骤如实施案例2所述，生成直径为95μm的液滴。水相换成含有目标序列的PCR反应液。
2)将收集的液滴放置于PCR仪中，以95℃，10min 1cycles；95℃,18s；60℃，1min,40cycles条件进行扩增，完成样品反应，以荧光显微镜读取液滴荧光信息，然后进行绝对定量统计分析。其反应结果与统计结果参照图9,图10。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种纳米粒子表面活性剂的快速合成方法，其特征在于：包括
1)将全氟硅烷试剂，正硅酸酯，醇，水、混合，其中全氟硅烷试剂与正硅酸酯在碱性，中性或酸性的条件下共水解，然后缩聚成为二氧化硅纳米粒子表面活性剂，调整反应物的比例，可以调整纳米粒子的大小以及纳米粒子在油水界面的接触角；
其中，全氟硅烷试剂、正硅酸酯、醇、水的体积比为0.1-5：1-10：20-100：0.5-10；
2)将合成的纳米粒子重悬在氟油中以备使用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，全氟硅烷试剂包括全氟烷基三乙氧基硅烷，全氟烷基三氯硅烷，全氟烷基单氯硅烷中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，正硅酸酯包括正硅酸甲酯，正硅酸乙酯，正硅酸丙酯，正硅酸丁酯，正硅酸戊酯中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醇包括C1-C10的醇类。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氟油包括：HFE-7100、HFE-7200、HFE-7500、HFE-71DA、HFE-71DE、HFE-72DA、HFE-72DE、HFE-71IPA、FC-3251、FC-3252、FC-3255、FC-3275、FC-3280、FC-3283、FC-3284、FC-40、FC-41、FC-43、FC-5311、FC-5312、FC-5320、FC-6003、FC-6064、FC-6047、FC-70、FC-72、FC-726、FC-75、FC-77、FC-770、FC-8270、FC-84、FC-87、GH135中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，纳米粒子大小在5nm-5μm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在油水界面的接触角在90°～180°之间。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，纳米粒子在氟油中的质量分数在0.1％-20％。
9.根据权利要求1至8任何所述的一种方法在液滴生成及微反应器的构建中的应用。
10.根据权利要求1至8任一项所述的方法在医疗诊断，生物、化学检测分析，材料合成中的应用。
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