CN108072759A - 一种哈维氏弧菌快速检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种哈维氏弧菌快速检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于检测领域，具体涉及鱼虾等水产品以及养殖鱼虾塘中病原性哈维氏弧菌，适用于现场快速检测鱼虾塘中病原性哈维氏弧菌及其检测方法。所述哈维氏弧菌快速检测试剂盒包括哈维氏弧菌快速检测试纸条、已与多抗偶联的免疫磁珠液和层析液；所述层析液由Tween‑20、BSA和BS组成，其中Tween‑20体积百分比为5％‑10％，BSA浓度为0.15‑0.2mg/mL，层析液的pH为8‑9。本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，开发出一种适用于现场快速检测水产品虾中哈维氏弧菌快速检测方法；可以在肉眼可见范围内达到样品中哈维氏弧菌数量在可控范围内。

Description

一种哈维氏弧菌快速检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及鱼虾等水产品以及养殖鱼虾塘中病原性哈维氏弧菌，适用于现场快速检测鱼虾塘中病原性哈维氏弧菌及其检测方法。
背景技术
哈维氏弧菌是一种发光弧菌,广泛分布于近岸温暖的海水或海洋沉积物中，富集在海洋动物的体表或肠道内，尤其在虾苗中最常见。养殖虾户们发现感染哈维氏弧菌的养殖虾经常会出现体表肌肉不同程度的充血溃烂，并且某些部位在黑暗处可以发光，喂养一段时间会死亡，给养殖业带来巨大的损失。虾体感染哈维氏弧菌初期，虾苗的活动能力会有所下降,此时哈维氏弧菌在虾体内累积量少而尚未观察到荧光，可通过对虾体或水质进行检测，判断哈维氏弧菌是否超过控制线，以便及时对养殖环境进行调控，即可控制哈维氏弧菌繁殖与传播。虾体感染哈维氏弧菌中期即虾苗处于濒死状态时,可在黑暗中观察到微弱的荧光,这时一旦生长环境有利于哈维氏弧菌的繁殖，则会导致养殖虾类大量死亡，这一阶段无任何补救措施。故此，控制哈维氏弧菌浓度在感染中期很关键。
目前检测哈维氏弧菌手段主要包括传统培养分离法、分子生物学法、免疫学检测方法等，由于操作要求高并不适用于现场检测；所以开发一种适用于现场检测哈维氏弧菌的方法很有必要。
中国海洋大学发明了一种检测病原性哈维氏弧菌的试剂盒，其特征是采用聚合酶链式反应(PCR)技术，对病原性哈维氏弧菌DNA的特异性片断进行定性检测(专利号CN101838691A)，灵敏度高，但是没有检测限，不容易检测出样品中哈维氏弧菌的数量，因此不能有效控制虾塘环境。山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心公开了一种哈维氏弧菌的荧光定量快速检测方法，采用哈维氏弧菌特异性引物和探针,即可对水产品中哈维氏弧菌的数量进行检测与监控(专利号CN102618643A)，但是此方法成本高，多因素影响扩增效果，而且专业性较强，基层检测人员不易上手耗时长，不适合现场检测。因此本发明的主要任务是开发出一种既能简便快速检测，又能在肉眼可见范围检测样品中哈维氏弧菌数量在可控范围内。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，开发出一种适用于现场快速检测水产品虾中哈维氏弧菌快速检测方法；可以在肉眼可见范围内达到样品中哈维氏弧菌数量在可控范围内。
本发明体重的哈维氏弧菌快速检测试剂盒包括哈维氏弧菌快速检测试纸条、已与多抗偶联的免疫磁珠液和层析液；
所述哈维氏弧菌快速检测试纸条包括底板和底板的上表面自一端至另一端依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次交错粘贴在底板；所述硝酸纤维素膜为预包被有哈维氏弧菌多克隆抗体的检测线和山羊抗兔IgG的控制线的硝酸纤维素膜；
所述已与多抗偶联的免疫磁珠液是与哈维氏弧菌多抗偶联过的磁珠的溶液；
所述层析液由Tween-20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯)、BSA(牛血清白蛋白)和BS(硼酸盐缓冲液)组成，其中Tween-20体积百分比为5％- 10％，BSA浓度为0.15-0.2mg/mL，层析液的pH为8-9。
上述已与多抗偶联的免疫磁珠液的制备方法包括以下步骤：
(1)将磁珠分散均匀，磁分离，至澄清，弃上清液，用MEST(活化缓冲液)清洗，弃上清液；优选的，所述磁珠的固含量为10mg/mL，平均粒径为 180nm。
(2)依次加入MEST、0.25g/mL EDC(1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亚胺盐酸盐)和0.5g/mL NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，混合均匀，弃上清液；
其中，步骤(1)和(2)中所述MEST为含0.05％Tween-20体积百分比的pH值为5.0的0.01mol/L MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)溶液。
所述MEST溶液、EDC和NHS的体积比为485：5：10；
(3)依次加入BST(在0.05mol/L BS溶液中加入0.05％(v/v)Tween- 20)、哈维氏弧菌多抗，混合均匀，封闭30min，去上清，最终加入500μL保存液；
优选的，保存液为含1g/L NaN3、1g/L BSA的BST。
所述BST、哈维氏弧菌多抗与磁珠的比例为340-400μL：100-160μg：1mg。随着抗体加入量的增加，有效偶联到磁珠表面的抗体量也随之增加。抗体加入量达到140μg时，偶联量达到饱和，继续加大抗体量，偶联量基本保持不变，偶联率明显的呈现下降趋势。所以哈维氏弧菌多抗与磁珠的比例在100-160μg： 1mg时，效果最佳。
根据权利要求1中所述哈维氏弧菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述检测线上哈维氏弧菌多克隆抗体的包被量为117-233ng/cm，控制线上山羊抗兔 IgG的包被量为50-100ng/cm。在上述体系下，只有当包被量在这个范围内，才能有效的测试出哈维氏弧菌。
利用所述的磁性免疫层析试纸条进行哈维氏弧菌检测时采用双抗夹心检测原理，当待测样本中含有哈维氏弧菌时，哈维氏弧菌作为抗原先与已偶联免疫磁珠的多抗结合，随着层析作用的进行，当经过检测线时，未结合抗体的哈维氏弧菌与检测线处的哈维氏弧菌多抗结合从而停留在检测线处，继而显色，未被多抗捕获的免疫磁珠则继续前行；当经过控制线时，控制线处的二抗与已偶联免疫磁珠的多抗结合从而同样使磁珠停留在该处。整个层析反应在15-30分钟内完成，在检测线和控制线上出现肉眼清晰可见的显色条带。依据样品层析后形成肉眼可见的1～2条显色条带，实现致病性哈维氏弧菌的快速定性检测，其中阴性(哈维氏弧菌浓度＜5x104CFU·ml-1)只有控制线控制线显色，阳性(哈维氏弧菌浓度≥5x104CFU·ml-1)会有检测线和控制线同时显色。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：当虾体的哈维氏弧菌浓度小于3×104CFU/mL时,该虾塘的水质及虾苗均为正常状态；若哈维氏弧菌浓度在 3×104CFU/mL～3×106CFU/mL之间，则可通过防治措施来控制哈维氏弧菌的生长繁殖；若哈维氏弧菌浓度大于3×106CFU/mL，则需把所有虾打捞进行处理，并进行水质清理。本发明可以达到肉眼可见的阴阳性区别，无需仪器检测，浓度超过5×104CFU/mL则会有检测线和控制线同时显色。
附图说明
图1为本发明的试剂盒的示意图。
图2是本发明制得的试剂盒的检测结果示意图，其中1为阴性，2为阳性。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
磁珠：固含量为10mg/mL，平均平均粒径为180nm，上海奥润微纳新材料科技有限公司
MEST：含0.05％Tween-20体积百分比的pH值为5.0的0.01mol/L MES溶液。
BST：含0.05％Tween-20体积百分比的0.05mol/L BS溶液。
保存液：称量0.05g NaN3和0.05g BSA，用50mL BST溶解。
实施例1制备已与多抗偶联的免疫磁珠液：
1、吸取1mg磁珠于2mL离心管中，震荡30s，超声30s，置于磁力架上，至澄清，弃上清液，加入500mL MEST重复上述操作3次。
2、依次加入MEST 485μL、0.25g/mL EDC 5μL、0.5g/mL NHS 10μL，震荡30s，超声30s，置于垂直混合仪上旋转30min，丢弃上清。
3、依次加入400μL BST、100μg哈维氏弧菌多抗，置于垂直混合仪旋转 3h，封闭30min。弃上清，加入500μL保存液保存。
实施例2：制备层析液
层析液由Tween-20、BSA和BS组成，其中Tween-20体积百分比为 10％，BSA浓度为0.2mg/mL，层析液的pH为9。
实施例3：制备哈维氏弧菌快速检测试纸条：
所述哈维氏弧菌快速检测试纸条包括底板和底板的上表面自一端至另一端依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次交错粘贴在底板；所述硝酸纤维素膜为预包被有哈维氏弧菌多克隆抗体的检测线和山羊抗兔IgG的控制线的硝酸纤维素膜；所述检测线上哈维氏弧菌多克隆抗体的包被量为233ng/cm，控制线上山羊抗兔IgG 的包被量为100ng/cm。
测试结果1：
取实施例1中制得的已与多抗偶联的免疫磁珠液3μL，与实施例2中制得的层析液15μL、样品105μL混合均匀，滴加120μL该混合液于实施例3中制得的试纸条的样品垫上，层析15min后观察结果。阴性结果为仅控制线出现明显条带；阳性结果为检测线和控制线均出现明显的条带。如图2所示，标号2 为阴性，哈维氏弧菌浓度＜5x104CFU·ml-1；标号1为阳性，哈维氏弧菌浓度≥ 5x104CFU·ml-1。
样品的检测：参照样品的检测1中的方法，用致病性哈维氏弧菌、含TLH 和TDH致病基因的副溶血性弧菌33847、含TLH和TRH致病基因的副溶血性弧菌17802、大肠杆菌作为样品。在试纸条的样品垫上加120μL样品与磁珠混合物，层析15min后观察结果。阴性结果为仅控制线出现明显条带；阳性结果为检测线和控制线均出现明显的条带。
检测结果见下表。
对比例1：制备哈维氏弧菌快速检测试纸条
所述哈维氏弧菌快速检测试纸条包括底板和底板的上表面自一端至另一端依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次交错粘贴在底板；所述硝酸纤维素膜为预包被有哈维氏弧菌多克隆抗体的检测线和山羊抗兔IgG的控制线的硝酸纤维素膜；所述检测线上哈维氏弧菌多克隆抗体的包被量为58ng/cm，控制线上山羊抗兔IgG的包被量为25ng/cm。
测试结果2：
取实施例1中制得的已与多抗偶联的免疫磁珠液3μL，与实施例2中制得的层析液15μL、致病性哈维氏弧菌液105μL混合均匀，滴加120μL该混合液于实施例3和对比例1中制得的试纸条的样品垫上，层析15min后观察结果。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种哈维氏弧菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述哈维氏弧菌快速检测试剂盒包括哈维氏弧菌快速检测试纸条、已与多抗偶联的免疫磁珠液和层析液；
所述哈维氏弧菌快速检测试纸条包括底板和底板的上表面自一端至另一端依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次交错粘贴在底板；所述硝酸纤维素膜为预包被有哈维氏弧菌多克隆抗体的检测线和山羊抗兔IgG的控制线的硝酸纤维素膜；
所述已与多抗偶联的免疫磁珠液是与哈维氏弧菌多抗偶联过的磁珠的溶液；
所述层析液由Tween-20、BSA和BS组成，其中Tween-20体积百分比为5％-10％，BSA浓度为0.15-0.2mg/mL，层析液的pH为8-9。
2.根据权利要求1中所述哈维氏弧菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述已与多抗偶联的免疫磁珠液的制备方法包括以下步骤：
(1)将磁珠分散均匀，磁分离，至澄清，弃上清液，用MEST清洗，弃上清液；
(2)依次加入MEST、0.25g/mL EDC和0.5g/mL NHS，混合均匀，弃上清液；
所述MEST、EDC和NHS的体积比为485：5：10；
(3)依次加入BST、哈维氏弧菌多抗，混合均匀，封闭30min，去上清，最终加入500μL保存液；
所述BST、哈维氏弧菌多抗与磁珠的比例为340-400μL：100-160μg：1mg。
3.根据权利要求2中所述哈维氏弧菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠的固含量为10mg/mL，平均粒径为180nm。
4.根据权利要求2中所述哈维氏弧菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述MEST为含0.05％Tween-20体积百分比的pH值为5.0的0.01mol/L MES溶液。
5.根据权利要求2中所述哈维氏弧菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述BST为含0.05％Tween-20体积百分比的0.05mol/L BS溶液。
6.根据权利要求2中所述哈维氏弧菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述保存液为含1g/LNaN3、1g/L BSA的BST。
7.根据权利要求1中所述哈维氏弧菌快速检测试剂盒，其特征在于，所述检测线上哈维氏弧菌多克隆抗体的包被量为117-233ng/cm，控制线上山羊抗兔IgG的包被量为50-100ng/cm。
8.根据权利要求1-7中任何一种哈维氏弧菌快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于：将所述已与多抗偶联的免疫磁珠液、所述层析液和样品按照体积比1-5：15：105进行混合，滴加110-130μL该混合液于所述哈维氏弧菌快速检测试纸条的所述样品垫上。
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