CN109187966A - 利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法 - Google Patents

利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109187966A
CN109187966A CN201811083628.7A CN201811083628A CN109187966A CN 109187966 A CN109187966 A CN 109187966A CN 201811083628 A CN201811083628 A CN 201811083628A CN 109187966 A CN109187966 A CN 109187966A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacterium
aptamers
vibrio harveyi
micro
fluorescent marker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811083628.7A
Other languages
English (en)
Inventor
郑江
彭英林
鄢庆枇
刘慧敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jimei University
Original Assignee
Jimei University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jimei University filed Critical Jimei University
Priority to CN201811083628.7A priority Critical patent/CN109187966A/zh
Publication of CN109187966A publication Critical patent/CN109187966A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/28—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Vibrionaceae (F)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，涉及哈维氏弧菌的荧光标记和显微识别方法。待测样品处理；核酸适配体处理；核酸适配体与菌的结合和洗涤；涂片、固定和染色；荧光显微镜观察。将具有特异性识别哈维氏弧菌的适配体进行荧光标记，然后通过洗涤、染色等步骤，最后通过荧光显微镜实现对哈维氏弧菌的可视化显微识别和鉴定。利用核酸适配体对哈维氏弧菌的特异性识别作用，通过对适配体进行荧光标记，进而实现对哈维氏弧菌的荧光标记，然后通过荧光显微镜来观察核酸适配体与目标菌结合后的荧光，实现对哈维氏弧菌的显微识别和鉴定。

Description

利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法
技术领域
本发明涉及一种哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的荧光标记和显微识别方法，尤其是涉及利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法。
背景技术
中国水产养殖为世界水产业的发展做出了巨大的贡献。但随着海水养殖业迅速发展和集约化养殖规模的逐渐扩大，海水养殖病害也呈多发趋势，每年约有10％的水产养殖动物死于感染性病害，而且相当多的疾病为弧菌感染所导致。因此建立病原弧菌的早期快速检测技术，对预防相应病害的发生和流行就显得极其重要。
哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是革兰氏阴性菌，菌体呈杆状，极生单鞭毛运动。它广泛存在于海洋环境中，是水产养殖中重要的条件致病菌，主要感染对象是对虾和鱼等，并可通过食物链引起人类食物中毒，危害人类健康。
核酸适配体(Aptamer)是利用体外筛选技术——指数富集配体的系统进化技术(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中筛选得到的寡核苷酸片段。经过研究发现，核酸适配体可以折叠成一定的三维空间立体结构，比如：假结、发卡、G-四链体、鼓包等。核酸适配体利用这些特殊的结构位点，通过静电作用、氢键作用、堆积作用、疏水作用和形状匹配等多种相互作用力，能够与靶标物质形成高亲和力复合物，从而实现对靶标物质的特异性识别结合。
发明内容
本发明的目的是提供操作简单，检测快速，大大缩短检测周期，在水产病原弧菌快速检测中具有较好应用前景的利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法。
本发明的具体步骤如下：
1)待测样品处理；
在步骤1)中，所述待测样品处理的具体方法可为：取待测菌悬液样品，6000rpm离心5min，去除上清后用0.9％生理盐水洗涤菌沉淀1次，然后用0.9％生理盐水重悬菌沉淀。
2)核酸适配体处理；
在步骤2)中，所述核酸适配体处理的具体方法可为：取已在5′端标记了荧光基团的哈维氏弧菌的核酸适配体，用2×结合缓冲液稀释配制成3.33nmol/L的溶液，然后在95℃变性30min，再冰浴10min，所述2×结合缓冲液可将20×结合缓冲液用超纯水稀释20倍所得，所述20×结合缓冲液的配制方法如下：分别称取3.725g的氯化钾、5.844g的氯化钠、2.033g的六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)和6.06g的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，然后将称量的物质用超纯水定容至100ml，调节混合溶液的pH值至7.4，再放入4℃冰箱储存、备用；所述5′端标记了荧光基团可为荧光基团异硫氰酸荧光素。
3)核酸适配体与菌的结合和洗涤；
在步骤3)中，所述核酸适配体与菌的结合和洗涤的具体方法可为：取100μl稀释处理好的适配体分别与100μl待测菌液混合，于常温100rpm的摇床中混合结合30min，然后6000rpm离心5min，弃上清，菌沉淀用1×结合缓冲液洗涤2次，最后用2×结合缓冲液100μl重悬菌沉淀得到结合了适配体的待测菌悬液；同时做一空白对照，即取100μl的2×结合缓冲液(代替原来的适配体)，与100μl待测菌液混合，于常温100rpm的摇床中混合30min，然后6000rpm离心5min，弃上清，菌沉淀用1×结合缓冲液洗涤2次，最后用2×结合缓冲液100μl重悬菌沉淀，即可得到未结合适配体的空白对照菌悬液。
4)涂片、固定和染色；
在步骤4)中，所述涂片、固定和染色的具体方法可为：从步骤3)结合适配体的待测菌悬液和未结合适配体的空白菌悬液中分别取相同量的1～10μl菌液涂布于载玻片上，避光干燥后，用酒精灯轻微加热，使菌固定，可见载玻片中央有白色的菌，然后分别向两种载玻片中滴加50μl 0.05g/ml的番红染液，染色2min，然后水洗，载玻片用滤纸吸干，避光干燥，最后在荧光显微镜下观察；所述两种载玻片包括涂布1～10μl菌液的载玻片和中央有白色菌的载玻片。
5)荧光显微镜观察。
在步骤5)中，所述荧光显微镜观察的具体方法可为：空白对照载玻片在显微镜的可见光下(明场下)可看到相应的细菌带，但在荧光下视野中均为黑暗、无荧光亮点；而与适配体进行结合处理后的待测菌载玻片在显微镜的可见光下(明场下)也可看到相应的细菌带，在荧光下如果相应的细菌带都出现明显的、大量的荧光亮点，说明该待测菌为哈维氏弧菌；如果相应的细菌带没有出现较明显的、大量的荧光亮点，说明该待测菌不是哈维氏弧菌。
本发明将具有特异性识别哈维氏弧菌的适配体进行荧光标记，然后通过洗涤、染色等步骤，最后通过荧光显微镜实现对哈维氏弧菌的可视化显微识别和鉴定。
与现有的哈维氏弧菌的识别标记技术相比较，本发明利用了核酸适配体对哈维氏弧菌的特异性识别作用，通过对适配体进行荧光标记，进而实现对哈维氏弧菌的荧光标记，然后通过荧光显微镜来观察核酸适配体与目标菌结合后的荧光，实现对哈维氏弧菌的显微识别和鉴定。
附图说明(各图均是在荧光显微镜40倍镜下的图片)
图1为哈维氏弧菌的明场图。
图2为哈维氏弧菌的荧光图。
图3为与核酸适配体结合后的哈维氏弧菌的明场图。
图4为与核酸适配体结合后的哈维氏弧菌的荧光图。
图5为与核酸适配体结合后溶藻弧菌的明场图。
图6为与核酸适配体结合后溶藻弧菌的荧光图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明实施例的具体步骤如下：
1)待测样品处理：取待测菌悬液样品，常温下6000rpm离心5min，去除上清后用0.9％生理盐水洗涤菌沉淀1次，然后用0.9％生理盐水重悬菌沉淀。
2)核酸适配体的处理：取已在5′端标记了荧光基团(如异硫氰酸荧光素)的哈维氏弧菌的核酸适配体，用2×结合缓冲溶液稀释配制成3.33nmol/L的溶液，然后在95℃变性30min，再冰浴10min。所述20×结合缓冲液配制：分别称取3.725g的氯化钾，5.844g的氯化钠，2.033g的六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)和6.06g的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)，然后将称量的物质用超纯水定容至100ml，调节混合溶液的pH值至7.4，即可将其放入4℃冰箱储存、备用。2×结合缓冲液是将20×结合缓冲液用超纯水稀释20倍所得。
3)结合和洗涤：取100μl稀释处理好的适配体分别与100μl待测菌液混合，于常温100rpm的摇床中结合30min，然后6000rpm离心5min，弃上清，菌沉淀用1×结合缓冲液洗涤2次，最后用2×结合缓冲液100μl重悬菌沉淀得到结合了适配体的待测菌悬液。同时做一空白对照，即取100μl的2×结合缓冲液(代替原来的适配体)，与100μl待测菌液混合，于常温100rpm的摇床中混合30min，然后6000rpm离心5min，弃上清，菌沉淀用1×结合缓冲液洗涤2次，最后用2×结合缓冲液100μl重悬菌沉淀，得到未结合适配体的空白对照菌悬液。同时按同样方法做一空白对照，即用2×结合缓冲液代替适配体，与待测菌液混合，按同样的方法进行结合、离心、洗涤和重悬，得到未结合适配体的空白对照菌液。
4)涂片、固定和染色：从上述结合了适配体的待测菌悬液和未结合适配体的空白菌悬液中分别取一定量的菌液涂布于载玻片上，避光干燥后，用酒精灯轻微加热，使菌固定，此时可见玻片中央有白色的菌。然后分别向两种玻片中滴加50μl 0.05g/ml的番红染液，染色2min，然后水洗，玻片用滤纸吸干，避光干燥，最后在荧光显微镜下观察。
5)荧光显微镜观察：空白对照玻片在显微镜的可见光下(明场下)可看到相应的细菌带(如图1)，但在荧光下视野中均为黑暗、无荧光亮点(如图2)；而与适配体进行结合处理后的待测菌玻片在显微镜的可见光下(明场下)也可看到相应的细菌带(如图3和5)，在荧光下如果相应的细菌带都出现明显的、大量的荧光亮点，说明该待测菌为哈维氏弧菌(如图4)，如果相应的细菌带没有出现较明显的、大量的荧光亮点，说明该待测菌不是哈维氏弧菌(如图6)。

Claims (8)

1.利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于其具体步骤如下：
1)待测样品处理；
2)核酸适配体处理；
3)核酸适配体与菌的结合和洗涤；
4)涂片、固定和染色；
5)荧光显微镜观察。
2.如权利要求1所述利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于在步骤1)中，所述待测样品处理的具体方法为：取待测菌悬液样品，6000rpm离心5min，去除上清后用0.9％生理盐水洗涤菌沉淀1次，然后用0.9％生理盐水重悬菌沉淀。
3.如权利要求1所述利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于在步骤2)中，所述核酸适配体处理的具体方法为：取已在5′端标记了荧光基团的哈维氏弧菌的核酸适配体，用2×结合缓冲液稀释配制成3.33nmol/L的溶液，然后在95℃变性30min，再冰浴10min，所述2×结合缓冲液将20×结合缓冲液用超纯水稀释20倍所得，所述20×结合缓冲液的配制方法如下：分别称取3.725g的氯化钾、5.844g的氯化钠、2.033g的六水合氯化镁和6.06g的三羟甲基氨基甲烷，然后将称量的物质用超纯水定容至100ml，调节混合溶液的pH值至7.4，再放入4℃冰箱储存、备用。
4.如权利要求3所述利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于所述5′端标记了荧光基团为荧光基团异硫氰酸荧光素。
5.如权利要求1所述利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于在步骤3)中，所述结合和洗涤的具体方法为：取100μl稀释处理好的适配体分别与100μl待测菌液混合，于常温100rpm的摇床中混合结合30min，然后6000rpm离心5min，弃上清，菌沉淀用1×结合缓冲液洗涤2次，最后用2×结合缓冲液100μl重悬菌沉淀得到结合了适配体的待测菌悬液；同时做一空白对照，即取100μl的2×结合缓冲液，与100μl待测菌液混合，于常温100rpm的摇床中混合30min，然后6000rpm离心5min，弃上清，菌沉淀用1×结合缓冲液洗涤2次，最后用2×结合缓冲液100μl重悬菌沉淀，即可得到未结合适配体的空白对照菌悬液。
6.如权利要求1所述利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于在步骤4)中，所述涂片、固定和染色的具体方法为：从步骤3)结合适配体的待测菌悬液和未结合适配体的空白菌悬液中分别取相同量的1～10μl菌液涂布于载玻片上，避光干燥后，用酒精灯轻微加热，使菌固定，载玻片中央有白色的菌，然后分别向两种载玻片中滴加50μl 0.05g/ml的番红染液，染色2min，然后水洗，载玻片用滤纸吸干，避光干燥，最后在荧光显微镜下观察。
7.如权利要求6所述利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于所述两种载玻片包括涂布1～10μl菌液的载玻片和中央有白色菌的载玻片。
8.如权利要求1所述利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法，其特征在于在步骤5)中，所述荧光显微镜观察的具体方法为：空白对照载玻片在显微镜的可见光下出现相应的细菌带，但在荧光下视野中均为黑暗、无荧光亮点；而与适配体进行结合处理后的待测菌载玻片在显微镜的可见光下出现相应的细菌带，在荧光下如果相应的细菌带都出现荧光亮点，说明该待测菌为哈维氏弧菌；如果相应的细菌带没有出现荧光亮点，说明该待测菌不是哈维氏弧菌。
CN201811083628.7A 2018-09-17 2018-09-17 利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法 Pending CN109187966A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811083628.7A CN109187966A (zh) 2018-09-17 2018-09-17 利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811083628.7A CN109187966A (zh) 2018-09-17 2018-09-17 利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109187966A true CN109187966A (zh) 2019-01-11

Family

ID=64911905

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811083628.7A Pending CN109187966A (zh) 2018-09-17 2018-09-17 利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109187966A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112175961A (zh) * 2020-10-26 2021-01-05 集美大学 一种具有靶向抑制鳗弧菌的核酸适配体h11及其应用
CN113278621A (zh) * 2021-05-14 2021-08-20 广西科学院 一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1527056A (zh) * 2003-09-25 2004-09-08 中国科学院南海海洋研究所 快速检测哈氏弧菌的试剂盒及检测方法
US20150044699A1 (en) * 2013-08-07 2015-02-12 National Cheng Kung University Vibrio harveyi-specific binding down syndrome cell adhesion molecule, method for identification thereof and use thereof
CN104388422A (zh) * 2014-10-24 2015-03-04 集美大学 寡核苷酸序列及其制备方法与应用
CN107619850A (zh) * 2017-09-08 2018-01-23 集美大学 一种基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法
CN108072759A (zh) * 2017-12-28 2018-05-25 上海海洋大学 一种哈维氏弧菌快速检测试剂盒及其使用方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1527056A (zh) * 2003-09-25 2004-09-08 中国科学院南海海洋研究所 快速检测哈氏弧菌的试剂盒及检测方法
US20150044699A1 (en) * 2013-08-07 2015-02-12 National Cheng Kung University Vibrio harveyi-specific binding down syndrome cell adhesion molecule, method for identification thereof and use thereof
CN104388422A (zh) * 2014-10-24 2015-03-04 集美大学 寡核苷酸序列及其制备方法与应用
CN107619850A (zh) * 2017-09-08 2018-01-23 集美大学 一种基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法
CN108072759A (zh) * 2017-12-28 2018-05-25 上海海洋大学 一种哈维氏弧菌快速检测试剂盒及其使用方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张庆庆: "基于核酸适配体的两种水产病原弧菌检测技术的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
鄢庆枇 等: "应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的河流弧菌", 《海洋科学》 *
金征宇 等主编: "《基因与纳米探针——医学分子成像理论与实践 上卷》", 30 November 2017, 天津科学技术出版社 *
顾月清 等主编: "《全国普通高等院校生物医学工程规划教材 生物医学工程技术》", 30 June 2017, 中国医药科技出版社 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112175961A (zh) * 2020-10-26 2021-01-05 集美大学 一种具有靶向抑制鳗弧菌的核酸适配体h11及其应用
CN112175961B (zh) * 2020-10-26 2022-03-22 集美大学 一种具有靶向抑制鳗弧菌的核酸适配体h11及其应用
CN113278621A (zh) * 2021-05-14 2021-08-20 广西科学院 一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bergman et al. Phycomyces
CN109187966A (zh) 利用适配体对哈维氏弧菌进行荧光标记和显微识别的方法
CN109055381B (zh) 用于鳗弧菌特异性识别的ssDNA核酸适配体及筛选与应用
CN107893101A (zh) 一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒、方法及应用
CN103502465B (zh) 使用荧光标记了的l-葡萄糖衍生物检测癌细胞的方法以及含有该衍生物的癌细胞的显像剂
CN104789568B (zh) 一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的dna核酸适配体及其筛选方法和应用
CN104789696B (zh) 一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的dna核酸适配体及其筛选方法和应用
CN104789569B (zh) 一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的dna核酸适配体及其筛选方法和应用
CN105176997B (zh) 一种副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和鰤诺卡氏菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法
CN107669697A (zh) Dna四面体在抑制阿尔兹海默细胞凋亡中的应用
CN105043842B (zh) 一种用于确定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)侵染小麦组织的染色方法
CN107858359A (zh) 一种可特异性识别溶藻弧菌的核酸适配体及其应用
CN109161547A (zh) 一种核酸适配体及其在检测致病性溶藻弧菌中的应用
CN109136229A (zh) 特异性识别卵形鲳鲹源神经坏死病毒的核酸适配体及其应用
CN105754927B (zh) 缢江蓠原生质体的制备方法
Vervoort et al. Studying AnnelidaRegeneration Using Platynereis dumerilii
CN109187970B (zh) 一种快速检测水产病害金标核酸试纸条及其制备方法
CN101956002A (zh) 使用微颗粒多重检测法检测非整倍性的方法
CN102876809B (zh) 一种草鱼呼肠孤病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN109207480A (zh) 特异性针对卵形鲳鲹神经坏死病毒的核酸适配体及其应用
Darken Natural and induced fluorescence in microscopic organisms
CN107937404A (zh) 一种核酸适配体及其在识别、检测溶藻弧菌中的应用
Mohan et al. Fluorescent nanodiamond–A novel nanomaterial for in vivo applications
Jakob et al. Phototaxis assays of Synechocystis sp. PCC 6803 at macroscopic and microscopic scales
CN104789570B (zh) 一种用于检测石斑鱼虹彩病毒感染的dna核酸适配体及其筛选方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190111

RJ01 Rejection of invention patent application after publication