CN109164098A

CN109164098A - 一种乙酰胆碱检测试纸条及其应用

Info

Publication number: CN109164098A
Application number: CN201811202196.7A
Authority: CN
Inventors: 韩磊; 吴加慧; 李峰
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2019-01-08
Anticipated expiration: 2038-10-16
Also published as: CN109164098B

Abstract

本发明涉及纳米催化、生物医学、分析化学领域，具体包括一种乙酰胆碱检测试纸条及其应用。在试纸条上原位生成具有仿过氧化物酶活性的纳米材料并修饰上乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶，测试样品中的乙酰胆碱可在上述试纸条上串联酶的催化下生成过氧化氢使有机显色试剂显色从而实现对乙酰胆碱的定性检测，并可通过层析现象有效排除干扰。通过手机拍照及手机软件分析可实现对乙酰胆碱的定量检测。该发明可应用于医学检测、生化分析等领域。

Description

一种乙酰胆碱检测试纸条及其应用

技术领域

本发明涉及分析化学领域及生物医学领域，具体包括一种乙酰胆碱检测试纸条及其应用。

背景技术

乙酰胆碱（Acetylcholine，简称ACh）作为一种神经递质，在神经细胞中是由胆碱和乙酰辅酶A在胆碱乙酰移位酶的催化作用下合成的。ACh能特异性地作用于各类胆碱受体，在组织内能被胆碱酯酶水解破坏。ACh作用广泛，对神经系统、心血管系统及胃肠道都有明显作用。脑内的ACh与认知活动、神经信号的传递密切相关。有研究表明人体内该物质含量与阿尔兹海默病的症状改善相关。ACh的传统检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法，虽然这些方法结果较为准确，但是存在检测所需的仪器设备体积笨重、所需物品价格昂贵、样品处理过程复杂、检测过程需要专业人员进行等缺点。为克服上述缺点，基于生物酶的光学测定法出现了，该方法主要是利用乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，简称AChE）可以选择性催化ACh水解成胆碱和乙酸，再通过胆碱氧化酶（Choline Oxidase，简称ChOx）催化胆碱而生成过氧化氢（H₂O₂），过氧化物酶或具有过氧化物酶活性的纳米酶可催化H₂O₂氧化有机底物产生荧光或颜色产物，从而实现ACh的荧光检测（C. I. Wang, W. T.Chen, H. T. Chang. Analytical Chemistry, 2012, 84 : 9706）与紫外检测（S. B. He,G. W. Wu, H. H. Deng, A. L. Liu, G. W. Li, X. H. Lin, X. H. Xia, W. Chen.Biosensors and Bioelectronics, 2014, 6（6）：1543）。但是这两种方法也分别具有检测仪器笨重、检测样品需提纯处理麻烦，需分步反应不能实时检测等缺点。

AChE能选择性水解ACh，参与细胞的发育和成熟、促进神经元眼、老年痴呆、重症肌无力等）的参考指标。ChOx可以水解由ACh水解产生的胆碱生成H₂O₂，从而可以通过检测H₂O₂来间接证明ACh的存在。

纳米酶是一种新型的模拟酶，由于其优异的催化活性和在生物传感、食品工艺、环境保护等方面有潜在应用价值而成为人们关注的焦点。纳米酶克服了天然酶的许多缺点，如价格昂贵、易失活和储存条件要求苛刻等，对生物传感、免疫分析、癌症诊断和治疗等领域产生了巨大影响。目前已报道四氧化三铁（Fe₃O₄）纳米酶具有仿过氧化物酶活性，可催化氧化H₂O₂氧化有机显色底物而产生颜色变化。目前，关于纸上原位生成纳米酶的报道还很少见。

检测试纸条因其体积较小，储存方便，测试简单而广受欢迎。目前，已报道的试纸有尿糖试纸、HIV试纸、毒品检测试纸等。但尚未见关于ACh试纸条及智能手机定量检测的报道。虽然有纳米酶用于免疫试纸条的报道，但未见纳米酶用于小分子检测的试纸条的报道，并且两者机理完全不明。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测ACh的试纸条。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测ACh的试纸条及其应用，所述的以滤膜为基底的试纸条可定性定量检测ACh。

优选的是，所述试纸条包括样品垫、滤膜、测试条带、控制条带、吸收垫、塑料基底六部分。

进一步优选的是，所述ACh检测试纸条的制备过程如下：

（1）将10%的牛血清蛋白（BSA）溶液、1 mmol/L的羟基丁二酰亚胺（NHS）、0.5 mmol/L的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）混合液滴加到滤膜上，室温下孵育30min后，水洗并干燥；

（2）将4 mmol/L的氯化铁溶液（FeCl₃）、2 mmol/L的氯化亚铁溶液（FeCl₂）和16 mmol/L的氨水等体积按顺序依次均匀分散到上步中所得到的滤膜上，室温下孵育1 h后，水洗并干燥；

（3）将一定浓度的AChE和ChOx分别滴加到上述的滤膜上，孵育1 h后，室温下水洗并干燥；

（4）将上步所得滤膜用裁纸机剪为0.2×0.5 cm的试纸带作为检测条带；

（5）将步骤（2）中所得的滤膜使用裁纸机裁剪为0.2×0.5 cm的试纸条带作为控制条带；

（6）将样品垫、滤膜、测试条带、控制条带和吸收垫按顺序从右到左彼此接触并粘贴到塑料基底上。

再一步优选的是，所述样品垫为玻璃纤维，所述纤维素膜可以为硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜、吸水纸，所述吸收垫为吸水纸。

所述试纸条可在室温，弱酸性条件下对ACh进行定性/定量检测，定性定量检测过程如下：

（1）对含有ACh的样品溶液，加入0.5 mmol/L的有机显色剂（显色剂为3，3'-二氨基联苯胺（DAB）或3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（TMB））并调节pH至弱酸性（pH4.0），将15 μL待测溶液滴加到ACh检测试纸条的样品垫上；

（2）2-5 min后观测试纸条上的检测条带与控制条带，若检测条带颜色比控制条带颜色深，则说明样品中含有ACh，从而进行定性检测；

（3）将加有样品与显色剂的试纸条，在LED灯的照射下用智能手机拍照，使用颜色识别器读取具体检测条带的RGB值，并令B_N=B/(R+G+B)，带入B_N-浓度曲线方程以计算ACh含量，从而实现对ACh的定量检测。

本发明的效果是：

1. 本发明制备了可快速、现场检测ACh的定性定量试纸条；

2. 本发明通过在纸上原位生成Fe₃O₄仿酶材料，而简化试纸条制备步骤；

3. 本发明利用原位生成Fe₃O₄仿酶材料上的BSA实现两种生物酶的快速固定，提高了天然酶的稳定性，并可改变天然酶的活性pH范围，使两种生物酶与仿酶材料同时发挥活性；

4. 本发明所制备的试纸条可通过层析策略排除真实样品中血细胞、有色蛋白等杂质的干扰。

附图说明：

图1为本发明所制备的ACh检测试纸条控制条带和检测条带的示意图；

图2为本发明所制备的ACh检测试纸条构造图；

图3为本发明实施例提供的ACh检测示意图；

图4为本发明实施例提供的检测条带的活性效果图；

图5为本发明实施例提供的pH优化效果图；

图6为本发明实施例提供的试纸条检测照片；

图7为本发明实施例提供的ACh检测工作曲线。

具体实施方式

为了更清楚更深入地说明本发明的内容，下面将进一步列举一些实施例，但本发明不局限于所列举的实施例。下列实施例中具体实验条件或方法如未注明，均按本领域的常规条件或方法进行。

实施例1

试纸条的制备：

（1）将10%的BSA、1 mmol/L的NHS、0.5 mmol/L的EDC混合液滴加到尼龙滤膜上（BSA用于提高尼龙滤膜的吸附能力并作为下一步反应的模板，EDC/NHS则是为了活化BSA是上的羧基），室温下孵育30 min后，水洗并干燥；

（2）将4 mmol/L的FeCl₃溶液、2 mmol/L的FeCl₂溶液和16 mmol/L的氨水等体积按顺序先后分散到步骤（1）中所得到的吸附有BSA模板的尼龙滤膜上孵育1 h并在室温下干燥，从而在滤膜上原位生成以BSA为模板的四氧化三铁纳米粒子（Fe₃O₄ NPs），冲洗掉未反应的FeCl₃、FeCl₂和氨水，然后在室温下晾干；

（3）将一定浓度的AChE和ChOx滴加到第（2）步中生成Fe₃O₄@BSA NPs的尼龙滤膜上室温下孵育1 h，将Fe₃O₄ NPs上的羧基与酶上的氨基通过酰胺反应连接到一起，水洗掉未连接的酶后在室温下晾干；

（4）将上述连接有酶的尼龙滤膜用裁纸机剪为0.2×0.5 cm的试纸带作为检测条带，具体示意图见说明书附图1（b）所示；

（5）将步骤（2）中所得的滤膜使用裁纸机裁剪为0.2×0.5 cm的试纸条带作为控制条带，具体示意图见说明书附图1（a）所示；

（6）将样品垫、尼龙滤膜、测试条带、控制条带和吸收垫从右到左依次叠加并粘贴到塑料基底上，具体示意图见说明书附图2。

实施例2

该试纸条中的检测条带在弱酸性条件下具有AChE、ChOx与仿过氧化物酶的活性，AChE可催化ACh生成胆碱，ChOx则可催化胆碱生成H₂O₂，仿过氧化物酶则催化H₂O₂和有机显色剂发生显色反应，检测示意图见说明书附图3。

检测条带活性验证：

实验体系a：催化反应体系为包含ACh的样品溶液（0.1 mmol/L）、上述实施例获得的检测条带（0.2×0.5 cm）、有机显色剂TMB（0.5 mmol/L）和醋酸盐缓冲液（pH 4.0， 100 mmol/L）。在室温（25 ℃）下将检测条带浸入含ACh和TMB的缓冲溶液中反应5min后，将检测试纸条移除，利用紫外分光光度计检测其在500-800 nm内的吸光值，（反应所用有机显色剂还可为DAB）。

另做两个对照试验：其中一个对照实验b的催化反应体系中不加检测条带，在与上述实验体系同样条件下反应5分钟后检测吸光值；另一份对照实验c的催化反应体系为检测条带（0.2×0.5 cm）浸入醋酸盐缓冲液（pH 4.0， 100 mmol/L）中，在与上述实验体系同样条件下静置5分钟后检测吸光值。

如说明书附图4所示，实验体系a显示出明显的峰，说明检测条带在pH 4.0处具有明显的三酶的活性；对照试验b在650 nm附近无明显的峰，说明若无检测条带作催化剂将无明显反应；对照试验c在650 nm附近无明显的峰，说明实验体系a的峰不是检测试纸条自身的响应峰。

实施例3

检测条带的pH优化：

催化反应体系为：含有ACh的样品溶液（100 µmol/L）、检测条带（0.2×0.5 cm）、有机显色剂TMB（0.5 mmol/L）和不同pH的缓冲液（pH 1.0−2.0，甘氨酸-盐酸缓冲液；pH 3.0−6.0，醋酸-醋酸钠缓冲液；pH 6.5−8.0，磷酸盐缓冲液；pH 9.0−10.0，Tris−盐酸缓冲液；pH 11.0−12.0，碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液）。在室温（25 ℃）下反应5分钟后，将检测条带取出，利用酶标仪检测反应液在650 nm处的吸光值。如说明书附图5所示，检测条带在酸性pH下（pH3.0−6.0）表现出三酶活性的活性，并且最适pH在4.0左右。

实施例4

ACh的定性分析

具体体系：未知成分的血清溶液，溶液调节pH至弱酸性，并加入0.5 mmol/L TMB，将15μL混合溶液滴加到检测试纸条上，5 min后观测检测条带与控制条带的颜色，若检测条带颜色比控制条带颜色深，则血清中含有ACh，若检测条带与控制条带无颜色差，则血清中无ACh。具体检测照片如说明书附图6所示。说明本发明所制备的ACh检测试纸条可以定性检测ACh。

实施例5

ACh的定量检测

检测体系为：包含不同浓度ACh的血清溶液（0-10 μmol/L），调节pH至弱酸性，分别将含有血清样品滴加到所制备的试纸条上，5 min后，按检测浓度从小到大的顺序将试纸条进行排序，在LED灯的照射下用智能手机拍照，使用颜色识别器读取具体的RGB值，并由RGB值计算其标准工作曲线，令B_N=B/(R+G+B)。具体工作曲线如说明书附图7所示，线性范围为0-500nmol/L，方程为y=0.0024x+0.67，（R²=0.9908）。说明本发明所制备的ACh检测试纸条可定量检测ACh。

Claims

1.一种乙酰胆碱检测试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品垫、滤膜、测试条带、控制条带、吸收垫、塑料基底六部分。

2.根据权利要求1所述的一种乙酰胆碱检测试纸条，其特征在于，所述试纸条制备过程如下：

（1）将10%的牛血清蛋白（BSA）溶液、1 mmol/L的羟基丁二酰亚胺（NHS）、0.5 mmol/L的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）等体积混合液滴加到滤膜上，室温下孵育30 min后，水洗并干燥；

（3）将一定浓度的乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶分别滴加到上述的滤膜上，孵育1 h后，室温下水洗并干燥；

（4）将上步所得滤膜用裁纸机剪为0.2×0.5 cm的试纸条带作为检测条带；

3.根据权利要求1、2所述的一种乙酰胆碱检测试纸条，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维，所述滤膜可以为硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜、吸水纸，所述吸收垫为吸水纸。

4.根据权力要求1-3所述的一种乙酰胆碱检测试纸条的乙酰胆碱的定性定量检测应用，其特征在于其检测应用步骤如下：

（1）对含有乙酰胆碱的样品溶液，加入0.5 mmol/L的有机显色剂（3，3'-二氨基联苯胺或3，3’，5，5’-四甲基联苯胺）并调节pH至弱酸性（pH4.0），将15 μL溶液滴加到乙酰胆碱检测试纸条的样品垫上；

（2）2-5 min后观测试纸条上的检测条带与控制条带，若检测条带颜色比控制条带颜色深，则说明样品中含有乙酰胆碱，从而进行定性检测；

（3）将加有样品与显色剂的试纸条，在LED灯的照射下用智能手机拍照，使用颜色识别器读取具体检测条带的RGB值，并令B_N=B/(R+G+B)，带入B_N-浓度工作曲线方程以计算乙酰胆碱含量，从而实现对乙酰胆碱的定量检测。