JP4409273B2 - 微生物の迅速検出装置及び方法 - Google Patents
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Description
しかし、PCR法にはサーマル・サイクラーと呼ばれる温度制御装置が必要であり、DNAプローブ法、ELISA法なども蛍光検出装置や吸光光度計などが必要であった。また、逆受身ラテックス凝集反応法やイムノクロマト法は感度が低いため、大量の微生物や毒素が無ければ検出できない問題があった。さらに、これらの検出方法はいずれも特定の遺伝子や蛋白質を検出するものであり、DNAの抽出を必要としたり、遺伝子に変異が入っているものの検出感度が著しく低下したり、蛋白質の発現量が少ない場合に検出感度が低下する問題があった。反対に蛋白質の量が多く、陽性と判定されても、微生物はすでに死滅している場合もあった。
(1)腸管出血性大腸菌(EHEC)血清型O157(RIMD0509939)
(2)毒素原性大腸菌(ETEC)(RIMD0509266)
(3)サルモネラ・エンテリティディス(RIMD1933006)
(4)赤痢菌(Shigella flexneri)(RIMD3102002)
(5)腸炎ビブリオ(神奈川現象陽性株)(RIMD2210633)
(6)枯草菌(RIMD0225012)
(7)黄色ブドウ球菌(RIMD3109007)
(8)腸球菌(RIMD3116001)
(9)DH−5α(大腸菌K12株であり病原性はない)
なお、これらの微生物はすべて大阪大学微生物病研究所にて保存されており、RIMDは同研究所エマージング感染症研究センター微生物株保存室の菌株保存番号を示す。
参考例1〔抗体の作製〕
抗体の作製は以下のように行った。上記(1)〜(9)の微生物をそれぞれLuria-Bertani(LB)寒天培地に植菌して37℃、15時間培養した。出現したコロニーを滅菌白金耳で回収し、15mlの滅菌チューブに入れ、0.5質量%ホルマリン5mlに懸濁して4℃で2日間静置した。2日後に懸濁液0.2mlを抜き取り、LB培地に植菌して37℃、15時間培養し、コロニーが出現しないことを確認した。コロニーが出現しないことを確認後、懸濁液は8000rpmで15分間遠心し、上清を除去した。その後菌体に3mlの生理食塩水を加えて再懸濁し、再び8000rpmで15分間遠心した。この洗浄操作はさらに2回繰り返し、死菌の生理食塩水懸濁液を得た。該懸濁液は吸光光度計によりOD600=0.8になるように希釈し、0.1mlをあらかじめ1週間予備飼育しておいたウサギ(New Zealand White種、メス、2.0〜2.5kg)に耳静脈注射した。ウサギはそのまま飼育し、1週間後にさらに前回の倍量の懸濁液を接種した。その後同様に毎週前週の倍量を接種し、5回目の接種を行った1週間後に全採血した。
参考例2〔抗体固定化基板材(A)の作製〕
基板材料にはポリスチレン製の20mm×50mm×厚み1mmの透明板を用いた。これを洗浄後、ろ過滅菌済みの100μg/mlのポリリジン水溶液に5分間浸漬し、滅菌水により2回洗浄した。次に、137mM塩化ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、10mMリン酸水素2ナトリウム、2mMリン酸2水素カリウムからなるpH7.4の緩衝液(以下PBSと略す)に50μg/mlの濃度で抗体を溶解した液に室温で1時間浸漬し、抗体を固定化した。次にPBSにポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(ICI社商標名Tween20)を0.02質量%添加した洗浄液によって1回洗浄し、さらにPBSによって1回洗浄した。続いて、PBSに1質量%牛血清アルブミン(BSA)を加えたブロッキング液に1時間浸漬した。この基板は使用前に洗浄液2により1回洗浄して抗体固定化基板(A)とした。
参考例3〔抗体固定化基板材(B)の作製〕
以下に示すように、Norio Koike et.al., Microbiol. Immunol.,43(11), 1057-1060の方法に準じて作製した。
参考例4〔抗体固定化基板材(C)の作製〕
抗体を固定化する材料として1m×2m×厚み75μmのナイロンフィルムを用いる以外は参考例3と同様に抗体の固定化を行った。このように抗体を固定化したナイロンフィルムは10mm×10mmに裁断し、20000枚の抗体固定化フィルム片を作製した。このフィルム片は1枚ずつ20mm×50mm×厚み1mmの透明ガラスにエポキシ樹脂系接着剤を用いて貼り付け、抗体固定化基板(C)とした。抗体固定化基板(C)は20000枚と簡単に大量生産できた。
参考例5〔抗体固定化基板材(D)の作製〕
抗体を固定化する材料としてアクリル樹脂板を用いた以外は参考例3と同様に抗体の固定化を行い、得られた基板を抗体固定化基板(D)とした。
実施例1
上述の図1〜図3で説明した装置を用いて微生物の検出を行った。なお、実施例で使用した細菌の大きさは概ね1μm〜3μmであり、捕捉された微生物は図4のように輪郭が黒く中心部は光が透過するような画像が得られるため、このような画像の数をカウントする機能を付与した。検出結果の表示は検出領域内の微生物数をカウントし、結果表示画面4に微生物数を表示させた。なお本装置の検出領域は200μm×200μmであった。
実施例1において、微生物の存在しないPBSに浸漬した以外は実施例1と同様の操作を行って検出装置に導入した。結果を表1に示すが、いずれの基板においてもほとんど微生物数はカウントされなかった。
実施例2
実施例1において、試料に基板材を浸漬する時間を1分とし、洗浄の浸漬時間を10秒とした以外は実施例1と同様に微生物の検出を行った。結果を表2に示す。いずれの基板材を用いても好適に検出できた。また、検出に要した時間は2分と非常に短いものであった。
実施例2において微生物の存在しないPBSに浸漬した以外は実施例2と同様の操作を行って検出装置に導入した。結果を表2に示すが、いずれの基板材においてもほとんど微生物数はカウントされなかった。
実施例3
微生物(1)EHECを2mlのLB培地で37℃16時間振とう培養し、これにPBSを導入し、2Lにしたものを6セット作製した。これら2Lの菌液はそれぞれナイロン袋に入れ、その中にレタス、ブロッコリー、牛肉(ローススライス)、鶏肉(胸肉かたまり)、スズキ切り身および車海老剥き身をそれぞれ100g入れて軽くかき混ぜた後、静置した。これらの食材は1時間後に取り出し、2Lの水道水に5秒浸漬することにより軽く洗浄して食品擬似サンプルとした。各食品擬似サンプルは900mlのPBSを加えてストマッカーで破砕処理を行い、25gを採取し10μmの目開きのフィルターによってろ過を行った。ろ液にEHECに対する抗体を固定化した抗体固定化基板材を10分間浸漬し、PBSで3回洗浄して検出装置に導入した。得られた結果を表3に示す。いずれの食品においてもEHECによる汚染が確認できた。
実施例3において、それぞれの食材を微生物が入っていないナイロン袋に入れた以外は実施例3と同様の操作を行って検出装置に導入した。結果を表3に示すが、いずれの食材からも微生物はほとんど確認されなかった。
実施例4
下痢症患者から研究に用いる旨を説明し、同意を得た上で採取し、保存された患者便検体3人分(それぞれEHEC、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌感染の患者便であった)および、健常人便検体2人分、各0.1gをそれぞれ20mlのPBSに懸濁し、上記の9種類の微生物に対して作製した抗体固定化基板材の検出領域内にそれぞれ100μl滴下した。10分間静置した後、PBSで3回洗浄して検出装置に導入した。結果を表4に示す。いずれの患者便においても感染源の特定が可能であった。
2 基板材差込口
3 画像の液晶表示部
4 結果表示画面
8 基板材
11 画像処理部
Claims (4)
- 試料に存在する目的微生物を特異的に捕捉する物質を結合した基板材を備え、該基板材上に捕捉された目的微生物を、蛍光試薬により標識することなく、直接光学的に検出する、大きさが400mm×400mm×200mmより小さく、重さが20kgより軽い電池式の装置からなる持ち運び可能な微生物の簡易迅速検出装置。
- 目的微生物を特異的に捕捉する物質が、抗体である請求項1記載の微生物の簡易迅速検出装置。
- 基板材上に捕捉された目的微生物を、蛍光試薬により標識することなく、直接光学的に検出する装置が、CCD(Charge Coupled Device)イメージセンサまたはC−MOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)イメージセンサを含む装置である請求項1又は2記載の微生物の簡易迅速検出装置。
- 試料と、該試料に存在する目的微生物を特異的に捕捉する物質を結合した基板材とを接触して該基板材上に目的微生物を捕捉し、捕捉した目的微生物を、蛍光試薬により標識することなく、直接光学的に検出して計数することを特徴とする微生物の簡易迅速検出方法。
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